JP4676727B2 - グァバの抗菌性物質 - Google Patents

Description

本発明は、天然由来の細菌増殖抑制剤に関するものであって、更に詳細には、本発明は、一般に、レトルト殺菌等で知られる高温・高圧条件下での加熱殺菌方法や化学薬品処理等以外に有効的な手段がない耐熱性芽胞形成細菌や大腸菌等の増殖を抑制することができる耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤及びその製造方法に関する。

従来より、天然原料・素材を用いる加工食品の品質保持において微生物の制御は大きな課題であり、微生物による変質や腐敗、人体へ悪影響を及ぼす菌類の混入を極力抑えた加工技術や製造技術の確立が求められている。微生物の中でも耐熱性芽胞形成細菌は、熱処理に対し強い耐性を有することが知られており、抗菌剤等の薬剤に対しても強い耐性を有している場合が多く、原料や製造工程の汚染等の原因で耐熱性芽胞形成細菌が製品中に混入した場合、通常の加熱処理や製品内容物により十分制御できない場合がある。

従来、食品製造においては防腐・防黴を目的に食品添加物である保存料や、日持ち向上剤が使用され、製品の保存流通期間中における品質保持を可能にしてきている。特に、食品分野においてはこれら添加物の摂取による人体への安全性が必須条件であり、ショ糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステルなどの食品添加物を主剤とした保存料、日持ち向上剤が多く用いられている。

しかしながら、これらの食品添加物を主剤とした保存料、日持ち向上剤では、耐熱性芽胞形成細菌に対する殺菌効力等の面で未だ十分に満足しうるものではく、また、人体への安全性や健康面に敏感な昨今の消費者のニーズからも、天然由来の保存料、日持ち向上剤への期待が高まってきている。

一方、グァバ（ｇｕａｖａ：Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ Ｌ．）は、主に亜熱帯から熱帯にかけて生育しているフトモモ科の常緑樹であって、その葉や、根、果実は古来より病気の処置や保存等に用いられてきた。現在も、果実は生食やジュースとして、葉はグァバ茶として利用されている（例えば、非特許文献１参照）。

また、グァバの抗菌活性についても最近になって研究がはじまり、例えば次のような微生物に対する抗菌性が検討されている：レジオネラ属菌、インフルエンザ等のウイルス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ヘリコバクター・ピロリ（例えば、それぞれ、特許文献１、２、３、４参照）。また飲食品の製造分野でも佐藤らによってグァバにも多少の抗菌活性があることが報告されているが（例えば、非特許文献２参照）、耐熱性芽胞形成細菌など特に食品製造の際に問題となる細菌類に対する抗菌性やその寄与成分に関しては、これまで検討がなされていなかった。

グァバ以外の植物体についてみても、熱帯〜亜熱帯植物の内では、例えばコーヒー、しかもコーヒー生豆の発酵物が耐熱性芽胞形成細菌に対して抗菌活性を有する点について、報告がなされている程度である（例えば、特許文献５参照）。
特開平１１−４３４４２号公報 特開２０００−２７３０４８号公報 特開平０８−９９８９３号公報 特開平０８−１１９８７２号公報 特開２００１−１７８４３１号公報 「廣川 薬科学大辞典」、廣川書店、昭和５８年４月１５日、ｐ．３５１ 「Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．」９０巻、４号、２０００年、ｐ．４４２−４４６

本発明は、上記従来の課題及び現状等に鑑み、これを解消しようとするものであり、安全性に優れ、且つ細菌、特に耐熱性芽胞形成細菌に対しても高い増殖抑制効果を発現させることができる耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤を提供することを目的とする。

