WO2012133572A1 - 形質細胞または形質芽細胞の選択方法、目的抗原特異的な抗体の製造方法、新規モノクローナル抗体 - Google Patents

形質細胞または形質芽細胞の選択方法、目的抗原特異的な抗体の製造方法、新規モノクローナル抗体 Download PDF

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guinea pig
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信幸 黒澤
正治 磯部
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    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting plasma cells or plasmablasts, a method for producing an antibody specific to a target antigen, and a novel monoclonal antibody. More specifically, the present invention relates to a method for selecting plasma cells or plasmablasts that specifically bind to the target antigen, and to produce antibodies specific to the target antigen using the plasma cells or plasmablasts obtained by using this method. And a novel monoclonal antibody newly obtained by this antibody production method.
  • hybridomas with autonomous growth ability are produced by fusing antibody-producing cells with myeloma cells, and clones having antibody production ability with the desired specificity are screened from them.
  • the method has been widely used.
  • the hybridoma method has several drawbacks.
  • One is that the hybridoma technique is limited to mouse antibody-producing cells, so that it is difficult to apply to other animal species.
  • it takes a long time and labor to screen hybridomas.
  • Another problem is that even if screening is performed, there is no guarantee that a clone having the ability to produce antigen-specific antibodies will be obtained.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-34047.
  • Plasma cells purified from human lymphocytes are placed in microwells that have been specially processed, and antibodies secreted in large quantities from the plasma cells are immobilized on the substrate around the plasma cells and reacted with the labeled antigen. This is a method for identifying antigen-specific plasma cells.
  • Patent Document 1 requires a special apparatus for identification of antigen-specific plasma cells, and requires very complicated operations for cell recovery. Furthermore, since this method requires purification of plasma cells using cell surface antigens, antigen-specific monoclonal antibodies cannot be produced from animal species for which plasma cell identification methods have not been established.
  • an object of the present invention is to provide a technique for overcoming the above-mentioned drawbacks and efficiently producing antigen-specific monoclonal antibodies from a wide range of animal species.
  • Another object of the present invention is to provide a new antigen-specific monoclonal antibody using the newly developed technique for producing an antigen-specific monoclonal antibody.
  • B cells express antibodies on the cell membrane (membrane-type antibodies), and antigen binding to them causes class switching of immunoglobulin genes and somatic hypermutation, resulting in affinity for the antigen. Increased B cells are selected. Part of this high affinity B cell differentiates into a plasma cell and becomes an antibody-producing cell. With this differentiation, plasma cells are known to abolish the expression of membrane-type antibodies by selective splicing of immunoglobulin genes and to express secretory antibodies in large quantities (Immunological Reviews, Sarah A. Oracki, Jennifer A . Walker, Margaret L. Hibbs, Lynn M. Corcoran, David M. Tarlinton, Special Issue: B-Lymphocyte Biology, Volume 237, Issue 1, pages 140-159, September 2010: Which is specifically incorporated herein by reference)).
  • the inventor In the process of analyzing rat, guinea pig and rabbit rabbit plasma cells, the inventor has newly found that the surface of plasma cells obtained from these animals expresses a quantity of membrane-type antibody molecules that can be analyzed for antigen binding. discovered. As a result, it was considered that antigen-specific plasma cells could be identified by directly binding the labeled antigen to the high-affinity membrane antibody expressed on the plasma cell surface. However, the amount of antibody molecules expressed on the plasma cell membrane is small, so even if there are plasma cells that specifically bind to the labeled antigen, antigen-specific plasma cells are not detected due to noise due to nonspecific adsorption of the labeled antigen. It was difficult to identify.
  • antigen-specific plasma cells can be identified by a simple operation in which a fluorescently labeled antigen and an endoplasmic reticulum affinity fluorescent dye are allowed to act on a cell suspension solution prepared from an immunized animal. Completed the invention.
  • the present invention is as follows. [1] Lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are collected from non-human animals, and the collected lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are sensitized in vitro to the target antigen, or non-human Immunize the animal with the antigen of interest, Collect lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells from non-human animals after immunization, Cells that are derived from the sensitized or collected lysate, lymphoid tissue, blood cell sample, or bone marrow, and (1) a labeled antigen of interest, and (2) a label that selectively binds to plasma cells and / or plasma blasts Mix with the substance, Selecting (1) the labeled target antigen and (2) a cell bound with the labeled substance, A method for selecting at least one of plasma cells and plasmablasts that specifically bind to an antigen of interest.
  • Lymph fluid, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow derived cells are collected from humans, and the collected lymph fluid, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow derived cells are sensitized in vitro to the target antigen, or antibodies against the target antigen are administered.
  • [3] Select at least one of plasma cells and plasmablasts that specifically bind to the target antigen by the method according to claim 1 or 2, Collect antibody genes against the target antigen from the selected cells, identify their base sequences, Preparing the antibody or antibody fragment based on the nucleotide sequence of the identified gene; A method for producing an antibody or antibody fragment specific for a target antigen.
  • the labeling substance that selectively binds to plasma cells and / or plasma blasts is a fluorescent probe that has a high staining selectivity for the endoplasmic reticulum of cells compared to staining organelles other than the endoplasmic reticulum, A fluorescent probe for use in identification or isolation of plasma cells and / or plasmablasts, which can be distinguished from plasma cells and plasmablasts and cells other than plasma cells and plasmablasts by staining with a fluorescent probe.
  • Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3.
  • [Five] Claims selected from the group consisting of (1) an amphipathic and cationic substance having moderate lipid solubility, and (2) a substance having a certain affinity for a protein exhibiting endoplasmic reticulum localization 4.
  • the method according to 4. [6]
  • the amphiphile has an amphipathic index (AI) of +6>AI> 0, and the medium lipophilicity has a hydrophobicity index (logP) of +6>logP> 0, which exceeds a certain level. 6.
  • the organelle other than the endoplasmic reticulum is a plasma membrane, mitochondria, Golgi apparatus, lysosome, peroxome, nucleus, centrosome, cytoplasmic substrate, phagosome, endosome, or aggresome. the method of. [8] The method according to any one of claims 4 to 7, wherein the fluorescent probe is selected from the group consisting of fluorescently labeled glibenclamide, fluorescently labeled Brefeldin A, fluorescent probe, and fluorescent protein.
  • Guinea pig against human insulin having the ⁇ chain variable region gene of the guinea pig antibody against human insulin represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 18 in the sequence listing or the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 19 to 30 and 89 to 91 A gene encoding a peptide of the ⁇ chain variable region of an antibody.
  • Guinea pig against human insulin having the gene of the kappa chain variable region of the guinea pig antibody against human insulin represented by any of SEQ ID NOs: 31 to 42 in the sequence listing or the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 43 to 54 and 86 to 88 A gene encoding a peptide in the kappa chain variable region of an antibody.
  • a peptide of the ⁇ chain variable region of a guinea pig antibody against human insulin having the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 19-30 and 89-91.
  • a peptide of the ⁇ chain variable region of a guinea pig antibody against human insulin having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 43 to 54 and 86 to 88.
  • a guinea pig monoclonal antibody against human insulin having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 19 to 30 and 89 to 91 as a variable region and a ⁇ chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as a constant region.
  • a guinea pig monoclonal antibody against human insulin having the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 43 to 54 and 86 to 88 as a variable region, and having a ⁇ chain having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5 as a constant region.
  • a kappa chain containing a combination of any one of the following kappa chain CDR1, kappa chain CDR2 and kappa chain CDR3 or a gamma chain containing a combination of any one of the following gamma chain CDR1, gamma chain CDR2 and gamma chain CDR3 A guinea pig monoclonal antibody against human insulin.
  • antigen-specific monoclonal antibodies can be rapidly produced from a wide range of animal species, thus providing new possibilities for the development of antibody drugs against target molecules that were difficult to produce using existing technologies. Is.
  • FIG. 2 is a photograph of rat lymphocytes derived from iliac lymph nodes stained with a cell surface antibody and endoplasmic reticulum using an anti-rat IgG antibody (green, left figure) and ER-tracker, and observed with a fluorescence microscope. IgG expression was observed on the surface of ER-tracker strongly positive plasma cells (arrow).
  • the result of Example 1 is shown. The results are obtained by staining rat lymphocytes derived from iliac lymph nodes using labeled GFP and ER-tracker, and then using a cell sorter.
  • A is a two-dimensional analysis diagram of rat lymphocytes derived from iliac lymph nodes by the fluorescence intensity of GFP (vertical axis) and ER-tracker (horizontal axis).
  • GFP positive and ER-tracker positive region (High) is shown as an antigen-specific plasma cell fraction, and a GFP negative and ER-tracker positive region (Low) is shown as a non-specific plasma cell fraction.
  • B shows a fluorescence micrograph in which cells collected from the antigen-specific plasma cell fraction were fixed and subjected to membrane solubilization treatment, and FITC-labeled anti-rat IgG antibody was allowed to act on this to stain intracellular IgG.
  • Example 1 The collected cells expressed intracellular immunoglobulins that are characteristic of plasma cells.
  • CDNA was synthesized from the cells separated by the cell sorter, and the rat ⁇ chain and ⁇ chain variable region genes were amplified by 5′-RACE PCR using this as a template (K chain, G chain in the upper part of the figure).
  • the amplified variable region was incorporated into a linearized expression vector to produce rat ⁇ chain and ⁇ chain immunoglobulin expression units.
  • the results of agarose electrophoresis of the amplified DNA are shown (K expression unit, G expression unit at the bottom of the figure).
  • the result of Example 1 is shown.
  • FIG. 3 is a photograph of iliac lymph node-derived guinea pig lymphocytes stained with a cell surface antibody and an endoplasmic reticulum using an anti-guinea pig IgG antibody (green, left figure) and ER-tracker and observed with a fluorescence microscope. IgG expression was observed on the surface of ER-tracker strongly positive plasma cells (arrow). The result of Example 2 is shown.
  • A shows two-dimensional guinea pig lymphocytes by fluorescence intensity when cells collected from guinea pig iliac lymph nodes are stained with fluorescently labeled human insulin (vertical axis) and ER-tracker (horizontal axis) and separated by cell sorter.
  • the cells in the region indicated by R1 were used as the antigen-specific plasma cell fraction, and single cell sorting was performed.
  • B cells obtained from the antigen-specific plasma cell fraction were fixed and subjected to membrane solubilization treatment, and FITC-labeled anti-guinea pig IgG antibody was allowed to act on this to stain intracellular IgG (green).
  • the endoplasmic reticulum was stained with an endoplasmic reticulum affinity fluorescent dye ER-ID Red (red).
  • Cell nuclei were stained with Hechst33342 (blue).
  • the fractionated cells had intracellular immunoglobulins (green), characteristic of plasma cells, developed endoplasmic reticulum (red), and a nucleus that was biased toward one of the cells.
  • Example 2 The result of Example 2 is shown. ⁇ and ⁇ chain variable region gene fragments were amplified from individual plasma cells isolated from the antigen-specific plasma cell fraction. A 1% agarose gel electrophoresis photograph of a typical amplification product is shown. G represents a guinea pig ⁇ variable region gene fragment, and K represents a ⁇ chain variable region gene fragment. The result of Example 2 is shown. 1 shows a 1% agarose gel electrophoresis photograph of linearized ⁇ chain and ⁇ chain expression units obtained by binding guinea pig ⁇ and ⁇ chain variable region gene fragments to respective linking double-stranded DNA fragments. G represents a linearized ⁇ chain expression unit, and K represents a ⁇ chain expression unit. The result of Example 2 is shown.
  • Example 3 By introducing linearized ⁇ chain and ⁇ chain or ⁇ chain expression unit into 293FT cells, binding of recombinant antibody secreted into the medium to human insulin was shown.
  • the horizontal axis shows the ability of human insulin to bind per ⁇ g of recombinant antibody.
  • the result of Example 3 is shown.
  • the results show that ovalbumin-positive and ER-tracker yangyang cells were present.
  • the result of Example 3 is shown. It is the result of having performed the amplification reaction of the variable region of a rabbit immunoglobulin (kappa) chain gene using a primer (d) and a primer (ne). The result of Example 3 is shown.
  • Example 3 It is the result of having confirmed conversion to the expression unit of (kappa) and (gamma) chain immunoglobulin gene fragment by the agarose gel electrophoresis method. The result of Example 3 is shown. It is the result of having investigated about the antigen binding ability of the recombinant rabbit monoclonal antibody obtained from the antigen-specific plasma cell and the non-specific plasma cell using ELISA method.
  • the first aspect of the present invention is a method for selecting at least one of a plasma cell and a plasmablast that specifically bind to a target antigen.
  • the first aspect of the present invention can be divided into two methods: a method for non-human animals (hereinafter referred to as NHA method) and a method for human subjects (hereinafter referred to as HU method).
  • the NHA method for non-human animals is Lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are collected from non-human animals, and the collected lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are sensitized in vitro to the target antigen, or non-human Immunize the animal with the antigen of interest, Collect lymphatic fluid, lymphoid tissue, blood cell sample or bone marrow derived cells from animals after immunization, The sensitized or collected lymph fluid, lymphoid tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells, and (1) a labeled target antigen and (2) a plasma cell and / or a labeling substance that selectively binds to plasmablasts And mix Selecting (1) the labeled target antigen and (2) a cell bound with the labeled substance
  • the HU method for humans is Lymph fluid, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow derived cells are collected from humans, and the collected lymph fluid, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow derived cells are sensitized in vitro to the target antigen, or antibodies against the target antigen are administered.
  • Mix the substances Selecting (1) the labeled target antigen and (2) a cell bound with the labeled substance.
  • the HU method at least one of human plasma cells and plasmablasts that specifically bind to the target antigen can be selected.
  • non-human animal means all animals having an immune system other than human.
  • mammals include ape, monkey, dog, cat, horse, cow, pig, sheep, goat, donkey, camel, llama, alpaca, reindeer, buffalo, yak, guinea pig, rabbit, mink, mouse, rat, gerbil Hamsters, golden hamsters, Armenian hamsters, ferrets, miniature pigs, raccoons, black rats, sunks, kangaroos, dolphins and the like.
  • birds include chickens, quails or ostriches.
  • the “target antigen” refers to microorganisms such as viruses, mycoplasma, bacteria, and molds, coronal animals such as shellfish, molting animals such as insects and crustaceans, new mouth animals such as vertebrates, and constituents thereof, Proteins, sugars, lipids, complex carbohydrates, nucleic acids, natural low molecular organic compounds, natural high molecular organic compounds, artificial low molecular organic compounds, artificial high molecular organic compounds, metal complexes, and the like.
  • it is not intended to limit the type of target antigen and these are merely examples.
  • the target antigen used for immunization of a non-human animal can be the target antigen as it is, but it can also be used as it is or in a state in which an organism containing the target antigen is killed or as an extract thereof, or an appropriate carrier. They can also be combined or mixed.
  • ⁇ ⁇ ⁇ Collect lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells from non-human animals, and sensitize the collected lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells to the target antigen in vitro.
  • Sensitization with the target antigen in vitro to lymph fluid and the like can be performed as follows. Dendritic cells, T cells, and B cells, which are antigen-presenting cells, are collected from non-human animals. Next, an antigen is allowed to act on a dendritic cell in a test tube to be phagocytosed and digested to produce a mature dendritic cell having the ability to present the antigen.
  • T cells and B cells T cells and B cells, cytokines such as interleukin 2, and immunostimulants such as poly (dI-dC) are added, and B cells that respond to the antigen are proliferated and differentiated in vitro to finally produce antibodies. Plasma cells and plasmablasts are obtained.
  • cytokines such as interleukin 2, and immunostimulants such as poly (dI-dC)
  • immunostimulants such as poly (dI-dC)
  • “immunizing a non-human animal with a target antigen” means bringing the target antigen into contact with the non-human animal and expressing immunity against the target antigen in the non-human animal.
  • the method for expressing immunity to the target antigen is not particularly limited.
  • a non-human animal can be immunized by administering or transplanting the target antigen to the non-human animal.
  • the administration method or transplantation method of the target antigen include intraperitoneal administration, oral administration, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or gene transfer into non-human animals. Examples thereof include a method of expressing in an animal body.
  • the non-human animal can be immunized by bringing the target antigen into contact with the skin of the non-human animal.
  • Immunization with a target antigen of a non-human animal is performed until immunization with the target antigen is established in the non-human animal. Therefore, the non-human animal is brought into contact with the target antigen until immunity with the target antigen is established.
  • the frequency and duration of contact of the target antigen with the non-human animal and the amount of the target antigen used for one contact can be appropriately determined according to the ease of establishing immunity. Whether or not immunity with a target antigen is established in a non-human animal can be confirmed by a conventional method, for example, by collecting blood from the non-human animal and measuring the antibody contained in the serum by ELISA. .
  • Lymph, lymph tissue, blood cell samples or bone marrow-derived cells are collected from the animal after immunization. Since the object of the present invention is to select at least one of plasma cells and / or plasmablasts of a non-human animal that specifically binds to the antigen of interest, the possibility of containing plasma cells and / or plasmablasts is high. Collect lymph, lymphoid tissue, blood cell samples or bone marrow derived cells.
  • Plasma cells and plasma blasts are cells that are terminally differentiated B lymphocytes and specialized in antibody production. These cells are particularly useful for isolating antibodies with high binding ability because somatic mutation of antibody genes called affinity maturation and selection by antigen have already been performed.
  • plasma cells and plasmablasts are heterogeneous cell populations composed of several subsets, and their presence in lymphoid tissues is as low as 0.1% or less, so that high-purity isolation is difficult.
  • Conventional methods require several steps of positive / negative selection in combination with antibodies against at least three cell surface markers to identify and isolate plasma cells and plasmablasts from peripheral blood and lymph nodes. (Sanderson, R. D., Lalor, P., Bernfield, M. B lymphocytes express and lose syndecan at specific stages of differentiation: Cell Regulation 1: 27-35 (1989): Non-Patent Document 1 (all The description is specifically incorporated herein as disclosure)).
  • the lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow can be prepared, for example, as follows.
  • the swollen lymph fluid and lymph tissue are surgically removed from a non-human animal that has been injected with the antigen subcutaneously, muscle, or footpad for about one month.
  • the cells inside the lymph node are in PBS solution (10 mM phosphate buffer, 120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.6) by breaking the lymph node membrane using tweezers.
  • PBS solution 10 mM phosphate buffer, 120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.6
  • As the blood cell sample mononuclear cells obtained by separating blood obtained by heparin blood collection from an immunized animal by density gradient centrifugation are used.
  • Bone marrow is cut from both bone ends of the femur removed from the immunized animal, and PBS solution is allowed to flow into the bone marrow from an injection needle inserted into one bone end, so that bone marrow cells that have flowed out from the other bone end are removed. Use.
  • ⁇ Selection of cells From the collected lymph nodes, at least one of plasma cells and plasmablasts of a non-human animal that specifically binds to the target antigen is selected. In order to perform this selection, (1) a labeled target antigen and (2) a labeling substance that selectively binds to plasma cells and / or plasmablasts are used.
  • a labeled target antigen is a substance containing the same epitope as the target antigen used for immunization of a non-human animal. Therefore, the labeled target antigen and the target antigen used for immunization can be the same substance or different substances containing a common epitope.
  • any label capable of selecting plasma cells and / or plasmablasts to which the labeled target antigen has been bound may be used.
  • Examples of such a label include a fluorescent label and a magnetic bead label.
  • a labeling substance that selectively binds to a target antigen and plasma cells and / or plasmablasts is a labeling substance that selectively binds to plasma cells and / or plasmablasts. As long as it can be distinguished from cells bound only to the antigen of interest and cells bound only to the labeling substance that selectively binds to plasma cells and / or plasma blasts.
  • Labeling substance that selectively binds to plasma cells and / or plasmablasts examples include, for example, fluorescent probe 1 described below. Can do.
  • Fluorescent probe 1 is a fluorescent probe for use in the identification or isolation of plasma cells and plasmablasts, and has a higher affinity for the endoplasmic reticulum than for other organelles, in other words, It is a fluorescent probe that selectively stains the endoplasmic reticulum of cells.
  • Plasma cells and plasmablasts have abnormally developed endoplasmic reticulum compared to plasma cells and cells other than plasmablasts, and as a result, the fluorescence intensity obtained by staining with fluorescent probe 1 is as follows. Compared to the fluorescence intensity when cells other than plasmablasts are stained with the fluorescent probe 1, the difference is such that the plasma cells, plasmablasts and plasma cells, and cells other than plasmablasts can be distinguished.
  • the fluorescence intensity ratio (fluorescence intensity of plasma cells and plasmablasts / fluorescence intensity of plasma cells and cells other than plasmablasts) shown by the fluorescent probe 1 is, for example, 3 times or more.
