CN107001429A - 乙型肝炎病毒表面抗原的表位及与其特异性结合以中和乙型肝炎病毒的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原特定的表位，和用于中和乙型肝炎病毒的、与该表位结合的结合分子。由于本发明所提供的表位是通过形成三维结构而产生的并且不包括a决定簇，通过该a决定簇诱导针对现有疫苗或HBIg给药的逃逸突变，所以包括与该表位结合的抗体的组合物或包括该表位的疫苗组合物发生由于逃逸突变而功效降低的可能性非常低。因此，这样的抗体或疫苗组合物在预防和/或治疗HBV中非常有效。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原的表位及与其特异性结合以中和乙型 肝炎病毒的结合分子
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原的表位，以及与该表位特异性结合的、中和乙型肝炎病毒的结合分子。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是引起急性和慢性肝炎的嗜肝DNA病毒(Hepadnaviridae)科中的DNA病毒，并且被认为是导致肝硬化和肝癌的主要原因。HBV按照乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对标准血清的反应和HBsAg氨基酸序列的差异被分成10种血清型，或者按照基因碱基序列的差异被分成8种基因型。2012年，世界范围内约有2.4亿例患有慢性HBV感染的患者，已知每年超过五十万人死于乙型肝炎所导致的疾病。慢性HBV感染率在韩国和中国的成人中非常高，约为5％至8％，并且80％的成人慢性肝炎患者、65％的肝硬化患者和70％的患肝细胞癌的患者与HBV感染有关。虽然能通过疫苗的开发和推广来预防慢性乙型肝炎，但慢性乙型肝炎仍然是导致慢性肝病的最重要的原因，而且肝病造成的社会性支出持续增加。因此，亟需开发出能预防和治疗慢性乙型肝炎的新型抗病毒药物。
目前用于治疗慢性乙型肝炎的有用药物包括干扰素(聚乙二醇干扰素)、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)，除干扰素以外的所有口服药物都是核苷/核苷酸类似物。这些药物抑制HBV的逆转录酶的活性，从而阻止病毒DNA复制，最终降低血清中HBV DNA的量、使ALT数正常化并且改善肝纤维化。
但是，核苷类似物的长期使用产生了耐药性，导致药效下降，从而使肝炎加重。对于最近开发的替诺福韦，还没有报道有耐药性，但是在世界范围内最广泛使用的拉米夫定已知在5年之后显示出70％至80％的耐药性发生率。此外，因为这些口服药物不直接阻止HBV感染，因此为了预防母亲至胎儿的垂直感染和肝移植患者中的再感染，而将人血浆来源的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)制剂与口服药物一起使用。
通过使用先进的纯化技术，从具有抗乙型肝炎抗体的人的血液中分离出抗体，并且使用病毒灭活技术去除潜在的污染源，来制备现有的HBIg。但是材料血浆是难以获得的，需要过高的进口成本，从而使其无法满足需求。另外，尽管花费了大量的时间和金钱去除血浆来源的病毒，但仍然会残留潜在的感染源，并且由于低功效而不方便给药，而且可能强加了相当大的经济负担。
此外，已知通过接种常规的乙型肝炎疫苗所形成的大部分抗体，识别位于HBsAg第124～147位氨基酸上的a-决定簇。该a-决定簇起到HBV的主要中和表位的作用，但是已经报道了a-决定簇在一些患者中出现的某些突变躲避了通过接种乙型肝炎疫苗所形成的抗体。相应地，存在对开发用于预防和治疗乙型肝炎的新的抗体或疫苗的日益增长的需求，其中新的抗体或疫苗可对由现有疫苗或HBIg诱导的逃逸突变作出反应。
发明内容
技术问题
本发明要解决现有技术中遇到的问题，本发明人开发出一种包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的第110位、第118位、第120位和/或第147位的氨基酸的表位，并且还证明了该表位具有三维结构特征。
相应地，本发明旨于提供一种HBsAg的表位。
此外，本发明旨于提供一种与所述表位特异性结合的、中和HBV的结合分子。
此外，本发明旨于提供一种编码所述结合分子的多核苷酸。
此外，本发明旨于提供一种包括所述多核苷酸的表达载体。
此外，本发明旨于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞经所述表达载体转染，来产生中和HBV的结合分子。
此外，本发明旨于提供一种用于预防、治疗或诊断乙型肝炎的组合物，所述组合物包括所述结合分子。
此外，本发明旨于提供一种编码所述表位的多核苷酸。
此外，本发明旨于提供一种表达载体，该表达载体包括编码所述表位的多核苷酸。
此外，本发明旨于提供一种重组的微生物或病毒，所述重组的微生物或病毒是经以下表达载体转化的，该表达载体包括编码所述表位的多核苷酸。
此外，本发明旨于提供一种生产表位的方法，该方法包括培养所述重组的微生物或病毒。
此外，本发明旨于提供一种HBV疫苗组合物，所述HBV疫苗组合物包括所述表位或编码所述表位的多核苷酸。
此外，本发明旨于提供一种用于检测HBV的组合物，所述组合物包括所述表位或编码所述表位的多核苷酸。
技术方案
因此，在本发明中，发现与HBsAg特异性结合的人抗体(参见PCT/KR2014/004612，下文称为“本发明抗体”)的表位包括HBsAg的第110位、第118位、第120位和/或第147位的氨基酸。另外，以三维结构的形式提供包括这四个氨基酸的序列或其一部分，从而形成本发明抗体能结合的表位，由此完成了本发明。
相应地，本发明提供了一种3mer至38mer的表位，所述表位选自HBsAg的第106～151位的氨基酸。
在本发明的实施方式中，所述表位可包括HBsAg的第110位、第118位和第120位和/或第147位的氨基酸。包括上述位置处的氨基酸的表位可以以与承载体(carrier)联合的形式使用，在用作疫苗组合物等时保持其三维结构或确保其效能。在本发明中，只要承载体是生物相容性的并且适用于实现本发明的效果，就可使用任意承载体，该承载体优选选自，但并不限于，肽、血清白蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白和多糖。
在本发明的实施方式中，所述表位可以是HBsAg的第106～110位、第107～111位、第108～112位、第109～113位、第110～114位、第114～118位、第115～119位、第119～123位、第120～124位、第143～147位、第144～148位、第145～149位、第146～150位、第147～151位、第110～118位、第118～120位、第116～120位、第117～121位、第118～122位、第120～147位、第110～120位、第118～147位或第110～147位的氨基酸。
在本发明中，HBV基因型C型(亚型adr)的HBsAg野生型全长氨基酸序列可如SEQ IDNO:3所示，该序列信息还可在Genebank No.GQ872210.1中进行核实。
