CN105849262A - 抗lps o11抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供具有针对铜绿假单胞菌的优越抗菌活性的物质和用于假单胞菌感染的治疗和/或预防的药物组合物。提供含有与铜绿假单胞菌的LPS O11抗原特异性结合并且具有优越抗菌活性的抗体的药物组合物。

Description

抗LPS O11抗体
技术领域
本发明涉及可用作假单胞菌感染(pseudomonal infection)的治疗剂和/或预防剂的物质，并涉及用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种存在于自然环境中的典型的常驻微生物群，并且作为在免疫受损的人中引起机会感染的病原体是众所周知的。另外，铜绿假单胞菌是因健康护理相关感染的高分离率和死亡率而最成问题的菌种之一。据报告，铜绿假单胞菌的分离率在所有健康护理相关致病感染中是第6最高，对于患有源于气管插管术的肺炎的患者为第2最高，且由铜绿假单胞菌所致死亡率在血流感染中为27.6-47.9%，在气管插管术中为42.1-87% (非专利文献1-3)。另外，由于铜绿假单胞菌本来对消毒药和抗生素具有高抗性，并且有已获得抗药性的许多菌株，因此常常难以治疗假单胞菌感染。铜绿假单胞菌的抗微生物剂包括碳青霉烯类、头孢类、青霉素类、喹诺酮类等，并且针对这些抗微生物剂的耐药率是高耐药率，分别为例如25.3%、11.2%、17.5%和30.7% (非专利文献1)。因此需要对多重耐药性铜绿假单胞菌也有效的新的抗铜绿假单胞菌药物，尤其因为几乎没有针对对上述抗微生物剂显示抗性的多重耐药性细菌有效的抗微生物剂。
铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，在表面层上具有脂多糖(LPS)，在这种LPS外部具有称为O抗原的糖链结构。O抗原具有抗原性，并且因为其多样性，已被用作细菌菌株的分类方法(非专利文献4和5)。一般已知铜绿假单胞菌的20种LPS O抗原血清型，而且近年来，已报告了具有O11抗原的菌株(O11菌株)在多重耐药性铜绿假单胞菌中占有高比率。据报告在日本，多重耐药性铜绿假单胞菌中的O11菌株的分离率为99%或约60%，在欧洲，例如法国、比利时和捷克共和国，还有报告称多种多重耐药性铜绿假单胞菌菌株为O11菌株(非专利文献6-11)。
已知抗体提供体内针对感染的长期保护。据报告，针对铜绿假单胞菌的LPS O抗原的许多抗体通过其在动物感染模型中对感染的调理吞噬杀伤活性而显示治疗功效(非专利文献12-14)。 据此，预期针对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原的这类抗体是针对多重耐药性铜绿假单胞菌的新的药物，并且已有一些有关抗LPS O11抗体的报告(专利文献1和2)。
本发明涉及靶向铜绿假单胞菌O11菌株的治疗性和诊断性抗体。需要具有高活性的治疗性和诊断性抗体，且其调理吞噬杀伤活性是重要的。另外，已知抗体具有高抗原特异性，需要具有能够广泛覆盖O11菌株的高覆盖比率的抗体作为治疗性和诊断性抗体。由于本发明抗体是抗LPS O11抗原的抗体，显示与常规抗体相比较强的调理吞噬杀伤活性和较高的覆盖比率，因此它们更有用。
引文表
专利文献
专利文献1：WO 2006/084758
专利文献2：WO 2011/102551
非专利文献
非专利文献1：Infect. Control Hosp. Epidemiol., 29, 996-1011 (2008)
非专利文献2：DATAMONITOR, DMHC2281, Nosocomial infections (2007)
非专利文献3：Chest, 139, 909-919 (2011)
非专利文献4：Crit. Rev. Microbiol., 17, 273-304 (1990)
非专利文献5：J. Endotoxin Res., 12, 324-335 (2006)
非专利文献6：J. Clin. Microbiol., 45, 979-989 (2007)
非专利文献7：Inter. J. Antimicrob. Agents, 39, 518-521 (2012)
非专利文献8：J. Clin. Microbiol., 49, 2578-2583 (2011)
非专利文献9：J. Antimicrob. Chemother., 65, 866-871 (2010)
非专利文献10：Research in Microbiology, 161, 234-242 (2010)
非专利文献11：PLoS ONE, 6, e25617 (2011)
非专利文献12：Infect. Immun., 57, 174-179 (1989)
非专利文献13：FEMS Microbiol. Immunol., 2, 263-268 (1990)
非专利文献14：Infect. Immun., 66, 4137-4142 (1998)
发明概述
技术问题
本发明的目的是提供具有针对铜绿假单胞菌的优良的抗微生物活性的物质，并提供用于假单胞菌感染的治疗剂和/或预防剂。
解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题进行了广泛研究，结果他们成功获得了与铜绿假单胞菌的LPS O11抗原特异性结合且对假单胞菌感染具有治疗和/或预防作用的新的抗体。根据这些研究结果完成了本发明。
也就是说，本发明包括以下发明。
(1) 一种抗体或其抗原结合片段，其识别铜绿假单胞菌的LPS；与O11抗原结合而不与O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原和O抗原缺乏型菌株结合，且针对O11临床分离株的覆盖比率为85%或更高。
(2) (1)的抗体或其抗原结合片段，其中对O11临床分离株的覆盖比率为95%或更高。
(3) 一种抗体或其抗原结合片段，其识别铜绿假单胞菌的LPS；与O11抗原结合而不与O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原和O抗原缺乏型菌株结合，且针对由ATCC 29260识别的铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤活性的50%最低生长抑制浓度为12 ng/mL或更低。
(4) (3)的抗体或其抗原结合片段，其中针对由ATCC 29260识别的铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤活性的50%最低生长抑制浓度为4.1 ng/mL或更低。
(5) 一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于它与选自以下抗体的至少一种交叉竞争：含有包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；含有包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；和含有包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体。
(6) (5)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于它与至少一种抗体与之结合的表位结合，其中抗体选自含有包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；含有包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；和含有包含SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体。
(7) (1)-(6)中任一个的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且CDRH1包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列，和
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且CDRL1包含SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列。
(8) (7)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(9) (1)-(6)中任一个的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且CDRH1包含SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 19所示氨基酸序列，和
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且CDRL1包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列。
(10) (9)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(11) (1)-(6)中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且CDRH1包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 26所示氨基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 27所示氨基酸序列，和
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且CDRL1包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列。
(12) (11)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(13) (1)-(12)中任一个的抗体的抗原结合片段，其特征在于选自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
(14) (1)-(12)中任一个的抗体，其特征在于是scFv。
(15) (1)-(12)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于是嵌合抗体。
(16) (1)-(12)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于是人源化抗体。
(17) (1)-(16)中任一个的抗体，其中重链含有人免疫球蛋白G1重链的恒定区，轻链含有人免疫球蛋白κ轻链的恒定区。
(18) 一种抗体或其抗原结合片段，其对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性，其特征在于所述抗体含有：
(a) 选自下列氨基酸序列的重链可变区序列：
a1) 包含SEQ ID NO: 57所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 63所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 65所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
a8) 在选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和
(b) 选自下列氨基酸序列的轻链可变区序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
b8) 在选自b1)-b5)中的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
(19) (18)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(20) (18)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(21) 对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有：
(a) 选自下列氨基酸序列的重链可变区序列：
a1) 包含SEQ ID NO: 77所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 83所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 85所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
a8) 在选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和
(b) 选自下列氨基酸序列的轻链可变区序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
b8) 在选自b1)-b5)中的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
(22) (21)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(23) (21)的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(24) (18)-(23)中任一个的抗体，其包含包括来自羧基端的一个至几个氨基酸的缺失的重链。
(25) 一种药物组合物，其包含(1)-(24)的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
(26) (25)的药物组合物，其特征在于是用于假单胞菌感染的治疗剂和/或预防剂。
(27) 用于治疗和/或预防假单胞菌感染的药物组合物，其特征在于包含(1)-(24)中任一个的抗体或其抗原结合片段的至少一种和选自以下的至少一种：青霉素、头孢(cephem)、碳青霉烯(carbapenem)、单环内酰胺、喹诺酮、氨基糖苷、多黏菌素、利福平和大环内酯抗微生物剂。
(28) (26)或(27)的药物组合物，其特征在于假单胞菌感染是由多重耐药性铜绿假单胞菌引起的全身性感染疾病。
(29) (26)或(27)的药物组合物，其特征在于假单胞菌感染是：
血流感染、脓毒症、脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎、肺脓肿、脓胸、慢性呼吸道感染、腹膜炎、术后感染、胆囊炎、胆管炎、眼睑肿瘤、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎、眶感染、泌尿道感染、导管感染、肛周脓肿、烧伤创面二次感染、褥疮感染、囊性纤维化疾病、淋巴管炎、淋巴结炎、骨髓炎、关节炎、扁桃体炎、肝脓肿、皮肤和软组织感染、子宫内感染、子宫附件炎、子宫旁组织炎、下颌周围蜂窝织炎或颌炎。
(30) (26)或(27)的药物组合物，其特征在于假单胞菌感染是肺炎。
(31) 一种用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于给予(1)-(24)的抗体或其抗原结合片段的至少一种或(26)或(27)的药物组合物。
(32) 一种用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于同时或序贯给予(1)-(24)中任一个的抗体或其抗原结合片段的至少一种或(26)的药物组合物和选自以下的至少一种：青霉素、头孢、碳青霉烯、单环内酰胺、喹诺酮、氨基糖苷、多黏菌素、利福平和大环内酯抗微生物剂。
(33) (31)或(32)的用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于假单胞菌感染是由多重耐药性铜绿假单胞菌引起的全身性感染疾病。
(34) (33)的用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于假单胞菌感染是血流感染、脓毒症、脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎、肺脓肿、脓胸、慢性呼吸道感染、腹膜炎、术后感染、胆囊炎、胆管炎、眼睑肿瘤、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎、眶感染、泌尿道感染、导管感染、肛周脓肿、烧伤创面二次感染、褥疮感染、囊性纤维化疾病、淋巴管炎、淋巴结炎、骨髓炎、关节炎、扁桃体炎、肝脓肿、皮肤和软组织感染、子宫内感染、子宫附件炎、子宫旁组织炎、下颌周围蜂窝织炎或颌炎。
(35) (33)的用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于假单胞菌感染是肺炎。
(36) 一种用于假单胞菌感染的诊断剂，其特征在于含有(1)-(24)的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
(37) 一种用于铜绿假单胞菌的检测试剂盒，其特征在于含有(1)-(24)的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
(38) 一种多核苷酸，其编码(1)-(24)的任一种抗体。
(39) (38)的多核苷酸，其特征在于含有：
(a) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
a1) 包含SEQ ID NO: 56所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 58所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 60所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 62所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 64所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
a8) 在严格条件下与包含与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a9) 在选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的核苷酸序列；和
(b) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
b1) 包含SEQ ID NO: 66所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 72所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
b8) 在严格条件下与包含与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b9) 在选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列。
(40) (39)的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 58所示核苷酸序列的核苷酸58-432的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
(41) (39)的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 60所示核苷酸序列的核苷酸58-432的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
(42) (38)的多核苷酸，其特征在于含有：
(a) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
a1) 包含SEQ ID NO: 76所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 78所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 80所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 82所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
a8) 在严格条件下与包含与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a9) 在选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的核苷酸序列；和
(b) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
b1) 包含SEQ ID NO: 66所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 72所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
b8) 在严格条件下与包含与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b9) 在选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列。
(43) (42)的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 78所示核苷酸序列的核苷酸58-420的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
(44) (42)的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 80所示核苷酸序列的核苷酸58-420的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
(45) 一种载体，其含有(38)-(44)的多核苷酸的任一个。
(46) 一种转化的宿主细胞，其含有(38)-(44)的多核苷酸的任一个。
(47) 一种转化的宿主细胞，其含有(45)的载体。
(48) 一种用于产生(1)-(24)中任一个的抗体的方法，所述方法包括培养(46)或(47)的宿主细胞和从所得培养产物中纯化抗体的步骤。
发明的有利效果
按照本发明，可获得用于是包括多重耐药性铜绿假单胞菌在内的铜绿假单胞菌引起的全身性感染疾病的假单胞菌感染的治疗剂和/或预防剂。
附图简述
图1显示No. 76抗体的各个CDR序列的氨基酸序列。
图2显示#1G5抗体的各个CDR序列的氨基酸序列。
图3显示#4C12抗体的各个CDR序列的氨基酸序列。
图4是显示对铜绿假单胞菌O11菌株的结合特异性的图示。