  • plasma cells and plasmablasts in which cells other than plasma cells and plasmablasts coexist are obtained from fluorescence intensity and plasma cells and plasmablasts from plasma cells and cells other than plasmablasts. Both can be identified by the difference in intensity of the fluorescence intensity. Therefore, by staining with the fluorescent probe 1, it is possible to easily identify the plasma cell and the plasmablast from the cell group in which cells other than the plasma cell and the plasmablast coexist, and the identified plasma cell and plasmablast It is possible to obtain a cell group containing a large amount of plasma cells and plasmablasts.
  • the fluorescent probe 1 can be distinguished from each other if the fluorescence intensity from the stained plasma cells and plasmablasts is at least three times the fluorescence intensity from the stained plasma cells and cells other than plasmablasts. From the viewpoint of facilitating identification, it is preferably 4 times or more, more preferably 5 times or more.
  • this fluorescence intensity ratio varies depending on the types of cells other than plasma cells and plasmablasts, and the degree of development of the endoplasmic reticulum differs depending on the types of cells other than plasma cells and plasmablasts. The higher the fluorescence intensity ratio, the more efficiently the plasma cells and plasmablasts can be identified from the cell group including cells other than plasma cells and plasmablasts.
  • cells other than plasma cells and plasmablasts include erythrocytes, platelets, T lymphocytes, B lymphocytes, granulocytes, macrophages, eosinophils, basophils, eosinophils, macrophages and the like.
  • plasma cells using the fluorescent probe 1 and discrimination between plasmablasts and plasma cells and cells other than plasmablasts can be performed as follows. Fluorescent probe 1 is added to the cell suspension and stained at 37 ° C. for 30 minutes. The concentration of the fluorescent probe 1 suitable for staining varies depending on the type of the fluorescent probe 1, but is, for example, 100 nM to 1 ⁇ M. After staining, the cells are washed with PBS. The washed cells are, for example, (1) observing the localization of the fluorescent probe in the cells using a fluorescence microscope, or (2) plasma cells as well as plasmablasts based on the intensity of fluorescence emitted from the cells. Or cells other than plasma cells and plasmablasts. A method for distinguishing plasma cells and plasmablasts from plasma cells and cells other than plasmablasts will be described in detail in Plasma cells and plasmablast identification / separation methods.
  • a substance that can be used as the fluorescent probe 1 can be screened from a substance with unknown staining selectivity. Screening of a fluorescent probe suitable as the fluorescent probe 1 of the present invention having high staining selectivity for the endoplasmic reticulum of cells is performed by immunostaining of proteins localized in the endoplasmic reticulum (immunoglobulin in plasma cells and plasmablasts), which will be described later.
  • the ratio of the fluorescence intensity A of the whole cell to the fluorescence intensity B from the endoplasmic reticulum (B) using a method of identifying the endoplasmic reticulum of a cell by expressing a recombinant fluorescent protein that migrates to the endoplasmic reticulum in cultured cells. / A) can be used.
  • the method for screening a substance that can be used as the fluorescent probe 1 can be carried out using only plasma cells and plasmablasts, or using only plasma cells and cells other than plasmablasts.
  • plasma cells and plasmablasts have developed endoplasmic reticulum and high fluorescence intensity can be obtained by staining
  • the use of plasma cells and plasmablasts has a higher selectivity for the staining of substances with respect to the endoplasmic reticulum of the cells. Evaluation is easier.
  • it since it is not easy to obtain plasma cells and plasmablasts, it can be used as fluorescent probe 1 by evaluating the staining (staining power) to the endoplasmic reticulum using cells other than plasma cells and plasmablasts. Substances can also be screened.
  • the ratio (B / A) of the fluorescence intensity A of the whole cell and the fluorescence intensity B from the endoplasmic reticulum is obtained.
  • Available substances can be screened.
  • the B / A value to be used as the threshold is determined according to the degree of endoplasmic reticulum development in the cells. It is appropriate to appropriately set a value lower than the B / A value as a threshold employed in the screening method, for example, about 50%.
  • Examples of cells other than plasma cells and plasmablasts include erythrocytes, platelets, T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, and basophils as other cells.
  • hybridoma cells, plasma cells and plasmablast tumor cells, or multiple myeloma cells can be used instead of plasma cells and plasmablasts. This is because hybridoma cells, plasma cells and plasma blast tumor cells, and multiple myeloma cells also develop the endoplasmic reticulum to produce immunoglobulins, so that high fluorescence intensity is obtained by staining. This is because it is easier to evaluate the staining selectivity of a substance with respect to the endoplasmic reticulum.
  • Fluorescent probe 1 with high staining selectivity for plasma cells and plasma blast cells and plasma cells and the endoplasmic reticulum of cells other than plasma blast cells includes: (1) Amphiphilic and cationic, and moderate Examples thereof include a substance having fat solubility, and (2) a substance having a certain affinity for a protein showing localization of the endoplasmic reticulum.
  • the substance having the property (1) or (2) has both the staining property to the endoplasmic reticulum of plasma cells and plasmablasts and the staining property to the endoplasmic reticulum of plasma cells and cells other than plasmablasts. Compared to other organelles, the staining is higher.
  • amphipathic and cationic in (1) above specifically means that the amphipathic index (AI) is, for example, +6> AI> 0.
  • the amphiphilic index is a value obtained by calculating the apparent logP value of the lipophilic domain of the molecule. Specifically, this is a value calculated according to the model of Morrall et al. Based on the fragment value of Hansch et al., Taking into account the carbon chain length and its positional relationship and the polar effect of the cationic quaternary ammonium group. [Hansch C, Leo AJ.
  • “medium lipid solubility” means that the hydrophobic index (logP) is, for example, +6> logP> 0.
  • the hydrophobicity index is the hydrophobicity value of the whole molecule calculated by the fragment estimation method of Hansch et al. Specifically, the influence of the structure attached to the hydrophobic group indicated by AI is added.
  • “having a certain affinity for a protein showing endoplasmic reticulum localization” specifically means that the dissociation constant has an affinity of 0.1 ⁇ M to 0.1 nM.
  • a substance having a certain affinity for a protein showing localization of the endoplasmic reticulum is also a fluorescent probe for selectively staining the endoplasmic reticulum of cells.
  • Examples of substances that are amphipathic and cationic and have moderate fat solubility include compounds represented by A, B, or C below.
  • the compound represented by Formula A is DiOC6 (3) (3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide), which accumulates in mitochondria at low concentrations, but accumulates in the endoplasmic reticulum at high concentrations.
  • the compound represented by formula B is rhodamine B hexyl ester, which accumulates in mitochondria at low concentrations but accumulates in the endoplasmic reticulum at high concentrations.
  • the compound represented by Formula C is ER-Tracker Blue white DPX, which mainly accumulates in the endoplasmic reticulum and also stains the Golgi apparatus at high concentrations. It is the fluorescent probe used in the Example. All of these compounds represented by A, B or C are amphipathic, cationic and moderately fat-soluble (see reference, Why fluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimental and QSAR-modeling study).
  • the amphiphilic index (AI) and hydrophobic index of the compound represented by A are 4.5 and 4.4, respectively, and have a monovalent cation.
  • the amphiphilic index (AI) and hydrophobicity index of the compound represented by B are 4.8 and 5.9, respectively, and have a monovalent cation.
  • the compound represented by C has an amphiphilic index (AI) and a hydrophobic index of 5.1 and 0.7, respectively, and has a monovalent cation. As shown in the Examples, the compound represented by C has a fluorescence intensity of 4 or more times higher than that when staining plasma cells and plasmablasts. is there.
  • the dyes (Dye) 1, 5, 7 and 10 are amphiphiles that are cationic and moderately fat-soluble, and are examples of the fluorescent probe 1. These dyes are those described in US Application Publication US 2010/0068752 A1, the entire description of which is specifically incorporated herein by reference. These dyes can be synthesized based on the description of the above-mentioned US application publication, and some of them are commercially available.
  • the amphiphilic index (AI) and hydrophobicity index of Dye 1 are 4.95 and 3.77, respectively, and have a monovalent cation.
  • the amphiphilic index (AI) and the hydrophobic index of Dye 5 are 5.11 and 4.32, respectively, and have a monovalent cation.
  • the amphiphilic index (AI) and hydrophobicity index of Dye 7 are 4.19 and 3.29, respectively, and have a monovalent cation.
  • the dye (Dye) 10 has an amphiphilic index (AI) and a hydrophobic index of 4.25 and 5.71, respectively, and has a monovalent cation.
  • the hydrophobic index of the dyes (Dye) 1, 5, 7 and 10 is calculated using two independent logP calculation indexes (logP (annlogp), logP (atomic6)) using CompuDrug's calculation software Pallas.
  • LogP (combined) 0.863 ⁇ logP (annlogp) + 0.137 ⁇ logP (atomic6), which is the sum of values multiplied by a coefficient for enhancing the coincidence.
  • the amphipathic index was calculated by excluding the phosphate group (P-0) from the value of logP (annlogp).
  • Examples of substances having a certain affinity or higher for proteins showing localization of the endoplasmic reticulum include fluorescently labeled glibenclamide and fluorescently labeled Brefeldin® A.
  • glibenclamide is a compound represented by the following formula, and trade names: ER-Tracker (registered trademark) Green (BODIPY (R) FL glibenclamide, ER-Tracker (registered trademark) Red, (BODIPY (R) TR glibenclamide is glibenclamide
  • the glibenclamide compound is known to bind to sulphonylurea receptors of ATP-sensitive K + channels, which are abundant in the endoplasmic reticulum, and inhibit its action. Dissociation constant of glibenclamide to ATP-sensitive K + channel is 0.1 ⁇ 3.6nM.
  • Brefeldin® A is a compound represented by the following formula, and trade name: BODIPY-brefeldin® A is commercially available as a compound in which a fluorescent dye (BODIPY) is bound to Brefeldin® A.
  • BODIPY fluorescent dye
  • Brefeldin A shows functional inhibition of Arf1 protein, a GTP-exchanging factor that acts in vesicle transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus.
  • the amount of fluorescent probe 1 added to lymph, lymphoid tissue, blood cell sample, or bone marrow can be appropriately determined in consideration of the sensitivity of the detector, the composition of the cell suspension, the staining time, etc.
  • ER-Tracker Blue white DPX In this case, it can be in the range of 100 nM to 1 ⁇ M. However, it is not intended to be limited to this range.
  • the lymph, lymph tissue, blood cell sample, or bone marrow stained with the fluorescent probe 1 identifies plasma cells and plasmablasts (or plasma cells and cells with high possibility of plasmablasts) based on fluorescence.
  • the method for identifying plasma cells and plasmablasts includes (1) a method for observing the location of the fluorescent probe in the stained cells under a fluorescence microscope, and (2) a cell subjected to sputum staining. There is a method based on the fluorescence intensity emitted from.
  • the method of observing the localization of a fluorescent probe in a cell using a fluorescence microscope is that the region of the endoplasmic reticulum contained in the cell is strongly stained (i.e., emits strong fluorescence).
  • a cell in which the area ratio of the strongly stained endoplasmic reticulum region is about 65% or more can be identified as a plasma cell and a plasma blast.
  • the fluorescence intensity of the entire cell is about 65% or more when the fluorescence intensity of the entire cell is 100%. It can also be identified as a blast.
  • the fluorescence intensity occupied by the endoplasmic reticulum is about 65% of the fluorescence intensity from one whole cell, and 35% in other organelles (mitochondrion, Golgi apparatus, plasma membrane, etc.)
  • the fluorescent dye migrates.
  • the ratio of the fluorescence intensity of the whole cell to the fluorescence intensity from the endoplasmic reticulum is determined by culturing immunostaining of proteins localized in the endoplasmic reticulum (immunoglobulin in plasma cells and plasmablasts) and recombinant fluorescent proteins that migrate to the endoplasmic reticulum.
  • proteins localized in the endoplasmic reticulum immunoglobulin in plasma cells and plasmablasts
  • recombinant fluorescent proteins that migrate to the endoplasmic reticulum By expressing in a cell, it can be determined as follows using a method for identifying the endoplasmic reticulum of the cell.
  • 293 cells are used to express recombinant fluorescent protein (red) in cultured cells, and the cells are stained with fluorescent probe 1 (for example, ER-Tracker Blue Blue White).
  • fluorescent probe 1 for example, ER-Tracker Blue Blue White.
  • A the fluorescence intensity of the fluorescent probe 1 in the whole cell and display it as A
  • B the fluorescent probe in the region (endoplasmic reticulum) stained with the recombinant fluorescent protein (red)
  • the fluorescence intensity of 1 is measured and displayed as B.
  • the fluorescence intensity B corresponds to the amount of fluorescent probe 1 localized in the endoplasmic reticulum.
  • the ratio of the fluorescence intensity B from the endoplasmic reticulum of the cell to the fluorescence intensity A from one whole cell can be expressed as B / A x 100 (%).
  • B / A x 100 %.
  • ER-tracker Blue / white intensity A occupying one whole cell and ER- in the region stained with immunoglobulin (green) (endoplasmic reticulum)
  • the fluorescence intensity B of trackerBBlue / white was measured, the value of B / A x 100 was 65% or more.
  • the fluorescent probe 1 has a fluorescence intensity obtained in plasma cells and plasmablasts as compared to the fluorescence intensity obtained in cells other than plasma cells and plasmablasts, for example, 3 times or more, preferably 4 times or more, More preferably, it is five times higher. Therefore, plasma cells and plasmablast candidates from the cells stained with the fluorescent probe 1 can be easily identified based on the fluorescence intensity using the above-described fluorescence scanner or the like.
  • plasma cells and plasmablasts are candidates only The ratio of true plasma cells as well as plasma blasts contained in is increased.
  • plasma cells and plasmablasts that show high fluorescence intensity compared to plasma cells and cells other than plasmablast cells but show relatively low fluorescence intensity below the reference fluorescence intensity ratio may be excluded. There is. Therefore, considering the characteristics of plasma cells and plasma blasts contained in the sample lymph, lymphoid tissue or blood cell sample, especially the degree of development of the endoplasmic reticulum, the criteria for selecting plasma cells and plasma blasts as candidates. It is preferable to select the fluorescence intensity ratio.
  • the method of the present invention it is preferable to further collect (sort) candidate plasma cells and plasmablasts identified by the above method.
  • the identified cells can be collected, for example, by sorting with a cell sorter. Identification of plasma cells and plasmablasts based on fluorescence and plasma cells identified as plasma cells and plasmablasts (or likely plasma cells and plasmablasts) based on fluorescence and plasma cell candidates Is sorted by a cell sorter.
  • the cells can be selected and separated as a group of a plurality of cells, but preferably, the cells are individually selected and separated one by one.
  • the cells selected here are cells that have binding properties to the target antigen, but the antibodies to the target antigens that each cell has are not necessarily the same, and the amino acid sequences of the antigen binding sites of each antibody are expected to be different. Is done. Accordingly, the same target antigen can be obtained by individually selecting and separating cells one by one and applying each cell one by one to the method for producing an antibody or antibody fragment specific for the target antigen described later. It is possible to obtain different monoclonal antibodies that specifically bind to.
  • the cells selected by this method are cells that show binding to the target antigen and are likely to be plasma cells and / or plasmablasts. It is possible to select at least one of plasma cells and plasmablasts of the non-human animal to be bound.
  • lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are collected from a human, and the collected lymph, lymph tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are sensitized in vitro with a target antigen or cells.
  • a target antigen such as collected lymph can be performed by the same method as described above. That is, dendritic cells, T cells, and B cells, which are antigen-presenting cells, are collected from humans.
  • an antigen is allowed to act on a dendritic cell in a test tube to be phagocytosed and digested to produce a mature dendritic cell having the ability to present the antigen.
  • T cells and B cells cytokines such as interleukin 2, and immunostimulants such as poly (dI-dC) are added, and B cells that respond to the antigen are proliferated and differentiated in vitro to finally produce antibodies. Plasma cells and plasmablasts are obtained.
  • lymph fluids received from humans with antibodies more specifically, blood received from humans with antibodies against the target antigen, or lymph nodes removed by surgery for the purpose of disease treatment, etc.
  • blood cells or lymphocytes are separated from blood or tissue provided by a human having an antibody against the target antigen, and (1) a labeled target antigen, and (2) a plasma cell and / or A labeling substance that selectively binds plasmablasts is mixed.
  • the target antigen used for immunization, (1) the labeled target antigen, and (2) the labeling substance that selectively binds plasma cells and / or plasmablasts are the same as in the NHA method.
  • selection of cells bound to (1) a labeled target antigen and (2) a labeling substance that selectively binds plasma cells and / or plasmablasts is the same as in the NHA method.
  • a sample provided from a human having an antibody against the target antigen is used, at least one of human plasma cells and plasmablasts that specifically bind to the target antigen can be selected.
  • the second aspect of the present invention is a method for producing an antibody or antibody fragment specific for a target antigen.
  • At least one of plasma cells and plasmablasts that specifically bind to the target antigen in the method of the present invention is selected, Collect antibody genes against the target antigen from the selected cells, identify their base sequences, Preparing the antibody or antibody fragment based on the nucleotide sequence of the identified gene; It is a method including. By this method, an antibody or antibody fragment specific to the target antigen can be produced.
  • the method for selecting at least one of plasma cells and plasmablasts that specifically bind to the target antigen in the method of the present invention is as described above.
  • Antibody genes against the target antigen are collected from the selected cells, and their base sequences are identified.
  • the selected cell is a cell that shows binding to the antigen of interest, and is a plasma cell or a plasmablast.
  • antibody genes can be collected and identified by handling a group consisting of a plurality of these selected cells.
  • antibody genes are collected from individual cells and their nucleotide sequences are identified. To do. This makes it possible to obtain different monoclonal antibodies that specifically bind to the same target antigen.
  • a known method can be used for collecting antibody genes against the target antigen from the selected cells and identifying the base sequence.
  • the method of collecting antibody genes against the target antigen and synthesizing cDNA from the collected antibody genes uses, for example, the methods described in WO2009 / 091048 (US2011 / 0020879A1, the entire description of which is specifically incorporated herein by reference) Furthermore, a method for cloning the synthesized cDNA is, for example, the homologous recombination method described in WO2009 / 110606, US2011 / 0117609A1 (the entire description of which is specifically incorporated herein by reference).
  • identification of the base sequence of the synthesized cDNA can be carried out using a known DNA base sequence determination method, and the antibody against the target antigen can be identified by identifying the base sequence of the cDNA. Genes can be identified.
  • a plurality of projecting enclosures are provided in alignment on one surface of a substrate, the projecting enclosure has at least one notch, and an inside thereof
  • a space that can hold droplets and at least the surface of the substrate surface that holds the droplets is immobilized on magnetic beads using a reaction jig whose contact angle with pure water is in the range of 90 to 150 °.
  • the magnet is moved from the surface opposite to the surface having the protruding enclosure of the substrate.
  • It is a reaction method including performing reaction and / or washing by sequentially moving them.
  • the substance immobilized on the magnetic beads can be used, for example, by using, for example, oligo dT having binding ability to mRNA in selected cells.
  • the cDNA synthesis method is the reaction jig described above, wherein a reaction jig provided with at least two protruding enclosures in one column is used in the droplet holding space of the two protruding enclosures.
  • the droplets of the cell lysis solution containing the surface tension reducing reagent and the cDNA synthesis solution are retained in this order, and the mRNA immobilized on the magnetic beads is retained in the droplet retaining space of the two protruding enclosures.
  • the solution held in the substrate can be sequentially moved from the surface opposite to the surface having the protruding enclosure of the substrate using a magnet to obtain cDNA immobilized on the magnetic beads.
  • the above cDNA synthesis method can be carried out, for example, by using a reaction jig provided with at least four protruding enclosures in one column.
  • a reaction jig provided with at least four protruding enclosures in one column.
  • droplets of the cell lysis solution, the mRNA washing solution, the cDNA synthesis solution, and the cDNA washing solution are respectively held in this order, and the magnetic
  • the mRNA immobilized on the beads is sequentially moved to the solution held in the space of the four protruding enclosures using a magnet from the surface opposite to the side where the substrate protrusions are provided. Thereby, cDNA immobilized on the magnetic beads is obtained.
  • the volume of the C-shaped projection space of the reaction jig used in the cDNA synthesis method is suitably in the range of 0.5 to 100 ⁇ L, for example.
  • the cell lysis solution retained in the space of the first C-shaped protrusion is, for example, a solution of 3 ⁇ L in total containing 100 mM Tris HCl (pH 7.5), 500 mM LiCl, 1% lithium dodecyl sulfate 5 mM dithiothreitol. Can do.
  • the mRNA washing solution held in the space of the second C-shaped protrusion can be a solution of 3 ⁇ L in total containing 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 0.1% lithium dodecyl sulfate.
  • the washing solution for reverse transcription reaction held in the space of the third C-shaped protrusion is 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM. It can be a 3 ⁇ L total solution containing DTT, 2 unit RNase inhibitor.