此外，本发明提供了与表位特异性结合的中和HBV的结合分子，所述表位包括选自HBsAg的第110位、第118位和第120位的氨基酸组成的组中的至少一个氨基酸残基。另外，所述表位可进一步包括HBsAg的第147位的氨基酸。
在本发明的实施方式中，与所述表位特异性结合的中和HBV的结合分子可具有小于1×10-9M的结合亲和力。在另一实施方式中，所述结合分子可具有小于9×10-10M的结合亲和力。在又一实施方式中，所述结合分子可具有小于8×10-10M的结合亲和力。在又一实施方式中，所述结合分子可具有小于7×10-10M的结合亲和力。在又一实施方式中，所述结合分子可具有小于6×10-10M的结合亲和力。在进一步的实施方式中，所述结合分子可具有小于5×10-10M的结合亲和力。在又一进一步的实施方式中，所述结合分子可具有小于4×10-10M的结合亲和力。在又一进一步的实施方式中，所述结合分子可具有小于3×10-10M的结合亲和力。在又一实施方式中，所述结合分子可具有小于2×10-10M的结合亲和力。在又一进一步的实施方式中，所述结合分子可具有小于1×10-10M的结合亲和力。在又一进一步的实施方式中，所述结合分子可具有小于1×10-11M的结合亲和力。在又一进一步的实施方式中，所述结合分子可具有小于1×10-12M的结合亲和力。
根据本发明，所述中和HBV的结合分子可与由HBsAg亚型adw、adr、ayw、和ayr组成的组中的至少一种结合，从而可具有针对HBV的中和活性。
根据本发明，所述结合分子可与HBV基因型A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型和H型结合，从而具有中和活性。
另外，本发明的结合分子可与耐受拉米夫定、阿德福韦、克来夫定(clevudine)或恩替卡韦的HBV结合，从而可具有中和活性。
在本发明的实施方式中，所述结合分子可在HBsAg的第101位、第112位、第126位、第129位、第133位、第143位、第173位、第175位、第184位、第185位或第196位氨基酸处与突变抗原结合，从而具有针对HBV的中和活性，但本发明并不限于此。
在本发明的实施方式中，所述突变抗原可包括，但并不限于Q101R、K112R、T126N、I126S、Q129H、M133H、P143K、L173F、L175S、A184V、I185M或W196L。
在本发明的实施方式中，所述结合分子可以是抗体或其片段。所述抗体可包括，但并不限于Fab片段、Fv片段、双链抗体(diabody)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。本发明的示例性实施方式提供了与HBsAg结合的全人抗体。此处，所述抗体以尽可能宽泛的意思来使用，其实例可包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由两个或更多个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和显示出期望生物活性的抗体片段。所述抗体是由免疫系统产生的、能识别特定抗原并与其结合的蛋白。就结构而言，所述抗体通常被配置为具有由四个氨基酸链(两个重链和两个轻链)构成的Y形蛋白。每一抗体都具有两种结构域，即可变区和恒定区。位于Y臂末端的可变区与靶抗原结合并且与其相互作用。可变区包括互补决定区(CDR)，其中互补决定区(CDR)识别特定抗原上的特定结合位点并且与其结合。位于Y尾部的恒定区被免疫系统识别并且与其相互作用。靶抗原具有多个被称为表位的、被抗体上的CDR识别的结合位点。各抗体与具有不同结构的不同表位特异性结合。因此，单一抗原可具有与其对应的至少一种抗体。
进一步地，本发明包括抗体的功能性变体。只要抗体的功能性变体可与本发明抗体竞争以特异性结合HBV或其表面抗原(HBsAg)亚型，则该抗体的功能性变体就被认为是本发明抗体的功能性变体。该功能性变体包括，但并不限于，一级构象序列基本类似的衍生物，及其实例包括体内或体外修饰、化学品和/或生物化学品，并且它们不存在于本发明的亲本单克隆抗体中。上述修饰的实例可包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价键合、脂质或脂质衍生物的共价键合、交联、二硫键键合、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解和磷酸化。所述功能性变体可选择性地是具有以下氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列是与亲本抗体相比，进行了至少一个氨基酸的替换、插入、缺失或其组合得到的。进一步地，所述功能性变体可包括在氨基末端和羧基末端之一或两端的截短形式的氨基酸序列。本发明的功能性变体可具有与本发明的亲本抗体相同或不同，或更高或更低的结合亲和力，但仍然可以结合HBV或其表面抗原(HBsAg)亚型。例如，可修饰可变结构域的氨基酸序列，该可变结构域包括，但并不限于框架结构或高变结构域，特别是CDR3。通常，轻链结构域或重链结构域包括具有三个CDR的三个高变结构域和更多的保守结构域，即框架区(FR)。高变结构域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。落入本发明范围内的功能性变体可具有与本发明的亲本抗体约50％～99％、约60％～99％、约80％～99％、约90％～99％、约95％～99％或约97％～99％的氨基酸同源性。为了最佳设置要进行对比的氨基酸序列，并且还为了定义类似或相同的氨基酸残基，可使用本领域技术人员已知的计算机算法中的Gap或Bestfit。可通过对亲本抗体或其部分进行已知的分子生物学方法，包括使用寡核苷酸的PCR或诱变/部分诱变，或进行有机合成方法，来获得功能性变体，但本发明并不限于此。
此外，本发明提供了编码上述结合分子的多核苷酸。例如，本发明包括编码抗HBsAg的单克隆抗体的分离的核酸分子。
此外，本发明提供了包括上述多核苷酸的表达载体。所述表达载体可包括，但并不限于选自下组中的任一种：可购自Celltrion的表达载体，例如MarEx载体和商业上广泛使用的pCDNA载体、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL和Ti载体；粘粒；噬菌体，例如λ噬菌体、λ形噬菌体、M13噬菌体、Mu噬菌体、p1P22噬菌体、Qμ噬菌体、T-偶数(T-even)噬菌体、T2噬菌体、T3噬菌体、T7噬菌体等；和植物病毒。而且，本领域技术人员已知的任意表达载体都可用于本发明中，并且可依赖于宿主靶细胞的性质来选择表达载体。可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔，将载体引入到宿主细胞中，但本发明并不限于此，本领域技术人员可采用适于表达载体和宿主细胞的引入方法。所述表达载体可含有至少一种选择标记物，但并不限于此，可以依赖于使用不包含选择标记物的载体是否获得产物来进行选择。可依赖于宿主靶细胞来选择所述选择标记物，这是使用本领域技术人员已知的任意方法来进行的，但本发明并不限于此。