CN111432798A - 包含木槿花提取物的用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤或用于抑制抗菌肽的组合物 - Google Patents
包含木槿花提取物的用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤或用于抑制抗菌肽的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本说明书涉及一种包含作为有效成分的木槿花提取物的组合物，尤其，涉及一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物及用于抑制抗菌肽的组合物，该组合物将作为表达量因微尘而受影响的皮肤细胞内基因的选自IL‑36G(NM_019618)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)及S100A7(NM_002963)中的一种或多种基因的表达量调节至正常水平，以及将作为抗菌肽的S100A7(NM_002963)的表达量调节至正常水平。通过利用所述用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物及用于抑制抗菌肽的组合物，可将因微尘而改变的基因表达量恢复为正常水平，从而护理皮肤细胞的损伤，可使因各种原因而增加的抗菌肽的表达量恢复为正常水平。
Description
技术领域
本说明书涉及一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤、或用于抑制抗菌肽的组合物。更详细地，涉及一种包含木槿花提取物的组合物，该组合物通过显着改变作为表达水平与正常状态的皮肤细胞相比、因微尘而改变的皮肤细胞基因的生物标志物等，来护理皮肤细胞损伤，或者显着改变表达水平与正常状态的皮肤细胞相比、因各种原因而改变的抗菌肽的表达水平。
背景技术
皮肤作为直接暴露于外部环境的身体部位，不仅起到保护人体重要器官的保护屏障的作用，还起到调节水分蒸发和保护身体免受外部感染的作用。然而，即使皮肤能阻挡来自外部的病毒渗透，但如果暴露于过度的紫外线或污染物质也会诱发皮肤刺激，尤其，伴有强风和沙尘的黄沙会使皮肤受到损伤。
黄沙是漂浮在位于中国和蒙古等内陆的沙漠的小沙或黄土乘着上层风被运送至远方而降落到地面附近的现象。在韩国，每到春天都会周期性地出现黄沙。黄沙为有机物和无机物的复合体，其物理性质和组成成分会根据发生时期与地点而非常多样，还包含有可从生物学角度产生影响的金属成分。如黄沙等尺寸较大的颗粒主要停留在发源地或其周边，其中颗粒尺寸小的粉尘流入韩国，据报道，吸入这些粉尘时，它们会沉积到下支气管及肺的换气部位，从而可引起呼吸系统的损伤。此外，已观察到，在黄沙、粉尘较多的地区居住的人的皮肤，皮肤细胞的损伤会增加。
抗菌肽在功能方面与抗生素相似，是一种已知能够增强免疫力的物质，近来备受关注。
抗菌肽是微生物、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物针对来自外界的微生物入侵所具有的非特异性免疫防御系统的一种。从结构上讲，其在序列内包含许多带正电荷的氨基酸，并且对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌、以及癌细胞表现出广谱抗菌活性。
当这些肽结合到细胞膜上时，会在细胞膜上形成离子通道，从而抑制微生物的能量生成，或在细胞膜上形成大孔，从而最终杀灭细胞。如上所述，其特征在于，具有在短时间内用非特异性且有效的物理方法来破坏细胞膜的作用机制。
但是，过量的抗菌肽可能会产生不利影响。例如，众所周知，S100蛋白家族成员之一的S100A7即为抗菌肽。尽管确切的机制尚不清楚，但已知，当用重组S100A7肽进行处理时，会损害表皮分化，以及在诸如患有特应性皮炎(AD)及牛皮癣(psoriasis lesions)的皮肤细胞中存在过量的抗菌蛋白S100A7时，抗菌蛋白S100A7在表皮分化中充当负调节因子(negative regulator)(参考非专利文献1)。
因此，有必要抑制皮肤细胞中的抗菌肽，以作为治疗皮肤细胞损伤的一个手段。
【现有技术文献】
【非专利文献】
(非专利文献1)孙等人，“S100A7(psoriasin)通过IκB/NF-κB信号传导增强IL-6分泌来抑制人体表皮分化(S100A7(psoriasin)inhibits human epidermaldifferentiation by enhanced IL-6secretionh through IκB/NF-κB signalling)”，实验皮肤病学2016年8月；25(8)：636-41。
