CN102272158B - 源自记忆b细胞的人单克隆抗体的快速表达克隆 - Google Patents

Abstract

本发明提供了无需利用杂交瘤细胞技术的人单克隆抗体的制备方法，采用所述的方法制备的抗体，以及采用该抗体治疗和预防病症(如人类免度缺陷病毒的病原体感染)的方法。

Description

源自记忆B细胞的人单克隆抗体的快速表达克隆

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2008年11月12日提交的第61/114,047号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用全部并入本文中。

技术领域

本申请大体上涉及不利用杂交瘤细胞技术来产生人单克隆抗体(mAb)的方法，以及使用该抗体来治疗或预防疾病(例如病原体、如人类免疫缺陷病毒的感染)的方法。

背景技术

虽然经过20多年的努力人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)疫苗仍然是难以获得的，但是它仍是唯一最有希望阻止疫情的措施^[1，2]。近期基于5型腺病毒(Ad5-)载体的细胞免疫(CTL)疫苗的失败和早期膜蛋白(gp120)亚单位疫苗的失败也反映了这个任务的困难度^[2]。由于这些失败，研究重点又回到研究某些能自发地控制感染病毒的HIV-1感染者群体的保护性体液反应及其抗原表位。这些群体包括保持稳定的CD4T淋巴细胞数量的多年不发病的长期不进展者(LTNP)^[3]，以及罕见病毒控制者(EC)^[4]即在申请人的研究组里称为的天然病毒抑制者(NVS)^[5]，这类人感染者无需抗逆转录病毒治疗就可以自发地将病毒复制控制在极低的水平。最近的几项研究试图识别在某些罕见的HIV感染者的血浆或血清中发现的具有高中和活性的抗膜蛋白抗体的抗原表位^[6，7]。然而，体液中抗体的特异性有可能因HIV包膜蛋白的高度易变而随着时间发生明显改变和/或减少^[8]，特别是在抗原血症起限制作用的情况下。因此，在慢性HIV-1型感染者体液中的抗体的特异性不大可能完全体现出早期急性感染阶段的病毒所诱导产生的抗体特性。此外，在急性感染的关键时期发生的可能的关键抗体反应可能无法通过在病毒载量已经下降到检测下限后进行的血清样本分析而检测到。例如，有文献显示EC具有比慢性进展者更低的HIV-1特异性抗体的滴度^[9，10]。因此，需要采取新的方法来评估HIV感染个体中的现在和过去的免疫反应，以寻找新的有益于治疗的抗体。同样的问题对于已经感染了其他病原体或有自身免疫性疾病的个体来说也是很重要的。

一旦这种抗体被鉴定，就需要有一种可靠的方法来进行制备，优选将其制成供人类使用的完全人抗体。有五种通用方法来分离人单克隆抗体，它们都存在各种的技术性缺陷，使它们难以与用来制备小鼠单克隆抗体的原Kohler-Milstein的杂交瘤技术相比。这些方法包括杂交瘤细胞法^[40]、利用Epstein-Barr病毒(EBV)的B细胞转化^[41]、噬菌体展示^[42]、酵母展示^[43]和小鼠单克隆抗体的“人源化”^[44]。由于缺乏适用的人细胞融合受体细胞，用常规的杂交瘤细胞法分离人单克隆抗体已被证明非常艰难，虽然这种方法已被证实是可能成功的(参见最近一个令人关注的例子^[45])。EBV转化已被证明具有同样困难，但其原因不同。EBV转化的B细胞系往往是遗传不稳定的，由此产生的高克隆损失率使得这种方法非常麻烦。

最近公布了一种改进的EBV转化方法，该方法使用EBV来从免疫的记忆B细胞(B_Mem)中转化富集的B_Mem ^[26]。这种方法适用于多种免疫原，但它需要健康的B_Mem，而这在如HIV-1感染的慢性感染过程中经常是缺乏的^[18]。噬菌体和酵母展示技术克服了这些问题，但这些方法在筛选过程中依赖于Fab片段或单链Fv(scFv)片段，从而无法通过诸如病毒中和的功能分析来进行筛选。噬菌体展示还存在这样的问题，即它对可以稳定地表达为重组噬菌体的抗体特性有未知的结构性限制^[46]。最后，可以通过移植编码人抗体可变区基因上的抗原结合区的基因片段来“人源化”小鼠单克隆抗体。这是一个高度繁琐的劳力密集的工作，超出了大多数研究实验室的所能达到的水平。因此，需要有一种新的方法来快速克隆全长的人单克隆抗体以解决这些问题。

发明内容

本发明所提供的方法可用于快速克隆全长的人单克隆抗体，其可用于治疗疾病和病症，如病原体感染、癌症以及自身免疫性疾病。

在第一方面，本发明提供了一种用于制备特异性结合特定的已知抗原的单克隆抗体的方法。该方法包括如下步骤：(a)从一个已接触过该特定已知抗原的动物中获取血液样本；(b)从该血液样本中分离出记忆B细胞；(c)在一定条件下培养所分离出的记忆B细胞一定时间，直到所述记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；(d)确定浆细胞是否能产生特异性结合该特定已知抗原的单克隆抗体；(e)如果浆细胞能产生特异性结合该特定已知抗原的单克隆抗体，则从浆细胞中分离出总RNA，而如果浆细胞不产生该单克隆抗体，则重复步骤(b)-(d)，直到所分离出的多个记忆B细胞被鉴定为可分化成能稳定产生单克隆抗体的浆细胞；(f)使用在步骤(e)中分离出的总RNA来制备总RNA中的编码抗体重链可变区(VH)的mRNA分子的cDNA和编码抗体轻链可变区(VL)的mRNA分子的cDNA；(g)将VH链cDNA克隆到真核表达载体，并将VL链cDNA克隆到真核表达载体；(h)选择包含VH链cDNA的表达载体制备VH链微型库，并选择包含VL链cDNA的表达载体制备VL链微型库；(i)用包括来自VH链微型库的VH链cDNA的表达载体的混合物和包括来自VL链微型库的VL链cDNA的表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使共转染细胞生长达足够长的时间，以允许这些细胞能稳定地产生抗体；(j)确定共转染细胞产生特异性结合该特定已知抗原的单克隆抗体；(k)鉴定编码有如步骤(j)中单克隆抗体的VH链的VH链cDNA，其包括步骤：(i)用从VH链cDNA微型库中获得的特定VH链cDNA表达载体和包括来自VL链微型库的VL链cDNA表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆；(ii)确定该克隆是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该共转染细胞产生了特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(k)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VH链cDNA表达载体来重复步骤(k)之(i)和步骤(k)之(ii)，直到特定VH链cDNA表达载体被鉴定为可产生单克隆抗体；(iv)鉴定产生单克隆抗体的VH链cDNA，并选择用来制备产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的克隆的VH链cDNA表达载体；(l)鉴定编码如步骤(k)中的单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，包括步骤：(i)用在步骤(k)之(iv)中鉴定的VH链cDNA的表达载体和选自VL链微型库的特定VL链cDNA表达载体共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定地产生抗体的克隆；(ii)确定该克隆是否产生特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该克隆产生了特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(l)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则用不同的特定VL链cDNA的表达载体重复步骤(l)之(i)和步骤(l)之(ii)，直到特定的VL链cDNA表达载体被鉴定出产生单克隆抗体；(iv)鉴定编码单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，并选择用于制备产生单克隆抗体的克隆的VL链cDNA表达载体；以及(m)用步骤(k)之(iv)所鉴定的VH链cDNA的表达载体和用步骤(l)之(iv)所鉴定的VL链cDNA的表达载体共转染恰当的宿主细胞，以制备能够产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的宿主细胞，从而产生结合特定已知抗原的单克隆抗体。

在上述方法中，VL链可以是Vκ链或Vλ链。

宿主细胞例如可以是细菌细胞、273T细胞或中国仓鼠卵巢细胞，而真核表达载体例如可以是IgG1、κ或γ真核表达载体。

在上述方法中，VH链cDNA和VL链cDNA可以被克隆到相同的表达载体中。

该特定已知抗原可以是来自病原体如病毒、细菌、朊病毒、真菌、酵母菌或寄生虫的抗原。例如，该病原体可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1或HIV-2。

在上述方法中，分离出的记忆B细胞例如可以约100个记忆B细胞/孔的密度培养。

从中获得B记忆细胞的动物可以是以前曾以针对病原体的疫苗免疫的方式暴露于病原体，或该动物可以是以前曾自然地被病原体感染。在某些例子中，该动物将被人类免疫缺陷病毒感染，并且该动物将能够自发地控制病毒。

从中获取B记忆细胞的动物可以患有可针对自体抗原产生抗体的自身免疫性疾病，这种疾病是选自包括系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、克罗恩病、多发性硬化症和重症肌无力的集合体中的一种。这些自身抗体可用作自身免疫性疾病的治疗标靶。

从中获取B记忆细胞的动物在获取B记忆细胞之时或在之前患有肿瘤或癌症。B记忆细胞如任其成长为可产生抗体的浆细胞，则可以产生特异性结合肿瘤或癌细胞的抗体。

抗原可以是包含碳水化合物、脂类、蛋白质、肽、核酸和小分子(有机和无机)的集合体中的一种。

动物可以是人，在这种情况下，单克隆抗体是完全人单克隆抗体。

在第二方面，本发明提供了用上述方法分离的单克隆抗体。该单克隆抗体可具有可变重链(VH)的第三互补决定区，其包括由从SEQ ID NO：73到SEQ ID NO：115中的至少一个氨基酸序列。该单克隆抗体可具有可变轻链(VL)的第三互补决定区，其包括由从SEQ ID NO：116到SEQ ID NO：163中的至少一个氨基酸序列。

在第三方面，本发明提供了一种治疗或预防由个体中的人类免疫缺陷病毒造成的感染的方法，包括对个体施用由上述方法分离出来的单克隆抗体。

在第四方面，本发明提供了一种鉴定用于治疗或预防由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的疾病的治疗用单克隆抗体的方法。该方法包括：(a)从其本身是HIV的精英控制者天然病毒抑制者的动物中获得血液样本；(b)确定该血液样本中是否包含任何结合特定已知病原体的抗体；(c)从血液样本中分离记忆B细胞；(d)在一定条件下培养多个分离出的记忆B细胞达足够长的时间，以允许记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；(e)确定浆细胞是否产生特异性结合HIV的单克隆抗体；(f)将由浆细胞产生的单克隆抗体与血液样本中的抗体进行比较；以及(g)如果由浆细胞产生的单克隆抗体与血液样本中的抗体不同，则鉴定并选择由浆细胞产生的该不同的单克隆抗体。

可以用如上述第一方面所述方法中的步骤(e)到(m)选择上述步骤(g)中的浆细胞来制备能稳定地产生该不同的单克隆抗体的转化的宿主细胞克隆。

在第五方面，本发明提供了一种在动物目前尚未有特异性结合特定已知抗原的体液抗体时确定动物是否曾被暴露于特定已知抗原下的方法。该方法包括：(a)从动物中获得血液样本；(b)从血液样本中分离记忆B细胞；(c)在一定条件下培养分离出的记忆B细胞达足够长的时间，以允许记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；以及(d)确定浆细胞是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，其中该单克隆抗体的产生表明该动物曾暴露在该特定已知抗原下，无该单克隆抗体产生则表明动物可能没有暴露于该特定已知抗原下。

该抗原可以是病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原。

附图说明

本发明将以示例的方式并通过非限制性地结合附图部分予以说明，其中：

图1是抗HIV-1包膜蛋白的血浆抗体的特异性的检测。其中A)采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测针对FLSC、gp120_Ba-L和gp140_Ba-L的血浆抗体，以对数标度显示半饱和结合滴度。B)在存在亚抑制浓度的sCD4的条件下，通过对HIV-2_7312A-V434M中和活性的增强来检测NVS供体的血浆中的CD4i抗体。示出了IC90滴度，虚线是检测极限。C)上排图显示了通过针对b12单克隆抗体的竞争性ELISA(左)、针对sCD4-Ig的竞争性ELISA(中)和针对结合到细胞表面CD4的gp120-Ig的抑制(右)所检测的血浆中CD4bs抗体的结果。下排图显示了通过针对17b单克隆抗体的竞争性ELISA(左)、针对ED47单克隆抗体的竞争性ELISA(中)和针对结合到细胞表面CCR5的FLSC-Ig的抑制(右)所检测的血浆中CD4i抗体的结果。NVS5、NVS9和NVS10的结果分别以圆圈、方块和三角形标识。

图2是HIV-1包膜蛋白特异性B_Mem的鉴定。对100个B_Mem/孔刺激2周，并利用抗κ和抗λ抗体的混合物通过ELISA从上清液中筛选出总的CD4i、CD4bs和“其它”的HIV-1包膜蛋白特异性的B_Mem。A)NVS10B_mem培养上清液的典型ELSIA数据。B)三个NVS供体中的HIV-1包膜蛋白特异性的B_Mem以频率/百万总B_Mem表示。检出限为10个前体/百万B_Mem。C)在一个饼图中显示了供体NVS5、NVS9和NVS10中每一个的CD4i(蓝色)、CD4bs(红色)和“其它”特异性(黄色)的B_Mem百分比。

图3显示了三个CD4i单克隆抗体的分离。如材料与方法部分中所述地从NVS5的CD4i抗体阳性孔中克隆出三个单克隆抗体。图中示出了单克隆抗体对于FLSC(实心符号)以及对于gp120_Ba-L(空心符号)的选择性活性的ELISA曲线。

