JP6494519B2 - 抗lpso11抗体 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
(1)緑膿菌のLPSを認識する抗体であって、O11抗原に結合し、O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原、及びO抗原欠損株に結合せず、O11臨床分離株に対するカバー率が85%以上である抗体又は該抗体の抗原結合断片
(2)O11臨床分離株に対するカバー率が95%以上である、(1)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(3)緑膿菌のLPSを認識する抗体であって、O11抗原に結合し、O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20抗原及びO抗原欠損株に結合せず、ATCC 29260で特定される緑膿菌に対するオプソニン活性の50%増殖阻害最小濃度が12ng/mL以下である抗体又は該抗体の抗原結合断片
(4)ATCC 29260で特定される緑膿菌に対するオプソニン活性の50%増殖阻害最小濃度が4.1ng/mL以下である、(3)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(5)配列番号8に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列、及び配列番号4に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体、配列番号16に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体、並びに配列番号24に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体からなる群から選択される少なくともいずれか一つと交差競合することを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片
(6)配列番号8に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列、及び配列番号4に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体、配列番号16に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体、並びに配列番号24に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体からなる群から選択される少なくともいずれか一つが結合するエピトープに結合することを特徴とする、(5)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(7)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号9に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号10に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号11に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること;及び
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号5に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号6に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号7に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(8)配列番号8に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号4に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(7)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(9)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号17に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号18に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号19に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること;及び
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(10)配列番号16に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号12に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(9)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(11)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号25に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号26に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号27に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること;及び
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(12)配列番号24に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号12に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(11)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(13)Fab、F(ab’)2、Fab’及びFvからなる群から選択される、(1)乃至(12)のいずれか一つに記載の抗体の抗原結合断片
(14)scFvであることを特徴とする、(1)乃至(12)のいずれか一つに記載の抗体
(15)キメラ抗体であることを特徴とする、(1)乃至(12)のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(16)ヒト化されていることを特徴とする、(1)乃至(12)のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(17)重鎖がヒト免疫グロブリンG1重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、(1)乃至(16)のいずれか一つに記載の抗体
(18)緑膿菌のLPS O11抗原に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
(a)以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列:
a1) 配列番号57に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a2) 配列番号59に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a3) 配列番号61に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a4) 配列番号63に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a5) 配列番号65に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a6) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95%の相同性を持つアミノ酸配列;
a7) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも99%の相同性を持つアミノ酸配列;
a8) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;及び
(b)以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列:
b1) 配列番号67に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b2) 配列番号69に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b3) 配列番号71に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b4) 配列番号73に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b5) 配列番号75に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b6) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95%の相同性を持つアミノ酸配列;
b7) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも99%の相同性を持つアミノ酸配列;
b8) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片
(19)配列番号59に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号69に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(18)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(20)配列番号61に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号71に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(18)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(21)緑膿菌のLPS O11抗原に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
(a)以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列:
a1) 配列番号77に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a2) 配列番号79に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a3) 配列番号81に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a4) 配列番号83に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a5) 配列番号85に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
a6) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95%の相同性を持つアミノ酸配列;
a7) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも99%の相同性を持つアミノ酸配列;
a8) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;及び
(b)以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列:
b1) 配列番号67に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b2) 配列番号69に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b3) 配列番号71に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b4) 配列番号73に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b5) 配列番号75に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;
b6) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95%の相同性を持つアミノ酸配列;
b7) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも99%の相同性を持つアミノ酸配列;
b8) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片