图5是显示对铜绿假单胞菌ATCC 29260所致肺部感染小鼠模型的治疗功效(静脉内给予)的图示。
图6是显示对由铜绿假单胞菌临床分离株No. 12所致肺部感染小鼠模型的治疗功效(混合给予细菌和抗体)的图示。
图7是显示对由铜绿假单胞菌临床分离株No. 31所致肺部感染小鼠模型的治疗功效(混合给予细菌和抗体)的图示。
图8是显示对由铜绿假单胞菌临床分离株No. 12所致肺部感染小鼠模型的治疗功效(静脉内给予)的图示。
图9显示h#1G5-H1的核苷酸序列和氨基酸序列。
图10显示h#1G5-H2的核苷酸序列和氨基酸序列。
图11显示h#1G5-H3的核苷酸序列和氨基酸序列。
图12显示h#1G5-H4的核苷酸序列和氨基酸序列。
图13显示h#1G5-H5的核苷酸序列和氨基酸序列。
图14显示h#1G5-L1的核苷酸序列和氨基酸序列。
图15显示h#1G5-L2的核苷酸序列和氨基酸序列。
图16显示h#1G5-L3的核苷酸序列和氨基酸序列。
图17显示h#1G5-L4的核苷酸序列和氨基酸序列。
图18显示h#1G5-L5的核苷酸序列和氨基酸序列。
图19显示h#4C13K-H1的核苷酸序列和氨基酸序列。
图20显示h#4C13K-H2的核苷酸序列和氨基酸序列。
图21显示h#4C13K-H3的核苷酸序列和氨基酸序列。
图22显示h#4C13K-H4的核苷酸序列和氨基酸序列。
图23显示h#4C13K-H5的核苷酸序列和氨基酸序列。
图24显示#4C13抗体的各个CDR序列的氨基酸序列。
图25是显示对铜绿假单胞菌O11菌株的结合特异性的图示。
图26是显示对铜绿假单胞菌O11的临床分离株的结合活性的图示。
图27是显示对由铜绿假单胞菌ATCC 29260所致肺部感染小鼠模型的治疗功效(静脉内给予)的图示。
图28是显示与No.76 mIgG2a的竞争试验的图示。
实施方案的描述
1. 定义
本文所用术语“基因”不仅包括DNA，而且还包括mRNA、cDNA和cRNA。
本文所用术语“多核苷酸”以与“核酸”相同的含义使用，且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
本文所用术语“多肽”和“蛋白质”无区别地使用。
本文所用术语“RNA部分”是指含有RNA的部分。
本文所用术语“细胞”包括动物个体中的细胞以及培养的细胞。
本文所用术语“LPS”以与“脂多糖”相同的含义使用。
本文所用术语“血清型”是指铜绿假单胞菌的任何已知的血清型。
本文所用术语“多重耐药性”意指“对碳青霉烯类(亚胺培南或美罗培南)、喹诺酮类(环丙沙星或左氧氟沙星)和氨基糖苷类(妥布霉素或阿米卡星)的所有三类有抗性”。根据临床与实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的断点测定各种药物的敏感性。
本文所用术语“O11临床分离株”意指通过用于对O11抗原有特异性的铜绿假单胞菌分类的市售的免疫血清或通过使用O11抗原特异性引物的PCR的阳性菌株。
术语“健康护理相关感染”亦称为院内感染或医院获得性感染，意指与在医疗机构或住家医疗中的患者的基础疾病区分开的新获得性疾病和卫生保健工作者在医疗机构或住家医疗中遭受的感染。
本文所用术语“抗体的抗原结合片段”亦称为“抗体的功能片段”，是指具有抗原结合活性的抗体的部分片段，包括Fab、F(ab')2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体等。该术语还包括Fab'，这是一种通过在还原条件下处理F(ab')2获得的抗体的可变区中的单价片段。然而，该术语不限于这些分子，只要该片段对抗原具有结合亲和力。另外，这些抗原结合片段不仅包括用合适的酶处理抗体蛋白质的全长分子获得的片段，而且还包括使用遗传修饰的抗体基因在合适的宿主细胞中产生的蛋白质。
本文所用术语“表位”是指特异性抗LPS O11抗体与之结合的LPS O11抗原的部分结构。由于O11抗原是由3种糖组成的重复结构(Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63,523-553(1999))，因此可通过合成不同长度的糖链并检查抗体对所述糖的反应性来确定表位。另外，可通过X射线晶体学明确接近抗体的LPS O11抗原的结构，确定作为与特异性抗LPS O11抗体结合的LPS O11抗原的部分三级结构的表位。如果第二抗LPS O11抗体与第一抗LPSO11抗体的结合部分糖链结合，则可确定第一抗体和第二抗体具有共同表位。另外，通过证实第二抗LPS O11抗体交叉竞争与第一抗LPS O11抗体的LPS O11抗原结合(即，第二抗体干扰第一抗体和LPS O11抗原间的结合)，可确定第一抗体和第二抗体具有共同表位，即使未确定表位的具体序列或结构。此外，如果第一抗体和第二抗体与共同表位结合且第一抗体对抗原具有特殊作用(例如中和活性)，则可预期第二抗体也具有相同的活性。
已知抗体分子的每条重链和轻链具有3个互补决定区(CDR)。互补决定区亦称超变结构域，且存在于抗体每条重链和轻链的可变区中。该区是在其一级结构中具有极高可变性的部位，在每条多肽重链和轻链的一级结构中有3个不相连的CDR。在本说明书中，对于抗体的互补决定区，重链的互补决定区用来自重链氨基酸序列的氨基端的CDRH1、CDRH2和CDRH3表示，轻链的互补决定区用来自轻链氨基酸序列的氨基末端的CDRL1、CDRL2和CDRL3表示。这些区在三级结构中彼此接近，并决定对抗体与之结合的抗原的特异性。
本文所用短语“在严格条件下进行杂交”是指在以下条件下进行的杂交：在所述条件下可通过在市售杂交溶液ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech，Inc.制造)中于68℃进行杂交，或者通过使用DNA固定在之上的滤器，在0.7-1.0 M NaCl存在下于68℃进行杂交，接着使用0.1-2倍SSC溶液(1倍SSC溶液由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成)于68℃或在其等同条件下进行洗涤，实现鉴定。
本文在描述“一个至几个”和“一个或几个”时所用术语“几个”是指选自2-10。该术语优选10为或更小，更优选5或6或更小，而且优选2或3。
2. LPS O11
本发明的抗体与之结合的“LPS”是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的组分，是一种由脂质和多糖组成的物质(糖脂)。糖链部分由称为核心多糖(或核心寡糖)的部分和称为O抗原(O侧链多糖)的部分组成。
对于铜绿假单胞菌的不同血清型，有通过IATS (国际抗原分型系统(International Antigenic Typing System))的分型，和通过铜绿假单胞菌血清分型委员会(日本铜绿假单胞菌协会(Japan Pseudomonas Aeruginosa Society)，JPAS)的分类。表1显示IATS分型和通过JPAS分类的对应关系。可通过使用用于对铜绿假单胞菌分类的市售免疫血清，确定铜绿假单胞菌的血清型。
[表1]
据报告，近年来多重耐药性铜绿假单胞菌中具有O11抗原的菌株(O11菌株)的比率是高的。LPS O11血清型的铜绿假单胞菌包括例如ATCC登记号26290、33358等。
3. 抗LPS O11抗体的产生
可通过例如描述于WO 2009/091048、WO 2011/027808或WO 2012/133572的方法，获得本发明的针对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原的抗体。即，通过使非人动物对靶抗原免疫，一旦免疫建立，则从非人动物中收集淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓来源细胞，来选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和/或成浆细胞。从所获得的浆细胞和/或成浆细胞中收集针对靶抗原的抗体基因，鉴定碱基序列，从而能够根据所鉴定的基因的碱基序列获得抗体或抗体的片段。此外，通过同样从受感染的人患者的血液中获得浆细胞和/或成浆细胞，可获得抗体或抗体片段。可通过测试所获得的抗体与LPS O11抗原的结合，获得适用于人类疾病的抗体。以这种方式获得的单克隆抗体包括No. 76、#1G5、#4C12、#4C13和#4C13K。#4C12、#4C13和#4C13K的重链彼此是相同的。#4C13是其中#4C12轻链中的第75个氨基酸半胱氨酸被酪氨酸取代的抗体，#4C13K是其中#4C12的轻链被#1G5的轻链取代的抗体。
另外，可按照已知方法通过使产生针对LPS O11抗原的抗体的产抗体细胞与骨髓瘤细胞融合以建立杂交瘤，来获得单克隆抗体(例如，Kohler和Milstein, Nature, (1975)256, 第495-497页；Kennet, R.编辑, Monoclonal Antibodies, 第365-367页, PlenumPress, N.Y. (1980))。所述方法的一个具体实例描述于WO 2009/48072 (2009年4月16日公开)和WO 2010/117011 (2010年10月14日公开)。然而，获得单克隆抗体的方法符合已良好建立的领域，并且不限于上述具体实例。
本发明的抗体不仅包括针对LPS O11抗原的上述单克隆抗体，而且还包括出于降低对人的异源抗原性的目的通过人工修饰获得的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。这些抗体可采用已知方法制备。
嵌合抗体的实例是其中抗体可变区和恒定区来源于不同物种的抗体，例如，其中使小鼠或大鼠来源的抗体可变区与人来源的恒定区连接的嵌合抗体(参见Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984))。来源于No. 76的嵌合抗体的一个实例是这样的抗体，其含有具有包含序列表中的SEQ ID NO: 33的氨基酸残基20-470的氨基酸序列的重链和具有包含SEQ ID NO: 31的氨基酸残基21-234的氨基酸序列的轻链；来源于#1G5的嵌合抗体的一个实例是这样的抗体，其含有具有包含序列表中的SEQ ID NO: 37的氨基酸残基20-474的氨基酸序列的重链和具有包含SEQ ID NO: 35的氨基酸残基21-234的氨基酸序列的轻链；来源于#4C13的嵌合抗体的一个实例是这样的抗体，其含有具有包含序列表中的SEQ ID NO: 41的氨基酸残基20-470的氨基酸序列的重链和具有包含SEQ ID NO: 39的氨基酸残基21-234的氨基酸序列的轻链。
人源化抗体的实例是通过将仅CDR整合到来源于人的抗体中获得的抗体(参见Nature (1986) 321，第522-525页)和通过经由CDR移植方法(WO 90/07861)，将构架的氨基酸残基的部分以及CDR序列移植到人抗体中获得的抗体。
来源于抗体No. 76的人源化抗体包括在本发明的抗体中，只要人源化抗体携带No. 76的所有6个CDR序列并对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性。另外，No. 76抗体的重链可变区携带包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDRH1 (NYWIN)、包含SEQ IDNO: 10所示氨基酸序列的CDRH2 (DIYPGTSTTNYNEKFKN)和包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列的CDRH3 (IYYDYDGYYFDY)。另外，No. 76抗体的轻链可变区携带包含SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的CDRL1 (KASENVGTSVS)、包含SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的CDRL2(GASNRYT)和包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDRL3 (GQSYSYPYT)。这些CDR的氨基酸序列亦见图1。
来源于#1G5抗体的人源化抗体包括在本发明的抗体中，只要人源化抗体携带#1G5的所有6个CDR序列，并对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性。另外，#1G5抗体的重链可变区携带包含SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列的CDRH1 (SYWIN)、包含SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的CDRH2 (NIYPGSSSINYNEKFKS)和包含SEQ ID NO: 19所示氨基酸序列的CDRH3 (TIYNYGSSGYNYAMDY)。此外，#1G5抗体的轻链可变区携带包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的CDRL1 (KASENVGNSVS)、包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的CDRL2(GASNRYT)和包含SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列的CDRL3 (GQSYSYPYT)。这些CDR的氨基酸序列亦见图2。
来源于#4C12抗体的人源化抗体包括在本发明的抗体中，只要人源化抗体携带#4C12的所有6个CDR序列，并对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性。另外，#4C12抗体的重链可变区携带包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的CDRH1 (TYWIN)、包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的CDRH2 (NIYPGTRSSNYNEKFKN)和包含SEQ ID NO: 27所示氨基酸序列的CDRH3 (VYYDHVGYYFDY)。此外，#4C12抗体的轻链可变区携带包含SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的CDRL1 (KASENVGVSVS)、包含SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的CDRL2(GASNRCT)和包含SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的CDRL3 (GQSYSYPYT)。这些CDR的氨基酸序列亦见图3。
来源于#4C13抗体的人源化抗体包括在本发明的抗体中，只要人源化抗体携带#4C13的所有6个CDR序列，并对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性。另外，#4C13抗体的重链可变区携带包含SEQ ID NO: 86所示氨基酸序列的CDRH1 (TYWIN)、包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的CDRH2 (NIYPGTRSSNYNEKFKN)和包含SEQ ID NO: 88所示氨基酸序列的CDRH3 (VYYDHVGYYFDY)。此外，#4C13抗体的轻链可变区携带包含SEQ ID NO: 123所示氨基酸序列的CDRL1 (KASENVGVSVS)、包含SEQ ID NO: 124所示氨基酸序列的CDRL2(GASNRYT)和包含SEQ ID NO: 125所示氨基酸序列的CDRL3 (GQSYSYPYT)。这些CDR的氨基酸序列亦见图24。
来源于#4C13K抗体的人源化抗体包括在本发明的抗体中，只要人源化抗体携带#4C13K的所有6个CDR序列，并对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性。另外，#4C13K抗体的重链可变区携带包含SEQ ID NO: 86所示氨基酸序列的CDRH1 (TYWIN)、包含SEQ IDNO: 87所示氨基酸序列的CDRH2 (NIYPGTRSSNYNEKFKN)和包含SEQ ID NO: 88所示氨基酸序列的CDRH3 (VYYDHVGYYFDY)。此外，#4C13K抗体的轻链可变区与#1G5抗体的完全共同，携带包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的CDRL1 (KASENVGNSVS)、包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的CDRL2 (GASNRYT)和包含SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列的CDRL3(GQSYSYPYT)。这些CDR的氨基酸序列亦见图24和图2。
另外，通过用其它氨基酸残基取代各个CDR中的1-3个氨基酸残基获得的CDR修饰的人源化抗体也包括在本发明的抗体中，只要所述人源化抗体对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性。
来源于#1G5抗体的人源化抗体的实例包括含有以下重链可变区的重链和含有以下轻链可变区的轻链的任意组合：所述重链可变区含有包含序列表中的SEQ ID NO: 57所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 63所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 65所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列，所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列、包含SEQID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列。
优选的组合包括包含含有包含含SEQ ID NO: 57所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体、包含含有包含含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体、包含含有包含含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体、包含含有包含含SEQ ID NO: 63所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体或包含含有包含含SEQ ID NO: 65所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体。
一个更优选的组合包括包含含有包含含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体或包含含有包含含SEQID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体。
来源于#4C13K抗体的人源化抗体的实例包括含有以下重链可变区的重链和含有以下轻链可变区的轻链的任意组合：所述重链可变区含有包含SEQ ID NO: 77所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 83所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列或包含SEQID NO: 85所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列，所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列。
优选的组合包括包含含有包含含SEQ ID NO: 77所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体、包含含有包含含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体、包含含有包含含SEQ ID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体、包含含有包含含SEQ ID NO: 83所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体或包含含有包含含SEQ ID NO: 85所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体。
一个更优选的组合包括包含含有包含含SEQ ID NO: 79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体或包含含有包含含SEQID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列的重链可变区的重链和含有包含含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体。
另外，本发明的抗体包括人抗体。抗LPS O11人抗体是指仅具有来源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体。可通过使用具有含有人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段的产生人抗体的小鼠的方法，获得抗LPS O11人抗体(参见Tomizuka, K.等, NatureGenetics (1997) 16, 第133-143页；Kuroiwa, Y.等, Nucl. Acids Res. (1998) 26, 第3447-3448页；Yoshida, H.等, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspectsv第10卷, 第69-73页(Kitagawa, Y., Matsuda, T.和Iijima, S.编辑), KluwerAcademic Publishers, 1999；Tomizuka, K.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000)97, 第722-727页, 等)。
可如下具体地产生所述产生人抗体的小鼠。通过产生敲除动物和转基因动物，并使这些动物彼此交配产生其中内源免疫球蛋白重链和轻链基因座被破坏，代之以通过酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链基因座的遗传修饰的动物。
另外，按照遗传工程技术，通过使用分别编码这类人抗体的重链和轻链的cDNA和优选含有cDNA的载体，转化真核细胞，培养产生重组人单克隆抗体的转化株，从而，还可从培养上清液中获得抗体。在此作为宿主，可使用例如真核细胞，优选哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、淋巴细胞或骨髓瘤细胞。