  • the reverse transcription reaction solution retained in the space of the fourth C-shaped projection is 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, A total volume of 3 ⁇ L containing 2 unit RNase inhibitor and 8 unit SuperScript III Reverse transcriptase can be used. However, these are examples and are not intended to be limited to these solutions.
  • mRNA immobilized on magnetic beads There are no particular restrictions on the type or length of the mRNA. MRNAs derived from various organisms can be used. As the magnetic beads, for example, particles having a particle system of 2.8 ⁇ m and oligo dT25 covalently bonded to the surface can be used. Immobilization of mRNA on magnetic beads can be performed as follows.
  • the mRNA immobilized on the magnetic beads is sequentially added to the solution (droplet) held in the space of the four C-shaped protrusions.
  • the magnet for example, a small neodymium magnet can be used.
  • Each droplet is allowed to stay for the time required for reaction or washing.
  • the time required for the reaction or washing varies depending on the reaction conditions and washing conditions, but can be, for example, in the range of 1 second to 1 hour.
  • the above reaction and washing can be performed at room temperature (room temperature), but the temperature can be adjusted as necessary. Furthermore, when the amount of droplets is small, the solvent in the solution may evaporate, so put the reaction jig in a sealed container and keep the humidity in the container constant to prevent the solvent from evaporating. Is preferred. In order to keep the humidity in the container constant, a container containing water or a suitable aqueous solution can coexist in the sealed container.
  • the cDNA immobilized on the magnetic beads can be obtained by sequentially retaining and passing the mRNA immobilized on the magnetic beads in the solution (droplet) held in the space of the four C-shaped projections. .
  • the obtained cDNA can be used in subsequent steps without being cut out from the magnetic beads. Specifically, the obtained cDNA can be subjected to the cloning method described below.
  • a cloning method using the homologous recombination method described in WO2009 / 110606 is a homologous recombination method in which a PCR product containing a sequence of a target gene (antibody gene) having amplification primer sequences P1 and P2 at both ends, Homologous pair consisting of homologous recombination regions VP1 and VP2 consisting of base sequences homologous to the primer sequences P1 and P2 for PCR product amplification, and consisting of base sequences homologous to part T1 inside P1 Using a linearized vector having the recombination region VT1 on the terminal side of VP1 and / or the homologous recombination region VT2 consisting of a base sequence homologous to the partial sequence T2 inside P2 on the terminal side of VP2.
  • T1 and T2 has a base sequence unique to the target gene
  • the PCR product is subjected to homologous recombination reaction and inserted into the vector, and the target PCR product is specifically vectorized Recombinant DNA inserted into Methods including obtaining a method of using.
  • a PCR product containing the sequence of the target gene (antibody gene) having the amplification primer sequences P1 and P2 at both ends can be obtained from the cDNA obtained above by the method described in WO2009 / 110606.
  • a recombinant DNA molecule in which the target PCR product is specifically inserted into the vector is prepared, and then the obtained recombinant DNA molecule is amplified,
  • the antibody gene can be cloned.
  • the target gene (antibody gene) contained in the amplified recombinant DNA molecule (recombinant vector) is excised from the vector by, for example, restriction enzyme treatment and purified as necessary. Separation and purification of the target gene can be performed by conventional methods. Examples of the separation and purification of the target gene include gel extraction and column purification. The separated and purified target gene can be used for, for example, determination of a base sequence, incorporation into an expression vector, and functional analysis of the target gene.
  • an antibody or antibody fragment Based on the nucleotide sequence of the identified gene, an antibody or antibody fragment is prepared. Preparation of an antibody or antibody fragment based on the nucleotide sequence of the identified gene can be performed using an antibody gene fragment prepared using the specific method for producing a DNA fragment described in WO2011 / 027808.
  • a method for producing a ligated DNA fragment in which ligation DNA regions are ligated on both sides of a target gene comprising (1) to (4).
  • the target gene is an antibody gene.
  • a base sequence containing the target gene sequence in the center having regions that can associate with both ends, and the two regions capable of associating do not associate with each other And one or both regions have a unique base sequence in which at least a part of the base sequence is included in the target gene sequence, and has a protruding end of 1 nucleotide or more at the 3 ′ end of both associable regions Preparing a 3 ′ overhanging double stranded gene fragment, (2) preparing a ligation double-stranded DNA fragment containing a ligation DNA region in the center and having regions that can associate with both ends, (3-1) One associable region of the 3′-end protruding double-stranded gene fragment has a base sequence homologous to the associable region at one end of the linking double-stranded DNA fragment.
  • the sequence on the terminal side to which the 3 ′ protruding end is added is the side that binds to the DNA region for ligation in one of the regions that can associate with the double-stranded DNA fragment for ligation, (3-2)
  • the protruding end from one of the regions capable of associating in the 3′-end protruding double-stranded gene fragment does not have a chain extension function in the DNA synthesis reaction, (3-3)
  • the other associateable region of the 3′-end protruding double-stranded gene fragment is composed of a base sequence homologous to the associateable region at the other end of the linking double-stranded DNA fragment.
  • the sequence on the terminal side to which the 3 ′ protruding end is added is the side that binds to the DNA region for ligation in the other associateable region of the ligation double-stranded DNA fragment, (3-4)
  • the protruding end from the other associateable region of the 3′-end protruding double-stranded gene fragment does not have a chain extension function in the DNA synthesis reaction, (4)
  • the ligated DNA fragment is obtained by performing heat denaturation, reassociation and DNA synthesis reaction at least twice. Including, A method for producing a ligated DNA fragment.
  • region 1 Assuming that one of the associable regions is “region 1” and the other associable region is “region 2”, the ligated DNA fragment is schematically represented as region 2—ligation DNA region—region 1 -Target gene-Region 2-DNA region for ligation-A DNA fragment having at least one sequence represented by region 1.
  • the ligation DNA region comprises sequence A and sequence B as two ligation DNA regions;
  • One of the regions capable of associating the 3′-end protruding double-stranded gene fragment has sequences P1 and T1 from the end side, and the other has sequences P2 and T2 from the end side, and at least of sequences T1 and T2
  • One of the regions capable of associating the double-stranded DNA fragment for ligation has the sequences VP1 and VT1 from the terminal side, the other has the sequences VP2 and VT2 from the terminal side, and the sequences VP1 and VT1 are the sequences P1 and VT1.
  • VT1 The ligated DNA fragment represented by VT1 is VT2-VP2 (T2-P2) -sequence B-sequence A-VP1-VT1 (P1-T1) -target gene-VT2-VP2 (T2-P2) -sequence B
  • VP1-VT1 (P1-T1) means VT1-VP1 that is homologous to T1-P1.
  • the sequence that does not have a chain extension function is a sequence that is non-homologous to the sequence adjacent to the VP2 of the sequence B.
  • a sequence that does not have a chain extension function in the DNA synthesis reaction at the protruding end at the end is a non-homologous sequence when adjacent to VP1 of the sequence A.
  • the protruding end is a sequence containing dideoxynucleotide at the 3 ′ end.
  • the ligated DNA fragment produced by the method according to [1] as a template, the ligated DNA fragment so as to amplify at least one of the ligation DNA regions and the target gene sequence contained in the ligated DNA fragment.
  • PCR is performed using a forward primer and a reverse primer that function in different ligation DNA regions contained in the DNA to produce a DNA fragment containing at least one ligation DNA region and all of the target gene sequence it can.
  • a deoxynucleotide terminal is added to a double-stranded DNA fragment containing a target gene sequence and a polydeoxynucleotide.
  • the method can further comprise obtaining a 3′-overhanging double-stranded gene fragment containing a target gene sequence by acting on a transferase.
  • the double-stranded DNA fragment containing the sequence of the target gene has a sequence P1 and a sequence P2 at each end, has a sequence T1 in a part of the inside of the sequence P1, and has an inner side of the sequence P2.
  • sequence T2 (In part, it has the sequence T2, and one or both of the sequences T1 and T2 have a base sequence unique to the target gene.)
  • sequence T1 and T2 have a base sequence unique to the target gene, or one or both of the sequence P1 and the sequence P2 have a base sequence unique to the target gene.
  • sequences P1 and P2 are independently 10 bases or more
  • the target gene is an antibody gene
  • the 3′-protruding double-stranded gene fragment includes a sequence derived from the antibody gene
  • the linking double-stranded DNA fragment Alternatively, the region VP1 and the region VT1 in the linking double-stranded DNA fragment having the sequence A can have a sequence derived from or not derived from an antibody gene.
  • the target gene is an antibody gene
  • the 3′-protruding double-stranded gene fragment includes a sequence derived from the antibody gene
  • the linking double-stranded DNA fragment Alternatively, the region VP2 and the region VT2 in the linking double-stranded DNA fragment having the sequence B can be sequences derived from or not derived from an antibody gene.
  • An antibody can be produced using the ligated DNA fragment produced by the method described in [4] or [5].
  • the method for producing an antibody using the obtained ligated DNA fragment can be carried out using a method such as the cationic liposome method.
  • the antibody can be produced by introducing the ligated DNA fragment into a cell such as the 293T cell line and then culturing the cell to express the antibody gene.
  • the present invention includes genes and peptides of the variable and constant regions of guinea pig antibodies against human insulin newly obtained using the above-described method of the present invention, as well as rumott monoclonal antibodies against human insulin.
  • ⁇ chain constant region gene of guinea pig antibody against human insulin having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • ⁇ chain constant region of guinea pig antibody against human insulin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • a peptide of a ⁇ -chain constant region of a guinea pig antibody against human insulin having a gene encoding a peptide and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • ⁇ chain constant variable region gene of guinea pig antibody against human insulin having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7-18 in the sequence listing, ⁇ of guinea pig antibody against human insulin having amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19-30
  • a peptide of a ⁇ chain variable region of a guinea pig antibody against human insulin having a gene encoding a chain variable region peptide and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 19 to 30.
  • a guinea pig monoclonal antibody against human insulin having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 19 to 30 as a variable region and the ⁇ chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as a constant region.
  • a guinea pig monoclonal antibody against human insulin having the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 43 to 54 as a variable region and having a ⁇ chain having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5 as a constant region.
  • variable region and constant region genes and peptides of guinea pig antibodies against human insulin of the present invention refer to the description of Examples described later using known DNA and peptide preparation methods. Can be prepared.
  • Example 1 Production of rat monoclonal antibody [Materials and methods] As immunized animals, Wistar rats were 6 weeks old. Antigen is GFP. For immunization, 50 ⁇ g of GFP was injected intramuscularly three times every other month on both sides of the rat ridge. After immunization, iliac lymph nodes were collected from rats. GFP was fluorescently labeled with Alexafluor488 and purified by gel filtration. The iliac lymph node-derived lymphocytes were suspended in a PBS-0.5% bovine serum albumin solution, GFP (0.5 ⁇ g / ml) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 30 minutes to label the cells with antigen.
  • GFP 0.5 ⁇ g / ml
  • the cells were centrifuged, suspended in DMEM medium, ER-Tracker (1 ⁇ M) was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes to stain the endoplasmic reticulum. After washing the cells with PBS, the antigen-specific plasma cell fraction is GFP positive and ER-tracker strong positive cells, and the antigen non-specific plasma cell fraction is GFP negative and ER-tracker strong positive cells using a cell sorter. separated.
  • Lymphocytes prepared from iliac lymph nodes were stained with anti-rat IgG (green) and ER-tracker and then observed with a fluorescence microscope. As a result, IgG expression was observed on the surface of plasma cells strongly positive for ER-tracker, although it was weak (FIG. 1).
  • FIG. 2A High and Low in FIG. 2A.
  • the isolated cells were fixed and solubilized with cell membranes, and stained with anti-rat antibodies. As a result, the fractionated cells expressed a large amount of antibody in their cytoplasm. (FIG. 2B).
  • cDNA synthesis cDNA synthesis and immunoglobulin gene amplification were performed according to the method described in “Reaction jig and reaction method, and cDNA synthesis method” (WO2009 / 091048) (FIG. 3).
  • mRNA washing solution A 10 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 0.1% LiDS
  • mRNA washing solution B 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2
  • Triton X 0.1% Triton X
  • 0.5 mM dNTP 0.5 mM dNTP
  • 5 mM DTT 2 unit RNase inhibitor
  • cDNA synthesis solution 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 10 unit SuperScriptllll Reversesetripase (Invitrogen) was added and reacted for 1 hour at 37 ° C.
  • 3 ⁇ L of 3 ′ tailing washing solution 50 mM potassium phosphate (pH 7.0), 0.5 mM dGTP, 0.1% Triton X was added to the magnetic beads.
  • PCR reaction solution (primer 0.2 ⁇ M each, dNTP 0.2 mM, Takara Bio PrimeSTAR thermostable DNA polymerase 1U) was added to the magnetic beads, and the reaction was performed at 94 ° C. for 30 seconds to 68 ° C. for 40 seconds. 35 cycles were performed.
  • the primer used was (a) and annealed to poly G added to the 3 ′ end of cDNA by TdT.
  • the primer sequence is (A) and is derived from the constant region of the rat immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • the primer sequence is (c) and is derived from the constant region of the rat immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • variable region of the rat immunoglobulin ⁇ chain gene An amplification reaction was performed. Similarly, amplification reaction of the variable region of rat immunoglobulin kappa chain gene was performed using primer (d) and primer (f).
  • the primers used were 1st PCR sense primer 5-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCDN-3 (A) (SEQ ID NO: 55) Antisense primer for 1st PCR ⁇ chain amplification 5- GCAGGTGACGGTCTGGCTGGRCCAGGTGCTGGA-3 (I) (SEQ ID NO: 56) Antisense primer for first PCR ⁇ chain amplification 5- TCGTTCAGTGCCATCAATCTTCCACTTGAC-3 (U) (SEQ ID NO: 57) Sense primer for second PCR amplification 5-CGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCC-3 (d) (SEQ ID NO: 58) Antisense primer for second PCR gamma chain amplification 5- CTGCAGGACAGCTGGGAAGGTGTGCAC-3 (e) (SEQ ID NO: 59) Antisense primer for second PCR ⁇ chain amplification 5- TAACTGTTCCGTGGATGGTGGGAAGAT-3 (F) (SEQ ID NO: 60) After the
  • rat immunoglobulin linearized expression vector Preparation of rat immunoglobulin linearized expression vector
  • rat ⁇ -chain gene and ⁇ -chain gene expression unit was prepared according to the method of “Specific method for producing a linked DNA fragment containing a target gene-derived sequence” (WO2011 / 027808). did. That is, 2 units of terminaldeoxynucleotidyltransferase was added to 1 ⁇ L of each PCR product amplified by the 5′-RACE-PCR method, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then heated at 94 ° C. for 5 minutes to stop the enzyme reaction. .
  • a rat ⁇ chain gene expression unit was prepared by adding a rat ⁇ chain gene double-stranded DNA fragment to the rat ⁇ chain gene solution and performing a reaction.
  • 5-AGAGAAACCGTCTATCAGGGCGATGGC-3 (ki) (SEQ ID NO: 61)
  • 5-AGAGACCCTTTGACGTTGGAGTCCACG-3 (ku)
  • SEQ ID NO: 62 After the reaction, 1 ⁇ L each of the PCR solution was taken, and the conversion of ⁇ and ⁇ chain immunoglobulin gene fragments into expression units was confirmed by agarose gel electrophoresis (see the lower part of FIG. 3). Double-stranded DNA fragment for gene ligation
  • the double-stranded DNA fragment for ligation of rat ⁇ -chain gene consists of rat ⁇ -chain constant region (1-873) ligation sequence II (1-54), poly A addition signal (1045-1051), CMV promoter (1577-2172), ligation It consists of sequence 1 (2173-2201) (SEQ ID NO: 63).
  • Double-stranded DNA fragment for gene ligation comprises rat ⁇ chain constant region (1-325), ligation sequence II (1-53), poly A addition signal (507-513), It consists of a CMV promoter (1038-1633) and linking sequence 1 (1634-1662) (SEQ ID NO: 64).
  • the full-length rat ⁇ chain and ⁇ chain gene expression units amplified in the above experiment were introduced into 293FT cells and cultured for 2 days to secrete recombinant rat antibodies in the cell culture medium.
  • Antigen-binding ability of recombinant rat monoclonal antibodies obtained from antigen-specific plasma cells and non-specific plasma cells was examined using ELISA (FIG. 4).
  • Recombinant rats obtained from antigen-specific plasma cells were examined.
  • As for the monoclonal antibody 9 out of 12 clones showed strong binding force to GFP. In contrast, only 1 out of 12 recombinant rat monoclonal antibodies obtained from all plasma cell fractions showed strong binding to GFP.
  • antigen-specific plasma cells can be identified by high-efficiency production of antigen-specific rat monoclonal antibodies by simply allowing the labeled antigen and ER-tracker to act on the lymphocyte suspension. It became clear that this is possible.
  • Example 2 Production of Anti-Human Insulin Guinea Pig Monoclonal Antibody Insulin binds to insulin receptors present on the cell surface of liver, muscle and adipose tissue, and regulates the energy metabolism in the body by controlling glucose uptake into cells. It is an important hormone that plays a regulatory role. The measurement of blood insulin concentration is extremely important in grasping the pathological conditions such as diabetes and obesity. Since the structure of mammalian insulin has high homology except for guinea pigs, it is difficult to produce monoclonal antibodies using mice. For this reason, polyclonal antibodies obtained from guinea pig serum have been used to measure the blood concentration of human insulin.
  • an anti-human insulin guinea pig monoclonal antibody was prepared using the present invention.
  • the immunized animals used were 6 weeks old guinea pigs.
  • the antigen is human insulin.
  • 50 ⁇ g of human insulin was injected intramuscularly 4 times every other month on both sides of the guinea pig tail.
  • iliac lymph nodes were collected from guinea pigs. Insulin was fluorescently labeled with Alexafluor594 and purified by gel filtration.
  • [result] Lymphocytes were suspended from the iliac lymph nodes in PBS-0.5% bovine serum albumin solution, and then a fluorescent dye-labeled anti-guinea pig antibody was added and stirred at 4 ° C. for 30 minutes. The cells were centrifuged, suspended in DMAM medium, ER-Tracker (1 ⁇ M) was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. The endoplasmic reticulum was stained and observed with a fluorescence microscope. As a result, IgG expression was observed on the surface of plasma cells strongly positive for ER-tracker (FIG. 5).
  • the iliac guinea pig lymphocyte suspension was stained with Alexafluor594-labeled insulin and ER-tracker and analyzed with a flow cytometer.
  • a labeled insulin-positive and ER-tracker strong cell group was present (R1 in FIG. 6). This was defined as an antigen-specific plasma cell fraction.
  • cDNA synthesis cDNA synthesis and immunoglobulin gene amplification were performed according to the method described in "Reaction jig and reaction method, and cDNA synthesis method" (WO2009 / 091048).
  • mRNA for washing mRNA 10 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 0.1% LiDS
  • mRNA washing solution B 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2.
  • 0.1% Triton X 0.1% Triton X, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor
  • cDNA synthesis was performed.
  • cDNA synthesis solution 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 10 unit SuperScriptll Reversesetripase (Invitrogen) was added and reacted for 1 hour at 37 ° C.
  • 3 ⁇ L of 3 ′ tailing washing solution 50 mM potassium phosphate (pH 7.0), 0.5 mM dGTP, 0.1%) was added.
  • the primer used was (a) and annealed to poly G added to the 3 ′ end of cDNA by TdT.
  • the primer sequence is (K) and is derived from the constant region of the guinea pig immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • the primer sequence is (ko) and is derived from the constant region of the guinea pig immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • the primer sequence is (sa) and is derived from the constant region of the guinea pig immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • variable region of the rat immunoglobulin ⁇ chain gene An amplification reaction was performed. Similarly, amplification reaction of the variable region of rat immunoglobulin kappa chain gene was performed using primer (d) and primer (s). Similarly, amplification reaction of the variable region of rat immunoglobulin ⁇ chain gene was performed using primer (d) and primer (se) (FIG. 7).
  • the primers used were Antisense primer for 1st PCR ⁇ chain amplification 5-GGTGCTGCTGGCCGGGTGGGCTACATTGCA-3 (K) (SEQ ID NO: 65) Antisense primer for first PCR ⁇ chain amplification 5-CAGAGCCATCCACCTTCCACTTGACGG-3 (co) (SEQ ID NO: 66) Antisense primer for first PCR ⁇ chain amplification 5-CTGCTGGCCATGTATTTGTTGTCGCTCTG-3 (sa) (SEQ ID NO: 67) Sense primer for second PCR amplification 5-CTGAAGGACGGCCGGGAAGGTGTGCAC-3 (si) (SEQ ID NO: 68) Antisense primer for second PCR ⁇ chain amplification 5-GGAAGAGGGAGATAGTTGGCTTCTGCACACTC-3 (su) (SEQ ID NO: 69) Antisense primer for second PCR ⁇ chain amplification 5-AGAAGGAATTCAGGAGACACACCACTGT-3 (se) (SEQ ID NO
  • the cDNA prepared from guinea pig spleen cells was used to clone the guinea pig ⁇ chain gene constant region, ⁇ chain gene constant region and ⁇ chain gene constant region, The sequence was determined. Specifically, 3 ⁇ L of cell lysate containing 3 ⁇ g of magnetic beads (Dynapies) bound to oligo dT25 was added to guinea pig spleen cells (100 mM TrisHCl (pH 7.5), 500 mM LiCl, 1% dodecyl sulfate Li (LiDS), 5 mM).
