WO2011062263A1 - 医薬組成物 - Google Patents

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陽 櫻井
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    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition.
  • Type A is a zoonotic disease.
  • Influenza A virus has many subtypes due to the combination of 16 types of hemagglutinin (HA) and 9 types of neuraminidase (NA) on the membrane surface. According to the antigenicity of HA, it is classified into low pathogenic virus and highly pathogenic virus, but low pathogenic virus infects only locally (respiratory organs and intestinal tract), whereas HA antigenicity is H5. Type and H7 highly pathogenic viruses infect and propagate organs throughout the body and kill the host.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • Influenza virus When influenza virus infects cells, it is necessary for HA to bind to cell surface receptors. Influenza virus binds to the receptor, enters the cell, and grows inside the cell. In this case, the low pathogenic virus is required to be cleaved by a protease secreted locally outside the cell, thereby acquiring the ability to infect cells, so that HA cleavage and infection are coupled.
  • a highly pathogenic virus is proliferated in a cell and then released to the outside of the cell, the HA is cleaved to acquire the ability to infect cells. Therefore, the highly pathogenic virus present outside the cells is already infectious, so HA cleavage and infection are not coupled. Therefore, highly pathogenic virus HA is called self-cleaving type (Kawaoka, Y. and Webster, R. G., Proc. Natl Acad. Sci. USA vol.85, p.324-328, 1988) .
  • avian influenza virus since the receptor to which influenza virus infects is animal species-specific, avian influenza virus usually does not infect humans. However, it has been pointed out that the avian influenza virus is mutated, the receptor recognition changes, and the risk of infecting humans.
  • An object of the present invention is to provide an influenza virus infection inhibitor.
  • One embodiment of the present invention is an antibody that recognizes a peptide having an RR sequence, particularly the amino acid sequence RERRRKKR (SEQ ID NO: 1), or a fragment thereof, or an expression vector that expresses at least one of them.
  • the antibody or fragment thereof preferably recognizes the RR sequence as an epitope, particularly the amino acid sequence of RERRRKKR (SEQ ID NO: 1).
  • the antibody or fragment thereof may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a further embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an inhibitor that inhibits the cellular transduction action of an RR sequence, particularly RERRRKKR (SEQ ID NO: 1), a cell of a peptide having an amino acid sequence of RR sequence, particularly RERRRKKR (SEQ ID NO: 1) It is an entry inhibitor that inhibits entry into the inside.
  • the inhibitor may be the antibody or a fragment thereof, or an expression vector that expresses any of them.
  • the highly pathogenic influenza virus may be a type A H5N1 subtype.
  • a further embodiment of the present invention is a highly pathogenic influenza virus infection inhibitor that inhibits infection of cells with a highly pathogenic influenza virus, or a medicament for preventing or treating influenza with a highly pathogenic influenza virus, It contains an inhibitor that inhibits the cell introduction effect of the RR sequence, particularly RERRRKKR (SEQ ID NO: 1).
  • the cells preferably do not have a functional influenza virus receptor, and are preferably cells other than those of the respiratory tract and intestinal tract. In the case of cells of the respiratory tract and intestinal tract, the function of the influenza virus receptor is preferred. Is preferably inhibited.
  • the inhibitor may be the antibody or a fragment thereof, or an expression vector that expresses any of them.
  • the highly pathogenic influenza virus may be a type A H5N1 subtype.
  • a further embodiment of the present invention is a method for preventing or treating highly pathogenic influenza viruses, wherein cell transfer of RR sequences, particularly RERRRKKR (SEQ ID NO: 1), into healthy individuals or influenza patients infected with highly pathogenic influenza viruses.
  • Administering an inhibitor that inhibits the action may be the antibody or a fragment thereof, or an expression vector that expresses any of them.
  • the highly pathogenic influenza virus may be a type A H5N1 subtype.
  • it may be administered to the patient while inhibiting the route of infection by the low pathogenic influenza virus, and for example, a neuraminidase inhibitor may be used in combination.
  • the neuraminidase inhibitor is preferably selected from the group consisting of oseltamivir, zanamivir, salts thereof, hydrates thereof, and mixtures thereof.
  • Example of this invention it is a figure which shows that the peptide which has RR arrangement
  • the upper left is a fluorescence signal by GFP
  • the upper right is a signal by antibody staining using an anti-GFP antibody
  • the lower left is a nuclear staining signal by DAPI
  • the lower right is a fluorescence signal by GFP / anti-GFP antibody.
  • This is a triple image of a signal by antibody staining and a nuclear staining signal by DAPI.
  • the four photos in the left column show the nuclear staining signal with DAPI, the four photos in the right column show the signal with antibody staining using anti-GFP antibody, and the top four photos recognize the peptide with RR sequence.
  • the results of an experiment using a GFP-RR fusion protein treated with a polyclonal antibody and a control experiment using a GFP-RR fusion protein treated with rabbit serum before immunization are shown in the lower four photographs.
  • A shows the results of a control experiment using a GFP-RR fusion protein treated with pre-immune rabbit serum
  • B shows an experiment using a GFP-RR fusion protein treated with a polyclonal antibody that recognizes a peptide having an RR sequence. Results are shown.
  • it is a figure which shows that a RR sequence specific antibody has an infection inhibitory effect, when the highly pathogenic influenza virus is infected with respect to the cell which removed the sialic acid of the cell surface by the sialidase.