另外，还已知获得从人抗体文库筛选的来源于噬菌体展示的人抗体的方法(参见Wormstone, I. M.等, Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002) 43(7), 第2301-2308页；Carmen, S.等, Briefings in Functional Genomics andProteomics (2002),1(2), 第189-203页；Siriwardena, D.等, Ophthalmology (2002)109(3), 第427-431页, 等)。
例如，可采用其中人抗体的可变区在噬菌体表面作为单链抗体(scFv)表达并选择与抗原结合的噬菌体的噬菌体展示方法(Nature Biotechnology (2005)，23(9)，第1105-1116页)。通过分析根据与抗原的结合选择的噬菌体的基因，可测定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果测定出与抗原结合的scFv的DNA序列，则可通过制备具有所述序列的表达载体，并将载体引入合适的宿主中使其表达，来获得人抗体(WO 92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388；Annu.Rev. Immunol. (1994) 12, 第433-455页；Nature Biotechnology (2005) 23(9), 第1105-1116页)。
基于上述抗体与抗原的结合活性、调理吞噬杀伤活性、补体依赖性杀伤活性和/或凝集活性对其进行评价，从而能够选择合适的抗体。可通过实施例3所示全细胞ELISA方法评价与抗原的结合活性，该方法使得能够测定抗体对其显示结合活性的铜绿假单胞菌的血清型的范围。可通过针对被吞噬细胞吞噬的细菌百分比或量的实施例1所示活细胞计数测量，或通过将细菌用荧光标记处理，接着采用流式细胞术的定量测量等，评价调理吞噬杀伤活性。可通过例如针对被补体和抗体灭菌的细菌的量的活细胞计数测量等方法，评价补体依赖性杀伤活性。此外，可通过检测系列稀释的抗体对细菌的凝集能力，以每IgG的量的凝集效价，评价凝集活性。另外，可通过实施例4所述方法等，评价针对全身感染和肺部感染的抗微生物活性。
作为用于比较抗体性质的另一个指标的一个实例，可以抗体的稳定性为例说明。示差扫描量热法(DSC)是一种能够快速并准确测量热变性中点温度(Tm)以用作蛋白质的相对构象稳定性的有利指标的方法。可通过采用DSC测量Tm值，并对该值进行比较，来比较热稳定性的差异。已知抗体的保存稳定性显示与抗体的热稳定性有某种相关性(Lori Burton等, Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, 第265-273页)，可使用热稳定性作为指标选择优选的抗体。用于选择抗体的其它指标的实例包括下列因素：在合适宿主细胞中的产量高，且在水溶液中的聚集性低。例如，显示最高产量的抗体并不总是显示最高的热稳定性，因此，必需根据上述指标进行全面评价来选择最适于给予人的抗体。
此外，其中抗体的全长重链和轻链序列使用合适的接头连接以获得单链免疫球蛋白的方法也是已知的(Lee，H-S等，Molecular Immunology (1999) 36，第61-71页；Shirrmann，T.等，mAbs (2010)，2，(1) 第1-4页)。通过使这类单链免疫球蛋白二聚化，所得二聚体可具有与本身是四聚体的抗体类似的结构和活性。此外，本发明的抗体可以是具有单一重链可变区且没有轻链序列的抗体。这类抗体称为单域抗体(sdAb)或纳米抗体(nanobody)，实际上，在骆驼和美洲驼中观察到这类抗体，据报道这类抗体具有抗原结合亲和力(Muyldemans S.等，Protein Eng. (1994) 7 (9)，1129-35；Hamers-Casterman C.等，Nature (1993) 363 (6428) 446-8)。上述抗体也可理解为本发明抗体的抗原结合片段的类型。
此外，通过控制与本发明的抗体结合的糖链的修饰，可能提高调理吞噬杀伤活性。用于控制抗体的糖链修饰的技术从WO 99/54342、WO 00/61739、WO 02/31140等来看是已知的。然而，这类技术不限于此。
在其中抗体通过先分离抗体基因，然后将该基因导入合适的宿主中来产生的情况下，可以使用合适宿主和合适表达载体的组合。抗体基因的具体实例包括编码本说明书中所述抗体的重链序列的基因和编码其轻链序列的基因的组合。当宿主细胞转化时，可能将重链序列基因和轻链序列基因插入同一表达载体中，也可分别插入不同的表达载体中。在其中真核细胞用作宿主的情况下，可使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。作为动物细胞，(1)哺乳动物细胞，可以例如类人猿COS细胞(Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, 第175-182页, ATCC CRL-1650)的二氢叶酸还原酶缺陷型品系(Urlaub, G.和Chasin, L. A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 第4126-4220页)、鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCCNo. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞；ATCC：CCL-61)为例。另外，在其中使用原核细胞的情况下，可以例如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为例。可通过转化将靶抗体基因导入这些细胞，并体外培养由此转化的细胞，来获得抗体。在上述培养方法中，产量有时可随抗体的序列而变化，因此，通过在具有相当结合活性的抗体中使用产量作为指标，可选出容易产生的抗体作为药物。
对本发明抗体的同种型没有限制，其实例包括IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA (IgA1、IgA2)、IgD和IgE，其优选的实例包括IgG和IgM，其更优选的实例包括IgG1和IgG3。
另外，本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合部位的抗体的抗原结合片段或其修饰片段。可通过用例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白酶处理抗体，或按照遗传工程技术修饰抗体基因和在合适的培养细胞中表达修饰的基因，来获得抗体的片段。在这些抗体片段中，具有全长抗体分子的全部或部分功能的片段可称为抗体的抗原结合片段。抗体的功能一般包括抗原结合活性、中和抗原的活性、提高抗原的活性、调理吞噬杀伤活性和补体依赖性杀伤活性。本发明的抗体的抗原结合片段的功能是与铜绿假单胞菌的LPS O11抗原结合，优选为对铜绿假单胞菌菌株的LPS O11抗原的调理吞噬杀伤活性。
抗体的片段的实例包括Fab、F(ab')2、Fv、其中重链和轻链的Fv分子通过合适的接头连接的单链Fv (scFv)、双抗体、线性抗体和由抗体片段组成的多特异性抗体。另外，作为通过在还原条件下处理F(ab')2获得的抗体可变区中的单价片段的Fab'也包括在抗体的片段中。
另外，本发明的抗体可以是具有对至少两种不同抗原的特异性的多特异性抗体。一般来讲，这类分子与两种抗原结合(即，双特异性抗体)，然而，本文所用术语“多特异性抗体”包括对两种或更多种(例如3种)抗原具有特异性的抗体。
本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或所述抗体的片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。双特异性抗体可通过连接两种抗体类型的重链和轻链(HL对)来产生，或也可通过使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合以制备产生双特异性抗体的融合细胞来产生(Millstein等, Nature (1983) 305, 第537-539页)。
本发明的抗体可以是单链抗体(亦称为scFv)。单链抗体可通过多肽接头连接抗体的重链可变区和轻链可变区来获得(Pluckthun, The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, 113 (Rosenberg和Moore编辑), Springer Verlag, New York, 第269-315页(1994), Nature Biotechnology (2005), 23, 第1126-1136页)。另外，通过多肽接头连接两个scFv分子产生的BiscFv片段也可用作双特异性抗体。
产生单链抗体的方法是本技术领域众所周知的(参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513、5,455,030等)。在这种scFv中，通过不形成缀合物的接头、优选通过多肽接头使重链可变区和轻链可变区连接(Huston, J. S.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1988), 85, 第5879-5883页)。在scFv中，重链可变区和轻链可变区可来源于相同抗体或不同抗体。作为待用于连接可变区的多肽接头，使用例如由12-19个残基组成的任何单链肽。
编码scFv的DNA可如下获得：使用界定其两个末端的引物对，通过PCR方法，使用编码选自编码上述抗体的重链或重链可变区的DNA和编码其轻链或轻链可变区的DNA的DNA的整个氨基酸序列或所需部分氨基酸序列的DNA作为模板进行扩增，并通过将编码多肽接头部分的DNA和界定其两个末端的引物对组合，使得分别连接重链和轻链的两个末端，来进一步进行扩增。
另外，一旦产生编码scFv的DNA，便可按照通用程序，获得含有所述DNA的表达载体和被表达载体转化的宿主。另外，通过使用所得宿主，可按照通用程序获得scFv。可按与上述相同的方式，通过获得基因并表达基因，在宿主中产生其抗体片段。
可使本发明的抗体多聚化以提高其对抗原的亲和力。待多聚化的抗体可以是一种类型的抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。抗体聚合的方法包括IgG CH3结构域与两个scFv分子的结合、与链霉抗生物素结合、引入螺旋-转角-螺旋基序等。
本发明的抗体可以是多克隆抗体，其是具有不同氨基酸序列的多种抗LPS O11抗体类型的混合物。多克隆抗体的一个实例包括具有不同CDR的多种类型的抗体的混合物。所述多克隆抗体可通过如下获得：培养产生不同抗体的细胞的混合物，然后从所得培养物中纯化抗体(参见WO 2004/061104)。
本发明的抗体可以是与上述抗体的重链和/或轻链相比有80%-99%同一性的抗体。通过将与重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列具有高同源性的序列组合，可选出具有与各抗体相当的抗原结合亲和力、调理吞噬杀伤活性和/或补体依赖性杀伤活性的抗体。所述同源性一般为80%或更高的同源性，优选90%或更高的同源性，更优选95%或更高的同源性，最优选99%或更高的同源性。另外，通过将其中重链和/或轻链氨基酸序列的一个至几个氨基酸残基被取代、缺失或添加的氨基酸序列组合，也可选出具有与各上述抗体相当的各种活性的抗体。待取代、缺失或添加的氨基酸残基的数目一般为10个氨基酸残基或更少，优选5-6个氨基酸残基或更少，更优选2或3个氨基酸残基或更少，最优选1个氨基酸残基。
已知培养的哺乳动物细胞中产生的抗体重链羧基端处的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))，另已知培养的哺乳动物细胞中产生的抗体重链羧基端处的2个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)缺失，且位于羧基端的脯氨酸残基新近被酰胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83 (2007))。然而，重链序列的这类缺失和修饰不影响抗体的抗原结合亲和力和效应子功能(补体活化或调理吞噬杀伤活性等)。因此，在本发明中，还包括进行这类修饰的抗体，可以其中重链羧基端处一个或两个氨基酸缺失的缺失变体和通过缺失变体的酰胺化获得的变体(例如其中羧基端脯氨酸残基被酰胺化的重链)等为例说明。在本发明抗体重链的羧基端具有缺失的缺失变体的类型不限于上述变体，只要保留抗原结合亲和力和效应子功能。构成本发明抗体的2个重链可以是选自全长重链和上述缺失变体的一类型，或可具有从中选出的组合中的两种类型。产生本发明抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件可影响各缺失变体的量的比率，然而，可以其中在本发明抗体中作为主成分包含在内的2条重链两者中羧基端的一个氨基酸残基缺失的情况为例说明。
可应用Blast算法2.2.2版(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden,Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller和David J.Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of proteindatabase search programs (空位化BLAST和PSI-BLAST：新一代的蛋白质数据库检索程序)”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)的默认参数测定两个氨基酸序列间的同源性。还可经互联网访问网址www.ncbi.nlm.nih.gov/blast，应用Blast算法。顺便提一句，通过Blast算法，计算同一性和阳性(positivity)的百分比值的两种类型。前者是当待确定其同源性程度的两个氨基酸序列中氨基酸残基彼此匹配时的值，后者是还考虑具有类似化学结构的氨基酸残基所获得的值。在本说明书中，当氨基酸残基彼此匹配时同一性的值被用作同源性值。
作为修饰抗体，也可使用与任何不同类型的分子(例如聚乙二醇(PEG))结合的抗体。
另外，本发明的抗体可以是这些抗体的任一种和另一种药剂间形成的缀合物的形式(免疫缀合物)。所述抗体的实例包括其中抗体与放射性物质或具有药理作用的化合物缀合的抗体(Nature Biotechnology (2005) 23, 第1137-1146页)。
所获得的抗体可纯化至均质性。抗体的分离和纯化可采用常规蛋白质分离和纯化方法进行。例如，可通过适当选择和联合以下方法，来分离和纯化抗体：柱层析法、过滤器过滤、超滤、盐沉淀、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳等(Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, DanielR. Marshak等编辑, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；Antibodies: ALaboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但是所述方法不限于此。
这类层析法的实例包括亲和层析法、离子交换层析法、疏水层析法、凝胶过滤层析法、反相层析法、吸附层析法等。
可通过采用液相层析法，例如HPLC、FPLC等，来进行这类层析法。
用于亲和层析法的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。
例如，使用蛋白A柱的柱包括Hyper D、POROS、Sepharose F. F. (Pharmacia)等。
另外，通过使用抗原固定在其上的载体，利用抗体与抗原的结合性质，也可纯化抗体。
4. 含有抗LPS O11抗体的药物
由于通过上文章节“3抗LPS O11抗体的产生”中描述的方法获得的抗LPS O11抗体显示调理吞噬杀伤作用(OPK)和/或补体依赖性杀伤(CDK)作用，因此可用作用于假单胞菌感染的治疗剂和/或预防剂。
用抗LPS O11抗体能够治疗和/或预防的假单胞菌感染的实例包括由假单胞菌感染引起的、优选由多重耐药性假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。由假单胞菌感染引起的全身性假单胞菌感染包括例如血流感染、脓毒症、脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎、肺脓肿、脓胸、慢性呼吸道感染、腹膜炎、术后感染、胆囊炎、胆管炎、眼睑肿瘤、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎、眶感染、泌尿道感染、导管感染、肛周脓肿、烧伤创面二次感染、褥疮感染、囊性纤维化疾病、淋巴管炎、淋巴结炎、骨髓炎、关节炎、扁桃体炎、肝脓肿、皮肤和软组织感染、子宫内感染、子宫附件炎、子宫旁组织炎、下颌周围蜂窝织炎或颌炎，优选肺炎，但不限于此，只要这类假单胞菌感染是由假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。
作为用于上述疾病的药物的抗LPS O11抗体的实例包括按照描述于“3. 抗LPSO11抗体的产生”的方法，自#1G5抗体或#4C13K抗体生产的嵌合抗体或人源化抗体。此外，具有与#1G5抗体和/或#4C13K抗体相同表位的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体也可用作药物。通过观察这些抗体是否共同地与LPS O11抗原的特定糖链结合，可证实一些抗LPS O11抗体具有与#1G5抗体和/或#4C13K抗体相同的表位。此外，如果一些抗LPS O11抗体与#1G5抗体和/或#4C13K抗体竞争结合LPS O11抗原，则可确定这些抗体具有共同的表位。
可通过测量针对例如铜绿假单胞菌ATCC 29260的调理吞噬杀伤活性或补体依赖性杀伤活性，来证实抗LPS O11抗体的体外抗微生物活性。ATCC 29260菌株是最著名的O11菌株之一，并且获自ATCC。该菌株已由路易斯维尔大学的P. V. Liu存放在ATCC (J.Infect. Dis, 128:506-513 (1973))。该菌株可以CIP 102967获自Institute Pasteur，或甚至以CNCTC 5997获自The National Institute of Public Health。
使用实验动物，将抗LPS O11抗体静脉内给予肺部感染、全身感染、大腿感染或烧伤创面感染的小鼠或大鼠模型，并测量感染部位活细胞计数的变化或存活率，来证实抗LPSO11抗体对假单胞菌感染的体内治疗或预防作用。
由此获得的抗LPS O11抗体可用作药物，特别是用作治疗或预防例如血流感染、肺炎、慢性呼吸道感染、败血症、腹膜炎、皮肤软组织感染、烧伤创面二次感染等假单胞菌感染的药物组合物，或用作用于这类疾病的免疫学诊断的抗体。
本发明的抗LPS O11抗体是识别铜绿假单胞菌的LPS、并与O11抗原结合但不与O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原和O抗原缺陷型菌株结合的抗体。
本发明的抗LPS O11抗体对O11临床分离株的覆盖比率(即抗体可与之结合的菌株的比率)为85%或更高，优选90%或更高，更优选95%或更高，最优选100%。
另外，本发明的抗LPS O11抗体显示针对由ATCC 29260识别的铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤活性的50%最低生长抑制浓度为12 ng/mL或更低，优选4.1 ng/mL或更低，更优选1.4 ng/mL或更低。
举个例子来说，抗LPS O11抗体可单独给予或与至少一种其它抗感染药组合给予以治疗或预防铜绿假单胞菌感染性疾病。举个例子来说，抗LPS O11抗体可与治疗有效量的治疗剂组合给予。可与抗LPS O11抗体组合给予的这类抗感染药的实例包括但不限于青霉素、头孢、碳青霉烯、单环内酰胺、喹诺酮、氨基糖苷、多黏菌素、利福平、大环内酯抗微生物剂等。
青霉素抗微生物剂包括哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉维酸等，优选哌拉西林或哌拉西林/三唑巴坦。
头孢抗微生物剂包括头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢唑兰等，优选头孢他啶或头孢吡肟。
碳青霉烯抗微生物剂包括亚胺培南、帕尼培南、美罗培南、多利培南等，优选美罗培南或多利培南。
单环内酰胺抗微生物剂包括氨曲南、卡芦莫南等，优选氨曲南。
喹诺酮抗微生物剂包括环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、西他沙星等，优选环丙沙星或左氧氟沙星。
氨基糖苷抗微生物剂包括庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、阿贝卡星等，优选妥布霉素或阿米卡星。
多黏菌素抗微生物剂包括多黏菌素、黏菌素等。
大环内酯抗微生物剂包括红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等，优选阿奇霉素。
根据假单胞菌感染的状态或治疗和/或预防的预期程度，可给予两种或三种或更多种类型的治疗剂，且可通过将这些其它治疗剂包封在同一制剂中来同时给予。可通过将这些其它治疗剂和抗LPS O11抗体包封在同一制剂中来同时给予它们。此外，可通过将抗LPS O11抗体和这些其它治疗剂包封在独立的制剂中来同时给予它们。另外，这些其它治疗剂和抗LPS O11抗体可依次分别给予它们。换句话说，可在给予这些其它治疗剂后，给予含有抗LPS O11抗体或其抗原结合片段作为活性成分的治疗剂，或可在给予含有抗LPS O11抗体或其抗原结合片段作为活性成分的治疗剂后，给予其它治疗剂。在基因疗法中给予的情况下，可将用于感染性疾病的蛋白质性治疗剂的基因和抗LPS O11抗体的基因插入相同启动子区或不同启动子区的下游，并可引入相同的载体或不同的载体中。