  • mRNA washing solution B 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2.
  • Triton X 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor
  • cDNA synthesis solution 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 10 unit SuperScriptll Reversesetriptase (Invitrogen) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • primer (So) and (Ta) for ⁇ chain constant region primer (h) and (tu) for ⁇ chain constant region
  • primer (te) and (g) The ⁇ chain constant region was amplified.
  • Gamma chain constant region amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) CLVKGYFPEPVTVKWNSGALTSGVHTFPAVLQSGLYSLTSMVTVPSSQKKATCNVAHPASSTKVDKTVEPIRTPQPNPCTCPKCPPPENLGGPSVFIFPPKPKDTLMISLTPRVTCVVVDVSQDEPEVQFTWFVDNKPVGNAETKPRVEQYNTTFRVESVLPIQHQDWLRGKEFKCKVYNKALPAPIEKTISKTKGAPRMPDVYTLPPSRDELSKSKVSVTCLIINFFPADIHVEWASNRVPVSEKEYKNTPPIEDADGSYFLYSKLTVDKSAWDQGTVYTCSVMHEALHNHVTQKAISRSPG
  • Kappa chain constant region sequence GGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGAGTGTGCAGAAGCCAACTATCTCCCTCTTCCCTCCATCATCTGAGGAGGTGACAGCTGGAAGTGCCTCAGTTGTGTGCTTCATTAATAGCTTCTATCCAAGAGACATCACCGTCAAGTGGAAGGTGGATGGCTCTGAACGCTCACAAGGCATCCTGAACAGTTACACAGATCAGGACAGCAAGGACAACACCTACAGCCTCAGTAGCACCCTGGCGCTGACGGCTTCAGAGTACAATCAGCATGAGAGGTACACCTGCGAGGTCTCCCACGCTGGCCTGACCTCACCCGCTGCCAAGACCATCAACAGGAGCGAGTGCTAGCTAG
  • the guinea pig ⁇ chain gene, ⁇ chain gene, and ⁇ chain gene expression unit was prepared according to the method described in “Specific method for producing a ligated DNA fragment containing a target gene-derived sequence” (WO2011 / 027808). That is, 2 units of terminaldeoxynucleotidyltransferase was added to 1 ⁇ L of each PCR product amplified by the 5′-RACE-PCR method, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then heated at 94 ° C. for 5 minutes to stop the enzyme reaction. It was.
  • a guinea pig ⁇ chain gene expression unit was prepared.
  • a guinea pig ⁇ chain gene expression unit was prepared by adding a double-stranded DNA fragment for ligation of guinea pig ⁇ chain genes to the guinea pig ⁇ chain gene solution.
  • a guinea pig lambda chain gene expression unit was prepared by adding a guinea pig lambda chain gene double-stranded DNA fragment for ligation to a guinea pig lambda chain gene solution.
  • the double-stranded DNA fragment for ligation of guinea pig ⁇ chain gene includes guinea pig ⁇ chain constant region (1-911), linking sequence II (1-96), poly A addition signal (912-1118), CMV promoter (1628-2093), Consists of linking sequence 1 (2094-2123) (SEQ ID NO: 77).
  • the double-stranded DNA fragment for ligation of guinea pig ⁇ chain gene is the guinea pig ⁇ chain constant region (1-345), It consists of linking sequence II (1-55), poly A addition signal (346-548), CMV promoter (1058-1652), linking sequence 1 (1653-1682) (SEQ ID NO: 78).
  • the double-stranded DNA fragment (sequence) for ligation of guinea pig ⁇ chain gene consists of guinea pig ⁇ chain constant region (1-272), ligation sequence II (1-52), poly A addition signal (53-410), CMV promoter (985- 1579), consisting of linking sequence 1 (1580-1609) (SEQ ID NO: 79).
  • the full-length guinea pig ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain gene expression units amplified in the above experiment were introduced into 293FT cells and cultured for 2 days to secrete the recombinant guinea pig antibody into the cell culture medium.
  • the human insulin binding ability of recombinant guinea pig monoclonal antibodies obtained from antigen-specific plasma cells and non-specific plasma cells was examined by ELISA (FIG. 9). As a result, among 241 monoclonal antibodies obtained from antigen-specific plasma cells, 146 clones showed 10 times the insulin binding ability of the negative control, and 77 clones showed 50 times the strong binding ability of the negative control.
  • antigen-specific plasma cells can be identified and antigen-specific monoclonal antibodies can be produced from these by simply applying labeled antigen and ER-tracker to the lymphocyte suspension. It became clear that this is possible.
  • FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4 of the ⁇ chain and ⁇ chain constant variable regions of the guinea pig antibody against human insulin were determined using homology with human immunoglobulin variable regions, respectively.
  • the amino acid sequences of ⁇ chain and ⁇ chain FR1-4 and CDR1-3 of the resulting guinea pig monoclonal antibodies 12 are shown in the following table.
  • [result] Lymphocytes were suspended from the iliac lymph node in a PBS-0.5% bovine serum albumin solution, Alexafluor488 fluorescently labeled ovalbumin was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cells were centrifuged and resuspended in PBS, ER-Tracker (1 ⁇ M) was added to the cells, and the cells were left at room temperature for 5 minutes to stain the endoplasmic reticulum and analyzed with a flow cytometer. As a result, there was a cell group positive for ovalbumin and ER-tracker strong (FIG. 10). This was defined as an antigen-specific plasma cell fraction.
  • cDNA synthesis cDNA synthesis and immunoglobulin gene amplification were performed according to the method described in "Reaction jig and reaction method, and cDNA synthesis method" (WO2009 / 091048).
  • mRNA washing solution A 10 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 0.1% LiDS
  • mRNA washing solution B 75 mM KCl, 3 mM MgCl2
  • Triton X 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor
  • cDNA synthesis solution 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2, 0.1% Triton X-100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 10 unit SuperScriptllll Reversesetripase (Invitrogen) was added and reacted for 1 hour at 37 ° C.
  • 3 ⁇ L of 3 ′ tailing washing solution 50 mM potassium phosphate (pH 7.0), 0.5 mM dGTP, 0.1% Triton X was added to the magnetic beads.
  • 3 ′ tailing reaction solution 50 mM potassium phosphate (pH 7.0), 0.5 mM dGTP, 0.1% Triton X-100, 4 mM magnesium chloride, terminal deoxynucleotidyltransferase 10 U was added, and the reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Amplification of rabbit ⁇ and ⁇ chain variable region gene fragments After washing magnetic beads with 3 ⁇ L of TE solution (10 mM TrisHCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100), 5′-RACE PCR was performed. The human immunoglobulin ⁇ chain and ⁇ chain genes were amplified. In the first PCR reaction, 25 ⁇ L of PCR reaction solution (primer 0.2 ⁇ M each, dNTP 0.2 mM, Takara Bio PrimeSTAR thermostable DNA polymerase 1U) was added to the magnetic beads, and the reaction was performed at 94 ° C. for 30 seconds to 68 ° C. for 40 seconds. 35 cycles were performed.
  • the primer used was (a) and annealed to poly G added to the 3 ′ end of cDNA by TdT.
  • the primer sequence is (na)) and is derived from the constant region of the rabbit immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • the primer sequence is (d) and is derived from the constant region of the rabbit immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • variable region of the rabbit immunoglobulin ⁇ chain gene An amplification reaction was performed. Similarly, amplification reaction of the variable region of rabbit immunoglobulin kappa chain gene was performed using primer (d) and primer (ne). (FIG. 11).
  • the primers used were Antisense primer for 1st PCR ⁇ chain amplification 5-GCTGGCTGCTTGAGGTCACGCTCACCAC-3 (Na) (SEQ ID NO: 80) Antisense primer for first PCR ⁇ chain amplification 5- CAGTTGTTTGGGTGGTGCCATCCAC-3 (D) (SEQ ID NO: 81) Antisense primer for second PCR gamma chain amplification 5- CTGCCGGACGGACGGGAAGGTGCGTAC-3 (nu) (SEQ ID NO: 82) Antisense primer for second PCR ⁇ chain amplification 5- ACACACGATGGTGACTGTTCCAGTTG-3 (ne) (SEQ ID NO: 83)
  • rabbit ⁇ chain gene and ⁇ chain gene expression unit was prepared according to the method of “Specific production method of linked DNA fragment containing target gene-derived sequence” (WO2011 / 027808) did. That is, 2 units of terminaldeoxynucleotidyltransferase was added to 1 ⁇ L of each PCR product amplified by the 5′-RACE-PCR method, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then heated at 94 ° C. for 5 minutes to stop the enzyme reaction. .
  • the double-stranded DNA fragment for ligation of rabbit ⁇ chain gene consists of rabbit ⁇ chain constant region (1-893) ligation sequence II (1-93), poly A addition signal (1065-1071), CMV promoter (1606-2195), ligation It consists of sequence
  • Double-stranded DNA fragment for gene ligation The double-stranded DNA fragment for ligation of rabbit ⁇ chain gene consists of rabbit ⁇ chain constant region (1-312), ligation sequence II (1-95), poly A addition signal (507-513), It consists of CMV promoter (1050-1633) and linking sequence 1 (1640-1675) (SEQ ID NO: 85).
  • the full-length rabbit ⁇ chain and ⁇ chain gene expression units amplified in the above experiment were introduced into 293FT cells and cultured for 2 days to secrete the recombinant rabbit antibody in the cell culture medium.
  • the antigen-binding ability of recombinant rabbit monoclonal antibodies obtained from antigen-specific plasma cells and non-specific plasma cells was examined using ELISA (FIG. 13). Recombinant rabbits obtained from antigen-specific plasma cells were examined.
  • the monoclonal antibody showed a strong binding force to ovalbumin.
  • antigen-specific plasma cells can be identified by high-efficiency production of antigen-specific rabbit monoclonal antibodies by simply applying labeled antigen and ER-tracker to the lymphocyte suspension. It became clear that this is possible.
  • the present invention is useful in the field related to antibody production.

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Abstract

【課題】幅広い動物種から効率よく抗原特異的モノクローナル抗体を作製する技術を提供し、当該技術を用いて新たな抗原特異的モノクローナル抗体を提供する。【解決手段】非ヒト動物を目的抗原で免疫し、免疫成立後の非ヒト動物からリンパ液等を採取し、または、目的抗原に対する抗体を有するヒトからリンパ液等を採取し、採取したリンパ液等と、(1)標識した目的抗原および(2)形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質とを混合し、前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択する。上記方法で目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方の細胞を選択し、選択した細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、同定した遺伝子の塩基配列に基づいて前記抗体または抗体の断片を調製する、目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片を製造する。

Description

形質細胞または形質芽細胞の選択方法、目的抗原特異的な抗体の製造方法、新規モノクローナル抗体 関連出願の相互参照
　本出願は、２０１１年３月３０日出願の日本特願２０１１－０７５１３５号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、形質細胞または形質芽細胞の選択方法、目的抗原特異的な抗体の製造方法、新規モノクローナル抗体に関する。さらに詳しくは、本発明は、目的抗原に特異的に結合する形質細胞または形質芽細胞の選択方法、この方法を用いて得られる形質細胞または形質芽細胞を用いて目的抗原特異的な抗体を製造する方法、さらには、この抗体製造方法により新たに得られた新規モノクローナル抗体に関する。
　現在抗体医薬品開発に用いられるモノクローナル抗体の多くは、マウス抗体をヒト化したものである。この理由は、モノクローナル抗体作製法としてマウスハイブリドーマ法が確立されているためである。しかし、抗体医薬の標的となるヒトタンパク質の機能的抗原エピトープの多くは、ヒト-マウス間のアミノ酸配列相同性が高く、このような抗原をマウスに免疫しても免疫寛容のために特異性の高い抗体が得られにくい。このため高い能力を有する抗体を手に入れるまでには、膨大な数のハイブリドーマの作製とこれらのスクリーニングを行う必要がある。そこで新たな抗体医薬品開発のためには、ヒトの抗原とは、なるべく異なるアミノ酸配列を有する動物種に免疫を行い、免疫寛容の制限を回避することで、高い能力を有するモノクーナル抗体を効率よく生産するための手法が求められている。
　従来のモノクローナル抗体作製は、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることで自律増殖能を持ったハイブリドーマを作製し、その中から目的の特異性をもった抗体産生能を有すクローンをスクリーニングする方法が広く用いられてきた。しかしハイブリドーマ方法には幾つかの欠点が存在する。一つは、ハイブリドーマ技術がマウス抗体産生細胞に限定された方法であるため、他の動物種への応用が難しいことである。さらに、ハイブリドーマのスクリーニングに時間と手間がかかることも欠点である。またスクリーニングを行っても、抗原特異的抗体産生能を有するクローンが得られる保証が無い点も問題である。
　上記の欠点を克服するため、エリスポット法を応用した抗原特異的抗体産生能を有する形質細胞（抗原特異的形質細胞）の同定法が、ヒトモノクローナル抗体作製に開発された（特開２００９－３４０４７号公報:特許文献１（ＷＯ２００９／０１７２２６、ＵＳ２０１１／０２９４６７８Ａ１）（それらの全記載は、ここに特に開示として援用される））。ヒトリンパ球から精製された形質細胞を、特殊加工がほどこされたマイクロウエルに入れ、形質細胞から多量に分泌される抗体を形質細胞周辺の基盤に固定化させ、これに標識抗原を反応させることで、抗原特異的形質細胞の同定を行う方法である。
　しかし、上記特許文献１に記載の方法では、抗原特異的形質細胞の同定に特殊な装置が必要で、細胞の回収にも非常に煩雑な操作を要する。更にこの方法では、細胞表面抗原を用いた形質細胞の純化作業が必要であるため、形質細胞同定法が確立されていない動物種から抗原特異的モノクローナル抗体を作製することはできない。
　そこで本発明の目的は、上記欠点を克服し、幅広い動物種から効率よく抗原特異的モノクローナル抗体を作製する技術を提供することにある。
　さらに本発明は、上記新たに開発された抗原特異的モノクローナル抗体を作製する技術を用いて、新たな抗原特異的モノクローナル抗体を提供することも目的とする。
　Ｂ細胞は細胞膜上に抗体を発現しており（膜型抗体）、これに抗原が結合することで免疫グロブリン遺伝子のクラススイッチおよび体細胞高頻度突然変異が起こり、その結果抗原に対し親和性の増大したB細胞が選択される。この高親和性Ｂ細胞の一部が形質細胞に分化して抗体産生細胞となる。この分化に伴い形質細胞は、免疫グロブリン遺伝子の選択的スプライシングにより膜型抗体の発現を消失させ、分泌型抗体を多量に発現させることが知られている（Immunological Reviews，Sarah A. Oracki, Jennifer A. Walker, Margaret L. Hibbs, Lynn M. Corcoran, David M. Tarlinton，Special Issue: B-Lymphocyte Biology，Volume 237, Issue 1, pages 140-159, September 2010: 非特許文献２（その全記載は、ここに特に開示として援用される））。
　発明者はラット、モルモット, ウサギの形質細胞の解析を行う過程で、これら動物から得られた形質細胞表面には抗原結合解析が可能な量の膜型抗体分子が発現していることを新たに発見した。これにより形質細胞表面に発現する高親和性膜型抗体に標識抗原を直接結合させることで、抗原特異的形質細胞を同定できる可能性が考えられた。しかし形質細胞膜上に発現する抗体分子の量は少なく、このためたとえ標識抗原に特異的に結合した形質細胞が存在しても、標識抗原の非特異的吸着によるノイズのため抗原特異的形質細胞を同定することは困難であった。
　発明者は、小胞体特異的な蛍光色素を用いることで効率よく形質細胞を同定する方法として「形質細胞同定及び単離用蛍光プローブ並びにこのプローブを用いた形質細胞の同定または単離方法」を開発し、特許出願した［ＷＯ２０１１／１１８５７９（その全記載は、ここに特に開示として援用される）]。
　発明者は、免疫動物から調製した細胞懸濁溶液に、蛍光標識抗原と小胞体親和性蛍光色素を作用させるだけの単純な操作で、抗原特異的形質細胞を同定することができることを見出して本発明を完成させた。
　本発明は以下の通りである。
[1]
非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、
免疫成立後の非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、
前記感作させた、または採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞と、(1)標識した目的抗原、および(2)形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質とを混合し、
前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することを含む、
目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択する方法。
[2]
ヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または目的抗原に対する抗体を有するヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、
前記感作させた、または採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞と、(1)標識した目的抗原と(2)形質細胞および／または形質芽細胞を選択的に結合する標識物質を混合し、
前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することを含む、
目的抗原に特異的に結合するヒトの形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択する方法。
[3]
請求項1または2に記載の方法で目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方の細胞を選択し、
選択した細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、
