JP2017536832A - B型肝炎ウイルス表面抗原のエピトープおよびこれに特異的に結合するb型肝炎ウイルス中和結合分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の抗体のHBsAg上の結合部位を確認するために、HBsAgの野生型および各種欠損突然変異を製造し、これに対する結合能力をファージ(Phage)を用いたenzyme−linked immunosorbent assay(ELISA)で調べた。
野生型HBsAgおよびこれを3つの部分に分けた欠損突然変異蛋白質をファージの表面に発現させるために、ファージの発現ベクターを用いてクローニングを行った。詳細な実験方法は次の通りである。HBsAg野生型と部位毎欠損突然変異をクローニングするために、HBV遺伝子型CのHBsAg遺伝子塩基配列を含んでいるHBVベクター(韓国の建国大学医学専門大学院薬理学教室)を鋳型として重合酵素連鎖反応(PCR)によりそれぞれに対する遺伝子を増幅した。これに制限酵素SfiIを処理した後、同一の制限酵素で処理されたファージ発現ベクターにそれぞれ挿入した。作製されたプラスミドは、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、Germany、Cat#27106)を用いて抽出され、抽出されたDNAを用いて、塩基配列の分析により最終的に抗体の塩基配列を確認した。完成した各クローンの名称およびHBsAg部位は表1の通りである。
クローニングされたHBsAg全体あるいは一部に対する結合実験を行うために、まず、発現用大膓菌(ER2738、Lucigen、USA、Cat#60522−2)にエレクトロポレーション(electroporation)によりベクターを挿入した後、抗生剤(ampicillin)耐性のある大膓菌を選択的に翌日培養し始めた。約10時間程度培養した後、バクテリオファージ(bacteriophage)を感染させ、感染した大膓菌を選択的に培養するために、他の種類の抗生剤(kanamycin)を使用した。翌日バクテリオファージを抽出するために、まず、大膓菌を遠心分離機で分離した後、上層液にpolyethylene glycol(PEG)を処理して30分間氷に放置し、再び遠心分離機でバクテリオファージを分離した。分離されたバクテリオファージを溶かした後、上層液をフィルタリングしてHBsAg全体あるいは一部を表面に有している純粋なバクテリオファージを抽出した。
実施例1で確認した本発明の抗体の主要結合部位に基づいてエピトープ部位を特定するために、Region2の開始アミノ酸である101番から15個のアミノ酸を順次に切っていく連続欠損(serial deletion)突然変異を製造した後、バクテリオファージの表面に露出させて、ELISAにより本発明の抗体に対する結合力を確認した。
Region2+3のクローンを基準としてアミノ酸15個ずつ欠損突然変異を製造した。完成した各クローンの名称およびHBsAg部位は表2の通りである(図3参照)。詳細なクローニング過程は実施例1−1と重複するので省略する。
実施例1−2と同様の方法で4種の連続欠損突然変異が表面に露出しているバクテリオファージを抽出して、ELISAを行った。
本発明の抗体のエピトープをさらに正確に究明するために、米国のインテグラルモレキュラー(Integral Molecular)社のショットガン突然変異法(shotgun mutagenesis,J Am Chem Soc.2009;131(20):6952〜6954等参照)を利用して、HBsAg(adr subtype)内にランダム突然変異(random mutagenesis)を導入させて、各突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合能力を測定した。実験に使用された突然変異抗原のライブラリーの特性は表3の通りである。作製されたライブラリーそれぞれのクローンは、384−wellプレートに培養されたHEK−293T細胞で発現した。
突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合能は、免疫蛍光FACS分析法で3回繰り返し測定され、野生型HBsAgに対する反応性を基準として標準化(normalization)が行われた。また、HBsAgに対するマウス単クローン抗体であるorb43805を対照抗体として用いた結合能の結果は、実験結果の信頼度確認およびエピトープの選定に対する基準設定に使用された。すなわち、対照抗体のorb43805に対する結合反応性が野生型HBsAgに対する結合反応性対比55%以上(>55%WT)でかつ、同時に本発明の抗体に対する結合反応性が野生型対比15%未満(<15%WT)であるクローンに存在する突然変異残基を、本発明の抗体の結合に必須の核心残基(critical residue)として選別した。
実施例1、2および3を通して明らかにされた結合部位が構造エピトープを形成するかを確認するために、Western blotを行った。この時、蛋白質の変性条件であるSodium dodecyl sulfate−Polyacrylamide gel electrophoresis(SDS−PAGE)ゲルと、非変性条件であるNative−PAGEゲルをすべて用いて、HBsAgの構造による本発明の抗体との結合力の差を究明した。特に、蛋白質の変性条件内においても還元剤(reducing agent)の使用の有無によってHBsAgの三次構造の形成に重要な二硫化結合(disulfide bond)を除去して完全に線状化(linearization)させた場合と、そうでない場合とに分けて、構造エピトープ形成の有無を綿密に検討した。