  • A shows experimental results of infection with highly pathogenic influenza virus treated with PBS
  • B shows experimental results of treatment with serum containing RR sequence-specific antibody.
  • the right figure of B is a photograph of the cell nucleus stained with DAPI.
  • One embodiment of the present invention is an inhibitor that inhibits the cell introduction action of RR sequences, particularly RERRRKKR (SEQ ID NO: 1).
  • the inhibitor is preferably an antibody that recognizes a peptide having an RR sequence (hereinafter referred to as an RR peptide-recognizing antibody), but is not particularly limited as long as it inhibits the cell introduction action of the RR sequence.
  • Aptamer, cyclic peptide Alternatively, a low molecular compound or the like may be used.
  • an antibody it is not particularly limited as long as it structurally inhibits the function of the RR sequence, but it is preferable to recognize the RR sequence as an epitope.
  • This antibody may be monoclonal, polyclonal, or an artificial antibody such as a human antibody. These antibodies can be produced according to production methods apparent to those skilled in the art.
  • the antigen used in that case may be the RR sequence itself, or a hapten or the like may be bound thereto.
  • the RR sequence is a basic amino acid sequence that the highly pathogenic influenza virus has at the HA cleavage site, and consists of amino acids of 5 to 8 bases.
  • RERRRKKR SEQ ID NO: 1 possessed by type A H5N1 subtype influenza virus and its mutant sequence (SEQ ID NO: 2 to 4), and basic amino acid sequence possessed by type A H7 subtype influenza virus (SEQ ID NO: 5-9) (see Table 1).
  • Another embodiment of the present invention may be a fragment of an RR peptide recognition antibody.
  • the antibody fragment is not particularly limited as long as it is a part of an antibody and contains an antigen-binding site containing a variable region.
  • a Fab fragment, an F (ab ′) 2 fragment, or the like can be used. These fragments can be obtained, for example, by partially digesting a monoclonal antibody with a proteolytic enzyme.
  • the proteolytic enzyme may be any as long as it can obtain Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments.
  • a protease such as pepsin or ficin should be used. Can do.
  • Still other embodiments include DNA encoding an RR peptide recognition antibody or fragment thereof, or an expression vector having the DNA and expressing the RR peptide recognition antibody or fragment thereof.
  • DNAs and expression vectors can be produced according to production methods apparent to those skilled in the art.
  • RR peptide-recognizing antibodies or fragments thereof are prepared by preparing an expression vector using a promoter that functions in Escherichia coli or mammalian cultured cells, etc., introducing it into a host cell, and expressing and purifying the antibody or fragment thereof. May be. At that time, it is preferable to add a signal peptide and secrete it outside the cell.
  • RR sequence inhibitory substance that inhibits the cell introduction action of RR sequence, particularly RERRRKKR (SEQ ID NO: 1), preferably a RR peptide recognition antibody or fragment thereof has a portion having this RR sequence by binding to a peptide having the RR sequence. Can inhibit the interaction with the cell membrane and prevent this peptide from entering the cell. Therefore, the RR sequence inhibitor can be used in in vivo and in in vitro as an entry inhibitor that inhibits the entry of a peptide having an RR sequence into a cell.
  • An expression vector that can secrete an RR peptide-recognizing antibody or fragment thereof outside the cell can also be used as an entry inhibitor.
  • the target cells are not particularly limited, but cells that are not infected with a low pathogenic influenza virus, but are infected with a highly pathogenic influenza virus, for example, preferably do not have a functional influenza virus receptor.
  • cells other than those of the respiratory tract and intestinal tract are preferable, but in the case of cells of the respiratory tract and intestinal tract, it is preferable that the function of the influenza virus receptor is inhibited.
  • the functional influenza virus receptor is a receptor used to infect a low-pathogenic influenza virus, that is, a sugar chain structure containing sialic acid on the cell surface, and the influenza virus may be infected. It means a possible receptor.
  • the method for inhibiting the function is not particularly limited. For example, sialic acid on the cell surface may be removed by sialidase, and a compound that binds to sialic acid competitively with influenza virus may be administered.
  • highly pathogenic influenza viruses have an RR sequence at the terminal of the outer shell peptide, and enter the cell using that sequence. Therefore, the RR sequence inhibitor binds to the outer peptide and inhibits highly pathogenic influenza virus from entering the cell.
  • the RR sequence inhibitor can be used as a highly pathogenic influenza virus infection inhibitor.
  • the highly pathogenic influenza virus is not particularly limited as long as it is systemic infectious, but preferably has an RR sequence at the cleavage site of HA and is already cleaved when proliferating in the cell and released outside the cell. It is preferable that the outer shell peptide has an RR sequence at the terminal. Specific examples include influenza viruses whose HA antigenicity is H5 or H7.
  • the RR sequence inhibitor can inhibit the highly pathogenic influenza virus from entering the cells, it can be used as a pharmaceutical composition for diseases caused by the highly pathogenic influenza virus.
  • the administration target of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it is a vertebrate, but is preferably a human, bird, or pig.
  • This pharmaceutical composition may be formulated into tablets, powders, granules, powders, capsules, solutions, emulsions, suspensions, etc. by adding a pharmaceutically acceptable carrier as necessary.
  • a medicine for preventing or treating influenza can be produced.
  • the pharmaceutically acceptable carrier used here can be appropriately selected from conventionally used carriers according to the form of the pharmaceutical to be prepared.