通过将用于感染性疾病的治疗剂与抗LPS O11抗体或其片段缀合，可制备描述于M. C. Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progress (靶向药物缀合物：原理和发展)”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216的靶向药物缀合物。为了实现这个目的，除抗体分子以外，可使用任何抗体片段，只要其不完全失去识别LPS O11抗原的能力，其实例包括例如Fab、F(ab′)2、Fv等片段。在本发明中，可以相同方式使用抗体、片段等。抗LPS O11抗体或其片段和用于感染性疾病的治疗剂之间的缀合方式可以是描述于以下文献的不同形式的任一种：M. C. Garnet “Targeted drugconjugates: principles and progress (靶向药物缀合物：原理和发展)”, AdvancedDrug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216；G. T. Hermanson “BioconjugateTechniques (生物缀合技术)” Academic Press, California (1996), Putnam和J.Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具有抗癌活性的聚合物缀合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123等。即，可以其中LPS O11抗体和用于感染性疾病的治疗剂彼此以化学法直接或通过间隔物(例如寡肽)缀合的缀合物形式，和通过合适的药物载体的缀合物形式为例说明。药物载体的实例包括脂质体和水溶性聚合物。通过所述药物载体形成的缀合物的更具体的实例包括其中抗体和用于感染性疾病的治疗剂被掺入脂质体且脂质体和抗体彼此缀合的缀合物形式，和其中用于感染性疾病的治疗剂与水溶性聚合物(一种分子量约1000-100000的化合物)以化学法直接或通过间隔物(例如寡肽)缀合且抗体与水溶性聚合物缀合的缀合物形式。可通过本领域技术人员熟知的方法，例如描述于G. T. Hermanson “Bioconjugate Techniques (生物缀合技术)”Academic Press, California (1996)；Putnam和J. Kopecek “Polymer Conjugates withAnticancer Activity (具有抗癌活性的聚合物缀合物)” Advances in Polymer Science(1995) 122, 55-123等的方法，实现抗体(或其片段)与用于感染性疾病的治疗剂或药物载体(例如脂质体或水溶性聚合物)的缀合。可通过本领域技术人员熟知的方法，例如描述于D. D. Lasic “Liposomes: From Physics to Applications (脂质体：从物理学到应用)”Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993)”等的方法，实现将用于感染性疾病的治疗剂掺入脂质体中。可通过本领域技术人员熟知的方法，例如描述于D. Putnam和J. Kopecek “Polymer Conjugates with Anticancer Activity (具有抗癌活性的聚合物缀合物)” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123等的方法，实现用于感染性疾病的治疗剂与水溶性聚合物的缀合。可通过除上述方法以外的遗传工程，通过本领域技术人员熟知的方法产生抗体(或其片段)和用于感染性疾病的蛋白质性治疗剂(或其片段)间的缀合物。
本发明还提供含有治疗和/或预防有效量的抗LPS O11抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
本发明还提供含有治疗和/或预防有效量的抗LPS O11抗体、治疗和/或预防有效量的至少一种用于感染性疾病的治疗剂和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
就剂量和浓度而言，待用于在本发明的药物组合物中可接受的药物制剂中的物质优选为对给予其药物组合物的人是无毒的。
本发明的药物组合物可含有用于药物制剂的物质，所述物质能够改变或保持pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等张性、无菌状态、稳定性、溶解度、释放率、吸收率或渗透性。用于药物制剂的物质的实例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；抗微生物剂；抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠等抗氧化剂；磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲剂、碳酸氢盐和Tris-HCl溶液等缓冲剂；甘露糖醇和甘氨酸等填充剂；乙二胺四乙酸盐(EDTA)等螯合剂；咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精等络合剂；葡萄糖、甘露糖和糊精等填充剂；单糖和二糖等其它碳水化合物；着色剂；香料剂；稀释剂；乳化剂；聚乙烯吡咯烷酮等亲水聚合物；低分子量多肽、成盐抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸盐、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢等防腐剂；甘油、丙二醇和聚乙二醇等溶剂；甘露糖醇和山梨糖醇等糖醇；助悬剂；山梨坦酯、聚山梨酯(包括聚山梨酯20和聚山梨酯80)、Triton、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇等表面活性剂；蔗糖和山梨糖醇等稳定促进剂；氯化钠、氯化钾和甘露糖醇/山梨糖醇等弹性增强剂；输送剂；赋形剂和/或药用佐剂。药物制剂的这些物质的添加量优选为抗LPS O11抗体重量的0.01-100倍，特别优选为0.1-10倍。本领域技术人员可根据待治疗的疾病、待采用的给药途径等，适当地确定药物制剂中药物组合物的优选组成。
药物组合物中的赋形剂或载体可呈液体或固体的形式。合适的赋形剂或载体可为注射用水、生理盐水、人工脑脊液或常用于胃肠外给药的其它物质。此外，中性生理盐水或含有血清白蛋白的生理盐水也可用作载体。药物组合物可含有pH 7.0-8.5的Tris缓冲液、pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液或pH 3.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液，这类缓冲液可补充山梨糖醇或另一种化合物。本发明的药物组合物的实例包括含有抗LPS O11抗体的药物组合物和含有抗LPS O11抗体和至少一种用于感染性疾病的治疗剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以冻干制品或液体的形式制备，作为具有所选组成和所需纯度的药剂。还可使用合适的赋形剂(例如蔗糖)，将含有抗LPS O11抗体的药物组合物和含有抗LPS O11抗体和至少一种用于感染性疾病的治疗剂的药物组合物制成冻干制品。
可以制备本发明的药物组合物用于胃肠外给药或用于通过口服给药途径的胃肠吸收。药物制剂的组成和浓度可根据给药方法确定。就本发明的药物组合物中所含抗LPSO11抗体对LPS O11抗原的亲和力越高，即其对LPS O11抗原的解离常数(Kd值)越低而言，抗LPS O11抗体可甚至当用于人的较低剂量时显示其药物功效，因此还可根据该结果确定本发明的药物组合物用于人的剂量。至于剂量，在其中将人抗LPS O11抗体给予人的情况下，抗体可以约0.1-100 mg/kg的剂量每1-180天给予一次。
本发明的药物组合物的剂型的实例是注射剂包括输注剂、栓剂、经鼻剂、舌下剂和经皮吸收剂。
本发明的抗体与暴露于铜绿假单胞菌细胞表面的LPS结合，因此还可用作用于假单胞菌感染的诊断剂。
当本发明的抗体作为诊断剂配制时，可通过采用适于其目的的任何方法获得呈任何剂型的这种诊断剂。例如，测量腹水、含有目标抗体的培养溶液或纯化抗体的抗体效价，用PBS (含磷酸盐缓冲液的盐水)等适当稀释；此后，向其中加入防腐剂，例如0.1%叠氮化钠。或者，测定吸附至乳胶等上的本发明的抗体的抗体效价，适当稀释，其中加入防腐剂备用。作为这种情况下的乳胶，可以合适的树脂材料，例如乳胶例如聚苯乙烯、聚乙烯甲苯和聚丁二烯为例说明。
按照本发明，提供使用本发明的抗体对假单胞菌感染的诊断方法。可如下实施本发明的诊断方法：通过从有假单胞菌感染风险的哺乳动物(包括人)中收集生物样品，例如痰、肺灌洗液、脓、眼泪、血液或尿液，随后使所收集的样品与本发明的抗体接触，测定是否发生抗原-抗体反应。
按照本发明，提供用于检测铜绿假单胞菌的存在情况的试剂盒，试剂盒至少包含本发明的抗体。
本发明的抗体可以是标记的。该检测试剂盒能够通过检测抗原-抗体反应，检出铜绿假单胞菌的存在情况。
因此，本发明的检测试剂盒可进一步包含用于进行抗原-抗体反应的各种试剂，例如需要时用于ELISA方法等中的第二抗体、显色试剂、缓冲液、说明书和/或仪器等。
实施例
在下文中，将参照实施例更具体地描述本发明，然而，本发明不限于此。注意，在下列实施例中有关基因操作的各种操作按照描述于“Molecular Cloning” (Sambrook, J.,Fritsch, E. F.和Maniatis, T.编著, Cold Spring Harbor Laboratory Press于1989出版)的方法进行，或在使用市售试剂或试剂盒的情况下，按照随附方案进行，除非另有说明。
实施例1 抗LPS O11抗体的筛选
1)-1 免疫
在Mueller Hinton Agar (MHA，Becton，Dickinson和Company)中培养的铜绿假单胞菌ATCC 29260悬浮于盐水中，通过将悬液每10-11天给予腓肠肌5次使ICR小鼠(CharlesRiver)免疫。在最后一次免疫后第6天收获膝淋巴结，使细胞通过细胞滤器(Becton，Dickinson和Company)分别分离，用RPMI 1640 (Invitrogen)洗涤，悬浮于中Cell Banker(Juji Field Inc.)中，并保存在-80℃下。
1)-2 获得单克隆抗体
按照描述于WO 2009/091048、WO 2011/027808、WO 2012/133572、BMC Biotechnology,11, 39 (2011)和BMC Biotechnology 11, 75 (2011)的方法，获得单克隆抗体。
1)-2-1 产抗体细胞的分离
将从免疫小鼠的淋巴结收集的细胞用0.5% BSA/2 mM EDTA/PBS悬浮，将别藻蓝蛋白标记的抗小鼠CD138抗体(Becton, Dickinson and Company)加入其中。将悬液在4℃下温育15分钟，然后将细胞在RPMI 1640中洗涤，加入ER-Tracker Blue-White DPX(Invitrogen)，允许在避光条件下反应5分钟。将细胞悬浮于PBS中，使用FACS Aria细胞分选仪(Becton, Dickinson and Company)，将双阳性细胞分别分离。
1)-2-2 cDNA的合成
将通过细胞分选仪分别分离的细胞溶于含有与寡聚体dT25结合的磁珠(DynabeadsmRNA DIRECT Kit，Invitrogen)的细胞裂解液(50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、250 mM LiCl、5mM EDTA (pH 8)、0.5%十二烷基硫酸锂(LiDS)、2.5 mM二硫苏糖醇(DTT))中，使得mRNA与磁珠结合。然后将磁珠分别用mRNA洗涤溶液A (10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.15 M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% Triton X-100)和cDNA合成溶液(50 mM Tris-HCl (pH 8.3)、75mM KCl、3 mM MgCl2、5 mM DTT、0.5 mM dNTP、0.2% Triton X-100和48单位RNA酶抑制剂(Invitrogen))洗涤1次，在补充480单位SuperScript III反转录酶(Invitrogen)的cDNA合成溶液中进行cDNA合成。珠粒用3’加尾反应溶液(50 mM磷酸钾、4 mM MgCl2、0.5 mM dGTP、0.2% Triton X-100、48单位RNA酶抑制剂(Invitrogen))洗涤，3’加尾反应在反应溶液中进行，向该反应溶液中加入480单位重组末端转移酶(Terminal Transferase) (Roche)。
1)-2-3 小鼠重链和轻链可变区基因片段的扩增
在将磁珠在TE溶液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.1% Triton X-100)中洗涤后，采用5’-RACE PCR方法，进行小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的扩增。首先，将磁珠转移到PCR反应溶液(0.2 μM 引物、0.2 mM dNTP、0.1单位PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA))中，进行在94℃下30秒钟和在68℃下90秒钟的35个循环的反应(第一PCR)。然后将第一PCR产物稀释10倍，使用稀释的第一PCR产物作为模板，在与第一PCR相同的条件下，分别扩增小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的可变区(第二PCR)。各引物组如下。
第一PCR引物组
5’-cggtaccgcgggcccgggatcccccccccccccdn-3’ (AP3dC-S)(SEQ ID NO: 89)
5’-accytgcatttgaactccttgcc-3’ (mIgγRT1 1111-AS) (SEQ ID NO: 90)
5’-actgccatcaatcttccacttgaca-3’ (mIgκ 1st 589-AS) (SEQ ID NO: 91)
第二PCR引物组(重链)
5’-cttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccggga-3’ (MCS-AP3-S) (SEQ ID NO: 92)
5’-ctggacagggatccagagttcca-3’ (mIgγ 3rd 656T-AS) (SEQ ID NO: 93)
第二PCR引物组(轻链)
5’-cttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccggga-3’ (MCS-AP3-S) (SEQ ID NO: 92)
5’-actgaggcacctccagatgttaact-3’ (mIgκ 3rd 525-AS) (SEQ ID NO: 94)
1)-2-4 小鼠IgG2a或人IgG1恒定区基因连接双链DNA片段和小鼠轻链恒定区基因连接双链DNA片段的制备
分别使用SEQ ID NO: 1-3所示质粒pJON mIgG2a、pJON mIgG2a-hIgG1和pJON mIgκ作为模板，通过用各引物组的PCR反应扩增，获得小鼠IgG2a或人IgG1恒定区基因连接双链DNA片段和小鼠轻链恒定区基因连接双链DNA片段，接着用DpnI (Roche)处理。使用0.4 ng/mlpJON作为模板的PCR反应的25个循环在含有0.2 mM dNTP、0.2 μM引物和20单位PrimeSTARHS DNA聚合酶的反应溶液中进行，在94℃下40秒钟，65℃ 40秒钟，72℃ 30秒钟。
pJON mIgG2a和pJON mIgG2a-hIgG1的引物组
5’-gcctggtcaagggctatttccctgag-3’ (mIgG连接PCR-S) (SEQ ID NO: 95)
5’-gggggggggggggggggatcccgg-3’ (聚G-AS) (SEQ ID NO: 96)
pJON mIgκ的引物组
5’-ctgtatccatcttcccaccatccagt-3’ (mIgκ连接PCR-S) (SEQ ID NO: 97)
5’-gggggggggggggggggatcccgg-3’ (聚G-AS) (SEQ ID NO: 96)
1)-2-5 小鼠或人嵌合免疫球蛋白线性化表达载体的制备
将16单位重组末端转移酶(Roche)加入第二PCR产物中，使混合物在37℃下反应30分钟，然后在94℃下加热5分钟以终止酶促反应。向上文制备的3’端多核苷酸添加小鼠重链可变区基因溶液中加入小鼠IgG2a或人IgG1恒定区基因连接双链DNA片段、0.2 μM引物和0.2mM dNTP。随着0.1单位PrimeSTAR HS DNA聚合酶的使用，进行在94℃下30秒钟和在70℃下4分钟的反应5个循环，接着在94℃下30秒钟、在60℃下30秒钟和在72℃下1分钟的反应30个循环，从而制备小鼠重链或人嵌合重链基因表达单位。同样地，向小鼠轻链可变区基因溶液中加入小鼠轻链恒定区基因连接双链DNA片段，进行反应以制备小鼠轻链基因表达单位。所用引物如下。
用于连接的引物组
5’-agagaaaccgtctatcagggcgatggc-3’ (miniCMV f1-S) (SEQ ID NO: 98)
5’-agagaccctttgacgttggagtccacg-3’ (miniCMV f1-AS) (SEQ ID NO: 99)
1)-2-6 抗体基因的表达
使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，将在上述实验中扩增的全长的小鼠重链或人嵌合重链和小鼠轻链基因表达单位以遗传方法导入HEK 293T细胞中，将细胞在5% CO2下在37℃下培养4天以获得抗体培养上清液。
1)-3 单克隆抗体的筛选
1)-3-1 抗体浓度的测量
使用小鼠IgG2a ELISA Quantitation Set (Bethyl Laboratories)或人IgG ELISAQuantitation Set (Bethyl Laboratories)，测量抗体浓度。该方法按照随附手册进行。换句话说，将亲和纯化的山羊抗小鼠IgG2a包被抗体或亲和纯化的山羊抗人IgG-Fc包被抗体用0.05 M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释101倍。将100 μl的稀释溶液加入孔中，在室温下固定1小时。在将孔用150 μl补充0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS；添加Tween20的TBS为TBST)洗涤3次后，将200 μl 1% BSA/TBS加入孔中，进行封闭0.5-2小时。以100 μl的量将各抗体培养上清液或纯化抗体(如有必要，在1% BSA/TBST中稀释)直接加入孔中，允许在室温下反应1小时。在将孔用TBST洗涤3次后，以100 μl/孔的量加入50,000倍稀释的HRP缀合的山羊抗小鼠IgG2a检测抗体或100,000倍稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG-Fc检测抗体，允许反应1小时。 将孔用TBST洗涤3次，将SuperSignal ELISA PicoChemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific K.K.)加入其中，在加入后，立即用ARVO 1420多标记计数器(Perkin Elmer)测量发光。使用试剂盒随附标准物获得校准曲线，从而计算抗体的浓度。
1)-3-2 调理吞噬杀伤活性的测量
作为测量用缓冲液，制备0.1%明胶/1% FBS/Hank平衡盐溶液(调理缓冲液)。使作为效应细胞的HL60在补充0.8% N,N-二甲基甲酰胺的含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen)中培养5或6天以在调理缓冲液中制备嗜中性粒细胞样分化的HL60。作为目标细菌，通过将其悬浮于调理缓冲液中来制备在MHA上培养的铜绿假单胞菌ATCC 29260。作为补体，通过将其用冰冷的蒸馏水溶解来制备幼兔血清(Cederlane)。将细菌悬液(2 × 104个细胞/ml的终浓度)与抗体培养上清液或纯化抗体混合，允许在4℃下静置30分钟，将制备的嗜中性粒细胞样分化的HL60细胞(4 × 106个细胞/ml的终浓度)和补体(终浓度10%)加入其中，接着在轻轻搅拌时在5% CO2下在37℃下温育1小时。在温育后，将各样品涂布在MHA上，次日对集落计数。与不加入抗体的对照相比，显示50%生长抑制作用的样品被确定为具有活性。
1)-3-3 CDR序列的测定
使用在1)-2-3中获得的小鼠重链和轻链可变区基因产物作为模板，用下列序列引物证实CDR序列。使用Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Life technologies)的基因序列分析仪进行序列分析。根据所获得的序列，按照Andrew C. R. Martin等的Abysis数据库(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid)，测定CDR序列。
序列引物(对于重链)
5’-acaccgctggacagggatccagag-3’ (mIgG序列) (SEQ ID NO: 100)
序列引物(对于轻链)
5’-gtagaagttgttcaagaagcacac-3’ (mIgκ序列) (SEQ ID NO: 101)
1)-3-4 单克隆抗体的选择
从上述筛选来看，发现抗体培养上清液样品No. 76、#1G5和#4C12各具有强的调理吞噬杀伤活性和独特的CDR序列。No. 76是通过使用pJON mIgG2a和pJON mIgκ制备的抗体，#1G5和#4C12是分别使用pJON mIgG2a-hIgG1和pJON mIgκ制备的抗体。SEQ ID NO: 4-27显示重链和轻链可变区和CDR各自的氨基酸序列。虽然序列表中SEQ ID NO: 20所示#4C12的轻链包括第75个氨基酸的半胱氨酸残基，但其中#4C12中75位的半胱氨酸残基被酪氨酸取代的轻链被命名为“#4C13”。此外，#4C12的重链和#1G5的轻链的组合被命名为“#4C13K”。按照1)-2-6的方法，在HEK293T中表达1)-2-5中制备的#4C12的人嵌合重链基因表达单位和#1G5的小鼠轻链基因表达单位，获得#4C13K。#1G5和#4C13K通过蛋白G (GE Healthcare)纯化，分别被命名为“c#1G5M”和“c#4C13KM”。按照1)-3-1的方法计算抗体浓度。
实施例2
人嵌合抗LPS O11抗体和Meiji 1640、Meiji 1656、人IgG1型1BO11 (1BO11 hIgG1)、小鼠IgG2a型No. 76 (No. 76 mIgG2a)的制备
2)-1 嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的构建
通过使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Inc.)，将通过用限制性内切酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ和(INVITROGEN Corp.)获得的约5.4 kb片段和包含编码SEQ ID NO: 28所示人轻链分泌信号和人轻链恒定区的DNA序列的DNA片段彼此连接，制备pcDNA3.3/LK。
使用pcDNA3.3/LK作为模板，用下列引物组进行PCR反应，使所得的约3.8 kb片段磷酸化并进行自我连接，从而构建具有CMV启动子下游的信号序列、克隆位点和人轻链恒定区的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK。
引物组