本出願人は先の発明（特願２００３−４４２５４）において、グァバ葉抽出液中にこれら細菌類に対し強い抗菌性を有する２種の化合物（Ｍｏｒｉｎ−３−Ｏ−ｌｙｘｏｓｉｄｅ、Ｍｏｒｉｎ−３−Ｏ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）を見出し出願した。さらに、上記従来の課題等を解決するためく鋭意研究を重ねた結果、前記２種化合物およびその類縁体（モリン、ケルセチン及びそれら配糖体）由来の抗菌活性は、グァバ葉抽出液全体の有する抗菌活性の一部分であり、これら化合物以外に耐熱性芽胞形成細菌に対し強い抗菌活性を有している成分が存在することが示唆された。本発明者らはグァバ葉抽出液の中でより水溶性が高い分画に耐熱性芽胞形成細菌に対し強い抗菌活性を有する成分を見出し、以下の発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は下記（１）、（２）を態様として包含するものである。
（１）グァバから得た抽出液を有効成分とすることを特徴とする耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
（２）抽出液中に下記分析データで示される成分が含有される上記態様１記載の耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制剤。
分析データ：分析用ＯＤＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製分析用ＯＤＳカラム、ＬＵＮＡ ５μＣ１８ ２．０×２５０ｍｍ）を用いて、カラム温度４０℃、流速０．２ｍｌ／分、メタノール／１％酢酸−水（０→２０分：１０／９０→３０／７０、２０→３０分：３０／７０→１００／０）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイーにおいて、同条件で検出されるモリン、ケルセチンおよびそれら配糖体より必ず前に溶出される成分（リテンションタイム：１０分から１３分の成分）を含むこと。

なお、本発明で規定する「耐熱性芽胞形成細菌」とは、耐熱性を有する芽胞（胞子）を形成する細菌をいい、具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細薗（例えば、ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｃｅｒｅｕｓ，ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなど）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌（例えば、ボツリヌス菌、ｓｐｏｒｐｇｅｎｅｓ，ｐｅｒｔｒｉｎｇｅｎｓなど）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属細菌（例えば、ｖｉｏｌａｃｅｕｓなど）等の細菌をいう。また、本発明で規定する耐熱性芽胞形成細菌に対する「増殖抑制（効果）」とは、内容液中で微生物の増殖に伴い観察されるｐＨの低下、並びに、通常法に従い所定の栄養を含んだ寒天培地と共にシャーレヘ混釈後、培養期間を経た後に計測しうるコロニー数での増減の差をいう。

このように構成される本発明の細菌増殖抑制剤では、グァバから抽出して得られた抽出液およびその精製エキスを含有するものであり、得られた細菌増殖抑制剤は、耐熱性芽胞形成細菌などに対する増殖抑制効果を発現することとなる。また、本発明では、天然物であるグァバを出発原料として製造するため、生分解性が良く人体に対する安全性も高いことが期待され、食品、清涼飲料等へ添加して使用できるものとなる。更に、本発明では、加工食品の製造工程で制御困難な細菌芽胞の増殖を抑制できるので、製造工程で使用する場合は安定した製造品質を提供することができ、また、本発明の細菌増殖抑制剤を添加した加工食品等の場合は、過度な加熱殺菌を施す必要がないので、加熱による品質の劣化を極力抑えることができ、香味豊かな加工食品などを提供でき、更に熱に対して不安定な有用成分を有する加工食品に対して配合しても細菌芽胞の増殖を抑制できるものとなる。

本発明に係る細菌増殖抑制剤は、大腸菌を含む通常の一般細菌や、食中毒菌の黄色ブドウ球菌のほか耐熱性芽胞形成細菌の増殖を抑制することができるので、例えば缶詰、ビン詰、レトルト食品、ペットボトル入り飲料等の容器入り飲食品に添加使用した場合、たとえ製造工程において多少の細菌が残留していても、それらの細菌が増殖するのを防止することができるので、実質的に腐敗が防止され、細菌増殖による容器の変形や破裂等の事故も防止され、商品のシェルフライフの大幅延長が可能となる。

また、本発明に係る細菌増殖抑制剤は、飲食品のほか、化粧品、医薬品、衛生薬品や工業薬品にも使用することができる。

以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明における細菌増殖抑制剤は、グァバ葉から抽出した成分を有効成分とすることを特徴とするものである。

本発明に用いる原料としては、グァバの葉部、枝部、幹部、根部、実部、花部などが挙げられ、通常、食用に用いられる部分であれば特に限定されるものではない。最適な部位としてグァバ茶等で利用される葉部が好適であり、生の葉でも製茶用に焙煎された茶葉でも原料として利用可能であり、これらを混合したものでも用いることが可能である。

本発明における抽出処理において、抽出溶媒としては水またはエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコールのほか、ジエチルエーテル、エステル（例えば酢酸エチル）等の有機溶媒が単用又は２種以上併用され、水と有機溶媒との混用も可能である。抽出方法としては、適宜常法が使用されるが、加温抽出や加圧加熱抽出、過熱蒸気抽出、二酸化炭素を用いた超臨界抽出や、液化炭酸ガス抽出などの手法が例示され、所望に応じて、これらの抽出をくり返したり、１種又は２種以上を組み合わせたりすることも可能である。