图4显示了NVS5、NVS9和NVS10的病毒载量及CD4计数。所有供体都有稳定的CD4计数(圆圈，细胞/ml)。病毒载量(方形)的检出限为75拷贝/ml。在NVS10的多个时间点(三角形)处采用敏感度较低的病毒载量检测(＜400拷贝/ml)。箭头指示为这项研究取样的时间点。

图5显示了采用ELISA法鉴定CD4i和CD4bs单克隆抗体(mAb)。依照示例部分中所述的三种模式的HIV-1包膜蛋白ELISA法来检测代表性的CD4i和CD4bs单克隆抗体。A)右、中、左图分别显示出对于CD4i单克隆抗体(17b，ED47，A32)、CD4bs单克隆抗体(b12，M14，sCD4-Ig)和单克隆抗体2G12的结果。还显示了对于FLSC(实心符号)和对于gp120_Ba-L(空心符号)的反应性的ELISA曲线。B)显示了在0.1μg/ml下用于所有这些代表性单克隆抗体的ELISA法的OD值。CD4i单克隆抗体是通过其与FLSC的强键结合和与gp120_Ba-L或gp140_Ba-L的弱键结合进行鉴定，而CD4bs单克隆抗体是通过其与gp120_Ba-L或gp140_Ba-L的强键结合和其与FLSC的弱键结合的比较进行鉴定。除了CD4i和CD4bs外的单克隆抗体被标记为“其他”类。其中一个“其他”单克隆抗体2G12同样很好地结合FLSC和gp120_Ba-L，因此可用来标化ELISA法。

图6是用来鉴定分泌抗包膜蛋白抗体的浆细胞的步骤的示意图。

图7是显示了查找正确的VH-VL基因对的复杂性的示意图。

图8是显示了用来自VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)微型库的cDNA混合物(池)进行细胞转染的示意图。

图9显示了如何鉴定制备抗包膜蛋白抗体的VH链cDNA的示意图。

图10显示了如何鉴定制备包膜蛋白抗抗体的VL链cDNA的示意图。

图11是显示了用本发明所述的方法利用从人B_Mem细胞中克隆得到的抗HIV-1 gp120抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测的图。

具体实施方式

申请人发现，记忆B细胞(B_Mem)分析可以用来鉴定针对特定已知抗原的已过抗体反应。这种抗体反应往往不能通过同期血浆抗体样本的分析来检测。申请人的研究结果表明，通过B_Mem分析单克隆抗体的多样性对将针对特定病原体或抗原的抗体特异性和保护免疫相关联的血清学研究形成了补充。因此，本发明的某些实施例涉及一种方法，用于鉴定特异性结合由已知曾经在过去暴露于抗原的动物产生的已知抗体的单克隆抗体，但是该单克隆抗体目前在从动物中获得的同期血清样本中无法检测出来。使用这种方法，申请人发现，属于感染了HIV-1的罕见病毒控制者(EC)或天然病毒抑制者(NVS)的某些个体具有能够产生在同期血清样本中无法检出的抗包膜蛋白单克隆抗体的B_Mem。新近发现的抗包膜蛋白单克隆抗体具有治疗意义，因为它们是由能不借助药物治疗便可自我控制潜在致命的HIV-1感染的罕见人群产生的。特别是，申请人发现抗原CD4i的单克隆抗体治疗HIV-1感染时特别有用。这种抗体包括N5-I1、N5-I2、N5-I3、17b、ED47和A32(详见下文)。该新方法可用于制备针对可产生抗原、即能够诱导宿主产生免疫反应的任何分子的单克隆抗体。

在申请人的研究过程中，申请人不仅鉴定出新的治疗用抗体，还开发出一种无需使用杂交瘤细胞融合、噬菌体展示或EBV转化就可制备特异性结合已知抗原的完全人单克隆抗体的新方法。一些实施例涉及这种新方法以及用这种方法重组单克隆抗体，特别是下面介绍的新发现的抗HIV包膜蛋白单克隆抗体。

其他一些实施例涉及一种方法，用于在动物目前还不能产生特异性结合已知抗原的抗体时确定该动物是否曾经接触或感染已知抗原。

早期急性HIV-1感染的关键窗口期内的抗病毒抗体反应性质对于疫苗和药物设计都很重要，但在本质上是难以评估的。一旦慢性感染已形成，特别是在复制和抗原血症受到自然过程或药物干预限制的条件下，抗体特异性有可能明显改变。因此，过去的反应不太可能在现在的样本中反映出来。几个研究组正在试图通过建立网络跟踪高危个体以期在急性感染后的最短时间内获得样本来克服这种限制。但是，这些努力面临许多实际上的和后勤上的限制，特别是在资源匮乏的环境中。

长寿命的B_Mem提供了在宿主的大部分寿命期内产生的抗体特异性的历史档案^[11]。例如，B_Mem在接种牛痘疫苗后能持续50年^[12]。相比之下，体液中抗体通常会在抗原清除后衰减。例如，多达一半的接种者在接种乙肝(HBV)疫苗后几年之内会失去保护性抗体^[13]。另一方面，在缺乏抗体时HBV特异性B_Mem可以持续，并为在暴露于HBV或疫苗下时的快速保护性抗体反应创造条件^[14-17]。这些研究为B_Mem提供了先前抗体反应的高度稳定记录的方面提供了强有力的综合性证据。由于B_Mem可以在宿主的大部分寿命时间内持续，可推理认为他们可以提供这种早期反应的记录，并可提供一个新窗口，通过其可将抗体特异性与申请人的NVS人群中的病毒控制机制相关联。

HIV-1感染者体内的B_Mem细胞的分析本质上很困难，因为HIV-1发病机理包含可以扩展至体液免疫的严重的免疫功能障碍^[18，19]。幸运的是，可以维持一个相对完整的免疫系统的EC或NVS提供了一个可在感染期内由HIV-1包膜蛋白诱导产生的体液免疫的档案进行调查的机会。因此，申请人采用一个本地NVS人群^[5]，针对gp120和CD4bs上的两个被高度保护性的交叉反应性中和标靶以及包含CD4诱导的(CD4i)抗原决定族的辅助受体结合位点来将存档的B_Mem特异性和同期血浆抗体反应来进行比较并对照^[20-23]。

NVS志愿者

在确定申请人的NVS人群里的抗包膜蛋白抗体反应的研究的早期阶段，申请人观察到在特异性结合HIV-1包膜蛋白表位的血浆抗体和B_Mem之间的特异性存在明显不一致性。对三名志愿者NVS5、NVS9和NVS10进行了更详细的研究以探索这一观察结果。每个志愿者的临床特征见表1。自诊断之日起至今的时间：NVS9(53岁的非裔美国男性，危险因素：静脉注射吸毒)是5年，NVS10(57岁的非裔美国女性，危险因素：性行为)是13年，而NVS5(50岁的非裔美国女性，危险因素：性行为)是17年。这些个体在此期间没有接受过抗逆转录病毒治疗。总B细胞和B_Mem频率在正常范围内^[19]，表明了这些人没有整体免疫失调(见表1)。无法检测到的病毒载量以及正常的CD4+T细胞计数也支持这一点。在全部试验时间内，NVS9和NVS10将病毒复制抑制到检测不到的水平(＜75拷贝/毫升血浆)(图4)。相比之下，NVS5在第一个三年观察期内曾出现高达约300拷贝/毫升血浆的低水平病毒的瞬态峰值，在随后的约四年内被控制到检测不到的水平(图4)。有趣的是，在样本被采集用于这里披露的研究后不久，就出现了约100拷贝/毫升血浆的病毒峰值。如下面所讨论的，这可能是很重要的，因为NVS5是三个志愿者中唯一具有明显的中和抗体滴度的。这可能反映出在诊断后的17年，NVS5成为本发明研究的三个NVS志愿者中受感染时间最长的。重要的是，在整个观测时间，所有三个供体都具有正常范围内的稳定的CD4+T细胞计数(图5)。总之，这些数据表明，在没有抗逆转录病毒治疗的情况下，这三个NVS志愿者维持无法检测到的病毒载量多年，而且就总表型而言，他们的淋巴细胞亚群是正常的。

表1三个NVS供体的特征

^*正常值如文献[18，19]所述

尽管表面上对病毒复制存在很强的控制，但是在样本采集时所有三个NVS志愿者仍然都对包膜蛋白表位是血清阳性的。这通过三种ELISA来测定，其利用了gp120_Ba-L、gp120_Ba-L和CD4 D1D2的全长度单链(FLSC)融合蛋白或者gp140_Ba-L，它们均基于HIV-1_Ba-L包膜蛋白，如示例部分所述。如图1A所示，每个志愿者都具有能在10^-3到10^-4的滴度范围内识别三种抗原中的每一种的血浆抗体。这些ELISA都无法进行表位特异性鉴定，但它们确实显示这三个NVS志愿者对包膜蛋白表位是低水平的血清阳性，尽管在样本采集时病毒载量是不可检测的。

血浆CD4bs和CD4i抗体滴度

在HIV-1的已知的保护性中和表位中，那些与CD4和gp120辅助受体结合位点相关的往往在感染期间最具持续性免疫原性^[20，24]。由于这个原因，申请人的早期分析集中在NVS志愿者中的血浆和对这些表位的B_Mem反应。申请人采用三个独立的竞争试验研究了NVS血浆中的CD4bs抗体。首先，评价连续半对数稀释的血浆的阻断一定浓度的生物素化的单克隆抗体b12结合到ELISA板上所捕获的gp120_Ba-L上的能力。单克隆抗体b12识别与gp120的CD4bs相关联的高度保护性的中和表位^[25]。第二，通过捕获法ELISA评价连续半对数稀释的血浆的阻断sCD4-Ig结合到捕获了gp120_Ba-L的板上的能力。第三，通过流式细胞仪评价连续半对数稀释的血浆的阻断APC标记的gp120-Ig结合到CD4+T细胞系、CEM-NK^r上的能力。如图1C所示，在上排图中，血浆抗体对于CD4bs表位的反应在所有三个NVS志愿者中为零到边界值，任何检测法中的最大竞争值仅为上述检测极限的半对数。例如，每个阻断b12结合的血浆的半大竞争值约为10^-2，而背景竞争值为10^-1.5。在三个独立检测法中的每一个中的这些边界滴度值表明，NVS志愿者只有很少的针对CD4bs表位的持续血浆抗体反应。如下所述，这与三个个体中的两个中的CD4bs特异性B_Mem的高频率形成鲜明对比。

使用选择性检测这些抗体的HIV-2指示病毒，通过CD4诱导的中和试验进行了类似的分析，发现在10^-3到10^-5的滴度范围内大多数HIV-1感染者体内有高交叉反应性CD4i抗体^[20]。采用这种中和试验(图1B)，NVS5具有IC90滴度约为1.5×10^-3的CD4i中和抗体。至于CD4i抗体，只有在有限浓度的sCD4的存在下才能观察到中和(图1B)。相比之下，NVS9和NVS10在本实验中分别显示出低的和负的滴度。因此，在CD4诱导的试验中，中和度排列顺序是NVS5＞NV9＞NVS10。

CD4i中和度排列顺序通过阻断试验来确认，在其中检测NVS血浆的与将两个生物素化的CD4i单克隆抗体、17b及ED47和ELISA中的FLSC相结合以及将荧光FLSC-Ig和CfT2h-CCR5细胞上的CCR5相结合的竞争性。如图1C所示，在下排图中，所有三个实验中NVS5血浆的竞争滴度比NVS9和NVS10都高。17b或ED47的竞争滴度差异在NVS9和NVS10之间不那么明显，尽管NVS9的滴度略高。相比之下，来自NVS9的血浆在约2×10^-2的滴度下阻断了荧光FLSC-Ig与CfT2h-CCR5细胞的结合，而在来自NVS10的血浆中没有观察到竞争性。总之，该竞争性数据确认，CD4i抗体反应的排列顺序是NVS5＞NVS9＞NVS10。

NVS血浆中的中和抗体

NVS血浆还在两个独立的常规中和实验中进行了评价，以进一步评估其活性排列顺序。在第一种中和实验中，采用如“材料和方法”部分所述的基于外周血单核细胞(PBMC)的检测法来评价来自三个NVS志愿者的血浆样本。如表2所示，尽管没有抗CD4bs抗体的存在，NVS5血浆表现出明显的高交叉反应性，并在IC50滴度为1.8×10^-2到6.8×10^-3的范围内中和了全部10个分离毒株。相比之下，来自NVS9和NVS10的血浆在4×10^-1到6×10^-1的微量滴度范围内分别中和了10个分离毒株中的3个和10个分离毒株中的1个。

在第二种中和法中，全部IgG从NVS血浆中提纯，并在基于细胞系的假病毒检测法中进行评价。根据血浆的中和活性，在IC90 IgG浓度大约在10μg/ml到200μg/ml的范围内，NVS5的IgG可以中和12个假病毒中的11个(见表3)。另一方面，在约10μg/ml到290μg/ml的滴度范围内，来自NVS9和NVS10的IgG分别中和了12个假病毒中的5个和12个假病毒中的3个(见表3)。值得注意的是，在这两种方验(表2和3)中，来自NVS9和NVS10的血浆或IgG选择性地中和了X4病毒或相对敏感的R5/双嗜性病毒。总之这些数据表明，在两个独立的检测法中，中和活性排列顺序是NVS5＞＞NVS9≥NVS10，表明NVS5有高中和度的持续抗体反应，而NVS9和NVS10只有低特异性的持续性很低的中和抗体反应。应该指出，NVS5是三个个体中唯一展示短暂的、低水平病毒的个体，而上述分析的样本正好在病毒载量增加到可检出水平之前获取(图4)。