(22)配列番号79に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号69に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(21)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(23)配列番号81に示されるアミノ酸配列の20乃至140番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号71に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(21)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片
(24)(18)乃至(23)のいずれか一つに記載の抗体において、カルボキシル基末端側の1乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体
(25)(1)乃至(24)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物
(26)緑膿菌感染症の治療及び/又は予防剤であることを特徴とする、(25)に記載の医薬組成物
(27)(1)乃至(24)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ペニシリン系、セフェム系、カルバペネム系、モノバクタム系、キノロン系、アミノ配糖体系、ポリミキシン系、リファンピシン、マクロライド系抗菌薬からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、緑膿菌感染症の治療及び/又は予防用医薬組成物
(28)緑膿菌感染症が、多剤耐性緑膿菌感染に起因する全身感染疾患であることを特徴とする、(26)又は(27)に記載の医薬組成物
(29)緑膿菌感染症が、血流感染、敗血症、髄膜炎、心内膜炎、中耳炎、副鼻腔炎、肺炎、肺膿瘍、膿胸、慢性気道感染症、腹膜炎、術後感染症、胆嚢炎、胆管炎、眼瞼腫瘍、涙嚢炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜膿瘍、全眼球炎、眼窩感染、尿路感染症、カテーテル感染症、肛門周辺膿瘍、熱傷の二次感染、褥瘡感染症、嚢胞性線維症、リンパ管炎、リンパ節炎、骨髄炎、関節炎、扁桃炎、肝膿瘍、皮膚軟部組織感染症、子宮内感染、子宮付属器炎、子宮旁結合織炎、顎骨周辺の蜂巣炎、又は顎炎であることを特徴とする、(26)又は(27)に記載の医薬組成物
(30)緑膿菌感染症が、肺炎であることを特徴とする、(26)又は(27)に記載の医薬組成物
(31)(1)乃至(24)に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は(26)若しくは(27)に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、緑膿菌感染症の治療及び/又は予防方法
(32)(1)乃至(24)に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は(26)に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、ペニシリン系、セフェム系、カルバペネム系、モノバクタム系、キノロン系、アミノ配糖体系、ポリミキシン系、リファンピシン、マクロライド系抗菌薬からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後して投与することを特徴とする、緑膿菌感染症の治療及び/又は予防方法
(33)緑膿菌感染症が、多剤耐性緑膿菌感染に起因する全身感染疾患であることを特徴とする、(31)又は(32)に記載の治療及び/又は予防方法
(34)緑膿菌感染症が、血流感染、敗血症、髄膜炎、心内膜炎、中耳炎、副鼻腔炎、肺炎、肺膿瘍、膿胸、慢性気道感染症、腹膜炎、術後感染症、胆嚢炎、胆管炎、眼瞼腫瘍、涙嚢炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜膿瘍、全眼球炎、眼窩感染、尿路感染症、カテーテル感染症、肛門周辺膿瘍、熱傷の二次感染、褥瘡感染症、嚢胞性線維症、リンパ管炎、リンパ節炎、骨髄炎、関節炎、扁桃炎、肝膿瘍、皮膚軟部組織感染症、子宮内感染、子宮付属器炎、子宮旁結合織炎、顎骨周辺の蜂巣炎、又は顎炎であることを特徴とする、(33)に記載の治療及び/又は予防方法
(35)緑膿菌感染症が、肺炎であることを特徴とする(33)に記載の治療及び/又は予防方法
(36)(1)乃至(24)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、緑膿菌感染症の診断剤
(37)(1)乃至(24)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、緑膿菌の検出キット
(38)(1)乃至(24)のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド
(39)(38)に記載のポリヌクレオチドであって、
(a)以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
a1) 配列番号56に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a2) 配列番号58に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a3) 配列番号60に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a4) 配列番号62に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a5) 配列番号64に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a6) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも95%の相同性を持つヌクレオチド配列;
a7) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも99%の相同性を持つヌクレオチド配列;
a8) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;
a9) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;及び
(b)以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
b1) 配列番号66に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b2) 配列番号68に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b3) 配列番号70に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b4) 配列番号72に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b5) 配列番号74に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b6) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも95%の相同性を持つヌクレオチド配列;
b7) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも99%の相同性を持つヌクレオチド配列;
b8) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;
b9) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に1乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド
(40)配列番号58に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号68に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする(39)に記載のポリヌクレオチド
(41)配列番号60に示されるヌクレオチド配列の58乃至432番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号70に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする(39)に記載のポリヌクレオチド
(42)(38)に記載のポリヌクレオチドであって、
(a)以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
a1) 配列番号76に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a2) 配列番号78に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a3) 配列番号80に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a4) 配列番号82に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a5) 配列番号84に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
a6) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも95%の相同性を持つヌクレオチド配列;
a7) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも99%の相同性を持つヌクレオチド配列;
a8) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;
a9) a1)乃至a5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;及び
(b)以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
b1) 配列番号66に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b2) 配列番号68に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b3) 配列番号70に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b4) 配列番号72に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b5) 配列番号74に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;
b6) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも95%の相同性を持つヌクレオチド配列;
b7) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも99%の相同性を持つヌクレオチド配列;
b8) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;
b9) b1)乃至b5)から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に1乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド
(43)配列番号78に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号68に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする(42)に記載のポリヌクレオチド
(44)配列番号80に示されるヌクレオチド配列の58乃至420番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号70に示されるヌクレオチド配列の61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする(42)に記載のポリヌクレオチド
(45)(38)乃至(44)に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター
(46)(38)乃至(44)に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞
(47)(45)に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞
(48)(46)又は(47)に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む(1)乃至(24)のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、DNAのみならずmRNA、cDNA及びcRNAも含まれるものとする。
2.LPS O11
本発明の抗体が結合する「LPS」は、グラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であり、脂質及び多糖から構成される物質(糖脂質)である。糖鎖部分は、コア多糖(またはコアオリゴ糖)と呼ばれる部分と、O抗原(O側鎖多糖)と呼ばれる部分から構成される。