(非专利文献2)金等人，“空气PM2.5对人角质形成细胞的有害影像的转录组分析(Transcriptome analysis of airborne PM2.5-induced detrimental effects onhuman keratinocytes)”，毒理学快报273，26-35，2017年。
发明内容
技术问题
在一个方面，本发明的目的在于提供一种用于抑制抗菌肽的组合物。
此外，本发明人发现微尘对皮肤产生有害影响，而这种影响也会对皮肤细胞基因的表达产生影响，从而引起诸如皮肤细胞损伤等的症状。因此，在一个方面，本发明的目的在于提供一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物。
技术方案
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，其包含作为有效成分的木槿花提取物，所述组合物将作为表达量因微尘而受影响的皮肤细胞内基因的选自IL-36G(NM_019618)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)及S100A7(NM_002963)中的一种或多种基因的表达量调节至正常水平。
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供一种用于抑制抗菌肽的组合物，其包含作为有效成分的木槿花提取物，所述组合物将作为抗菌肽的S100A7(NM_002963)的表达量调节至正常水平。
有益效果
在一个方面，通过利用本发明提供的用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，可将因微尘而改变的基因表达量恢复为正常水平，从而护理皮肤细胞的损伤。
在一个方面，通过利用本发明提供的用于抑制抗菌肽的组合物，可使因各种原因而增加的抗菌肽的表达量恢复至正常水平。
附图说明
图1示出了用微尘提取物处理后的细胞存活率，其中ADSP代表亚洲沙尘暴颗粒(Asian dust storm particle)，即黄沙，PM10(Particulate matter 10)代表颗粒尺寸为10μm的微尘，PM2.5(Particulate matter 2.5)代表颗粒尺寸为2.5μm的微尘。
图2a示出了在因PM2.5微尘而受刺激的皮肤细胞中，IL-36G基因的mRNA表达量增加，通过木槿花提取物的处理恢复至正常水平。
图2b示出了在因PM2.5微尘而受刺激的皮肤细胞中，PTGS2基因的mRNA表达量增加，通过木槿花提取物的处理恢复至正常水平。
图2c示出了在因PM2.5微尘而受刺激的皮肤细胞中，XDH基因的mRNA表达量增加，通过木槿花提取物的处理恢复至正常水平。
图2d示出了在因PM2.5微尘而受刺激的皮肤细胞中，S100A7基因的mRNA表达量增加，通过木槿花提取物的处理恢复至正常水平。
具体实施方式
以下，详述本发明。
在本发明的一个方面，所述用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物,可包含作为有效成分的木槿花提取物。
在本发明的一个方面，所述用于抑制抗菌肽的组合物,可包含作为有效成分的木槿花提取物。
木槿花(Hibiscus syriacus L.)属于双子叶植物锦葵目锦葵科的落叶灌木。高度达3m至4m，幼枝多毛，但逐渐会消失。木槿花易于在庭院中种植，可通过种子繁殖，但通过扦插繁殖会易于维护且不改变形态特征。叶子交错且为卵形，通常分为3个，叶缘有锯齿。木槿花的外皮，剥来用作纸张的原料，经干燥后还用作药材。幼叶可食用，花和叶子可作为茶饮。
木槿花是一种抗氧化物质，主要成分为皂草苷(Saponarin)。已知，木槿花的根和表皮含有鞣酸(Tannic acid)，花和叶子含有皂草苷，种子和籽含有锦葵酸(Malvalicacid)、苹婆酸(Sterculic acid)等。
东医宝鉴和本草纲目中记载，根部和表皮可通过煎熬或浸取后进行涂抹或热敷来治疗脚气、痔疮阵痛，花和叶子经干燥并制成粉末后与温水一起服用，可对祛痰、止渴、呕吐、恢复食欲等发挥功效，种子和籽可通过将燃烧其的烟雾熏于患处，用作头痛、偏头痛、脓疮的治疗方法。其他功效包括停止失血、解热、排毒、消肿、睡眠诱导、妇科疾病、疥疮的治疗、止痛及解痉效果、育发及防脱发、支气管炎、咽炎、肠炎、痢疾、脱肛症、杀虫效果等。