本発明の抗体が自然的に形成されたHBsAgの構造エピトープを認識するか否かを評価するために、SDSが添加されていないNativePAGEゲルを用いてWestern blotを行った。まず、HBsAgが入っている溶液にNativePAGETM Sample Buffer(Invitrogen、USA、Cat#BN2003)とNativePAGETM5%G−250 Sample Additive(Invitrogen、USA、Cat#BN2004)とを混合した後、NativePAGETM Novex(R)3−12%Bis−Tris Protein Gel(Invitrogen、USA、Cat#BN1003BOX)にローディングした。2時間程度のゲルラニング後、NuPAGE(R) Transfer Buffer(Invitrogen、USA、Cat#NP0006)を用いて、ゲルにある蛋白質をPVDF membrane(Invitrogen、USA、Cat#LC2002)にトランスファー(transfer)した。1時間5%スキムミルク(skim milk)が含まれたPhosphate buffered saline(PBS)−Tween20バッファーでmembraneブロッキングを行った後、3%スキムミルクが含まれたPBS−Tween20バッファーに一次抗体を混合してmembraneに一晩冷蔵処理した。この時、本発明の抗体に対する陽性対照群として、World Health Organization(WHO)の標準品(WHO International Standard for anti−HBs immunoglobulin、human(code:07/164))を使用し、陰性対照群としては、human epidermal growth receptor2(HER2)に対するヒト化抗体である抗−HER2抗体を使用した。PBS−Tween20バッファーでmembraneを十分にウォッシュ(wash)した後、二次抗体として、Horseradish Peroxidase(HRP)付きのanti−human Fc(Thermo Scientific、USA、Cat#31413)を3%スキムミルクが含まれたPBS−Tween20バッファーに混合した後、1時間処理した。PBS−Tween20バッファーで十分にウォッシュした後、enhanced chemiluminescent(ECL)基質を処理後、ChemiDoc(Bio−Rad、USA)機器を用いて、HBsAgとテストされた各抗体との間の結合の有無を観察した。
本発明の抗体に対するエピトープの構造的特性をより綿密に分析するために、SDS−PAGEゲルおよび還元剤を用いてWestern blotを行った。全般的な実験の過程は実施例4−1と同一であり、簡略に示すと次の通りである。
a決定基上の4つの突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合活性を確認すべく、ELISAを行った。これらの抗原はそれぞれ126、129、133、143番のアミノ酸位置で変異を有するものであって、実際に慢性B型肝炎患者で報告されたHepatitis B Immune globulin(HBIg)またはワクチンに対する回避突然変異から発見されたものだけでなく、診断においても表面抗原の測定がままならないなどの問題を起こすものである(Horvat et al.,Labmedicine,vol.42(8):488−496,2011)。これら抗原の組換え蛋白質は前記ProspecBio社から購入した。
多様な遺伝子型のB型肝炎ウイルスに対する本発明の抗体の中和力を検証するために、試験管内中和実験(in vitro neutralization assay)を行った。
B型肝炎ウイルスの感染に必要なヒト肝細胞は、ウイルス接種1日前日、ヒト化された肝組織を持っているキメラマウス(uPA/SCID mouse with humanized liver)から2段階のコラゲナーゼパーフュージョン(collagenase perfusion)方法により用意された。分離された肝細胞は、第1型コラーゲンが塗布されている24−ウェルプレートにウェルあたり4×105個ずつ敷き、この時、培地としては、10%FBS(Atlas Biologicals、USA、F0500A)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(pecinillin/streptomycin;Gibco、USA、15140)と20mMヘペス(HEPES;Gibco、USA、15630)が含まれたDMEM(Gibco、USA、11965)が各ウェルあたり500μlずつ使用された。用意された肝細胞は、37℃の5%CO2湿潤(humidified)細胞培養器で24時間培養された。
dHCGM培地(DMEM+10%FBS、NaHCO3 44mM、L−proline15ug/ml、insulin0.25ug/ml、dexamethasone50nM、EGF5ng/ml、Asc−2p0.1mM、DMSO2%)を用いて、最終的に100μlとなるようにウイルスと各抗体とを混合して、常温で1時間反応させた。この時、ウイルスは2×106個となるようにし、本発明の抗体は10、1、0.1、0.01ug/mlの4つの濃度となるように希釈した。
125μlのdHCGM培地に25μlの40%PEG(Sigma、USA、P1458)を混合した後、Aで用意したウイルス/抗体混合物を入れることにより、最終的に250μlの接種混合物を用意した。用意された細胞から培地を除去した後、接種混合物を入れて、その後、24時間培養した。
ウイルスの接種後、肝細胞は計12日間培養され、1日、2日、7日目に細胞のwashingおよび培地の交換が行われた。既存の培養液を除去した後、500μlのDMEM+10%FBSでウォッシングを行い、同量のdHCGM培地を新たに入れた。そして、7日目の培地交換の場合、既存の培養液は、細胞から新たに生産されて排出された細胞外HBsAgとHBV DNA定量のために、それぞれ300μlと30μlずつ集めておき、分析時点まで−20℃に保管された。
HBV DNA定量は、TaqMan probe、TaqMan PCR Core Reagents(Life Technologies、USA)、そしてABI Prism 7500 sequence detector system(Applied Biosystems、USA)を用いたrealtime−PCR方法で行われた。HBsAg定量は、CLIA方法を用いた自動化システムであるARCHITECT(Abbott、USA)で行われた。
本発明の抗体1、2が実際に全世界的に流行する多様な遺伝子型のウイルスに対して結合して中和効力を示し得るかを確認すべく、患者血清由来の多様な遺伝子型ウイルスの表面抗原からなっているWorld Health Organization(WHO)のreference panel(1st WHO International Reference Panel for HBV Genotypes for HBsAg Assays、PEI code6100/09)を用いてsandwich ELISAを行った。当該標準品の詳細情報は表8の通りであり、実験方法は下記の通りである。