3.抗LPS O11抗体の製造
本発明の緑膿菌LPS O11抗原に対する抗体は、例えば、WO2009/091048、WO2011/027808、又はWO2012/133572に記載の方法で得ることができる。すなわち、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞及び/又は形質芽細胞を選択する。得られた形質細胞及び/又は形質芽細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、同定した遺伝子の塩基配列に基づいて上記抗体又は抗体の断片を得ることができる。また、ヒト感染患者の血液から同様に形質細胞及び/又は形質芽細胞を得ることにより、抗体又は抗体断片を得ることができる。取得された抗体はLPS O11抗原に対する結合性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。このようにして得られたモノクローナル抗体の例としては、No.76、#1G5、#4C12、#4C13、#4C13Kを挙げることができる。#4C12、#4C13、#4C13Kの重鎖は全て完全に共通で、#4C13は#4C12の軽鎖のアミノ酸番号75のシステインをチロシンに置換した抗体であり、#4C13Kは#4C12の軽鎖を#1G5の軽鎖に置換した抗体である。
#4C13K抗体由来のヒト化抗体としては、#4C13Kの6種全てのCDR配列を保持し、緑膿菌のLPS O11抗原に対する結合活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。なお、#4C13K抗体の重鎖可変領域は、配列番号86に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1(TYWIN)、配列番号87に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(NIYPGTRSSNYNEKFKN)、及び配列番号88に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3(VYYDHVGYYFDY)を保有している。また、#4C13K抗体の軽鎖可変領域は、#1G5抗体の軽鎖可変領域と完全に共通であり、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(KASENVGNSVS)、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(GASNRYT)、及び配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3(GQSYSYPYT)を保有している。これらのCDRのアミノ酸配列は、図24及び図2にも記載されている。
4.抗LPS O11抗体を含有する医薬
上述の「3.抗LPS O11抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗LPS O11抗体は、オプソニン作用(オプソニン食作用傷害作用、Opsonophagocytic killing(OPK))及び/又は補体依存的殺菌作用(Complement dependent killing(CDK))を示すことから、医薬として、緑膿菌感染症の治療及び/又は予防剤として用いることができる。
Mueller Hinton Agar(MHA、Becton,Dickinson and Company)で培養した緑膿菌ATCC 29260を生食に懸濁し、ICRマウス(チャールズリバー)の腓腹筋に10−11日おきに5回免疫した。最終免疫6日後に膝下リンパ節を採取し、セルストレーナー(Becton,Dickinson and Company)で細胞を個々に分離し、RPMI1640(Invitrogen)で洗浄した後、セルバンカー(十慈フィールド株式会社)に懸濁して‐80℃で保存した。
WO2009/091048、WO2011/027808、WO2012/133572、BMC Biotechnology,11,39(2011)、及びBMC Biotechnology,11,75(2011)に記載の方法に準じて実施した。
免疫マウスのリンパ節から採取した細胞を0.5%BSA/2mM EDTA/PBSで懸濁し、allophycocyanin標識坑マウスCD138抗体(Becton,Dickinson and Company)を添加して4℃で15分間インキュベートした。その後、RPMI1640で細胞を洗浄し、ER−Tracker Blue−White DPX(Invitrogen)を添加し、遮光下にて5分間反応させた。細胞をPBSに懸濁し、FACS Aria(Becton,Dickinson and Company)のセルソーターを用いてダブルポジティブとなる細胞を個々に分離した。
セルソーターにより個々に分離された細胞をオリゴdT25が結合した磁気ビーズ(Dynabeads mRNA DIRECT Kit、Invitrogen)の入った細胞溶解液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、250mM LiCl、5mM EDTA(pH8)、0.5%ドデシル硫酸Li(LiDS)、2.5mM dithiothreitol(DTT))で溶解し、mRNAを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをmRNA洗浄溶液A(10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1%TritonX−100)とcDNA合成用溶液(50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dNTP、0.2% TritonX−100、48unit RNase inhibitor(Invitrogen))で1回ずつ洗浄した後、480unit SuperScriptIII Reverse Transcriptase(Invitrogen)を加えたcDNA合成用溶液でcDNA合成を行った。続いて3’テーリング反応溶液(50mM リン酸カリウム、4mM MgCl2、0.5mM dGTP、0.2% TritonX−100、48unit RNase inhibitor(Invitrogen))で洗浄した後、480unit Terminal Transferase, recombinant(Roche)を加えた反応溶液で3’テーリング反応を行った。
磁気ビーズをTE溶液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1% TritonX−100)にて洗浄後、5’−RACE PCR法を用いてマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の増幅を行った。始めに、磁気ビーズをPCR反応溶液(0.2μM プライマー、0.2mM dNTP、0.1unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA))に移し、94℃30秒−68℃90秒の反応を35サイクル行った(1st PCR)。次に1st PCR産物を10倍希釈し、これを鋳型に1st PCRと同条件でマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の可変領域をそれぞれ別々に増幅した(2nd PCR)。各プライマーセットは下記の通り。
1st PCRプライマーセット
5’−cggtaccgcgggcccgggatcccccccccccccdn−3’(AP3dC−S)(配列番号89)
5’−accytgcatttgaactccttgcc−3’(mIgγRT1 1111−AS)(配列番号90)
5’−actgccatcaatcttccacttgaca−3’(mIgκ 1st 589−AS)(配列番号91)
2nd PCRプライマーセット(重鎖)
5’−cttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccggga−3’(MCS−AP3−S)(配列番号92)
5’−ctggacagggatccagagttcca−3’(mIgγ 3rd 656T−AS)(配列番号93)
2nd PCRプライマーセット(軽鎖)
5’−cttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccggga−3’(MCS−AP3−S)(配列番号92)
5’−actgaggcacctccagatgttaact−3’(mIgκ3rd 525−AS)(配列番号94)
マウスIgG2aあるいはヒトIgG1定常領域遺伝子連結用二本鎖DNA断片およびマウス軽鎖定常領域遺伝子連結用二本鎖DNA断片はそれぞれ配列番号1−3に示すプラスミドpJON mIgG2a、pJON mIgG2a−hIgG1、pJON mIgκを鋳型にそれぞれのプライマーセットでPCRを実施して増幅し、DpnI(Roche)処理して得た。PCRは0.4ng/ml pJONをテンプレートに0.2mM dNTP、0.2μM プライマー、20unit PrimeSTAR HS DNA Polymeraseの反応溶液で94℃40秒−65℃40秒−72℃30秒の反応を25サイクル行った。
pJON mIgG2aおよびpJON mIgG2a−hIgG1用プライマーセット
5’−gcctggtcaagggctatttccctgag−3’(mIgG joint PCR−S)(配列番号95)
5’−gggggggggggggggggatcccgg−3’(polyG−AS)(配列番号96)
pJON mIgκ用プライマーセット
5’−ctgtatccatcttcccaccatccagt−3’(mIgκ joint PCR−S)(配列番号97)
5’−gggggggggggggggggatcccgg−3’(polyG−AS)(配列番号96)
1)−2−5 マウスあるいはヒトキメラ化免疫グロブリン線上化発現ベクターの作製
2nd PCR産物にTerminal Transferase, recombinant(Roche)を16unit加え、37℃にて30分反応させ、その後94℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止させた。調製した3’端ポリヌクレオチド付加マウス重鎖可変領域遺伝子溶液に、マウスIgG2aあるいはヒトIgG1定常領域遺伝子連結用二本鎖DNA断片、0.2μM プライマー、0.2mM dNTPを加え、0.1unit PrimeSTAR HS DNA Polymeraseを用いて94℃30秒−70℃4分の反応を5サイクル、引き続き、94℃30秒−60℃30秒−72℃1分の反応を30サイクル行うことでマウス重鎖あるいはヒトキメラ化重鎖遺伝子発現ユニットを作製した。同様に、マウス軽鎖可変領域遺伝子溶液に、マウス軽鎖定常領域遺伝子連結用二本鎖DNA断片を加えて反応を行い、マウス軽鎖遺伝子発現ユニットを作製した。用いたプライマーは下記の通り。
連結用プライマーセット
5’−agagaaaccgtctatcagggcgatggc−3’(miniCMV f1−S)(配列番号98)
5’−agagaccctttgacgttggagtccacg−3’(miniCMV f1−AS)(配列番号99)
1)−2−6 抗体遺伝子の発現
上記の実験で増幅された全長のマウス重鎖またはヒトキメラ重鎖とマウス軽鎖遺伝子発現ユニットをLipofectamine2000(Invitrogen)を用いてHEK293T細胞に遺伝子導入し、37℃、5%CO2下で4日間培養することで抗体培養上清を得た。
1)−3−1 抗体濃度の測定
Mouse IgG2a ELISA Quantitation Set(Bethyl Laboratories)またはHuman IgG ELISA Quantitation Set(Bethyl Laboratories)を用いて測定した。方法は添付のマニュアルに準じて行った。すなわち、Affinity purified Goat anti−Mouse IgG2a Coating AntibodyまたはAffinity purified Goat anti−Human IgG−Fc Coating Antibodyを0.05MCarbonate−Bicarbonate(pH9.6)で101倍希釈し、100μlをwellに添加して室温で1時間固相化した。150μlの0.05%Tween20添加Tris buffered saline(TBS;Tween20添加TBSはTBST)で3回洗浄し、200μlの1%BSA/TBSをwellに添加して0.5−2時間ブロッキングした。各抗体培養上清あるいは精製抗体を、原液あるいは必要に応じて1%BSA/TBSTで希釈し、100μlをwellに添加し、室温で1時間反応させた。TBSTで3回洗浄し、50000倍希釈したHRP Conjugated Goat anti−Mouse IgG2a Detection Antibodyまたは100000倍希釈したHRP Conjugated Goat anti−Human IgG−Fc Detection Antibodyを100μl/well添加し、1時間反応させた。TBSTで3回洗浄し、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific K.K.)を添加し、添加直後に発光をARVO 1420マルチラベルカウンター(Perkin Elmer)で測定した。キット添付の標準品を用いて検量線を求め、濃度を算出した。