天然病毒抑制者独立于血清学状态保护特异性结合HIV-1包膜蛋白的保护表位上的高频率B_Mem

上述结果表明，虽然在NVS个体之间对gp120或gp140表位的总体液中抗体滴度只有很小差异，但是在抗体良好特异性方面却有明显差异。CD4bs表位的抗体反应在所有三个个体中都是从极小到零，而CD4i表位的体液中抗体的排列顺序是NVS5＞NVS9＞NVS10。总的来说，这些数据表明三个NVS个体中的血浆抗体特异性和感染控制之间无明显关系。然而，这些个体中的抗原载量可能很低，因为他们控制自己的感染。申请人试图确定在过去是否发生了明显抗体反应，它会随抗原载量减少而减弱。如果有，则体液中抗体反应只会提供一个可能与感染控制相关的初步反应的浅表迹象。

由于B_Mem在个体的大部分寿命时间内持续，申请人认为它们可以提供这种早期反应的记录，并可能提供一个新窗口，通过其可将抗体特异性与申请人的NVS人群中的病毒控制相关联。为了验证这一假设，申请人分析了NVS个体中产生抗体的B_Mem的存在，该抗体特异性结合不同于血浆所识别的包膜蛋白表位。首先，申请人建立了培养条件及分析方法，以检测属于单克隆抗体的单个B_Mem前体所分泌的抗包膜蛋白抗体。申请人的培养条件基于上述那些分化和分泌抗体的多克隆活化B_Mem(见文献[26]，其通过引用结合于本文中)。初步研究表明，将50至100个富集在磁珠上的B_Mem与饲养细胞一起培养(来自无亲缘关系的供体的辐照PBMC)7-14天，足以诱导产生足够高水平的IgG抗包膜蛋白抗体，以便为采用ELISA分析抗体特异性做准备。如示例部分中所述，每种培养物上清液在采用gp120_Ba-L、FLSC或gp140_Ba-L的三种ELISA法中进行试验。这种方法使申请人能够将特异性结合CD4bs和CD4i表位的抗体彼此之间区分开，并与特异性结合其它HIV-1包膜蛋白表位的抗体区分开。

该方案采用特异性结合CD4bs、CD4i和其它HIV-1包膜蛋白表位的人单克隆抗体得以证实。CD4bs单克隆抗体、b12和m14以及CD4-Ig(可选择地与gp120反应以证明与gp120的反应性，但与FLSC不反应)指明了特异性地结合CD4bs表位的抗体(图5A中)。相比之下，CD4i单克隆抗体17b、ED47和A32可与FLSC反应，但当用gp120代替FLSC时反应不佳，这证明了可与FLSC但不与gp120反应检测到了CD4i特异性单克隆抗体(图5A左)。

如图所示，通过与结合到碳水化合物表位的单克隆抗体2G12的反应，申请人还能够检测到特异性结合在gp120上表达的其他表位的抗体(图5A右)。在这种情况下，无论与俘获到板上的FLSC还是gp120结合都没有区别。最后，申请人还分析了每个培养物上清液与gp140_Ba-L的反应。因为申请人比较单一上清液与多个包膜蛋白制剂的结合，重要的是要使用已知的单克隆抗体标化ELISA法，以检测B_Mem培养物上清液中具有抗体所期望水平的特异性结合。图5B中显示的数据示出了当IgG浓度为来自活化B_Mem培养物的上清液中所存在的一般水平时不同的单克隆抗体与gp120、FLSC或gp140的结合程度。

在这里所述的实验中，与FSLC的选择反应性被推测存在CD4i特异性，与gp120的选择反应性被推测存在CD4bs特异性，与所有抗原制剂或仅与gp140的反应性则被认为是“其他”抗体。申请人已通过从活化B_Mem(图3和文稿中)中分离出的单克隆抗体以及用从未接触HIV-1的个体中或从源自这些NVS个体的CD19⁺CD27^-细胞中分离出的B_Mem进行对照试验而确定了这个方案。在这两种情况下都没有观察到包膜蛋白特异性前体。

通过这些试验，申请人总结得出识别CD4bs、CD4i和“其他”包膜蛋白表位的B_Mem前体。在图2A中针对NVS10显示了所产生的ELISA数据类型的一个例子。在这一个体中，对于CD4i、CD4bs和“其他”特异性来说，B_Mem前体近似相等，处于200到300前体每百万B_Mem的范围内(图2B，2C)。“其他”类别中的进一步细分见图2A，约70％(即10/14)B_Mem前体选择性地识别gp140低聚物。在这一点申请人很难对低聚物的明显特异性研究很深，因为一旦被吸附到塑料上，gp140制剂在大小方面以及也许在本体结构方面是不均匀的。这个附加说明不会改变这一结论，即CD4i和CD4bs的B_Mem前体在NVS10中处于主导地位，而该个体中具有相同特异性的循环抗包膜蛋白抗体的水平非常低。图2B和2C中的NVS9存在类似的结果，在400到600前体每百万B_Mem的范围内，NVS9也具有大致相同的能制备特异性结合CD4i、CD4bs和“其他”包膜蛋白表位的抗体的B_Mem频率。同样，产生CD4i和CD4bs表位的B_Mem前体的主导性与针对这些表位的体液中抗体的滴度不一致。

NVS5的B_Mem前体分析提出了不同的和具有潜在重要性的图。该个体在约20个前体每百万B_Mem下具有非常低的CD4bs特异性B_Mem水平。这相当于该个体的总包膜蛋白特异性B_Mem前体的5.6％，这仅略高于这个检验法的检测极限10前体每百万B_Mem。相比之下，在B_Mem前体库中，可制备特异性结合CD4i和“其他”包膜蛋白表位的抗体的B_Mem占主导，分别相当于50％和44.4％的可检测包膜蛋白特异性前体(图2B和2C)。CD4bs特异性血浆抗体的缺失、特别是极低水平的CD4bs特异性B_Mem强烈地表明，NVS5的高中和度抗体反应不是由特异性结合CD4bs表位的抗体所造成的。

因为申请人的结论建立在对有限稀释条件下活化的B_Mem上清液进行分析的基础上，重要的是要证实在上清液中发现的单克隆抗体特异性与B_Mem本身的相对应。这采用为此目的而开发的如下所述的新算法通过单克隆抗体分离来解决。这种新算法使申请人能够鉴定编码特异性单克隆抗体的特异性VH和VL链，并克隆转染了恰当VH和VL链的基因的细胞，以便表达并分泌大量完全人抗体，而无需使用杂交瘤细胞融合技术、噬菌体展示或EBV转化。作为该新方法原理的证据，申请人鉴定了上清液为CD4i抗体阳性的孔中的B_Mem细胞，申请人从他们中克隆出三个单克隆抗体(N5-I1、N5-I2和N5-I3)。如图3所示，所有三个IgG1单克隆抗体在ELISA中都显示出与FLSC的高反应性，以及与gp120的低反应性。此外，每个单克隆抗体都采用VH(1-69)基因片段进行编码，该基因片段可发现于目前公布的大部分CD4i单克隆抗体中^[27]。通过对从申请人的NVS人群中的B_Mem培养物中分离出的23个另外的包膜蛋白特异性单克隆抗体(文稿写作中)的不断分析也证实了这一结果。总之，上述数据充分说明，B_Mem特异性应被视为旨在关联抗体特异性和HIV-1感染控制的研究的一个组成部分。

本发明所述的实验表明，B_Mem分析提供了一种简便的高信息量的方法，用以考察对于临床组群中交叉反应性HIV-1包膜蛋白表位的过去抗体反应，这些反应可能无法与体液抗体相吻合。申请人的NVS组群^[5]由不借助抗逆转录病毒治疗就可以将病毒控制在检测不到的水平多年的HIV-1感染个体组成，就是一个这样的人群。这些个体由于病毒控制应具备较低的抗原载量，这可以通过对某些HIV-1表位的同时低稳态抗体反应反映出来。申请人所进行的与gp120上的保护性受体结合部位的反应活性的血清学分析(图1)与这一预测是一致的。申请人的数据也支持最近的研究结果，该结果表明具有无法测出的病毒的精英控制者和鸡尾酒疗法(高效抗逆转录病毒疗法)治疗的患者，其所具有的包膜蛋白结合和中和抗体的水平均低于病毒慢性进展者^[9，10]。然而，申请人的研究表明，保护性中和标靶(CD4bs和CD4i表位)的特异性在于血浆采集时具有很少或没有同源抗体滴度的两个NVS个体(NVS9和NVS10)的B_Mem池中都很明显。此外，这些B_Mem的高频率说明对CD4i和CD4bs表位的反应在感染的早期阶段的某些时候相当强。采用更大的组群，此时应该是可以确定这些存档的反应是否与NVS的状态或某些会随病毒消除而最终减弱的短暂免疫控制的机制相关。

申请人的第三个NVS个体即NVS5在循环过程中具有高中和性抗体，如同在CD4诱导的和两个常规性的中和试验法(表2和3；图1B)中所测定的那样。该个体对于NVS个体的CD4i表位有最强的结合抗体反应，而对于CD4bs表位的重要反应并不明显。这种模式也在B_Mem池中得以反映，其中大约50％的前体对于CD4i表位是特异性的，而对于CD4bs表位却只有5.6％的极少量呈现特异性。

表2：PBMC法的中和度

表3：包膜蛋白假型病毒法的中和度

最近有人假定，在罕见的HIV阳性个体体内观察到的高中和活性归因于针对CD4bs的抗体^[6，7]，并且自然产生的或疫苗诱导产生的感染控制必须依赖于这种特异性。因为特异性结合CD4bs表位的一个单克隆抗体是高中和性的^[25]，因此鉴定这种与保护性相关的体内反应非常有用^[6，7]。相比之下，申请人发现，NVS5在感染过程中在还不具有高中和性免疫球蛋白活性时，对于CD4bs表位仅产生极少或无体液中抗体反应或B_Mem前体。具体地，申请人发现，NVS5具有CD4i表位的B_Mem前体似乎与控制该个体中的HIV-1感染同等重要。事实上，根据申请人的数据，CD4bs特异性抗体不太可能有助于NVS5中的病毒控制。

NVS5也是很突出的，其在体液中抗体反应和B_Mem前体池之间有良好的特异性匹配。值得注意的是，在第一个3年观察期内以及之后的8年观察期内，在上述所研究样本采样后不久，NVS5是申请人这个群体中唯一呈现出100到400拷贝范围内的短暂低水平病毒的个体。很可能在NVS5的血浆中观察到的中和抗体是响应于试样采集前后的时间内的病毒载量的增加而被诱导产生的。由于随后的病毒载量分析(图4)表明这种反弹被控制，因此NVS5提供了一个在HIV-1感染控制中产生特定抗体特异性的独特机会。

重要的是申请人的结果表明，在所有三个NVS个体中都以高频率呈现出CD4i特异性B_Mem，即使NVS个体中的两个表现出严格病毒控制的个体具有0到低水平的特异性结合CD4i表位的体液中抗体。相比之下，第三个个体NVS5在每种检测法中展示出特异性结合CD4i表位的抗体的高得多的滴度。这一结果与对暂时性病毒的这些反应的增加是一致的，并表明CD4i抗体对NVS5中的病毒复制有抑制作用。虽然申请人不能仅从NVS5就建立病毒控制和CD4i特异性抗体的存在之间的因果关系，他们却是与申请人最近获得的病毒控制和体液中抗体之间的相关性一致，其中该体液中抗体特异性结合了用FLSC免疫的恒河猴中的CD4i表位，在FLSC的该版本中CD4成分源自恒河猴(rhFLSC)^[28]。同样有关的是，大多数HIV-1感染者都有对CD4i表位的抗体反应，这些反应出现在人体^[29]和恒河猴中的申请人rhFLSC疫苗模型^[28]的初始病毒控制时间前后。因此，某些实施例涉及一种通过施用治疗有效量的抗CD4i特异性抗体来治疗人类HIV感染的方法，该抗体优选是完全人单克隆抗CD4i特异性抗体，包括那些在申请人NVS组群中鉴定的抗体，包括下述单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的新方法并不局限于人类，而是适用于制备用于任何动物种属的完全同源的单克隆抗体。因此，该方法可用于制备兽医用的单克隆抗体。

总之，申请人的数据表明需要对B_Mem库的特异性进行综合分析，以便对可有效治疗感染的抗体、如抗包膜蛋白体液免疫反应进行比仅用血浆抗体反应进行血清学分析更精确的鉴定。这种观点对个体NVS9和NVS10是显而易见的，其中血浆CD4bs和CD4i反应为低到负值，但在B_Mem池中这两组都呈现出良好特异性。因此，至少在一些严格控制病毒的个体中，血清学反应不足以表现在病毒受到控制时由该个体所产生的真实的抗体反应谱。还需要对B_Mem库的特异性进行综合分析，以便对其他传染病中的其他病原体的抗体进行更精确的鉴定，因为体液中抗体的水平远比存档记忆B细胞的滴度和特异性更低和更窄。

