CN103534352B - 浆细胞或成浆细胞的选择方法、靶抗原特异性抗体的制备方法、新的单克隆抗体 - Google Patents
浆细胞或成浆细胞的选择方法、靶抗原特异性抗体的制备方法、新的单克隆抗体 Download PDFInfo
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Abstract
提供由广泛的动物物种高效率地制作抗原特异性单克隆抗体的技术,利用该技术提供新的抗原特异性单克隆抗体。用靶抗原对非人动物进行免疫,从免疫成立后的非人动物中采集淋巴液等,或者,从具有抗靶抗原抗体的人采集淋巴液等,将采集的淋巴液等和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合,选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。根据上述方法,选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞,从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因,鉴定其核苷酸序列,根据鉴定的基因的核苷酸序列制备所述抗体或抗体片段,并制备靶抗原特异性抗体或抗体片段。
Description
相关申请的相互参照
本申请主张于2011年3月30日申请的日本特愿2011-075135号的优先权,其全部内容作为公开而特别引用于此。
技术领域
本发明涉及浆细胞或成浆细胞的选择方法、靶抗原特异性抗体的制备方法、新的单克隆抗体。更详细而言,本发明涉及与靶抗原特异性结合的浆细胞或成浆细胞的选择方法、使用利用该方法得到的浆细胞或成浆细胞制备靶抗原特异性抗体的方法、以及利用该抗体制备方法新得到的新的单克隆抗体。
背景技术
目前,抗体药品开发中使用的单克隆抗体,大多是将小鼠抗体人源化而得到的抗体。其原因在于,作为单克隆抗体制作方法,确立了小鼠杂交瘤法。但是,对于作为抗体药物的靶标的人蛋白的功能性抗原表位中的多数,人-小鼠间的氨基酸序列同源性高,即使用这样的抗原对小鼠进行免疫,由于免疫耐受,也难以得到特异性高的抗体。因此,必须制作数量巨大的杂交瘤并进行筛选,直至获得具有高能力的抗体。于是,为了开发新的抗体药品,人们对尽可能与人的抗原具有不同的氨基酸序列的动物物种进行免疫,回避免疫耐受的限制,从而寻求用于高效率地生产具有高能力的单克隆抗体的方法。
以往的单克隆抗体制作广泛采用下述方法:通过使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合,制作具有自主增殖能力的杂交瘤,再从中筛选具有产生具备靶标特异性的抗体的能力的克隆。但是,杂交瘤方法存在几个缺点。其中一个缺点是,由于杂交瘤技术是限于小鼠抗体产生细胞的方法,所以难以在其他动物物种中应用。而且,杂交瘤的筛选费时费事,这也是缺点。另外,即使进行筛选,也无法保证得到具有抗原特异性抗体产生能力的克隆,这也是个问题。
为了克服上述缺点,在人单克隆抗体的制作中,开发了应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)的具有抗原特异性抗体产生能力的浆细胞(抗原特异性浆细胞)的鉴定法(日本特开2009-34047号公报:专利文献1(WO2009/017226、US2011/0294678A1)(它们的全部内容作为公开而特别引用于此))。该方法是将由人淋巴细胞纯化的浆细胞放入实施了特殊加工的微孔中,将由浆细胞大量分泌的抗体固定在浆细胞周围的底座上,使标记抗原与其反应,从而进行抗原特异性浆细胞的鉴定。
发明内容
但是,在上述专利文献1记载的方法中,抗原特异性浆细胞的鉴定需要特殊的装置,细胞的回收也需要非常繁杂的操作。而且,在该方法中,必须进行使用细胞表面抗原的浆细胞的纯化操作,所以无法由尚未确立浆细胞鉴定法的动物物种制作抗原特异性单克隆抗体。
因此,本发明的目的在于:克服上述缺点,提供由广泛的动物物种高效率地制作抗原特异性单克隆抗体的技术。
而且,本发明的目的还在于:利用上述新开发的制作抗原特异性单克隆抗体的技术,提供新的抗原特异性单克隆抗体。
B细胞在细胞膜上表达抗体(膜型抗体),抗原与其结合,从而引起免疫球蛋白基因的类别转换和体细胞高频率突变,其结果,选出与抗原的亲和性增强的B细胞。该高亲和性B细胞中的一部分分化成浆细胞,成为抗体产生细胞。已知随着该分化,浆细胞通过免疫球蛋白基因的选择性剪接使膜型抗体的表达消失,使分泌型抗体大量表达(ImmunologicalReviews,Sarah A. Oracki, Jennifer A. Walker, Margaret L. Hibbs, Lynn M.Corcoran, David M. Tarlinton,Special Issue: B-Lymphocyte Biology,第237卷, 第1期, 第140-159页, September 2010: 非专利文献2(其全部内容作为公开而特别引用于此))。
在进行大鼠、豚鼠、兔的浆细胞分析的过程中,发明人新发现了:在由这些动物得到的浆细胞表面,有能够进行抗原结合分析的量的膜型抗体分子在表达。由此认为:通过使标记抗原与在浆细胞表面表达的高亲和性膜型抗体直接结合,有可能可以鉴定抗原特异性浆细胞。但是,在浆细胞膜上表达的抗体分子的量少,因此即使存在与标记抗原特异性结合的浆细胞,由于标记抗原的非特异性吸附而产生的噪音,也难以鉴定抗原特异性浆细胞。
作为通过使用内质网特异性荧光色素来高效率地鉴定浆细胞的方法,发明人开发了“浆细胞鉴定和分离用荧光探针以及使用该探针的浆细胞的鉴定或分离方法”,并申请了专利[WO2011/118579(其全部内容作为公开而特别引用于此)]。
发明人发现:利用只是使荧光标记抗原和内质网亲和性荧光色素与由免疫动物制备的细胞悬浮溶液作用的单纯的操作,可以鉴定抗原特异性浆细胞,完成了本发明。
本发明如下。
[1]选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法,该方法包括:
从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,用靶抗原对非人动物进行免疫,
从免疫成立后的非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,
将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合,
选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。
[2]选择与靶抗原特异性结合的人的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法,该方法包括:
从人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,从具有抗靶抗原抗体的人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,