測定用バッファーとして0.1%gelatin/1%FBS/Hank‘s balanced salt solution(オプソニンバッファー)を調製した。エフェクター細胞としてHL60を0.8%N,N−Dimethylformamideを添加した10%FBS含有RPMI1640(Invitrogen)で5または6日間培養し、好中球様分化HL60をオプソニンバッファーで調製した。ターゲット菌としてMHAで培養した緑膿菌ATCC 29260をオプソニンバッファーで懸濁して調製した。補体としてBaby Rabbit Serum(Cederlane)を氷冷蒸留水で溶解して調製した。菌液(最終濃度2×104cells/ml)と抗体培養上清あるいは精製抗体を混合し、4℃で30分間静置した後、調製した好中球用分化HL60(最終濃度4×106cells/ml)と補体(最終濃度10%)を添加し、37℃、5%CO2下で緩やかに撹拌しながら1時間培養した。培養後、各サンプルをMHAに塗沫し、翌日にコロニー数をカウントした。抗体非添加のコントロールと比較して、50%増殖抑制効果を示したサンプルを活性ありと判定した。
1)−2−3で得たマウス重、軽鎖可変領域遺伝子産物をテンプレートとして下記シーケンスプライマーでシーケンスを確認した。シーケンス解析は遺伝子配列解析装置Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer(Life technologies)を用いて実施した。得られた配列をもとにAndrew C.R. MartinらのAbysisデータベース(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid)に従って、CDR配列を決定した。
シーケンスプライマー(重鎖用)
5’−acaccgctggacagggatccagag−3’(mIgG sequence)(配列番号100)
シーケンスプライマー(軽鎖用)
5’−gtagaagttgttcaagaagcacac−3’(mIgκ sequence)(配列番号101)
以上のスクリーニングからオプソニン活性が強く、CDR配列がユニークな抗体培養上清サンプルNo.76、#1G5、#4C12を見出した。No.76はpJON mIgG2aとpJON mIgκを、#1G5と#4C12はpJON mIgG2a−hIgG1とpJON mIgκをそれぞれ用いて作製した抗体である。それぞれの重鎖と軽鎖の可変領域とCDRのアミノ酸配列を配列番号4−27に示した。配列表の配列番号20に示される#4C12の軽鎖はアミノ酸番号75にシステインを含むが、チロシンに置き換えたものを「#4C13」と命名した。また、#4C12の重鎖と#1G5の軽鎖を組み合わせたものを「#4C13K」と命名した。#4C13Kは1)−2−5で作製された#4C12のヒトキメラ化重鎖遺伝子発現ユニットおよび#1G5のマウス軽鎖遺伝子発現ユニットを1)−2−6の方法に従って、HEK293Tで発現させた。#1G5と#4C13KはProteinG(GE Healthcare)で精製し、それぞれ「c#1G5M」、「c#4C13KM」と命名した。抗体濃度は1)−3−1の方法で算出した。
プラスミドpcDNA3.3-TOPO/LacZ(INVITROGEN社)を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号28に示すヒト軽鎖分泌シグナル、及びヒト軽鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
プライマーセット
5’−tataccgtcgacctctagctagagcttggc−3’(3.3−F1)(配列番号102)
5’−gctatggcagggcctgccgccccgacgttg−3’(3.3−R1)(配列番号103)
2)−2 キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1の構築
pCMA−LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖分泌シグナル及びヒト軽鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列番号29に示すヒト重鎖シグナル配列、及びヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトIgG1重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を構築した。
2)−3−1 ヒトキメラ化No.76軽鎖発現ベクターの構築
実施例1)−2−3で得られたNo.76軽鎖の可変領域を含むcDNAをテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするcDNAを含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化No.76軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/No.76」と命名した。ヒトキメラ化No.76軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号30に示し、アミノ酸配列を配列番号31に示した。
ヒトキメラ化No.76軽鎖用プライマーセット
5’−atctccggcgcgtacggcaacattgtaatgacccaatctcccaaatc−3’(76L−F)(配列番号104)
5’−ggagggggcggccacagcccgttttatttccagcttggtcctccc−3’(76L−R)(配列番号105)
実施例1)−2−3で得られたNo.76重鎖の可変領域を含むcDNAをテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするcDNAを含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化No.76重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/No.76」と命名した。ヒトキメラ化No.76重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号32に示し、アミノ酸配列を配列番号33に示した。
ヒトキメラ化No.76重鎖用プライマーセット
5’−ccagatgggtgctgagccaggtccaactgcagcagcctggtgctgag−3’(76H−F)(配列番号106)
5’−cttggtggaggctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag−3’(76H−R)(配列番号107)
配列表の配列番号34に示すヒトキメラ化#1G5軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒトキメラ化#1G5軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIとPmeIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化#1G5軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/1G5」と命名した。ヒトキメラ化#1G5軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号35に示した。
ヒトキメラ化#1G5軽鎖用プライマーセット
5’−ccagcctccggactctagagccacc−3’(CM−inf−F)(配列番号108)
5’−agttagcctcccccgtttaaactc−3’(CM−inf−R)(配列番号109)
配列表の配列番号36に示すヒトキメラ化#1G5重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至449に示されるヒトキメラ化#1G5重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒトキメラ化#1G5重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりヒトキメラ化#1G5重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/1G5」と命名した。ヒトキメラ化#1G5重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号37に示した。
ヒトキメラ化#1G5重鎖用プライマーセット
5’−agctcccagatgggtgctgagc−3’(EG−Inf−F)(配列番号110)
5’−gggcccttggtggaggctgagc−3’(EG1−Inf−R)(配列番号111)
配列表の配列番号38に示すヒトキメラ化#4C13軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒトキメラ化#4C13軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIとPmeIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化#4C13軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/4C13」と命名した。ヒトキメラ化#4C13軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号39に示した。
ヒトキメラ化#4C13軽鎖用プライマーセット
5’−ccagcctccggactctagagccacc−3’(CM−inf−F)(配列番号108)
5’−agttagcctcccccgtttaaactc−3’(CM−inf−R)(配列番号109)
配列表の配列番号40に示すヒトキメラ化#4C13重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至437に示されるヒトキメラ化#4C13重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒトキメラ化#4C13重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりヒトキメラ化#4C13重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/4C13」と命名した。ヒトキメラ化#4C13重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号41に示した。
ヒトキメラ化#4C13重鎖用プライマーセット
5’−agctcccagatgggtgctgagc−3’(EG−Inf−F)(配列番号110)
5’−gggcccttggtggaggctgagc−3’(EG1−Inf−R)(配列番号111)
2)−3−7 ヒトキメラ化抗LPS O11抗体の調製
2)−3−7−1 ヒトキメラ化抗LPS O11抗体の生産
FreeStyle 293F細胞(INVITROGEN社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。
上記2)−3−7−1で得られた培養上清から抗体を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー(4−6℃下)1段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は4−6℃下で実施した。最初に、培養上清を、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社製)が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mMヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社,4℃下)にて濃縮し、IgG濃度を5mg/ml以上に調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
2)−4 Meiji1640およびMeiji1656、ヒトIgG1タイプ1BO11(1BO11 hIgG1)、マウスIgG2aタイプNo.76(No.76 mIgG2a)の作製
2)−4−1 Meiji1640の作製
Meiji1640はWO2011/102551に記載されている軽鎖、及び重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
配列表の配列番号42に示すMeiji1640軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至408に示されるMeiji1640軽鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでMeiji1640軽鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりMeiji1640軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/Meiji1640」と命名した。Meiji1640軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号43に示した。
Meiji1640軽鎖用プライマーセット
5’−ctgtggatctccggcgcgtacggc−3’(CM−LKF)(配列番号112)
5’−ggagggggcggccaccgtacg−3’(KCL−Inf−R)(配列番号113)