本发明的一些实施例涉及这里提出的新的单克隆抗体。

制备完全人单克隆抗的方法

在进行上述实验以鉴定特定的产生单克隆抗体的记忆B细胞的过程中，申请人开发了一种制备特异性结合已知抗原的完全人单克隆抗体的新方法，其解决了采用传统方法如杂交瘤经细胞法、EBV转化和噬菌体展示会遇到的许多问题。这种新算法基于直接克隆和表达来自活化B_Mem培养物的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)，其中该培养物包含可分泌用于靶免疫原的细胞的抗体。该方法基于激活B_Mem，以使其分化为能分泌所需单克隆抗体的体外浆细胞。B_Mem从已经接种疫苗进行免疫或自然感染病原体的个体的外周血细胞中分离得到。在本发明所述研究中，申请人从HIV感染的自我控制者体内分离B_Mem。B_Mem也可来自正在产生自身免疫反应的个体，如患有系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、克罗恩病、慢性疲劳综合症、多发性硬化症、重症肌无力、帕金森病和许多其它疾病的患者。自身免疫抗体可作为用于获得可阻断自体免疫抗体活性的治疗性分子如治疗性抗体的靶标。B_Mem也可来自患有或曾患有肿瘤性疾病且其B_Mem可包含肿瘤特异性免疫反应的个体。这种肿瘤例如可包括乳腺癌、卵巢癌和子宫肌瘤；前列腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤(如黑色素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌)、肝肿瘤、脑肿瘤等。

该B_Mem细胞在一定条件下培养激活，允许它们分化为可生产单克隆抗体的浆细胞。在该新算法中，产生特异性识别目标抗原(在本发明的示例部分中，目标抗原是上述HIV包膜蛋白中的一种)的抗体的VL和VH链的免疫球蛋白基因从该浆细胞中克隆，并且由诸如293T细胞(一种人胚胎肾细胞系)的合适细胞系表达，以生产所需的抗体。可以使用任何常用的用来表达哺乳动物重组蛋白的哺乳动物或昆虫细胞系。

该算法是通用的，因为它仅要求所需的浆细胞以大约1％人群的最少频率而存在，以便克隆免疫球蛋白基因。它原则上可用来从任何在其生命的一些时间点中引入了常规抗体反应的个体中鉴定和分离人单克隆抗体，因为已知B_Mem在外周血中会循环至少10个十年^[45]。该新方法不限于人，而是可用于制备可产生免疫反应的任何动物的抗体。

申请人已经简化了算法，以便在无需抗病毒治疗地控制病毒的HIV-1感染者的环境中实施^[5]。这些个体被引发对于HIV-1包膜蛋白糖蛋白的强烈免疫反应(在感染早期很明显)，并将病毒控制到抗原载量可能会非常低的值。由于需要抗原持续存在以促使持续的抗体反应，在这些个体中对包膜蛋白表位的体液中抗体滴度通常较低^[9]。然而申请人发现，即使抗体滴度减少后包膜蛋白特异性B_Mem仍然持续存在。

分泌抗包膜蛋白抗体的浆细胞的鉴定

从感染了目标病原体或接种了目标病原体疫苗或有自身免疫性疾病的供体中分离得到PBMC。在本发明的示例部分中，记忆B细胞是通过磁珠负分选法从三个不同的HIV-自我控制供体的PBMC中纯化得到的(加拿大温哥华的StemCell公司)。B_Mem采用抗CD27微珠通过细胞正分选进一步富集(美国加州Auburn的Miltenyi Biotech公司)。收集无B_Mem的B细胞群作为阴性对照。可采用本领域已知的任何方法来分离B_Mem细胞。

分泌对应于目标抗原的抗体(三个抗包膜蛋白抗体中的一个)的浆细胞可通过在细胞培养中诱导包膜蛋白特异性B_Mem分化成分泌抗体的浆细胞间接地鉴定。这是通过培养大约每孔100个采用细胞分选法从自发地控制病毒的HIV-1感染个体的外周血中分离出的B_Mem来完成的，该培养利用一种用于Toll样受体9(TLR9)的促效剂CpG ODN2006，该促效剂特异性结合到TLR9并触发相关的细胞内信号级联^[47]。还包括其他人所述的IL-2、IL-10和EBV^[26，48]。EBV已被证明可以促使B_Mem在体外分化为浆细胞^[48]。该公布方案通过添加来自无亲缘关系的供体的50,000个经辐照PBMC进行了改良，其中B细胞部分通过细胞分选而去尽。经辐照的且B细胞耗尽的PBMC此后被指定为饲养细胞。本领域的技术人员会知道激活记忆B细胞的其他方法。因为浆细胞中多达10％的总细胞蛋白可以成为抗体，因此他们是用于克隆编码由该细胞制备的抗体的VH和VL基因的mRNA的优良来源。

用于分离人单克隆抗体的新算法有两个主要步骤：鉴定分泌所需抗体的浆细胞，以及克隆编码该抗体的免疫球蛋白VH和VL基因。这些步骤如图6所示，说明如下。

具体来说，在RPMI 1640-10％FSC培养基内加入1μg/ml的CpG ODN-2006、5ng/ml的IL-2、5ng/ml的IL10、25％的EBV上清液以及饲养细胞，在96孔的圆底板中培养每孔100个B_Mem，每孔终体积为200μl。该板在37℃条件下在含5％CO₂的湿润培养箱中培养。培养2周后收集上清液，并通过使用抗人λ-链和κ链抗体的混合物来筛选全部抗HIV-1包膜蛋白抗体。采用ELISA法评价上清液中总免疫球蛋白，并采用重组包膜蛋白抗原评价特异性抗包膜蛋白抗体。包膜蛋白抗原组包括三种重组蛋白：

1.gp120，结合在HIV-1的外包膜蛋白糖蛋白gp160的结构域上的受体；

2.FISC(全长度单链)，它是人CD4的D1D2亚区和gp120结合域之间形成的一种融合蛋白^[30]。FLSC的gp120和CD4半部互相结合，形成稳定的分子复合物，其组成性地暴露通过由HIV-1感染诱导产生的广谱中和抗体所识别的CD4i表位^[30]。

3.稳定的寡聚蛋白，即对应于包膜蛋白的膜外区的gp140。这些试剂允许对特异性结合CD4i表位、CD4结合位点表位(CD4bs)和“其他”表位的抗体进行快速鉴定，后者包括各种由所有形式的包膜蛋白或仅由低聚物形式的包膜蛋白所表达的表位。

随后分析抗包膜蛋白+上清液，评价个体的轻链特异性和重链同种型。超过90％的抗包膜蛋白+培养物是IgG+。上清液中的总IgG也通过捕获ELISA法进行量化，但是本领域已知的任何方法都可以使用，包括放射免疫(RIA)、辐射免疫扩散法或免疫固定。总人IgG浓度通常在0.5至2μg/ml的范围内。

申请人确定，在96孔培养盘中培养100个B_Mem会导致不到10％的孔呈抗包膜蛋白抗体阳性。通过泊松统计，申请人确定任何阳性孔的抗体都来自单个包膜蛋白特异性B_Mem到浆细胞的分化。这也通过从随机孔中分离单克隆抗体抗体得到证实。HIV-1包膜蛋白特异性B_Mem前体的频率通过含有包膜蛋白特异性抗体的孔相对于总孔数量的分数来估算，并在B_Mem纯度校正后标化为每百万B_Mem。这些频率与测量用于各种抗原的人类B_Mem频率的其他研究非常一致^[38]。图2A显示了对第7天B_Mem培养物进行上清液分析的示例。

这些结果表明，分泌独特的抗包膜蛋白抗体的个体浆细胞克隆可在上述培养条件下在B_Mem培养7-14天后容易地鉴定。该系统不限于HIV-1抗原。原则上它可用于任何诱导个人产生抗体反应的抗原。此外，它不仅限于人，并可适用于可发现抗原特异性B_Mem的任何种属。该培养系统可提供用于克隆和表达编码所需抗体的免疫球蛋白基因的细胞源。

新算法涉及一种用于制备对应于已知抗原的完全人单克隆抗体或源自从其他动物种属的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

1.从曾暴露于特定的已知抗原的动物体中获取血液样本，

2.从该血液样本中分离出其中的记忆B细胞，

3.在一定条件下培养所分离出的全部记忆B细胞达足够长的时间，以允许记忆B细胞分化为能稳定产生单克隆抗体的浆细胞，

4.确定浆细胞是否产生特异性结合到特定已知抗原的单克隆抗体，

5.如果浆细胞产生单克隆抗体，则从浆细胞中分离总RNA，如果浆细胞不产生单克隆抗体，则重复步骤2-4，直到所分离的一定数量的记忆B细胞被鉴定分化成能稳定产生单克隆抗体的浆细胞。

从B_Mem培养物中分离包膜蛋白特异性单克隆抗体

一旦培养孔经鉴定含有能产生和分泌特异性结合该已知抗原的单克隆抗体(在本例中是抗包膜蛋白单克隆抗体)的浆细胞，下一步是克隆编码所需抗体的免疫球蛋白基因，并将其表达在真核细胞系中以产生抗体，而不需要杂交瘤细胞技术、EBV转化或噬菌体展示。

这就提出了一个问题，抗体是由两种基因表达的，一种编码重链和另一种编码轻链。抗体的抗原结合位点由VH基因(通用重链V区基因，记为VH)和VL基因、即Vκ或Vλ基因(通用轻链V区基因，记为VL)来编码，每一个都与各自的恒定区基因融合。对于最初有100个B_Mem的培养孔，理论上讲孔中将有100个不同的VH基因和100个不同的VL基因。问题是如何从用于100个B_Mem群的潜在10,000可能的VH-VL基因对中发现其中一对编码抗包膜蛋白抗体的正确VH和VL基因对。这一复杂的问题示于图7，其中正确的VH和VL基因用蓝色圆圈表示。为了保证清晰度，在图7中只标示了50个VH和50个VL基因，但问题的复杂性是显而易见的。

虽然应该有可能转染10,000个不同VH-VL基因对并利用高产量机器人方法通过ELISA进行筛选，但这是不实际的。申请人能够通过自己的发现来解决这个“复杂”问题，即只含有一个或两个目标基因(这里是编码所鉴定单克隆抗体的VH和VL链的基因)的单独克隆的基因的大型混合体能被共转染到单个细胞，然后可鉴定所需的基因产物。唯一的限制是要求一种足够敏感以鉴定该产品的检测法。用多个表达载体转染单个细胞是基于20年前开发的一种表达克隆法^[50，51]，申请人将其调整用于申请人的算法。

VH链和VL链cDNA的基因微型库的制备

要确定B_Mem特异性是否可通过培养物上清液分析来准确反映，申请人需要从能产生所鉴定抗包膜蛋白单克隆抗体的选定培养物中分离出单克隆抗体。尽管多次尝试，申请人采用改良的EBV转化法^[26]的最初尝试在分离能分泌所鉴定包膜蛋白特异性单克隆抗体的稳定细胞系方面失败了。出于此原因，申请人开发了一种全新的算法，其包括建立从选定孔内B_Mem培养物中直接制备的VH和VL链(Vκ/λ)基因的“微型库”，并用微型库中的基因鉴定编码由选定孔内B_Mem培养物所制备的特异性抗包膜蛋白单克隆抗体的特异性VH和VL链(Vκ/λ)基因。虽然有一个以上的B_Mem培养物可制备所需的抗包膜蛋白单克隆抗体，但是只选择一个阳性单克隆抗体制备孔用于下一步。可类似地处理其他单克隆抗体制备孔，以制备其各自的单克隆抗体。应记住，对应于其蛋白有很多表位的单个包膜蛋白来说，有许多可能的单克隆抗体。在一些实施例中，本领域的技术人员可鉴定多种不同的单克隆抗体制备孔，需要测试不同的单克隆抗体对于目标抗原或交叉反应性或其他特性的亲和力，以便在继续试验前确定该单克隆抗体之一是否在临床或研究应用中有可能更大的潜在意义。

之后采集来自所选的产生抗包膜蛋白的单克隆抗体阳性孔的细胞而不经过组织培养，利用RNAEasy^TM小量试剂盒(美国加州Valencia的QIAGEN公司)来分离总RNA。可使用本领域已知的分离总RNA的任何方法。然后，申请人通过逆转录酶-PCR选择性地放大人VH和VL链基因(Vκ或Vλ组基因，但不能同时有)，以制备各自的cDNA分子。选择Vk或Vl取决于培养物中原抗体的轻链同种型。这是使用κ或λ链特异性检测抗体通过ELISA来确定的。然后采用以前公开方法的改良方法将VH和Vκ或Vλ的cDNA克隆到IgG1和κ或λ真核表达载体上^[39]；任何真核表达载体都可以使用，只要它包括使蛋白能由哺乳动物或昆虫细胞系来分泌的启动子和分泌序列。

制备用于选定阳性孔的单独的VH或Vκ/Vλ的“微型库”通过汇集所有VH质粒克隆以制备VH微型库来实现。所有Vκ或Vλ质粒克隆被汇集用以制备单独的Vκ或Vλ微型库。然后将VH和Vκ或Vλ微型库混合并用于转染293T细胞。因此，细胞在同一时间用所有各自的VH链和VL链cDNA表达载体共转染。申请人使用了脂质体2000试剂盒(美国加州Carlsbad的Invitrogen公司)，但可使用本领域已知的任何方法。本领域的技术人员可认识到，可使用其他的宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞、杆状病毒、昆虫细胞，以及任何能够在允许细胞系内表达分泌哺乳动物蛋白的病毒系统。