  • purified water sterile water
  • physiological buffer glycol, glycerol
  • injectable organic esters such as olive oil, and the like
  • this medicine may contain conventionally used stabilizers, excipients and the like.
  • the administration method of the medicine there are no particular limitations on the administration method of the medicine, and it may be appropriately determined according to various preparation forms, patient age, sex, other conditions, severity of disease, etc.
  • Parenteral dosage forms such as drops and sprays are preferred.
  • it when used as an injection or infusion, it is administered intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously, or intraperitoneally, if necessary, mixed with a salt solution, a normal fluid such as glucose or amino acid.
  • This medicament may be used alone or in combination with other drugs (for example, other antiviral agents, anti-inflammatory agents, drugs that relieve symptoms, etc.).
  • oseltamivir which is an inhibitor thereof, or a salt or hydrate thereof (for example, Tamiflu (Roche) which is a phosphate) It is preferably used in combination with a neuraminidase inhibitor such as zanamivir or a salt or hydrate thereof (for example, Relenza (Glaxo) which is a hydrate).
  • a neuraminidase inhibitor such as zanamivir or a salt or hydrate thereof (for example, Relenza (Glaxo) which is a hydrate).
  • the RR sequence inhibitor and neuraminidase inhibitor may be administered at the same time, but there is no problem even if they are administered before and after the time as long as one effect is within the period.
  • GFP-RR fusion protein The RR sequence was amplified by PCR using H5N1 highly pathogenic avian influenza Vietnam1203 strain DNA and the following primers. forward: ACCATTggggAATgCCCCAAATATgTgAAATC (SEQ ID NO: 10) reverse: CgACAAgCTTgAATTCTTATCTCTTTTTTCTTCTTCTCTC (SEQ ID NO: 11) This sequence and the EGFP gene or EGFP gene alone were incorporated into a protein expression vector pCold-II (Takara). EGFP was amplified with the following primers.
  • EGFP primer-F CgAgggATCCgAATTCAgTAAAggAgAAgAACTTTTCAC (SEQ ID NO: 12)
  • EGFP primer-R gCATTCCCCAATggTTTTgTATAgTTCATCCATgCCATg (SEQ ID NO: 13)
  • pCold-II was cleaved with EcoRI. DNA was integrated by homologous recombination using Takara's kit In-fusion. GFP contained in GFP-RR was prepared as a fusion protein on the N-terminal side of the RR sequence.
  • This expression vector was introduced into Escherichia coli Rosseta-Gami (Novagen) for gene introduction and cultured at 15 ° C. for 48 hours. The cultured bacterial solution was lysed with BugBuster (Novagen) and then purified with Ni-Sepharose (GE healthcare).
  • the weakly shining signal is a signal of nuclear staining with DAPI.
  • the brightly shining signal is that of the GFP-RR fusion protein.
  • mice were immunized with a synthetic peptide (sequence: CTGLRNSPQRERRRRKKR (SEQ ID NO: 14)) four times every two weeks. 100 ⁇ g of peptide was injected intraperitoneally or subcutaneously for the first immunization and 100 ⁇ g of the peptide after the second immunization. As an adjuvant, TiterMax Gold (Funakoshi) was used for the first immunization, and 300 ⁇ l each of incomplete Freund's adjuvant was used after the second time. Two weeks after the final immunization, mice were killed and spleens were collected, and monoclonal antibodies were prepared as usual. And the antibody reacting with the said peptide was obtained by screening by ELISA using the said peptide used for immunization.
  • a synthetic peptide sequence: CTGLRNSPQRERRRRKKR (SEQ ID NO: 14)
  • FIG. 2 shows fluorescence micrographs (2 fields of view) in which staining was observed.
  • an antibody against the RR sequence is an inhibitor that inhibits the protein having the RR sequence from entering the cell, and therefore inhibits the cell introduction action of the RR sequence.
  • Fab fragments were purified from the purified antibody obtained using Pierce Fab Preparation Kit (Thermo Fisher Scientific) according to the protocol. Specifically, the purified antibody was cleaved using papain, the Fc fragment and undigested IgG were adsorbed to protein A, and the Fab fragment was purified.
  • the treated C1C12 cells were fixed with paraformaldehyde and blocked at 37 ° C. for 30 minutes with a solution obtained by adding anti-GFP antibody (rabbit polyclonal, MBL, 500-fold diluted) to skim milk. Subsequently, after treatment with 0.1% TritonX-100 for 30 minutes at room temperature, the mixture was reacted with an anti-GFP antibody (mouse monoclonal, MBL, 500-fold diluted) as a primary antibody for 30 minutes at 37 ° C. as a secondary antibody.
  • anti-GFP antibody goat polyclonal, MBL, 500-fold diluted
  • FIG. 3A when a GFP-RR fusion protein treated with pre-immune rabbit serum was administered to C1C12 cells (control experiment), GFP expression was observed in the cells, and the fusion protein entered the cells. It was.
  • FIG. 3B when the GFP-RR fusion protein treated with the Fab fragment was used, expression of GFP was not observed in the cells, and entry of the fusion protein into the cells was inhibited.
  • the signal shining brightly in a spot shape in FIG. 3A is a signal of the GFP-RR fusion protein
  • the signals shining weakly in a circle in FIGS. 3A and B are signals of nuclear staining by DAPI.