同定した遺伝子の塩基配列に基づいて前記抗体または抗体の断片を調製する、
ことを含む目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造方法。
[4]
形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質が、細胞の小胞体に対する染色選択性が、小胞体以外の細胞小器官に対する染色選択性に比べて高い蛍光プローブであって、該蛍光プローブによる染色により、形質細胞及び形質芽細胞と形質細胞及び形質芽細胞以外の細胞とを識別可能な、形質細胞及び／又は形質芽細胞の同定又は単離に用いるための蛍光プローブである請求項1～3のいずれか１項に記載の方法。
[5]
(1)両親媒でカチオニックであり、かつ中程度の脂溶性を有する物質、および(2)小胞体局在を示すタンパク質に対して一定以上の親和性を有する物質から成る群から選ばれる請求項4に記載の方法。
[6]
前記両親媒は、両親媒性インデックス（AI）が、+6>AI>0であり、中程度の脂溶性は、疎水性インデックス(logP)が、+6>logP>0であり、一定以上の親和性は、解離定数が0.1μM～0.1nMの範囲である請求項5に記載の方法。
[7]
前記小胞体以外の細胞小器官が、形質膜、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、パーオキソーム、核、中心体、細胞質基質、ファゴソーム、エンドソーム、又はアグリソームである請求項4～6のいずれか１項に記載の方法。
[8]
前記蛍光プローブが、蛍光標識glibenclamide、蛍光標識Brefeldin A、蛍光プローブ、および蛍光タンパク質から成る群から選ばれる請求項4～7のいずれか１項に記載の方法。
[9]
配列表の配列番号1で示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域の遺伝子または配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子。
[10]
配列表の配列番号2で示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域の遺伝子または配列表の配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子。
[11]
配列表の配列番号3で示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域の遺伝子または配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子。
[12]
配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域のペプチド。
[13]
配列表の配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域のペプチド。
[14]
配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域のペプチド。
[15]
配列表の配列番号7～18のいずれかで示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域の遺伝子または配列番号19～30及び89～91のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチドをコードする遺伝子。
[16]
配列表の配列番号31～42のいずれかで示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域の遺伝子または配列番号43～54及び86～88のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチドをコードする遺伝子。
[17]
配列番号19～30及び89～91のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチド。
[18]
配列番号43～54及び86～88のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチド。
[19]
可変領域として配列番号19～30及び89～91のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、かつ定常領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖を有する、ヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
[20]
可変領域として配列番号43～54及び86～88のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、かつ定常領域として配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、ヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
[21]
下記κ鎖CDR1、κ鎖CDR2及びκ鎖CDR3のいずれか1つずつの組合せを含むκ鎖または下記γ鎖CDR1、γ鎖CDR2及びγ鎖CDR3のいずれか1つずつの組合せを含むγ鎖を含むヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　本発明を用いることで、幅広い動物種から抗原特異的モノクローナル抗体を迅速に産生することができるため、既存の技術では作製が困難であった標的分子に対する抗体医薬品の開発に新たな可能性を与えるものである。
実施例１の結果を示す。腸骨リンパ節由来ラットリンパ球を、抗ラットIgG抗体（緑、左図）並びにER-trackerを用いて細胞表面抗体並びに小胞体を染色し蛍光顕微鏡にて観察した写真である。ER-tracker強陽性の形質細胞表面にIgGの発現が観察された（矢印）。 実施例１の結果を示す。腸骨リンパ節由来ラットリンパ球を標識GFP並びにER-trackerを用いて染色し、セルソーターを用いて分離した結果である。Ａは、GFP(縦軸)とER-tracker(横軸)の蛍光強度による腸骨リンパ節由来ラットリンパ球の二次元分析図である。GFP陽性でER-tracker陽性領域（High）を抗原特異的形質細胞画分、GFP陰性でER-tracker陽性領域（Low）を非特異的形質細胞画分として示した。Ｂは、抗原特異的形質細胞画分より分収された細胞を固定後膜可溶化処理を行い、これにFITC標識抗ラットIgG抗体を作用させ細胞内IgGを染色した蛍光顕微鏡写真を示す。分収された細胞は、形質細胞の特徴である細胞内免疫グロブリンを発現していた。 実施例１の結果を示す。セルソーターで分離された細胞からcDNAを合成し、これを鋳型として5'-RACE PCR法によりラットγ鎖及びκ鎖可変領域遺伝子を増幅した（図上部K chain, G chain）。増幅された可変領域を線状化発現ベクターに組み込み、ラットγ鎖及びκ鎖免疫グロブリン発現ユニットを作製した。増幅されたDNAのアガロース電気泳動の結果を示した（図下部K expression unit, G expression unit）。 実施例１の結果を示す。抗原特異的形質細胞 (High)、及び非特異的形質細胞（total）から得られた組換え抗体のGFP結合能をＥＬＩＳＡ法にて決定した結果である。縦軸は抗体1ngあたりのGFP結合量を示す。1から12が抗原特異的形質細胞画分より調製された組換え抗体、１３から２４が非特異的形質細胞画分より調製された組換え抗体、２５は陰性コントロールである。 実施例２の結果を示す。腸骨リンパ節由来モルモットリンパ球を、抗モルモットIgG抗体（緑、左図）並びにER-trackerを用いて細胞表面抗体並びに小胞体を染色し蛍光顕微鏡にて観察した写真である。ER-tracker強陽性の形質細胞表面にIgGの発現が観察された（矢印）。 実施例２の結果を示す。Ａは、モルモット腸骨リンパ節より採取した細胞を蛍光標識ヒトインスリン（縦軸）とER-tracker（横軸）で染色し、これをセルソーターにより分離した際の蛍光強度によるモルモットリンパ球の二次元分析図である。Ｒ１で示された領域の細胞を抗原特異的形質細胞画分とし、シングルセルソーティングを行った。Ｂは、抗原特異的形質細胞画分から得られた細胞を固定、膜可溶化処理を行い、これにFITC標識抗モルモットIgG抗体を作用させ細胞内IgGを染色した（緑）。また小胞体を小胞体親和性蛍光色素ER-ID Redを用いて染色した（赤）。細胞核はHechst33342を用いて染色した（青）。分収された細胞は、形質細胞の特徴である細胞内免疫グロブリン（緑）、発達した小胞体（赤）並びに細胞の一方に偏った核を有していた。 実施例２の結果を示す。抗原特異的形質細胞画分から単離された個々の形質細胞からγ及びκ鎖可変領域遺伝子断片を増幅した。典型的な増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動写真を示す。Ｇはモルモットγ可変領域遺伝子断片、Ｋはκ鎖可変領域遺伝子断片を示す。 実施例２の結果を示す。モルモットγ及びκ鎖可変領域遺伝子断片をそれぞれの連結用二本鎖ＤＮＡ断片に結合させることで得られた、線状化γ鎖及びκ鎖発現ユニットの１％アガロースゲル電気泳動写真を示す。Gは線状化γ鎖発現ユニット、Ｋはκ鎖発現ユニットを示す。 実施例２の結果を示す。線状化γ鎖及びκ鎖またはλ鎖発現ユニットを293FT細胞に導入することで培地中に分泌された組換え抗体のヒトインスリンに対する結合を示した。横軸は組換え抗体1μgあたりのヒトインスリン結合能を示す。 実施例３の結果を示す。卵白アルブミン陽性でER-tracker強陽の細胞群が存在したことを示す結果である。 実施例３の結果を示す。プライマー（エ）とプライマー（ネ）を用いウサギ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った結果である。 実施例３の結果を示す。アガロースゲル電気泳動法にてκ及びγ鎖免疫グロブリン遺伝子断片の発現ユニットへの変換を確認した結果である。 実施例３の結果を示す。抗原特異的形質細胞及び非特異的形質細胞より得られた組換えウサギモノクローナル抗体の抗原結合能についてＥＬＩＳＡ法を用いて調べた結果である。
［目的抗原に特異的に結合する形質細胞、形質芽細胞の選択方法］
　本発明の第１の態様は、目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択する方法である。
　本発明の第１の態様は、非ヒト動物を対象とする方法（以下ＮＨＡ法と呼ぶ）とヒトを対象とする方法（以下ＨＵ法と呼ぶ）の２つの方法に分けられる。非ヒト動物を対象とするＮＨＡ法は、
非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、
免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、
前記感作させた、または採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞と、(1)標識した目的抗原および(2)形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質とを混合し、
前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することを含む。
ＮＨＡ法により、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択することができる。
　ヒトを対象とするＨＵ法は、
ヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または目的抗原に対する抗体を有するヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、
前記感作させた、または採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞と、(1)標識した目的抗原、および(2)形質細胞および／または形質芽細胞を選択的に結合する標識物質を混合し、
前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することを含む。
ＨＵ法により、目的抗原に特異的に結合するヒトの形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択することができる。
　以下、ＮＨＡ法について説明する。
＜非ヒト動物の目的抗原での免疫＞
　非ヒト動物を目的抗原で免疫する。
　本発明において「非ヒト動物」とは、ヒト以外の免疫系を有する全ての動物を意味する。そのような動物の例としては、哺乳動物、鳥類などを挙げることができる。哺乳動物の例としては、類人猿、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ラマ、アルパカ、トナカイ、スイギュウ、ヤク、モルモット、ウサギ、ミンク、マウス、ラット、スナネズミ、ハムスター、ゴールデンハムスター、アルメニアンハムスター、フェレット、ミニブタ、アライグマ、フクロネズミ、スンクス、カンガルー、イルカなどを挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ、ウズラまたはダチョウなどを挙げることができる。
　本発明において「目的抗原」とは、ウイルス、マイコプラズマ、細菌、カビ等の微生物、貝類等の冠輪動物、昆虫や甲殻類等の脱皮動物、脊椎動物等の新口動物及びこれらの構成物質、蛋白質、糖、脂質、複合糖質、核酸、天然低分子有機化合物、天然高分子有機化合物、人工低分子有機化合物、人工高分子有機化合物、金属錯体などである。但し、目的抗原の種類を限定する意図ではなく、これらはあくまでも例示である。
　非ヒト動物の免疫に用いる目的抗原は、目的抗原をそのまま用いることもできるが、目的抗原を含む生物等をそのまま、あるいは死滅させた状態あるいはその抽出液として用いることもでき、あるいは、適当な担体結合または混合して用いることもできる。
　非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させる。リンパ液等に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏでの目的抗原による感作は、以下のように実施できる。非ヒト動物より抗原提示細胞である樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞を採取する。次に試験管中で抗原を樹状細胞に作用させ貪食・消化させ、抗原の提示能力を備えるようになった成熟樹状細胞を作製する。これにＴ細胞並びにＢ細胞とインターロイキン２等のサイトカインやpoly(dI-dC)等の免疫刺激剤を加え、抗原に対し応答するＢ細胞を試験管内で増殖・分化させ、最終的に抗体産生細胞である形質細胞および形質芽細胞を得る。
　本発明において「非ヒト動物を目的抗原で免疫する」とは、非ヒト動物に目的抗原を接触させて、非ヒト動物において、目的抗原に対する免疫を発現させることを意味する。目的抗原に対する免疫の発現方法は特に制限されるものではないが、例えば、非ヒト動物に目的抗原を投与または移植することで非ヒト動物を免疫することができる。目的抗原の投与方法や移植方法にも特に制限はないが、投与方法としては、例えば、経気投与、経口投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、あるいは非ヒト動物への遺伝子導入により抗原を動物体内で発現させる方法などを挙げることができる。あるいは、非ヒト動物の皮膚に目的抗原を接触させることでも非ヒト動物を免疫することができる。
　非ヒト動物の目的抗原での免疫は、目的抗原による免疫が非ヒト動物において成立するまで行う。従って、非ヒト動物は、目的抗原による免疫が成立するまで、目的抗原を接触させる。目的抗原の非ヒト動物への接触の頻度、期間、一回の接触に使用される目的抗原の量は、免疫成立の容易さに応じて適宜決定できる。非ヒト動物において、目的抗原による免疫が成立しているか否かは、常法、例えば、非ヒト動物より血液を採取し血清中に含まれる抗体をELISA法により測定することにより確認することができる。
＜免疫成立後の動物からのリンパ節等の採取＞
　免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取する。本発明の目的は、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択することであるので、形質細胞および／または形質芽細胞を含む可能性が高い、リンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取する。
　形質細胞および形質芽細胞は、Ｂリンパ球が最終分化したもので、抗体産生に特化した細胞である。アフィニティーマチュレーションと呼ばれる抗体遺伝子の体細胞突然変異と抗原による選択が既に行われているため、結合能の高い抗体単離にこれらの細胞は特に有用である。しかし、形質細胞および形質芽細胞はいくつかのサブセットからなる不均一な細胞集団であり、リンパ組織内の存在率は0.1％以下と少ないことから、高純度の単離は難しい。従来の方法では、末梢血やリンパ節より形質細胞および形質芽細胞を同定・単離するには、最低でも３種類以上の細胞表面マーカーに対する抗体を組み合わせた数段階のポジティブ・ネガティブ選別操作が必要であった(Sanderson, R. D., Lalor, P., Bernfield, M. B lymphocytes express and lose syndecan at specific stages of differentiation: Cell Regulation 1: 27-35(1989):非特許文献1（その全記載は、ここに特に開示として援用される）)。
　リンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄は、例えば、以下のように調製することができる。皮下、筋肉又はフットパッドに抗原を注射し約１ヶ月以上経過した非ヒト動物より、腫脹したリンパ液、リンパ組織を外科的に取り出す。リンパ節に付随した組織を実体顕微鏡下で取り除いた後、ピンセットを用いリンパ節の皮膜を破ることでリンパ節内部の細胞をPBS溶液（10mM phosphate buffer、120mM NaCl、2.7mM KCl、pH 7.6）中に分散させる。血球試料は、免疫動物からヘパリン採血によって得られた血液を密度勾配遠心法により分離された単核球を用いる。骨髄は、免疫動物より取り出された大腿骨の両骨末端を切断し、一方の骨末端に挿入した注射針からPBS溶液を骨髄に流入させることで、他方の骨末端から流出させた骨髄細胞を用いる。
＜細胞の選択＞
　採取したリンパ節から、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択する。この選択を行うために、(1)標識した目的抗原、および(2)形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質を用いる。
(1)標識した目的抗原
　標識した目的抗原とは、非ヒト動物の免疫に用いた目的抗原と同一のエピトープを含む物質である。従って、標識した目的抗原と免疫に用いた目的抗原とは、全く同一の物質であることもできるし、共通するエピトープを含む別の物質であることもできる。
　目的抗原の標識に用いる物質は特に制限はない。標識した目的抗原が結合した形質細胞および／または形質芽細胞を選択できる標識であればよい。そのような標識としては、例えば、蛍光標識、磁気ビーズ標識などを挙げることができる。蛍光標識の種類には特に制限はない。但し、形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質とは、標識として区別できるものであることが、目的抗原並びに形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質が結合した細胞を、目的抗原のみに結合した細胞、並びに形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質のみに結合した細胞とから区別できるものであればよい。
(2)形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質
　形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質としては、例えば、以下に説明する蛍光プローブ1を挙げることができる。
<蛍光プローブ1>
　蛍光プローブ１は、形質細胞並びに形質芽細胞の同定または単離に用いるための蛍光プローブであって、細胞の小胞体に対する親和性が、他の小器官に対する親和性に比べて高い、換言すると、細胞の小胞体を選択的に染色する蛍光プローブである。形質細胞並びに形質芽細胞は、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞に比べて、小胞体が異常に発達しており、その結果、蛍光プローブ１での染色により得られる蛍光強度は、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞が蛍光プローブ１で染色された場合の蛍光強度に比べて、形質細胞並びに形質芽細胞と形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞とを識別可能な程度の差を示す。蛍光プローブ１が示す、上記蛍光強度比（形質細胞並びに形質芽細胞の蛍光強度／形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の蛍光強度）は、例えば、３倍以上である。
　形質細胞並びに形質芽細胞の小胞体と形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の小胞体とでは、蛍光プローブ１に対する親和性に大きな違いはないが、小胞体の発達の程度の違いにより上記蛍光強度の相違を生じる。その結果、上記蛍光強度比に基づいて、蛍光プローブ1による染色により、形質細胞並びに形質芽細胞と形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞とを識別することができる。
　蛍光プローブ１で染色することで、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞が共存する形質細胞並びに形質芽細胞を、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞からの蛍光強度と形質細胞並びに形質芽細胞からの蛍光強度の強弱の違いで両者を識別可能である。そのため、蛍光プローブ１で染色することで、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞が共存する細胞群の中から、形質細胞並びに形質芽細胞を容易に同定でき、かつ同定した形質細胞並びに形質芽細胞を採取することで、形質細胞並びに形質芽細胞を多く含む細胞群を得ることかできる。
　蛍光プローブ１は、染色された形質細胞並びに形質芽細胞からの蛍光強度が、染色された形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞からの蛍光強度の３倍以上であれば、両者の識別が可能であり、識別を容易にするという観点からは、好ましくは４倍以上、さらに好ましくは５倍以上のものである。但し、この蛍光強度比は、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の種類によって小胞体の発達の程度が異なるので、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の種類が異なると変化する。前記蛍光強度比が高いほど、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞を含む細胞群の中から形質細胞並びに形質芽細胞をより効率よく同定できる。形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞としては、例えば、赤血球、血小板、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、好酸球、マクロファージ等を挙げることができる。
　本発明において、蛍光プローブ1を用いた形質細胞並びに形質芽細胞と形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞との判別は以下のように行うことができる。蛍光プローブ1を細胞懸濁液に加え37℃にて30分間染色を行う。染色に適した蛍光プローブ1の濃度は、蛍光プローブ1の種類により異なるが、例えば、100nM～1μMである。染色後、細胞をＰＢＳにて洗浄する。洗浄した細胞は、例えば、(1)蛍光顕微鏡を用いて細胞における蛍光プローブの局在を観察すること、または(2)細胞から発せられる蛍光の強度に基づいて、形質細胞並びに形質芽細胞であるか、または形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞であるかを判別できる。形質細胞並びに形質芽細胞と形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞との判別方法については、形質細胞並びに形質芽細胞同定・分離方法において詳述する。
　さらに上記形質細胞並びに形質芽細胞と形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞との判別方法を応用して、形質細胞並びに形質芽細胞の小胞体及び形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の小胞体に対する染色選択性が未知の物質から蛍光プローブ1として利用可能な物質をスクリーニングすることもできる。細胞の小胞体に対する染色選択性が高い、本発明の蛍光プローブ1として適した蛍光プローブのスクリーニングは、後述する、小胞体に局在するタンパク質の免疫染色（形質細胞並びに形質芽細胞では免疫グロブリン）や、小胞体移行性の組換え蛍光タンパク質を培養細胞で発現させることで、細胞の小胞体を同定する方法を利用した、細胞全体の蛍光強度Aと小胞体からの蛍光強度Bの割合(B/A)を求める方法を利用して行うことができる。
　蛍光プローブ1として利用可能な物質をスクリーニングする方法においては、形質細胞並びに形質芽細胞のみを用いても、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞のみを用いても実施できる。但し、形質細胞並びに形質芽細胞は小胞体が発達しており、染色により高い蛍光強度が得られることから、形質細胞並びに形質芽細胞を用いる方が、細胞の小胞体に対する物質の染色選択性の評価はより容易である。しかし、形質細胞並びに形質芽細胞の入手は容易でないことから、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞を用いて小胞体への染色性(染色力)を評価して、蛍光プローブ1として利用可能な物質をスクリーニングすることもできる。例えば、一般的な培養細胞（例えばHela細胞）を用いた染色実験において、上記細胞全体の蛍光強度Aと小胞体からの蛍光強度Bの割合(B/A)を求めることで、蛍光プローブ1として利用可能な物質をスクリーニングすることができる。但し、細胞として形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞を用いる場合には、閾値とすべきB/Aの値を、細胞における小胞体の発達の程度に応じて、形質細胞並びに形質芽細胞を用いるスクリーニング法で採用する閾値としてのB/Aの値よりは、低い値、例えば、50%程度に適宜設定することが適当である。
　形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の例としては、赤血球、血小板、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球等を他の細胞として挙げることができる。さらに、上記方法でのスクリーニングには、形質細胞並びに形質芽細胞の代わりに、ハイブリドーマ細胞、形質細胞並びに形質芽細胞腫瘍細胞、または多発性骨髄腫細胞を用いることもできる。これは、ハイブリドーマ細胞、形質細胞並びに形質芽細胞腫瘍細胞、および多発性骨髄腫細胞も、免疫グロブリンを産生するため小胞体が発達しており、このため染色により高い蛍光強度が得られ、細胞の小胞体に対する物質の染色選択性の評価がより容易であるためである。
　形質細胞並びに形質芽細胞および形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の小胞体に対する染色選択性が高い蛍光プローブ1は、物質の例としては、(1)両親媒でカチオニックであり、かつ中程度の脂溶性を有する物質、および(2)小胞体局在を示すタンパク質に対して一定以上の親和性を有する物質を挙げることができる。このような(1)または(2)の性質を有する物質は、形質細胞並びに形質芽細胞の小胞体に対する染色性および形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞の小胞体に対する染色性の両方が、細胞のその他の小器官に対する染色性に比べて高くなる。
　上記(1)における「両親媒でカチオニックである」とは、具体的には、両親媒性インデックス（AI）が、例えば、+6>AI>0であることを意味する。ただし両親媒性インデックスは分子の脂溶性ドメインの見かけ上のlogP値を算出することで得られた値である。具体的には、Hansch らのフラグメント値に基づき、炭素鎖の長さとその位置関係と陽イオン性の４級アンモニウム基の極性効果を考慮し、Morrallらのモデルに従って算出された値である。[Hansch C, Leo AJ. Exploring QSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, p.160, American Chemical Society: Washington, DC, 1995.，Morrall SW, Herzog RR, Kloepper-Sams P, Rosen MJ. Octanol/water partitioning of surfactants and its relevance to toxicity and environmental behavior. Proc 4th World Surfactants Congress,vol. 3. AEPSAT: Barcelona, 1996; 220-227.
