KR20140058711A

KR20140058711A - 백련을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 한방건강식품

Info

Publication number: KR20140058711A
Application number: KR1020120123947A
Authority: KR
Inventors: 이희운; 배난희; 조현우; 정원석; 유영법
Original assignee: (주)제이비티
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2014-05-15

Abstract

본 발명은 미백 및 노화방지 개선효과를 갖는 연의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 이용한 한방건강식품에 관한 것으로서, 연 추출물은, 연(연화, 연근)을 건조한 다음, 건조 중량의 10배의 정제수를 포함한 물로 80 내지 100℃의 추출 온도에서 3시간 동안 3회 반복하여 열수 추출, 또는 에탄올 용매로 60 내지 80℃의 추출 온도에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각 추출하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 동결 건조하여 최종 추출물을 수득하는 방법으로 제조되며, 본 발명에 따른 한방건강식품은, 연화 추출물 또는 건조연화(또는 연근 추출물 또는 건조연근) 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부, 지황 22.6 중량부, 꿀 51.0 중량부를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 연의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 이용한 한방건강식품은 피부흑화를 개선하고 피부탄력손실 및 피부노화를 방지하는 효과가 있다.

Description

백련을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 한방건강식품{Food composition comprising a white lotus for skin health}

본 발명은 피부건강 개선용 식품 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 멜라노사이트의 성장을 억제하거나 티로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌의 합성을 억제하고, 콜라겐 합성을 향상시켜 주름개선효과를 줌으로써 노화를 억제할 수 있는 백련을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 한방건강식품에 관한 것이다.

최근에 웰빙의 개념보다 더 포괄적이고 광범위한 로하스(LOHAS, Lifestyles of Health and Sustainablity)에 대한 관심이 높아지면서 건강한 아름다움을 추구하고자 하는 욕구는 사회전반에 걸쳐 매우 팽대되고 있고, 이러한 사회적 여건 조성은 미용에서도 아름다운 피부를 관리할 수 있는 화장품과 식품 산업의 발전과 시장성이 급속하게 확대되고 있다.

이와 더불어 한방소재의 피부건강 개선용 식품은 자신의 피부에 신비스러운 힘을 부여할 것으로 기대되고 있고, 또한 피부건강 및 노화억제에 대한 욕구로 인하여 천연재료에 대한 관심이 더욱 증폭되고 있다. 천연재료의 장점은 항균활성, 항산화 및 부작용이 경미하다는 것을 들 수 있고, 사용후에는 환경친화적인 부산물을 만든다는 점이다.

이와 같은 수요의 흐름에 따라, 현재 한의학계, 의학계, 화장품업계, 식품업계에서는 안전성을 고려하여 천연물로부터 피부 미백제나 노화억제제 개발을 위하여 많은 연구가 이루어지고 있으며, 그 중 일부는 제품으로 상용화되어 있다. 미백제는 멜라노사이트 (melanocyte)의 성장을 억제하거나 티로시나제 (tyrosinase)의 활성을 억제하여 멜라닌의 합성을 억제하는 효과를 갖는다.

멜라닌은 피부의 색조를 결정하는 주요인자로서 검은색소와 단백질의 복합체로서 주로 인체의 피부에 존재하며 자외선에 대응하여 피부를 보호하고 아민, 유리기, 금속이온 등과 같은 세포독성물질을 제거하는 역할을 수행하고 있다. 멜라닌은 일반적으로 알카리에 난용성인 흑색 멜라닌과 가용성 적색 및 황색 멜라닌으로 구분된다.

이와 같은 멜라닌 세포가 인체에 미치는 유익한 효과에도 불구하고, 자외선, 특히 자외선의 95%에 해당하는 UV-A에 의해 생성되는 멜라닌 세포는 피부에 색소침착과 피부노화를 일으켜 주름, 탄력 상실, 피부흑화 등의 피부 증상이 나타난다. 이를 방지하기 위해 멜라노사이트 (melanocyte)의 성장을 억제하거나 티로시나제 (tyrosinase)의 활성을 억제하여 멜라닌의 합성을 억제함으로써, 인체의 피부에 나타나는 흑화현상 및 노화를 방지할 수 있게 된다.

본 발명에서는 이와 같은 효과를 가져오는 식품 조성물로 연 중에서도 백련을 활용했으며, 백련의 성분중에서도 연화와 연근을 주로 활용하였다.