5’-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3’ (3.3-F1) (SEQ ID NO: 102)
5’-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3’ (3.3-R1) (SEQ ID NO: 103)
2)-2 嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1的构建
通过使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Inc.)，将通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK除去轻链分泌信号和人轻链恒定区获得的DNA片段和包含编码SEQ IDNO: 29所示人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段彼此连接，从而构建具有CMV启动子下游的信号序列、克隆位点和人IgG1重链恒定区的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1。
2)-3 人嵌合抗LPS O11抗体的制备
2)-3-1 人嵌合No. 76轻链表达载体的构建
通过使用含有实施例1)-2-3中获得的No. 76的轻链可变区的cDNA作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，使嵌合和人源化抗体轻链表达载体(pCMA-LK)插入用限制性内切酶BsiWI切割的位点处，从而，构建人嵌合No. 76轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-LK/No. 76”。序列表中的SEQ ID NO: 30显示人嵌合No. 76轻链的核苷酸序列，SEQ ID NO: 31显示其氨基酸序列。
No. 76轻链的引物组
5’-atctccggcgcgtacggcaacattgtaatgacccaatctcccaaatc-3’ (76L-F) (SEQ ID NO:104)
5’-ggagggggcggccacagcccgttttatttccagcttggtcctccc-3’ (76L-R) (SEQ ID NO:105)
2)-3-2 人嵌合No. 76重链表达载体的构建
通过使用实施例1)-2-3中获得的含有No. 76的重链可变区的cDNA作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体(pCMA-G1)插入用限制性内切酶BlpI切割的位点，从而，构建人嵌合No. 76重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-G1/No. 76”。序列表中的SEQ ID NO: 32显示人嵌合No. 76重链的核苷酸序列，SEQ ID NO: 33显示其氨基酸序列。
人嵌合No. 76重链的引物组
5’-ccagatgggtgctgagccaggtccaactgcagcagcctggtgctgag-3’ (76H-F) (SEQ ID NO:106)
5’-cttggtggaggctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3’ (76H-R) (SEQ ID NO:107)
2)-3-3 人嵌合#1G5轻链表达载体的构建
合成包含编码序列表中SEQ ID NO: 34所示人嵌合#1G5轻链的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial Gene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码人嵌合#1G5轻链的DNA序列的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK插入用限制性内切酶XbaI和PmeI切割的位点，从而，构建人嵌合#1G5轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-LK/1G5”。序列表中的SEQID NO: 35显示人嵌合#1G5轻链的氨基酸序列。
人嵌合#1G5轻链的引物组
5’-ccagcctccggactctagagccacc-3’ (CM-inf-F) (SEQ ID NO: 108)
5’-agttagcctcccccgtttaaactc-3’ (CM-inf-R) (SEQ ID NO: 109)
2)-3-4 人嵌合#1G5重链表达载体的构建
合成含有编码由序列表中SEQ ID NO: 36的人嵌合#1G5重链核苷酸序列的核苷酸编号36-449表示的人嵌合#1G5重链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., ArtificialGene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO,Co., Ltd.)和下列引物组，扩增包含编码人嵌合#1G5重链可变区的DNA序列的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1插入用限制性内切酶BlpI切割的位点，从而，构建人嵌合#1G5重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-G1/1G5”。序列表中的SEQ ID NO: 37显示人嵌合#1G5重链的氨基酸序列。
人嵌合#1G5重链的引物组
5’-agctcccagatgggtgctgagc-3’ (EG-Inf-F) (SEQ ID NO: 110)
5’-gggcccttggtggaggctgagc-3’ (EG1-Inf-R) (SEQ ID NO: 111)
2)-3-5 人嵌合#4C13轻链表达载体的构建
合成含有编码序列表中的SEQ ID NO: 38所示人嵌合#4C13轻链的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial Gene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码人嵌合#4C13轻链的DNA序列的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK插入用限制性内切酶XbaI和PmeI切割的位点，从而，构建人嵌合#4C13轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-LK/4C13”。序列表中的SEQ ID NO: 39显示人嵌合#4C13轻链的氨基酸序列。
人嵌合#4C13轻链的引物组
5’-ccagcctccggactctagagccacc-3’ (CM-inf-F) (SEQ ID NO: 108)
5’-agttagcctcccccgtttaaactc-3’ (CM-inf-R) (SEQ ID NO: 109)
2)-3-6 人嵌合#4C13重链表达载体的构建
合成含有编码由序列表中SEQ ID NO: 40的人嵌合#4C13重链核苷酸序列的核苷酸编号36-437表示的人嵌合#4C13重链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc.,Artificial Gene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，扩增包含编码人嵌合#4C13重链可变区的DNA序列的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1插入用限制性内切酶BlpI切割的位点从而构建人嵌合#4C13重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-G1/4C13”。序列表中的SEQ IDNO: 41显示人嵌合#4C13重链的氨基酸序列。
人嵌合#4C13重链的引物组
5’-agctcccagatgggtgctgagc-3' (EG-Inf-F) (SEQ ID NO: 110)
5’'gggcccttggtggaggctgagc-3' (EG1-Inf-R) (SEQ ID NO: 111)
2)-3-7 人嵌合抗LPS O11抗体的制备
2)-3-7-1 人嵌合抗LPS O11抗体的产生
使FreeStyle 293-F细胞(Invitrogen Inc.)按照手册传代并培养。
将对数生长期中的2 × 109个FreeStyle 293-F细胞(Invitrogen，Inc.)接种在3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING Co.)中，用FreeStyle 293表达培养基(INVITROGEN Corp.)稀释至1.0 × 106个细胞/ml，在8% CO2培养箱中，在以90 rpm振荡的同时在37℃下培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polyscience，Inc.，#24765)溶于20 mlOpti-Pro SFM培养基(INVITROGEN，Inc.)中，然后将使用PureLink HiPure Plasmid试剂盒(Invitrogen Corp.)制备的轻链表达载体(0.8 mg)和重链表达载体(0.4 mg)悬浮于20 mlOpti-Pro SFM (Invitrogen Corp)中。向聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合液体(20 ml)中加入20 ml表达载体/Opti-Pro SFM混合液体，将所得液体轻轻搅拌，并允许再静置5分钟。之后，将液体加入FreeStyle 293-F细胞中。在8% CO2培养箱中，在37℃下以90 rpm进行振荡培养7天，将培养上清液用Disposable Capsule Filter (ADVANTEC #CCS-045-E1H)过滤。
通过pCMA-LK/No. 76和pCMA-G1/No. 76的组合获得的人嵌合No. 76被命名为“cNo. 76”；通过pCMA-LK/1G5和pCMA-G1/1G5的组合获得的人嵌合#1G5被命名为“c#1G5”；通过pCMA-LK/4C13和pCMA-G1/4C13的组合获得的人嵌合#4C13被命名为“c#4C13”。
2)-3-7-2 人嵌合抗LPS O11抗体的纯化
通过rProtein A亲和层析法(在4-6℃下)的一步过程，纯化在2)-3-7-1中获得的培养上清液中的抗体。在通过rProtein A亲和层析法纯化之后，在4-6℃下进行缓冲液更换过程。首先，将培养上清液施加在用PBS平衡的充满MabSelect SuRe (由GE HealthcareBioscience Co.制造)的柱中。在全部培养液体置于柱中后，将柱用两倍或更多倍柱体积的PBS洗涤。然后将柱用2M盐酸精氨酸溶液(pH 4.0)洗脱以收集含有抗体的流分。将流分透析(Thermo Scientific，Inc.，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，以用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH 6.0)置换溶液。将溶液用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分级分子量UF10K，Sartorius，Inc.，在4℃下)浓缩，以调节至5 mg/ml或更高的IgG浓度。最后，将溶液通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤，并用作纯化样品。
2)-4 Meiji 1640和Meiji 1656、人IgG1型1BO11 (1BO11 hIgG1)、小鼠IgG2a型No. 76 (No. 76 mIgG2a)的制备
2)-4-1 Meiji 1640的制备
根据WO 2011/102551所述的轻链和重链的氨基酸序列制备Meiji 1640。
2)-4-1-1 Meiji 1640轻链表达载体的构建
合成含有编码由序列表中的SEQ ID NO: 42的Meiji 1640轻链核苷酸序列的核苷酸编号38-408表示的Meiji 1640轻链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., ArtificialGene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO,Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码Meiji 1640轻链可变区的DNA序列的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK插入用限制性内切酶BsiWI切割的位点，从而构建Meiji 1640轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-LK/Meiji 1640”。序列表中的SEQ ID NO: 43显示Meiji1640轻链的氨基酸序列。
Meiji 1640轻链的引物组
5’-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3’ (CM-LKF) (SEQ ID NO: 112)
5’-ggagggggcggccaccgtacg-3’ (KCL-Inf-R) (SEQ ID NO: 113)
2)-4-1-2 Meiji 1640重链表达载体的构建
合成含有编码由序列表中的SEQ ID NO: 44的Meiji 1640重链核苷酸序列的核苷酸编号36-458表示的Meiji 1640重链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., ArtificialGene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO,Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码Meiji 1640重链可变区的DNA序列的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1插入用限制性内切酶BlpI切割的位点，从而构建Meiji 1640重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-G1/Meiji 1640”。序列表中的SEQ ID NO: 45显示Meiji 1640重链的氨基酸序列。
Meiji 1640重链的引物组
5’-agctcccagatgggtgctgagc-3’ (EG-Inf-F) (SEQ ID NO: 110)
5’-gggcccttggtggaggctgagc-3’ (EG1-Inf-R) (SEQ ID NO: 111)
2)-4-2 Meiji 1656的制备
根据WO 2011/102551所述的轻链和重链的氨基酸序列制备Meiji 1656。
2)-4-2-1 Meiji 1656轻链表达载体的构建
合成含有编码由序列表中的SEQ ID NO: 46的Meiji 1656轻链核苷酸序列的核苷酸编号38-402表示的Meiji 1656轻链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., ArtificialGene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO,Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码Meiji 1656轻链可变区的DNA序列的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK插入用限制性内切酶BsiWI切割的位点，从而构建Meiji 1640轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-LK/Meiji 1656”。序列表中的SEQ ID NO: 47显示Meiji1656轻链的氨基酸序列。
Meiji 1656轻链的引物组
5’-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3’ (CM-LKF) (SEQ ID NO: 112)
5’-ggagggggcggccaccgtacg-3’ (KCL-Inf-R) (SEQ ID NO: 113)
2)-4-2-2 Meiji 1656重链表达载体的构建
合成含有编码由序列表中SEQ ID NO: 48的Meiji 1656重链核苷酸序列的核苷酸编号36-467表示的Meiji 1656重链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART Inc., ArtificialGene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO,Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码Meiji 1656重链可变区的DNA序列的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1插入用限制性内切酶BlpI切割的位点，从而构建Meiji 1656重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-G1/Meiji 1656”。序列表中的SEQ ID NO: 49显示Meiji 1656重链的氨基酸序列。
Meiji 1656重链的引物组
5’-agctcccagatgggtgctgagc-3’ (EG-Inf-F) (SEQ ID NO: 110)
5’-gggcccttggtggaggctgagc-3’ (EG1-Inf-R) (SEQ ID NO: 111)
2)-4-3 人IgG1型1BO11 (1BO11 hIgG1)的制备
根据WO 2006/084758的图1和2中所述的轻链和重链的氨基酸序列制备1BO11 hIgG1。
2)-4-3-1 1BO11 hIgG1轻链表达载体的构建
合成编码序列表中SEQ ID NO: 50所示小鼠IgG2b型嵌合1BO11轻链的DNA片段(MBLCo., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码轻链可变区的cDNA的DNA片段扩增，并随着In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)的使用，将嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK插入用限制性内切酶BsiWI切割的位点，从而构建1BO11hIgG1轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-LK/1BO11”。序列表中SEQ IDNO: 51显示1BO11 hIgG1轻链的核苷酸序列，SEQ ID NO: 52显示1BO11 hIgG1轻链的氨基酸序列。
1BO11 hIgG1轻链的引物组
5’-atctccggcgcgtacggcgacgtggtgatgacccagagccctctgtcc-3’
(h1BO-LF)(SEQ ID NO: 114)
5’-gggcggccaccgtacgcttgatctccaccttggtgcctccgccg-3’
(h1BO-LR)(SEQ ID NO: 115)
2)-4-3-2 1BO11 hIgG1重链表达载体的构建
合成编码序列表中SEQ ID NO: 53所示小鼠IgG2b型嵌合1BO11重链的DNA片段(MBLCo., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码重链可变区的cDNA的DNA片段扩增，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1插入用限制性内切酶BlpI切割的位点，从而构建1BO11hIgG1重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA-G1/1BO11”。序列表中SEQ IDNO: 54显示1BO11 hIgG1重链的核苷酸序列，SEQ ID NO: 55显示1BO11 hIgG1重链的氨基酸序列。
1BO11 hIgG1重链的引物组
5’-ccagatgggtgctgagcgaggagcaagtggtggagagcgg-3’ (h1BO-HF)
(SEQ ID NO: 116)
5’-cttggtggaggctgagctcacggtcaccatggtgccttgtc-3’ (h1BO-HR)
(SEQ ID NO: 117)
2)-4-4 小鼠IgG2a型No. 76 (No. 76 mIgG2a)的制备
2)-4-4-1 No. 76 mIgG2a轻链表达载体的制备
合成含有编码SEQ ID NO: 118所示No. 76 mIgG2a轻链的序列的DNA片段(GENEARTInc.，Strings DNA Fragments)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将合成的DNA插入嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK用限制性内切酶XbaI和PmeI消化以除去κ链分泌信号和人κ链恒定区的位点，从而构建No. 76 mIgG2a轻链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA/No. 76 mIgG2aL”。SEQ ID NO: 119显示No. 76 mIgG2a轻链的氨基酸序列。
2)-4-4-2 No. 76 mIgG2a重链表达载体的制备
合成含有编码SEQ ID NO: 120所示No. 76 mIgG2a重链的序列的DNA片段(GENEARTInc., Artificial Gene Synthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.)和下列引物组，使包含编码No. 76 mIgG2a重链的序列的DNA片段扩增，并随着In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)的使用，插入嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK用限制性内切酶XbaI和PmeI消化以除去κ链分泌信号和人κ链恒定区的位点，从而构建No. 76 mIgG2a重链表达载体。由此获得的表达载体被命名为“pCMA/No. 76 mIgG2aH”。SEQ ID NO: 121显示No. 76 mIgG2a重链的氨基酸序列。
No. 76 mIgG2a重链的引物组
5’-ccagcctccggactctagagccacc-3’ (CM-inf-F) (SEQ ID NO: 108)