設備の面、簡便性の面、操作の容易性や労働安全性等の面から、水を溶媒とした加熱抽出が好適例として例示されるが、グァバの葉を原料とした場合、水温は１５℃から２００℃までのいずれの温度でも抽出可能であり、必要であれば加圧して抽出しても良く、好適には５０℃以上、更に好適には８５℃以上、特に好適には９５℃以上の抽出温度（９５〜１００℃）が好ましい。

抽出時間は５分〜１２０分の間で適宜定めればよい。通常、８５℃、８分の抽出処理でも本発明の有効成分は抽出されるが、本発明の成分は抽出温度が高いほど効率よく原料から抽出され、９５℃の抽出温度では通常１５分以上、より好適には３０分から６０分の抽出時間が望ましい。抽出時間が１２０分を越えると葉部からペクチン等の可溶性食物繊維の溶出が激しく、その後の精製処理が難しくなる。有機溶媒、有機溶媒と水の混液の場合も、上記に準じて行えばよい。

本発明の細菌増殖抑制剤は、上記の方法で得られたグァバ抽出液を有効成分とするものであるが、より好ましくはこの抽出液から難溶解性成分や着色成分、風味成分を取り除いた精製エキスとすることが望ましい。精製エキスの精製法としては、アンバーライト系の樹脂といった合成吸着樹脂やフィルターや膜を用いた濾過等の方法が挙げられ、アンバーライト系の樹脂、例えば（株）オルガノ社製のＸＡＤ１６のアンバーライト樹脂を用いる場合、あらかじめ水に十分浸漬した樹脂に、上記の方法で得られたグァバ抽出液を通し吸着させ、エタノール、メタノール等の有機溶媒で溶出する方法が利用できる。溶出に用いる有機溶媒は、抽出に用いた有機溶媒がそのまま使用できるほか、水または水と有機溶媒の混液も使用可能である。エタノール水を用いた場合、本発明に係る有効成分は、５〜９５％、好ましくは１０〜７５％のエタノール水で溶出される。また、合成吸着樹脂としては上に例示したものの他、各種の逆相系樹脂が広く使用できる。

すなわち、グァバの抽出液が本発明における有効成分であるが、所望する場合、この抽出液を合成吸着樹脂に供した後にエタノール水等で溶出することにより、有効成分の濃度を高めることができ、このようにして精製した精製エキス、そしてこれを更に分画して得た特定画分も本発明の有効成分として使用できる。

図２はグァバ葉を８５℃の温水で８分間抽出し得られた抽出液の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。同条件で得られた成分のうち、溶出時間１０分から１３分の間に存在する成分が本発明で得られた抗菌性成分であり、上記の精製方法で１０％から７５％、より好ましくは２０％から４０％のエタノール水で樹脂から溶出した区分に特異的に多く含まれていることから、このような精製処理を行うことで、より効果の強い精製エキスを得ることが可能となる。

また、図２の後半のピーク、つまり溶出時間２０分以降に存在する成分も本発明で得られた抗菌性成分であって、この中には、先願発明においてはじめて見出した２種の新規抗菌性化合物（モリン−３−Ｏ−α−Ｌ−リクソピラノシド、モリン−３−Ｏ−α−Ｌ−アラボピラノシド）のほか、抗菌性を有するこれらの類縁体（モリン、ケルセチン及びそれらの配糖体）も含まれている。

先の発明で得られた２種の新規抗菌性化合物は、上記したように図２の後半（溶出時間２０分以降、通常、２０分〜３０分の間）に出現する成分に含まれるが、この抗菌性成分（つまり、後半のピーク）は、よりエタノール濃度の高い区分、例えば５０％以上（５０〜９８％、好ましくは６０〜９５％）のエタノール水で効率よく溶出される。なお、この際、抗菌性のないあるいは低いモリン及びケルセチンの類縁体も同時に溶出される場合がある。特に、モリン及びケルセチンの類縁体は葉部に高濃度に含有される成分であるが、茶褐色を呈し、水溶性が悪く、苦味など強い呈味を有する成分であることから、飲食品や化粧品、医薬品等の製品の助剤として利用する場合は、取り除いたほうが望ましい成分であるといえる。