연 (蓮, Nelumbo nucifera Gaertner)은 수련과의 여러해살이 수생 식물로서 연의 잎을 연잎(또는 하엽), 연의 꽃 봉우리를 연화, 연꽃의 과실 및 종자를 연자(또는 연밥), 연꽃의 열매인 연밥이 박혀 있는 송이를 연방(또는 연봉), 연의 수술을 연수, 연의 뿌리를 연근이라고 한다. 연잎의 화학성분은 로에메린 (roemerine), 누시페린 (nuciferine), 노르누시페린 (nornuciferine), 아르메파빈 (armepavine), 프로누시페린 (pronuciferine), N-노루시페린 (N-nornuciferine), 루테올린(luteolin), 아노나인 (anonaine), 아시미로빈 (asimilobine), N-메틸아시미로빈 (N-methylasimilobine), N-노라르메파빈 (N-norarmepavine), 리리니딘 (lirinidine), 쿼세틴 (quercetin), 이소쿼세틴 (isoquercitrin), 류코시아니딘 (leucocyanidin), 류코델피니딘 (leucodelphinidin), 글루코니카시드 (gluconicacid), 10-노나코사놀 (10-nonacosanol), β-시토스테롤 (β-sitosterol), 디하이드로로에메린 (dehydroroemerine), 디하이드로누시페린 (dehydronuciferine), 캠프페롤 (kaempferol), 캠프페롤-3-갈락토글루코시드 (kaempferol-3-galactoglucoside), 캠프페롤-3-디클루코시드 (kaempferol-3-diglucoside), 디하이드로아노나인(dehydroanonaine), N-메틸이소코클라우린 (N-methylisococlaurine), N-메틸코클라우린 (N-methylcoclaurine)등이 알려져 있다.

또한, 본 발명에서는 백련의 미백 및 노화방지 효과를 확인하기 위하여 연 추출물의 티로시나제 활성 억제효과, 멜라닌 생합성 저해효과, 항산화(DPPH) 라디컬 소거효과, 도파(DOPA) 산화 저해활성효과, 콜라겐 합성능 평가를 통한 추출물의 주름개선효과, 세포외메트릭스분해효소(MMP-1)의 활성억제효과, 노화억제효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 멜라노사이트의 성장을 억제하거나 티로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌의 합성을 억제하고, 콜라겐합성을 향상시켜 주름을 개선하며, MMP-1의 활성을 억제함으로써, 인체의 피부에 나타나는 흑화현상 및/또는 노화를 방지할 수 있는 천연재료인 백련을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 한방건강식품을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미백 및 노화방지 개선효과를 갖는 연의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이 특징이다.

또한, 본 발명에 따른 피부건강 개선용 식품 조성물에서,

상기 연 추출물은,

상기 연(연화, 연근)을 건조한 다음, 건조 중량의 10배의 정제수를 포함한 물로 80 내지 100℃의 추출 온도에서 3시간 동안 3회 반복하여 열수 추출, 또는 에탄올 용매로 60 내지 80℃의 추출 온도에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각 추출하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 동결 건조하여 최종 추출물을 수득하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 피부건강 개선용 한방건강식품은,

연화 추출물 또는 건조연화 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부, 지황 22.6 중량부, 꿀 51 중량부를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 피부건강 개선용 한방건강식품은,

연근 추출물 또는 건조연근 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부, 지황 22.6 중량부, 꿀 51 중량부를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 피부건강 개선용 식품 조성물을 이용하여 피부건강 개선용 한방건강식품이 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 백련을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 한방건강식품은 멜라노사이트의 성장을 억제하거나 티로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌 합성을 억제하고, 항산화효과를 나타내고, 콜라겐합성을 향상시켜 주름을 개선하며, MMP-1의 활성을 억제함으로써, 인체의 피부에 나타나는 흑화현상 및/또는 노화를 방지할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 연의 부위별 물 추출물의 티로시나제 저해 활성을 나타낸 비교도면,
도 2는 연의 부위별 물 추출물의 B16F10 cell에 대한 세포독성평가를 나타낸 도면,
도 3은 연의 부위별 물 추출물의 B16F10 cell에서 α-MSH로 유도한 멜라닌 생성 억제 효능 평가를 나타낸 도면,
도 4는 연의 부위별 물 추출물의 B16F10 cell에서 α-MSH로 유도한 TRP-1, 2 유전자 발현 여부를 나타낸 도면,
도 5는 연의 부위별 물 추출물의 B16F10 cell에서 α-MSH로 유도한 MITF 유전자 발현 여부를 나타낸 도면,
도 6는 연의 부위별 물 추출물의 DPPH 라디컬 소거효과를 나타낸 도면,
도 7은 연의 부위별 물 추출물의 DOPA 산화 저해활성을 나타낸 도면,
도 8은 HaCaT cell (human keratinocyte)에서 연의 부위별 추출물의 세포독성을 나타낸 도면,
도 9는 HaCaT cell (human keratinocyte)에서 연의 부위별 추출물의 seramide 유도 인자 유전자 발현량을 확인하는 도면,
도 10은 연의 부위별 추출물의 세포생존율 측정도면,
도 11은 연의 부위별 추출물의 콜라겐 합성능평가를 나타내는 도면,
도 12는 연의 부위중에서 연근 추출물의 MMP-1 활성저해효과를 측정한 값을 나타낸 도면,
도 13은 연의 부위중에서 연근 추출물의 열 스트레스 억제효과를 나타낸 도면,
도 14는 연의 부위중에서 연근 추출물의 산화적 스트레스 억제효과를 나타낸 도면,
도 15는 연의 부위중에서 연근 추출물에 대해 RT- PCR을 이용한 노화조절인자 daf-16, HSF-1 관련 mRNA 발현분석을 나타낸 도면.