将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合,
选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。
[3]靶抗原特异性抗体或抗体片段的制备方法,该方法包括:
利用权利要求1或2所述的方法选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞,
从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因,鉴定其核苷酸序列,
根据鉴定的基因的核苷酸序列,制备上述抗体或抗体片段。
[4]权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,
选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质是用于浆细胞和/或成浆细胞的鉴定或分离的荧光探针,该荧光探针对细胞内质网的染色选择性高于其对内质网以外的细胞器的染色选择性,通过利用该荧光探针进行的染色,可以识别浆细胞和成浆细胞与浆细胞和成浆细胞以外的细胞。
[5]权利要求4所述的方法,其中,上述荧光探针选自(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质、以及(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质。
[6]权利要求5所述的方法,其中,上述两亲性的两亲性指数(AI)为+6>AI>0,中等程度的脂溶性的疏水性指数(logP)为+6>logP>0,一定以上的亲和性的解离常数为0.1µM~0.1nM的范围。
[7]权利要求4~6中任一项所述的方法,其中,上述内质网以外的细胞器是质膜、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、核、中心体、细胞质基质、吞噬体、核内体或聚集体。
[8]权利要求4~7中任一项所述的方法,其中,上述荧光探针选自荧光标记格列本脲、荧光标记布雷菲德菌素A、荧光探针和荧光蛋白。
[9]序列表的SEQ ID NO: 1所示抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链恒定区的基因或编码具有序列表的SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链恒定区的肽的基因。
[10]序列表的SEQ ID NO: 2所示抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链恒定区的基因或编码具有序列表的SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链恒定区的肽的基因。
[11]序列表的SEQ ID NO: 3所示抗人胰岛素的豚鼠抗体的λ链恒定区的基因或编码具有序列表的SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的λ链恒定区的肽的基因。
[12]具有序列表的SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链恒定区的肽。
[13]具有序列表的SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链恒定区的肽。
[14]具有序列表的SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的λ链恒定区的肽。
[15]序列表的SEQ ID NO: 7~SEQ ID NO: 18中任一个所示的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的基因或编码具有SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 89~SEQ ID NO: 91中任一个所示的氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的肽的基因。
[16]序列表的SEQ ID NO: 31~SEQ ID NO: 42中任一个所示的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的基因或编码具有SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 86~SEQ ID NO: 88中任一个所示的氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的肽的基因。
[17]具有SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 89~SEQ ID NO: 91中任一个所示的氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的肽。
[18]具有SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 86~SEQ ID NO: 88中任一个所示的氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的肽。
[19]抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,该抗体具有γ链,所述γ链具有SEQ ID NO:19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 89~SEQ ID NO: 91中任一个所示的氨基酸序列作为可变区,并且具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列作为恒定区。
[20]抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,该抗体具有κ链,所述κ链具有SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 86~SEQ ID NO: 88中任一个所示的氨基酸序列作为可变区,并且具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列作为恒定区。
[21]抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,该抗体包含κ链或者γ链,所述κ链包含下述κ链CDR1、κ链CDR2和κ链CDR3中各一个的任意组合,所述γ链包含下述γ链CDR1、γ链CDR2和γ链CDR3中各一个的任意组合。
发明效果
通过利用本发明,可以由广泛的动物物种快速地产生抗原特异性单克隆抗体,因此给利用已有技术难以制作的抗靶分子的抗体药品的开发带来了新的可能性。