进一步，为了容易地纯化本发明的核酸分子，可将标签序列插入到表达载体中，从而被融合。所述标签可包括，但并不限于六-组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或flag标签，任意标签都可用于本发明中，只要该标签如本领域技术人员所已知的便于进行纯化。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞通过表达载体的转染，产生具有针对HBV的中和活性的结合分子。在本发明中，该宿主细胞可包括，但并不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞。哺乳动物细胞可包括，但并不限于CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、鲍斯(Bowes)黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK 293细胞或HEK293T细胞，并且可使用任意细胞，只要该细胞如本领域技术人员已知的可用作哺乳动物的宿主细胞。
此外，本发明提供了一种用于预防、治疗或诊断乙型肝炎的组合物，所述组合物包括上述结合分子。除了上述结合分子之外，本发明的组合物可进一步包括作为抗病毒药物的干扰素、抗HBV的单克隆抗体、抗HBV的多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂或治疗性疫苗。
根据本发明，包括所述结合分子的组合物可以以剂型，诸如无菌注射液、冻干剂型、预填充式注射器溶液、口服剂型、外用药物或栓剂的形式，通过各自典型的方法来提供，但本发明并不限于此。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种治疗乙型肝炎的方法，所述方法包括向患HBV的个体给药治疗有效量的上述组合物。在本发明的治疗方法中，可将本领域技术人员已知的治疗剂随其一起给药。在本发明的治疗方法中，所述给药可以口服给药或肠道外给药的方式进行。例如，给药途径可为静脉给药，但并不限于此。
在本发明的实施方式中，所述治疗方法可进一步包括给药抗病毒药物。所述抗病毒药物可包括，但并不限于，干扰素、核苷/核苷酸类似物、抗HBV的单克隆抗体、抗HBV的多克隆抗体、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂或治疗性疫苗。所述核苷/核苷酸类似物可包括，但并不限于，拉米夫定、恩替卡韦、克来夫定或阿德福韦酯。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种预防乙型肝炎的方法，该方法包括向个体给药治疗有效量的上述组合物。在本发明的预防方法中，可将本领域技术人员已知的预防剂随其一起给药。在本发明的预防方法中，所述给药可以口服给药或肠道外给药的方式进行。例如，给药途径可为静脉给药，但并不限于此。
向包括人的哺乳动物给药本发明的组合物，从而预防或治疗HBV感染和由HBV感染引起的疾病。在此，给药的结合分子(例如抗体)的量取决于治疗个体、疾病或状态的严重程度、给药速率和医生处方。所述结合分子用作活性成分可通过肠道外途径向哺乳动物，以0.001～10mg/kg(体重)或0.005～1mg/kg(体重)的剂量，每天给药一次或分为每天给药数次。在一些情况中，小于上述范围的剂量可能更合适，也可以在不引起副作用的情况下施用更大剂量，并且可分配成小量一天施用数次。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种诊断患者感染HBV的方法，该方法包括：i)使上述组合物与样品接触；以及ii)检测所述组合物与所述样品的反应。在本发明的诊断方法中，本发明的结合分子(例如单克隆抗体)在必要时可与标记材料偶联以检测诊断，这是本领域技术人员已知的。
在本发明的诊断方法中，所述样品可以是，但并不限于，选自由个体的痰、唾液、血液、汗液、肺细胞、肺组织粘液、呼吸道组织和唾沫组成的组中的任一种，并且所述样品可使用本领域技术人员通常已知的方法来制备。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种提供关于患者感染HBV的诊断信息的方法，该方法包括：i)使上述组合物与样品接触；以及ii)检测所述组合物与所述样品的反应。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种诊断HBV的试剂盒，该试剂盒包括：i)上述组合物；和ii)容器。在本发明的诊断试剂盒中，2)容器包括固体承载体。本发明的结合分子可附着至固体承载体，所述固体承载体可为多孔的或无孔的，或平面的或非平面的。
另外，在本发明的另一实施方式中，本发明涉及一种检测HBV存在的方法，该方法包括使上述组合物与来源于患者的样品接触。
此外，本发明提供了一种编码所述表位的多核苷酸。根据本发明的，编码包括上述氨基酸位点的表位的多核苷酸可以基因疫苗的形式单独使用。在此，所述多核苷酸可在没有任何载体的情况下单独使用，并且可被嵌入在病毒或非病毒载体中，然后转染到体内。所述病毒或非病毒载体可以没有限制的使用，只要已知在本发明所属的领域中通常使用该病毒或非病毒载体。具体地，所述病毒载体的实例可包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等，而所述非病毒载体可包括阳离子聚合物、非离子聚合物、脂质体、脂质、磷脂、亲水性聚合物、疏水性聚合物和选自其中的至少一种组合，但本发明并不限于此。
此外，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括编码所述表位的多核苷酸。
此外，本发明提供了一种经所述表达载体转化的重组的微生物或病毒。在实施方式中，所述重组的微生物或病毒可以是重组的大肠杆菌(E.coli)、重组的酵母或重组的噬菌体。
在本发明的实施方式中，本发明提供了一种在微生物或病毒表面上表达以下表位的方法，该表位包括HBsAg的第110位、第118位、第120位和/或第147位的氨基酸。在此，可使用具有编码诱导型启动子或信号蛋白的序列的重组载体，和包括该重组载体的任意微生物或病毒。具体地，适当的微生物或病毒可包括，但并不限于，重组的大肠杆菌(E.coli)、重组的酵母或重组的噬菌体。为了在微生物或病毒表面上表达包括上述氨基酸位点的表位，可利用本发明所属领域中公知的展示技术。具体地，本发明的表达方法可以如下方式进行，其中编码包括上述氨基酸位点的表位的多核苷酸可与编码启动子或信号蛋白的序列结合，该启动子或信号蛋白诱导在微生物细胞或病毒表面上的表达；或其中，可缺失编码在表面上原始表达的蛋白的一些基因，然后可将编码包括上述氨基酸位点的多核苷酸序列插入在其中，但本发明并不限于此。当使用本发明的表达方法时，可分离在微生物或病毒表面上表达的、包括上述氨基酸位点的表位，并且进行纯化，从而可应用于本发明的某些目的；另外，还可以筛选且获得与包括上述氨基酸位点的表位特异性结合的抗体，其中包括上述氨基酸位点的表位处于在表面上表达的状态。
此外，本发明提供了一种生产表位的方法，该方法包括培养所述重组的微生物或病毒。