上記の精製処理を行うことで、これら成分の大部分を取り除くことが可能であることから、得られた精製エキスは、より水溶性が増し、呈味、呈色が抑えられ、飲料や食品へ添加しやすい性状となる。
また、精製エキスは、フリーズドライなどの方法により乾燥させることもでき、乾燥物のほか、濃縮物、ペースト化物、あるいは乳化物、懸濁物、希釈物等、精製エキス及び／又は抽出液を各種処理して得た処理物として本発明において使用することもできる。

このように、本発明においては、有効成分として、グァバを原料とした抽出液、精製処理して得た精製エキス、図２に示したグァバ抽出液の特定画分（すなわち、図２の前半に出現する成分：溶出時間１０〜１３分の特定画分１、図２の後半に出現する成分：溶出時間２０分以降に溶出される特定画分２、これらの混合物の少なくともひとつ）、これらの処理物の少なくともひとつが使用される。

これらの有効成分は、いずれもすぐれた細菌増殖抑制作用を示すが、特に、図２の前半に出現する成分（特定画分１）は耐熱性芽胞形成細菌に対してすぐれた増殖抑制作用を示す。したがって、特定画分１を含有する成分は、耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制作用も示す。

本発明における細菌増殖抑制剤は、グァバを原料とした抽出液、より好ましくは精製処理を行った精製エキスを有効成分とするものであり、野菜、果実、豆類、穀類、茶類、香辛料、魚介類、畜肉類、清涼飲料、粉末食品、カップベンダー用粉末飲料などの加工食品等に直接ないし間接的に用いる保存料及び／又は品質向上剤等としても好適に使用できるものとなる。

本発明における細菌増殖抑制剤の加工飲食品や香粧品等に対する配合量は、清涼飲料など用途により異なるものであるが、加工食品の全量に対して、１００ｐｐｍ（０．０１％）から１０％である。細菌増殖抑制剤の配合量が１００ｐｐｍ未満であると、目的の細菌への増殖抑制効果を発揮することができず、また、１０％を越えた場合は、目的の細菌への増殖抑制効果は変わらず、不経済であり、また、不必要な呈色を示し、品質劣化を招く原因となることがある。

本発明に係る有効成分は、後記するところから明らかなように、すぐれた細菌及び／又は耐熱性芽胞形成細菌を包含する各種細菌に対してすぐれた増殖抑制作用を示すだけでなく、本来、天然物由来であるだけでなく、グァバ葉として長期間飲用されているように安全性が高く（事実、１日当り１００ｍｇの化合物をラットに対して経口投与したが、１５日間経過後においても急性毒性は認められなかった）細菌増殖抑制剤として各種用途に広範に使用することができる。

本発明に係る有効成分化合物は、飲食品に対して直接ないし間接的に添加して、飲食品用の日持ち向上剤及び／又は保存料として使用したり、抗カビ剤あるいは果実や野菜等青果物の貯蔵や輸送時の腐敗防止剤（例えばポストハーベスト農薬の代替物）として使用できるほか、医薬品や化粧品あるいは工業薬品の腐敗、変質を防止する細菌増殖抑制剤としても使用可能である。

また、本発明に係る細菌増殖抑制剤は、医薬品としても使用可能であって、有効成分化合物をそのまま又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば０．１〜９９．５％、好ましくは０．５〜９０％含有する医薬組成物として投与される。

担体としては、固形、半固形、又は液状の希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤の一種以上が使用される。本発明医薬組成物は、経口、組織内、局所、経腸投与がそれぞれ可能であって、経皮など外用剤としても使用可能であり、常法にしたがって、これらの投与に適応した剤型に製剤化すればよい。その用量としては、患者の年齢、体重、投与経路、疾病の種類等にしたがって適宜定める。通常は、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、１０〜２０００ｍｇの範囲が一般的であるが、この範囲はひとつの目安であって、必要に応じて増減すればよい。

なお、本発明における検討から、茶類の分析で汎用されるタンニン測定法（酒石酸鉄比色法）で得られた数値も、精製エキスの添加量の目安として使用することが可能であり、タンニン測定法で５ｍｇ／１００ｍｌ以上のエキスを添加することで細菌への増殖抑制効果を発揮することができる。

以下に本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

＜実施例１：新たな抗菌活性ピークの同定＞
グァバ葉抽出エキスの抗菌活性成分を明らかにするため、グァバ葉３００ｇを８５℃の熱水９Ｌで８分間浸し得られた抽出液８Ｌをアンバーライト系樹脂（ＸＡＤ１６：（株）オルガノ社製）に通し、グァバ葉抽出液中の成分を吸着させた後に、エタノール濃度を０から１００％まで１０％ずつ段階的に変えた水溶液で分画し、各画分を粉末化した。