附图说明
图1显示实施例1的结果。对于来自肠骨淋巴结的大鼠淋巴细胞,使用抗大鼠IgG抗体(绿、左图)以及ER-tracker将其细胞表面抗体以及内质网染色,在荧光显微镜下进行观察的照片。在ER-tracker强阳性的浆细胞表面观察到IgG的表达(箭头)。
图2显示实施例1的结果。使用标记GFP以及ER-tracker将来自肠骨淋巴结的大鼠淋巴细胞染色,使用细胞分选仪进行分离的结果。图2的A是根据GFP(纵轴)和ER-tracker(横轴)的荧光强度得到的来自肠骨淋巴结的大鼠淋巴细胞的二维分析图。显示GFP阳性且ER-tracker阳性区(高)作为抗原特异性浆细胞组分,显示GFP阴性且ER-tracker阳性区(低)作为非特异性浆细胞组分。图2的B显示对从抗原特异性浆细胞组分中分离收集的细胞进行固定后膜增溶处理,使FITC标记抗大鼠IgG抗体与其作用,将细胞内IgG染色的荧光显微镜照片。分离收集的细胞表达作为浆细胞的特征的细胞内免疫球蛋白。
图3显示实施例1的结果。由通过细胞分选仪分离的细胞合成cDNA,以其为模板,利用5’-RACE PCR法扩增大鼠γ链和κ链可变区基因(图上部K链、G链)。将所扩增的可变区掺入线状化表达载体中,制作大鼠γ链和κ链免疫球蛋白表达单元。显示所扩增的DNA的琼脂糖电泳的结果(图下部K表达单元、G表达单元)。
图4显示实施例1的结果。利用ELISA法确定由抗原特异性浆细胞(高)和非特异性浆细胞(总体)得到的重组抗体的GFP结合能力的结果。纵轴表示每1ng抗体的GFP结合量。1~12是由抗原特异性浆细胞组分制备的重组抗体,13~24是由非特异性浆细胞组分制备的重组抗体,25是阴性对照。
图5显示实施例2的结果。对于来自肠骨淋巴结的豚鼠淋巴细胞,使用抗豚鼠IgG抗体(绿、左图)以及ER-tracker将其细胞表面抗体以及内质网染色,在荧光显微镜下进行观察的照片。在ER-tracker强阳性的浆细胞表面观察到IgG的表达(箭头)。
图6显示实施例2的结果。A是将从豚鼠肠骨淋巴结中采集的细胞用荧光标记人胰岛素(纵轴)和ER-tracker(横轴)染色,根据使用细胞分选仪对其进行分离时的荧光强度得到的豚鼠淋巴细胞的二维分析图。以R1所示区域的细胞作为抗原特异性浆细胞组分,进行单细胞分选。B是对由抗原特异性浆细胞组分得到的细胞进行固定、膜增溶处理,使FITC标记抗豚鼠IgG抗体与其作用,将细胞内IgG染色(绿)。另外,使用内质网亲和性荧光色素ER-ID Red将内质网染色(红)。使用Hechst33342将细胞核染色(蓝)。分离收集的细胞具有作为浆细胞的特征的细胞内免疫球蛋白(绿)、发达的内质网(红)以及偏向于细胞的一侧的核。
图7显示实施例2的结果。由从抗原特异性浆细胞组分中分离的各个浆细胞扩增γ和κ链可变区基因片段。显示典型的扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳照片。G显示豚鼠γ可变区基因片段,K显示κ链可变区基因片段。
图8显示实施例2的结果。显示通过使豚鼠γ和κ链可变区基因片段与各自的连接用双链DNA片段结合而得到的、线状化γ链和κ链表达单元的1%琼脂糖凝胶电泳照片。G显示线状化γ链表达单元,K显示κ链表达单元。
图9显示实施例2的结果。显示通过将线状化γ链和κ链或λ链表达单元导入293FT细胞中而分泌到培养基中的重组抗体与人胰岛素的结合。横轴显示每1μg重组抗体的人胰岛素结合能力。
图10显示实施例3的结果。是显示存在卵清蛋白阳性且ER-tracker强阳性的细胞群的结果。
图11显示实施例3的结果。是使用引物(d)和引物(x)进行兔免疫球蛋白κ链基因可变区的扩增反应的结果。
图12显示实施例3的结果。是利用琼脂糖凝胶电泳法确认κ和γ链免疫球蛋白基因片段转换成表达单元的结果。
图13显示实施例3的结果。是利用ELISA法对由抗原特异性浆细胞和非特异性浆细胞得到的重组兔单克隆抗体的抗原结合能力进行研究的结果。
具体实施方式
[与靶抗原特异性结合的浆细胞、成浆细胞的选择方法]
本发明的第1方案涉及选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法。
本发明的第1方案分为下述两种方法:以非人动物为对象的方法(以下称为NHA法)和以人为对象的方法(以下称为HU法)。以非人动物为对象的NHA法包括:
从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,用靶抗原对非人动物进行免疫,
从免疫成立后的动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,
将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合,
选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。
利用NHA法,可以选择与靶抗原特异性结合的非人动物的浆细胞和成浆细胞中的至少一种。
以人为对象的HU法包括:
从人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,从具有抗靶抗原抗体的人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,
将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合,
选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。
利用HU法,可以选择与靶抗原特异性结合的人的浆细胞和成浆细胞中的至少一种。
以下,对NHA法进行说明。
<用靶抗原对非人动物进行的免疫>
用靶抗原对非人动物进行免疫。
本发明中,“非人动物”是指人以外的具有免疫系统的所有动物。作为这样的动物的例子,可以列举哺乳动物、鸟类等。作为哺乳动物的例子,可以列举:类人猿、猴、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、驴、骆驼、大羊驼、羊驼、驯鹿、水牛、牦牛、豚鼠、兔、水貂、小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、叙利亚仓鼠、亚美尼亚仓鼠、雪貂、迷你猪、浣熊、负鼠、臭鼩、袋鼠、海豚等。作为鸟类,可以列举:鸡、鹌鹑或鸵鸟等。
本发明中,“靶抗原”是指病毒、支原体、细菌、真菌等微生物、贝类等冠轮动物、昆虫或甲壳类等蜕皮动物、脊椎动物等后口动物以及它们的构成物质、蛋白、糖、脂质、复合糖质、核酸、天然低分子有机化合物、天然高分子有机化合物、人工低分子有机化合物、人工高分子有机化合物、金属络合物等。但是,用意并不在于限定靶抗原的种类,这些终究是例示。
非人动物的免疫中使用的靶抗原,可以直接使用靶抗原,但还可以将包含靶抗原的生物等直接、或者死亡状态或者以其提取液的形式使用,或者,还可以结合或混合适当的载体后使用。