此外，本发明提供了一种HBV疫苗组合物，该HBV疫苗组合物包括上述表位或编码该表位的多核苷酸。所述HBV疫苗组合物可进一步包括药学上可接受的佐剂。所述佐剂用于在注射到体内时增加抗体的形成，并且只要能实现本发明的效果，就可使用任意佐剂。所述佐剂的实例可包括，但并不限于铝盐(Al(OH)3、AlPO4)、鲨烯、山梨聚糖、聚山梨醇酯80、CpG、脂质体、胆固醇、MPL(单磷酰脂质A)和GLA(吡喃葡萄糖基脂A)。
此外，本发明提供了一种用于检测HBV的组合物，该组合物包括上述表位，或编码该表位的多核苷酸。
有益效果
根据本发明，HBsAg的表位不包括在给药现有的疫苗或HBIg时产生逃逸突变的a-决定簇中的主要残基，因此包括与其结合的抗体的组合物或包括上述表位的疫苗组合物，发生由于逃逸突变而功效降低的可能性非常低。因此，这样的抗体或疫苗组合物在预防和/或治疗HBV中非常有效。
附图说明
图1示出了突变体结构，其中野生型HBsAg(226a.a)分成三个区域，即氨基酸序列第1～100位(区域1)、第101～160位(区域2)和第161～226位(区域3)，并且其中，对各区域进行缺失，以鉴定出本发明抗体的结合位点。
图2示出了使用噬菌体通过ELISA，对本发明抗体与野生型HBsAg和分别缺失区域1、区域2、区域3的三种突变HBsAg的结合强度的测量结果。
图3示出了四种突变HBsAg的结构，其中顺序缺失了15个氨基酸，以鉴定本发明抗体的表位。
图4示出了使用噬菌体通过ELISA，对本发明抗体与四种突变HBsAg的结合强度的测量结果，在该四种突变HBsAg中，顺序缺失了15个氨基酸。
图5示出了HBsAg模型上的表位和二硫键的位置。
图6a和图6b示出了用于鉴定本发明抗体的表位的特征的Western印记测定的结果。
图7示出了根据本发明实施方式的、本发明抗体1、2与a-决定簇的各突变抗原的反应性的ELISA结果。
图8a至图8d示出了对于四种HBV基因型A、B、C、D，根据本发明实施方式的、本发明抗体1、2的体外中和测试的结果，其中根据使用实时PCR扩增的HBV DNA的量，测量细胞内病毒的量。
图9a至图9d示出了对于四种HBV基因型A、B、C、D，根据本发明实施方式的、本发明抗体1、2的体外中和测试的结果，其中根据使用化学发光免疫测定(CLIA)测量的HBsAg的量，来测量扩增且分泌到细胞外的病毒的量。
图10示出了本发明抗体1、2与15种HBV表面抗原血清样品(来源于七种HBV基因型A、B、C、D、E、F、H的患者)的结合活性的夹心ELISA的结果。
图11示出了本发明抗体1、2与耐受药物(拉米夫定、阿德福韦、克来夫定、恩替卡韦)的病毒的结合活性的夹心ELISA的结果。
具体实施方式
实施例
通过下面的实施例可更好地理解本发明，对下面的实施例进行阐述以进行例示，但并不构成对本发明范围的限制。本文所引用的文件通过引用并入本申请中。
实施例1：使用抗原的缺失突变体来鉴定本发明抗体的结合位点
为了验证本发明抗体与HBsAg的结合位点，制备了野生型HBsAg和HBsAg的多种缺失突变体，并且使用噬菌体通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量其结合活性。
在此，以两个步骤进行测试。具体地，HBsAg(226a.a)分成三个区域，即氨基酸序列第1～100位、第101～160位和第161～226位，并且制备了野生型的表达载体和缺失了各区域的突变体的表达载体(图1)，各蛋白在噬菌体表面上表达，然后测量其与本发明抗体的结合强度。
实施例1-1.野生型HBsAg和三种突变HBsAg的表达载体的制备。
为了在噬菌体表面上表达野生型HBsAg及其三种分开的部分，即缺失突变体蛋白，使用噬菌体表达载体进行克隆。详细的测试方法如下。为了克隆野生型HBsAg和具有缺失位点的突变体，使用包括HBV基因型C型的HBsAg基因碱基序列的HBV载体(建国大学医学院药理学系)作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，然后使用限制性酶Sfi I处理，之后插入经相同限制性酶处理的噬菌体表达载体中。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN,德国,Cat#27106)提取制造的质粒，使用所提取的DNA，通过碱基序列分析来最终鉴定出抗体的碱基序列。下面的表1中示出了完成的克隆名称和HBsAg位点。
[表1]用于鉴定本发明抗体的结合位点的克隆信息
克隆名称 克隆描述 HBsAg位点(氨基酸)
HBsAg全长 野生型 第1～226位
区域2+3 氨基酸第1～100位缺失 第101～226位
区域1+3 氨基酸第101～160位缺失 第1～100位&第161～226位
区域1+2 氨基酸第161～226位缺失 第1～160位
在本实施例中，HBV基因型C型(亚型adr)的HBsAg野生型全长氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，并且序列信息可在Genebank No.GQ872210.1中进行核实。
实施例1-2.对本发明抗体与野生型HBsAg和三种突变HBsAg的结合强度的评价。
为了对全部或部分克隆的HBsAg进行结合测试，通过电穿孔将每一载体插入到表达大肠杆菌(E.coli)(ER2738,Lucigen,USA,Cat#60522-2)中，耐抗生素(氨苄青霉素)的大肠杆菌(E.coli)从第二天开始选择性生长。在生长约10小时之后，使用噬菌体感染大肠杆菌(E.coli)，并且使用另一种抗生素(卡那霉素)使经感染的大肠杆菌(E.coli)选择性生长。为了在第二天提取噬菌体，经离心分离大肠杆菌(E.coli)，使用聚乙二醇(PEG)处理上清液，在冰浴中静置30分钟，之后再次离心分离噬菌体。裂解所分离的噬菌体，对上清液进行过滤，从而提取在其表面上具有全部或部分HBsAg的纯的噬菌体。
为了定量地评价本发明抗体与暴露于噬菌体表面的野生型和突变HBsAg的结合强度，而进行了ELISA。具体地，将抗人Fc的抗体(Jackson Immunoresearch,USA,Cat#109-006-098)与包被缓冲液(Sigma,USA,Cat#c3041)混合，使其在4℃包被96孔板一天，然后使本发明抗体与其结合。之后，使所提取的噬菌体附接至本发明抗体，并且先使用HRP酶缀合的噬菌体M13蛋白抗体(GE healthcare,USA,27-9421-01)，后使用2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS,KPL,USA,Cat#50-62-00)，测量与本发明抗体结合的具有野生型和突变HBsAg的噬菌体的量。在此，为了测量各测试组的全部噬菌体的量，其中在噬菌体表面上表达有HBsAg，将抗HA的抗体(Genescript,USA,Cat#A00168-100)施加在96孔板上，4℃保持一天，所提取的噬菌体附接至抗体，并且以与上述相同的方式进行测量。
如其结果所示，仅在区域1+3噬菌体样品中观察到与本发明抗体的结合强度特别低(图2)，在该区域1+3噬菌体样品中，缺失了氨基酸第101～160位的HBsAg表达在噬菌体表面上。这表明本发明抗体的主要结合位点在区域2中。