이하, 본 발명의 주재료인 연(백련)의 효능을 실험하기 위하여, 우선 아래의 방법으로 연의 추출물을 수득한다.

본 발명에서 연의 추출물은 연화, 연근, 연자와 연방을 건조하여 그 중량의 약 10배의 정제수를 포함한 물로 80 내지 100℃, 바람직하게는 95℃의 추출 온도에서 약 3시간 동안 3회 반복하여 열수 추출, 또는 에탄올 용매로 60 내지 80℃, 바람직하게는 70℃의 추출 온도에서 약 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각 추출하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 동결 건조하여 연의 부위별 추출물을 수득한다.

상기 추출물은 멜라닌 생성 억제효과, 티로시나제 활성 억제효과, 멜라닌 합성억제효과, 항산화(DPPH) 라디컬 소거효과, 도파(DOPA) 산화 저해활성효과, 콜라겐 합성능 향상에 따른 주름개선효과, 세포외메트릭스분해효소(MMP-1)의 활성억제효과, 노화억제효과를 확인한 결과 뛰어난 효과를 나타내었으며, 또한 안전성에도 문제가 없음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 수득한 연 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부의 미백/주름/노화 개선용 약학조성물도 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 환제로 제조하여 복용하거나, 차 형태로 식음할 수 있음은 물론이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것이 아님은 물론이다.

실시예1 . 연의 부위별 추출물의 제조

연 소재인 연화, 연근, 연자, 연잎을 각각 100g씩 정칭하여 그 10배의 정제수인 1,000ml를 가한 다음 냉각기를 부착하여 95℃ 온도에서 3시간 동안 가열하고 3회 반복하여 추출한 후, 여과지로 감압여과한 여과액을 회전식 감압농축기로 감압농축하여 동결건조기를 이용 건조하여 각각 농축량 16.1g (수율 16.1), 농축량 2.3g (수율 2.3), 농축량 6.3g (수율 6.3), 농축량 16.2g (수율 16.2)를 얻었다.

상기 연 추출물에 대해 미백활성조사와 보습, 주름개선, 노화억제활성조사로 나누어 실험을 실시하였다.

<연 부위별 추출물의 미백활성조사 >

실험예1 . 세포독성도 조사( MTT assay )

세포배양은 일반적으로 마우스 멜라노마(mouse melanoma)로 알려진 B16F10 cell, B16F1 cell을 DMEM+10% FBS medium을 이용하여 5% CO₂, 37℃가 유지되는 incubator 배양하여 실험한다. 대식세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛(formazan) 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정하며, 지수성장을 하는 세포를 DMEM배지에서 1x10⁶개/ml의 밀도로 현탁하고, 여러 가지 농도로 처리 4시간 동안 배양한 뒤 1 mg/ml의 농도로 MTT용액을 첨가한다.

그런 다음, 다시 2시간 동안 배양하여 생성된 MTT-formazan 생성물은 동일한 용량의 용해 완충액(50%n, n-dimethylformamide을 포함하는 20% SDS 용액, pH4.7)으로 용해 후 formazan 양은 570nm에서 흡광도 값으로 측정한다.

실험예2 . 티로시나제 활성억제효과 측정

티로시나제 활성억제효과를 측정하기 위하여, 각각 추출물 3~4 mg에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8) 1.5~2 ml 넣고 완전 용해시킨 후 각각의 농도별(100, 250, 500, 1000, 2000 μg/ml) 시료로 준비하였다. 그리고, 기질로서 엘-티로신(L-tyrosin,100 unit, Sigma, U.S.A) 0.3 mg/ml 농도로 인산염완충액(pH 6.8)을 완전히 녹이고, 티로시나제(tyrosinase)는 125 unit/ml 농도로 준비하였다.

96 웰 플레이트(well plate)에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8) 220 μl와 시료액 20 μl 그리고 티로시나제(tyrosinase, 150 unit/ml ~ 200 unit/ml)액 20 μl를 순서대로 넣은 다음, 이 용액에 1.5 mM 티로신(tyrosin) 액 40 μl를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨 후 이것을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

공시료액으로는 시료액 대신 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8)을 넣었으며, 양성대조군은 티로시나아제 반응 억제제인 코직산(kojic acid)을 사용하였다.

<실험결과>

도 1에 도시된 바와 같이 연의 부위별 추출물의 Tyrosinase 저해 활성을 확인한 결과, 다른 추출물에 비하여 연근, 연잎, 연자 추출물에서는 유의성 있는 억제효과가 나오지 않았지만, 연화 추출물에서는 농도의존적으로 Tyrosinase 활성을 억제하는 결과를 나타내었다.