从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞。在体外用靶抗原对淋巴液等进行的致敏可以如下实施。从非人动物中采集作为抗原提呈细胞的树突细胞、T细胞、B细胞。接下来,在试管中使抗原作用于树突细胞,被吞噬·消化,制作具备了抗原提呈能力的成熟树突细胞。向其中加入T细胞以及B细胞和白介素2等细胞因子和poly(dI-dC)等免疫刺激剂,使对抗原产生应答的B细胞在试管内增殖·分化,最终得到作为抗体产生细胞的浆细胞和成浆细胞。
本发明中,“用靶抗原对非人动物进行免疫”是指,使靶抗原与非人动物接触,在非人动物中表达对靶抗原的免疫。针对靶抗原的免疫的表达方法没有特别限定,例如,可以通过将靶抗原给予或移植到非人动物中,对非人动物进行免疫。对靶抗原的给予方法或移植方法也没有特别限定,作为给予方法,例如可以列举:经气道给药、口服给药、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、或者通过对非人动物进行基因导入,使抗原在动物体内表达的方法等。或者,通过使靶抗原接触非人动物的皮肤,也可以对非人动物进行免疫。
用靶抗原对非人动物进行的免疫,进行至靶抗原所致的免疫在非人动物中成立为止。因此,使靶抗原与非人动物接触,直至靶抗原所致的免疫成立。靶抗原与非人动物接触的频率、时间、一次接触所使用的靶抗原的量,可以根据免疫成立的容易度适当确定。在非人动物中靶抗原所致的免疫是否成立,这可以利用常规方法、例如从非人动物中采集血液,再利用ELISA法测定血清中所含的抗体来进行确认。
<从免疫成立后的动物中采集淋巴结等>
从免疫成立后的动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞。本发明的目的在于选择与靶抗原特异性结合的非人动物的浆细胞和成浆细胞中的至少一种,因此采集含有浆细胞和/或成浆细胞的可能性高的、来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞。
浆细胞和成浆细胞是B淋巴细胞最终分化的产物,因此是抗体产生中特化的细胞。被称为亲和力成熟的抗体基因的体细胞突变和利用抗原的选择已经在进行,所以这些细胞对于分离结合能力高的抗体特别有用。但是,浆细胞和成浆细胞是由几个亚组组成的不均匀的细胞群,其在淋巴组织内的存在率低至0.1%以下,所以难以进行高纯度的分离。按照现有的方法,由外周血或淋巴结鉴定·分离浆细胞和成浆细胞时,必须进行组合最低3种以上的抗细胞表面标志物的抗体的几个阶段的阳性·阴性筛选操作(Sanderson, R. D.,Lalor, P., Bernfield, M. B lymphocytes express and lose syndecan at specificstages of differentiation: Cell Regulation 1: 27-35(1989): 非专利文献1(其全部内容作为公开而特别引用于此))。
淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓例如可如下制备。向皮下、肌肉或足底注射抗原,经过约1个月以上通过外科方式从非人动物中采集肿胀的淋巴液、淋巴组织。在实体显微镜下除去淋巴结所附带的组织后,用小镊子弄破淋巴结的皮膜,从而使淋巴结内部的细胞分散在PBS溶液(10mM的磷酸缓冲液、120mM的NaCl、2.7mM的KCl、pH7.6)中。血细胞样品使用通过从免疫动物中进行肝素采血而得到的血液经密度梯度离心法分离得到的单核细胞。骨髓使用下述骨髓细胞,即切断从免疫动物中取出的大腿骨的两骨末端,使PBS溶液从插入其中一个骨末端的注射针流入骨髓中,由此从另一个骨末端流出的骨髓细胞。
<细胞的选择>
从采集的淋巴结中选择与靶抗原特异性结合的非人动物的浆细胞和成浆细胞中的至少一种。为了进行该选择,使用(1)标记的靶抗原和(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质。
(1)标记的靶抗原
标记的靶抗原是指,包含与非人动物的免疫中使用的靶抗原相同的表位的物质。因此,标记的靶抗原和免疫中使用的靶抗原可以是完全相同的物质,也可以是包含共同的表位的不同物质。
对用于标记靶抗原的物质没有特别限定。只要是可以选择标记的靶抗原所结合的浆细胞和/或成浆细胞的标记即可。作为这样的标记,例如可以列举荧光标记、磁珠标记等。对荧光标记的种类没有特别限定。其中,选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质是指可以作为标记来区别的物质,但只要是可以将靶抗原以及选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质所结合的细胞从只与靶抗原结合的细胞、以及只与选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质结合的细胞中区别开来的物质即可。
(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质
作为选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质,例如可以列举以下说明的荧光探针1。
<荧光探针1>
荧光探针1是用于浆细胞以及成浆细胞的鉴定或分离的荧光探针,其对细胞内质网的亲和性高于其对其他细胞器的亲和性,换言之,其是选择性地将细胞内质网染色的荧光探针。与浆细胞以及成浆细胞以外的细胞相比,浆细胞以及成浆细胞的内质网异常发达,其结果,对于通过用荧光探针1进行染色而得到的荧光强度,与浆细胞以及成浆细胞以外的细胞被荧光探针1染色时的荧光强度相比,显示出可以识别浆细胞以及成浆细胞和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的程度的差异。荧光探针1显示出的上述荧光强度比(浆细胞以及成浆细胞的荧光强度/浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的荧光强度)例如为3倍以上。
浆细胞以及成浆细胞的内质网和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的内质网,两者对荧光探针1的亲和性不存在大的差异,但由于内质网的发达程度不同,而产生了上述荧光强度的不同。其结果,根据上述荧光强度比,通过用荧光探针1进行的染色,可以识别浆细胞以及成浆细胞和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞。
通过用荧光探针1进行染色,根据来自浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的荧光强度与来自浆细胞以及成浆细胞的荧光强度的强弱的不同,可以识别浆细胞以及成浆细胞以外的细胞和与其共存的浆细胞以及成浆细胞。因此,通过用荧光探针1进行染色,可以容易地从浆细胞以及成浆细胞以外的细胞所共存的细胞群中鉴定浆细胞以及成浆细胞,并且,通过采集所鉴定的浆细胞以及成浆细胞,可以得到包含大量的浆细胞以及成浆细胞的细胞群。