　上記(1)における「中程度の脂溶性」とは、疎水性インデックス(logP)が、例えば、+6＞logP＞0であることを意味する。疎水性インデックスは、Hansch らのフラグメント推算法により算出された分子全体の疎水性値である。具体的には、AIで示された疎水基にこれに付随した構造の影響を加算したものである。
　上記(2)における「小胞体局在を示すタンパク質に対して一定以上の親和性を有する」とは、具体的には解離定数が0.1μMから0.1nMの親和性を有することを意味する。小胞体局在を示すタンパク質に対して一定以上の親和性を有する物質も、細胞の小胞体を選択的に染色する蛍光プローブである。
　(1)両親媒でカチオニックであり、かつ中程度の脂溶性を有する物質の例としては、下記A、BまたはCで示される化合物を挙げられる。
　式Aで示される化合物は、DiOC6(3) (3、3'-dihexyloxacarbocyanine iodide)であり、低濃度ではミトコンドリアに集積するが、高濃度では小胞体に集積する。式Bで示される化合物は、rhodamine B hexyl esterであり、低濃度ではミトコンドリアに集積するが、高濃度では小胞体に集積する。式Cで示される化合物は、 ER-Tracker Blue white DPXであり、主に小胞体に集積し、高濃度ではゴルジ体も染色する。実施例で使用した蛍光プローブである。これらA、BまたはCで示される化合物はいずれも両親媒でカチオニック、中程度の脂溶性を有する（参考文献、Why fluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimental and QSAR-modeling studyを参照）。
　Aで示される化合物の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ4.5と4.4であり、１価の陽イオンを有する。Bで示される化合物の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ4.8と5.9であり、１価の陽イオンを有する。Cで示される化合物の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ5.1と0.7であり、１価の陽イオンを有する。Cで示される化合物は、実施例で示すように、形質細胞並びに形質芽細胞を染色した場合の蛍光強度が、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞を染色した場合の蛍光強度の4倍以上である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　色素（Ｄｙｅ）１、５、７及び１０は、両親媒でカチオニックであり、かつ中程度の脂溶性を有する物質であり、蛍光プローブ1の例である。これらの色素は、米国出願公開ＵＳ２０１０／００６８７５２Ａ１（その全記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の色素である。これらの色素は、上記米国出願公開の記載に基づいて合成できる他、一部は市販されている。色素（Ｄｙｅ）１の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ4.95と3.77であり、１価の陽イオンを有する。色素（Ｄｙｅ）５の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ5.11と4.32であり、１価の陽イオンを有する。色素（Ｄｙｅ）７の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ4.19と3.29であり、１価の陽イオンを有する。色素（Ｄｙｅ）１０の両親媒性インデックス（AI）および疎水性インデックスは、それぞれ4.25と5.71であり、１価の陽イオンを有する。色素（Ｄｙｅ）１、５、７及び１０の疎水性インデックスは、CompuDrug社の計算ソフトPallasを用い、2種の独立したlogP算出指標（ logP(annlogp) 、logP(atomic6) ）に、実測値との一致性を高めるための係数を掛けた数値の和であるlogP(combined) = 0.863 × logP(annlogp) + 0.137 × logP(atomic6)の値として算出した。両親媒性インデックスは、logP(annlogp)の値からリン酸基 (P-0)を除いたものとして算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　(2)小胞体局在を示すタンパク質に対して一定以上の親和性を有する物質の例としては、例えば、蛍光標識glibenclamide、および蛍光標識Brefeldin Aを挙げることができる。
　glibenclamideは、下記式で示される化合物であり、商品名：ER-Tracker(登録商標) Green (BODIPY(R) FL glibenclamide、 ER-Tracker(登録商標) Red、(BODIPY(R) TR glibenclamideは、glibenclamideに蛍光色素（BODIPY）を結合させた化合物として市販されている。glibenclamide化合物は、小胞体に多いsulphonylurea receptors of ATP-sensitive K+ channelsに結合し、その作用を阻害することか知られており、糖尿病治療薬として用いられている。glibenclamideのATP-感受性 K+ channelへの解離定数は0.1～3.6nMである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　Brefeldin Aは、下記式で示される化合物であり、商品名：BODIPY-brefeldin AはBrefeldin Aに蛍光色素（BODIPY）が結合された化合物として市販されている。Brefeldin Aは、小胞体からゴルジ体への小胞輸送に働くGTP-exchanging factorであるArf1タンパク質の機能阻害を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　リンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄に対する蛍光プローブ1の添加量は、検出器の感度、細胞懸濁液の組成、染色時間等を考慮して適宜決定できるが、例えば、ER-Tracker Blue white DPXの場合 100nM～1μMの範囲であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。
＜(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞の選択＞
　(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞の選択は、目的抗原の標識および形質細胞および／または形質芽細胞に特異的に結合する標識物質の種類に応じて、適宜選択することができる。目的抗原の標識および形質細胞および／または形質芽細胞に特異的に結合する標識物質のいずれもが蛍光標識（例えば、蛍光色素）の場合には、これら標識が発する蛍光を利用して、(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することができる。(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞の選択方法やこの方法に用いる装置には特に制限はない。既存の細胞を個々の細胞レベルで分離する方法も装置をそのまま利用できる。
　蛍光プローブ1を用いて染色を施したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄は、蛍光に基づいて形質細胞並びに形質芽細胞(または形質細胞並びに形質芽細胞の可能性が高い細胞)を同定する。形質細胞並びに形質芽細胞を同定する方法には、前述のように、(1)染色を施した細胞における蛍光プローブの局在を蛍光顕微鏡下で観察する方法と、(2) 染色を施した細胞から発せられる蛍光強度に基づく方法がある。
　(1)蛍光顕微鏡を用いて細胞における蛍光プローブの局在を観察する方法は、細胞に含まれる小胞体の領域が強染色されている(即ち、強い蛍光を発している)が、観察対象である1つの細胞について、強染色されている小胞体の領域の面積的な割合が約65％以上である細胞を形質細胞並びに形質芽細胞と同定できる。また、面積的な割合ではなく、その1つの細胞について、その細胞全体の蛍光強度を100％としたときに、小胞体からの蛍光強度の割合が約65％以上である細胞を形質細胞並びに形質芽細胞と同定することもできる。形質細胞並びに形質芽細胞の場合、一つの細胞全体からの蛍光強度のうち小胞体の占める蛍光強度が約65％であり、他の細胞小器官（ミトコンドリア、ゴルジ体、形質膜等）に35％蛍光色素が移行する。
　細胞全体の蛍光強度と小胞体からの蛍光強度の割合は、小胞体に局在するタンパク質の免疫染色（形質細胞並びに形質芽細胞では免疫グロブリン）や、小胞体移行性の組換え蛍光タンパク質を培養細胞で発現させることで、細胞の小胞体を同定する方法を利用して、以下のように求めることができる。
　例えば293細胞を用い組換え蛍光タンパク質（赤）を培養細胞で発現させ、この細胞を蛍光プローブ1（例えばER-Tracker Blue White）で染色する。蛍光顕微鏡の画像解析装置を用い、細胞全体に占める蛍光プローブ1の蛍光強度を計測してＡと表示し、及び組換え蛍光タンパク質（赤）で染色されている領域内（小胞体）の蛍光プローブ1の蛍光強度を計測してＢと表示する。蛍光強度Ｂは小胞体に局在する蛍光プローブ1の量に相当する。そのため、1つの細胞全体からの蛍光強度Aに対するその細胞の小胞体からの蛍光強度Bの割合は、B/A x 100（%）として表示できる。実施例における結果では、形質細胞並びに形質芽細胞では、1つの細胞全体に占めるER-tracker Blue/whiteの強度Ａ、及び免疫グロブリン（緑）で染色されている領域内（小胞体）のER-tracker Blue/whiteの蛍光強度Ｂを計測したところ、B/A x 100の値が65％以上となった。
　(2)蛍光強度に基づく形質細胞並びに形質芽細胞の同定は、例えば、蛍光スキャナー、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、セルソーター等により実施できる。蛍光プローブ1は、前述のように形質細胞並びに形質芽細胞で得られる蛍光強度が形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞で得られる蛍光強度に比べ、例えば、3倍以上、好ましくは4倍以上、さらに好ましくは5倍以上高い。そのため、蛍光プローブ1に染色された細胞から形質細胞並びに形質芽細胞の候補を、上記蛍光スキャナー等を用いて蛍光強度に基づいて容易に同定できる。
　形質細胞並びに形質芽細胞の候補として選択する基準としての蛍光強度比(形質細胞並びに形質芽細胞／形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞)を高く設定すればそれだけ、形質細胞並びに形質芽細胞の候補に含まれる真の形質細胞並びに形質芽細胞の比率は高まる。しかし、形質細胞並びに形質芽細胞以外の細胞に比べれば高い蛍光強度を示すが、基準としての蛍光強度比未満の比較的低い蛍光強度しか示さない形質細胞並びに形質芽細胞について、排除される可能性がある。従って、試料とするリンパ液、リンパ組織または血球試料に含まれる形質細胞並びに形質芽細胞の特質、特に小胞体の発達の程度を考慮して、形質細胞並びに形質芽細胞の候補として選択する基準としての蛍光強度比を選択することが好ましい。
　本発明の方法は、上記方法で同定された形質細胞並びに形質芽細胞の候補をさらに採取(分取)することが好ましい。同定された細胞の採取は、例えば、セルソーターによる分取により行うことができる。蛍光に基づく形質細胞並びに形質芽細胞の同定と蛍光に基づいて形質細胞並びに形質芽細胞(または形質細胞並びに形質芽細胞の可能性が高い)と同定または判断された形質細胞並びに形質芽細胞の候補は、セルソーターにより分取される。
　細胞の選択は、細胞を複数の細胞の集団として選択し、分離することもできるが、好ましくは、細胞を１つ１つ個別に選択し、分離する。ここで選択される細胞はいずれも目的抗原に対する結合性を有する細胞であるが、各細胞が有する目的抗原に対する抗体は、必ずしも同一ではなく、各抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列は異なることが予想される。従って、細胞を１つ１つ個別に選択し、分離し、後述する目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造方法に、それぞれの細胞を１つずつ適用することで、同一の目的抗原に対して特異的に結合する、異なるモノクローナル抗体を得ることが可能になる。
　この方法で選択された細胞は、目的抗原に対して結合性を示すものであり、かつ形質細胞および／形質芽細胞である可能性が高い細胞であり、この方法により、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択することができる。
　次に、ヒトを対象とするＨＵ法について説明する。ＨＵ法は、ヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または細胞を選択するための試料として、目的抗原に対する抗体を有するヒトから提供を受けたリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を用いる。採取したリンパ液等の目的抗原によるｉｎ　ｖｉｔｒｏでの感作は、前述と同様の方法で行うことができる。即ち、ヒトより抗原提示細胞である樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞を採取する。次に試験管中で抗原を樹状細胞に作用させ貪食・消化させ、抗原の提示能力を備えるようになった成熟樹状細胞を作製する。これにＴ細胞並びにＢ細胞とインターロイキン２等のサイトカインやpoly(dI-dC)等の免疫刺激剤を加え、抗原に対し応答するＢ細胞を試験管内で増殖・分化させ、最終的に抗体産生細胞である形質細胞および形質芽細胞を得る。
　抗体を有するヒトから提供を受けたリンパ液等については、より具体的には、目的抗原に対する抗体を有するヒトから提供を受けた血液、または病気の治療等の目的により手術で切除されたリンパ節等を用いる。さらに具体的には、目的抗原に対する抗体を有するヒトから提供を受けた血液または組織から血球またはリンパ球を分離し、これと、(1)標識した目的抗原、および(2)形質細胞および／または形質芽細胞を選択的に結合する標識物質を混合する。免疫に用いる目的抗原、(1)標識した目的抗原および(2)形質細胞および／または形質芽細胞を選択的に結合する標識物質は、ＮＨＡ法と同様である。さらに、(1)標識した目的抗原および(2)形質細胞および／または形質芽細胞を選択的に結合する標識物質に結合した細胞の選択についても、ＮＨＡ法と同様である。
　ＨＵ法では、目的抗原に対する抗体を有するヒトから提供を受けた試料を用いるため、目的抗原に特異的に結合するヒトの形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択することができる。
［目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造方法］
　本発明の第２の態様は、目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造方法である。
　この方法は、上記本発明の方法で目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方の細胞を選択し、
選択した細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、
同定した遺伝子の塩基配列に基づいて前記抗体または抗体の断片を調製する、
ことを含む方法である。この方法により、目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造することができる。
　上記本発明の方法での、目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方の細胞の選択方法は、上述の通りである。
＜抗体遺伝子の塩基配列同定＞
　選択した細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定する。選択した細胞は、目的抗原に対する結合性を示す細胞であり、かつ形質細胞または形質芽細胞である。本発明では、これら選択した細胞の複数からなる集団で扱って、抗体遺伝子の採取と同定を行うこともできるが、好ましくは、個々の細胞について、それぞれ抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定する。これにより、同一の目的抗原に対して特異的に結合する、異なるモノクローナル抗体を得ることが可能になる。
　選択した細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定する方法は既知の方法を利用できる。
　目的抗原に対する抗体遺伝子の採取及び採取した抗体遺伝子からｃＤＮＡを合成する方法は、例えば、ＷＯ２００９／０９１０４８（ＵＳ２０１１／００２０８７９Ａ１（その全記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の方法を利用して行うことができる。さらに、合成したｃＤＮＡをクローニングする方法は、例えば、ＷＯ２００９／１１０６０６、ＵＳ２０１１／０１１７６０９Ａ１（その全記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の相同組換方法を利用したクローニング方法で行うことができる。さらに、合成したｃＤＮＡの塩基配列の同定は、公知のＤＮＡの塩基配列決定方法を用いて実施できる。ｃＤＮＡの塩基配列を同定することで、目的抗原に対する抗体遺伝子を同定することができる。
[方法]
　ＷＯ２００９／０９１０４８に記載の方法は、基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有し、かつ前記基板表面の少なくとも前記液滴を保持する面は、純水に対する接触角が90～150°の範囲である反応治具を用い、磁気ビーズに固定化した物質を、上記突起状囲いの液滴保持用空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中で、前記基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させることにより、反応及び/または洗浄を行うことを含む、反応方法である。この反応方法において磁気ビーズに固定化した物質として、選択した細胞中のmRNAと結合性を有する、例えば、オリゴdTを用いることで、実施できる。
　さらに、ｃＤＮＡの合成方法は、上記反応治具であって、１つの縦列に、少なくとも２つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、前記２つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及びｃＤＮＡ合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、磁気ビーズに固定化したｍＲＮＡを、前記２つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、磁気ビーズに固定化したｃＤＮＡを得ることができる。
　上記ｃＤＮＡの合成方法は、例えば、１つの縦列に、少なくとも４つの突起状囲いが設けられた反応治具を用いることで実施できる。前記４つの突起状囲い(例えば、ハの字型突起)の空間には、細胞溶解用溶液、ｍＲＮＡ洗浄用溶液、ｃＤＮＡ合成用溶液及びｃＤＮＡ洗浄用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、磁気ビーズに固定化したｍＲＮＡを、前記４つの突起状囲いの空間に保持された溶液に、順次、基板の突起を設けたとは反対側の表面から磁石を用いて、移動させる。それによって、磁気ビーズに固定化したｃＤＮＡを得る。
　ｃＤＮＡの合成方法に用いる反応治具のハの字型突起の空間の容量は、例えば、0.5～１００μＬの範囲とすることが適当である。
　第１のハの字型突起の空間に保持される細胞溶解用溶液は、例えば、100mM Tris HCl (pH7.5), 500ｍＭ LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitolを含む全量3μＬの溶液であることができる。
　第２のハの字型突起の空間に保持されるｍＲＮＡ洗浄用溶液は、10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% ドデシル硫酸リチウムを含む全量3μＬの溶液であることができる。
　第３のハの字型突起の空間に保持される逆転写反応用洗浄溶液は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitorを含む全量3μＬの溶液であることができる。
第４のハの字型突起の空間に保持される逆転写反応溶液は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 8 unit SuperScript III Reverse transcriptaseを含む全量3μＬの溶液であることができる。
　但し、これらは例示であって、これらの溶液に限定される意図ではない。
　磁気ビーズに固定化したｍＲＮＡを用意する。ｍＲＮＡの種類や長さ等には特に制限はない。種々の生物由来のｍＲＮＡを用いることができる。磁気ビーズとしては、例えば、粒子系2.8μm, oligo dT25が表面に共有結合されたものを用いることができる。ｍＲＮＡの磁気ビーズへの固定化は以下のように実施できる。
　細胞溶解用溶液に磁気ビーズを濃度10mg/mlになるように懸濁し、これに細胞1から100個を加える。上記の操作により、細胞内のmRNAはそのpolyAテールを介して磁気ビーズ上に固定化されたoligo dT25に結合する。
　基板の突起を設けた表面とは反対側の表面から磁石を用いて、磁気ビーズに固定化したｍＲＮＡを、前記４つのハの字型突起の空間に保持された溶液（液滴）に、順次、移動させる。磁石としては、例えば、小型ネオジム磁石を用いることができる。各液滴中では、反応または洗浄に必要な時間、滞留させる。反応または洗浄に必要な時間は、反応条件、洗浄条件によって異なるが、例えば、1秒～１時間の範囲であることができる。
　上記反応及び洗浄は、常温（室温）で行うことができるが、必要により、温度調節をすることもできる。さらに、液滴の量が少量である場合、溶液中の溶媒が蒸発することもあるので、反応治具を密閉容器に入れ、容器中の湿度を一定に保つことで、溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。容器中の湿度を一定に保つには、水あるいは適当な水溶液を含む容器を上記密閉容器に共存させることができる。
　上記４つのハの字型突起の空間に保持された溶液（液滴）に、順次、磁気ビーズに固定化したｍＲＮＡを滞留及び通過させることで、磁気ビーズに固定化したｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡは、磁気ビーズから切り取ることなく、後の工程に使用することができる。具体的には、得られたｃＤＮＡは、後述のクローニング方法等に供することができる。
　ＷＯ２００９／１１０６０６に記載の相同組換方法を利用したクローニング方法は、相同組換方法として、増幅用プライマー配列P1およびP2を両末端に有する標的遺伝子(抗体遺伝子)の配列を含むPCR産物と、このPCR産物の増幅用プライマー配列P1およびP2に相同的な塩基配列からなる相同組換領域VP1およびVP2を有し、かつ、P1の内側の一部の配列T1に相同的な塩基配列からなる相同組換領域VT1をVP1の末端側に、および／またはP2の内側の一部の配列T2に相同的な塩基配列からなる相同組換領域VT2をVP2の末端側に有する線状化されたべクターを用い(但し、T1およびT2の少なくとも一方は、標的遺伝子に特有の塩基配列を有する)前記PCR産物を相同組換え反応に付して前記ベクターに挿入して、目的とするPCR産物を特異的にベクターへ挿入した組換DNA分子を得ることを含む方法を用いる方法である。前記増幅用プライマー配列P1およびP2を両末端に有する標的遺伝子(抗体遺伝子)の配列を含むPCR産物は前記で得られたｃＤＮＡからＷＯ２００９／１１０６０６に記載の方法で得ることができる。さらに、上記相同組換方法により、目的とするPCR産物を特異的にベクターに挿入した組換DNA分子を調製し、次いで得られた組換DNA分子を持つ組換え体を増幅することで、目的とする抗体遺伝子のクローニングをすることかできる。
　また、増幅された組換DNA分子(組み換えベクター)に含まれる標的遺伝子(抗体遺伝子)は、例えば、制限酵素処理によってベクターから切り出され、必要により精製される。標的遺伝子の分離及び精製は、常法により行うことができる。標的遺伝子の分離及び精製としては、例えば、ゲル抽出やカラム精製等を挙げることができる。分離及び精製された標的遺伝子は、例えば、塩基配列の決定、発現ベクターへ組み込み、標的遺伝子の機能解析などに利用することができる。
＜抗体または抗体の断片の調製＞
　同定した遺伝子の塩基配列に基づいて、抗体または抗体の断片を調製する。
　同定した遺伝子の塩基配列に基づく抗体または抗体の断片の調製は、ＷＯ２０１１／０２７８０８に記載のＤＮＡ断片の特異的作製方法を用いて作製した抗体遺伝子の断片を用いて行うことができる。
　ＷＯ２０１１／０２７８０８に記載の方法は以下のとおりである。
[１]
　標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、(1)～(4)を含む方法。尚、以下において標的遺伝子は、抗体遺伝子である。
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片及び連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、上記連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
連結ＤＮＡ断片の製造方法。
　[１]に記載の製造方法において、具体的には以下を例示できる。
（ａ）前記一方の会合可能な領域を「領域1」とし、他方の会合可能な領域を「領域2」とすると、前記連結ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である。
（ｂ）連結用ＤＮＡ領域が2つの連結用ＤＮＡ領域として配列Ａおよび配列Ｂを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、他方が末端側から配列Ｐ２およびＴ２を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列ＶＰ１およびＶＴ１を有し、他方が末端側から配列ＶＰ２およびＶＴ２を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、配列ＶＰ２およびＶＴ２は、配列Ｐ２およびＴ２とそれぞれ相同的な塩基配列を有する。
（ｃ）前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１－Ｔ１－標的遺伝子－Ｔ２－Ｐ２で表され、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、ＶＴ２－ＶＰ２－配列Ｂ－配列Ａ－ＶＰ１－ＶＴ１で表され、前記連結ＤＮＡ断片は、ＶＴ２－ＶＰ２（Ｔ２－Ｐ２）－配列Ｂ－配列Ａ－ＶＰ１－ＶＴ１（Ｐ１－Ｔ１）－標的遺伝子－ＶＴ２－ＶＰ２（Ｔ２－Ｐ２）－配列Ｂ－配列Ａ－ＶＰ１－ＶＴ１（Ｐ１－Ｔ１）を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＴ２－ＶＰ２（Ｔ２－Ｐ２）は、Ｔ２－Ｐ２と相同的なＶＴ２－ＶＰ２であることを意味し、ＶＰ１－ＶＴ１（Ｐ１－Ｔ１）は、Ｔ１－Ｐ１と相同的なＶＴ１－ＶＰ１であることを意味する。
（ｄ）配列Ｐ２の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＢのＶＰ２と隣接する配列と非相同的な配列であり、配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接すると非相同的な配列である。
（ｅ）前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である。
[２]
　[１]に記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、連結ＤＮＡ断片に含まれる少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを増幅するように、連結ＤＮＡ断片に含まれる異なる連結用ＤＮＡ領域で機能するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを含むＤＮＡ断片を製造することができる。
　[１]の（ｂ）に記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、配列Ａの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むフォワードプライマー、および配列Ｂの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列Ａ、標的遺伝子の配列および配列Ｂが連結されたＤＮＡ断片を得ることを含むＤＮＡ断片を製造する。
[３]
　（ａ）[１]（ｂ）（ｃ）及び[２]（ａ）（ｂ）に記載の製造方法においては、標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片およびポリデオキシヌクレオチドに、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを作用させて、標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片を得ることをさらに含むことができる。（但し、前記標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ｐ１および配列Ｐ２を各末端に有し、前記配列Ｐ１の内側の一部に配列Ｔ１を有し、前記配列Ｐ２の内側の一部に配列Ｔ２を有し、かつ前記配列Ｔ１およびＴ２の一方又は両方は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する。）
（ｂ）前記配列Ｔ１および配列Ｔ２の一方または両方が、標的遺伝子に固有の塩基配列を有するか、または前記配列Ｐ１および配列Ｐ２の一方または両方が、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する。
（ｃ）前記配列Ｐ１およびＰ２は、独立に１０塩基以上である
[４]
　［１］～［３］においては、前記標的遺伝子が抗体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ａを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ１および領域ＶＴ１は、抗体遺伝子に由来するまたは由来しない配列を有することができる。
[５]
　［１］～［３］においては、前記標的遺伝子が抗体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ｂを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ２および領域ＶＴ２は、抗体遺伝子に由来するまたは由来しない配列であることができる。
［６］