实施例2：使用连续缺失突变抗原来鉴定本发明抗体的表位。
为了基于实施例1中所确定的本发明抗体的主要结合位点来鉴定表位，制备了连续缺失突变体，其中自区域2的起始氨基酸第101位顺序缺失15个氨基酸，然后暴露于噬菌体表面，之后通过ELISA测量其与本发明抗体的结合强度。
实施例2-1.四种突变HBsAg的表达载体的制备。
制备基于区域2+3克隆缺失15个氨基酸的突变体。下面的表2中示出了完成的克隆名称和HBsAg位点(图3)。详细的克隆方法与实施例1-1重复，从而省略对其的描述。
[表2]用于鉴定本发明抗体的表位的克隆信息。
克隆名称 克隆描述 HBsAg位点(氨基酸)
区域2+3 氨基酸第1～100位缺失 第101～226位
区域2+3 Del 1 氨基酸第1～115位缺失 第116～226位
区域2+3 Del 2 氨基酸第1～130位缺失 第131～226位
区域2+3 Del 3 氨基酸第1～145位缺失 第146～226位
区域2+3 Del 4 氨基酸第1～160位缺失 第161～226位
实施例2-2.对本发明抗体和四种突变HBsAg的结合强度的测量。
以与实施例1-2中相同的方式，通过提取其中四种连续缺失突变体暴露于表面的噬菌体，来进行ELISA。
如其结果所示，与本发明抗体的结合强度在区域2+3 del 1中显著降低，这表明本发明抗体的主要抗原决定簇(表位)存在于氨基酸第101～115位上(图4)。
实施例3.使用单一氨基酸突变抗原鉴定本发明抗体的表位。
为了更准确地鉴定本发明抗体的表位，使用Integral Molecular,USA(J Am ChemSoc.2009；131(20):6952～6954)的鸟枪诱变技术在HBsAg(亚型adr)中引入随机诱变，以便测量本发明抗体与每一突变抗原的结合能力。下面的表3中示出了用于测试的突变抗原文库的特征。在培养于384孔板中的HEK-293T细胞中表达所制造的文库的每一克隆。
[表3]用于表位鉴定测试的HBsAg随机诱变文库的特征。
文库的总克隆数 456
经诱变的HBsAg残基数(总共为226) 226(100％)
在一个残基上发生诱变的克隆数 367
在两个残基上发生诱变的克隆数 78
在三个或更多个残基上发生诱变的克隆数 11
实施例3-1：对抗体表位的验证
通过免疫荧光FACS对本发明抗体与突变抗原的结合能力进行三次测量，并且基于与野生型HBsAg的反应性进行标准化。另外，使用orb43805(其为抗HBsAg的小鼠单克隆抗体)作为对照抗体，利用它的结合能力的结果来证实测试结果的可信度，并且设置表位选择的标准。具体地，选择存在于以下克隆中的突变残基作为对于本发明抗体的结合必要的关键残基，在该克隆中，与野生型HBsAg相比，与本发明抗体的结合反应性小于15％(<15％WT)，同时与野生型HBsAg的反应性相比，与作为对照抗体的orb43805的结合反应性为55％或更高(>55％WT)。
基于测试结果，对于本发明抗体来说的关键残基来源于总共四种突变抗体，因此证实了本发明抗体的表位具有HBsAg的氨基酸第110位、第118位、第120位和第147位。在下面的表4中示出了详细地测试结果。
[表4]HBsAg的对于本发明抗体来说的关键残基。
其中，氨基酸第110位处于通过实施例2的测试所鉴定的结合位点中，因此可断定是本发明抗体的关键表位。氨基酸第118位、第120位和第147位不存在于通过实施例2的测试所鉴定的结合位点中。但是，在缺失测试的情况中，可能由于很多氨基酸的去除而发生构象改变，因此一些表位没有被鉴定出来的可能性是较高的。
尤其是HBsAg包含经由二硫键，如C107-C138、C139-C147等来保持三维结构。当这样的键合由于实施例2的缺失突变而被破坏时，原始结构破裂，从而影响抗体结合。在本实施例中，通过单一突变测试，鉴定在实施例2的缺失测试中没有发现的表位残基(图5)。因为氨基酸第147位是形成二硫键的残基，而二硫键对于保持HBsAg的三维结构来说很重要，因此氨基酸第147位可能参与本发明抗体的结合，以便在第110位、第118位和第120位正常形成构象表位。
实施例4：对本发明抗体的表位的特征的鉴定
为了验证构象表位是否由实施例1、实施例2、实施例3所证明的结合位点形成的，进行了Western印记。在此，使用对应于蛋白变性条件的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶和对应于非变性条件的Native-PAGE凝胶，测量本发明抗体的取决于HBsAg结构的结合强度的差异。具体地，在蛋白变性条件下存在或不存在还原剂的情况中，在非线性化时，和在通过去除对于形成HBsAg的三级结构来说重要的二硫键而发生线性化时，观察构象表位的形成。
4-1.使用Native-PAGE的Western印记测定。
为了评价本发明抗体是否能识别天然形成的HBsAg的构象表位，使用没有SDS的NativePAGE凝胶进行Western印记。具体地，将含HBsAg的溶液与NativePAGETM样品缓冲液(Invitrogen,USA,Cat#BN2003)和NativePAGETM 5％G-250样品添加剂(Invitrogen,USA,Cat#BN2004)混合，然后加载到NativePAGETM 3-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Invitrogen,USA,Cat#BN1003BOX)上。跑胶约2小时之后，使用转移缓冲液(Invitrogen,USA,Cat#NP0006)将凝胶上的蛋白转至PVDF膜(Invitrogen,USA,Cat#LC2002)。使用含5％脱脂奶的磷酸盐缓冲液(PBS)-Tween20缓冲液对膜封闭1小时，之后将第一抗体添加到含3％脱脂奶的PBS-Tween20缓冲液中，将膜冷藏过夜。在此，作为本发明抗体的阳性对照，使用世界卫生组织(WHO)(WHO对于抗HB免疫球蛋白的国际标准，人(编码：07/164))的标准，并且作为阴性对照，使用抗HER2的抗体，其为针对人表皮生长受体2(HER2)的人源化抗体。使用PBS-Tween20缓冲液对膜进行充分冲洗，将缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗人Fc的第二抗体(Thermo Scientific,USA,Cat#31413)与含3％脱脂奶的PBS-Tween20缓冲液混合，然后处理1小时。使用PBS-Tween20缓冲液对膜进行充分冲洗，然后使用增强化学发光(ECL)底物进行处理，之后使用ChemiDoc(Bio-Rad,USA)观察HBsAg与每一测试的抗体的结合。
基于测试结果，保持其天然三级结构的HBsAg显示出与本发明抗体具有非常高的结合强度(图6a)。基于作为阳性对照的WHO标准和作为阴性对照的抗HER2抗体的测试结果，证实了该结合的特异性。WHO标准是从人的血液中纯化出的多克隆抗体，包括能识别HBsAg的线性表位和构象表位的所有抗体，并且在本测试中证实了其结合，而且用作非特异性抗体的抗HER2的抗体不被附接。