当来自被染色的浆细胞以及成浆细胞的荧光强度为来自被染色的浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的荧光强度的3倍以上时,荧光探针1可以识别两者,从容易识别的角度考虑,优选为4倍以上,进一步优选为5倍以上。但是,由于内质网的发达程度根据浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的种类而不同,所以若浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的种类不同,则该荧光强度比发生变化。上述荧光强度比越高,则越能更高效率地从包含浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的细胞群中鉴定浆细胞以及成浆细胞。作为浆细胞以及成浆细胞以外的细胞,例如可以列举:红细胞、血小板、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等。
在本发明中,使用荧光探针1判别浆细胞以及成浆细胞和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞可以如下进行。向细胞悬浮液中加入荧光探针1,在37℃下进行30分钟染色。适于染色的荧光探针1的浓度根据荧光探针1的种类而不同,例如为100nM~1µM。染色后,用PBS清洗细胞。对于清洗的细胞,例如,(1)使用荧光显微镜观察细胞中的荧光探针的分布,或者(2)根据由细胞发出的荧光的强度,可以判别是浆细胞以及成浆细胞、或者是浆细胞以及成浆细胞以外的细胞。关于浆细胞以及成浆细胞和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的判别方法,在浆细胞以及成浆细胞鉴定·分离方法中详细阐述。
而且,利用上述浆细胞以及成浆细胞和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的判别方法,还可以从对浆细胞以及成浆细胞的内质网和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的内质网的染色选择性是未知的物质中筛选可以用作荧光探针1的物质。对细胞内质网的染色选择性高的、适合作为本发明的荧光探针1的荧光探针的筛选,可以利用后述的方法来进行,即,利用通过内质网中分布的蛋白的免疫染色(在浆细胞以及成浆细胞中是免疫球蛋白)、或者使内质网转移性的重组荧光蛋白在培养细胞中表达来鉴定细胞的内质网的方法,求出细胞整体的荧光强度A与来自内质网的荧光强度B的比例(B/A)。
在筛选可以用作荧光探针1的物质的方法中,可以只使用浆细胞以及成浆细胞、也可以只使用浆细胞以及成浆细胞以外的细胞来实施。但是,由于浆细胞以及成浆细胞的内质网发达,通过染色得到高的荧光强度,所以使用浆细胞以及成浆细胞时,评价物质对细胞内质网的染色选择性更为容易。但是,由于浆细胞以及成浆细胞的获取并不容易,所以也可以使用浆细胞以及成浆细胞以外的细胞来评价对内质网的染色性(染色力),筛选可以用作荧光探针1的物质。例如,在使用普通的培养细胞(例如Hela细胞)的染色实验中,通过计算上述细胞整体的荧光强度A与来自内质网的荧光强度B的比例(B/A),可以筛选能够用作荧光探针1的物质。但是,当使用浆细胞以及成浆细胞以外的细胞作为细胞时,根据细胞中的内质网的发达程度,将适合作为阈值的B/A值适当地设定为较在使用浆细胞以及成浆细胞的筛选方法中采用的作为阈值的B/A值低的值、例如50%左右是适当的。
作为浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的例子,可以列举红细胞、血小板、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等作为其他的细胞。而且,在上述方法中的筛选中,还可以使用杂交瘤细胞、浆细胞以及成浆细胞肿瘤细胞、或多发性骨髓瘤细胞来代替浆细胞以及成浆细胞。这是由于:杂交瘤细胞、浆细胞以及成浆细胞肿瘤细胞和多发性骨髓瘤细胞也产生免疫球蛋白,所以内质网发达,因此通过染色得到高的荧光强度,评价物质对细胞内质网的染色选择性更为容易。
作为对浆细胞以及成浆细胞和浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的内质网的染色选择性高的荧光探针1的物质的例子,可以列举:(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质;以及(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质。具有上述(1)或(2)的性质的物质,其对浆细胞以及成浆细胞的内质网的染色性和对浆细胞以及成浆细胞以外的细胞的内质网的染色性均高于其对细胞的其他细胞器的染色性。
上述(1)中的“两亲性、阳离子型”,具体而言,是指两亲性指数(AI)例如为+6>AI>0。其中,两亲性指数是通过计算分子的脂溶性结构域的表观上的logP值而得到的值。具体而言,根据Hansch等人的片段值,考虑到碳链的长度、其位置关系和阳离子性季铵基团的极性效果,根据Morrall等人的模型算出的值[Hansch C, Leo AJ. Exploring QSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, 第160页, AmericanChemical Society: Washington, DC, 1995.,Morrall SW, Herzog RR, Kloepper-SamsP, Rosen MJ. Octanol/water partitioning of surfactants and its relevance totoxicity and environmental behavior. Proc 4th World Surfactants Congress, 第3卷. AEPSAT: Barcelona, 1996; 220-227.]。
上述(1)中的“中等程度的脂溶性”是指,疏水性指数(logP)例如为+6>logP>0。疏水性指数是利用Hansch等人的片段推算法算出的分子整体的疏水性值。具体而言,是指将AI所示的疏水基与其所附带的结构的影响相加而得到的值。
上述(2)中的“对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性”,具体而言,是指具有解离常数为0.1µM~0.1nM的亲和性。对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质也是选择性地将细胞的内质网染色的荧光探针。
作为(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质的例子,可以列举下述A、B或C所示的化合物。