5’-agttagcctcccccgtttaaactc-3’ (CM-inf-R) (SEQ ID NO: 109)
2)-4-5 Meiji 1640、Meiji 1656、1BO11 hIgG1和No. 76 mIgG2a的产生和纯化
2)-4-5-1 Meiji 1640、Meiji 1656、1BO11 hIgG1和No. 76 mIgG2a的产生
按与实施例2)-3-7-1相同的方式产生这些抗体。
Meiji 1640通过pCMA-LK/Meiji 1640和pCMA-G1/Meiji 1640的组合获得；Meiji1656通过pCMA-LK/Meiji 1656和pCMA-G1/Meiji 1656的组合获得；1BO11 hIgG1通过pCMA-LK/1BO11和pCMA-G1/1BO11的组合获得；而No. 76 mIgG2a通过pCMA/No. 76 mIgG2aL和pCMA/No. 76 mIgG2aH的组合获得。
2)-4-5-2 Meiji 1640、Meiji 1656、1BO11 hIgG1和No. 76 mIgG2a的纯化
按与实施例2)-3-7-2相同的方式，从2)-4-5-1中获得的培养上清液纯化出这些抗体。
实施例3 抗LPS O11抗体的体外活性
3)-1 针对铜绿假单胞菌ATCC 29260的调理吞噬杀伤活性
按照1)-3-2的方法测量cNo. 76、c#1G5M、c#1G5、c#4C13KM、c#4C13、Meiji 1640、Meiji1656和1BO11 hIgG1各自针对铜绿假单胞菌ATCC 29260的调理吞噬杀伤活性。调理吞噬杀伤活性用50%最低生长抑制浓度表示。结果见表2。
[表2]
cNo. 76、c#1G5M、c#1G5、c#4C13KM和c#4C13显示几乎相同水平的调理吞噬杀伤活性，它们显示Meiji 1640的27-81倍的调理吞噬杀伤活性、Meiji 1656的9-27倍的调理吞噬杀伤活性和1BO11 hIgG1的243-729倍的调理吞噬杀伤活性。
3)-2 与铜绿假单胞菌O11菌株的结合特异性
cNo. 76、c#1G5和c#4C13与携带不同O抗原的铜绿假单胞菌的结合特异性通过全细胞ELISA来证实。所用菌株和O抗原见表3。
[表3]
菌株编号 O抗原
ATCC 33348 O1
ATCC 33349 O2
ATCC 33350 O3
ATCC 33351 O4
ATCC 33352 O5
ATCC 33354 O6
ATCC 33353 O7
ATCC 33355 O8
ATCC 33356 O9
ATCC 33357 O10
ATCC 33358 O11
ATCC 33360 O13
ATCC 33361 O14
ATCC 33362 O15
ATCC 33363 O16
ATCC 33364 O17
ATCC 43390 O18
ATCC 43731 O19
ATCC 43732 O20
ATCC 21636 M (无法归类)
ATCC 29260 O11 (阳性对照)
ATCC 25922 大肠杆菌(阴性对照)
将在MHA上培养的细菌悬浮于盐水中以调节OD600至0.5-0.6，并固定1小时。在用5%脱脂乳(Becton, Dickinson and Company)/TBST封闭2小时后，将0.1 μg/ml cNo. 76、c#1G5和c#4C13作为第一抗体加入悬液中。使悬液反应1小时，接着与作为第二抗体的抗人IgG，HRP-Linked WholeAb Sheep (GE Healthcare)反应1小时，之后加入SuperSignal ELISA PicoChemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific K.K.)，在添加后立即用ARVO1420多标记计数器(Perkin Elmer)测量光发射。在各步骤之间，用TBST进行2次或3次洗涤。铜绿假单胞菌ATCC 29260用作阳性对照，大肠杆菌ATCC 25922用作阴性对照。cNo. 76、c#1G5和c#4C13显示与O11菌株的高结合活性。另一方面，因为cNo. 76、c#1G5和c#4C13显示与其它携带O抗原的菌株无结合活性，因此发现它们特异性识别抗原O11 (图4)。
3)-3 对铜绿假单胞菌O11临床分离株的结合活性
通过全细胞ELISA，测量抗体与Daiichi Sankyo Co., Ltd.保存的31个铜绿假单胞菌O11的临床分离株和与作为阳性对照的ATCC 29260的结合活性。如下测定铜绿假单胞菌的O抗原：将20 μl用于铜绿假单胞菌血清分型的免疫血清(Denka Seiken Co., Ltd.)和20 μl细菌溶液混合，观察由抗原-抗体反应引起的凝集存在与否。按与3)-2中相同的方式，进行全细胞ELISA，制备0.1 μg/ml的cNo. 76、c#1G5M、c#4C13KM、Meiji 1640和Meiji 1656和6.4 μg/ml的1BO11 hIgG1，作为第一抗体并允许反应1小时。所用细菌菌株的信息见表4，测量结果见表5。
[表4]
菌株编号 分离年份 分离国家 分离部位
1 2010 日本 呼吸道
2 2010 日本 呼吸道
3 2010 日本 呼吸道
4 2010 日本 呼吸道
5 2010 日本 呼吸道
6 2010 日本 呼吸道
7 2010 日本 呼吸道
8 2010 日本 呼吸道
9 2010 日本 尿液
10 2010 日本 尿液
11 2009 美国 呼吸道
12 2009 美国 血液
13 2009 美国 呼吸道
14 2009 美国 呼吸道
15 2009 美国 血液
16 2009 美国 呼吸道
17 2009 美国 呼吸道
18 2009 美国 血液
19 2009 美国 血液
20 2009 美国 血液
21 2009 德国 血液
22 2009 西班牙 呼吸道
23 2009 西班牙 呼吸道
24 2009 法国 血液
25 2009 意大利 呼吸道
26 2009 意大利 呼吸道
27 2009 法国 呼吸道
28 2009 西班牙 血液
29 2010 瑞典 血液
30 2003 西班牙 呼吸道
31 2007 日本 呼吸道
[表5]
菌株编号 cNo. 76 c#1G5M c#4C13KM Meiji1640 Meiji1656 1BO11 hIgG1
ATCC 29260 + + + + + +
1 + + + + + +
2 + + + + + +
3 + + + + + -
4 + + + + + +
5 + + + + + +
6 + + + + + +
7 + + + + + +
8 + + + + + +
9 + + + - - -
10 + + + + + +
11 + + + - - -
12 + + + - - -
13 + + + + + +
14 + + + + + +
15 + + + - + -
16 + + + + + +
17 + + + + + +
18 + + + - - -
19 + + + - + -
20 + + + - + -
21 + + + + + +
22 + + + + + +
23 + + + + + +
24 + + + + + +
25 + + + + + +
26 + + + + + +
27 + + + + + +
28 + + + - - -
29 + + + - - -
30 + + + + + +
31 + + + + + +
＋：阳性，－：阴性
当针对铜绿假单胞菌O11临床分离株的抗体的结合活性是针对大肠杆菌的结合活性的4倍或更多倍强时，认定所述抗体具有针对铜绿假单胞菌O11临床分离株的结合活性。cNo.76、c#1G5M和c#4C13KM显示针对所有菌株的结合活性，Meiji 1640显示只针对22个菌株的结合活性，Meiji 1656显示只针对25个菌株的结合活性，1BO11 hIgG1显示只针对21菌株的结合活性。cNo. 76、c#1G5M、c#4C13KM、Meiji 1640、Meiji 1656和1BO11 hIgG1对O11临床分离株的覆盖比率分别为100%、100%、100%、71%、81%和68%。
3)-4 针对铜绿假单胞菌O11临床分离株的调理吞噬杀伤活性
测量了针对用于3)-3中的O11菌株中的第9号、第12号、第18号、第24号、第26号和第31号菌株的调理吞噬杀伤活性。该方法按与1)-3-2中所述相同的方式进行，测定在观察到50%最低生长抑制浓度下的最低浓度。结果见表6。
[表6]
cNo. 76、c#1G5或c#1G5M、c#4C13或c#4C13KM显示针对全部菌株的活性。另一方面，Meiji 1640、Meiji 1656和1BO11 hIgG1不显示针对第9、12和18号菌株的调理吞噬杀伤活性，未观察到与其有结合活性。这些结果显示，与Meiji 1640、Meiji 1656和1BO11 hIgG1相比，cNo. 76、c#1G5或c#1G5M、c#4C13或c#4C13KM显示体外针对O11菌株的较高覆盖比率。
实施例4 抗LPS O11抗体的体内活性
4)-1 对铜绿假单胞菌ATCC 29260所致肺部感染的小鼠模型的治疗功效(静脉内给予)
将在MHA上培养的铜绿假单胞菌ATCC 29260制备至OD600 = 0.10，用Mueller HintonBroth (Becton, Dickinson and Company)制备100-109的10倍稀释系列，并在35℃下培养过夜。使用OD600 = 0.10或在稀释系列中大于OD600 = 0.10的最高稀释度的细菌悬液，将悬液制备至OD600 = 0.10，稀释4倍，将稀释悬液用作接种物。用50 μl的接种物给ICR小鼠(Charles River)鼻内接种，在接种后1小时，静脉内给予3或10 mg/kg的cNo. 76、Meiji1640和Meiji 1656 (n = 3)。在接种24小时后，测量肺中的活细胞计数以确定治疗功效。与不给予抗体的对照组相比，在cNo. 76给药组中证实良好的治疗功效，这种治疗功效等于或大于Meiji 1640和Meiji 1656各自的作用(图5)。
4)-2 对铜绿假单胞菌临床分离株所致肺部感染的小鼠模型的治疗功效
4)-2-1 由铜绿假单胞菌临床分离株第12号所致肺部感染的小鼠模型的治疗功效(混合给予细菌和抗体)
将培养在MHA上的铜绿假单胞菌临床分离株第12号悬浮于盐水中，调节至OD600 = 2.0(调节10倍稀释的悬液以制备OD600 = 0.2的细菌悬液)。将20 μg/ml或100 μg/ml的cNo.76、Meiji 1640r或Meiji 1656以1:9的比率混合，使得确实发生细菌和抗体间的结合，用50μl混合物给ICR小鼠(Charles River) (n = 3)鼻内接种。在接种后24小时，测量肺中的活细胞计数以确定治疗作用。另外，还检查了作为对照的左氧氟沙星(LVFX)的治疗功效(LVFX针对第12号菌株的最低抑制浓度(MIC)为>128 μg/ml)。换句话说，以1:9的比率将细菌悬液和盐水混合，将50 μl混合物给小鼠接种，并且在接种后立即将240 mg/kg的LVFX皮下给予接种的小鼠。与不给予抗体的对照组相比，在cNo. 76给药组中证实良好的治疗功效，但是在Meiji 1640、Meiji 1656或LVFX给药组中未观察到(图6)。
4)-2-2对铜绿假单胞菌临床分离株第31号所致肺部感染的小鼠模型的治疗功效(混合给予细菌和抗体)
将培养在MHA上的铜绿假单胞菌临床分离株第31号悬浮于盐水中，调节至OD600 = 5.0(调节10倍稀释的悬液以制备OD600 = 0.5的细菌悬液)。将细菌悬液和20 μg/ml或100 μg/ml的cNo. 76，Meiji 1640或Meiji 1656以1:9的比率混合，使得确实发生细菌和抗体间的结合，用50 μl混合物给ICR小鼠(Charles River) (n = 3)鼻内接种。在接种后24小时，测量肺中的活细胞计数以确定治疗功效。另外，还检查了作为对照的LVFX的治疗功效(LVFX针对菌株第31号的MIC为32 μg/ml)。换句话说，以1:9的比率将细菌悬液和盐水混合，将50 μl混合物给小鼠接种，并且在接种后立即将240 mg/kg的LVFX皮下给予接种的小鼠。与不给予抗体的对照组相比，在cNo. 76、Meiji 1640和Meiji 1656给药组中证实了良好的治疗功效，但在LVFX给药组中未观察到(图7)。
4)-2-3 对由铜绿假单胞菌临床分离株第12号所致肺部感染的小鼠模型的治疗功效(静脉内给予)
将培养在MHA上的铜绿假单胞菌临床分离株第12号悬浮于盐水中以调节至OD600 =0.20，将此用作接种物。用接种物(50 μl)给ICR小鼠(Charles River)(n = 3)鼻内接种，在接种后立即静脉内给予2 mg/kg或10 mg/kg的cNo. 76、Meiji 1640或Meiji 1656。在接种后24小时，测量肺中的活细胞计数以确定治疗作用。另外，通过以240 mg/kg剂量的皮下给药，还检查了作为对照的LVFX的治疗功效。甚至在静脉内给予时，cNo. 76都显示良好的治疗功效，但在Meiji 1640、Meiji 1656或LVFX给药组中未观察到治疗功效(图8)。这就表明，甚至针对现有药物(例如LVFX)对之无效的多重耐药性铜绿假单胞菌，cNo. 76也是有效的。另外，体内还证实了cNo. 76的实施例3中所示的特有的高的体外覆盖比率。
实施例5 人源化#1G5和#4C13K的设计
5)-1 #1G5的人源化形式的设计
5)-1-1 #1G5可变区的分子建模
#1G5可变区的分子建模按照通常称为同源建模的方法进行(Methods in Enzymology,203, 121-153, (1991))。将蛋白质数据库(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(可获得来源于X射线晶体结构的三维结构)与上文测定的#1G5可变区进行比较。结果，在构架中同样具有缺失的抗体中，选出1UYW作为与#1G5轻链可变区具有最高序列同源性的序列。另外，选出3GI9作为与#1G5重链可变区具有最高序列同源性的序列。通过将相当于#1G5轻链的1UYW的坐标与相当于#1G5重链的3GI9的坐标结合，根据“构架模型”，制备构架区的三维结构。然后，将各CDR的代表性构象整合到构架模型中。
最后，为了获得在能量方面的#1G5可变区的可能的分子模型，进行能量计算，以排除不利的原子间接触。应用市售蛋白质构象分析程序Discovery Studio (Accelrys，Inc)，进行上述程序。
5)-1-2 人源化#1G5的氨基酸序列的设计
按照通常称为CDR移植的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989))，构建人源化#1G5抗体。根据构架区内的氨基酸同源性选择接纳体抗体。将#1G5的构架区的序列与抗体氨基酸序列的Kabat数据库(Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001))的所有人构架序列进行比较。结果，根据构架区中75%的序列同源性，选择HuMc3抗体作为接纳体。使HuMc3的构架区中的氨基酸残基与#1G5的氨基酸残基进行比对，鉴定出其中使用不同氨基酸的位置。使用上文构建的#1G5的三维模型，分析这些残基的位置。然后，按照Queen等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))提供的标准，选择待移植到接纳体中的供体残基。按下列实施例中所述，通过将一些所选的供体残基转移到接纳体抗体上，构建人源化#1G5序列。
5)-2 #1G5重链的人源化
5)-2-1 h#1G5-H1型重链：
通过将序列表中SEQ ID NO: 37所示#1G5重链的氨基酸编号24 (谷氨酰胺)用缬氨酸、氨基酸编号26 (脯氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号30 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号57 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号59 (精氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号67 (异亮氨酸)用甲硫氨酸、氨基酸编号86(赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号87 (丙氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号89 (亮氨酸)用异亮氨酸、氨基酸编号91 (缬氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号95 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号101(谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号106 (苏氨酸)用精氨酸、氨基酸编号108 (天冬氨酸)用谷氨酸、氨基酸编号110 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号116 (丝氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号139 (丝氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号141 (异亮氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5重链被命名为“h#1G5-H1型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 57给出h#1G5-H1型重链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的氨基酸残基20-144的序列和包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列的氨基酸残基145-474的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 56给出编码SEQ ID NO:57的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 56的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 56的核苷酸序列的核苷酸58-432的序列和包含SEQ ID NO: 56的核苷酸序列的核苷酸433-1422的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQID NO: 56的核苷酸序列和SEQ ID NO: 57的氨基酸序列也记载于图9中。
5)-2-2 h#1G5-H2型重链：
通过将序列表中SEQ ID NO: 37所示#1G5重链的氨基酸编号24 (谷氨酰胺)用缬氨酸、氨基酸编号26 (脯氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号30 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号57 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号59 (精氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号67 (异亮氨酸)用甲硫氨酸、氨基酸编号86(赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号87 (丙氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号95 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号101 (谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号106 (苏氨酸)用精氨酸、氨基酸编号108(天冬氨酸)用谷氨酸、氨基酸编号110 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号139 (丝氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号141 (异亮氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5重链被命名为“h#1G5-H2型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 59给出h#1G5-H2型重链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的氨基酸残基20-144的序列和包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的氨基酸残基145-474的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 58给出编码SEQ ID NO:59的氨基酸序列的核苷酸序列。 包含SEQ ID NO: 58的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 58的核苷酸序列的核苷酸58-432的序列和包含SEQ ID NO: 58的核苷酸序列的核苷酸433-1422的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQID NO: 58的核苷酸序列和SEQ ID NO: 59的氨基酸序列同样记载于图10中。
5)-2-3 h#1G5-H3型重链：
通过将序列表中SEQ ID NO: 37所示#1G5重链的氨基酸编号30 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号57 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号59 (精氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号67 (异亮氨酸)用甲硫氨酸、氨基酸编号86 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号95 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号101 (谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号108 (天冬氨酸)用谷氨酸、氨基酸编号110 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号139 (丝氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号141 (异亮氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5重链被命名为“h#1G5-H3型重链”.