즉, 실험군인 연화의 물 추출물은, 농도가 100μg/ml, 250μg/ml, 500μg/ml, 1000μg/ml, 2000μg/ml로 증가함에 따라 티로시나제 활성이 105%에서 대략 78%로 감소된 바 활성이 유의하게 억제되었음을 알 수 있다.

실험예3 . 멜라닌 생합성 저해 효과 측정

실험에 사용된 세포주는 뮤린 멜라노마(murine melanoma, B-16 F1) 또는 이와 유사한 세포를 적량의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트(well plate)에 웰(well)당 1×10⁵ 개로 접종한 후 5% CO₂ _,37℃하에서 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다.

멜라닌 생성 저해 실험 및 세포생존율을 측정하기 위하여,

배양 후 배지를 제거하고 시료가 적당 농도로 희석된 배지로 교체한 후 5% CO_2,37℃하에서 일정시간 배양하였으며, 시료의 농도범위는 크리스탈 바이올렛 어세이(crystal violet assay)를 이용한 독성실험을 통하여 결정하였다.

배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였으며, 회수된 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000~10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠릿(pellet)을 얻었다.

이 세포 펠릿은 60℃에서 건조한 후 10 % DMSO가 함유된 1 M 수산화나트륨액 100 μl 또는 적량의 세포분쇄버퍼(cell lysis buffer)를 넣어 60℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 가지고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정수 당 멜라닌양을 구하였다.

<실험결과>

도 2에 도시된 바와 같이, 멜라닌 형성세포인 B16F10(mouse melanomacyte)에 대한 세포독성을 평가한 결과, 모든 추출물에서 독성이 나타나지 않았다.

또한, 도 3에 도시된 바와 같이, B16F10(mouse melanomacyte)에서 α-MSH로 유도한 멜라닌 생성 억제효능을 평가한 결과, 연화, 연자에서 유의성 있는 효과가 나타났으며, 특히 연화에서 멜라닌 형성 억제 효과가 가장 높았다. (멜라닌 생성을 유도하고 2일 뒤에 세포 배지에서 멜라닌 형성을 확인함)

실험예4 . TRP -1, TRP -2 유전자 발현확인

B16F10(mouse melanomacyte)에서 α-MSH로 유도한 tyrosinase 활성에 관여한다고 알려진 단백질인 TRP-1, 2의 유전자 발현을 확인하기 위하여, B-16 mouse melanoma 세포를 6-well plates에 1×106cells/㎖로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 연 추출물을 처리하여 24시간 동안 더 배양. 물 추출물이 함유된 배지를 제거한 후 QIAzol lysis buffer를 각 wells에 500㎕ 씩 분주하여 세포를 분쇄(lysis)한 후 -70℃에 보관한다. 시료를 실온에서 녹여 chloroform 200㎕를 분주하여 15초간 섞은 후 12,000×g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 isopropanol 500㎕ 들어 있는 튜브에 옮겨 섞는다. 그런 다음 다시 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 100% ethanol과 0.1% diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 75 : 25로 섞어 만든 75% ethanol를 각 튜브에 1 씩 분주하여 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시킨다. Nuclease free water를 40㎕ 씩 분주하여 녹인 후 RNA 5㎕에 0.1% DEPC를 955㎕ 첨가하여 260nm에서 흡광도를 측정하였고 total RNA 양을 정량하였다.

Oligo (dT)15 primer (500㎍/㎖) 1㎕, dNTP mix (10mM) 1㎕, 추출한 RNA 2㎍와 RNase free water로 11㎕을 맞추고 65℃에서 5분간 반응시킨 후 5배 first-stand 완충용액 4㎕, nuclease free water 1㎕, DTT (100 mM) 2㎕, SuperScript III reverse transcriptase 1㎕를 섞어 9㎕ 씩 각 PCR tube에 더한 후 42℃에서 50분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 http://bioinfo.appliedbiosystems.com/genomic-products/gene-expression.html 에서 검색하여 주문 후 사용하였다. 이용한 gene은 다음과 같다.

gene name	assay ID	reporter dye
TRP-1	Mm00453201_m1	Fam
Dct	Mm01225584_m1	Fam
MITF	Mm00434954_m1	Fam
Hprt1	Mm00446968_m1	VIC-limited

합성된 cDNA 1㎕, TaqMan Universal PCR Master Mix 10㎕(applied bio systems), Taqman gene(20X) 1㎕를 넣고 DEPC water로 최종 볼륨을 20㎕로 맞춘다음 ABI-7500 PCR을 사용하여 Taq-man assay 방식으로 조건은 92℃에서 30초, 60℃에서 45초, 그 후에 72℃에서 30초를 40cycle로 반응시킨다. 반응시킨 후 자체 분석프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.