式A所示的化合物是DiOC6(3) (碘化3,3’-二己基氧杂羰花青),低浓度时聚集在线粒体中,高浓度时聚集在内质网中。式B所示的化合物是罗丹明B己酯,低浓度时聚集在线粒体中,高浓度时聚集在内质网中。式C所示的化合物是ER-Tracker Blue white DPX,其主要聚集在内质网中,高浓度时也将高尔基体染色。它们是实施例中使用的荧光探针。上述A、B或C所示的化合物均为两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性(参照参考文献Whyfluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimentaland QSAR-modeling study)。
A所示化合物的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为4.5和4.4,具有一价阳离子。B所示化合物的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为4.8和5.9,具有一价阳离子。C所示化合物的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为5.1和0.7,具有一价阳离子。如实施例所示,C所示的化合物将浆细胞以及成浆细胞染色时的荧光强度是其将浆细胞以及成浆细胞以外的细胞染色时的荧光强度的4倍以上。
[化学式1]
色素(染料)1、5、7和10是两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质,是荧光探针1的例子。这些色素是美国申请公开US2010/0068752A1(其全部内容作为公开而特别引用于此)中记载的色素。上述色素可以根据上述美国申请公开的记载来合成,此外还有一部分在市售。色素(染料)1的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为4.95和3.77,具有一价阳离子。色素(染料)5的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为5.11和4.32,具有一价阳离子。色素(染料)7的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为4.19和3.29,具有一价阳离子。色素(染料)10的两亲性指数(AI)和疏水性指数分别为4.25和5.71,具有一价阳离子。关于色素(染料)1、5、7和10的疏水性指数,使用CompuDrug公司的计算软件Pallas,将用于提高与实测值的一致性的系数与两种独立的logP计算指标(logP(annlogp)、logP(atomic6))相乘,以得到的数值之和即logP(合并)=0.863×logP(annlogp)+0.137×logP(atomic6)的值的形式算出。两亲性指数以从logP(annlogp)的值中扣除磷酸基(P-0)而得到的值的形式算出。
[化学式2]
色素(染料)1
色素(染料)5
色素(染料)7
色素(染料)10
作为(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质的例子,例如可以列举:荧光标记格列本脲和荧光标记布雷菲德菌素A。
格列本脲为下式所示的化合物,商品名:ER-Tracker(注册商标) Green (BODIPY(R) FL格列本脲、ER-Tracker(注册商标) Red、(BODIPY(R) TR格列本脲作为在格列本脲上结合有荧光色素(BODIPY)的化合物来销售。已知格列本脲化合物与内质网中丰富的ATP-敏感性钾离子通道的磺脲受体结合,抑制它的作用,被用作糖尿病治疗药。格列本脲与ATP-敏感性钾离子通道的解离常数是0.1~3.6nM。
[化学式3]
4-[2-(5-氯-2-甲氧基苯甲酰基氨基)乙基]-N -(环己基氨甲酰基)苯磺酰胺
布雷菲德菌素A为下式所示的化合物,商品名:BODIPY-布雷菲德菌素A作为在布雷菲德菌素A上结合有荧光色素(BODIPY)的化合物而销售。布雷菲德菌素A显示出对作为作用于从内质网向高尔基体的囊泡运输的GTP-交换因子的Arf1蛋白的功能抑制。
[化学式4]
关于荧光探针1相对于淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的添加量,可以考虑检测器的灵敏度、细胞悬浮液的组成、染色时间等适当确定,例如,当为ER-Tracker Bluewhite DPX时,可以是100nM~1µM的范围。但并不旨在限于该范围。
<(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞的选择>
(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞的选择,可以根据靶抗原的标记和与浆细胞和/或成浆细胞特异性结合的标记物质的种类来适当选择。当靶抗原的标记和与浆细胞和/或成浆细胞特异性结合的标记物质均为荧光标记(例如荧光色素)时,可以利用这些标记所发出的荧光,选择(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。对(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞的选择方法或该方法中使用的装置没有特别限定。已有的将细胞按照各个细胞水平进行分离的方法也可直接利用装置。
使用荧光探针1施行了染色的淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓,根据荧光鉴定浆细胞以及成浆细胞(或浆细胞以及成浆细胞的可能性高的细胞)。如上所述,鉴定浆细胞以及成浆细胞的方法有:(1)在荧光显微镜下观察实施了染色的细胞中的荧光探针的分布的方法,和(2)基于由实施了染色的细胞发出的荧光强度的方法。
在(1)使用荧光显微镜观察细胞中的荧光探针的分布的方法中,虽然细胞中所含的内质网区被强染色(即发出强的荧光),但对于作为观察对象的1个细胞,可以鉴定被强染色的内质网区的面积比例为约65%以上的细胞是浆细胞以及成浆细胞。另外,也可以不依据面积比例,对于这1个细胞,以该细胞整体的荧光强度作为100%时,可以鉴定来自内质网的荧光强度的比例为约65%以上的细胞是浆细胞以及成浆细胞。当为浆细胞以及成浆细胞时,在来自一个细胞整体的荧光强度中,内质网所占的荧光强度为约65%,有35%的荧光色素转移到其他的细胞器(线粒体、高尔基体、质膜等)中。
关于细胞整体的荧光强度与来自内质网的荧光强度的比例,可以利用通过内质网中分布的蛋白的免疫染色(在浆细胞以及成浆细胞中为免疫球蛋白)、或者使内质网转移性的重组荧光蛋白在培养细胞中表达来鉴定细胞的内质网的方法,如下求得。