配列表の配列番号44に示すMeiji1640重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至458に示されるMeiji1640重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでMeiji1640重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりMeiji1640重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/Meiji1640」と命名した。Meiji1640重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号45に示した。
Meiji1640重鎖用プライマーセット
5’−agctcccagatgggtgctgagc−3’(EG−Inf−F)(配列番号110)
5’−gggcccttggtggaggctgagc−3’(EG1−Inf−R)(配列番号111)
2)−4−2 Meiji1656の作製
Meiji1656はWO2011/102551に記載されている軽鎖、及び重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
配列表の配列番号46に示すMeiji1656軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるMeiji1656軽鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでMeiji1656軽鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりMeiji1656軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/Meiji1656」と命名した。Meiji1656軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号47に示した。
Meiji1656軽鎖用プライマーセット
5’−ctgtggatctccggcgcgtacggc−3’(CM−LKF)(配列番号112)
5’−ggagggggcggccaccgtacg−3’(KCL−Inf−R)(配列番号113)
配列表の配列番号48に示すMeiji1656重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至467に示されるMeiji1656重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでMeiji1656重鎖可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりMeiji1656重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/Meiji1656」と命名した。Meiji1656重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号49に示した。
Meiji1656重鎖用プライマーセット
5’−agctcccagatgggtgctgagc−3’(EG−Inf−F)(配列番号110)
5’−gggcccttggtggaggctgagc−3’(EG1−Inf−R)(配列番号111)
2)−4−3 ヒトIgG1タイプ1BO11(1BO11 hIgG1)の作製
1BO11 hIgG1はWO2006/084758の図2、及び図1に記載されている軽鎖、及び重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
配列表の配列番号50に示すマウスIgG2bタイプキメラ化1BO11軽鎖をコードするDNA断片を合成した(MBL社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするcDNAを含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することにより、1BO11 hIgG1軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/1BO11」と命名した。1BO11 hIgG1軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号51に示し、アミノ酸配列を配列番号52に示した。
1BO11 hIgG1軽鎖用プライマーセット
5’−atctccggcgcgtacggcgacgtggtgatgacccagagccctctgtcc−3’(h1BO−LF)(配列番号114)
5’−gggcggccaccgtacgcttgatctccaccttggtgcctccgccg−3’(h1BO−LR)(配列番号115)
配列表の配列番号53に示すマウスIgG2bタイプキメラ化1BO11重鎖をコードするDNA断片を合成した(MBL社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするcDNAを含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することにより、1BO11 hIgG1重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/1BO11」と命名した。1BO11 hIgG1重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号54に示し、アミノ酸配列を配列番号55に示した。
1BO11 hIgG1重鎖用プライマーセット
5’−ccagatgggtgctgagcgaggagcaagtggtggagagcgg−3’(h1BO−HF)(配列番号116)
5’−cttggtggaggctgagctcacggtcaccatggtgccttgtc−3’(h1BO−HR)(配列番号117)
2)−4−4−1 No.76 mIgG2a軽鎖発現ベクターの作製
配列番号118に示すNo.76 mIgG2a軽鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 Strings DNA Fragments)。合成したDNA断片を、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりNo.76 mIgG2a軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /No.76 mIgG2aL」と命名した。No.76 mIgG2a軽鎖のアミノ酸配列を配列番号119に示した。
2)−4−4−2 No.76 mIgG2a重鎖発現ベクターの作製
配列番号120に示すNo.76 mIgG2a重鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでNo.76 mIgG2a重鎖をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりNo.76 mIgG2a重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /No.76 mIgG2aH」と命名した。No.76 mIgG2a重鎖のアミノ酸配列を配列番号121に示した。
No.76 mIgG2a重鎖用プライマーセット
5’−ccagcctccggactctagagccacc−3’(CM−inf−F)(配列番号108)
5’−agttagcctcccccgtttaaactc−3’(CM−inf−R)(配列番号109)
2)−4−5 Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1、No.76 mIgG2aの生産および精製
2)−4−5−1 Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1、No.76 mIgG2aの生産
実施例2)−3−7−1と同様の方法で生産した。
2)−4−5−2 Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1、No.76 mIgG2aの精製
上記2)−4−5−1で得られた培養上清から抗体を実施例2)−3−7−2と同様の方法で精製した。
3)−1 緑膿菌ATCC 29260に対するオプソニン活性
1)−3−2の方法に従ってATCC 29260に対するcNo.76、c#1G5M、c#1G5、c#4C13KM、c#4C13、Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1のオプソニン活性を測定した。オプソニン活性は50%増殖阻害最小濃度で示した。その結果を表2に示す。
各種O抗原保有緑膿菌に対するcNo.76、c#1G5、c#4C13の結合特異性をwhole cell ELISAによって確認した。用いた菌株とO抗原を表3に示す。
第一三共株式会社保有の緑膿菌O11臨床分離31株およびポジティブコントロールとしてATCC 29260に対する結合活性をwhole cell ELISAによって測定した。緑膿菌のO抗原は緑膿菌群別免疫血清(デンカ生研)20μlと菌液20μlを混合し、抗原抗体反応による凝集の有無によって判定した。Whole cell ELISAは3)−2と同様に行い、1次抗体として0.1μg/mlのcNo.76、c#1G5M、c#4C13KM、Meiji1640、Meiji1656と6.4μg/mlの1BO11 hIgG1を調製し、1時間反応させた。用いた菌株の情報を表4に、測定結果を表5に示す。
3)−3で用いたO11株のうちNo.9、12、18、24、26、31株に対するオプソニン活性を測定した。方法は1)−3−2と同様の方法で行い、50%増殖阻害活性が認められる最小濃度を求めた。その結果を表6に示す。
4)−1 緑膿菌ATCC 29260によるマウス肺感染モデルにおける治療効果(静脈内投与)
MHAで培養した緑膿菌ATCC 29260をOD600=0.10に調製した後、Mueller Hinton Broth(Becton,Dickinson and Company)で100−109の10倍希釈系列を調製し、35℃で一晩培養した。希釈系列のうち、OD600=0.10または0.10を超える最大希釈率の菌液を用いてOD600=0.10に調製し、4倍希釈して接種菌液とした。ICRマウス(チャールズリバー)に接種菌液を50μl経鼻接種し、接種1時間後にcNo.76、Meiji1640、Meiji1656を3または10mg/kg静脈内投与した(n=3)。接種24時間後に肺内生菌数を測定し、治療効果を判定した。抗体非投与のコントロール群と比較してcNo.76投与群で良好な治療効果が確認され、またその治療効果はMeiji1640、Meiji1656と同等以上であった(図5)。
4)−2−1 緑膿菌臨床分離株No.12によるマウス肺感染モデルにおける治療効果(菌と抗体の混合投与)
MHAで培養した緑膿菌臨床分離株No.12を生食に懸濁し、OD600=2.0に調製した(10倍希釈液が0.2となる菌液を調製)。菌と抗体の結合が確実に起こるよう、菌液と20または100μg/mlのcNo.76、Meiji1640、またはMeiji1656を1:9の割合で混合し、それらをICRマウス(チャールズリバー)に50μl経鼻接種した(n=3)。接種24時間後に肺内生菌数を測定し、治療効果を判定した。また、対象としてレボフロキサシン(LVFX)の治療効果も検討した(No.12株に対するLVFXの最小発育阻止濃度(MIC)は>128μg/ml)。すなわち、菌液と生食を1:9で混合し、50μl接種したマウスに240mg/kgのLVFXを接種直後に皮下投与した。抗体非投与のコントロール群と比較してcNo.76は良好な治療効果を示したが、Meiji1640、Meiji1656、LVFX投与群では治療効果は認められなかった(図6)。
MHAで培養した緑膿菌臨床分離株No.31を生食に懸濁し、OD600=5.0に調製した(10倍希釈液が0.5となる菌液を調製)。菌と抗体の結合が確実に起こるよう、菌液と20または100μg/mlのcNo.76、Meiji1640、またはMeiji1656を1:9の割合で混合し、それらをICRマウス(チャールズリバー)に50μl経鼻接種した(n=3)。接種24時間後に肺内生菌数を測定し、治療効果を判定した。また、対象としてLVFXの治療効果も検討した(No.31株に対するLVFXのMICは32μg/ml)。すなわち、菌液と生食を1:9で混合し、50μl接種したマウスに240mg/kgのLVFXを接種直後に皮下投与した。抗体非投与のコントロール群と比較してcNo.76、Meiji1640、Meiji1656は良好な治療効果を示したが、LVFX投与群では治療効果は認められなかった(図7)。
MHAで培養した緑膿菌臨床分離株No.12を生食に懸濁し、OD600=0.20に調製し、それを接種菌液とした。ICRマウス(チャールズリバー)に50μl経鼻接種し、接種直後にcNo.76、Meiji1640、Meiji1656を2または10mg/kg静脈内投与した(n=3)。接種24時間後に肺内生菌数を測定し、治療効果を判定した。また、対象としてLVFXも240mg/kg皮下投与し、治療効果を検討した。静脈内投与においてもcNo.76は良好な治療効果を示したが、Meiji1640、Meiji1656、LVFX投与群では治療効果は認められなかった(図8)。以上の結果から、cNo.76はLVFXのような既存薬が無効である多剤耐性緑膿菌に対しても有効である可能性が示された。また、cNo.76は実施例3で示されたin vitroにおける高いカバー率の特長がin vivoにおいても示された。