標準寒天培地（ＳＭＡ）に、得られた粉末を１％添加した培地に、耐熱性芽胞形成細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＩＦＯ３３６６））を接種し、抗菌活性が高い区分を調査した結果、３０％エタノールで回収した区分に最も強い抗菌活性が確認された（表１）。

表中、抗菌活性の強さは＋の数で表わし、−は活性がないことを示す。上記表の結果から抗菌活性が確認された３０％エタノール抽出画分について、以下の条件にて含有成分の分析を実施した。そして得られた結果を下記表２に示した。但し表中、数値はＰＤＡ検出器で得られたＵＶ−ｍａｘのＨｅｉｇｈｔ値を示す。

（含有成分の分析条件）
使用機器 高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ−１０ＡＤ：以下ＨＰＬＣとする）およびフォトダイオードアレイ検出器（島津製作所製ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ：以下ＰＤＡ検出器とする）

ＰＤＡ検出器条件 λ＝１９０−４５０ｎｍ
仕様カラム ＬＵＮＡ ５μＣ１８ ２．０×２５０ｍｍ（Ｎｏ．ＯＯＧ−４２５２−ＢＯ 島津製作所製）
カラム温 ４０℃
溶媒 Ａ：メタノール Ｂ：１％酢酸 ０ｍｉｎ−２０ｍｉｎ（Ｂ．ｃｏｎｃ９０％→７０％）グラジエント条件
２０ｍｉｎ−３０ｍｉｎ（Ｂ．ｃｏｎｃ７０％→０％）グラジエント条件
溶媒流量 ０．２ｍｌ／ｍｉｎ

表１および表２の結果から、各エタノール回収液の抗菌活性の強さと、各区分の含有成分を比較したところ、Ｒ．ｔｉｍｅ（リテンション・タイム）＝１１．３８ｍｉｎに見られるピークの値と抗菌活性の間に相関が見られた。このピークを分離するため、８５℃熱水−８分間抽出したグァバ抽出液を以下の条件にて図１に示した様にさらに細かく分離した。

（分取カラム分離条件）
・使用機器 分取用ＨＰＬＣ及びＰＤＡ検出器（島津製作所製：ＬＣ−８Ａシリーズ）
・ＵＶ検出器条件 λ＝２３５ｍｍ
・仕様カラム ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５３−１５１Ａ（ＹＭＣ製）カラム温度：室温
・溶媒 Ａ−メタノール：Ｂ−水＝１５：８５イソクラティック条件（Ｆｒｃ ＡからＤに分離）
Ａ−メタノール：Ｂ−水＝１０：９０イソクラティック条件（Ｆｒｃ Ｂ−１からＢ−４に分離）

図１のように分離したフラクション（以下Ｆｒｃとする）ＡからＤ、およびＦｒｃ Ｂをさらに細かく分離したＦｒｃ Ｂ−１からＢ−５について、以下に示した方法にて、抗菌活性を試験し、使用菌株を抑制する各フラクションの添加濃度（添加量）を確認した（表３）。

・抽出方法 ８５℃熱水−８分間抽出
・検証物質 分取ＨＰＬＣにて分離した区分Ｆｒｃ ＡからＤ（図１参照）
・基礎培地 標準寒天培地（ＳＭＡ）
・使用菌株 Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（ＩＦＯ１５３０５Ｔ）（初期菌数；５．６×１０¹ｃｆｕ／シャーレ）

以上の試験結果から、表２に示した測定条件においてＲ．ｔｉｍｅ＝１１．３８ｍｉｎに見られるピーク成分を含むＦｒｃ Ｂ−４がグァバ葉熱水抽出エキスの抗菌活性に大きく寄与している事が明らかになった。本発明でＦｒｃ Ｂ−４で得られた成分と既に報告されているグァバ葉由来の抗菌物質５種（ケルセチン、ケルセチン−３−アラビノサイド、モリン、モリン−３−アラビノサイド、モリン−３−リクソサイド）を比較した結果、今回発明で新たに得られた抗菌活性ピークとは異なる区分（Ｆｒｃ Ｃ）にそれらが存在する事を確認した（図２）。