然后，转染细胞被克隆并在一定条件下生长一段时间(约2～3天)，使该细胞产生抗体。然后用ELISA分析培养物上清液，以鉴定表达包膜蛋白特异性抗体的克隆。任何本领域已知的方法都可以用来鉴定合适的抗体表达。微型库的共转染证实，在混合物中存在至少一对抗包膜蛋白的VH-Vκ/λ基因对。采用从现有CD4i和CD4bs单克隆抗体中克隆出的VH和Vκ/Vλ基因进行的模拟研究显示，如果它以1％或更高的频率(当微型库是由50～100个总记忆B细胞/孔的培养物制成时，这是一个可行的范围)存在于混合物中，这一步可检测到正确的VH和Vκ/λ对。表达功能性抗包膜蛋白抗体的孔可利用目标重组抗原的筛查来鉴定。如果没有产生抗体的孔，则试验进程停止(并用一组新的记忆B细胞重复进行)。一旦确定微型库包含至少一个所需VH和VL基因的拷贝(以产生目标抗体为证)，则下一步是要鉴定正确的VH基因。

正确的VH基因可通过采用cDNA的整个Vκ或整个Vλ微型库与个体VH基因(cDNA)共转染到293T细胞中来鉴定。参见图4，申请人的研究结果表明，通常情况下只筛选约12到25个个体VH克隆就足以鉴定至少一个编码功能性抗包膜蛋白抗体的VH cDNA。然后转化的细胞在一定条件下在单个孔中生长一段时间以允许抗体表达，对培养物上清液进行筛选(例如用ELISA)，用于产生针对目标抗原的功能性抗体。阳性克隆表明已找到正确的VH基因。

下一步是鉴定正确的VL cDNA，如图5所示，其通过采用在上一步骤中鉴定的VH基因来共转染个体Vκ或Vλ基因、并再次筛选培养物上清液以用于功能性抗包膜蛋白抗体来完成。如对VH基因所观察到，筛选出12至25个个体VL克隆足以鉴定至少一个编码功能性抗包膜蛋白抗体的VL cDNA。

为了产生完全人单克隆抗体的克隆，申请人用所鉴定的VH和Vκ/λ对来瞬时转染293T细胞。在一定条件下生长一段时间以使转染细胞产生抗体后，用蛋白A亲和层析法从上清液中提纯单克隆抗体。该抗体可以采用任何其他用于纯化免疫球蛋白的常用方法如分子排阻色谱法、离子交换色谱法或高效盐分级分离法进行纯化。

这些步骤可以概括如下：

6.使用在步骤5中分离出的总RNA，制备用于由总RNA编码的每个VH链和每个VL链的cDNA，

7.克隆每个VH链和VL链cDNA到一个单独的真核表达载体，

8.选择所有包含VH链cDNA的表达载体以制备VH链微型库，并选择所有包含VL链cDNA的表达载体以制备VL链微型库，

9.用包括VH链微型库中的每个VH链cDNA表达载体的混合物和包括VL链微型库中的每个VL链cDNA表达载体的混合物来共转染恰当的宿主细胞，并使该共转染细胞在一定条件下生长达足够长的时间，以允许细胞稳定地产生抗体，

10.确定共转染细胞产生单克隆抗体，

11.用以下步骤鉴定在步骤10中产生单克隆抗体的VH链cDNA：

a.用从VH链cDNA微型库中获得的特定VH链cDNA表达载体和包括了来自VL链微型库的各cDNA表达载体之一的混合物共转染宿主细胞，并使该共转染细胞在一定条件下生长达足够长的时间，以允许共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆，

b.确定该克隆是否产生单克隆抗体，

c.如果共转染细胞产生单克隆抗体，则进行步骤11d，如果共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VH链cDNA表达载体重复步骤11a和11b，直到特定VH链cDNA表达载体被鉴定生产该单克隆抗体，

d.鉴定产生单克隆抗体的VH链cDNA，并选择用来制备产生单克隆抗体的克隆的VH链cDNA表达载体，

12.用以下步骤鉴定在步骤11中产生单克隆抗体的VL链cDNA：

a.用在步骤11d中鉴定的VH链cDNA表达载体和选自VL链微型库的特定VL链cDNA表达载体来共转染宿主细胞，并使共转染细胞在一定条件下生长达足够长的时间，以允许共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆，

b.确定该克隆是否产生单克隆抗体，

c.如果克隆产生单克隆抗体，则进行步骤12d，如果共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VL链cDNA表达载体重复步骤12a和12b，直到特定VL链cDNA表达载体被鉴定产生单克隆抗体，

d.鉴定产生单克隆抗体的VL链cDNA，并选择用来制备产生单克隆抗体的克隆的VL链cDNA表达载体，和

13.用在步骤11d中鉴定出的VH链cDNA表达载体和在步骤12d中鉴定出的VL链cDNA表达载体共转染宿主细胞，以制备可产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的宿主细胞。

一旦所需的VH-VL基因对已被鉴定，单克隆抗体可根据方案中特定目标所要求的量制备。为制备实验室规模的量(1-20mg)，申请人采用标准75cm²或150cm²组织培养瓶，用编码所需单克隆抗体的正确VH和VL基因的cDNA表达载体来共转染293T细胞。在培养几天后，用蛋白A色谱法从培养物上清液中分离IgG。一旦被克隆，VH和VL基因可在任何标准工业系统中进行表达，如CHO细胞或杆状病毒，以产生大量所期望的完全人单克隆抗体。本领域的技术人员知道如何鉴定该恰当的宿主细胞。

另外的实施例涉及一种在动物现时不存在特异性结合已知抗原的抗体时来确定该动物是否接触过或感染过已知抗原的方法。

其它算法和自动化

本领域的技术人员将了解如何自动化或简化本发明所述的方法。节省时间的一种改进是同时进行步骤2.2和2.3，这通过用VH微型库替代步骤2.3中的“已知”VH基因来实现。这导致正确VH和VL基因的同期鉴定，其通过随后转染以产生抗体来确认。在这个过程中的附加步骤可实现自动化；例如可在本发明所述方法中使用离心机，其可以在一天内制备数百个质粒小量试剂。同样，并行液体处理方法可以容易地适用于放置和获取B_Mem培养物，进行RNA分离并克隆VH和VL基因。如这里所述的96孔盘中的转染可适用于液体处理自动化。

本发明所述实验采用96孔盘进行B_Mem激活和上清液制备。在每200μl体积100个细胞的相同密度的B_Mem下但使用具有348或1536个孔的盘，应该有可能找到具有单个包膜蛋白特异性B_Mem和极少数其他B_Mem的培养物(特别是1536孔的盘)。由于用ELISA扩大了筛选，后一盘需要液体处理设备，以减少培养物和检测法之间的差异，但这些方法被已制定用于人类基因组计划，并应容易适应。使用1536孔盘的主要优点是，微型库的复杂性将被简化到该步骤可被省略的程度。

申请人根据本发明制备的单克隆抗体是使用转染到宿主细胞的重组表达载体所表达的“重组”抗体。本发明说明书及权利要求书所述的新的重组单克隆抗体和片段或其变种是通过用编码恰当的免疫球蛋白轻链和重链的cDNA转化宿主细胞而产生的。这些重组抗体可通过任何已知的基因工程技术制备。在一个优选实施例中，编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的cDNA与他们自己的转录和翻译表达调控序列操作性连接。表达载体和表达调控序列选择成与所采用的表达宿主细胞兼容。在一些实施例中，这两个基因都插入到相同的表达载体中。该记忆B细胞可以从任何产生抗体的动物中分离。在示例部分中使用了真核宿主细胞如293T细胞，但也可使用其他宿主细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、昆虫细胞或任何能够表达允许细胞系中的分泌真核蛋白的病毒系统。CHO细胞是重组蛋白疗法的工业生产中最常使用的哺乳动物宿主。自基因技术开始，大量的微生物细菌、真菌和哺乳动物细胞曾被开发用于生产外源蛋白。能够用携带了用于目标蛋白的基因的表达载体来转染的常用有机“平台”或宿主细胞包括大肠杆菌、几个酵母和哺乳动物细胞，其中大部分来自中国仓鼠细胞。

真核宿主细胞中的表达优选用于制备完全人单克隆抗体，因为这种细胞比原核细胞更可能构建和分泌正确折叠的和有免疫活性的抗体。但是，任何所制备的因不当折叠而无效的抗体(例如原核细胞中产生的抗体)可根据已知方法来复原(Kim and Baldwin，“Specific Intermediates in the Folding Reactions ofSmall Proteins and the Mechanism of Protein Folding”，Ann.Rev.Biochem.51，pp.459 89(1982))。此外，宿主细胞可用于制备部分完整抗体，如轻链二聚体或重链二聚体，根据本发明它们是抗体同系物。

应理解，在本发明中也可使用上述过程的变体。可采用重组DNA技术来去除部分或全部编码对结合目标蛋白来说是不必要的轻链和重链中的一种或两种的DNA，例如，恒定区可通过去除特异性氨基酸来进行修改。这种分子由截断DNA分子来表达，在本发明中也称为“抗体片段”。此外，可以制备双功能抗体，其中一重链和一轻链对应于第一抗原，而另一重链和轻链特异性结合到不同的第二抗原，或者第一抗原上的另一表位。

应用该新方法，就无需制备嵌合抗体如鼠/人嵌合体以用于人类治疗用途，制备嵌合体是非常昂贵的，并会引起不希望的免疫反应。但是，如果他们可以有应用的话，嵌合的免疫球蛋白链能利用本发明所述的VH或VL cDNA采用本领域已知的重组DNA技术来制备。

最近的研究显示，对应于辅助受体的抗体在治疗HIV中是有用的。见文献J Infect Dis.2008 Mar1；197(5)：721-7.Link Safety，pharmecokinetics，and antiviral activity of HGS004，a novel fully human IgG4monoclonal antibody against CCR5，in HIV-1-infected patients；and Lalezari J，Yadavalli GK，Para M，RichmondG，Dejesus E，Brown SJ，Cai W，Chen C，Zhong J，Novello LA，Lederman MM，Subramanian GM，该文献通过引用结合于本文中。本发明的某些实施例陈述了制备用于治疗HIV或AIDS的对应于该辅助受体抗原目标的完全人单克隆抗体的方法。

该方法的其他用途

该算法可很易于扩展用于分离特异性结合到任何动物已产生频率为1前体每千总B_Mem的B_Mem反应的抗原的单克隆抗体。可采用任何能够诱导产生免疫反应或者被修改或衍生成抗原的抗原分子(有机或无机的)来制备单克隆抗体。这在对疫苗或病原体的许多免疫反应的范围内是适用的^[52，38]。该方法也适用于诸如非人类灵长目动物如恒河猴的其他物种。

已经知道，具有采自于人类的免疫原的恒河猴的免疫反应会引起在人体内会被消除的抗体反应，因为它们是“自抗的”。另一方面，恒河猴和人类使用类似的VH和VL基因，使来自恒河猴的抗体特异性可利用分子遗传学接种到人类免疫球蛋白。例如，恒河猴可用来自作为治疗用单克隆抗体的潜在目标的人体的细胞蛋白进行免疫。由于这些蛋白是人体“自有”的，就难以在人体内激发针对这种蛋白质的自体抗体。相比之下，恒河猴应该会作出这样的抗体反应，并且恒河猴的特异性结合到所需免疫原的单克隆抗体抗体能够采用申请人的方法进行分离。通过简单地将恒河猴的VH和VL基因接种到所期望的IgG同种型的编码序列，可以很容易地将单克隆抗体人源化。

抗体及抗体检测

“抗体”包括能够特异性结合到目标蛋白表位的完整分子及其片段和变种，包括所例举的特异性结合到HIV包膜蛋白的单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体可用于治疗和诊断。例如，单克隆抗包膜蛋白抗体可用来治疗HIV或AIDS。这里所使用的用语“特异性结合”是指抗体的如下特性，即(1)以至少约1×10⁷M^-1的亲和力结合到目标蛋白，例如HIV包膜蛋白，和(2)优先以至少2倍、50倍、100倍、1000倍亲和力或远大于其结合到除目标蛋白以外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)的亲和力结合到该蛋白。在一个优选实施例中，抗体和目标蛋白质之间的相互作用如结合具有高亲和力(如亲和力稳定在至少10⁷M^-1，优选在10⁸M^-1和10¹⁰M^-1之间，例如约109M^-1)和特异性。这里所用的抗体的“治疗性或预防性有效量”是指这样的量，其在以单剂量或多剂量给药于个体时在防止、减少或延缓这里所述的任何疾病的发作或复发或减少相关症状方面是有效的。

抗体被认为是选择性或特异性结合到目标蛋白，即使它也结合本质上与目标蛋白不同源的其他蛋白。这发生在这些其他蛋白与目标蛋白的片段或结构域具有同源性时。这种在特定区域的保护产生了借助同源序列结合两个蛋白的抗体。在这种情况下可以理解，结合目标蛋白的抗体仍是选择性的。