同时，已知HBsAg的分子量约为23kd，而在该测试中与抗体结合的HBsAg的分子量非常大，其中通过自组装以特定形式(具有22nm大小的亚病毒颗粒)形成天然HBsAg是公知的，这可被推断为天然现象(Ira Berkower et al.,J Virol.,Mar 2011；85(5):2439-2448)。
4-2.使用SDS-PAGE的Western印记测定。
为了更清楚地测定本发明抗体的表位的构象特征，使用SDS-PAGE凝胶和还原剂进行Western印记。整个测试程序与实施例4-1相同，下面进行简单描述。
首先，将HBsAg溶液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，在95℃反应5分钟，然后加载到4-20％Mini-PROTEAN TGX Precast凝胶上，进行跑胶。在此，制备了两种上样样品，其中一种添加有还原剂(NuPAGE样品还原剂(10×),Life Technologies,USA)以诱导完全的蛋白变性，另一种不包括还原剂以保持HBsAg的二硫键，从而导致不完全变性。跑胶之后，将HBsAg转至硝化纤维素(NC)膜，封闭，与第一抗体冷藏过夜。第一抗体的实例包括本发明抗体、WHO标准、HBIg(Hepabig，绿十字，韩国)和抗HER2的抗体。随后的程序与上面相同，因此省略对其的描述。
如其结果所示，本发明抗体不附接没有二硫键的完全线性化的HBsAg，而有效附接发生部分变性的HBsAg。用作阳性对照的WHO标准和HBIg是如实施例4-1中所述的多克隆抗体，包括能识别线性表位的抗体，从而与还原条件下完全线性化的HBsAg很好地结合。不管HBsAg的结构如何，抗HER2的抗体都不与HBsAg结合。在HBsAg的三级结构中，在蛋白中或在蛋白之间形成的二硫键的重要性是公知的(Mangold CM et al.,Arch Virol.,1997；142(11):2257-67))。
因此，通过二硫键保持HBsAg的三级结构对于本发明抗体的结合来说是必要的，因此可断定本发明抗体识别HBsAg的构象表位。
实施例5：本发明抗体与a-决定簇的各突变抗原的结合活性的评价。
为了评价本发明抗体与a-决定簇的四种突变抗原的结合活性，进行了ELISA。在患慢性乙型肝炎的患者中报道的、疫苗或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)诱导的逃逸突变体中发现了这些抗原，即在氨基酸第126位、第129位、第133位和第143位发生突变的抗原，这还产生在诊断时难以测量表面抗原的问题(Horvat et al.,Lab medicine,vol.42(8):488-496,2011)。从ProSpec Bio购买了这些抗原的重组蛋白。
图7示出了本发明抗体1、2对a-决定簇的突变抗原的反应性，下面的表5中总结了取决于存在或不存在反应性的阳性(+)和阴性(-)结果。
[表5]本发明抗体1、2对a-决定簇的突变HBsAg的结合活性的ELISA结果。
HBsAg 本发明抗体1 本发明抗体2
adw T126N + +
adw Q129H + +
adw M133H + +
adw T143K + +
如测试结果所示，本发明抗体1、2与a-决定簇的各种突变HBsAg都具有结合活性。因为本发明抗体能够识别HBsAg的第110位、第118位、第120位和/或第147位的表位，因此它可能不受具有高突变率的a-决定簇(氨基酸第124～147位)的影响。
第147位的氨基酸是对于形成构象来说很重要的残基，已知该残基的突变对传染性具有严重影响，因此预期实际突变率非常低。
因此，包括第110位、第118位、第120位和/或第147位的表位的疫苗组合物或与上述表位结合的抗体由于逃逸突变而效能降低的可能性很低，从而在预防或治疗HBV中是有用的。
实施例6：针对HBV的体外中和活性的验证。
为了验证本发明抗体针对HBV各基因型的中和活性，进行了体外中和测定。
对于HBV的体外中和测试是通过在病毒增殖的最活跃阶段测量细胞内和细胞外的病毒的量，来评价抗体的中和活性的方法，以依赖于每一抗体的处理情况评价抑制人肝细胞被病毒感染的程度。根据增殖的HBV DNA的量，测量细胞内病毒的量，根据培养基中的HBsAg和HBV DNA的量，测量增殖且分泌到细胞外的病毒的量。在此，使用TaqMan探针，通过实时PCR对HBV DNA进行定量，并且通过化学发光免疫测定(CLIA)对HBsAg进行定量。
6-1.第一体外中和测试
在病毒接种前一天，通过两步胶原酶灌注，从具有人源化肝脏组织的uPA/SCID嵌合小鼠制备对于HBV感染所必须的人肝细胞。将分离的肝细胞以每孔4×105的浓度施加到经1型胶原包被的24孔板上。作为培养基，每孔使用500μl含10％FBS(Atlas Biologicals,USA,F0500A)、1×青霉素/链霉素(Gibco,USA,15140)和20mM HEPES(Gibco,USA,15630)的DMEM(Gibco,USA,11965)。将制备的肝细胞培养在5％CO2加湿细胞培养箱中，37℃保持24小时。
以以下方式进行病毒感染，其中，将四种HBV基因型与本发明抗体混合，然后以每孔2×106的病毒浓度来施加，这四种HBV基因型被称为A型(Genebank登记号:AB246345.1)、B型(Genebank登记号:AB246341)、C型(Genebank登记号:AB246338.1)和D型(Genebank登记号:AB246347)，每一种均由具有人源化肝脏组织的嵌合小鼠产生。下面对其进行了详细描述。
A.病毒接种混合物的制备。
使用dHCGM培养基(DMEM+10％FBS,44mM NaHCO3,15μg/ml L-脯氨酸,0.25μg/ml胰岛素,50nM地塞米松,5ng/ml EGF,0.1mM Asc-2p,2％DMSO)混合病毒和各抗体，以便终体积是100μl，然后在室温下反应1小时。在此，病毒浓度是2×106，本发明抗体以10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的四种浓度进行稀释。
B.病毒接种
混合125μl dHCGM培养基和25μl 40％PEG(Sigma,USA,P1458)，然后添加在上面A中制备的病毒/抗体混合物，从而获得250μl的终接种混合物。从制备的细胞去除培养基并且引入接种混合物，然后培养24小时。
C.培养基更换和培养，以及分析样品的制备
在病毒接种之后，肝细胞培养总共12天，在第一天、第二天和第七天进行细胞冲洗和培养基更换。去除存在的培养基，使用500μl DMEM+10％FBS进行冲洗，重新放入相同量的dHCGM培养基。对于第七天的培养基更换，分别以300μl和30μl的量收集存在的培养基，以对从细胞分泌到细胞外的HBsAg和HBV DNA进行定量，在分析前储存在-20℃。
在培养12天结束之后，使用所有的细胞和培养基来进行细胞内/细胞外的病毒定量分析。分别收集培养基，用于以上面相同的方式测量HBsAg和HBV DNA，并且以用500μlDMEM+10％FBS冲洗每孔一次，然后用500μl SMITEST(Medical&Biological LaboratoriesCo.,Ltd.)溶液裂解的方式收集细胞。按照制造商(Medical&Biological LaboratoriesCo.,Ltd.)的方案进行HBV DNA的提取。