慢性B型肝炎患者に広く使用されるHBV重合酵素の抑制剤であるラミブジン(lamivudine、LMV)、アデホビル(adefovir、ADV)、クレブジン(clevudine、CLV)、エンテカビル(entecavir、ETV)に対する耐性突然変異と本発明の抗体1、2との間の結合特性を、前記実施例7で用いた方法と同様のsandwich ELISA法を用いて確認した。実験に使用された野生型ウイルスをはじめとするすべての耐性突然変異ウイルスは、当該薬物治療に対する耐性が発生した患者の血液から得たHBV DNAを用いて、建国大学医学専門大学院薬理学教室でクローニングされたものであって、Huh7細胞株あるいはHepG2細胞株を用いた形質導入実験を通して薬剤耐性が実験的にも確認された菌株である(Ahn et al.,Journal of Virology,88(12):6805−6818、2014)。すべてのウイルスは遺伝子型C型であり、各ウイルスの特徴は表9の通りである。
本発明の抗体の抗原−抗体の結合親和度を測定するために、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance、以下、SPR)検定を利用した。具体的には、組換えHBsAg(adr subtype、ProspecBio)と本発明の抗体との結合親和度は、25℃で分析緩衝液HBS−EP(10mM HEPES[pH7.4]、150mM NaCl、3mM EDTAおよび0.005%界面活性剤P20)を使用するBiacore T200(GE Healthcare)装備で表面プラズモン共鳴分析により決定された。10mM酢酸ナトリウム(Sodium Acetate、pH5.0)中に希釈されたHBsAg蛋白質50μg/mlを製造会社の指針および手順に従って、アミンカップリングキット(Amine coupling kit)を用いてCM5研究用バイオセンサチップに約500RUだけ直接的に固定させた。バイオセンサの表面で反応しない部分をエタノールアミン(ethanolamine)で遮断した。反応分析のために、Biacore T200コントロールソフトウェア、Biacore T200エバリュエーションソフトウェアを用いた。本発明の抗体は、HBS−EP緩衝液に希釈した。検定過程で、すべての測定は、固定されたHBsAgのないバイオセンサの表面を対照群として使用した。結合および分離速度定数Ka(M−1s−1)およびKd(s−1)は、30μl/分の流速で決定した。速度定数は3倍の連続希釈であって、2.46〜200nM範囲の抗体濃度で反応結合測定を実施し、緩衝液を対照群として用いることにより獲得した。次に、抗体と標的抗原との間の反応に対する平衡解離定数KD(M)を反応速度定数から次の等式によって計算した:KD=Kd/Ka。結合は、時間と反応速度定数の関数を計算して記録する。
Claims (15)
- B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)のアミノ酸位置106−151の中から選択された3〜38merのエピトープ。
- 前記エピトープは、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)のアミノ酸位置106−110、107−111、108−112、109−113、110−114、114−118、115−119、119−123、120−124、143−147、144−148、145−149、146−150、147−151、110−118、118−120、116−120、117−121、118−122、120−147、110−120、118−147または110−147であることを特徴とする請求項1に記載のエピトープ。
- 前記エピトープは、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)のアミノ酸位置110−120または110−147であることを特徴とする請求項1または2に記載のエピトープ。
- B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)のアミノ酸位置110、118および120からなる群より選択された1つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合するB型肝炎ウイルス(HBV)中和結合分子。
- 前記エピトープは、アミノ酸位置147を追加的に含むことを特徴とする請求項4に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、1×10−9M未満の結合親和度を有することを特徴とする請求項4または5に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項4または5に記載の結合分子。
- 前記抗体は、ヒト単一クローン抗体であることを特徴とする請求項7に記載の結合分子。
- 請求項1〜3から選択されたいずれか1項に記載のエピトープを暗号化するポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項10に記載の発現ベクターが形質転換された組換え微生物またはウイルス。
- 請求項11に記載の組換え微生物またはウイルスを培養するステップを含むエピトープを生産する方法。
- 請求項1〜3から選択されたいずれか1項に記載のエピトープまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含むHBVワクチン組成物。
- 薬学的に許容可能な免疫補助剤(adjuvant)を追加的に含むことを特徴とする請求項13に記載のワクチン組成物。
- 請求項1〜3から選択されたいずれか1項に記載のエピトープまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含むHBV検出用組成物。
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