过去在韩国，木槿花的叶子经煮熟后被用作救荒作物。木槿花的花瓣用来制作年糕和茶，而木槿花的嫩叶用来制作拌菜、酱汤，根用来泡酒。在欧洲和中国，叶子和花被用作花草茶，花苞经煮熟后被用作皇家料理的香料。此外，从木槿花的树皮获取纤维，以用作制纸原料。
在一个方面，本发明的组合物可利用木槿花的叶、茎、表皮、根、果实、花或花苞、及种子等。具体而言，本发明的组合物可利用木槿花的叶、茎、表皮、根、果实、花或花苞、及种子等的提取物，在一个实施例中，本发明的组合物利用木槿花树皮提取物(Hibiscussyriacus BARK EXTRACT)。
在本发明的一个方面，可使用特定的提取溶剂对所述木槿花进行提取，以形成木槿花提取物。
在本发明的一个方面，可通过使用水或有机溶剂对木槿花进行提取来制备所述木槿花提取物。具体地，可通过使用选自水、C1-C6无水或水合低级醇、丙酮、丁二醇、乙酸乙酯、乙酸二乙酯、二乙醚、苯、氯仿及己烷中的一种或多种提取溶剂，对木槿花进行提取来制备。
在一个方面，所述木槿花提取物可为在室温下提取的提取物。
在一个方面，所述木槿花提取物可为通过用所述提取溶剂提取之后，进一步经蒸发、过滤、浓缩、分离或干燥过程中的一种或多种过程而获得的提取物。尤其，所述木槿花提取物可为进行一次或以上过滤过程的提取物，在一个实施例中，进行二次过滤过程。
在一个实施例中，所述分离过程可包括离心分离过程。
具体地，所述提取可将包括水、C1-C6无水或水合低级醇、丙酮及丁二醇的极性溶剂和包括乙酸乙酯、乙酸二乙酯、二乙醚、苯、氯仿及己烷的非极性溶剂中的一种或多种用作溶剂。
更具体地，所述溶剂可为50％至90％的乙醇水溶液，且可为60％至80％或65％至75％的乙醇水溶液。当所述溶剂为50％至90％的乙醇水溶液时，可从木槿花有效地提取出有效成分。在一个实施例中，所述溶剂可为约70％的乙醇水溶液。
在一个方面，在提取后，可在具有冷却冷凝器的蒸馏装置中以适当温度对所述提取物进行减压浓缩。
不过，根据本发明的木槿花提取物可通过所属技术领域的常规方法提取而获得，并不限于上述的方法。
在本发明的一个方面，基于组合物的总重量，所述组合物中的所述木槿花提取物的含量可为0.000001重量％至30重量％。当含量为0.000001重量％至30重量％时，木槿花提取物对由微尘引起的皮肤损伤的护理效果优异。
具体地，可为0.0000001重量％或以上、0.0000005重量％或以上、0.0000007重量％或以上、0.0000009重量％或以上、0.000001重量％或以上、0.000002重量％或以上、0.000004重量％或以上、0.000006重量％或以上、0.000008重量％或以上、0.00001重量％或以上、0.00003重量％或以上、0.00005重量％或以上、0.00007重量％或以上、0.00009重量％或以上、0.0001重量％或以上、0.0003重量％或以上、0.0005重量％或以上、0.0007重量％或以上、0.0009重量％或以上、0.001重量％或以上、0.01重量％或以上、0.1重量％或以上、1重量％或以上、3重量％或以上、5重量％或以上、7重量％或以上、9重量％或以上、10重量％或以上、13重量％或以上、15重量％或以上、17重量％或以上、19重量％或以上、21重量％或以上、23重量％或以上、25重量％或以上、27重量％或以上、29重量％或以上、30重量％或以上、31重量％或以上，且可为32重量％或以下、31重量％或以下、30重量％或以下、29重量％或以下、28重量％或以下、26重量％或以下、24重量％或以下、22重量％或以下、20重量％或以下、18重量％或以下、16重量％或以下、14重量％或以下、12重量％或以下、10重量％或以下、9重量％或以下、8重量％或以下、6重量％或以下、4重量％或以下、2重量％或以下、1重量％或以下、0.1重量％或以下、0.09重量％或以下、0.04重量％或以下、0.01重量％或以下、0.006重量％或以下、0.001重量％或以下、0.0009重量％或以下、0.0007重量％或以下、0.00005重量％或以下、0.00003重量％或以下、0.00001重量％或以下、0.000009重量％或以下、0.000007重量％或以下、0.000005重量％或以下、0.000003重量％或以下、0.000001重量％或以下、0.0000009重量％或以下、0.0000007重量％或以下、0.0000005重量％或以下、0.0000003重量％或以下、0.0000002重量％或以下、0.0000001重量％或以下、0.00000009重量％或以下，但不限于此。
在本发明的另一个方面，本发明包括所述组合物在护理由微尘引起的皮肤损伤中的用途。