<실험결과>

도 4에 도시된 바와 같이, B16F10(mouse melanomacyte)에서 α-MSH로 유도한 tyrosinase 활성에 관여한다고 알려진 단백질인 TRP-1, 2의 유전자 발현을 확인한 결과, 연화, 연자, 연잎에서 유의적인 효과가 나타났으며 연화 추출물에서 TRP-1, 2 모두 유전자 발현을 억제하는 효능이 다른 추출물에 비해 높게 나타났다.

실험예5 . MITF 유전자 발현확인

Microphthalmia-associated transcription factor(MITF)는 멜라닌 생성에 관여한다고 알려진 전사인자로, 구체적으로는 MITF가 바로 멜라닌 생성의 속도조절단계 효소인 티로시나제의 발현을 조절하게 되며 증가된 티로시나제의 발현이 멜라닌생성을 촉진시키게 되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 멜라닌 생성의 신호전달과정에서 연 부위별 물 추출물의 mRNA의 발현을 조사하였고, 그 결과 도 5에 도시된 바와 같이, 연잎, 연화, 연자에서 유의적인 효과가 나타났으며, 그 효과는 연잎이 가장 활성이 높게 나타났지만 연화, 연자와의 차이는 미비하였다.

실험예6 . 항산화( DPPH ) 라디칼 소거 효과 측정

대조군(control)에는 추출물의 용매를 실험군에는 실험재료를 농도별(10, 25, 50, 100, 250 μg/ml)로 100 μl씩 넣은 후 대조군(control)과 실험군에 각각 60 μM DPPH를 첨가하고, 블랭크(blank)에는 60 μM DPPH대신 에탄올을 넣고 약 3초 정도 흔들어 섞은 후, 실온에서 30분간 방치하고 540 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 비타민C 추출물을 사용하였다.

<실험결과>

도 6에 도시된 바와 같이, 연 부위별 물 추출물의 항산화 효과를 연구한 결과, 항산화 효능은 연잎과 연화에서 상대적으로 높게 나타났으며 특히 연잎 물 추출물의 항산화 활성은 대조군인 Vitamin C와 유사한 항산화 활성을 나타내었고 연화 또한 고농도에서는 Vitamin C와 유사한 활성을 나타내었다. 모든 시료가 농도가 높아질 수록 항산화 라디컬 소거효과가 높아졌다.

항산화제는 산화로 인한 여러 가지 바람직하지 않은 화합물의 형성을 방지하기 위해 지질 시스템 내에 첨가된다. 항산화 물질은 유지식품의 산화 억제뿐만 아니라 인체내에서 활성산소에 의한 산화적 스트레스를 감소시켜 노화억제, 항암 등 생리활성 기능이 입증되면서 식품 그 자체보다 항산화와 관련된 생리기능에 더 많은 관심이 쏠리고 있다.

실험예7 . 도파 ( DOPA ) 산화 저해활성 효과 측정

타이로신(Tyrosine)이 타이로시나제(Tyrosinase)에 의해 만들어진 DOPA가 도파퀴논(DOPA quinone), 도파크롬(DOPA chrome)으로 산화되는 과정을 억제하는 효과를 측정하였다.

각각 추출물 3~4 mg에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8)을 1.5~2 ml 넣고 완전 용해시킨 후 각각의 농도별(50, 100, 250, 500, 1000 ㎍/ml) 시료로 준비하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 6.8) 850㎕와 시료액 50㎕, 그리고 티로시나제( tyrosinase)(1500~2,000) unit/ml 50㎕를 순서대로 넣고 37℃에서 6분 동안 반응시킨다.

이 용액에 0.06 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)액 50㎕를 넣은 다음 37℃에서 1분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로는 시료액 대신 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8)을 넣었으며, 양성대조군은 코직산(kojic acid)를 사용하였다.

<실험결과>

도 7에 도시된 바와 같이, 연 부위별 물 추출물의 DOPA 산화 저해 활성 실험 결과 대조군인 코직산(Kojic acid)에 비해 그 효과가 미약하게 나타났다. 그 중에서 연화 물 추출물이 가장 고농도에서 약 15%의 억제 효과를 나타내어 가장 우수한 효과를 보였다.

<연 부위별 추출물의 보습, 주름개선, 노화억제활성조사>

실험예1 . 세포독성도 조사( MTT assay )

세포배양은 일반적으로 휴먼 케라티노사이트(human keratinocyte)로 알려진 HaCaT cell를 DMEM+10% FBS medium을 이용하여 5% CO₂, 37℃가 유지되는 incubator에서 배양하여 실험을 실시하였다.

대식세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛(formazan) 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정하였으며, 지수성장을 하는 세포를 DMEM배지에서 1x10⁶개/ml의 밀도로 현탁하고, 여러 가지 농도로 처리 4시간 동안 배양한 뒤 1 mg/ml의 농도로 MTT용액을 첨가하였다. 그런 다음, 다시 2시간 동안 배양하여 생성된 MTT-formazan 생성물은 동일한 용량의 용해 완충액(50%n,n-dimethylformamide을 포함하는 20% SDS 용액, pH4.7)으로써 용해 후 formazan 양은 570nm에서 흡광도 값으로 측정하였다.