　［４］または［５］に記載の方法で製造された連結ＤＮＡ断片を用いて抗体を製造することができる。ここで得られた連結ＤＮＡ断片を用いて、抗体を製造する方法は、例えば、カチオニックリポソーム法などの方法を用いて実施できる。具体的には、上記連結ＤＮＡ断片を293T細胞株などの細胞に導入し、次いで、細胞を培養することで抗体遺伝子を発現させて抗体を製造することができる。
［抗体遺伝子およびペプチド］
　本発明は、上記本発明の方法を用いて新たに得られた、ヒトインスリンに対するモルモット抗体の可変領域および定常領域の遺伝子およびペプチド、さらにはヒトインスリンに対するルモットモノクローナル抗体を包含する。
(1)配列表の配列番号1で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域の遺伝子、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域のペプチド。
(2)配列表の配列番号2で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域の遺伝子、配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域のペプチド。
(3)配列表の配列番号3で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域の遺伝子、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域のペプチド。
(4)配列表の配列番号7～18で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定可変領域の遺伝子、配列番号19～30で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチドをコードする遺伝子及び配列番号19～30で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチド。
(5)配列表の配列番号31～42で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域の遺伝子、配列番号43～54で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチドをコードする遺伝子及び配列番号43～54で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチド。
(6)可変領域として配列番号19～30のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、かつ定常領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖を有する、ヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
(7)可変領域として配列番号43～54のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、かつ定常領域として配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、ヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
(8)下記CDR1、CDR2及びCDR3のいずれか1つずつの組合せを含むκ鎖またはγ鎖を含むヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　上記本発明のヒトインスリンに対するモルモット抗体の可変領域および定常領域の遺伝子およびペプチド、さらにはヒトインスリンに対するルモットモノクローナル抗体は、既知のＤＮＡおよびペプチドの調製方法を用いて、後述する実施例の記載を参照することで調製することができる。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、これらの実施例は例示を目的とするものであって本発明を限定する意図ではない。
実施例１　ラットモノクローナル抗体の作製
[材料と方法]
　免疫動物はウイスター系ラット♀6週齢を用いた。抗原はGFP。免疫は、ラット尾根部の両側にGFP 50μgを一ヶ月おきに3回筋肉注射した。免疫成立後、ラットより腸骨リンパ節を採取した。GFPはAlexafluor488にて蛍光標識し、ゲルろ過により精製した。
　腸骨リンパ節由来リンパ球をPBS-0.5%牛血清アルブミン溶液に懸濁させた後、GFP (0.5μg/ml)を加え4℃にて30分間撹拌させ、細胞の抗原標識を行った。細胞を遠心分離後DMEM培地に懸濁させ、これにER-Tracker (1μM)を加え5分間室温で放置することで小胞体を染色した。細胞をPBSで洗浄後、抗原特異的形質細胞画分をGFP陽性でER-tracker強陽性細胞として、また抗原非特異的形質細胞画分をGFP陰性でER-tracker強陽性細胞として、セルソーターにて分離した。
[結果]
　腸骨リンパ節より調製したリンパ球を、抗ラットIgG（緑）およびER-trackerによって染色後、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果ER-tracker強陽性の形質細胞表面に弱いながらIgGの発現が認められた（図１）。
　次に、この膜型IgGにGFPを作用させることで抗原特異的形質細胞の同定が可能であるかを試みた。腸骨由来ラットリンパ球懸濁液を、Alexafluor488標識GFP及びER-trackerで染色し、これをフローサイトメーターにて解析した。その結果、図２Ａに示すようにGFP陽性の細胞群が存在した。これらGFP陽性の細胞群の多くはGFPの非特異的吸着、低親和性膜型抗体を発現するＢ細胞に由来するシグナルである。この中から抗原特異的形質細胞を同定するためGFP強陽性でER-tracker強陽性の細胞を抗原特異的形質細胞として、GFP陰性でER-tracker強陽性の細胞を非特異的形質細胞としてセルソーターを用いて分離した（図２ＡのHighとLow）。分離された細胞を固定化・細胞膜可溶化処理を行い、抗ラット抗体を用いて染色を行った結果、分収された細胞はその細胞質内に多量の抗体を発現していたことから、形質細胞であることが判明した（図２Ｂ）。
cDNA合成
　cDNA合成および免疫グロブリン遺伝子増幅は、「反応治具及び反応方法、並びにｃＤＮＡの合成方法」(WO2009/091048)に記載の方法に準じて行った（図３）。
　セルソーターにより分離された個々のラットプラズマ細胞をオリゴｄＴ２５が結合した磁気ビーズ（ダイナピーズ）３μｇの入った細胞溶解液３μＬ（１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ　ＬｉＣｌ，１％ドデシル硫酸　Ｌｉ（ＬｉＤＳ），５ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）に加え、細胞内のｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。　次に磁気ビーズを、３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶Ａ（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ　ＬｉＣｌ，０．１％　ＬｉＤＳ）、続いて３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶液Ｂ（７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）にて１回洗浄した後、ｃＤＮＡ合成を行った。洗浄後の磁気ビーズに、ｃＤＮＡ合成用溶液３μＬ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２　ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｌ０ｕｎｉｔ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌｌｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。次に磁気ビーズを３’テーリング洗浄溶液３μＬ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，４ｍＭ塩化マグネシウム）にて洗浄し、新たに３’テーリング反応溶液３μＬ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，４ｍＭ塩化マグネシウム，ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１０Ｕ）を加え、３７℃にて３０分間反応を行った。
ラットγ、κ鎖可変領域遺伝子断片の増幅
　磁気ビーズを３μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）にて洗浄後、５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲ法を用いてヒト免疫グロブリンγ鎖及びκ鎖遺伝子の増幅を行った。１回目のＰＣＲ反応は、磁気ビーズに２５μＬのＰＣＲ反応溶液（プライマーを各0.2μM、ｄＮＴＰ　0.2 mM、タカラバイオＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ　ｌＵ含有）を加え９４℃３０秒－６８℃４０秒の反応を３５サイクル行った。用いたプライマーは（ア）であり、ＴｄＴによりｃＤＮＡの３’端に付加されたポリＧにアニーリングする。プライマー配列は（イ）であり、ラット免疫グロブリンγ鎖遺伝子の定常領域に由来する。プライマー配列は（ウ）であり、ラット免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域に由来する。
　反応後ＰＣＲ溶液に水２２５μＬを加え１０倍希釈した溶液１μＬを鋳型とし、プライマー（エ）とプライマー（オ）を用いて１回目のＰＣＲと同様の条件でラット免疫グロブリンγ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。同様にプライマー（エ）とプライマー（カ）を用いラット免疫グロブリンκ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。
用いたプライマーは、
１回目ＰＣＲセンスプライマー
5-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3  （ア）（配列番号55）
１回目ＰＣＲγ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- GCAGGTGACGGTCTGGCTGGRCCAGGTGCTGGA-3　（イ）（配列番号56）
１回目ＰＣＲκ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- TCGTTCAGTGCCATCAATCTTCCACTTGAC-3  （ウ）（配列番号57）
２回目ＰＣＲ増幅用センスプライマー
5-CGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCC-3　（エ）（配列番号58）
２回目ＰＣＲγ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- CTGCAGGACAGCTGGGAAGGTGTGCAC-3　（オ）（配列番号59）
２回目ＰＣＲκ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- TAACTGTTCCGTGGATGGTGGGAAGAT-3　（カ）（配列番号60）
　反応後、PCR溶液各１μＬを取り、アガロースゲル電気泳動法にてκ及びγ鎖免疫グロブリン遺伝子断片の発現ユニットへの変換を確認した（図3上を参照）
ラット免疫グロブリン線状化発現ベクターの作製
　ラットγ鎖遺伝子、κ鎖遺伝子発現ユニット作製は、「標的遺伝子由来配列を含む連結DNA断片の特異的作製方法」（WO2011/027808）の方法に準じて調製した。
　即ち5'-RACE-PCR法により増幅された各ＰＣＲ産物１μＬに、terminaldeoxynucleotidyltransferaseを2 unit加え、３７℃にて３０分反応させ、その後９４℃にて５分間加熱することで酵素反応を停止させた。
　上記で調製した３’端ポリヌクレオチド付加ラットγ鎖遺伝子溶液に、ラットγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を１０ｎｇ、プライマー（キ）（ク）を各１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い２５μｌの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行うことでラットγ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。
　同様に、ラットκ鎖遺伝子溶液に、ラットκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を加え反応を行い、ラットκ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。
5-AGAGAAACCGTCTATCAGGGCGATGGC-3  （キ）（配列番号61）
5-AGAGACCCTTTGACGTTGGAGTCCACG-3  (ク)（配列番号62）
　反応後、PCR溶液各１μＬを取り、アガロースゲル電気泳動法にてκ及びγ鎖免疫グロブリン遺伝子断片の発現ユニットへの変換を確認した（図3下を参照）
遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片
　ラットγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片はラットγ鎖定常領域（1-873）連結配列II(1-54）、ポリＡ付加シグナル（1045-1051）、ＣＭＶプロモーター（1577-2172）、連結配列１（2173-2201）からなる（配列番号63）。
TGGAACTCTGGAGCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGGGCTCTACACTCTCACCAGCTCAGTGACTGTACCCTCCAGCACCTGGCCCAGCCAGACCGTCACCTGCAACGTAGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGAAACTGTGGAGGTGATTGCAAGCCTTGTATATGTACAGGCTCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAAGATGTGCTCACCATCACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATTAGCCAGGACGATCCCGAGGTCCATTTCAGCTGGTTTGTAGATGACGTGGAAGTCCACACAGCTCAGACTCGACCACCAGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTCCCCATCCTGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAGGACGTTCAGATGCAAGGTCACCAGTGCAGCTTTCCCATCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAACCCGAAGGCAGAACACAAGTTCCGCATGTATACACCATGTCACCTACCAAGGAAGAGATGACCCAGAATGAAGTCAGTATCACCTGCATGGTAAAAGGCTTCTATCCCCCAGACATTTATGTGGAGTGGCAGATGAACGGGCAGCCACAGGAAAACTACAAGAACACTCCACCTACGATGGACACAGATGGGAGTTACTTCCTCTACAGCAAGCTCAATGTGAAGAAGGAAAAATGGCAGCAGGGAAACACGTTCACGTGTTCTGTGCTGCATGAAGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGTCTCTCCCACTCTCCGGGTAAATGACCCGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCagatctTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片
　ラットκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片はラットκ鎖定常領域（1-325）、連結配列II(1-53）、ポリＡ付加シグナル（507-513）、ＣＭＶプロモーター（1038-1633）、連結配列１（1634-1662）からなる（配列番号64）。
GGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCTATCTTCCCACCATCCACGGAACAGTTAGCAACTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCCTCATGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCACTGAACGACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGACCAAGGCTGACTATGAAAGTCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAGACGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCagatctTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
　上記の実験で増幅された全長のラットγ鎖、κ鎖遺伝子発現ユニットを293FT細胞に遺伝子導入し2日間培養を行うことで、細胞培養液中組換えラット抗体を分泌させた。抗原特異的形質細胞及び非特異的形質細胞より得られた組換えラットモノクローナル抗体の抗原結合能についてＥＬＩＳＡ法を用いて調べた（図４）ところ、抗原特異的形質細胞から得られた組換えラットモノクローナル抗体は、12クローン中9クローンがGFPに対し強い結合力を示した。これに対し全形質細胞画分から得られた組換えラットモノクローナル抗体は12クローン中1クローンのみがGFPに対する強い結合を示した。以上の結果から、標識抗原とER-trackerをリンパ球懸濁液に作用させるだけの操作により、抗原特異的な形質細胞を同定し、これから抗原特異的なラットモノクローナル抗体を高効率で作製することが可能であることが明らかとなった。
実施例２　抗ヒトインスリンモルモットモノクローナル抗体の作製
　インスリンは、肝臓、筋肉や脂肪組織の細胞表面に存在するインスリン受容体と結合し、ブドウ糖の細胞内への取り込みを制御することで体内のエネルギー代謝を調節する役割を担う重要なホルモンである。血中インスリン濃度の測定は糖尿病、肥満等の病態を把握する上でも極めて重要な意味を持っている。哺乳動物のインスリンの構造は、モルモットを除いては高いホモロジーを有しているため、マウスを用いたモノクローナル抗体の作製は困難である。このため、ヒトインスリンの血中濃度測定にはモルモット血清から得られたポリクローナル抗体が用いられてきた。しかしポリクローナル抗体は免疫動物個体間のロット差が大きく、一定の品質を維持することが困難であり、抗ヒトインスリンモルモットモノクローナル抗体の開発が望まれていた。そこで本発明を用い、抗ヒトインスリンモルモットモノクローナル抗体の作製を行った。
[材料と方法]
　免疫動物はモルモット♀6週齢を用いた。抗原はヒトインスリン。免疫は、モルモット尾部の両側にヒトインスリン50μgを一ヶ月おきに4回筋肉注射した。免疫成立後、モルモットより腸骨リンパ節を採取した。インスリンはAlexafluor594にて蛍光標識し、ゲルろ過により精製した。
[結果]
　腸骨リンパ節よりリンパ球をPBS-0.5%牛血清アルブミン溶液に懸濁させた後、蛍光色素標識抗モルモット抗体を加え4℃にて30分間撹拌させた。細胞を遠心分離後DMAM培地に懸濁させ、これにER-Tracker (1μM)を加え5分間室温で放置することで小胞体を染色し蛍光顕微鏡にて観察した。その結果ER-tracker強陽性の形質細胞表面にIgGの発現が認められた（図５）。
　次に、この膜型IgGに蛍光標識抗原を作用させることで抗原特異的な形質細胞の同定が可能であるかを試みた。腸骨モルモットリンパ球懸濁液を、Alexafluor594標識インスリン及びER-trackerで染色し、これをフローサイトメーターにて解析した。その結果、図６に示すように標識インスリン陽性でER-tracker強陽の細胞群が存在した（図６のＲ１）。これを抗原特異的形質細胞画分とした。
cDNA合成
　cDNA合成および免疫グロブリン遺伝子増幅は、「反応治具及び反応方法、並びにｃＤＮＡの合成方法」(WO2009/091048)に記載の方法に準じて行った。
　セルソーターにより分離された個々のモルモットプラズマ細胞をオリゴｄＴ２５が結合した磁気ビーズ（ダイナピーズ）３μｇの入った細胞溶解液３μＬ（１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ　ＬｉＣｌ，１％ドデシル硫酸　Ｌｉ（ＬｉＤＳ），５ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）に加え、細胞内のｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。　次に磁気ビーズを、３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶Ａ（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ　ＬｉＣｌ，０．１％　ＬｉＤＳ）、続いて３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶液Ｂ（７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ2，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）にて１回洗浄した後、ｃＤＮＡ合成を行った。洗浄後の磁気ビーズに、ｃＤＮＡ合成用溶液３μＬ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ2，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２　ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｌ０ｕｎｉｔ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌｌｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。次に磁気ビーズを３’テーリング洗浄溶液３μＬ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，４ｍＭ塩化マグネシウム）にて洗浄し、新たに３’テーリング反応溶液３μＬ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，　４ｍＭ塩化マグネシウム，ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１０Ｕ）を加え、３７℃にて３０分間反応を行った。
モルモットγ、κ、λ鎖可変領域遺伝子断片の増幅
　磁気ビーズを３μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）にて洗浄後、５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲ法を用いてヒト免疫グロブリンγ鎖及びκ鎖遺伝子の増幅を行った。１回目のＰＣＲ反応は、磁気ビーズに２５μＬのＰＣＲ反応溶液（プライマーを各0.2μM、ｄＮＴＰ　0.2 mM、タカラバイオＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ　ｌＵ含有）を加え９４℃３０秒－６８℃４０秒の反応を３５サイクル行った。用いたプライマーは（ア）であり、ＴｄＴによりｃＤＮＡの３’端に付加されたポリＧにアニーリングする。プライマー配列は（ケ）であり、モルモット免疫グロブリンγ鎖遺伝子の定常領域に由来する。プライマー配列は（コ）であり、モルモット免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域に由来する。プライマー配列は（サ）であり、モルモット免疫グロブリンλ鎖遺伝子の定常領域に由来する。
　反応後ＰＣＲ溶液に水２２５μＬを加え１０倍希釈した溶液１μＬを鋳型とし、プライマー（エ）とプライマー（シ）を用いて１回目のＰＣＲと同様の条件でラット免疫グロブリンγ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。同様にプライマー（エ）とプライマー（ス）を用いラット免疫グロブリンκ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。同様にプライマー（エ）とプライマー（セ）を用いラット免疫グロブリンλ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った（図７）。
用いたプライマーは、
１回目ＰＣＲγ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5-GGTGCTGCTGGCCGGGTGGGCTACATTGCA-3　（ケ）（配列番号65）
１回目ＰＣＲκ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5-CAGAGCCATCCACCTTCCACTTGACGG-3（コ）（配列番号66）
１回目ＰＣＲλ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5-CTGCTGGCCATGTATTTGTTGTCGCTCTG-3（サ）（配列番号67）
２回目ＰＣＲ増幅用センスプライマー
5-CTGAAGGACGGCCGGGAAGGTGTGCAC-3（シ）（配列番号68）
２回目ＰＣＲκ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5-GGAAGAGGGAGATAGTTGGCTTCTGCACACTC-3（ス）（配列番号69）
２回目ＰＣＲλ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5-AGAAGGAATTCAGGAGACACACCACTGT-3（セ）（配列番号70）
　モルモットの抗体遺伝子の構造は未だ明らかにされていないため、モルモット脾臓細胞から調製したcDNAを用い、モルモットγ鎖遺伝子定常領域、κ鎖遺伝子定常領域およびλ鎖遺伝子定常領域をクローン化し、これらの塩基配列を決定した。具体的には、モルモット脾臓細胞を、オリゴｄＴ２５が結合した磁気ビーズ（ダイナピーズ）３μｇの入った細胞溶解液３μＬ（１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ　ＬｉＣｌ，１％ドデシル硫酸　Ｌｉ（ＬｉＤＳ），５ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）に加え、細胞内のｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。　次に磁気ビーズを、３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶Ａ（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ　ＬｉＣｌ，０．１％　ＬｉＤＳ）、続いて３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶液Ｂ（７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ2，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）にて１回洗浄した後、ｃＤＮＡ合成を行った。洗浄後の磁気ビーズに、ｃＤＮＡ合成用溶液３μＬ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ2，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２　ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｌ０ｕｎｉｔ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌｌｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。
　上記で調製されたcDNAを鋳型として用い、プライマー（ソ）と（タ）でγ鎖定常領域を、プライマー（チ）と（ツ）でκ鎖定常領域を、プライマー（テ）と（ト）でλ鎖定常領域を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をpBlucscript SKベクターのXhoI/NotIサイトに挿入した後、塩基配列を決定した。
（ソ）5-AGAGACTCGAGTGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGA-3（配列番号71）
（タ）5-GAGAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGAT-3（配列番号72）
（チ）5-AGAGACTCGAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGA-3（配列番号73）
（ツ）5-GAGAGAGCGGCCGCCTAGCACTCGCTCCTGTTGATGGTCT-3（配列番号74）
（テ）5-AGAGACTCGAGGAGGAGCTCCAGGACAACAAGGC-3（配列番号75）
（ト）5-GAGAGAGCGGCCGCTAAGAACACTCTGACGGGGCCAC-3（配列番号76）
γ鎖定常領域配列(配列番号1)
TGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGCCGGTGACTGTGAAATGGAACTCAGGGGCCCTGACCAGTGGAGTGCACACCTTCCCGGCCGTCCTTCAGTCAGGCCTGTACTCACTCACCAGCATGGTAACTGTGCCCTCCAGCCAGAAGAAGGCCACCTGCAATGTAGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCCTATTCGAACTCCTCAACCCAACCCGTGTACATGTCCCAAGTGCCCACCTCCTGAAAACCTGGGTGGACCATCTGTCTTCATCTTTCCCCCGAAGCCCAAGGACACGCTCATGATCTCCCTGACCCCTAGGGTCACATGTGTGGTGGTAGATGTGAGCCAAGATGAGCCTGAAGTCCAGTTCACATGGTTCGTGGACAACAAACCGGTCGGCAATGCTGAGACAAAGCCCCGAGTGGAGCAATACAACACGACATTCCGCGTGGAAAGTGTCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAATTCAAGTGCAAGGTCTACAACAAAGCCCTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACCATCTCCAAAACCAAAGGGGCTCCCCGCATGCCAGATGTGTACACCCTTCCCCCGTCCCGAGACGAGCTATCCAAGAGCAAAGTCAGTGTGACCTGCCTGATCATCAACTTCTTTCCTGCCGACATCCACGTGGAGTGGGCCAGCAATAGGGTTCCAGTGAGTGAGAAGGAATACAAGAACACCCCACCCATTGAGGACGCTGACGGGTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCACTGTGGATAAGAGCGCGTGGGATCAGGGAACCGTCTACACCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCACAATCATGTCACTCAGAAGGCCATCTCCCGGTCTCCGGGTAA