在本说明书中所用的“微尘”是指，人类眼睛不可见的非常小的物质，且长时间漂浮或飘散在大气中的颗粒状物质，且粒径为10μm或以下的物质。尤其，将粒径为2.5μm或以下的颗粒状物质称为“超微尘”，在本发明中，“微尘”旨在包括“超微尘”。
在本说明书中所用的术语“护理”是指，有效保护皮肤细胞以免受刺激，抑制、防止或恢复(复原)由所述刺激引起的特定基因表达量的变化。
在本发明的另一个方面，提供一种用于护理受试者的由微尘引起的皮肤损伤的方法，所述方法包括将有效量的木槿花提取物给药于所需的受试者。
在本发明的另一个方面，提供一种木槿花提取物在制备用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物中的用途。
在本发明的另一个方面，提供一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的木槿花提取物。
在一个方面，本发明是通过在因微尘而受损伤的皮肤细胞中将特定基因的表达量调节至正常水平，来提供用于抑制由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物。
具体地，在本发明中，表达量因微尘而受影响的皮肤细胞内基因可包括IL-36G(NM_019618)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)及S100A7(NM_002963)等。所述IL-36G(NM_019618)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)及S100A7(NM_002963)是其表达量因微尘而增加的基因，因此通过抑制这些基因的表达量以调节至正常水平，可抑制皮肤细胞的损伤。
在本发明中所涉及的表达量因微尘而增加的基因示于[表1]中。[表1]中示出了表达量因微尘而增加的基因，在这些表中，名称是指NCBI的基因库登录号(genebankaccession ID)，基因符号是指官方基因符号，基因全称是各个基因的名称。这些内容可通过非专利文献2中的描述来确认。
【表1】
在本发明的另一个方面，本发明包括所述组合物在抑制抗菌肽中的用途。
在本发明的另一个方面，本发明提供一种用于抑制受试者的抗菌肽的方法，所述方法包括将有效量的木槿花提取物给药于所需的受试者。
在本发明的另一个方面，本发明提供一种木槿花提取物在制备用于抑制抗菌肽的组合物中的用途。
在本发明的另一个方面，本发明提供一种用于抑制抗菌肽的木槿花提取物。在一个方面，本发明提供一种通过将皮肤细胞中特定基因的表达量调节至正常水平来抑制抗菌肽的组合物。
具体地，在本发明中，抗菌肽S100A7(NM_002963)的表达量可能因多种原因而受到影响，当所述抗菌肽S100A7(NM_002963)的表达量由于这些原因而增加时，可利用所述组合物对这些基因的表达量进行抑制以调节至正常水平，从而可抑制抗菌肽。
在本发明中所涉及的表达量因多种原因而增加的基因示于[表2]中。[表2]中示出了表达量增加的抗菌肽基因，在这些表中，名称是指NCBI的基因库登录号(genebankaccession ID)，基因符号是指官方基因符号，基因全称是各个基因的名称。这些内容可通过非专利文献2中的描述来确认。
【表2】
可以使用微阵列、PCR、NGS(第二代测序技术；Nest Generation Sequencing)、蛋白质印迹法、诺瑟印迹法(Northern blot)、ELISA法、放射免疫测定法、放射免疫扩散法、组织免疫化学染色法、免疫沉淀分析法等本领域已知的各种分析方法，对所述基因或蛋白质的表达量进行分析。
在本发明的一个方面，所述组合物可为化妆品组合物，可为药物组合物，且可为保健食品组合物。
所述化妆品组合物可为，例如各种霜、乳液、爽肤水等的化妆品类，以及清洁剂、洗面剂、香皂、美容液等。
在一个方面，添加有本发明的所述包含木槿花提取物的组合物的化妆品组合物可采用溶液、乳液、粘性混合物等的形式。
即，在一个方面，本发明的化妆品的剂型没有特别限制，例如可为乳液、霜、化妆水、精华素、面膜、凝胶、粉剂、底妆液、粉底、滋润乳、软膏、贴剂、美容液、洁面泡沫、卸妆霜、卸妆水、润肤乳、润肤霜、润肤油、润肤精华、洗发剂、护发剂、沐浴剂、香皂、染发剂和喷雾剂等剂型。
在各种剂型的化妆品组合物中，除了所述木槿花提取物以外，本领域技术人员可根据其他化妆品的剂型或使用目的毫无困难地适当选择和配制其他成分。