D.样品分析
使用TaqMan探针、TaqMan PCR核心试剂(Life Technologies,USA)和ABI Prism7500序列检测系统(Applied Biosystems,USA)，通过实时PCR进行HBV DNA的定量。另外，还通过作为CLIA辅助自动系统的ARCHITECT(Abbott,USA)来定量HBsAg。
[表6]用于HBV定量的实时PCR的引物/探针序列。
[表7]实时PCR程序
程序 循环
50℃2min 1
95℃10min 1
95℃20sec→60℃1min 53
阈值 0.1
图8a至图8d及图9a至图9d按照每一测量项目中的病毒基因型，示出了本发明抗体1、2的测试结果。
对比且分析了取决于每一抗体处理浓度的、细胞内HBV DNA的量。具体地，可发现本发明抗体1、2具有针对基因型C型的强中和活性，其中本发明抗体1、2是基于对基因型C型的HBsAg亚型adr的结合强度选择出来的。与用作阴性对照的抗HER2的抗体相比，在HBIg用作阳性对照的情况中HBV DNA的量降低至少400倍，在使用对应于其处理量1/10的1μg/ml本发明抗体2处理的样品中，也显示出相同水平的病毒DNA降低。对于本发明抗体1，甚至在0.1μg/ml的低处理浓度下，HBV DNA的量就降低了100倍，从而保持了相对高的中和活性。进一步地，与HBIg用作阳性对照时相比，本发明抗体1、2针对基因型A和B的中和活性比最大中和活性高两倍以上，并且针对基因型D的中和活性甚至在0.1μg/ml(本发明抗体1)或1μg/ml(本发明抗体2)的低浓度下也保持较高水平(图8a至图8d)。
发现本发明抗体1、2针对四种基因型A、B、C和D的中和活性与在培养基中测量的细胞外HBsAg的定量结果非常类似(图9a至图9d)。
总之，基于针对HBV的四种基因型A、B、C和D的体外中和活性的测量结果，本发明抗体1、2显示出针对所有所使用的病毒都具有高中和活性。
实施例7：对来源于慢性乙型肝炎患者的各病毒表面抗原基因型的结合特征的测 量。
为了评价本发明抗体1、2是否可通过与全球流行的各病毒基因型结合，来显示出中和活性，而使用世界卫生组织(WHO)的、包括来源于患者血清的各病毒表面抗原基因型的参考组(用于HBsAg测定的HBV基因型的第一WHO国际参考组,PEI编码6100/09)，进行夹心ELISA。在下面的表8中示出了对应标准的详细信息，测试方法如下。
将浓度为2μg/ml的两种抗体以100μl的量分装到包被有抗人的IgG Fcγ(伽马)抗体(Jackson ImmunoResearch,U.S.A,109-006-098)的96孔微量滴定板(Nunc,丹麦,449824)的每一孔中，然后吸附在其中。冲洗之后，微量滴定板经含3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(Teknova,USA,D5120)处理，以进行封闭。再次冲洗之后，以每孔100μl的量分装15种HBsAg基因型组的血清样品，在37℃孵育90分钟。在此，每一血清样品经含1％BSA的磷酸盐缓冲液(Teknova,USA,D5120)适当稀释，以在450/620nm具有约0.8～1.2的吸光度。为了检测附接至抗体的HBsAg，在37℃，处理经过氧化物酶标记的兔抗HBV表面抗原的抗体(Thermo Scientific,U.S.A.,PA1-73087)60分钟。以与实施例5相同的方式进行颜色显影、反应终止和吸光度测量。使用Excel(Microsoft,U.S.A.)，对两种抗体与每一HBV表面抗原基因型的反应性进行绘图，并进行分析(图10)。
基于分析结果，本发明抗体1、2二者均有效结合15种HBsAg样品。如上所述，该表面抗原样品是从患者血液中实际制备的血清，涵盖所有八种HBV基因型中的A至H七种基因型，不包括基因型G型。另外，具有多种亚基因型的基因型A型、B型、C型、D型和F型包括在每一基因型中占优势的亚基因型和亚型(血清型)的两种至三种样品，这意味着用于测试的WHO的HBV基因型组基本代表在全世界流行最多的HBV基因型。该组不包括基因型G型，且基因型G型迄今还没有报道有亚基因型，并且以亚型(血清型)adw2为特征，因此可基于该组中包括的五种adw2样品的测试结果，来预测本发明抗体1、2与基因型G型的结合活性。
因此，本发明抗体1、2显示出与15种样品都具有优秀的结合活性，这意味着这两种抗体能结合HBV的全世界所有的基因型，因此表明具有相应的中和活性。
[表8]患者来源的血清HBV表面抗原组的详细信息(用于HBsAg测定的HBV基因型的第一WHO国际参考组,PEI编码6100/09)。
实施例8：与各耐药性病毒的结合特征的评价
使用与实施例7相同的夹心ELISA，测量本发明抗体1、2与突变体之间的结合特征，所述突变体耐受广泛用于慢性乙型肝炎患者的HBV聚合酶抑制剂，例如拉米夫定(LMV)、阿德福韦(ADV)、克来夫定(CLV)和恩替卡韦(ETV)。包括测试中所使用的野生型病毒的所有耐受性突变体病毒均是在建国大学医学院药理学系，使用获自对相应的药物治疗具有耐受性的患者血液的HBV DNA克隆得到的，并且是通过使用Huh7细胞系或HepG2细胞系转导，实验证实了该菌株的耐药性(Ahn et al.,Journal of Virology,88(12):6805-6818,2014)的菌株。所有病毒都是基因型C型，各病毒的特征示于下面的表9中。
使用Lipofectamine2000(Life technologies,11698019)，将这样制备的各HBV表达载体转导到在T75培养瓶(BD BioScience,353136)中生长的Huh7细胞系中，培养3天以产生病毒。使用Centricon(Millipore,U.S.A.)浓缩所产生的病毒，使用Monolisa HBsAgUltra(BioRad,72346)ELISA试剂盒，将各样品的病毒量与HBsAg的量进行对比，然后进行适当稀释以具有类似的值，从而用于测试。
基于测试结果，示出本发明抗体1、2二者均以与野生型病毒相同的水平，具有与耐受拉米夫定(LMV)、阿德福韦(ADV)、克来夫定(CLV)和恩替卡韦(ETV)的病毒的结合活性(图11)。在此，与耐受ADV的病毒的结合活性似乎相对较低，但认为这是因为相应的样品自身产量略低于其他样品的产量。
这意味着，本发明抗体1、2不仅针对用于测试的一种耐药病毒，而且针对耐受相应药物的大部分病毒，都能具有结合活性和中和活性。这是因为引起HBV耐药性的突变与如表9中所示的、HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域的特定氨基酸突变有关，这样的突变对于各药物非常特定地发生。基于基因共享的HBV的特征，这种特定的聚合酶突变包括HBsAg的特定突变。例如，聚合酶的rtM204I突变导致HBsAg的W196L突变，而rtA181V突变导致HBsAg的L173F突变。不管由耐药性突变所导致的表面抗原突变如何，都可被本发明抗体1、2有效结合。