  • neuraminidase (Seikagaku Corporation) isolated from Streptococcus 6646K as sialidase
  • the cells were treated for 1 hour at 37 ° C to remove sialic acid on the cell surface.
  • a / Whooper Swan / Hokkaido / 2008 (H5N1) highly pathogenic avian influenza virus with MOI 1 was further added to the medium to infect the cells.
  • the influenza virus used was pre-incubated in PBS or serum described in (3) for 1 hour at 37 ° C.
  • FIG. 4 shows a fluorescence micrograph of the observed staining.
  • an antibody against the RR sequence is useful as an influenza virus infection inhibitor because it can inhibit the highly pathogenic influenza virus from infecting cells using the RR sequence.
  • an influenza virus infection inhibitor can be provided.

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Abstract

　本発明は、インフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することを目的とする。具体的には、アミノ酸配列RERRRKKR（配列番号１）を有するペプチドを認識する抗体などのRR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を医薬組成物とし、その医薬組成物を含むインフルエンザウイルス感染阻害剤を製造する。

Description

医薬組成物
　本発明は、医薬組成物に関する。
　インフルエンザウイルスには、A,B,C型の3種類が存在し、A型は人畜共通感染症である。A型インフルエンザウイルスは、その膜表面にある16種類のヘマグルチニン(HA）と9種類のノイラミニダーゼ(NA)の組み合わせにより多数の亜型が存在する。そして、HAの抗原性により、低病原性ウイルスと高病原性ウイルスに分類されるが、低病原性ウイルスが局部的（呼吸器や腸管）にしか感染しないのに対し、HAの抗原性がH5型及びH7型の高病原性ウイルスは、全身の臓器に感染して増殖し、宿主を死亡させる。
　インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、HAが細胞表面の受容体に結合することが必要となる。インフルエンザウイルスは、受容体に結合して細胞内に侵入し、細胞内で増殖する。その際、低病原性ウイルスは、局部的に細胞外に分泌されているプロテアーゼによってHAが開裂する必要があり、それによって細胞感染能力を獲得するため、HA開裂と感染はカップルしている。一方、高病原性ウイルスは、細胞内で増殖後、細胞外へ放出される際にHAが開裂して、細胞感染能力を獲得する。従って、細胞外に存在する高病原性ウイルスは、すでに感染力を有しているため、HAの開裂と感染はカップルしていない。そこで、高病原性ウイルスのHAは自己開裂タイプと呼ばれている（Kawaoka, Y. and Webster, R. G., Proc. Natl Acad. Sci. USA vol.85, p.324－328, 1988）。
　ところで、インフルエンザウイルスが感染する受容体は動物種特異的であるため、通常、トリインフルエンザウイルスがヒトに感染することは無い。しかしながら、トリインフルエンザウイルスに変異が生じ、受容体認識が変化し、ヒトに感染する危険性が指摘されている。
　これまで、トリからヒトへの感染は何度か確認されているが、ヒト間での感染は確認されていない。しかしながら、一旦高病原性のトリインフルエンザウイルスがヒトへの感染能力を獲得すると、ヒトは、トリインフルエンザウイルスに対する免疫を持たないので、流行が急速に広まることが予想されている。従って、高病原性のインフルエンザウイルスに対する予防薬や治療薬の開発が期待されている。
　本発明は、インフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することを課題とする。
　これまで、高病原性インフルエンザウイルスが、どのようにして全身の細胞に侵入できるか明らかではなかった。というのは、上述した様に、高病原性インフルエンザウイルスは、細胞外ではHAの開裂が既に起きているため、全身の細胞に対する感染は、開裂するためのプロテアーゼの発現パターンでは説明がつかないからである。
　ところで、高病原性インフルエンザウイルスは、ＨＡの開裂部位に塩基性アミノ酸が連続した特異的な配列RERRRKKR（配列番号１）を有することが知られているが、この配列の機能は明らかにはされていなかった。本発明者らは、このアミノ酸配列の機能を調べる中で、このアミノ酸配列を有するペプチドが膜透過性ペプチド(CPP; Cell penetrating peptide)として機能することを発見した。そして、この機能によって、高病原性インフルエンザウイルスが、全身性に感染すると考えられたので、このアミノ酸配列に関するポリクローナル抗体を作製したところ、このアミノ酸配列を有するペプチドが細胞内へ侵入することを阻害することができた。従って、このアミノ酸配列に関する抗体は、高病原性インフルエンザウイルスの感染を抑制できることが明らかになり、本発明は完成に至った。
　本発明の一実施形態は、RR配列、特にアミノ酸配列RERRRKKR（配列番号１）を有するペプチドを認識する抗体またはそのフラグメント、または少なくともそれらのいずれかを発現する発現ベクターである。前記抗体またはそのフラグメントは、エピトープとしてRR配列、特にRERRRKKR（配列番号１）のアミノ酸配列を認識することが好ましい。また、前記抗体またはそのフラグメントは、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
　本発明のさらなる実施形態は、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する医薬組成物、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドの細胞内への侵入を阻害する侵入阻害剤である。前記阻害物質は、前記抗体またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかを発現する発現ベクターであってもよい。前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であってもよい。