此外，在一个方面，本发明的化妆品可包括选自水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多糖、鞘脂和海藻提取物中的物质的组合物。
在一个方面，除了所述必须成分以外，本发明的化妆品根据需要还可调配常规化妆品中所使用的其他成分。
除此之外还可添加的调配成分可为有机成分、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机颜料和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、醇、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。
此外，除此之外还可添加的调配成分不限于此，并可在不损害本发明的目的和效果的范围内调配上述任何成分。
在一个方面，本发明的包含木槿花提取物的药物组合物，可进一步包含通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂及稀释剂。
作为其剂型，按照常规方法，所述包含木槿花提取物的药物组合物可通过制备成包括片剂、胶囊剂、散剂或糖浆剂等的口服剂，或软膏剂、凝胶剂、霜剂、贴剂或喷雾剂等的外用剂的任何适于药物制剂的形式来使用。
应当理解，通常通过所述药物组合物而给药的有效成分的实际剂量，应根据症状的严重程度、所选择的给药方式、受试者的年龄、性别、体重和健康状况等各种相关因素来确定。通常，有效成分的给药剂量可为0.0001mg/kg/天至3000mg/kg/天，例如10mg/kg/天至500mg/kg/天。
在本发明的一个方面的保健食品组合物中，保健食品是使用在日常膳食中易缺乏的营养素、或对人体具有有利功能的原料或成分(功能性原料)来制造的，可指通过维持人体的正常功能或激活生理功能来维持和改善健康的食物，但不限于此。所述保健食品可制备、加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体剂、丸剂等形式，但不限于此，且可制备、加工成法律允许的任何形式。
具体地，保健饮料组合物除了以指定比例包含作为必需成分的所述化合物外，对其他成分没有特别限制，并且与常规饮料雷同地可包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。天然碳水化合物的实例有常规的糖，如单糖、多糖、环糊精等，以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。除上述以外，作为调味剂可使用天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)及合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
应当理解，通常通过所述保健食品组合物而给药的有效成分的实际剂量，应根据症状的严重程度、所选择的给药方式、受试者的年龄、性别、体重和健康状况等各种相关因素来确定。通常，有效成分的给药剂量可为0.0001mg/kg/天至1000mg/kg/天，例如0.02mg/kg/天至6mg/kg/天。
以下，将参考实施例更详细地描述本发明的构成和效果。但是，提供这些实施例的目的仅在于帮助理解本发明，本发明的范畴和范围并不限于此。
【实施例1】木槿花提取物的制备
所使用的木槿花(Hibiscus syriacus)为morechem公司的种植于庆尚北道的木槿花。使用将纯净水和乙醇以3：7的比例混合的提取溶剂，即70％的乙醇作为提取溶剂，在室温下对木槿花树皮进行提取，并蒸发去除乙醇。在室温提取后，进行一次过滤以去除提取物中所含的固体物质，然后对提取物进行浓缩以去除乙醇，随后对其进行分离和纯化。经过离心分离及二次过滤后进行干燥，以获得木槿花提取物。
【实施例2】微尘的收集与提取
微尘的收集方法为，使用低容量空气采样器(Low Volume Air Sampler；赛福莱博公司，美国佛罗里达)，每个测量日的上午10点左右更换过滤器和采样管，以使过滤袋采集约24小时的样品。每天在首尔的丰下地区(位于京畿道龙仁市处仁区的韩国外国语大学外文学综合研究中心生活馆6层楼顶)收集微尘，为期28天，打开真空泵的同时启动计时器，然后记录关闭真空泵时的时间，以获得测量时间。采集流量设为16.7L/min，在开始测量时用流量计(Model 4143，TSI公司)测量流量，并在测量完成时再次测量流量。在取样前和取样后对过滤袋(filter pack)中的特氟龙(Teflon)过滤器进行称重。在对铁氟龙过滤器进行称重之前，在相对湿度为40％的干燥器(日光公司，日本)中进行24小时的恒量处理，然后用精确到小数点后五位的电子秤(DVG215CD，Ohaus)进行2次称重并记录平均值。