本発明で新たに得られた抗菌活性ピーク（図２）
表２のＨＰＬＣ条件にてＲ．ｔｉｍｅ＝１１から１１．５ｍｉｎにて測定される
最大吸収波長 λ＝２３２ｍｍ
分子量 Ｍ．Ｗ．＝２８８、３０２（島津製作所製：ＬＣ−ＭＳ ＱＰ−８０００にて測定）
粉末形状 淡黄色
溶解性 水、エタノール、メタノールいずれも可溶
融点 未確認
融点 未確認
比重 未確認
（エラグ酸（Ｍ．Ｗ．＝３０２）およびタンニン（Ｍ．Ｗ．＝２８８）の重合物と推測される）

本発明においては、上記した図２の前半に出現する抗菌活性ピークを示す特定画分１、図２の後半に出現する抗菌活性ピークを示す特定画分２（この中に先の発明で新たに見出した新規抗菌性物質（モリン−３−Ｏ−リキソシド、モリン−３−Ｏ−アラビノシド）が含まれている）、これらの混合物の少なくともひとつが有効成分として使用される。

＜実施例２：新たな抗菌活性ピークおよび新規モリン配糖体の抽出条件＞
次に、本発明で特定した新規抗菌活性ピークおよび、先に報告した新規モリン配糖体の精製条件について検討を実施した。より効率良くグァバ葉から目的成分を抽出するために、抽出時の水温及び抽出時間について、茶葉の抽出に実際に用いられるニーダー装置を用いて検討を行なった。各区分とも、使用したグァバ葉は４５０ｇ使用し、抽出水は１３．５Ｌ使用した。以下に抽出効率について検討を行った５種の化合物について記す。なお、Ｃｏｍ Ａは今回新たに分画するのに成功した新規抗菌活性を有する成分（特定画分１）を示す。

Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ（Ｃｏｍ Ａ：本発明により見出されたピーク）
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｉ（Ｃｏｍ I：Ｍｏｒｉｎ−３−Ｏ−ｌｙｘｏｓｉｄｅ）
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ II（Ｃｏｍ II：Ｍｏｒｉｎ−３−Ｏ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ III（Ｃｏｍ III：ｇｕａｉｊａｖｅｒｉｎ）
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ IV（Ｃｏｍ IV：ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）

検討を行うにあたり、まず水温について１５℃から９５℃の間で、抽出時間を６０分と一定条件にして検討を実施した。実施した結果を表４−１に示す。なお表中、数値はｈｅｉｇｈｔ（ＰＤＡ検出器数値）を示し、％は各精製画分中に各化合物の占める割合を示す。

なお上記したように表４-１に示した数値は、各化合物の分析の際に得られたＰＤＡ検出器の数値（ｈｅｉｇｈｔ）であり、横に示した％は液全体のピーク総和（Ｔｏｔａｌのｈｅｉｇｈｔ値）のうち各化合物の占める割合を示した数値である。すなわち、横に示した％の数値が多いほど、該当化合物が割合として多く含まれる抽出液が得られることが示される。この結果から、今回検討している５種の化合物は抽出温度による影響が非常に大きく、この中では９５℃で最も抽出効率が良いことが示された。低温（１５℃）では本発明で得られた成分（Ｃｏｍ Ａ）の割合が多い液が得られるものの全体的な抽出率としては悪く効率が悪いことから、抽出の際にセルラーゼやペクチナーゼなど抽出効率を上げるような酵素の併用や、あらかじめ茶葉を微粉砕しておくなどの処理が望ましい。

先ほどの検討から抽出温度を９５℃に固定し、抽出時間を８分から１２０分まで段階的に設定した検討を実施した（表４-２）。なお、表中、単位はｈｅｉｇｈｔ（ＰＤＡ検出器数値）を示し、％は各精製画分中に各化合物が占める割合を示す。

この結果から、９５℃で抽出した場合、１５分の時点で目的の５種化合物の抽出率はかなり大きくなっており、１５分以上の抽出時間をとることで効率よく抽出できることが明らかとなった。抽出時間が長くなると抽出率も徐々に上がってくるが、長時間加熱するとペクチンなどの可溶性食物繊維の溶出が激しくなり、その後の精製処理に非常に面倒になることから抽出時間は６０分以内とすることが望ましい。