进一步地，除了上述耐受性的特定表面抗原突变(表9)之外，在本测试中使用的各耐受性病毒都具有很多非特定出现的表面抗原突变。该结果表明，本发明抗体1、2对HBsAg的Q101R、K112R、I126S、L175S、A184V、I185M位发生突变的病毒具有结合活性和中和活性。
[表9]用于测试的耐药性病毒的信息
菌株 HBV聚合酶的突变位置(RT结构域) HBsAg的突变位置
野生型(基因型C) N/A N/A
耐受LMV的病毒 L80I、M204I W196L
耐受ADV的病毒 A181V I126S、L173F、L175S
耐受CLV的病毒 M204I Q101R、I126S、A184V、W196L
耐受ETV的病毒 L180M、M204V Q101R、K112R、I185M
实施例9：抗原-抗体结合亲和力的测量
为了测量本发明抗体的抗原-抗体结合亲和力，进行了表面等离子体共振(SPR)。具体地，在25℃，使用分析缓冲液HBS-EP(10mM HEPES[pH 7.4],150mM NaCl,3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)，利用Biacore T200(GE Healthcare)，通过SPR分析，确定重组HBsAg(亚型adr,ProSpec Bio)和本发明抗体的结合亲和力。使用氨基偶联试剂盒，按照制造商的方案和程序，以约500RU，将稀释在10mM的乙酸钠(pH 5.0)中的50μg/ml HBsAg蛋白直接固定在用于CM5研究的生物传感器芯片上。使用乙醇胺封闭在生物传感器表面上不反应的部分。对于反应分析，使用Biacore T200对照软件和Biacore T200评价软件。将本发明抗体稀释在HBS-EP缓冲液中。在测试过程中，没有固定HBsAg的生物传感器表面在所有测量中用作对照。以30μl/min的流速，确定结合速率常数Ka(M-1s-1)和解离速率常数Kd(s-1)。通过以2.46～200nM的抗体浓度测量反应结合，并且使用缓冲液作为对照，使用3倍系列稀释液获得速率常数。随后，使用等式KD＝Kd/Ka，根据反应速率常数，计算抗体与靶抗原之间的反应的平衡解离常数KD(M)。通过作为时间和反应速率常数的函数进行计算，来记录所述结合。
测试结果示于下面的表10中，从中证实了本发明抗体与HBsAg的高结合亲和力。
[表10]使用重组的HBsAg对结合亲和力的测量
<110> 赛特瑞恩股份有限公司
<120> 乙型肝炎病毒表面抗原的表位及与其特异性结合以中和乙型肝炎病毒的结合分子
<130> CPD2015041KR
<150> KR 10-2014-0167937
<151> 2014-11-28
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBsAg
<400> 1
Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys
35 40 45
Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly
100 105 110
Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg
145 150 155 160
Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile
195 200 205
Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HBV DNA定量的实时PCR的正向引物
<400> 2
cacatcagga ttcctaggac c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HBV DNA定量的实时PCR的反向引物
<400> 3
aggttggtga gtgattggag 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HBV DNA定量的实时PCR的TaqMan探针
<400> 4
cagagtctag actcgtggtg gacttc 26

Claims (15)

1.一种3mer至38mer的表位，所述表位选自乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的第106～151位的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的表位，其中，所述表位是所述乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的第106～110位、第107～111位、第108～112位、第109～113位、第110～114位、第114～118位、第115～119位、第119～123位、第120～124位、第143～147位、第144～148位、第145～149位、第146～150位、第147～151位、第110～118位、第118～120位、第116～120位、第117～121位、第118～122位、第120～147位、第110～120位、第118～147位或第110～147位的氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的表位，其中，所述表位是所述乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的第110～120位或第110～147位的氨基酸。
4.一种用于中和乙型肝炎病毒(HBV)的结合分子，所述结合分子特异性结合以下表位，所述表位包括选自由乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的第110位、第118位和第120位的氨基酸所组成的组中的至少一个氨基酸残基。
5.根据权利要求4所述的结合分子，其中，所述表位进一步包括第147位的氨基酸。
6.根据权利要求4或5所述的结合分子，其中，所述结合分子具有小于1×10-9M的结合亲和力。
7.根据权利要求4或5所述的结合分子，其中，所述结合分子是抗体或其片段。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其中，所述抗体是人单克隆抗体。
9.一种编码权利要求1～3中任一项所述的表位的多核苷酸。
10.一种包括权利要求9所述的多核苷酸的表达载体。
11.一种重组的微生物或病毒，所述重组的微生物或病毒是经权利要求10所述的表达载体转化的。
12.一种生产表位的方法，包括培养权利要求11所述的重组的微生物或病毒。
13.一种HBV(乙型肝炎病毒)疫苗组合物，包括：权利要求1～3中任一项所述的表位，或编码权利要求1～3中任一项所述的表位的多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，进一步包括药学上可接受的佐剂。
15.一种用于检测HBV的组合物，包括：权利要求1～3中任一项所述的表位，或编码权利要求1～3中任一项所述的表位的多核苷酸。
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