取样后也相同地，称重之前在干燥器中进行24小时的恒量处理，进行2次称重，并通过与取样前测量的重量进行比较来计算质量浓度。将特氟隆过滤器浸湿于1mL的乙醇后，加入14mL的DW，在使过滤器的气溶胶收集面与水表面接触的状态下盖上盖子，然后用超声波清洗器施加30分钟的超声波，以进行微尘的提取。为了最大程度地减少过滤步骤中因水分引起的误差，在干燥器(decicator)中48小时内完全去除过滤器的水分，然后使用精度为0.1mg的超精密秤(梅特勒-托利多公司)对过滤器的重量进行称量，以称量过滤器的提取前和提取后的重量。
【实施例3】(正常人)角质形成细胞株的培养
将(正常人)角质形成细胞(Human normal epidermal keratinocytes)购自龙沙公司(龙沙公司，位于美国马里兰州沃克斯维尔)，进行继代培养后，在CO2培养箱中以37℃、5％CO2的条件进行培养。细胞培养液遵循龙沙公司的指南。使用在500ml的KBM-2(KBMTM-2,CC-3103)培养基中使用KGM-2Bullet试剂盒CC-4152(KGM TM-2Bullet kit,CC-4152)，KGM-2Bullet试剂盒CC-4152中添加有BPE(牛脑垂体提取物，Bovine pituitary extract))、人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)、胰岛素(Insulin)、氢化可的松(Hydrocortisone)、转铁蛋白(Transferrin)、肾上腺素(Epinephrine)、及硫酸庆大霉素+两性霉素B(Gentamycin Suflate+Amphofericin-B：GA-1000)。
【实施例4】对(正常人)角质形成细胞株进行微尘处理及细胞毒性的测定
按照Mossman等人(J.Immunol.Methods，65，55-63，1983)的方法进行(正常人)角质形成细胞株的MTT实验，以确认通过微尘处理后的细胞毒性。
具体地，使用24孔板，将在所述实施例3中采集获得的直径为2.5μm的微尘分散在纯净水中，以制备微尘分散液，然后按照实施例4的细胞培养条件，并在每孔的细胞数为2.5×105的条件下，在经培养的细胞中处理上述微尘分散液，并进行24小时的培养，然后与5mg/ml的MTT(溴化3-4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑)混合，在37℃下再进行3小时的培养。之后，除去培养基，将形成的甲瓒晶体(formazan crystal)溶解在500μL的DMSO中。将该溶解物转移并分(aliquot)到96孔板，然后在540nm处测量OD值。测量结果示于图1。
如图1所示，关于分散有2.5μm或以下的微尘的分散液对所述细胞株的细胞毒性，显示出80％存活率的2.5μm或以下的微尘水溶性提取液的浓度(IC20)值为12.5μg/ml。
【实施例5】通过二代测序技术(Next Generation Sequencing)确认微尘下细胞基因的变化
通过参考Trapnell等人(2012)开发的一般分析步骤，来进行RNA碱基序列数据的处理和分析。使用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)确认RNA-序列数据质量，使用FASTX(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)去除准确性较差的碱基和接头序列。之后，使用Tophat(Trapnell等，2009)与人类基因组(hg19)进行比对，并使用重命名为RSeQC的EVER-seq确认各个样品的数据量(Wang等人，2012)。此外，使用Cufflinks对转录物(transcript)的表达水平进行定量，并比较用微尘分散液处理的样品和正常样品之间的转录水平(Trapnell等人，2010)。在FDR校正p值<0.05的情况下，通过应用倍数变化量(fold-change)≥2.0的严格界限，确定在处理直径为2.5μm的微尘的分散液时表现出显着的表达差异的基因。测量结果显示在以下[表3]和[图2a]至[图2d]中。
【表3】
【实施例6】实时RT-PCR定量
用实施例2中提取的直径为2.5μm的微尘，以12.5(μg/1ml细胞培养基)的量对在实施例3中培养的正常人角质形成细胞进行处理，用下表4所示的基因的引物(appliedbiosystems