　本発明のさらなる実施形態は、高病原性インフルエンザウイルスの細胞への感染を阻害する高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤、または高病原性インフルエンザウイルスによるインフルエンザの予防または治療のための医薬であって、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する。前記細胞は、機能的なインフルエンザウイルス受容体を有さないことが好ましく、特に呼吸器や腸管以外の細胞であることが好ましいが、呼吸器や腸管の細胞である場合、インフルエンザウイルス受容体の機能が阻害されていることが好ましい。前記阻害物質は、前記抗体またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかを発現する発現ベクターであってもよい。前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であってもよい。
　本発明のさらなる実施形態は、高病原性インフルエンザウイルスの予防方法または治療方法であって、健常人または高病原性インフルエンザウイルスに感染したインフルエンザ患者に、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質を投与する工程を含む。前記阻害物質は、前記抗体またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかを発現する発現ベクターであってもよい。前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であってもよい。さらに、前記患者に、低病原性インフルエンザウイルスによる感染経路を阻害しながら投与してもよく、例えばノイラミニダーゼ阻害剤を併用してもよい。前記ノイラミニダーゼ阻害剤は、オセルタミビル、ザナミビル、それらの塩、それらの水和物、及びそれらの混合物からなるグループから選択されることが好ましい。
[関連出願へのクロスリファレンス]
　本出願は、２００９年１１月２０日付で出願した日本国特許出願２００９－２６５３９に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施例において、RR配列を有するペプチドが、細胞内へ侵入することを示す図である。なお、Ａ、Ｂ共に、左上がGFPによる蛍光シグナル、右上が抗GFP抗体を用いた抗体染色によるシグナル、左下がDAPIによる核染色シグナル、右下が、GFPによる蛍光シグナル・抗GFP抗体を用いた抗体染色によるシグナル・DAPIによる核染色シグナルの三重撮影である。 本発明の一実施例において、RR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体が、そのペプチドの細胞内への侵入を阻害することを示す図である。なお、左カラムの４枚の写真がDAPIによる核染色シグナル、右カラムの４枚の写真が抗GFP抗体を用いた抗体染色によるシグナルを示し、上４枚の写真がRR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた実験、下４枚の写真が免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた対照実験の結果を示す。 本発明の一実施例において、RR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体のFabフラグメントが、そのペプチドの細胞内への侵入を阻害することを示す図である。Ａが免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた対照実験の結果を示し、ＢがRR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた実験の結果、を示す。 本発明の一実施例において、シアリダーゼによって細胞表面のシアル酸を除去した細胞に対し、高病原性インフルエンザウイルスを感染させたとき、RR配列特異的抗体が感染阻害効果を有することを示す図である。ＡがＰＢＳで処理した高病原性インフルエンザウイルスを感染させた実験結果を示し、ＢがRR配列特異的抗体を含む血清で処理した実験結果を示す。なお、Ｂ右図は、DAPIで細胞の核を染色した写真である。
　実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
　なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
　本発明の一実施態様は、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質である。この阻害物質は、好ましくは、RR配列を有するペプチドを認識する抗体（以下、RRペプチド認識抗体と称する）であるが、RR配列の細胞導入作用を阻害すれば特に限定されず、アプタマー、環状ペプチド、低分子化合物等でも構わない。抗体の場合、構造的にRR配列の機能を阻害するものであれば特に限定されないが、エピトープとしてRR配列を認識することが好ましい。また、この抗体は、モノクローナルでもよく、ポリクローナルでもよく、ヒト型抗体等の人工抗体であっても構わない。これらの抗体は、当業者には明らかな製造方法に従って製造することができる。その際に用いる抗原は、RR配列そのものでも良く、あるいは、ハプテンなどを結合させても良い。
　なお、RR配列とは、高病原性インフルエンザウイルスがHA開裂部位に有する塩基性アミノ酸配列であり、５～８塩基のアミノ酸からなる。具体的には、A型H5N1亜型インフルエンザウイルスの有するRERRRKKR（配列番号１）とその変異型配列（配列番号２～４）、及びＡ型H7亜型インフルエンザウイルスの有する塩基性アミノ酸配列（配列番号５～９）を含む（表１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の他の実施態様は、RRペプチド認識抗体のフラグメントでも良い。この抗体フラグメントは、抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、FabフラグメントやF(ab’)2フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。
　さらに他の実施態様として、RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントをコードするDNA、またはそのDNAを有し、RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントを発現する発現ベクターが挙げられる。これらのDNAや発現ベクターは、当業者には明らかな製造方法に従って製造することができる。
　RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントは、大腸菌や哺乳類の培養細胞などで機能するプロモーターを用いて発現ベクターを作製し、宿主細胞内に導入して抗体やそのフラグメントを発現させ、精製することによって作製しても良い。その際、シグナルペプチドを付加し、細胞外に分泌させるのが好ましい。