以上の検討結果から、本発明で特定された新規抗菌活性ピークおよび新規モリン配糖体、ケルセチン類の抽出条件は、９５℃で１５分から１２０分、望ましくは３０分から６０分の条件で抽出することが望ましいとの結果が得られた。得られたグァバ葉抽出液をアンバーライト系樹脂（ＸＡＤ１６：オルガノ製）に吸着させた後に４０％エタノール水溶液で回収する事で本発明で得られた抗菌活性区分が効率良く回収することが可能である。また、所望に応じて、更にクロマト処理することにより、細菌増殖抑制作用を有する特定画分１、２に分画することができ、特に特定画分１は耐熱性芽胞形成細菌増殖抑制作用が強いという点で特徴的である。

＜実施例３：新たな抗菌活性ピークの抗菌活性＞
グァバ葉を８５℃、８分間の熱水抽出に供し、得られた抽出液を、該樹脂吸着後、４０％エタノール水溶液で回収し粉末化することで得られた精製エキスについて、標準寒天培地（ＳＭＡ）を用い、細菌の中でも代表的な以下の４菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（ＩＦＯ１５３０５Ｔ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＩＦＯ３３６６）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＩＦＯ１５０３５）について抗菌効果を確認した（表５）。菌種により若干効果濃度に差は見られるものの、いずれも２５０ｐｐｍの添加量で菌の増殖を抑制する効果があることが確認された。

菌種名の下の数値は初期菌数の値。
＋：菌の増殖あり（抗菌活性なし） −：菌の増殖なし（抗菌活性あり）

＜実施例４：飲食品への添加による細菌増殖抑制効果１＞
細菌増殖抑制効果が確認された上記グァバ抽出液精製エキスについて、実際の飲食品に添加した場合にも同様の細菌抑制効果が得られるかどうか確認の検討を実施した。本検討では、緑茶飲料および緑茶粉末に細菌を摂取し菌の増殖を確認した。一般的に緑茶飲料のように栄養分が乏しく、かつ抗菌活性があるカテキン類を含む内容物中では、通常の細菌は増殖しにくいとされているが、今回、実施例に用いた缶詰変敗菌（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）は、このような特異的な条件でも増殖可能な菌株であり、製造ラインの汚染など何らかの原因で内容液中に混入した場合、大きな問題となる場合がある。今回の検討では、この菌株を接種したモデル液に、本発明で得られた成分を添加することにより、このようなリスクを低減できるかどうか検証を実施した。

また、これまでの検討から抗菌活性区分には酒石酸鉄比色法で検出される成分も含まれており、実製造時の簡便性を考慮し、茶飲料などで用いられるタンニン測定法（酒石酸鉄比色法）の分析値を指標として有効添加濃度の検討を実施した。モデルとしては緑茶、ブレンド茶の茶飲料を用い、以下の８タイプの内容液を耐熱ＰＥＴボトルに詰めて試験を実施した。

なお、前述のように、緑茶中にはカテキンなど抗菌活性を有するタンニンが含まれており、これらもタンニン測定法（酒石酸鉄比色法）で検出されるため、各実験区ではタンニン測定法により総タンニン量（酒石酸鉄比色法測定量）が５０ｍｇ／１００ｍｌに均一になるようにグァバ精製エキスを添加した（表６）。

（試験サンプルの製造法）
緑茶７．５ｇを６０℃の水２６０ｍｌで抽出し、重曹０．３ｇ、ビタミンＣ ０．４ｇを添加した後に、調合液のタンニン量が５０ｍｇ／１００ｍｌになるように下記の表の割合でグァバ抽出液精製エキスを加え、１０Ｌの調合液を調整した。各区分ともＵＨＴ殺菌後、耐熱性ＰＥＴボトルにホットパックし、缶詰変敗菌（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）を接種した後に、横転保持殺菌し、３０℃まで冷却した。

なお、本検討で用いたグァバエキスは８５℃の温水で８分間抽出した液と、８５℃の温水で２時間抽出を行った液の２種類をそれぞれ樹脂吸着後４０％エタノール水溶液で回収し粉末化したサンプルを用いた。なお、充填容器としては３５０ＰＥＴボトルを用い、培養条件は３７℃恒温、１ヶ月間とした。

缶詰変敗菌を接種した各サンプルを３７℃恒温条件にて１ヶ月間保存したところ、区分１および区分５において接種菌の増殖によるｐＨの低下が確認された。グァバエキス添加区分で変敗した区分はタンニン量で２．５６ｍｇ／１００ｍｌの区分（区分５）のみで、タンニン量として５ｍｇ／１００ｍｌ以上の添加量で緑茶内容液の変敗を防止する効果が認められた。この結果は再現試験においても同様の効果が認められ、タンニン測定法により得られるタンニン分析値も本サンプルの抗菌力の指標となりうる事が示された（表７）。