序列表中的SEQ ID NO: 61给出h#1G5-H3型重链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的氨基酸残基20-144的序列和包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的氨基酸残基145-474的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 60给出编码SEQ ID NO: 61的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 60的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 60的核苷酸序列的核苷酸58-432的序列和包含SEQ ID NO: 60的核苷酸序列的核苷酸433-1422的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ IDNO: 60的核苷酸序列和SEQ ID NO: 61的氨基酸序列也记载于图11中。
5)-2-4 h#1G5–H4型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 37所示#1G5重链的氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号57 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号59 (精氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号139 (丝氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号141 (异亮氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5重链被命名为“h#1G5-H4型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 63给出h#1G5-H4型重链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列的氨基酸残基20-144的序列和包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列的氨基酸残基145-474的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 62给出编码SEQ ID NO:63的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列的核苷酸58-432的序列和包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列的核苷酸433-1422的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQID NO: 62的核苷酸序列和SEQ ID NO: 63的氨基酸序列也记载于图12中。
5)-2-5 h#1G5-H5型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 37所示#1G5重链的氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸和氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸取代而设计的人源化#1G5重链被命名为“h#1G5-H5型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 65给出h#1G5-H5型重链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列的氨基酸残基20-144的序列和包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列的氨基酸残基145-474的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 64给出编码SEQ ID NO:65的氨基酸序列的核苷酸序列。 包含SEQ ID NO: 64的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 64的核苷酸序列的核苷酸58-432的序列和包含SEQ ID NO: 64的核苷酸序列的核苷酸433-1422的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQID NO: 64的核苷酸序列和SEQ ID NO: 65的氨基酸序列也记载于图13中。
5)-3 #1G5轻链的人源化
5)-3-1 h#1G5-L1型轻链
通过将序列表中的SEQ ID NO: 35所示#1G5轻链的氨基酸编号21 (天冬酰胺)用天冬氨酸、氨基酸编号29 (赖氨酸)用天冬氨酸、氨基酸编号31 (甲硫氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号32 (丝氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号33 (甲硫氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号35 (缬氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号39 (缬氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号41 (亮氨酸)用异亮氨酸、氨基酸编号42 (丝氨酸)用天冬酰胺、氨基酸编号60 (丙氨酸)用脯氨酸、氨基酸编号61 (谷氨酸)用甘氨酸、氨基酸编号63 (丝氨酸)用脯氨酸、氨基酸编号66 (脯氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号83 (苏氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号88 (丙氨酸)用甘氨酸、氨基酸编号98 (缬氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号103 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号105 (天冬氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号107 (组氨酸)用酪氨酸、氨基酸编号120 (甘氨酸)用谷氨酰胺、氨基酸编号124 (亮氨酸)用缬氨酸和氨基酸编号129 (丙氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5轻链被命名为“h#1G5-L1型轻链”。
序列表中的SEQ ID NO: 67给出h#1G5-L1型轻链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的序列和包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列的氨基酸残基130-234的序列分别相当于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 66给出编码SEQ ID NO:67的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 66的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含SEQ ID NO: 66的核苷酸序列的核苷酸61-387的序列和包含SEQ ID NO: 66的核苷酸序列的核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ IDNO: 66的核苷酸序列和SEQ ID NO: 67的氨基酸序列也记载于图14中。
5)-3-2 h#1G5-L2型轻链：
通过将序列表中的SEQ ID NO: 35所、示#1G5轻链的氨基酸编号29 (赖氨酸)用天冬氨酸、氨基酸编号31 (甲硫氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号32 (丝氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号33(甲硫氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号35 (缬氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号39 (缬氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号41 (亮氨酸)用异亮氨酸、氨基酸编号60 (丙氨酸)用脯氨酸、氨基酸编号61(谷氨酸)用甘氨酸、氨基酸编号83 (苏氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号98 (缬氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号103 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号105 (天冬氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号124(亮氨酸)用缬氨酸和氨基酸编号129 (丙氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5轻链被命名为“h#1G5-L2型轻链”。
序列表中的SEQ ID NO: 69给出h#1G5-L2型轻链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的序列和包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列的氨基酸残基130-234的序列分别相当于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 68给出编码SEQ ID NO:69的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 68的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含SEQ ID NO: 68的核苷酸序列的核苷酸61-387的序列和包含SEQ ID NO: 68的核苷酸序列的核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ IDNO: 68的核苷酸序列和SEQ ID NO: 69的氨基酸序列也记载于图15中。
5)-3-3 h#1G5-L3型轻链
通过将序列表中的SEQ ID NO: 35所示#1G5轻链的氨基酸编号29 (赖氨酸)用天冬氨酸、氨基酸编号31 (甲硫氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号32 (丝氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号33(甲硫氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号35 (缬氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号39 (缬氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号41 (亮氨酸)用异亮氨酸、氨基酸编号60 (丙氨酸)用脯氨酸、氨基酸编号61(谷氨酸)用甘氨酸、氨基酸编号83 (苏氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号98 (缬氨酸)用亮氨酸、氨基酸编号103 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号124 (亮氨酸)用缬氨酸和氨基酸编号129(丙氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5轻链被命名为“h#1G5-L3型轻链”.
序列表中的SEQ ID NO: 71给出h#1G5-L3型轻链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的序列和包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的氨基酸残基130-234的序列分别相当于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 70给出编码SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 70的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含SEQ ID NO: 70的核苷酸序列的核苷酸61-387的序列和包含SEQ ID NO: 70的核苷酸序列的核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ IDNO: 70的核苷酸序列和SEQ ID NO: 71的氨基酸序列也记载于图16中。
5)-3-4 h#1G5-L4型轻链
通过将序列表中的SEQ ID NO: 35所示#1G5轻链的氨基酸编号29 (赖氨酸)用天冬氨酸、氨基酸编号39 (缬氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号98 (缬氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号129(丙氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化h#1G5轻链被命名为“h#1G5-L4型轻链”.
序列表中的SEQ ID NO: 73给出h#1G5-L4型轻链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的序列和包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的氨基酸残基130-234的序列分别相当于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 72给出编码SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 72的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含SEQ ID NO: 72的核苷酸序列的核苷酸61-387的序列和包含SEQ ID NO: 72的核苷酸序列的核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ IDNO: 72的核苷酸序列和SEQ ID NO: 73的氨基酸序列也记载于图17中。
5)-3-5 h#1G5-L5型轻链
通过将序列表中的SEQ ID NO: 35所示#1G5轻链的氨基酸编号29 (赖氨酸)用天冬氨酸、氨基酸编号98 (缬氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号129 (丙氨酸)用苏氨酸取代而设计的人源化#1G5轻链被命名为“h#1G5-L5型轻链”。
序列表中的SEQ ID NO: 75给出h#1G5-L5型轻链的氨基酸序列。包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含SEQ ID NO: 75的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的序列和包含SEQ ID NO: 75的氨基酸序列的氨基酸残基130-234的序列分别相当于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 74给出编码SEQ ID NO:75的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 74的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含SEQ ID NO: 74的核苷酸序列的核苷酸61-387的序列和包含SEQ ID NO: 74的核苷酸序列的核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ IDNO: 74的核苷酸序列和SEQ ID NO: 75的氨基酸序列也记载于图18中。
5)-4 #4C13K的人源化形式的设计
5)-4-1 #4C13K可变区的分子建模
#4C13K可变区的分子建模按照通常称为同源建模的方法进行(Methods inEnzymology, 203, 121-153, (1991))。将蛋白质数据库(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303(2007))登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(可获得来源于X射线晶体结构的三维结构)与上文测定的#4C13K可变区进行比较。结果，在构架中同样具有缺失的抗体中，选择1UYW作为与#4C13K轻链可变区具有最高序列同源性的序列。另外，选择1CIC作为与#4C13K重链可变区具有最高序列同源性的序列。通过将相当于#4C13K轻链的1UYW的坐标与相当于#4C13K重链的1CIC的坐标结合，根据“构架模型”，制备构架区的三维结构。然后，将各CDR的代表性构象并入构架模型中。
最后，为了获得在能量方面的#4C13K可变区可能的分子模型，进行能量计算，以排除不利的原子间接触。应用市售蛋白质构象分析程序Discovery Studio (Accelrys，Inc)，进行上述程序。
5)-4-2 人源化#4C13K的氨基酸序列的设计
人源化#4C13K抗体按照通常称为CDR移植的方法构建(Proc. Natl. Acad. Sci. USA86, 10029-10033 (1989))。根据构架区内的氨基酸同源性选择接纳体抗体。将#4C13K的构架区的序列与抗体氨基酸序列的Kabat数据库(Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001))的所有人构架序列进行比较。结果，根据构架区中73%的序列同源性，选择HuMc3抗体作为接纳体。将HuMc3构架区的氨基酸残基与#4C13K的氨基酸残基比对，鉴定出其中使用不同氨基酸的位置。使用上文构建的#4C13K的三维模型，分析这些残基的位置。然后，按照Queen等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))提供的标准，选择待移植到接纳体中的供体残基。通过将一些所选的供体残基转移到接纳体抗体上，按下列实施例中所述，构建人源化#4C13K序列。人源化#4C13K序列的轻链与人源化#1G5序列的轻链完全一样。
5)-5 #4C13K重链的人源化
5)-5-1 h#4C13K-H1型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 41所示#4C13K重链的氨基酸编号24 (谷氨酰胺)用缬氨酸、氨基酸编号26 (脯氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号30 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号31(缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号56 (甲硫氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号57 (谷氨酰胺)用精氨酸、氨基酸编号59 (精氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号67(异亮氨酸)用甲硫氨酸、氨基酸编号86 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号87 (丙氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号89 (亮氨酸)用异亮氨酸、氨基酸编号91 (缬氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号95 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号101 (谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号103 (天冬酰胺)用丝氨酸、氨基酸编号106 (苏氨酸)用精氨酸、氨基酸编号108 (天冬氨酸)用谷氨酸、氨基酸编号110 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号116 (苏氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号135 (苏氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号136 (亮氨酸)用缬氨酸取代而设计的人源化#4C13K重链被命名为“h#4C13K-H1型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 77给出h#4C13K-H1型重链的氨基酸序列。包含SEQ IDNO: 77的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的序列和包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列的氨基酸残基141-470的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 76给出编码SEQ IDNO: 77的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 76的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 76的核苷酸序列的核苷酸58-420的序列和包含SEQ ID NO: 76的核苷酸序列的核苷酸421-1410的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 76的核苷酸序列和SEQ ID NO: 77的氨基酸序列也记载于图19中。
5)-5-2 h#4C13K-H2型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 41所示#4C13K重链的氨基酸编号24 (谷氨酰胺)用缬氨酸、氨基酸编号26 (脯氨酸)用丝氨酸、氨基酸编号30 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号31(缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号56 (甲硫氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号57 (谷氨酰胺)用精氨酸、氨基酸编号59 (精氨酸)用丙氨酸、氨基酸编号67(异亮氨酸)用甲硫氨酸、氨基酸编号86 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号87 (丙氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号95 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号101 (谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号103 (天冬酰胺)用丝氨酸、氨基酸编号106 (苏氨酸)用精氨酸、氨基酸编号108 (天冬氨酸)用谷氨酸、氨基酸编号110 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号135 (苏氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号136 (亮氨酸)用缬氨酸取代而设计的人源化#4C13K重链被命名为“h#4C13K-H2型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 79给出h#4C13K-H2型重链的氨基酸序列。包含SEQ IDNO: 79的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 79的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的序列和包含SEQ ID NO: 79的氨基酸序列的氨基酸残基141-470的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 78给出编码SEQ IDNO: 79的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 78的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 78的核苷酸序列的核苷酸58-420的序列和包含SEQ ID NO: 78的核苷酸序列的核苷酸421-1410的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 78的核苷酸序列和SEQ ID NO: 79的氨基酸序列也记载于图20中。
5)-5-3 h#4C13K-H3型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 41所示#4C13K重链的氨基酸编号30 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号67 (异亮氨酸)用甲硫氨酸、氨基酸编号86 (赖氨酸)用精氨酸、氨基酸编号95 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号101 (谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号103 (天冬酰胺)用丝氨酸、氨基酸编号108 (天冬氨酸)用谷氨酸、氨基酸编号110 (丝氨酸)用苏氨酸、氨基酸编号135 (苏氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号136 (亮氨酸)用缬氨酸取代而设计的人源化#4C13K重链被命名为“h#4C13K-H3型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 81给出h#4C13K-H3型重链的氨基酸序列。包含SEQ IDNO: 81的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 81的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的序列和包含SEQ ID NO: 81的氨基酸序列的氨基酸残基141-470的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 80给出编码SEQ IDNO: 81的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 80的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 80的核苷酸序列的核苷酸58-420的序列和包含SEQ ID NO: 80的核苷酸序列的核苷酸421-1410的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 80的核苷酸序列和SEQ ID NO: 81的氨基酸序列也记载于图21中。
5)-5-4 h#4C13K-H4型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 41所示#4C13K重链的氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号101 (谷氨酰胺)用谷氨酸、氨基酸编号103(天冬酰胺)用丝氨酸、氨基酸编号135 (苏氨酸)用亮氨酸、和氨基酸编号136 (亮氨酸)用缬氨酸取代而设计的人源化#4C13K重链被命名为“h#4C13K-H4型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 83给出h#4C13K-H4型重链的氨基酸序列。包含SEQ IDNO: 83的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 83的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的序列和包含SEQ ID NO: 83的氨基酸序列的氨基酸残基141-470的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 82给出编码SEQ IDNO: 83的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 82的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 82的核苷酸序列的核苷酸58-420的序列和包含SEQ ID NO: 82的核苷酸序列的核苷酸421-1410的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 82的核苷酸序列和SEQ ID NO: 83的氨基酸序列也记载于图22中。
5)-5-5 h#4C13K-H5型重链
通过将序列表中SEQ ID NO: 41所示#4C13K重链的氨基酸编号31 (缬氨酸)用赖氨酸、氨基酸编号39 (亮氨酸)用缬氨酸、氨基酸编号135 (苏氨酸)用亮氨酸和氨基酸编号136(亮氨酸)用缬氨酸取代而设计的人源化#4C13K重链被命名为“h#4C13K-H5型重链”。
序列表中的SEQ ID NO: 85给出h#4C13K-H5型重链的氨基酸序列。包含SEQ IDNO: 85的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的序列和包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列的氨基酸残基141-470的序列分别相当于信号序列、重链可变区和重链恒定区。序列表中的SEQ ID NO: 84给出编码SEQ IDNO: 85的氨基酸序列的核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 84的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含SEQ ID NO: 84的核苷酸序列的核苷酸58-420的序列和包含SEQ ID NO: 84的核苷酸序列的核苷酸421-1410的序列列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 84的核苷酸序列和SEQ ID NO: 85的氨基酸序列也记载于图23中。
实施例6 人源化抗体#1G5和#4C13K的制备
6)-1 人源化#1G5抗体轻链表达载体的构建
6)-1-1 h#1G5-L2型轻链表达载体的构建
合成含有编码ID SEQ NO: 68所示h#1G5-L2型轻链的核苷酸序列的核苷酸编号38-402所示h#1G5-L2型轻链可变区的序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial GeneSynthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co.,Ltd.)和下列引物组，扩增包含编码h#1G5-L2型轻链可变区的DNA序列的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，将嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK插入用限制性内切酶BsiWI切割的位点，从而，构建人嵌合h#1G5-L2型轻链表达载体。所得表达载体被命名为“pCMA-LK/h#1G5-L2”。
人源化抗体轻链的引物组
5’-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3’ (CM-LKF)(SEQ ID NO: 112)
5’-ggagggggcggccaccgtacg-3’ (KCL-Inf-R)(SEQ ID NO: 113)
6)-1-2 h#1G5-L3型轻链表达载体的构建
合成含有编码ID SEQ NO: 70所示#1G5-L3型轻链的核苷酸序列的核苷酸编号38-402所示h#1G5-L3型轻链可变区的序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial GeneSynthesis Service)。h#1G5-L3型轻链表达载体按与实施例6)-1-1相同的方式构建。所得表达载体被命名为“pCMA-LK/h#1G5-L3”。
6)-2 人源化抗体#1G5重链表达载体的构建
6)-2-1 h#1G5-H2型重链表达载体的构建
合成含有编码ID SEQ NO: 58所示h#1G5-H2型重链的核苷酸序列的核苷酸编号36-432所示h#1G5-H2型重链可变区的序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial GeneSynthesis Service)。通过使用合成的DNA片段作为模板，另使用KOD-Plus-(TOYOBO, Co.,Ltd.)和下列引物组，扩增包含编码h#1G5-H2型重链可变区的DNA序列的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech，Inc.)，使嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1插入用限制性内切酶BlpI切割的位点，从而，构建h#1G5-H2型重链表达载体。所得表达载体被命名为“pCMA-G1/h#1G5-H2”。
人源化抗体重链的引物组
5’-agctcccagatgggtgctgagc-3’ (EG-Inf-F) (SEQ ID NO: 110)
5’-cttggtggaggctgagctcacggtcacgagggtgccctggcc-3’ (H-R) (SEQ ID NO: 122)
6)-2-2 h#1G5-H3型重链表达载体的构建
合成含有编码ID SEQ NO: 60所示#1G5-H3型重链的核苷酸序列的核苷酸编号36-432所示h#1G5-H3型重链可变区的序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial GeneSynthesis Service)。h#1G5-H3型重链表达载体以与实施例6)-2-1相同的方式构建。所得表达载体被命名为“pCMA-G1/h#1G5-H3”。
6)-3 人源化抗体#4C13K重链表达载体的构建
6)-3-1 h#4C13K-H2型重链表达载体的构建
合成含有编码ID SEQ NO: 78所示h#4C13K-H2型重链的核苷酸序列的核苷酸编号36-420所示h#4C13K-H2型重链可变区的序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial GeneSynthesis Service)。h#4C13K-H2型重链表达载体按与实施例6)-2-1相同的方式构建。所得表达载体被命名为“pCMA-G1/h#4C13K-H2”。
6)-3-2 h#4C13K-H3型重链表达载体的构建
合成含有编码ID SEQ NO: 80所示#4C13K-H3型重链的核苷酸序列的核苷酸编号36-420所示h#4C13K-H3型重链可变区的序列的DNA片段(GENEART Inc., Artificial GeneSynthesis Service)。#4C13K-H3型重链表达载体按与实施例6)-2-1相同的方式构建。所得表达载体被命名为“pCMA-G1/#4C13K-H3”。
实施例7 #1G5和#4C13K的人源化抗体的制备
7)-1 #1G5和#4C13K的人源化抗体的产生
这些人源化抗体按与实施例2)-3-7-1相同的方式产生。
在本说明书中，要注意，例如具有h#1G5-H1重链和h#1G5-L1的抗体被称为“h#1G5-H1/L1”或“h#1G5-H1/L1抗体”，具有h#4C13K-H1重链和h#1G5-L1的抗体被称为“h#4C13K-H1/L1”或“h#4C13K-H1/L1抗体”。
h#1G5-H2/L2通过将pCMA-G1/h#1G5-H2和pCMA-LK/h#1G5-L2组合获得；h#1G5-H3/L3通过将pCMA-G1/h#1G5-H3和pCMA-LK/h#1G5-L3组合获得；h#4C13K-H2/L2通过将pCMA-G1/h#4C13K-H2和pCMA-LK/h#1G5-L2组合获得；h#4C13K-H3/L3通过将pCMA-G1/h#4C13K-H3和pCMA-LK/h#1G5-L3组合获得。