用语“表位”指与抗体结合的抗原上的抗原决定基。表位通常包括如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团，典型地具有特异性三维结构特征和荷质比特性。表位一般至少有五个连续的氨基酸。

用语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人或嵌合抗体，单链Fv抗体片段、Fab片段、F(ab)₂片段和任何其他片段或其变种。多克隆抗体是特异性结合到特定抗原的抗体分子的异质群体，而单克隆抗体是对应于抗原内所含特定表位的抗体的同质群体。单克隆抗体是本发明实施例的重点。

对特定的目标蛋白或多肽具有特异性结合亲和力的抗体片段可通过已知技术来制备。这种抗体片段包括但不限于可由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)₂片段，以及可以通过导出F(ab’)₂片段的二硫键产生的Fab片段。备选地也可构建Fab表达库。例如见于Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281。单链Fv抗体片段是通过氨基酸桥(例如15～18个氨基酸)将Fv区内的重链和轻链片段连接形成的，产生一个单链多肽。单链Fv抗体片段可通过标准技术制备，如美国专利4,946,778所公开的技术。

一旦产生，抗体或其片段可依照标准免疫检测方法(例如包括下文所述的ELISA或RIA)进行检验以识别目标多肽。这可见于Short Protocols in Molecular Biology eds.Ausubel et al.Green PublishingAssociates and John Wiley & Sons(1992)。恰当的抗体通常具有对重组和天然蛋白相等的结合亲和力。

用语“单特异性抗体”是指显示出对特定目标如表位具有单一结合特异性和亲和力的抗体。该用语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，其在这里指单一分子组成的抗体或其片段的制剂。

本发明所称用语“重组”抗体是指通过重组方式来制备、表达、构建或分离的抗体，例如采用由转染到宿主细胞的重组表达载体所表达的抗体，从重组的组合抗体库中分离出的抗体，从被转基因以用于人类免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)中分离出的抗体，或者通过任何其他方式(其涉及将人类免疫球蛋白基因序列拼接到其他DNA序列)而制备、表达、构建或分离出的抗体。根据本说明书和权利要求书鉴定的抗包膜蛋白单克隆抗体是通过使用转染到宿主细胞的重组表达载体来表达的重组抗体。本发明所公开、描述及如权利要求所述的方法可用来自然地制备完全人单克隆抗体，而不使用化学合成。此外，用人VH和VL cDNA转染的宿主细胞优选被选择成可允许恰当的转译后修饰的细胞类型。

可用于本发明所述方法的免疫测定、免疫组织化学、RIA和IRMA是基于各种抗体或他们的变异或片段的产生。

生物样本中的抗原的量可通过放射性免疫测定法、免疫放射分析和/或酶联免疫测定法来测定。“放射性免疫测定法”是使用抗原的标记(即放射性标记)形式来检测和测量抗原浓度的技术。用于抗原的放射性标记的例子包括H3、C14和I125。样本(即生物样本)中抗原(即标靶蛋白，如抗包膜蛋白)的浓度通过比较样品中的抗原与有标记(即放射性标记)的抗原之间的对于抗体结合到抗原的竞争力来进行检测。为确保标记抗原和未标记抗原之间的竞争结合力，标记抗原的浓度应足以饱和抗体的结合位点。样本中抗原的浓度越高，则结合到抗体的标记抗原的浓度越低。

在放射性免疫测定中，为了确定结合到抗体的标记抗原的浓度，抗原-抗体复合物必须与游离抗原分离。将抗原-抗体复合物与游离抗原分离的一种方法是用抗同种型抗血清来沉淀抗原-抗体复合物。将抗原-抗体复合物与游离抗原分离的另一种方法是用福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌来沉淀抗原-抗体复合物。另一种将抗原-抗体复合物与游离抗原分离的方法是进行“固相放射免疫测定法”，其中使抗体(共价键地)链接到琼脂糖小球、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微滴度孔。通过比较结合到抗体的标记抗原的浓度与依据具有已知抗原浓度的样品制成的标准曲线，可确定生物样品中抗原的浓度。

“免疫放射分析法(IRMA)”是一种放射性标记抗体试剂的免疫测定。IRMA要求通过蛋白如兔血清白蛋白(RSA)的偶联技术产生一种多价抗原偶联物。该多价抗原偶联物必须具有每分子至少两个抗原残基，并且抗原残基彼此间必须分开足够的距离，至少可让两个抗体与抗原结合。例如，IRMA中的多价抗原偶联物可结合到固体表面如塑料球上。将未标记的“样本”抗原和针对被放射性标记的抗原的抗体加入到含有多价抗原偶联物涂层小球的试管中。样品中的抗原与多价抗原偶联物竞争抗原与抗体的结合位点。经过一段恰当的培养期，洗涤去除未结合的反应物，并测定固相放射量。所结合的放射性抗体的量与样品中的抗原浓度成反比。

最常见的酶免疫测定法是“酶联免疫吸附试验(ELISA)”。“酶联免疫吸附试验(ELISA)”是采用抗体的标记(即酶联)的形式来检测和测量抗原浓度的技术。

在一种“夹心式ELISA”中，抗体(即对应于特定目标抗原)链接到固相(即微滴度板)并暴露于抗原。然后固相被清洗以去除未结合的抗原。然后一个标记(即酶联)抗体结合到结合抗原(如果存在)，形成抗体-抗原-抗体夹心式结构。可以链接到该抗体的酶的例子是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反应，生成可检测的有色反应产物。

药物组合物

基于并受支持于上述数据，本发明的一些实施例提供了通过施用一个或多个特异性结合到HIV抗包膜蛋白或其片段或变种的新重组单克隆抗体的治疗有效量来治疗HIV或AIDS的方法。在一个优选实施例中，单克隆抗体特异性结合到CD4i蛋白。

本发明包括一种组配在施用给个体或个体中的靶细胞或组织的药物组合物中的单克隆抗体的应用。该应用既是诊断性的又是治疗性的。治疗性抗体(也称为“活性成分”)可结合到适合施用给个体(如人类)的药物组合物中。这种组合物通常包括抗体和药学上可接受的载体。然而可以理解，也可施用于体外细胞以及体内模型系统。

目前的单克隆抗体制剂可包含超过一种类形的抗体，以及超过一种对于所治疗的特定适应症是必需的其他治疗HIV的活性成分，特别是那些具有相互间无不利影响的互补活性的活性成分。这些分子以对于预定目的为有效量的形式存在于组合物中。

这对于配制剂量单位形式的口服或静脉注射组合物以方便给药和统一剂量来说是特别有利的。本发明中所称“剂量单位形式”是指适于作为单一剂量供给被治疗个体的物理性独立的单位；每个单位包含有经计算可与所需药物载体相关联地产生所需治疗效果的活性或分的预定量。本发明中剂量单位形式的说明决定于并直接取决于活性成分的独特性质和所要达到的特定疗效，以及对这种活性成分进行组合以用于个体治疗的技术领域中的内在限制。

抗体的治疗有效量(即有效剂量)是指可以降低或消除所治疗疾病的一种或多种症状或达到理想治疗效果的剂量。另一种确定单克隆抗包膜蛋白抗体的治疗有效剂量的方法是确定可减少HIV病毒载量的剂量。凡特异性结合到另一病原体的单克隆抗体，其治疗有效剂量可以是减少个体中病原体的数量的剂量。这个剂量通常会变化，可以是足以达到在个体中通常约1ng/ml到约10μg/ml之间的血清治疗剂水平的剂量，或者是足以达到在个体中约1ng/ml到约7μg/ml之间的血清治疗剂水平的剂量，不过这也可以有所变化。表示为每日剂量时，这一剂量可处于约0.1ng/kg体重/天和约20μg/kg体重/天之间，或者处于约1ng/kg体重/天和约10μg/kg体重/天之间。然而本领域的技术人员可以理解，某些因素可能会影响有效治疗一个个体所需的剂量，包括但不限于个体病症的严重性、以前的治疗、总体健康状况和/或年龄，以及其他失调或疾病的存在。此外，以一个治疗有效剂量的抗体对个体进行治疗可包括单一的治疗，或优选可以包括一系列治疗。

可以理解，活性治疗剂的恰当剂量取决于一般熟练的医生、兽医师或研究人员的专业知识范围内的许多因素。剂量会有所不同，例如取决于所治疗的个体或样本的个体特性、大小和病症，还取决于药物组合物的给药途径。还可以理解，适当剂量取决于治疗剂相对于要调制的表达或活性的潜能。例如，医生、兽医师或研究人员可能先开出一个剂量较低的药方，其后增加剂量，直到获得恰当的反应。此外可以理解，任何特定的动物个体的具体剂量水平将取决于各种因素，包括所使用具体药物成分的活性，个体的年龄、体重、健康状况、性别和日常饮食，以及给药时间、给药途径、排泄率、任何联合用药，以及需要调节的表达或活性程度。

本发明所使用的用语“药学上可接受的载体”意在包括任何及所有的与给药兼容的溶剂、分散介质、涂敷材料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。将这种介质和试剂用做药用活性物质是本领域中众所周知的。除了与活性成分不相容的传统介质或试剂，这些介质都可以用于本发明的组合物。补充活性成分或治疗剂也可被纳入组合物中。本发明的药物组合物的配方与它预期的给药途径相容。给药途径的示例包括注射用药，例如经静脉注、皮内的、皮下的、口服的(如吸入)、经皮吸收的(局部)、透黏膜的和直肠给药。用于注射、皮内或皮下用药的溶液或者悬浮液可包括以下成分：无菌稀释液，如注射用水、生理盐水、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或甲基苯甲酸酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸、柠檬酸或磷酸盐；和肌肉弹性调节剂，如氯化钠或葡萄糖。pH值可用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。肠外制剂可以封装于安瓿、一次性注射器或多剂量的玻璃或塑料小瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在可溶于水时)或分散液，以及用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。对于静脉注射给药来说，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(美国新泽西州Parsippany的BASF公司)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，其流动性应该达到易于通针的水平。它在生产和储存条件下必须是稳定的，必须能防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用而保存。无菌注射液可通过将抗体和任何其他活性成分以所要求的量加入具有上棕例举成分中的一种或其组合的恰当溶剂中来制备，并根据需要接着进行过滤消毒。

对于吸入给药，成分从含有合适推进剂(如二氧化碳类气体)的压力容器或分配器或喷雾器中以喷雾形式给药。

全身给药也可采用透黏膜或经皮的方式。对于透黏膜或经皮给药，在制剂中使用适于渗透穿过屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域技术人员熟知的，其中例如包括用于透黏膜给药的洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。透黏膜给药可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮给药，活性成分被制成到本领域已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏中。

如果合适，这些成分也可制成栓剂的形式(例如具有传统的栓剂基底，如可可脂和其他甘油酯)，或用于直肠给药的保留灌肠剂。

在下面的示例中对本发明做了更详细的描述，它们只是示例性的，因为其中许多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。

示例

示例1：个体和试剂

经美国马里兰大学机构审查委员会批准，从NVS供体^[5]和正常健康志愿者中采集血液。在离心过滤后从血液中采集血浆，保存在-80℃的条件下。采用Ficoll-Hypaque离心机分离外周血单核细胞(PBMC)，其在于冷冻介质(90％(v/v)的胎牛血清，DMSO)中再悬浮后保存在液氮中。

如前所述，在实验室内由HIV-1_Ba-L分离物和gp120_Ba-L与人CD4 D1D2的全长度单链(FLSC)融合蛋白制得重组gp120_Ba-L ^[30]。根据已公布的方法^[31]，在美国马里兰州Kensington的先进生物科学实验室中制备具有嵌合N端gp41的HIV-1_Ba-Lgp140寡聚蛋白(gp140_Ba-L)。从由美国马萨诸塞州波士顿的麻省总医院Brian Seed博士提供的sCD4-Ig构体所稳定转染的293T细胞中分离出融合到人IgG1(sCD4-Ig)的FC结构域的可溶性人CD4-D1D2。可溶性人CD4 D1-D4蛋白是由美国马萨诸塞州Cambridge的Biogen公司慷慨赞助的。FLSC的IgG嵌合体(FLSC-Ig)是在申请人的实验室依照文献[32]制备的。gp120_Ba-L的IgG嵌合体(gp120-Ig)源自于FLSC-Ig构体通过去除CD4-D1D2编码区和融合gp120区再加上FLSC与嵌合体的人IgG Fc片段的灵活的丝氨酸-甘氨酸连接而得。由此产生的gp120-Ig蛋白在实验室通过蛋白A层析柱(Sigma-Aldrich)从稳定转染的293T细胞中分离获得^[30]。亲和纯化的特异性结合到HIV-1gp120的C端肽上的山羊抗体(D7324)购自美国加州洛杉矶的Cliniqa公司。HIV-1CD4i单克隆抗体17b、19e、ED47、C11和A32通过蛋白A亲和层析从杂交瘤细胞或通过转染编码抗体的重、轻链基因制得的293T悬浮物分离纯化而得。这些单克隆抗体由美国新奥尔良的杜兰大学的James Robinson博士善意提供。CD4bs单克隆抗体m14^[33]由美国马里兰州Frederick的国立癌症研究所的Dimiter Dimitrov博士善意提供。CD4bs单克隆抗体b12^[25]从用合成b12-IgG1表达载体转染的293T细胞中制得。高度中和的单克隆抗体2G12购自奥地利维也纳的Polymun Scientific。

示例2：酶联免疫吸附试验(ELISA)