Primers)来测量相对的mRNA表达量。木槿花提取物使用了在实施例1中制备的提取物。
【表4】
用浓度为20ppm的木槿花提取物对培养基进行处理，在24小时后去除培养液，用2ml的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)对细胞进行洗涤，然后使用Trizol试剂(Trizol reagent；英杰公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)分离细胞内的RNA。使用QIAGEN公司的RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt，QIAGEN公司，加利福尼亚州瓦伦西亚)对分离的RNA再一次进行纯化，然后再使用安捷伦科技公司的2100生物分析仪(Agilent2100BioAnalyzer，安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣塔克拉拉)确认RNA的质量(quality)。使用英杰公司的逆转录试剂盒(Superscript Reverse Transcriptase(RT)kit，英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)从所述RNA合成出cDNA，通过利用了所述表4中引物的实时逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR:real time-reverse transcriptionpolymerase chain reaction)对其进行定量分析。使用应用生物系统公司的TaqMan基因表达检测试剂盒(TaqMan gene expression assay kit，应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特城)并通过实时PCR评估细胞的基因变化，以评估基因的表达模式变化，其结果示于图2a至图2d。所用的Q-RT-PCR和实时PCR均按照生命技术公司发行的标准协议进行，具体地，在95℃下进行20秒的处理，然后将在95℃下进行3秒处理及在60℃下进行30秒处理的工序循环实施40个周期。
如图2a至2d中所示，可确认到，存在表达量在因微尘而受刺激的皮肤细胞中有所增加的基因，而通过木槿花提取物的处理后，白介素36γ(IL-36G)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、黄嘌呤脱氢酶(XDH)、及S100钙结合蛋白A7(S100A7)基因的表达量降低。
因此可知，木槿花提取物可有效地保护皮肤细胞免受微尘引起的刺激，并且抑制或防止上述特定基因的表达量因所述刺激而改变，从而可使表达量处在正常水平内。此外，木槿花提取物可有效地保护皮肤细胞免受抗菌肽的刺激，并且抑制或防止上述特定基因的表达量因所述刺激而改变，从而可使表达量处在正常水平内。
以下，将描述根据本发明的组合物的剂型实施例，虽然可通过各种剂型应用化妆品组合物、药物组合物和保健食品组合物，但其仅出于详细描述的目的，而并不旨在限制本发明。
【剂型实施例1】片剂
将100mg的根据本发明的实施例的木槿花提取物、400mg的乳糖、400mg的玉米淀粉和2mg的硬脂酸镁进行混合，然后按照常规的片剂制备方法进行压片以制备片剂。
【表5】
【剂型实施例2】胶囊
将100mg的根据本发明的实施例的木槿花提取物、400mg的乳糖、400mg的玉米淀粉和2mg的硬脂酸镁进行混合，然后按照常规的胶囊剂制备方法填充至明胶胶囊中以制备胶囊。
【表6】
| 调配成分 | 含量(mg) |
| 木槿花提取物 | 100 |
| 乳糖 | 400 |
| 玉米淀粉 | 400 |
| 硬脂酸镁 | 2 |
【剂型实施例3】颗粒
将50mg的根据本发明的实施例的木槿花提取物、250mg的无水葡萄糖和550mg的淀粉进行混合，使用流化床制粒机模制成颗粒，然后填充到小袋中。
【表7】
| 调配成分 | 含量(mg) |
| 木槿花提取物 | 50 |
| 无水结晶葡萄糖 | 250 |
| 淀粉 | 550 |
【剂型实施例4】香皂
【表8】
【剂型实施例5】乳液(lotion)
【表9】
| 调配成分 | 含量(％) |
| 木槿花提取物 | 5.00 |
| L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐 | 1.00 |
| 水溶性胶原蛋白(1％水溶液) | 1.00 |
| 柠檬酸钠 | 0.10 |