5)−1 #1G5のヒト化バージョンの設計
5)−1−1 #1G5の可変領域の分子モデリング
#1G5の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法(Methodsin Enzymology,203,121−153,(1991))によって実行された。ProteinData Bank(Nuc.AcidRes.35,D301−D303(2007))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、上で決定された#1G5の可変領域と比較した。結果として、1UYWが、#1G5の軽鎖の可変領域に対して同様にフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、3GI9が、#1G5の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、#1G5の軽鎖及び重鎖に対応する1UYW及び3GI9の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
ヒト化#1G5抗体の構築を、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。#1G5のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.AcidRes.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、HuMc3抗体がフレームワーク領域についての75%の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。HuMc3についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、#1G5についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された#1G5の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queenet al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化#1G5配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
5)−2−1 h#1G5−H1タイプ重鎖:
配列表の配列番号37に示される#1G5重鎖のアミノ酸番号24(グルタミン)をバリンに、アミノ酸番号26(プロリン)をセリンに、アミノ酸番号30(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号57(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(アルギニン)をアラニンに、アミノ酸番号67(イソロイシン)をメチオニンに、アミノ酸番号86(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号87(アラニン)をバリンに、アミノ酸番号89(ロイシン)をイソロイシンに、アミノ酸番号91(バリン)をアラニンに、アミノ酸番号95(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号106(スレオニン)をアルギニンに、アミノ酸番号108(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号110(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号116(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号139(セリン)をロイシンに、アミノ酸番号141(イソロイシン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5重鎖を「h#1G5−H1タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号37に示される#1G5重鎖のアミノ酸番号24(グルタミン)をバリンに、アミノ酸番号26(プロリン)をセリンに、アミノ酸番号30(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号57(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(アルギニン)をアラニンに、アミノ酸番号67(イソロイシン)をメチオニンに、アミノ酸番号86(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号87(アラニン)をバリンに、アミノ酸番号95(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号106(スレオニン)をアルギニンに、アミノ酸番号108(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号110(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号139(セリン)をロイシンに、アミノ酸番号141(イソロイシン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5重鎖を「h#1G5−H2タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号37に示される#1G5重鎖のアミノ酸番号30(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号57(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(アルギニン)をアラニンに、アミノ酸番号67(イソロイシン)をメチオニンに、アミノ酸番号86(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号95(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号108(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号110(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号139(セリン)をロイシンに、アミノ酸番号141(イソロイシン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5重鎖を「h#1G5−H3タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号37に示される#1G5重鎖のアミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号57(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(アルギニン)をアラニンに、アミノ酸番号139(セリン)をロイシンに、アミノ酸番号141(イソロイシン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5重鎖を「h#1G5−H4タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号37に示される#1G5重鎖のアミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5重鎖を「h#1G5−H5タイプ重鎖」と命名した。
5)−3−1 h#1G5−L1タイプ軽鎖:
配列表の配列番号35に示される#1G5軽鎖のアミノ酸番号21(アスパラギン)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号29(リジン)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号31(メチオニン)をロイシンに、アミノ酸番号32(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号33(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号35(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号39(バリン)をアラニンに、アミノ酸番号41(ロイシン)をイソロイシンに、アミノ酸番号42(セリン)をアスパラギンに、アミノ酸番号60(アラニン)をプロリンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号63(セリン)をプロリンに、アミノ酸番号66(プロリン)をロイシンに、アミノ酸番号83(スレオニン)をセリンに、アミノ酸番号88(アラニン)をグリシンに、アミノ酸番号98(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号103(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号105(アスパラギン酸)をバリンに、アミノ酸番号107(ヒスチジン)をチロシンに、アミノ酸番号120(グリシン)をグルタミンに、アミノ酸番号124(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号129(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5軽鎖を「h#1G5−L1タイプ軽鎖」と命名した。
配列表の配列番号35に示される#1G5軽鎖のアミノ酸番号29(リジン)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号31(メチオニン)をロイシンに、アミノ酸番号32(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号33(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号35(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号39(バリン)をアラニンに、アミノ酸番号41(ロイシン)をイソロイシンに、アミノ酸番号60(アラニン)をプロリンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号83(スレオニン)をセリンに、アミノ酸番号98(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号103(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号105(アスパラギン酸)をバリンに、アミノ酸番号124(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号129(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5軽鎖を「h#1G5−L2タイプ軽鎖」と命名した。
配列表の配列番号35に示される#1G5軽鎖のアミノ酸番号29(リジン)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号31(メチオニン)をロイシンに、アミノ酸番号32(セリン)をアラニンに、アミノ酸番号33(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号35(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号39(バリン)をアラニンに、アミノ酸番号41(ロイシン)をイソロイシンに、アミノ酸番号60(アラニン)をプロリンに、アミノ酸番号61(グルタミン酸)をグリシンに、アミノ酸番号83(スレオニン)をセリンに、アミノ酸番号98(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号103(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号124(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号129(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5軽鎖を「h#1G5−L3タイプ軽鎖」と命名した。
配列表の配列番号35に示される#1G5軽鎖のアミノ酸番号29(リジン)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号39(バリン)をアラニンに、アミノ酸番号98(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号129(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5軽鎖を「h#1G5−L4タイプ軽鎖」と命名した。
配列表の配列番号35に示される#1G5軽鎖のアミノ酸番号29(リジン)をアスパラギン酸に、アミノ酸番号98(バリン)をロイシンに、アミノ酸番号129(アラニン)をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#1G5軽鎖を「h#1G5−L5タイプ軽鎖」と命名した。