　RR配列特にRERRRKKR(配列番号１)の細胞導入作用を阻害するRR配列阻害物質、好ましくは、RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントは、RR配列を有するペプチドに結合することにより、このRR配列を有する部分が、細胞膜と相互作用することを阻害し、このペプチドが細胞内に侵入することを阻害することができる。従って、RR配列阻害物質は、RR配列を有するペプチドの細胞内への侵入を阻害する侵入阻害剤として、in vivo及びin vitroで用いることができる。また、RRペプチド認識抗体やそのフラグメントを細胞外に分泌できるようにした発現ベクターも、同様に侵入阻害剤として用いることができる。ここで、対象となる細胞は、特に限定されないが、低病原性インフルエンザウイルスが感染しないが、高病原性インフルエンザウイルスが感染する細胞、例えば、機能的なインフルエンザウイルス受容体を有さないことが好ましく、特に呼吸器や腸管以外の細胞であることが好ましいが、呼吸器や腸管の細胞である場合、インフルエンザウイルス受容体の機能が阻害されていることが好ましい。ここで、機能的なインフルエンザウイルス受容体とは、低病原性インフルエンザウイルスが感染するために用いられる受容体、すなわち細胞表面のシアル酸を含む糖鎖構造であって、インフルエンザウイルスが感染することができる受容体のことを意味する。その機能を阻害する方法は特に限定されず、例えば、シアリダーゼによって細胞表面のシアル酸を除去してもよく、インフルエンザウイルスと競合的にシアル酸に結合する化合物を投与してもよい。
　また、高病原性インフルエンザウイルスは、外殻ペプチドの末端にRR配列を有し、その配列を用いて細胞内に侵入する。従って、RR配列阻害物質は、この外殻ペプチドに結合し、高病原性インフルエンザウイルスが細胞内に侵入することを阻害する。このように、RR配列阻害物質は、高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤として用いることができる。
　ここで、高病原性インフルエンザウイルスは、全身感染性であれば特に限定されないが、HAの開裂部位にRR配列を有することが好ましく、細胞中で増殖し、細胞外に放出された時、既に開裂され、外殻ペプチドが末端にRR配列を有することが好ましい。具体的には、HAの抗原性がH5型及びH7型のインフルエンザウイルスが例示できる。
　このように、RR配列阻害物質は、高病原性インフルエンザウイルスが細胞内に侵入することを阻害することができるので、高病原性インフルエンザウイルスによって生じる疾患に対し、医薬組成物として用いることができる。医薬組成物の投与対象は、脊椎動物であれば特に限定されないが、ヒト、トリ、ブタであることが好ましい。
　この医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加し、錠剤、粉剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などに剤形化しても良く、これにより、インフルエンザ予防または治療のための医薬を製造することができる。ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含ませることができる。医薬の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤等の非経口投与形態が好ましい。特に注射剤や点滴剤として用いる場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液などと混合して静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与する。この医薬は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。特に、低病原性インフルエンザウイルスによる感染経路を阻害しながら投与することが好ましく、例えば、その阻害薬であるオセルタミビルあるいはその塩や水和物（例えば、リン酸塩であるタミフル（ロシュ社））やザナミビルあるいはその塩や水和物（例えば、水和物であるリレンザ（グラクソ社））などのノイラミニダーゼ阻害剤と併用することが好ましい。
　併用する場合、RR配列阻害物質とノイラミニダーゼ阻害剤を、同時に投与してもよいが、一方の効果がある時間内であれば、時間的に前後して投与しても問題はない。
（１）GFPタンパク質とRR配列の融合タンパク質（以下、GFP-RR融合タンパク質と称する）の合成
 RR配列はH5N1高病原性トリインフルエンザVietnam1203株DNAを用い、下記プライマーを使ってPCRにより増幅した。　
forward: ACCATTggggAATgCCCCAAATATgTgAAATC　（配列番号１０）
reverse: CgACAAgCTTgAATTCTTATCTCTTTTTTCTTCTTCTCTC　（配列番号１１）
　この配列とEGFP遺伝子もしくはEGFP遺伝子単体をタンパク発現ベクターpCold-II(Takara)に組み込んだ。EGFPは以下のプライマーで増幅した。　
EGFP primer-F:CgAgggATCCgAATTCAgTAAAggAgAAgAACTTTTCAC　（配列番号１２）
EGFP primer-R:gCATTCCCCAATggTTTTgTATAgTTCATCCATgCCATg　（配列番号１３）
pCold-IIはEcoRIにより切断した。TakaraのキットIn-fusionを用いて、相同性組み換えによってDNAを組み込んだ。GFP-RRに含まれるGFPはRR配列のＮ末端側に融合タンパクとして作成した。この発現ベクターを遺伝子導入用大腸菌Rosseta-Gami (Novagen)に導入し、15℃で48時間培養した。培養した菌液をBugBuster (Novagen)により溶菌後、Ni-Sepharose (GE healthcare)によって精製した。
（２）GFP-RR 融合タンパク質の細胞内への侵入
　10 μｇのGFP-RR 融合タンパク質またはRR配列を有さないGFPタンパク質を、BHK細胞(1×105cells/ml)の培地（D-MEMに10%FCSを添加した培地とOPTI-MEMを1：9で混合した培地）に添加し、37℃、5% CO2存在下で、3時間インキュベートした。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、スキムミルクに抗GFP抗体(ポリクローナル、MBL、500倍希釈)を加えたもので30分間、37℃でブロッキングした。続けて0.1%TritonX-100で30分間、室温で処理した後、１次抗体として抗GFP抗体（モノクローナル、MBL、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させ、2次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体（ポリクローナル、Jackson、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させることにより免疫染色し、Cy3の蛍光発光を検出することにより、GFP-RR 融合タンパク質が細胞内に侵入するかどうかを調べた。なお、同時に、GFPの蛍光発光を検出するとともに、核をDAPIで染色し、DAPIの蛍光発光を検出した。　