＜実施例４：飲食品への添加による細菌増殖抑制効果２＞
また、茶飲料以外の使用例として、粉末茶（緑茶粉末）へ添加した際の抗菌効果についても検討を実施した。９５℃の温水で２時間抽出処理し樹脂吸着後４０％エタノール水溶液で回収、粉末化したグァバ精製エキスを以下の条件で粉末茶と混合し、大腸菌に対する抗菌効果を検証した（表８）。

・使用菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ（ＩＦＯ３３６６）（初期菌数；８．０×１０⁰ｃｆｕ）
・検体 粉末茶（Ａ）滅菌ビン（粉末茶１．５ｇ；滅菌水１００ｇ）→Ｅ．ｃｏｌｉ接種
（Ｂ）滅菌ビン（粉末茶１．５ｇ；滅菌水１００ｇ；検証物質０．０５ｇ）
→（Ａ）と同菌数のＥ．ｃｏｌｉ接種
・検体保管 （Ａ）（Ｂ）とも３０℃保管。０／２４／４８／７２時間後に菌数測定

その結果、グァバエキス無添加区では粉末茶を溶解した後、大腸菌の増殖が見られたのに対し、グァバエキス添加区では大腸菌の増殖が抑制される効果が得られた。粉末茶は自動給茶機等で利用される場合があり、構造上、装置内に残液が残る場合が多い。使用頻度にもよるが、このような残液が放置されることにより大腸菌の増殖の危険性が高まるため、あらかじめ抗菌成分を粉末茶に配合しておくことで、このような残液が放置された場合でも大腸菌の増殖を抑えることが可能となる。本検討の結果から、粉末茶に３％程度グァバエキスを加える事で、粉末茶を水で戻した際に起こる大腸菌の経時的な増殖を押さえることが可能であることが示された。

グァバ葉抽出液（８５℃温水８分間抽出）の高速液体クロマトグラフである。 グァバ葉抽出液の高速液体クロマトグラフィーによる抗菌活性を有する特定画分の分画を示す。

Claims (5)

1. グァバの葉部を８５〜１００℃の熱水で１５〜１２０分間抽出した後、合成吸着樹脂に供し、３０〜４５％エタノールで溶出して得た精製エキスを有効成分としてなること、を特徴とする難溶解性成分や着色成分、風味成分を取り除いた細菌増殖抑制剤。
2. グァバの葉部から抽出して得た下記分析データで示される成分のみを有効成分としてなること、を特徴とする難溶解性成分や着色成分、風味成分を取り除いた細菌増殖抑制剤。
   分析データ：分析用ＯＤＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製分析用ＯＤＳカラム、ＬＵＮＡ５μＣ１８ ２．０×２５０ｍｍ）を用いて、カラム温度４０℃、流速、０．２ｍｌ／分、メタノール／１％酢酸−水（０→２０分：１０／９０→３０／７０、２０→３０分：３０／７０→１００／０）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイーにおいて、同条件で検出されるモリン、ケルセチンおよびそれら配糖体より必ず前に溶出される成分（溶出時間：１０分から１３分の成分）。
3. グァバの葉部から抽出して得た下記分析データで示される成分のみを有効成分としてなること、を特徴とする難溶解性成分や着色成分、風味成分を取り除いた細菌増殖抑制剤。
   分析データ：分析用ＯＤＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製分析用ＯＤＳカラム、ＬＵＮＡ５μＣ１８ ２．０×２５０ｍｍ）を用いて、カラム温度４０℃、流速、０．２ｍｌ／分、メタノール／１％酢酸−水（０→２０分：１０／９０→３０／７０、２０→３０分：３０／７０→１００／０）を溶出液として行った高速液体クロマトグラフイーにおいて、同条件で検出されるモリン、ケルセチンおよびそれら配糖体より必ず前に溶出される成分（溶出時間：１１分から１１．５分の成分）。
4. 細菌が耐熱性芽胞形成細菌又は大腸菌又は黄色ブドウ球菌（食中毒原因菌）であること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌増殖抑制剤。
5. グァバの葉部を８５〜１００℃の熱水で１５〜１２０分間抽出した後、合成吸着樹脂に供し、３０〜４５％エタノールで溶出して精製エキスを得ること、を特徴とする難溶解性成分や着色成分、風味成分を取り除いた細菌増殖抑制剤の製造方法。

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