<실험결과>

도 8에 도시된 바와 같이, 인간 유래 피부각질 세포주를 활용하여 피부보습 관여 인자 유전자 발현 효능을 평가하기 위하여 세포에 연 추출물을 농도별로 처리한 결과 B16F10 세포에서와 마찬가지로 모든 추출물에서 세포독성이 나타나지 않았다.

실험예2 . 세라마이드 관련 효소의 mRNA 발현 변화 측정

2.1. RNA 추출

Total RNA는 TRIzol 시약을 이용하여 추출한다. HaCaT 세포를 2 x 10⁶cells 에 TRIzol (invitrogen, USA) 용액을 1 ml 넣어서 용해시킨 후 200㎕의 chloroform 용액을 가하고 두세 번 잘 섞어준 뒤 15,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 맨 위의 상층액을 500㎕ 취한다. 그 후 2-propanol과 1:1로 섞은 뒤 15,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 위에 상층액은 버리고 남은 침전물에 80% ethanol로 2회 씻고 침전물을 건조시켰다. 그리고 침전물에 DEPC 처리한 증류수를 20㎕ 씩 넣어 RNA를 용해시키고 정량 흡광도 측정기를 이용하여 260nm/280nm 파장으로 흡광도를 측정하여 정량한다. 정량한 RNA는 invitrogen superscript cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA로 전사시킨다.

2.2. 정량적 중합효소반응

mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 ml, Real time PCR master mix 4 ml (Invitrogen), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응시켰다. PCR 조건은 92℃에서 30초, 60℃에서 45초, 그 후에 72℃에서 30초를 40cycle로 하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan probe는 ABI TaqMan assay 검색 사이트(http://bioinfo.appliedbiosystems.com/)를 이용하여 검색 후 Ceramide 관련 효소를 주문하여 측정하였다. 사용한 gene은 다음과 같다.

gene name	assay ID	reporter dye
SPT1 (serine palmitoyltransferase)	Hs00272311_m1	Fam
FAS (fatty acid synthesis)	Hs01005622_m1	Fam
Hprt1	Mm00446968_m1	VIC-limited

<실험결과>

도 9에 도시된 바와 같이, 인간 피부 각질세포에 피부 보습에 주요한 역할을 하는 인자로 널리 알려진 세라마이드를 유도하는 효소 유전자인 serinepalmytoyl transferase(SPT)의 유전자 발현을 확인한 결과, 전체적으로 연 추출물 모두에서 SPT를 농도의존적으로 증가시키는 결과를 나타내었지만 그 효과는 연근, 연자, 연화, 연잎 순으로 나타났다.

SPT 발현 증가는 장기적인 피부 장벽 기능 개선에 도움을 주어 피부의 수분 함유 능력 증강, 피부 건조의 방지 등의 표피 보호 효능을 가질 수 있음을 의미한다.

실험예3 . 연 추출물의 주름제거효과 확인

3.1. 콜라겐 생합성 연구

콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 하는 것으로, 콜라겐은 나이가 들면서 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 진피층에 존재하는 섬유아세포가 피부 구성 주요 단백질인 콜라겐의 합성을 담당하고 있으므로, 섬유아세포를 이용하여 콜라겐의 생성 증가 정도를 측정함으로써 추출물의 collagen 합성능 향상 및 주름개선 효력을 평가할 수 있다.

3.2. 세포배양

사람의 피부아세포(HDFn, human Dermal fibroblast, neonatal)는 Gibco invitrogen cell culture에서 구입하여 실험에 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂에서 10% FBS혈청, penicillin(100 units/ml) 과 streptomycin(100 /ml) 그리고 2%의 LSGS (Low SErum Growth Supplement)가 첨가된 M106에 배지에서 배양하였다. 세포배양용기의 세포밀도가 80% 이상일 때 subculture를 실시하였으며 SFM (Serum Free Media)으로 일회세척하고 Trypsin/EDTA (0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA)처리하여 37에서 세포를 탈리하였다. 이를 원심분리(1,300 rpm, 4℃)하여 포들을 회수하고 1 x 10⁵개로 계대하여 2-3일 간격으로 배지를 교체하면서 배양하였다.