| 柠檬酸 | 0.05 |
| 甘草提取物 | 0.20 |
| 1,3-丁二醇 | 3.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例6】霜
【表10】
| 调配成分 | 含量(％) |
| 木槿花提取物 | 3.00 |
| 聚乙二醇单硬脂酸酯 | 2.00 |
| 自乳化单硬脂酸甘油酯 | 5.00 |
| 鲸蜡醇 | 4.00 |
| 角鲨烯 | 6.00 |
| 三异辛酸甘油酯 | 6.00 |
| 鞘糖脂(Sphingoglycolipid) | 1.00 |
| 1,3-丁二醇 | 7.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【制剂实施例7】软膏
【表11】
| 调配成分 | 含量(％) |
| 木槿花提取物 | 5.00 |
| 聚乙烯醇 | 13.00 |
| L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐 | 1.00 |
| 月桂酰羟脯氨酸 | 1.00 |
| 水溶性胶原蛋白(1％水溶液) | 2.00 |
| 1,3-丁二醇 | 3.00 |
| 乙醇 | 5.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例8】美容液的制备
【表12】
| 调配成分 | 含量(％) |
| 木槿花提取物 | 3.00 |
| 羟乙烯纤维素(2％水溶液) | 12.00 |
| 黄原胶(2％水溶液) | 2.00 |
| 1,3-丁二醇 | 6.00 |
| 浓缩甘油 | 4.00 |
| 透明质酸钠(1％水溶液) | 2.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例9】保健食品
【表13】
【剂型实施例10】保健饮料
【表14】
| 调配成分 | 含量 |
| 木槿花提取物 | 50mg |
| 柠檬酸 | 1000mg |
| 寡醣 | 100g |
| 牛磺酸 | 1g |
| 纯净水 | 余量 |
Claims (12)
1.一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，其包含作为有效成分的木槿花提取物。
2.一种用于抑制抗菌肽的组合物，其包含作为有效成分的木槿花提取物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，基于组合物的总重量，所述木槿花提取物的含量为0.000001重量％至30重量％。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述木槿花提取物为通过使用选自水、C1-C6无水或水合低级醇、丙酮、丁二醇、乙酸乙酯、乙酸二乙酯、二乙醚、苯、氯仿及己烷中的一种或多种提取溶剂进行提取的物质。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述木槿花提取物为从木槿花树皮中提取的物质。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物抑制选自IL-36G(NM_019618)、PTGS2(NM_000963)、XDH(NM_000379)及S100A7(NM_002963)中的一种或多种基因的表达。
7.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述抗菌肽包括S100A7(NM_002963)。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述组合物作用于角质形成细胞。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述微尘的颗粒尺寸为2.5μm或以下。
10.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述木槿花提取物的给药剂量为10mg/kg/天至500mg/kg/天。
11.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为化妆品组合物。
12.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为保健食品组合物。
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