例如,使用293细胞,使重组荧光蛋白(红)在培养细胞中表达,再使用荧光探针1(例如ER-Tracker Blue White)将该细胞染色。使用荧光显微镜的图像分析装置,计测荧光探针1在细胞整体中所占的荧光强度并以A表示,并计测被重组荧光蛋白(红)染色的区域内(内质网)的荧光探针1的荧光强度并以B表示。荧光强度B相当于内质网中分布的荧光探针1的量。因此,来自一个细胞的内质网的荧光强度B与来自该细胞整体的荧光强度A的比例可以以B/A×100(%)的形式表示。在实施例的结果中,在浆细胞以及成浆细胞中,计测ER-tracker Blue/white在1个细胞整体中所占的强度A、和被免疫球蛋白(绿)染色的区域内(内质网)的ER-tracker Blue/white的荧光强度B时,B/A×100的值达到65%以上。
(2)基于荧光强度的浆细胞以及成浆细胞的鉴定,例如,可以使用荧光扫描仪、荧光显微镜、流式细胞仪、细胞分选仪等来实施。如上所述,荧光探针1在浆细胞以及成浆细胞中得到的荧光强度与其在浆细胞以及成浆细胞以外的细胞中得到的荧光强度相比,例如高达3倍以上、优选4倍以上、进一步优选5倍以上。因此,使用上述荧光扫描仪等,根据荧光强度,可以容易地从被荧光探针1染色的细胞中鉴定浆细胞以及成浆细胞的候选。
只要往高设定作为选择浆细胞以及成浆细胞的候选的基准的荧光强度比(浆细胞以及成浆细胞/浆细胞以及成浆细胞以外的细胞),仅此就提高浆细胞以及成浆细胞的候选中所含的真正的浆细胞以及成浆细胞的比率。但是,虽然与浆细胞以及成浆细胞以外的细胞相比显示出高的荧光强度、但却只显示出不到作为基准的荧光强度比的较低的荧光强度的浆细胞以及成浆细胞则有可能被排除。因此,考虑到作为样品的淋巴液、淋巴组织或血细胞样品中所含的浆细胞以及成浆细胞的特质、特别是内质网的发达程度,优选选择作为选择浆细胞以及成浆细胞的候选的基准的荧光强度比。
本发明的方法,优选进一步采集(分离收集)通过上述方法鉴定的浆细胞以及成浆细胞的候选。所鉴定的细胞的采集,例如可以通过细胞分选仪的分离收集来进行。基于荧光的浆细胞以及成浆细胞的鉴定和根据荧光鉴定或判断是浆细胞以及成浆细胞(或浆细胞以及成浆细胞的可能性高)的浆细胞以及成浆细胞的候选,使用细胞分选仪进行分离收集。
关于细胞的选择,还可以作为多个细胞群来选择、分离细胞,但优选一个一个地选择、分离细胞。此处选择的细胞均为对靶抗原具有结合性的细胞,但各细胞所具有的抗靶抗原抗体未必相同,预想各抗体的抗原结合位点的氨基酸序列不同。因此,一个一个地选择、分离细胞,将各自的每一个细胞应用于后述的靶抗原特异性抗体或抗体片段的制备方法中,由此可以得到与相同的靶抗原特异性结合的不同的单克隆抗体。
通过该方法选择的细胞,其对靶抗原显示出结合性,并且为浆细胞和/或成浆细胞的可能性高,利用该方法,可以选择与靶抗原特异性结合的非人动物的浆细胞和成浆细胞中的至少一种。
接下来,对以人为对象的HU法进行说明。HU法是从人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,作为用于选择细胞的样品,使用由具有抗靶抗原抗体的人提供的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞。在体外用靶抗原对所采集的淋巴液等进行的致敏可以按照与上述相同的方法进行。即,从人中采集作为抗原提呈细胞的树突细胞、T细胞、B细胞。接下来,在试管中使抗原作用于树突细胞,被吞噬·消化,制作具备了抗原提呈能力的成熟树突细胞。向其中加入T细胞以及B细胞和白介素2等细胞因子和poly(dI-dC)等免疫刺激剂,使对抗原产生应答的B细胞在试管内增殖·分化,最终得到作为抗体产生细胞的浆细胞和成浆细胞。
关于由具有抗体的人提供的淋巴液等,更具体而言,使用由具有抗靶抗原抗体的人提供的血液、或根据疾病的治疗等目的通过手术切除的淋巴结等。进一步具体而言,从由具有抗靶抗原抗体的人提供的血液或组织中分离血细胞或淋巴细胞,将其与(1)标记的靶抗原和(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合。免疫中使用的靶抗原、(1)标记的靶抗原和(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质与NHA法中的相同。而且,与(1)标记的靶抗原和(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质结合的细胞的选择也与NHA法中相同。
在HU法中,由于使用由具有抗靶抗原抗体的人提供的样品,所以可以选择与靶抗原特异性结合的人的浆细胞和成浆细胞中的至少一种。
[靶抗原特异性抗体或抗体片段的制备方法]
本发明的第2方案涉及靶抗原特异性抗体或抗体片段的制备方法。
该方法包括:利用上述本发明的方法,选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞;
从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因,鉴定其核苷酸序列;以及
根据鉴定的基因的核苷酸序列,制备上述抗体或抗体片段。利用该方法,可以制备靶抗原特异性抗体或抗体片段。
上述本发明的方法中的、与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞的选择方法如上所述。
<抗体基因的核苷酸序列鉴定>
从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因,鉴定其核苷酸序列。所选择的细胞是显示出与靶抗原的结合性的细胞,并且是浆细胞或成浆细胞。在本发明中,还可以以由上述选择的多个细胞组成的群进行处理,进行抗体基因的采集和鉴定,但优选对于各个细胞,分别采集抗体基因,鉴定其核苷酸序列。由此,可以得到与相同的靶抗原特异性结合的、不同的单克隆抗体。
从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因、并鉴定其核苷酸序列的方法,可以利用已知的方法。
抗靶抗原抗体基因的采集和由采集的抗体基因合成cDNA的方法,例如可以利用WO2009/091048(US2011/0020879A1(其全部内容作为公开而特别引用于此)中记载的方法来进行。而且,克隆所合成的cDNA的方法,例如可以按照采用了WO2009/110606、US2011/0117609A1(其全部内容作为公开而特别引用于此)中记载的同源重组方法的克隆方法来进行。而且,已合成的cDNA的核苷酸序列的鉴定可以利用公知的DNA的核苷酸序列确定方法来实施。通过鉴定cDNA的核苷酸序列,可以鉴定抗靶抗原抗体基因。
[方法]
WO2009/091048中记载的方法是一种反应方法,其包括:在基板的一个表面上整列设有多个突起状围栏,上述突起状围栏具有至少1个缺口部,并且内部具有可以保持液滴的空间,并且,在上述基板表面的至少保持上述液滴的面上,使用与纯水的接触角为90~150˚的范围的反应治具,使用磁石使固定在磁珠上的物质从上述基板的与具有突起状围栏的表面相反侧的表面起,在保持在上述突起状围栏的液滴保持用空间中的含有表面张力降低试剂的溶液的液滴中依次移动,由此进行反应和/或清洗。在该反应方法中,作为固定在磁珠上的物质,使用与选择的细胞中的mRNA具有结合性的、例如oligo dT,由此实施。