3.3. 세포생존율 측정

세포를 96-well plate에 1×10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5 % CO₂ 에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리한 배지에 24 h 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS (Phosphate bufferedsaline) 두 번씩 세척하였다. MTT 를 300㎍/mL 로 PBS에 녹여 100 ㎕ 첨가하고 37℃, 5 %의 CO₂ 에서 4 h 동안 배양하였다. DMSO를 한 well 당 150㎕ 넣고 30 min 동안 교반한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3.4. 콜라겐 합성능 평가

콜라겐 합성능 평가는 콜라겐 전구체(PIP, Procollagen Type 1 C-peptide)의 C-말단을 인식하는 항체 이용법을 활용하였다. Trypsinization에 의하여 회수한 세포를 48 well plate에 5X10⁴ cells/well의 농도로 배양 배지 0.3 ml로 접종하여 37, 5% CO₂에서 배양하였다. 24시간 지난 이후 추출물을 농도 별로 포함한 새로운 배지로 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 모아서 enzymes-linked immunoassay kit (PIP-kit, Takara사)를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 양을 측정하였다. 콜라겐 용액 (640 ng/ml)을 이용하여 콜라겐 농도 0 ng ~ 640 ng (10, 20, 40, 80, 160, 320, 640ng/mL)사이의 standard curve(450nm)를 얻어 배지에 있는 콜라겐 양을 계산하였다.

<실험결과>

도 10(연의 부위별 추출물의 세포생존율 측정도면), 도 11(연의 부위별 추출물의 콜라겐 합성능평가를 나타내는 도면)에 도시된 바와 같이, 연방, 연잎, 연화, 연근, 연자에 대한 DW와 EtOH 추출 건조물의 콜라겐합성능 효능평가를 실시하였다. 시료의 용매는 두 가지 추출물에 대한 비교를 위하여 동일하게 50% DMSO로 하였으며, 처리 농도는 용매에 녹인 후 용매를 대조군으로 하여, 최종 10, 50, 100 ug/ml의 농도로 처리하였다. 콜라겐합성능 시험에 앞서 세포 독성 및 증식 시험결과, 모든 시료에서 독성이 나타나진 않았으며, 대부분의 시료에서 세포 증식에 효능을 나타내었다. 하지만, 콜라겐합성능 시험 결과는 세포 증식 결과와는 부합되지 않는 경향으로 나타났으며, 10가지 시료 중 연근 EtOH 추출에서만 유일하게 콜라겐 합성을 약 36% 정도 증가하는 것으로 나타났다.

실험예4 . MMP -1의 활성저해효과 측정

피부의 광노화에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP-1의 발현은 UVA에 의해 세포에서 JNK/p38 활성도가 증가하고 전사인자인 AP-1의 활성도가 증가되는 신호 전달경로를 통해 MMP-1 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다. 따라서, 시료의 MMP-1 활성저해효과측정은 Wang 등이 사용한 방법을 변형하여 실시하였다.

즉, 반응완충액 100㎕에 형광물질이 표지된 DQ collagen (0.25 mg/ml, Molecular Probe, USA) 20㎕, 시료 40㎕와 collagenase (0.5 unit) 40 ㎕를 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광분광광도계(PERKIN ELMER, USA)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm로 형광값을 측정하였고, 대조그룹으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량첨가하여 형광값을 측정하였다. 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다. 양성대조그룹으로는 1,10-PT를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 MMP-1 활성을50% 소거하는 농도(IC50)를 구하여 시료와 비교하였다.

<실험결과>

실험결과 도 12에 도시된 바와 같이, 연근 추출물 50ug/mL에서 MMP-1 활성을 유의적으로 억제하였다.

실험예5 . 연 추출물의 노화억제효과 측정

- 예쁜 꼬마선충을 활용한 노화억제 생명연장효과 검색

야생형 N2 C. elegans (Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA)를 활용하여 생명연장효과를 실험하였으며, 동일한 연령의 개체를 확보하기 위하여 100 마리의 혼합된 단계(Mixed stage)의 벌레를 대장균 OP50이 첨가된 아가 플레이트에 옮겼다. 그리고, 이를 20℃ 인큐베이터에서 14시간 방치한 후 알을 제외한 모든 단계의 벌레와 OP50을 제거하였다.

알이 포함된 아가 플레이트는 동기화된 L1(synchronized L1)이 되도록 20℃ 인큐베이터에 보관하였으며, 동기화된 L1의 100 마리 정도를 10cm 아가 플레이트에 옮겨서 65시간 동안 인큐베이터에 보관하였고, 동기화된 L1은 130㎕ S-완전 배지(OP50 6mg/㎖)에 10-15마리 정도가 되도록 하여 96well plate에 분주하며, 성체 벌레가 되도록 48시간 동안 보관하였다.

즉, Synch7ronized L1- stage C. elegans에 약물처리하고 일정시간 성장시킨 후, 온도스트레스, 산화적 스트레스 등을 유도하였다.

그런 다음, 24시간 후 추출물을 처리하고 매주 월요일, 수요일, 금요일에 생존율을 계산하였다.

<실험결과>

실험결과 도 13(연의 부위중에서 연근 추출물의 열 스트레스 억제효과를 나타낸 도면)에 도시된 바와 같이, 연근 추출물 농도 100㎍/㎖ 처리군이 대조군과 비교하여 24% 정도 생존율이 높아 열 스트레스 저항성에 유의적 활성이 있는 것으로 나타났으며, 도 14(연의 부위중에서 연근 추출물의 산화적 스트레스 억제효과를 나타낸 도면)에 도시된 바와 같이, 연근 추출물 농도 100㎍/㎖ 처리군이 대조군과 비교하여 14.7% 정도 생존율이 높아 산화적 스트레스 저항성에 유의적 활성이 있는 것으로 나타났다.