7)-2 #1G5和#4C13K的人源化抗体的构建
将在上文7)-1中获得的培养上清液按与实施例2)-3-7-2相同的方式纯化。
实施例8
#1G5和#4C13K的人源化抗体的体外活性的测量
8)-1 针对铜绿假单胞菌ATCC 29260的调理吞噬杀伤活性
按照1)-3-2的方法，测量h#1G5-H2/L2、h#1G5-H3/L3、h#4C13K-H2/L2和h#4C13k-H3/L3针对ATCC 29260的调理吞噬杀伤活性，然后与c#1G5和c#4C13的进行比较。调理吞噬杀伤活性用50%最低生长抑制浓度来表示。结果见表7。
[表7]
4种人源化抗体显示与c#1G5和c#4C13相等的活性。
8)-2 与铜绿假单胞菌O11菌株的结合特异性
h#1G5-H2/L2、h#1G5-H3/L3、h#4C13K-H2/L2和h#4C13K-H3/L3对携带不同O抗原的铜绿假单胞菌的结合特异性按照3)-2的方法证实。与c#1G5和c#4C13一样，4种人源化抗体仅对O11菌株显示高特异性活性(图25)。
8)-3 针对铜绿假单胞菌O11临床分离株的结合活性
h#1G5-H2/L2、h#1G5-H3/L3、h#4C13K-H2/L2和h#4C13K-H3/L3与由Daiichi SankyoCo., Ltd.保管的31种铜绿假单胞菌O11临床分离株的结合活性按照3)-3的方法评价。与c#1G5和c#4C13一样，4种人源化抗体对所有O11临床分离株显示结合活性(图26)。
实施例9 #1G5和#4C13K的人源化抗体的体内活性的评价
按照4)-1的方法，对c#1G5、c#4C13、h#1G5-H2/L2、h#1G5-H3/L3、h#4C13K-H2/L2和h#4C13K-H3/L3针对ATCC 29260的体内活性进行了评价。与不给予抗体的对照组相比，c#1G5、c#4C13和4种人源化抗体全都显示治疗效能，这种效能大于Meiji 1656的效能(图27)。
实施例10 竞争测定法
使用全细胞ELISA中的结合活性作为指标，用铜绿假单胞菌ATCC 29260进行了No. 76mIgG2a和cNO.76、c#1G5、c#4C13、Meiji 1640、Meiji 1656或1BO11 hIgG1间的竞争测定法。按照3)-2的方法，分别加入No. 76 mIgG2a (0.01 μg/ml的终浓度)和cNO.76、c#1G5、c#4C13、Meiji 1640、Meiji 1656和1BO11 hIgG1的任一种(0.01、0.1、1、10、100、1,000 μg/ml的终浓度)作为第一抗体，缀合的山羊抗小鼠IgG2a HRP (Bethyl Laboratories，Inc.)用作第二抗体。No. 76 mIgG2a与cNO.76、c#1G4和c#4C13竞争，但不与Meiji 1640、Meiji1656和1BO11 hIgG1竞争。据此，表明了cNO.76、c#1G5和c#4C13的表位不同于Meiji 1640、Meiji 1656和1BO11 hIgG1的表位(图28)。
工业实用性
由于本发明的嵌合或人源化抗LPS O11抗体具有调理吞噬杀伤作用和/或补体依赖性杀伤作用，因此含有抗LPS O11抗体的药物组合物可为假单胞菌感染的治疗剂或预防剂。
序列表自由原文
SEQ ID NO: 1：pJON mIgG2a的核苷酸序列
SEQ ID NO: 2：pJON mIgG2a-hIgG1的核苷酸序列
SEQ ID NO: 3：pJON mIgκ的核苷酸序列
SEQ ID NO: 4：No. 76轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 5：No. 76轻链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 6：No. 76轻链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 7：No. 76轻链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 8：No. 76重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 9：No. 76重链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 10：No. 76重链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 11：No. 76重链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 12：#1G5轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 13：#1G5轻链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 14：#1G5轻链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 15：#1G5轻链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 16：#1G5重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 17：#1G5重链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 18：#1G5重链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 19：#1G5重链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 20：#4C12轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 21：#4C12轻链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 22：#4C12轻链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 23：#4C12轻链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 24：#4C12重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 25：#4C12重链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 26：#4C12重链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 27：#4C12重链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 28：包含编码人轻链分泌信号和人轻链恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段
SEQ ID NO: 29：包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段
SEQ ID NO: 30：人嵌合No. 76轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 31：人嵌合No. 76轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 32：人嵌合No. 76重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 33：人嵌合No. 76重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 34：包含编码人嵌合#1G5轻链的DNA序列的DNA片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 35：人嵌合#1G5轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 36：人嵌合#1G5重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 37：人嵌合#1G5重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 38：包含编码人嵌合#4C13轻链的DNA序列的DNA片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 39：人嵌合#4C13轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 40：人嵌合#4C13重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 41：人嵌合#4C13重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 42：Meiji 1640轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 43：Meiji 1640轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 44：Meiji 1640重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 45：Meiji 1640重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 46：Meiji 1656轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 47：Meiji 1656轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 48：Meiji 1656重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 49：Meiji 1656重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 50：编码小鼠IgG2b型嵌合1BO11轻链的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO: 51：人IgG1型1BO11轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 52：人IgG1型1BO11轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 53：编码小鼠IgG2b型嵌合1BO11重链的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO: 54：人IgG1型1BO11重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 55：人IgG1型1BO11重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 56：h#1G5-H1的核苷酸序列
SEQ ID NO: 57：h#1G5-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 58：h#1G5-H2的核苷酸序列
SEQ ID NO: 59：h#1G5-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 60：h#1G5-H3的核苷酸序列
SEQ ID NO: 61：h#1G5-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 62：h#1G5-H4的核苷酸序列
SEQ ID NO: 63：h#1G5-H4的氨基酸序列
SEQ ID NO: 64：h#1G5-H5的核苷酸序列
SEQ ID NO: 65：h#1G5-H5的氨基酸序列
SEQ ID NO: 66：h#1G5-L1的核苷酸序列
SEQ ID NO: 67：h#1G5-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 68：h#1G5-L2的核苷酸序列
SEQ ID NO: 69：h#1G5-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 70：h#1G5-L3的核苷酸序列
SEQ ID NO: 71：h#1G5-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 72：h#1G5-L4的核苷酸序列
SEQ ID NO: 73：h#1G5-L4的氨基酸序列
SEQ ID NO: 74：h#1G5-L5的核苷酸序列
SEQ ID NO: 75：h#1G5-L5的氨基酸序列
SEQ ID NO: 76：h#4C13K-H1的核苷酸序列
SEQ ID NO: 77：h#4C13K-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 78：h#4C13K-H2的核苷酸序列
SEQ ID NO: 79：h#4C13K-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 80：h#4C13K-H3的核苷酸序列
SEQ ID NO: 81：h#4C13K-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 82：h#4C13K-H4的核苷酸序列
SEQ ID NO: 83：h#4C13K-H4的氨基酸序列
SEQ ID NO: 84：h#4C13K-H5的核苷酸序列
SEQ ID NO: 85：h#4C13K-H5的氨基酸序列
SEQ ID NO: 86：#4C13重链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 87：#4C13重链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 88：#4C13重链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 89：AP3DC-S
SEQ ID NO: 90：mIgγRT1 1111-AS
SEQ ID NO: 91：mIgκ 1st 589-AS
SEQ ID NO: 92：MCS-AP3-S
SEQ ID NO: 93：mIgγ 3rd 656T-AS
SEQ ID NO: 94：mIgκ 3rd 525-AS
SEQ ID NO: 95：mIgG连接PCR-S
SEQ ID NO: 96：聚G-AS
SEQ ID NO: 97：mIgκ连接PCR-S
SEQ ID NO: 98：miniCMV f1-S
SEQ ID NO: 99：miniCMV f1-AS
SEQ ID NO: 100：mIgG序列
SEQ ID NO: 101：mIgκ序列
SEQ ID NO: 102：3.3-F1
SEQ ID NO: 103：3.3-R1
SEQ ID NO: 104：76L-F
SEQ ID NO: 105：76L-R
SEQ ID NO: 106：76H-F
SEQ ID NO: 107：76H-R
SEQ ID NO: 108：CM-inf-F
SEQ ID NO: 109：CM-inf-R
SEQ ID NO: 110：EG-inf-F
SEQ ID NO: 111：EG1-inf-R
SEQ ID NO: 112：CM-LKF
SEQ ID NO: 113：KCL-inf-R
SEQ ID NO: 114：h1BO-LF
SEQ ID NO: 115：h1BO-LR
SEQ ID NO: 116：h1BO-HF
SEQ ID NO: 117：h1BO-HR
SEQ ID NO: 118：含有包含编码No. 76 mIgG2a轻链的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO: 119：No. 76 mIgG2a轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 120：含有包含编码No. 76 mIgG2a重链的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO: 121：No. 76 mIgG2a重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 122：H-R
SEQ ID NO: 123：#4C13轻链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 124：#4C13轻链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 125：#4C13轻链CDR3的氨基酸序列。

Claims (48)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其识别铜绿假单胞菌的LPS，与O11抗原结合而不与O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原和O抗原缺乏型菌株结合，且针对O11临床分离株的覆盖比率为85%或更高。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中对O11临床分离株的覆盖比率为95%或更高。
3.一种抗体或其抗原结合片段，其识别铜绿假单胞菌的LPS，与O11抗原结合，而不与O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原和O抗原缺乏型菌株结合，且针对由ATCC 29260识别的铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤活性的50%最低生长抑制浓度为12 ng/mL或更低。
4.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中针对由ATCC 29260识别的铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤活性的50%最低生长抑制浓度为4.1 ng/mL或更低。
5.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于它与选自以下抗体的至少一种交叉竞争：含有包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQID NO: 4所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；含有包含SEQ IDNO: 16所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；和含有包含SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体。
6.权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其特征在于它与至少一种抗体与之结合的表位结合，其中所述抗体选自含有包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；含有包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体；和含有包含SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列的抗体。
7.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且CDRH1包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 11所示氨基酸序列，和
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且CDRL1包含SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列。
8.权利要求7的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
9.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且CDRH1包含SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 19所示氨基酸序列，和
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且CDRL1包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列。
10.权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
11.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且CDRH1包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 26所示氨基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 27所示氨基酸序列，和
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且CDRL1包含SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列，CDRL3包含SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列。
12.权利要求11的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
13.权利要求1-12中任一项的抗体的抗原结合片段，其特征在于选自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
14.权利要求1-12中任一项的抗体，其特征在于是scFv。
15.权利要求1-12的抗体或其抗原结合片段，其特征在于是嵌合抗体。
16.权利要求1-12的抗体或其抗原结合片段，其特征在于是人源化抗体。
17.权利要求1-16中任一项的抗体，其中所述重链含有人免疫球蛋白G1重链的恒定区，所述轻链含有人免疫球蛋白κ轻链的恒定区。
18.一种抗体或其抗原结合片段，其对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性，其特征在于所述抗体含有：
(a) 选自下列氨基酸序列的重链可变区序列：
a1) 包含SEQ ID NO: 57所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 63所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 65所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的氨基酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
a8) 在选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和
(b) 选自下列氨基酸序列的轻链可变区序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
b8) 在选自b1)-b5)中的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
19.权利要求18的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 59所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
20.权利要求18的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 61所示氨基酸序列的氨基酸残基20-144的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
21.一种对铜绿假单胞菌的LPS O11抗原具有结合活性的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有：
(a) 选自下列氨基酸序列的重链可变区序列：
a1) 包含SEQ ID NO: 77所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 83所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 85所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
a8) 在选自a1)-a5)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和
(b) 选自下列氨基酸序列的轻链可变区序列：
b1) 包含SEQ ID NO: 67所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 73所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 75所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少95%同源性的氨基酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个氨基酸序列有至少99%同源性的氨基酸序列；和
b8) 在选自b1)-b5)中的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
22.权利要求21的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 79所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 69所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
23.权利要求21的抗体或其抗原结合片段，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 81所示氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和包含SEQ ID NO: 71所示氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
24.权利要求18-23中任一项的抗体，其包含包括来自羧基端的一个至几个氨基酸的缺失的重链。
25.一种药物组合物，其包含权利要求1-24的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
26.权利要求25的药物组合物，其特征在于是假单胞菌感染的治疗剂和/或预防剂。
27.一种用于治疗和/或预防假单胞菌感染的药物组合物，其特征在于包含权利要求1-24中任一项的抗体或其抗原结合片段的至少一种和选自青霉素、头孢、碳青霉烯、单环内酰胺、喹诺酮、氨基糖苷、多黏菌素、利福平和大环内酯抗微生物剂中的至少一种。
28.权利要求26或27的药物组合物，其特征在于所述假单胞菌感染是由多重耐药性铜绿假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。
29.权利要求26或27的药物组合物，其特征在于所述假单胞菌感染是：
血流感染、脓毒症、脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎、肺脓肿、脓胸、慢性呼吸道感染、腹膜炎、术后感染、胆囊炎、胆管炎、眼睑肿瘤、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎、眶感染、泌尿道感染、导管感染、肛周脓肿、烧伤创面二次感染、褥疮感染、囊性纤维化疾病、淋巴管炎、淋巴结炎、骨髓炎、关节炎、扁桃体炎、肝脓肿、皮肤和软组织感染、子宫内感染、子宫附件炎、子宫旁组织炎、下颌周围蜂窝织炎或颌炎。
30.权利要求26或27的药物组合物，其特征在于所述假单胞菌感染是肺炎。
31.一种用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于给予权利要求1-24的抗体或其抗原结合片段的至少一种或权利要求26或27的药物组合物。
32.一种用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于同时或序贯给予权利要求1-24中任一项的抗体或其抗原结合片段的至少一种或权利要求26的药物组合物和选自青霉素、头孢、碳青霉烯、单环内酰胺、喹诺酮、氨基糖苷、多黏菌素、利福平和大环内酯抗微生物剂中的至少一种。
33.权利要求31或32的用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于所述假单胞菌感染是由多重耐药性铜绿假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。
34.权利要求33的用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于所述假单胞菌感染是血流感染、脓毒症、脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎、肺脓肿、脓胸、慢性呼吸道感染、腹膜炎、术后感染、胆囊炎、胆管炎、眼睑肿瘤、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎、眶感染、泌尿道感染、导管感染、肛周脓肿、烧伤创面二次感染、褥疮感染、囊性纤维化疾病、淋巴管炎、淋巴结炎、骨髓炎、关节炎、扁桃体炎、肝脓肿、皮肤和软组织感染、子宫内感染、子宫附件炎、子宫旁组织炎、下颌周围蜂窝织炎或颌炎。
35.权利要求33的用于治疗和/或预防假单胞菌感染的方法，其特征在于所述假单胞菌感染是肺炎。
36.一种用于假单胞菌感染的诊断剂，其特征在于含有权利要求1-24的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
37.一种用于铜绿假单胞菌的检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1-24的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
38.一种多核苷酸，其编码权利要求1-24的任一种抗体。
39.权利要求38的多核苷酸，其特征在于含有：
(a) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
a1) 包含SEQ ID NO: 56所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 58所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 60所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 62所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 64所示核苷酸序列的核苷酸58-432的核苷酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
a8) 在严格条件下与包含与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a9) 在选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的核苷酸序列；和
(b) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
b1) 包含SEQ ID NO: 66所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 72所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
b8) 在严格条件下与包含与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b9) 在选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列。
40.权利要求39的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 58所示核苷酸序列的核苷酸58-432的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
41.权利要求39的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 60所示核苷酸序列的核苷酸58-432的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
42.权利要求38的多核苷酸，其特征在于含有：
(a) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
a1) 包含SEQ ID NO: 76所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a2) 包含SEQ ID NO: 78所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a3) 包含SEQ ID NO: 80所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a4) 包含SEQ ID NO: 82所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a5) 包含SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a6) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
a7) 与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
a8) 在严格条件下与包含与选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
a9) 在选自a1)-a5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的核苷酸序列；和
(b) 选自下列核苷酸序列的多核苷酸：
b1) 包含SEQ ID NO: 66所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b2) 包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b3) 包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b4) 包含SEQ ID NO: 72所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b5) 包含SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b6) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少95%同源性的核苷酸序列；
b7) 与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列有至少99%同源性的核苷酸序列；
b8) 在严格条件下与包含与选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和
b9) 在选自b1)-b5)的任一个核苷酸序列中包括一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列。
43.权利要求42的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 78所示核苷酸序列的核苷酸58-420的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
44.权利要求42的多核苷酸，其特征在于含有包含SEQ ID NO: 80所示核苷酸序列的核苷酸58-420的多核苷酸和包含SEQ ID NO: 70所示核苷酸序列的核苷酸61-387的多核苷酸。
45.一种载体，其含有权利要求38-44的多核苷酸的任一个。
46.一种转化的宿主细胞，其含有权利要求38-44的多核苷酸的任一个。
47.一种转化的宿主细胞，其含有权利要求45的载体。
48.一种用于产生权利要求1-24中任一项的抗体的方法，所述方法包括培养权利要求46或47的宿主细胞并从所得培养产物纯化抗体的步骤。
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