　RR配列を有さないGFPタンパク質を用いた場合（図１Ａ）、Cy3およびGFPによる発光が検出されず、このタンパク質が細胞内に侵入しなかった。一方、GFP-RR融合タンパク質を用いた場合（図１Ｂ）、細胞内でCy3およびGFPによる発光が検出され、この融合タンパク質が細胞内に侵入していた。なお、図１Ａ下及び図１Ｂ下の４つの写真で、円形に弱く光っているシグナルがDAPIによる核染色のシグナルであり、図１Ｂ左上、右上、及び右下の３つの写真で、斑点状に明るく光っているシグナルが、GFP-RR融合タンパクのシグナルである。　
　このように、RR配列を有するタンパク質は、それだけで細胞内に侵入することができる。
（３）ポリクローナル抗体の作製
　ウサギに対し合成ペプチド（配列：CTGLRNSPQRERRRRKKR　（配列番号１４））を二週間毎に４回にわたって免疫を行った。初回免疫に600μｇ、二次免疫以降に300μｇのペプチドを背部皮下注射した。アジュバンドとして初回免疫にTiterMax　Gold（フナコシ）、二回目以降に不完全フロイントアジュバンドを各300μｌ用いた。最終免疫から二週間後に全採血を行い、血清をポリクローナル抗体として用いた。
（４）モノクローナル抗体の作製
　マウスに対し合成ペプチド（配列：CTGLRNSPQRERRRRKKR　（配列番号１４））を二週間毎に４回にわたって免疫を行った。初回免疫に100μｇ、二次免疫以降にも100μｇのペプチドを腹腔内または皮下に注射した。アジュバンドとして初回免疫にTiterMax Gold（フナコシ）、二回目以降に不完全フロイントアジュバンドを各300 μｌ用いた。最終免疫から二週間後にマウスを殺して脾臓を採取し、通常通りモノクローナル抗体を作製した。そして、免疫に使用した上記ペプチドを用いてＥＬＩＳＡでスクリーニングすることにより、上記ペプチドに反応する抗体を得た。
（５）ポリクローナル抗体による侵入の阻害
　GFP-RR融合タンパク質10μｇに、10 μｌの免疫前あるいは免疫後のウサギ血清を添加し、常温で、3時間インキュベートした。その後、C1C12細胞(1×105個/ml)の培地(D-MEMに10%FCSを添加した培地とOPTI-MEMを1:9で混合した培地)に添加し、37℃、5%CO2存在下で、3時間インキュベートした。
　細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、スキムミルクに抗GFP抗体(ポリクローナル、MBL、500倍希釈)を加えた溶液で、30分間、37℃でブロッキングした。続けて0.1%TritonX-100で、30分間、室温で処理した後、1次抗体として抗GFP抗体(モノクローナル、MBL、500倍希釈)と30分間、37℃で反応させ、2次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体(ポリクローナル、Jackson、500倍希釈)と30分間、37℃で反応させることにより免疫染色し、Cy3の蛍光発光を検出することにより、GFP-RR融合タンパク質が細胞内に侵入するかどうかを、調べた。なお、同時に、核をDAPIで染色した。図２に、染色を観察した蛍光顕微鏡写真(各２視野)を示す。
　免疫前のウサギ血清を用いたところ、細胞内でGFPの発現が観察され、融合タンパク質が細胞内に侵入していた(図２下図）。一方、免疫後の抗体を含むウサギ血清を用いたところ、細胞内でGFPの発現が観察されず、融合タンパク質の細胞内への侵入が阻害されていた(図２上図)。なお、図２左カラムの４つの写真で、円形に弱く光っているシグナルがDAPIによる核染色のシグナルであり、図２右下の２つの写真で、斑点状に明るく光っているシグナルが、GFP-RR融合タンパクのシグナルである。
　このように、RR配列に対する抗体は、RR配列を有するタンパク質が細胞内に入るのを阻害することができるので、RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質である。
（６）Fabフラグメントによる侵入の阻害
１）Fabフラグメントの作製
　まず、免疫後の抗体を含むウサギ血清から、プロテインＧを用いてIgG抗体の精製を行った。具体的には、2mlの血清に18mlのTris-HClバッファー(pH=8.0)を加え、15000rpmで10分間遠心分離を行い、Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare社)と混合した。混合物をオープンカラムに充填し、10mlのPBS/0.1Tween20、20mlのTris-HClバッファー(pH 8.0)、10mlのPBSで順に洗浄を行った後、1mlの100mM Glycin-HCl (pH=3.0)により溶出し、1mlの１M Tris-HCl (pH=9.0)を加えて中和した。
　そして、得られた精製抗体に対し、Pierce Fab Preparation Kit (Thermo Fisher Scientific社)を用いて、そのプロトコールに従ってFabフラグメントを精製した。具体的には、パパインを用いて精製抗体を切断し、Fcフラグメントと未消化のIgGをプロテインＡに吸着させ、Fabフラグメントを精製した。
２）Fabフラグメントによる阻害実験
　GFP-RR融合タンパク質10μl（10μg）に、10μlのFabフラグメントを添加し、常温で、3時間インキュベートした。一方、Ｃ１Ｃ１２細胞（1×105個/ml）を準備し、1mlを直径3.5cmの培養皿に播種し、その培地（D-MEMに10%FCSを添加した培地とOPTI-MEMを1：9で混合した培地）に、Fabフラグメントで処理したGFP-RR融合タンパク質を全量（10μg）添加して、37℃、5％CO2存在下で3時間インキュベートした。
　処理後のＣ１Ｃ１２細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、スキムミルクに抗GFP抗体(ウサギポリクローナル、MBL、500倍希釈)を加えた溶液で、30分間、37℃でブロッキングした。続けて、0.1%TritonX-100で、30分間、室温で処理した後、１次抗体として抗GFP抗体（マウスモノクローナル、MBL、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させ、２次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体（ポリクローナル、Jackson、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させることにより免疫染色し、Ｃｙ３の蛍光発光を検出することにより、GFP-RR融合タンパク質が細胞内に侵入するかどうかを、調べた。同時に、核をDAPIで染色した。なお、対象実験として、免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた。図３に、染色を観察した際の蛍光顕微鏡写真を示す。
　図３Ａに示すように、免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質をＣ１Ｃ１２細胞に投与したところ（対照実験）、細胞内でGFPの発現が観察され、融合タンパク質が細胞内に侵入していた。一方、図３Ｂに示すように、Fabフラグメントで処理したGFP-RR融合タンパク質を用いたところ、細胞内でGFPの発現が観察されず、融合タンパク質の細胞内への侵入が阻害されていた。なお、図３Ａで斑点状に明るく光っているシグナルが、GFP-RR融合タンパクのシグナルであり、図３Ａ及びＢで円形に弱く光っているシグナルがDAPIによる核染色のシグナルである、