γ鎖定常領域アミノ酸配列(配列番号4)
CLVKGYFPEPVTVKWNSGALTSGVHTFPAVLQSGLYSLTSMVTVPSSQKKATCNVAHPASSTKVDKTVEPIRTPQPNPCTCPKCPPPENLGGPSVFIFPPKPKDTLMISLTPRVTCVVVDVSQDEPEVQFTWFVDNKPVGNAETKPRVEQYNTTFRVESVLPIQHQDWLRGKEFKCKVYNKALPAPIEKTISKTKGAPRMPDVYTLPPSRDELSKSKVSVTCLIINFFPADIHVEWASNRVPVSEKEYKNTPPIEDADGSYFLYSKLTVDKSAWDQGTVYTCSVMHEALHNHVTQKAISRSPG
κ鎖定常領域配列(配列番号2)
GGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGAGTGTGCAGAAGCCAACTATCTCCCTCTTCCCTCCATCATCTGAGGAGGTGACAGCTGGAAGTGCCTCAGTTGTGTGCTTCATTAATAGCTTCTATCCAAGAGACATCACCGTCAAGTGGAAGGTGGATGGCTCTGAACGCTCACAAGGCATCCTGAACAGTTACACAGATCAGGACAGCAAGGACAACACCTACAGCCTCAGTAGCACCCTGGCGCTGACGGCTTCAGAGTACAATCAGCATGAGAGGTACACCTGCGAGGTCTCCCACGCTGGCCTGACCTCACCCGCTGCCAAGACCATCAACAGGAGCGAGTGCTAG
κ鎖定常領域アミノ酸配列(配列番号5)
GTKLEIKRSVQKPTISLFPPSSEEVTAGSASVVCFINSFYPRDITVKWKVDGSERSQGILNSYTDQDSKDNTYSLSSTLALTASEYNQHERYTCEVSHAGLTSPAAKTINRSEC
λ鎖定常領域配列(配列番号3)
GAGGAGCTCCAGGACAACAAGGCCACAGTGGTGTGTCTCCTGAATTCCTTCTACCCCGGCTCTGTGAATGTCAGCTGGAAGGCAGATGGCACCACCATCAACCAGGGCGTGCAGACCACACAGCCTGCCAAACAGAGCGACAACAAATACATGGCCAGCAGCTACCTGACACTGACTCCCGACCAGTGGAGGTCTCACCAGAGAATCAGCTGCCAGGTCAAACACGAGGCAGGCAATGTGGAGAAGAGTTTGGCCCCGTCAGAGTGTTCTTAA
λ鎖定常領域アミノ酸配列(配列番号6)
EELQDNKATVVCLLNSFYPGSVNVSWKADGTTINQGVQTTQPAKQSDNKYMASSYLTLTPDQWRSHQRISCQVKHEAGNVEKSLAPSECS
　モルモットγ鎖遺伝子、κ鎖遺伝子、λ鎖遺伝子発現ユニット作製は、「標的遺伝子由来配列を含む連結DNA断片の特異的作製方法」（WO2011/027808）に記載の方法に準じて調製した。
　即ち、5'-RACE-PCR法により増幅された各ＰＣＲ産物１μＬに、terminaldeoxynucleotidyltransferaseを2 unit加え、３７℃にて３０分反応させ、その後９４℃にて５分間加熱することで酵素反応を停止させた。
　上記で調製した３’端ポリヌクレオチド付加モルモットγ鎖遺伝子溶液に、モルモットγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を１０ｎｇ、プライマーを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い２５μＬの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行うことで、モルモットγ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。
　同様に、モルモットκ鎖遺伝子溶液に、モルモットκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を加え反応を行い、モルモットκ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。同様に、モルモットλ鎖遺伝子溶液に、モルモットλ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を加え反応を行い、モルモットλ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。
　発現得ニット増幅に用いたプライマーは、（キ）(ク)。
　反応後、PCR溶液各１μＬを取り、アガロースゲル電気泳動法にてκ及びγ鎖免疫グロブリン遺伝子断片の発現ユニットへの変換を確認した（図８を参照）。
　モルモットγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片はモルモットγ鎖定常領域（1-911）,連結配列II(1-96）、ポリＡ付加シグナル（912-1118）、ＣＭＶプロモーター（1628-2093）、連結配列１（2094-2123）からなる（配列番号77）。
TGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGCCGGTGACTGTGAAATGGAACTCAGGGGCCCTGACCAGTGGAGTGCACACCTTCCCGGCCGTCCTTCAGTCAGGCCTGTACTCACTCACCAGCATGGTAACTGTGCCCTCCAGCCAGAAGAAGGCCACCTGCAATGTAGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCCTATTCGAACTCCTCAACCCAACCCGTGTACATGTCCCAAGTGCCCACCTCCTGAAAACCTGGGTGGACCATCTGTCTTCATCTTTCCCCCGAAGCCCAAGGACACGCTCATGATCTCCCTGACCCCTAGGGTCACATGTGTGGTGGTAGATGTGAGCCAAGATGAGCCTGAAGTCCAGTTCACATGGTTCGTGGACAACAAACCGGTCGGCAATGCTGAGACAAAGCCCCGAGTGGAGCAATACAACACGACATTCCGCGTGGAAAGTGTCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAATTCAAGTGCAAGGTCTACAACAAAGCCCTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACCATCTCCAAAACCAAAGGGGCTCCCCGCATGCCAGATGTGTACACCCTTCCCCCGTCCCGAGACGAGCTATCCAAGAGCAAAGTCAGTGTGACCTGCCTGATCATCAACTTCTTTCCTGCCGACATCCACGTGGAGTGGGCCAGCAATAGGGTTCCAGTGAGTGAGAAGGAATACAAGAACACCCCACCCATTGAGGACGCTGACGGGTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCACTGTGGATAAGAGCGCGTGGGATCAGGGAACCGTCTACACCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCACAATCATGTCACTCAGAAGGCCATCTCCCGGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAATAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
　モルモットκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片はモルモットκ鎖定常領域（1-345）,
連結配列II(1-55）、ポリＡ付加シグナル（346-548）、ＣＭＶプロモーター（1058-1652）、連結配列１（1653-1682）からなる（配列番号78）。
GGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGAGTGTGCAGAAGCCAACTATCTCCCTCTTCCCTCCATCATCTGAGGAGGTGACAGCTGGAAGTGCCTCAGTTGTGTGCTTCATTAATAGCTTCTATCCAAGAGACATCACCGTCAAGTGGAAGGTGGATGGCTCTGAACGCTCACAAGGCATCCTGAACAGTTACACAGATCAGGACAGCAAGGACAACACCTACAGCCTCAGTAGCACCCTGGCGCTGACGGCTTCAGAGTACAATCAGCATGAGAGGTACACCTGCGAGGTCTCCCACGCTGGCCTGACCTCACCCGCTGCCAAGACCATCAACAGGAGCGAGTGCTAGGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCagatctTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
　モルモットλ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片（配列）はモルモットλ鎖定常領域（1-272）,連結配列II(1-52）、ポリＡ付加シグナル（53-410）、ＣＭＶプロモーター（985-1579）、連結配列１（1580-1609）からなる（配列番号79）。
GAGGAGCTCCAGGACAACAAGGCCACAGTGGTGTGTCTCCTGAATTCCTTCTACCCCGGCTCTGTGAATGTCAGCTGGAAGGCAGATGGCACCACCATCAACCAGGGCGTGCAGACCACACAGCCTGCCAAACAGAGCGACAACAAATACATGGCCAGCAGCTACCTGACACTGACTCCCGACCAGTGGAGGTCTCACCAGAGAATCAGCTGCCAGGTCAAACACGAGGCAGGCAATGTGGAGAAGAGTTTGGCCCCGTCAGAGTGTTCTTAGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCagatctTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
　上記の実験で増幅された全長のモルモットγ鎖、κ鎖、λ鎖遺伝子発現ユニットを293FT細胞に遺伝子導入し2日間培養を行うことで、細胞培養液中に組換えモルモット抗体を分泌させた。抗原特異的形質細胞および非特異的形質細胞から得られた組換えモルモットモノクローナル抗体のヒトインスリン結合能をELISA法にて調べた（図９）。その結果、抗原特異的形質細胞から得られたモノクローナル抗体２４１種類のうち１４６クローンにおいて陰性コントロールの１０倍のインスルリン結合能が、７７クローンが陰性コントロールの５０倍の強い結合力を示した。以上の結果から、モルモットにおいても、標識抗原とER-trackerをリンパ球懸濁液に作用させるだけの操作により、抗原特異的な形質細胞を同定し、これから抗原特異的なモノクローナル抗体を作製することが可能であることが明らかとなった。
　得られた２４１種類の組換え抗体の中からヒトインスリンに対し特に結合能の高いクローン１２種類を選別し、その塩基配列を決定した。このようにして得られたヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定可変領域の遺伝子配列を配列表の配列番号7～18に示す。また、ヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号19～30に示す。さらに、ヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域の遺伝子配列を配列表の配列番号31～42に示す。ヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号43～54に示す。
　さらに上記ヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖およびγ鎖定可変領域のＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３，ＦＲ４は、それぞれヒト免疫グロブリン可変領域との相同性を用いて決定した。得られたモルモットのモノクローナル抗体１２類のκ鎖及びγ鎖のＦＲ１～４及びＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
実施例３　抗卵白アルブミンウサギモノクローナル抗体の作製
　ウサギは他の動物では得られない高親和性の抗体を作製することが知られている。そこで本発明を用い、ウサギモノクローナル抗体の作製を行った。
[材料と方法]
　免疫動物はウサギ♀6週齢を用いた。抗原は卵白アルブミン。免疫は、ウサギ尾部の両側に卵白アルブミン300μgを一ヶ月おきに4回筋肉注射した。免疫成立後、腸骨リンパ節を採取した。卵白アルブミンはAlexafluor488にて蛍光標識し、ゲルろ過により精製した。
[結果]
　腸骨リンパ節よりリンパ球をPBS-0.5%牛血清アルブミン溶液に懸濁させた後、Alexafluor488蛍光標識卵白アルブミンを加え4℃にて30分間撹拌させた。細胞を遠心分離後PBSに再懸濁させ、これにER-Tracker (1μM)を加え5分間室温で放置することで小胞体を染色しフローサイトメーターにて解析した。その結果、卵白アルブミン陽性でER-tracker強陽の細胞群が存在した（図１０）。これを抗原特異的形質細胞画分とした。
cDNA合成
　cDNA合成および免疫グロブリン遺伝子増幅は、「反応治具及び反応方法、並びにｃＤＮＡの合成方法」(WO2009/091048)に記載の方法に準じて行った。セルソーターにより分離された個々のウサギプラズマ細胞をオリゴｄＴ２５が結合した磁気ビーズ（ダイナピーズ）３μｇの入った細胞溶解液３μＬ（１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ　ＬｉＣｌ，１％ドデシル硫酸　Ｌｉ（ＬｉＤＳ），５ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）に加え、細胞内のｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。　次に磁気ビーズを、３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶Ａ（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ　ＬｉＣｌ，０．１％　ＬｉＤＳ）、続いて３μＬのｍＲＮＡ洗浄用溶液Ｂ（７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ2，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）にて１回洗浄した後、ｃＤＮＡ合成を行った。洗浄後の磁気ビーズに、ｃＤＮＡ合成用溶液３μＬ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ　ＫＣｌ，３ｍＭ　ＭｇＣｌ2，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，５ｍＭ　ＤＴＴ，２　ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｌ０ｕｎｉｔ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌｌｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。次に磁気ビーズを３'テーリング洗浄溶液３μＬ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，４ｍＭ塩化マグネシウム）にて洗浄し、新たに３'テーリング反応溶液３μＬ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，　４ｍＭ塩化マグネシウム，ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１０Ｕ）を加え、３７℃にて３０分間反応を行った。
ウサギγ、κ鎖可変領域遺伝子断片の増幅
　磁気ビーズを３μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）にて洗浄後、５'－ＲＡＣＥ　ＰＣＲ法を用いてヒト免疫グロブリンγ鎖及びκ鎖遺伝子の増幅を行った。１回目のＰＣＲ反応は、磁気ビーズに２５μＬのＰＣＲ反応溶液（プライマーを各0.2μM、ｄＮＴＰ　0.2 mM、タカラバイオＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ　ｌＵ含有）を加え９４℃３０秒－６８℃４０秒の反応を３５サイクル行った。用いたプライマーは（ア）であり、ＴｄＴによりｃＤＮＡの３'端に付加されたポリＧにアニーリングする。プライマー配列は（ナ））であり、ウサギ免疫グロブリンγ鎖遺伝子の定常領域に由来する。プライマー
配列は（ニ）であり、ウサギ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域に由来する。
　反応後ＰＣＲ溶液に水２２５μＬを加え１０倍希釈した溶液１μＬを鋳型とし、プライマー（エ）とプライマー（ヌ）を用いて１回目のＰＣＲと同様の条件でウサギ免疫グロブリンγ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。同様にプライマー（エ）とプライマー（ネ）を用いウサギ免疫グロブリンκ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。（図１１）。
用いたプライマーは、
１回目ＰＣＲγ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5-GCTGGCTGCTTGAGGTCACGCTCACCAC-3　（ナ）（配列番号80）
１回目ＰＣＲκ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- CAGTTGTTTGGGTGGTGCCATCCAC-3　（ニ）（配列番号81）
２回目ＰＣＲγ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- CTGCCGGACGGACGGGAAGGTGCGTAC-3　（ヌ）（配列番号82）
２回目ＰＣＲκ鎖増幅用アンチセンスプライマー
5- ACACACGATGGTGACTGTTCCAGTTG-3  （ネ）（配列番号83）
ウサギ免疫グロブリン線状化発現ベクターの作製
　ウサギγ鎖遺伝子、κ鎖遺伝子発現ユニット作製は、「標的遺伝子由来配列を含む連結DNA断片の特異的作製方法」（WO2011/027808）の方法に準じて調製した。即ち5'-RACE-PCR法により増幅された各ＰＣＲ産物１μＬに、terminaldeoxynucleotidyltransferaseを2 unit加え、３７℃にて３０分反応させ、その後９４℃にて５分間加熱することで酵素反応を停止させた。
　上記で調製した３'端ポリヌクレオチド付加ウサギγ鎖遺伝子溶液に、ウサギγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を１０ｎｇ、プライマー（キ）（ク）を各１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い２５μＬの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行うことでウサギγ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。
　同様に、ウサギκ鎖遺伝子溶液に、ウサギκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を加え反応を行い、ウサギκ鎖遺伝子発現ユニットを作製した。
発現ユニット増幅に用いたプライマーは、（キ）(ク)。
　反応後、PCR溶液各１μＬを取り、アガロースゲル電気泳動法にてκ及びγ鎖免疫グロブリン遺伝子断片の発現ユニットへの変換を確認した（図１２）。
遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片
　ウサギγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片はウサギγ鎖定常領域（1-893）連結配列II(1-93)、ポリＡ付加シグナル（1065-1071）、ＣＭＶプロモーター（1606-2195）、連結配列１（2196-2230）からなる（配列番号84）。
CTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGAGCGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCagatctTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片
　ウサギκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片はウサギκ鎖定常領域（1-312）、連結配列II (1-95)、ポリＡ付加シグナル（507-513）、ＣＭＶプロモーター（1050-1633）、連結配列１（1640-1675）からなる（配列番号85）。
ATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAACAGGGGTGACTGCTAGAGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCagatctTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCC
　上記の実験で増幅された全長のウサギγ鎖、κ鎖遺伝子発現ユニットを293FT細胞に遺伝子導入し2日間培養を行うことで、細胞培養液中組換えウサギ抗体を分泌させた。抗原特異的形質細胞及び非特異的形質細胞より得られた組換えウサギモノクローナル抗体の抗原結合能についてＥＬＩＳＡ法を用いて調べた（図１３）ところ、抗原特異的形質細胞から得られた組換えウサギモノクローナル抗体は、卵白アルブミンに対し強い結合力を示した。以上の結果から、標識抗原とER-trackerをリンパ球懸濁液に作用させるだけの操作により、抗原特異的な形質細胞を同定し、これから抗原特異的なウサギモノクローナル抗体を高効率で作製することが可能であることが明らかとなった。
　本発明は、抗体製造関連の分野に有用である。

Claims (21)

  1. 非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、
    免疫成立後の非ヒト動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、
    前記感作させた、または採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞と、(1)標識した目的抗原、および(2)形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質とを混合し、
    前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することを含む、
    目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択する方法。
  2. ヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を目的抗原にｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作させるか、または目的抗原に対する抗体を有するヒトからリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、
    前記感作させた、または採取したリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞と、(1)標識した目的抗原と(2)形質細胞および／または形質芽細胞を選択的に結合する標識物質を混合し、
    前記(1)標識した目的抗原および(2)標識物質が結合した細胞を選択することを含む、
    目的抗原に特異的に結合するヒトの形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方を選択する方法。
  3. 請求項1または2に記載の方法で目的抗原に特異的に結合する形質細胞および形質芽細胞の少なくとも一方の細胞を選択し、
    選択した細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、
    同定した遺伝子の塩基配列に基づいて前記抗体または抗体の断片を調製する、
    ことを含む目的抗原に特異的な抗体または抗体の断片の製造方法。
  4. 形質細胞および／または形質芽細胞に選択的に結合する標識物質が、細胞の小胞体に対する染色選択性が、小胞体以外の細胞小器官に対する染色選択性に比べて高い蛍光プローブであって、該蛍光プローブによる染色により、形質細胞及び形質芽細胞と形質細胞及び形質芽細胞以外の細胞とを識別可能な、形質細胞及び／又は形質芽細胞の同定又は単離に用いるための蛍光プローブである請求項1～3のいずれか１項に記載の方法。
  5. (1)両親媒でカチオニックであり、かつ中程度の脂溶性を有する物質、および(2)小胞体局在を示すタンパク質に対して一定以上の親和性を有する物質から成る群から選ばれる請求項4に記載の方法。
  6. 前記両親媒は、両親媒性インデックス（AI）が、+6>AI>0であり、中程度の脂溶性は、疎水性インデックス(logP)が、+6>logP>0であり、一定以上の親和性は、解離定数が0.1μM～0.1nMの範囲である請求項5に記載の方法。
  7. 前記小胞体以外の細胞小器官が、形質膜、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、パーオキソーム、核、中心体、細胞質基質、ファゴソーム、エンドソーム、又はアグリソームである請求項4～6のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記蛍光プローブが、蛍光標識glibenclamide、蛍光標識Brefeldin A、蛍光プローブ、および蛍光タンパク質から成る群から選ばれる請求項4～7のいずれか１項に記載の方法。
  9. 配列表の配列番号1で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域の遺伝子または配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子。
  10. 配列表の配列番号2で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域の遺伝子または配列表の配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子。
  11. 配列表の配列番号3で示される塩基配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域の遺伝子または配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域のペプチドをコードする遺伝子。
  12. 配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖定常領域のペプチド。
  13. 配列表の配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖定常領域のペプチド。
  14. 配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のλ鎖定常領域のペプチド。
  15. 配列表の配列番号7～18のいずれかで示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域の遺伝子または配列番号19～30及び89～91のいずれかで示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチドをコードする遺伝子。
  16. 配列表の配列番号31～42のいずれかで示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域の遺伝子または配列番号43～54及び86～88のいずれかで示されるヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチドをコードする遺伝子。
  17. 配列番号19～30及び89～91のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のγ鎖可変領域のペプチド。
  18. 配列番号43～54及び86～88のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するヒトインスリンに対するモルモット抗体のκ鎖可変領域のペプチド。
  19. 可変領域として配列番号19～30及び89～91のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、かつ定常領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するγ鎖を有する、ヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
  20. 可変領域として配列番号43～54及び86～88のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、かつ定常領域として配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するκ鎖を有する、ヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
  21. 下記κ鎖CDR1、κ鎖CDR2及びκ鎖CDR3のいずれか1つずつの組合せを含むκ鎖または下記γ鎖CDR1、γ鎖CDR2及びγ鎖CDR3のいずれか1つずつの組合せを含むγ鎖を含むヒトインスリンに対するモルモットモノクローナル抗体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
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