5)−4−1 #4C13Kの可変領域の分子モデリング
#4C13Kの可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法(Methodsin Enzymology,203,121−153,(1991))によって実行された。ProteinData Bank(Nuc.AcidRes.35,D301−D303(2007))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、上で決定された#4C13Kの可変領域と比較した。結果として、1UYWが、#4C13Kの軽鎖の可変領域に対して同様にフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、1CICが、#4C13Kの重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、#4C13Kの軽鎖及び重鎖に対応する1UYW及び1CICの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
ヒト化#4C13K抗体の構築を、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。#4C13Kのフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.AcidRes.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、HuMc3抗体がフレームワーク領域についての73%の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。HuMc3についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、#4C13Kについてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された#4C13Kの三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queenet al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化#4C13K配列を以下の実施例に記載されるように構築した。ヒト化#4C13K配列の軽鎖は、ヒト化#1G5配列の軽鎖と完全に共通のものとした。
5)−5−1 h#4C13K−H1タイプ重鎖:
配列表の配列番号41に示される#4C13K重鎖のアミノ酸番号24(グルタミン)をバリンに、アミノ酸番号26(プロリン)をセリンに、アミノ酸番号30(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号56(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号57(グルタミン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(アルギニン)をアラニンに、アミノ酸番号67(イソロイシン)をメチオニンに、アミノ酸番号86(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号87(アラニン)をバリンに、アミノ酸番号89(ロイシン)をイソロイシンに、アミノ酸番号91(バリン)をアラニンに、アミノ酸番号95(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号103(アスパラギン)をセリンに、アミノ酸番号106(スレオニン)をアルギニンに、アミノ酸番号108(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号110(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号116(スレオニン)をアラニンに、アミノ酸番号135(スレオニン)をロイシンにアミノ酸番号136(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#4C13K重鎖を「h#4C13K−H1タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号41に示される#4C13K重鎖のアミノ酸番号24(グルタミン)をバリンに、アミノ酸番号26(プロリン)をセリンに、アミノ酸番号30(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号56(メチオニン)をバリンに、アミノ酸番号57(グルタミン)をアルギニンに、アミノ酸番号59(アルギニン)をアラニンに、アミノ酸番号67(イソロイシン)をメチオニンに、アミノ酸番号86(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号87(アラニン)をバリンに、アミノ酸番号95(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号103(アスパラギン)をセリンに、アミノ酸番号106(スレオニン)をアルギニンに、アミノ酸番号108(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号110(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号135(スレオニン)をロイシンにアミノ酸番号136(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#4C13K重鎖を「h#4C13K−H2タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号41に示される#4C13K重鎖のアミノ酸番号30(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号67(イソロイシン)をメチオニンに、アミノ酸番号86(リジン)をアルギニンに、アミノ酸番号95(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号103(アスパラギン)をセリンに、アミノ酸番号108(アスパラギン酸)をグルタミン酸に、アミノ酸番号110(セリン)をスレオニンに、アミノ酸番号135(スレオニン)をロイシンにアミノ酸番号136(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#4C13K重鎖を「h#4C13K−H3タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号41に示される#4C13K重鎖のアミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号101(グルタミン)をグルタミン酸に、アミノ酸番号103(アスパラギン)をセリンに、アミノ酸番号135(スレオニン)をロイシンにアミノ酸番号136(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#4C13K重鎖を「h#4C13K−H4タイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号41に示される#4C13K重鎖のアミノ酸番号31(バリン)をリジンに、アミノ酸番号39(ロイシン)をバリンに、アミノ酸番号135(スレオニン)をロイシンにアミノ酸番号136(ロイシン)をバリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化#4C13K重鎖を「h#4C13K−H5タイプ重鎖」と命名した。
6)−1 #1G5のヒト化抗体の軽鎖発現ベクターの構築
6)−1−1 h#1G5−L2タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号68に示すh#1G5−L2タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるh#1G5−L2タイプ軽鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでh#1G5−L2タイプ軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりh#1G5−L2タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/h#1G5−L2」と命名した。
ヒト化抗体軽鎖用プライマーセット
5’−ctgtggatctccggcgcgtacggc−3’ (CM−LKF)(配列番号112)
5’−ggagggggcggccaccgtacg−3’(KCL−Inf−R)(配列番号113)
配列番号70に示すh#1G5−L3タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるh#1G5−L3タイプ軽鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例6)−1−1と同様の方法によりh#1G5−L3タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/h#1G5−L3」と命名した。
6)−2−1 h#1G5−H2タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号58に示すh#1G5−H2タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至432に示されるh#1G5−H2タイプ重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでh#1G5−H2タイプ重鎖の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりh#1G5−H2タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/h#1G5−H2」と命名した。
ヒト化抗体重鎖用プライマーセット
5’−agctcccagatgggtgctgagc−3’ (EG−Inf−F)(配列番号110)
5’−cttggtggaggctgagctcacggtcacgagggtgccctggcc−3’(H−R)(配列番号122)
配列番号60に示すh#1G5−H3タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至432に示されるh#1G5−H3タイプ重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。6)−2−1と同様の方法によりh#1G5−H3タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/h#1G5−H3」と命名した。
6)−3−1 h#4C13K−H2タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号78に示すh#4C13K−H2タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至420に示されるh#4C13K−H2タイプ重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。6)−2−1と同様の方法によりh#4C13K−H2タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/h#4C13K−H2」と命名した。
配列番号80に示すh#4C13K−H3タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至420に示されるh#4C13K−H3タイプ重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。6)−2−1と同様の方法によりh#4C13K−H3タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/h#4C13K−H3」と命名した。
実施例2)−3−7−1と同様の方法で生産した。
7)−2 #1G5、#4C13Kのヒト化抗体の精製
上記7)−1で得られた培養上清を、実施例2)−3−7−2と同様の方法で精製した。
8)−1 緑膿菌ATCC 29260に対するオプソニン活性
1)−3−2の方法に従って、ATCC 29260に対するh#1G5−H2/L2、h#1G5−H3/L3、h#4C13K−H2/L2、及びh#4C13K−H3/L3のオプソニン活性を測定し、c#1G5およびc#4C13と比較した。オプソニン活性は50%増殖阻害最小濃度で示した。その結果を表7に示す。
3)−2の方法に従って、各種O抗原保有緑膿菌に対するh#1G5−H2/L2、h#1G5−H3/L3、h#4C13K−H2/L2、及びh#4C13K−H3/L3の結合特異性を確認した。ヒト化4抗体はc#1G5、c#4C13と同様にO11株に対してのみ特異的に高い結合活性を示した(図25)。
3)−3の方法に従って、第一三共株式会社保有の緑膿菌O11臨床分離31株に対するh#1G5−H2/L2、h#1G5−H3/L3、h#4C13K−H2/L2、及びh#4C13K−H3/L3の結合活性を測定した。ヒト化4抗体はc#1G5、c#4C13と同様に全てのO11臨床分離株に結合活性を示した(図26)。