　このように、RR配列に対する抗体のFabフラグメントでも、RR配列を有するタンパク質が細胞内に入るのを阻害することができるので、RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質として用いることができる。
（７）シアル酸除去細胞への感染実験
　ここでは、ノイラミニダーゼ阻害剤投与のモデル系として、シアリダーゼによって細胞表面のシアル酸を除去した細胞に対し、高病原性インフルエンザウイルスを感染させ、RR配列特異的抗体によって、その感染阻害効果を検証した。
　シアリダーゼとして、ストレプトコッカス（Streptococcus）6646K株から単離されたノイラミニダーゼ（生化学工業）を用い、MDCK細胞（2×105個/ml）に対して0.17U/mlの酵素を培地に添加して、一時間37℃で処理し、細胞表面のシアル酸を除去した。その後、さらに培地にMOI=1のA/Whooper Swan /Hokkaido /2008 (H5N1)高病原性トリインフルエンザウイルスを添加し、細胞に感染させた。なお、インフルエンザウイルスはあらかじめPBSまたは（３）に記載の血清中で、1時間37℃でインキュベーションしたものを用いた。
　感染8時間後、細胞をPBSで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド水溶液で固定し、0.1%TritonX-100で、30分間、室温で処理した。そして、1次抗体として抗インフルエンザウイルスNPタンパク抗体（モノクローナル、Millipore社、500倍希釈）と1分間、37℃で反応させ、2次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体（ポリクローナル、Jackson社、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させた後、Cy3の蛍光発光を検出することにより、ウイルスの感染効率を調べた。図４に、染色を観察した蛍光顕微鏡写真を示す。
　PBSで処理したインフルエンザウイルスは、細胞表面上のシアル酸を除去したにもかかわらず、細胞への侵入が確認された（図４Ａ）。一方、インフルエンザウイルスをRR配列特異的抗体を含む血清で処理した場合、インフルエンザウイルスの細胞への侵入がほとんど検出されなかった（図４Ｂ左図）。なお、細胞の存在を示すため、同時に、核をDAPIで染色した（図４Ｂ右図）。このように、RR配列特異的抗体は、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を著しく阻害した。
　このように、RR配列に対する抗体は、高病原性インフルエンザウイルスがRR配列を利用して細胞に感染することを阻害できるので、インフルエンザウイルス感染阻害剤として有用である。
　本発明によって、インフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することができるようになった。

Claims (17)

  1. 　RR配列を有するペプチドを認識する抗体またはそのフラグメント。
  2. 　エピトープとしてRR配列のアミノ酸配列を認識することを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  3.  RR配列が、RERRRKKR（配列番号１）である、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  4. 　前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードするDNA。
  6. 　請求項５に記載のDNAを含み、請求項１～４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを発現することができる発現ベクター。
  7. 　RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する医薬組成物。
  8. 　前記阻害物質が、請求項１～４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項６に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　請求項７に記載の医薬組成物を含有するインフルエンザ予防または治療のための医薬。
  10. 　ノイラミニダーゼ阻害剤と併用されることを特徴とする、請求項９に記載のインフルエンザ予防または治療のための医薬。
  11. 　RR配列を有するペプチドの細胞内への侵入を阻害する侵入阻害剤であって、
    　当該RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する侵入阻害剤。
  12. 　前記阻害物質が、請求項１～４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項６に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項１１に記載の侵入阻害剤。
  13. 　RR配列を有する高病原性インフルエンザウイルスの細胞内への感染を阻害する高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤であって、
    　当該RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
  14. 　前記細胞が、機能的なインフルエンザウイルス受容体を有さないことを特徴とする、請求項１３に記載の高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
  15. 　前記細胞が、呼吸器や腸管以外の細胞であるか、または、呼吸器や腸管の細胞である場合、インフルエンザウイルス受容体の機能が阻害されていることを特徴とする、請求項１４に記載の高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
  16. 　前記阻害物質が、請求項１～４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項６に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、請求項１３～１５のいずれかに記載の高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
  17. 　前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であることを特徴とする請求項１３～１５のいずれかに記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
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