또한, RT- PCR을 이용한 노화조절인자 daf-16, HSF-1 관련 mRNA 발현분석을 한 결과, 도 15에 도시된 바와 같이, daf-16과 HSF-1 관련 인자들의 발현 정도에 미치는 영향을 real-time PCR을 통해 확인하였다.

여기서, daf-16과 HSF-1 는 mRNA를 분리하고 cDNA를 합성하여 생명연장에 중요한 인자이다.

상술한 바와 같은 특성을 가진 본 발명의 연 또는 연 추출물을 포함하는 조성물은 피부의 미백 및/또는 노화방지 효과를 위한 건강 식품으로도 제조할 수 있다. 본 발명의 추출물을 식품으로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있음은 물론이다.

일반적으로, 본 발명의 연의 각 부위별 추출물을 약제, 식품 또는 음료의 제조시 원료에 대하여 7 내지 14 중량%, 바람직하게는 7.8 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 물론이다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.

이하, 제제예 1 내지 2에서 연 추출물(특히, 연화 또는 연근)을 함유하는 약학 제제 및 건강 식품을 제조하였지만, 본 발명이 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 미백효과 있는 정제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 연화 추출물 또는 건조연화 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부를 분쇄하여 준비하고, 지황 22.6 중량부의 즙을 짠 후, 연화, 인삼, 복령, 지황을 균질하게 혼합한 후, 꿀 51 중량부의 원료를 넣고 재차 균질하게 혼합한 다음, 72시간동안 중탕한 후 24시간 방냉한다. 여기서, 복령 대신 연근 함량을 총 15.6 중량부로 해도 무방하다. 왜냐하면, 복령 역시 미백효능이 있기 때문이다.

그런 다음, 재차 24시간동안 중탕한 후 상온에서 숙성시킨다.

숙성된 혼합물을 대략 40℃에서 2~4시간 건조한 후, 환 크기 1정이 4g이 되도록 타정한다.

<제제예 2> 보습, 주름개선 및 노화방지효과 있는 정제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 연근 추출물 또는 건조연근 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부를 분쇄하여 준비하고, 지황 22.6 중량부의 즙을 짠 후, 연근, 인삼, 복령, 지황을 균질하게 혼합한 후, 꿀 51 중량부의 원료를 넣고 재차 균질하게 혼합한 다음, 72시간동안 중탕한 후 24시간 방냉한다.

<제제예 3> 미백효과 및 보습, 주름개선 및 노화방지효과 있는 정제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 연화와 연근 추출물 또는 건조연화와 건조연근 15.6 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부를 분쇄하여 준비하고, 지황 22.6 중량부의 즙을 짠 후, 연화, 인삼, 복령, 지황을 균질하게 혼합한 후, 꿀 51 중량부의 원료를 넣고 재차 균질하게 혼합한 다음, 72시간동안 중탕한 후 24시간 방냉한다.

숙성된 혼합물을 대략 40℃에서 건조한 후, 환 크기 1정이 4g이 되도록 타정한다.

<제제예 4> 연차의 제조

8~9월 사이에 채취한 연화 및/또는 연잎 4kg을 대략 45~60℃, 바람직하게는 50℃, 55℃, 60℃에서 1시간 30분~ 2시간 30분, 바람직하게는 각 온도별로 각각 2시간, 1시간 30분, 2시간 30분 정도 건조하고, 온도가 대략 120~140℃ 정도되는 가열솥에서 각각 2시간, 1시간 30분, 1시간 30분 정도 볶아(덖아) 차제품을 완성한다.

비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함함은 물론이다.

Claims

연 추출물을 유효성분으로 포함하는 하는 피부건강 개선용 식품 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 연 추출물은,
상기 연(연화, 연근)을 건조한 다음, 건조 중량의 10배의 정제수를 포함한 물로 80 내지 100℃의 추출 온도에서 3시간 동안 3회 반복하여 열수 추출, 또는 에탄올 용매로 60 내지 80℃의 추출 온도에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각 추출하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 동결 건조하여 최종 추출물을 수득하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부건강 개선용 식품 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 따라 제조된 연화 추출물 또는 건조연화 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부, 지황 22.6 중량부, 꿀 51.0 중량부를 포함하여 제조되는 피부건강 개선용 한방건강식품.
제 1 항 또는 제 2 항에 따라 제조된 연근 추출물 또는 건조연근 7.8 중량부, 인삼 7.8 중량부, 복령 7.8 중량부, 지황 22.6 중량부, 꿀 51.0 중량부를 포함하여 제조되는 피부건강 개선용 한방건강식품.
제1항 또는 제2항의 조성물을 이용하여 제조되는 한방건강식품.