4)−1の方法に従って、ATCC 29260に対するc#1G5、c#4C13、h#1G5−H2/L2、h#1G5−H3/L3、h#4C13K−H2/L2、及びh#4C13K−H3/L3のin vivo活性を測定した。抗体非投与のコントロールと比較してc#1G5、c#4C13、ヒト化4抗体はいずれも治療効果を示し、またその効果はMeiji1656以上であった(図27)。
緑膿菌ATCC 29260を用いてwhole cell ELISAにおける結合活性を指標に、No.76 mIgG2aとcNo.76、c#1G5、c#4C13、Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1の競合試験を実施した。3)−2の方法に従い、1次抗体としてNo.76 mIgG2a(終濃度0.01μg/mL)とcNo.76、c#1G5、c#4C13、Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1のいずれか(終濃度0.01、0.1、1、10、100、1000μg/mL)をそれぞれ添加し、2次抗体としてGoat anti−Mouse IgG2a HRP conjugated(Bethyl Laboratories,Inc.)を用いた。No.76 mIgG2aはcNo.76、c#1G4、c#4C13と競合したが、Meiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1とは競合しなかったことから、cNo.76、c#1G5、c#4C13とMeiji1640、Meiji1656、1BO11 hIgG1はエピトープが異なることが明らかとなった(図28)。
配列番号2:pJON mIgG2a−hIgG1のヌクレオチド配列
配列番号3:pJON mIgκのヌクレオチド配列
配列番号4:No.76の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号5:No.76の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号6:No.76の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号7:No.76の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号8:No.76の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号9:No.76の重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号10:No.76の重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号11:No.76の重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号12:#1G5の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号13:#1G5の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号14:#1G5の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号15:#1G5の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号16:#1G5の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号17:#1G5の重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号18:#1G5の重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号19:#1G5の重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号20:#4C12の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号21:#4C12の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号22:#4C12の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号23:#4C12の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号24:#4C12の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号25:#4C12の重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号26:#4C12の重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号27:#4C12の重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号28:ヒト軽鎖分泌シグナル、及びヒト軽鎖定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号29:ヒト重鎖シグナル配列、及びヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号30:ヒトキメラ化No.76軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号31:ヒトキメラ化No.76軽鎖のアミノ酸配列
配列番号32:ヒトキメラ化No.76重鎖のヌクレオチド配列
配列番号33:ヒトキメラ化No.76重鎖のアミノ酸配列
配列番号34:ヒトキメラ化#1G5軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号35:ヒトキメラ化#1G5軽鎖のアミノ酸配列
配列番号36:ヒトキメラ化#1G5重鎖のヌクレオチド配列
配列番号37:ヒトキメラ化#1G5重鎖のアミノ酸配列
配列番号38:ヒトキメラ化#4C13軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号39:ヒトキメラ化#4C13軽鎖のアミノ酸配列
配列番号40:ヒトキメラ化#4C13重鎖のヌクレオチド配列
配列番号41:ヒトキメラ化#4C13重鎖のアミノ酸配列
配列番号42:Meiji1640軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号43:Meiji1640軽鎖のアミノ酸配列
配列番号44:Meiji1640重鎖のヌクレオチド配列
配列番号45:Meiji1640重鎖のアミノ酸配列
配列番号46:Meiji1656軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号47:Meiji1656軽鎖のアミノ酸配列
配列番号48:Meiji1656重鎖のヌクレオチド配列
配列番号49:Meiji1656重鎖のアミノ酸配列
配列番号50:マウスIgG2bタイプキメラ化1BO11軽鎖をコードするDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号51:ヒトIgG1タイプ1BO11軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号52:ヒトIgG1タイプ1BO11軽鎖のアミノ酸配列
配列番号53:マウスIgG2bタイプキメラ化1BO11重鎖をコードするDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号54:ヒトIgG1タイプ1BO11重鎖のヌクレオチド配列
配列番号55:ヒトIgG1タイプ1BO11重鎖のアミノ酸配列
配列番号56:h#1G5−H1のヌクレオチド配列
配列番号57:h#1G5−H1のアミノ酸配列
配列番号58:h#1G5−H2のヌクレオチド配列
配列番号59:h#1G5−H2のアミノ酸配列
配列番号60:h#1G5−H3のヌクレオチド配列
配列番号61:h#1G5−H3のアミノ酸配列
配列番号62:h#1G5−H4のヌクレオチド配列
配列番号63:h#1G5−H4のアミノ酸配列
配列番号64:h#1G5−H5のヌクレオチド配列
配列番号65:h#1G5−H5のアミノ酸配列
配列番号66:h#1G5−L1のヌクレオチド配列
配列番号67:h#1G5−L1のアミノ酸配列
配列番号68:h#1G5−L2のヌクレオチド配列
配列番号69:h#1G5−L2のアミノ酸配列
配列番号70:h#1G5−L3のヌクレオチド配列
配列番号71:h#1G5−L3のアミノ酸配列
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配列番号73:h#1G5−L4のアミノ酸配列
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配列番号75:h#1G5−L5のアミノ酸配列
配列番号76:h#4C13K−H1のヌクレオチド配列
配列番号77:h#4C13K−H1のアミノ酸配列
配列番号78:h#4C13K−H2のヌクレオチド配列
配列番号79:h#4C13K−H2のアミノ酸配列
配列番号80:h#4C13K−H3のヌクレオチド配列
配列番号81:h#4C13K−H3のアミノ酸配列
配列番号82:h#4C13K−H4のヌクレオチド配列
配列番号83:h#4C13K−H4のアミノ酸配列
配列番号84:h#4C13K−H5のヌクレオチド配列
配列番号85:h#4C13K−H5のアミノ酸配列
配列番号86:#4C13の重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号87:#4C13の重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号88:#4C13の重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号89:AP3dC−S
配列番号90:mIgγRT1 1111−AS
配列番号91:mIgκ 1st 589−AS
配列番号92:MCS−AP3−S
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配列番号118:No.76 mIgG2a軽鎖をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号119:No.76 mIgG2a軽鎖のアミノ酸配列
配列番号120:No.76 mIgG2a重鎖をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号121:No.76 mIgG2a重鎖のアミノ酸配列
配列番号122:H−R
配列番号123:#4C13の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号124:#4C13の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号125:#4C13の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
Claims (11)
- 重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号17に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号18に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなること;及び
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする、緑膿菌のLPS O11抗原を認識する抗LPS O11抗体又は該抗体の抗原結合断片。 - Fab、F(ab’)2、Fab’及びFvからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体の抗原結合断片。
- scFvであることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
- キメラ抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
- ヒト化されていることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
- 配列番号57に示されるアミノ酸配列の20乃至144番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号67に示されるアミノ酸配列の21乃至129番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
- 請求項1乃至6のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチド又は請求項8に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
- 請求項9に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項1乃至6のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の生産方法。
- 請求項1乃至6のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片と他の薬剤を含むコンジュゲート。
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