用一个改良的方案进行ELISA^[30，34]。所有孵育都在37℃下并采用50μl/孔体积的方法进行。Blotto采用缓冲液(含10％奶粉和0.1％NP-40的TBS(10mM的Tris，100mM氯化钠，pH值8.0))作为样品和检测抗体的封闭液和稀释液。采用TBS-T缓冲液(含有1％Tween-20的TBS)作为洗涤液。简言之，板在TBS中包背D7324(2μg/ml)，在4℃条件下过夜。通过1小时孵育将重组gp120_Ba-L(1μg/ml)或FLSC(1μg/ml)捕获到板上，然后将在Blotto缓冲液内稀释4倍的抗体或B细胞培养液的上清液置于板中孵育1小时。结合后的抗体用1∶1000稀释的AP山羊抗人IgG(用于检测单克隆抗体)或抗人λ链和/或κ链抗体(用于检测总反应性抗体和确定轻链)(Southern Biotech公司，目录#2040-04)孵育1小时，并用蓝磷微孔磷酸酶培养基系统(KPL 50-88-00)检测。gp140 ELISA依照上述方法操作，除了将gp140_Ba-L以1μg/ml浓度直接包背在板上并在4℃下过夜。类似地，通过用未偶联的山羊抗人λ和抗人κ(均来自Southem Biotech公司)进行包背，并用AP山羊抗人IgG进行检测，从而建立自制定量人总IgG ELISA。

依照文献[35]所述，采用竞争性ELISA确定血浆样品中是否含有可阻断CD4i单克隆抗体(17b，ED47)结合到FLSC的CD4i抗体或者可阻断CD4bs单克隆抗体(b12，sCD4-Ig)结合到gp120的CD4bs抗体。简言之，申请人如上所述地将FLSC或gp120捕获到96孔板上。在洗涤后，捕获的包膜蛋白用与50％结合浓度的生物素化的单克隆抗体预混合1小时的标识浓度的血浆样本来孵育，然后如上所述地用AP-偶联链霉亲和素(Southern Biotech公司)来检测。数据被归一化到在正常血清存在条件下呈现的活性百分比，并计算IC50滴度。

示例3：对结合到CD4或CCR5的HIV-1包膜蛋白的抑制

通过流式细胞仪采用CEM-NK^r细胞(用于CD4检测)或C2fTh/CCR5细胞(用于CCR5检测)来测定单克隆抗体阻断gp120-Ig结合到CD4或FLSC-Ig结合到CCR5的能力。简言之，用Zenon-APC试剂盒(美国加州Carlsbad的Invitrogen公司)按照制造商的操作说明来标记FLSC-Ig或gp120-Ig，并将其用于确认配体与其受体的特异性饱和结合的初步实验中。血浆中的CD4bs或CD4i单克隆抗体阻断配体结合的能力是通过在用指示细胞进行孵育前用血浆稀释液来预孵育限制浓度的APC标记的gp120-Ig或FLSC-Ig、以及使用FACSCalibur流式细胞仪(美国加州圣何塞的BD Biosciences公司)通过流式细胞计数法测量结合配体来测定的。

示例4：中和实验

申请人测试了研究组所做的常规PHA-PBMC法^[28，36]的中和试验中的血浆样品，以及由美国加州南旧金山的Monogram Biosciences公司所做的包膜蛋白假型病毒法^[8，37]中的血浆所纯化制得的IgG。作为CD4i抗体的一种附加措施，在利用了TZM-bl报告细胞和HIV-2_7312A/V434M的“CD4诱导”的中和试验中测试血浆，如文献[20]所述。该法具体地是在亚抑菌量的可溶性CD4(sCD4)存在的条件下通过明显增强病毒中和度来检测CD4i抗体^[20，28]。

示例5：用于从人B_Mem细胞中克隆抗体的实验室方案

第一部分：用于来自RNA样本的人单克隆抗体VH和VK/VL基因的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

A)试剂

1.RT-PCR试剂盒：Invitrogen^TM SKU#12574-035(带有Platnum Taq High Fidelity的Superscript

Ⅲ一步式RT-PCR系统)

2.核糖核酸酶(RNase)抑制剂：Promega#N26IB，RNasin

Plus(40U/μl)

3.由RNeasy

小试剂盒(QIAGEN

#74106)从B_mem培养物细胞中或从任何含有编码所需单克隆抗体的mRNA的RNA样品中分离获得RNA

4.PCR引物(序列显示在下面的列表中)：

(a)VH引物：5’VH混合物(每个5μM)和3’VH混合物(每个20μM)

(b)VK引物：5’VK混合物(每个5μM)和3’VK混合物(每个20μM)

(c)VL引物：5’VL混合物(每个5μM)和3’VL混合物(每个20μM)

(d)IgG-VH引物(与3’IgG-VH-NheI配对的5’VH混合物)

(e)IgG-CH引物(与3’IgG-HCstop配对的5’VH混合物)

(f)IgCK引物(与3’Ig-CKstop配对的5’VK混合物)

(g)IgCL引物(与3’Ig-CLstop配对的5’VL混合物)

5.QIAEXⅡ凝胶回收试剂盒

(V＝可变区；C＝恒定区；H＝重链；L＝λ轻链；K＝κ轻链)

引物次序排列(下划线部分是限制性内切位点)

5’VH引物

3’VH引物：

3Sal1 JH1/2/4/5    TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACRGTGACCAGG    (SEQ ID：14)；

3Sal1 JH3          TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTC     (SEQ ID：15)；

3Sal1 JH6          TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG       (SEQ ID：16)；

3Sal1-JH3^*         TGCGAAGTCGACGCTAAAGAGACGGTGACCACTGTC     (SEQ ID：17)；

5’VK引物：

3’VK引物

3BsiWI JK1/4       GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTCCC         (SEQ ID：33)；

3BsiWI JK2         GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC         (SEQ ID：34)；

3BsiWI JK3         GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC         (SEQ ID：35)；

3BsiWI JK5         GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC         (SEQ ID：36)；

5’VL引物

3’VL引物：

3’Xho1-CL    CTCTACTCGAGGGYGGGAACAGAGTGAC           (SEQ ID：56)；

备选3’引物：

B)过程

1.建立VH、VK或VL链基因的RT-PCT反应；每个反应(25μL体积)：

(可以将前6种试剂混合制成主要混合物，分成若干20μl，每个反应加入5μl RNA样品)

2.PCR条件：

1)将PCR块预热到50℃

2)在50℃下保持30分钟

3)在94℃下保持2分钟

4)进行40个循环：94℃15秒、55℃30秒、68℃45秒(对于CH、CK或CL为2分钟)

5)在68℃下保持5分钟

6)保持4℃直到反应结束

3.从RT-PCR中分离VH和VK或VLDNA

1)运行1.2％Argrose凝胶

2)酶切DNA条带(约400bp大小)

3)用QIAEXⅡ凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化DNA

4)进样1μl纯化后的DNA以确认其纯度

第二部分：人单克隆抗体VH和VK/VL基因的表达克隆

A)试剂

1.载体质粒(载体序列如下所示)：

1)用于克隆VH基因的p19EH-AS6：

pBR322源载体，含有CMV启动子、连接到人IgG1重链恒定区(CH1到CH3)的单克隆抗体19e的VH基因的小鼠IgK信号肽序列上游以及hBGH聚腺苷酸位点。克隆位点被插入到信号序列(AgeI/SgrAI)、J-CH1联结点(SalI)、CH1序列(NheI)和CH3端(NotI/HindⅢ)，以促进重链基因的克隆。

2)用于克隆VK基因的p14B7K-SN1：

pBR322源载体，含CMV启动子、连接到人Igκ链恒定区(CK)的单克隆抗体14B7的VK基因的小鼠IgK信号肽序列上游以及hBGH聚腺苷酸位点。克隆位点被插入到信号序列(AgeI/SgrAI)、J-CK联结点(BsiWI)和CK端(NotI/HindⅢ)，以促进Igκ链基因的克隆。

3)用于克隆VL基因的pA32L-SN5：

pBR322源载体，含CMV启动子、连接到人Igλ链恒定区(CL)的单克隆抗体A32的VL基因的小鼠IgK信号肽序列上游以及hBGH聚腺苷酸位点。克隆位点被插入到信号序列(AgeI/SgrAI)、5’CL(XhoI)和CL端(NotI/HindⅢ)，以促进Igλ链基因的克隆。

B)载体序列

1)载体p19EH-AS6：

将单克隆抗体19e的VH基因插入到AgeI/SalI的克隆位点以制备19eVH质粒，然后通过PCR产生从位于AgeI位点5’端的A到C的点突变，将SgrAI位点引入AgeI位点(在小鼠IgK信号序列)。NheI的位点通过重叠PCR采用引物(5’IgG-CH1-NheI：cttcccgctagcaccctcctccaagagcac(SEQ ID NO：63)和3’IgG-CH1-NheI：ggagggtgctagcgggaagacsgatgggcccttg(SEQ ID NO：64))引入到CH1的5’端附近。NheI的位点通过PCR采用引物(5’IgG-CH1-NheI和3’IgG-Cstop-NotI(gtggaagcttgcggccgctcatttacccrgagacagggacaggct；SEQ ID NO：65)引入到CH3序列的端部。

2)载体p14B7K-SN1：

将单克隆抗体14B7(N5-I1)的VK基因插入到AgeI/BsiWI的克隆位点，以制备14B7VK质粒，然后通过PCR产生位于Agel位点5’端的A到C的点突变，以将SgrAI位点引入AgeI位点(在小鼠IgK信号序列)。NotI的A位点通过PCR采用引物5‘IgK-C(GGADATYAAACGTACGGTGGCTGCACCATC；SEQ ID NO：67)和3’IgK-NotI(GTGGAGCTTGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG；SEQ ID NO：68)引入到CK序列末端。

3)载体pA32L-SN5：

将单克隆抗体A32的VL基因插入到AgeI/XhoI的克隆位点以制备A32VL质粒，然后通过PCR产生位于Agel位点5’端的A到C的点突变，以将SgrAI位点引入Agel位点(在小鼠IgK信号序列)。NotI的A位点通过PCR采用引物5’IgL-CH1GTCACTCTGTTCCCRCCCTCGAGTGAGGAGCTTCAAGCC(SEQ ID NO：70)和3’IgL-NotI(GTGGAAGCTTGCGGCCGCTCATGAACATTCTGYAGGGGCCACTGTC；SEQ ID NO：71)引入到CL序列末端。

2.酶：AgeI、SalI、BsiWI、XhoI、SgrAI、NheI、NotI、T4DNA连接酶

3.DH5-α感受态细胞

4.QIAGEN QIAEXⅡ

凝胶回收试剂盒，QIAGEN MinElute

反应清理试剂盒，QIAGEN QIAprep

旋转小提试剂盒

5.源自RT-PCR的VH和VK/VLDNA

1)源自RT-PCR的VH DNA(与第一3’VH混合物配对的第一5’VH混合物)

2)源自RT-PCR的VKDNA(与第一3’VK混合物配对的第一5’VK混合物)，或

源自RT-PCR的VL DNA(与第一3’VL混合物配对的第一5’VL混合物)

3)源自RT-PCR的IgG-VH DNA(与第一3’IgG-CH1混合物配对的第一5’VH混合物)

4)源自RT-PCR的IgG-CHDNA(与第一3’IgG-HCstop混合物配对的第一5’VH混合物)

5)源自RT-PCR的IgCK DNA(与第一3’IgCKstop混合物配对的第一5’VK混合物)

6)或源自RT-PCR的Or IgCL DNA(与第一3’IgCLstop混合物配对的第一5’VL混合物)

B)过程：人单克隆抗体VH和VK/VL基因的克隆

1.载体的制备：

1)VH载体

p19EH-AS6用AgeI和SalI酶切，然后在Argrose凝胶电泳之后分离载体DNA(较宽条带，～5.7Kb)。

2)VK载体：

p14B7K-SN1用AgeI和BsiWI酶切，然后在Argrose凝胶电泳后分离载体DNA(较宽条带，～5.0Kb)。

3)VL载体：

pA32L-SN5用AgeI和XhoI酶切，然后在Argrose凝胶电泳后分离载体DNA(较宽条带，～4.9Kb)。

4)IgG-VH载体：

p19EH AS6用AgeI和NheI酶切，然后在Argrose凝胶电泳后分离载体DNA(较宽条带，～5.7Kb)。

5)IgC载体：

p19EH-AS6用AgeI和NotI酶切，然后在Argrose凝胶电泳后分离载体DNA(较宽条带，～4.5Kb)。

^*注意：确保所有载体是完全双酶切片段。这可以通过DH5-α感受态细胞的自连接和转化来测试。没有或极少有菌落是良好载体制剂的迹象。

2.插入段的制作：

1)VH基因插入段：

VH基因RT-PCR DNA用AgeI和SalI酶切，然后用QIAGEN MinElute

反应清理试剂盒纯化。

2)VK基因插入段：

VK基因RT-PCR DNA用AgeI和BsiWI酶切，然后用QIAGEN MinElute反应清理试剂盒纯化。

3)VL基因插入段：

VL基因RT-PCRDNA用AgeI和XhoI酶切，然后用QIAGEN MinElute

反应清理试剂盒纯化。

4)IgG-VH基因插入段：

来自RT-PCRDNA的IgG-VHDNA用AgeI和NheI酶切，然后用QIAGEN MinElute反应清理试剂盒纯化。

5)IgG-CH、Ig-CK和Ig-CL插入段：

IgG-CH、Ig-CK和Ig-CL基因RT-PCR DNA用AgeI和NotI酶切，然后用QIAGEN MinElute

反应清理试剂盒纯化。

3.连接和转化

1)使1μl量的每个载体和VH、VK/VL插入段DNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，以检测纯度并估算相对DNA浓度。

*注意：确保PCR DNA条带不会被切成两个或多个条带。如果PCR DNA被切成碎片，则应使用替代酶来酶切PCR DNA(分别用SgrAI替代AgeI，或克隆IgG-VH替代VH，或克隆IgG-CH、Ig-CK和Ig-CL分别替代VH、VK和VL)

2)构建每个VH、VK/VL载体和插入段对的DNA连接，载体/插入段之比为1∶4。

3)将所连接的DNA转化成DH5-α感受态细胞。每一种铺展到两个LB-Amp+板。

*注意：确保载体自身连接不含菌落(少数几个可以接受)，并且插入段转化是每个板至少有50个菌落。

第三部分：人单克隆抗体VH和VK/VL基因的表达克隆(续)

A)试剂

1.QIAGEN QIAprep

旋转小提试剂盒，QIAGEN质粒大提试剂盒

2.Invitrogen公司的Lipofectamine

2000和Roche公司的FuGENE

6

3.293T细胞及其培养基

4.测序引物序列：

Ig-F864：GTCCAACTGCACCTCGGTTC(SEQ ID NO：164)

B)过程：筛选所需的VH和VK/VL基因对克隆

1.制备质粒微型库

1)VH基因克隆微型库(VHm)

结合来自于用于VH克隆的两个板中之一的所有菌落，作为VH微型库。培养，然后用QIAprep旋转小提试剂盒分离质粒DNA，以获得VHm。试验浓度和纯度(OD260/280)

2)采用κ轻链的用于单克隆抗体的VK基因克隆微型库(VKm)

结合来自于用于VK克隆的两个板中之一的所有菌落，作为VK微型库。培养，然后用QIAprep旋转小提试剂盒分离质粒DNA，以获得VKm。试验浓度和纯度(OD260/280)

3)采用λ轻链的用于单克隆抗体的VL基因克隆微型库(VLm)

结合来自于用于VL克隆的两个板中之一的所有菌落，作为VL微型库。培养，然后用QIAprep旋转小提试剂盒分离质粒DNA，以获得VLm。试验浓度和纯度(OD260/280)

2.通过在96孔板中的转染来筛查微型库：

1)在转染前一天再生293T细胞。

2)在总25μl/孔普通培养基上，将0.15μg VHm DNA与0.15μg VKm或VLm DNA混合。

3)在25μl/孔普通培养基内稀释0.5μl Lipofectamine2000，室温孵育5分钟(可制备主要混合物)。

4)将25μl/稀释Liporectamine2000加入到DNA混合物孔，室温孵育15分钟。

5)加入150μl/孔的293T细胞(0.4×10⁶/ml完全培养基)，培养2～3天

6)取上清液(100μl/孔)，稀释到150μl/孔的Blotto缓冲液，然后采用ELISA检测抗体活性和总IgG浓度。

7)如果ELISA的抗体活性结果呈阳性(即使很弱)，则转到步骤3。如果总IgG浓度很低(＜0.5μg/ml)，则重复DNA的制备和/或转染，以获得良好的IgG收率。如果ELISA的抗体活性结果呈阴性，且总IgG浓度是正常的(＞1μg/ml)，则在这一点终止(可能需要采用个体或亚科特异性5’引物来重复RT-PCR，以优化RT-PCR)。

3.所需VH和VK或VL基因克隆的筛查：

1)从来自其他转化板的个体菌落中分离VH和VK或VL质粒DNA。获得VHn(1，2.n)和VKn或VLnDNA。一般来说，24个VH菌落和24个VK或VL菌落是良好的开端。

2)在转染前一天293T细胞传代培养。

3)对于VH克隆，在总25μl/孔普通培养基上将0.15μg VHn DNA与0.15μg VKm或VLm DNA混合。对于VK或VL克隆，在总25μl/孔普通培养基上，将0.15μg VHm DNA与0.15μg的VKn或VLn DNA混合。

4)在25μl/孔普通培养基内稀释0.5μl Lipofectamine2000，室温孵育5分钟(可制备主要混合物)。

5)将25μl/孔稀释Lipofectamine2000加入DNA混合物孔，室温孵育15分钟。

6)加入150μl/孔的293T细胞(0.4×10⁶/ml完全培养基)，培养2～3天

7)取上清液(100μl/孔)，稀释为150\μl/孔的Blotto缓冲液，然后采用ELISA检测抗体活性。

8)如果在ELISA中对于VHn、VKn或VLn的抗体活性结果呈阳性(通常很明显)，则转到步骤4。

如果对VHn、VKn或VLn中的任一个都呈阴性，则挑选更多的菌落，并重复直到对于每一个VHn和VKn或VLn基因来说至少有一个阳性菌落被鉴定。

4.鉴定VH和VK或VL基因克隆的证据

1)对所鉴定的VH和VK或VL基因克隆测序，确保他们是功能性VH和VK或VL基因，并且没有来自载体的污染。

2)在转染前一天293T细胞传代培养。

3)在总25μl/孔普通培养基上，将0.15μg鉴定VHn DNA与0.15μg鉴定VKn或VLn DNA混合。

4)在25μl/孔普通培养基内稀释0.5μl Lipofectamine2000，室温孵育5分钟(可制备主要混合物)。

5)将25μl/孔稀释Lipofectamine2000加入DNA混合物孔，室温孵育15分钟。

6)加入150μl/孔的293T细胞(0.4×10⁶/ml完全培养基)，培养2～3天

7)取上清液(100μl/孔)，稀释到150μl/孔的Blotto缓冲液，然后采用ELISA检测抗体活性和总IgG浓度。

8)如果在ELISA中对于所鉴定的VHn、VKn或VLn对的抗体活性结果呈阳性(通常很明显，阳性很强)，则转到步骤5。如果呈阴性，则检查步骤3中任何可能存在的错误。

5.人单克隆抗体的制备：

1)大量制备(maxiprep)所鉴定的VHn和VKn或VLn克隆

2)依照FuGENE

6试剂的使用指南，通过转染293T细胞来制备单克隆抗体

3)用蛋白A或蛋白G法纯化单克隆抗体

示例6：克隆自人B_Mem细胞的抗HIV-1gp120抗体

表3和4提供了特异性结合HIV gp120的人抗体的例子。这些抗体由人B_Mem细胞采用本发明所述方法克隆制得。表3显示了每个克隆抗体的重链基因的特征，表4显示了其轻链基因的特征。

对所列出的每一个抗体都显示了针对HIV gp120的单克隆抗体结合特特异性(CD4i、CD4bs或gp120的另一个区的“其他”)、单克隆抗体识别码，以及重组形成重链或轻链的基因。表中还示出重链(CDR-H3)或轻链(CDR-L3)的第三互补决定区(CDR-3)的氨基酸序列。还显示了每一所列抗体的重链的CDR-H3的长度，以及每一所列抗体的轻链的三个CDR中每一个的长度。互补决定区是每个抗体链中的高变区，并与确定抗体的结合特异性有关。虽然不受理论限制，然而可以认为就确定抗体的结合特异性而言，CDR-3是三个CDR中最具决定性的。

表3对应于HIV-1 gp120的新单克隆抗体的基因表达谱：重链基因

表4.对应于HIV-1 gp120的新单克隆抗体的基因表达谱：轻链基因

示例7：采用由人B_Mem细胞克隆得到的抗HIV-1 gp120抗体的HIV-I假病毒的中和试验

表5显示出用由本发明所述的人B_Mem细胞克隆得到的抗HIV-1 gp120抗体进行HIV-1假病毒的中和试验。中和实验采用标准方法进行(Montefiori，D.C.(2004)Evaluating neutralizing antibodies against HIV，SIV and SHIV in luciferase reporter gene assays.Current Protocols in Immunology，(Coligan，J.E.，et al，W.Strober，and R.Coico，eds.)，John Wiley & Sons，12.11.1-12.11.15。每个抗体的IC₅₀显示如下。

表5TZM-BL指示细胞系中HIV-1假病毒的中和

示例8：采用由人B_Mem细胞克隆得到的抗HIV-1 gp120抗体的ADCC试验。

图11A-C是表示采用由本发明所述的人B_Mem细胞克隆得到的示例性抗HIV-1 gp120抗体进行抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)试验。ADCC试验依照文献(Gomez-Roman VR，et al，Asimplifiedmethod for the rapid fluorometric assessment of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.J ImmunolMethods.2006 Jan 20；308(1-2)：53-67.Epub 2005 Nov 28)所述方法进行。

援引并入

在本申请中引用了各种出版物、专利和/或专利申请，以便更充分地描述本发明所属领域的技术状态。这些出版物、专利和/或专利申请的公开内容通过引用整体地结合到本文中，如同每个独立的出版物、专利和/或专利申请具体地和单独地通过引用结合于本文中一样。

其他实施例

本领域的技术人员可以清楚，可以在不会离本发明的范围或精髓的前提下对本发明进行各种修改和变化。对于本领域技术人员来说，从本发明此处所公开的详细说明和实践过程中可以清楚本发明的其他实施例。这些详细说明和示例被视为仅是示例性的，本发明的真实范围和思想将在下列权利要求中予以说明。

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Claims (6)

1.一种用于制备特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的方法，包括步骤：

(1)分离记忆B细胞：从一个已接触过所述特定已知抗原的动物中获取的血液样本中分离出记忆B细胞；

(2)筛选记忆B细胞：筛选能够分化成能稳定产生所述单克隆抗体的浆细胞的记忆B细胞

(b)培养记忆B细胞：有限稀释培养所分离出的记忆B细胞7～14天，以允许所述记忆B细胞分化为能稳定产生单克隆抗体的浆细胞；

(c)确定所述浆细胞是否能产生特异性结合所述特定已知抗原的单克隆抗体；

(d)如果所述浆细胞能产生特异性结合所述特定已知抗原的所述单克隆抗体，则从所述浆细胞中分离出总RNA，而如果所述浆细胞不产生所述单克隆抗体，则重复步骤(b)-(d)，直到所分离出的记忆B细胞被鉴定为分化成能稳定产生所述单克隆抗体的浆细胞；

(e)从所述浆细胞中分离出总RNA；

(f)使用在步骤(e)中分离出的总RNA来制备总RNA中的编码抗体重链可变区(VH)的mRNA分子的cDNA和编码抗体轻链可变区(VL)的mRNA分子的cDNA；

(g)将VH链cDNA克隆到真核表达载体，并将VL链cDNA克隆到真核表达载体；

(h)选择包含VH链cDNA的表达载体制备VH链微型库，并选择包含VL链cDNA的表达载体制备VL链微型库；

(i)用包括来自VH链微型库的VH链cDNA的表达载体的混合物和包括来自VL链微型库的VL链cDNA的表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，使共转染细胞生长达足够长的时间，以允许这些细胞能稳定地产生抗体；

(j)确定所述共转染细胞产生特异性结合所述特定已知抗原的单克隆抗体；

(k)鉴定编码了如步骤(j)中单克隆抗体的VH链的VH链cDNA，其包括步骤：

(i)用从VH链cDNA微型库中获得的特定VH链cDNA表达载体和包括来自VL链微型库的VL链cDNA表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆；

(ii)确定该克隆是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体；

(iii)如果该共转染细胞产生了特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(k)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VH链cDNA表达载体来重复步骤(k)之(i)和步骤(k)之(ii)，直到特定VH链cDNA表达载体被鉴定为可产生单克隆抗体；

(iv)鉴定产生单克隆抗体的VH链cDNA，并选择用来制备产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的克隆的VH链cDNA表达载体；

(l)鉴定编码了如步骤(k)中的单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，包括步骤：

(i)用在步骤(k)之(iv)中鉴定的VH链cDNA的表达载体和选自VL链微型库的特定VL链cDNA表达载体共转染恰当的宿主细胞，使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定地产生抗体的克隆；

(ii)确定该克隆是否产生特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体；

(iii)如果该克隆产生了特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(l)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则用不同的特定VL链cDNA的表达载体重复步骤(l)之(i)和步骤(l)之(ii)，直到特定的VL链cDNA表达载体被鉴定出产生单克隆抗体;

(iv)鉴定编码单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，并选择用于制备产生单克隆抗体的克隆的VL链cDNA表达载体；以及

(m)用步骤(k)之(iv)鉴定的VH链cDNA的表达载体和用步骤(l)之(iv)鉴定的VL链cDNA的表达载体共转染恰当的宿主细胞，以制备能够产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的宿主细胞，从而产生结合特定已知抗原的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特定已知抗原是病原体的抗原。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述病原体是人类免疫缺陷病毒(HIV)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：动物被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，并能自发地控制病毒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物是人，而所述单克隆抗体是完全人单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述单克隆抗体是完全人单克隆抗体；

重链可变区(VH)的第三互补决定区包含SEQ ID NO:73到SEQ ID NO:115中的至少一个氨基酸序列；

轻链可变区(VL)的第三互补决定区包含SEQ ID NO:116到SEQ ID NO:163中的至少一个氨基酸序列。

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