而且,在cDNA的合成方法中,使用上述反应治具、即1个纵列上设有至少2个突起状围栏的反应治具,在上述2个突起状围栏的液滴保持用空间中,依次分别保持含有表面张力降低试剂的细胞溶解用溶液和cDNA合成用溶液的液滴,使用磁石使固定在磁珠上的mRNA从基板的与具有突起状围栏的表面相反侧的表面起,在保持在上述2个突起状围栏的液滴保持用空间中的溶液中依次移动,可以得到固定在磁珠上的cDNA。
上述cDNA的合成方法,例如,通过使用在1个纵列上设有至少4个突起状围栏的反应治具实施。在上述4个突起状围栏(例如ハ字型突起)的空间,依次分别保持细胞溶解用溶液、mRNA清洗用溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴,使用磁石使固定在磁珠上的mRNA从基板的与设有突起的相反侧的表面起,在保持在上述4个突起状围栏的空间中的溶液中依次移动。由此,得到固定在磁珠上的cDNA。
cDNA的合成方法中使用的反应治具的ハ字型突起的空间容量,例如0.5~100μL的范围是适当的。
第1ハ字型突起的空间中保持的细胞溶解用溶液,例如可以是包含100mM的TrisHCl (pH7.5)、500mM的LiCl、1%的十二烷基硫酸锂、5mM的二硫苏糖醇的总量为3μL的溶液。
第2ハ字型突起的空间中保持的mRNA清洗用溶液,可以是包含10mM的Tris HCl(pH7.5)、0.15M的LiCl、0.1%的十二烷基硫酸锂的总量为3μL的溶液。
第3ハ字型突起的空间中保持的逆转录反应用清洗溶液,可以是包含50mM的TrisHCl (pH8.3)、75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的Triton X-100、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂的总量为3μL的溶液。
第4ハ字型突起的空间中保持的逆转录反应溶液,可以是包含50mM的Tris HCl(pH8.3)、75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的Triton X-100、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂、8单位的SuperScript III逆转录酶的总量为3μL的溶液。
但是,这些都是例示,用意不是限于这些溶液。
准备固定在磁珠上的mRNA。对mRNA的种类或长度等没有特别限定。可以使用来自各种生物的mRNA。作为磁珠,例如可以使用颗粒系2.8μm、表面共价键合有oligo dT25的磁珠。在磁珠上固定RNA可以如下实施。
将磁珠悬浮在细胞溶解用溶液中,使浓度达到10mg/ml,向其中加入1~100个细胞。通过上述操作,细胞内的mRNA经由其polyA尾,与固定在磁珠上的oligo dT25结合。
使用磁石,使固定在磁珠上的mRNA从基板的与设有突起的表面相反侧的表面起,在保持在上述4个ハ字型突起的空间中的溶液(液滴)中依次移动。作为磁石,例如可以使用小型钕磁石。在各液滴中滞留反应或清洗所必需的时间。反应或清洗所必需的时间根据反应条件、清洗条件而不同,例如可以是1秒~1小时的范围。
上述反应和清洗可以在常温(室温)下进行,但根据需要,也可以调节温度。而且,当液滴的量少时,由于溶液中的溶剂有时也会蒸发,所以优选将反应治具放入密闭容器中,保持容器中的湿度恒定,由此防止溶剂的蒸发。为了保持容器中的湿度恒定,可以使含有水或适当的水溶液的容器共存于上述密闭容器中。
通过使固定在磁珠上的mRNA依次在上述4种ハ字型突起的空间所保持的溶液(液滴)中滞留和通过,可以得到固定在磁珠上的cDNA。得到的cDNA不必从磁珠上切下,可以在以后的步骤中使用。具体而言,可以将得到的cDNA供给后述的克隆方法等。
利用了WO2009/110606中记载的同源重组方法的克隆方法,其使用下述方法作为同源重组方法,所述方法包括:使用PCR产物和线状化的载体,所述PCR产物包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因(抗体基因)的序列,所述线状化的载体具有包含与该PCR产物的扩增用引物序列P1和P2相同的核苷酸序列的同源重组区VP1和VP2,并且,在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的一部分序列T1相同的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的一部分序列T2相同的核苷酸序列的同源重组区VT2(其中,T1和T2中的至少一个具有靶基因所特有的核苷酸序列),使上述PCR产物经过同源重组反应而插入到上述载体中,得到将目标PCR产物特异性地插入载体中而得到的重组DNA分子。上述的包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因(抗体基因)的序列的PCR产物,可以利用WO2009/110606中记载的方法由上述得到的cDNA得到。而且,利用上述同源重组方法,制备将目标PCR产物特异性地插入载体中而得到的重组DNA分子,接着扩增持有所得的重组DNA分子的重组体,由此可以进行目标抗体基因的克隆。
另外,扩增的重组DNA分子(重组载体)中所含的靶基因(抗体基因),例如通过限制酶处理从载体中切出,再根据需要进行纯化。靶基因的分离和纯化可以通过常规方法来进行。作为靶基因的分离和纯化,例如可以列举凝胶提取或柱纯化等。分离和纯化的靶基因例如可以用于核苷酸序列的确定、掺入到表达载体中、靶基因的功能分析等。
<抗体或抗体片段的制备>
根据鉴定的基因的核苷酸序列,制备抗体或抗体片段。
根据鉴定的基因的核苷酸序列进行的抗体或抗体片段的制备,可以使用采用WO2011/027808中记载的DNA片段的特异性制作方法制作的抗体基因片段来进行。
WO2011/027808中记载的方法如下。
[1]连接DNA片段的制备方法,该方法是制备在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法,包含(1)~(4)。尚需说明的是,以下靶基因是指抗体基因。
(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段,该3’端突出双链基因片段在中央部包含靶基因序列,两末端侧分别具有可缔合的区,上述可缔合的2个区具有彼此不会缔合的核苷酸序列,并且,其中一个或两个区是至少一部分核苷酸序列是靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列,在两个可缔合的区的3’端具有1个核苷酸以上的突出末端;
(2)准备连接用双链DNA片段,该连接用双链DNA片段在中央部包含连接用DNA区,两末端侧分别具有可缔合的区;
(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一个可缔合的区包含与上述连接用双链DNA片段的一个末端的可缔合区同源的核苷酸序列,但在连接用双链DNA片段的一个可缔合的区中,添加有3’突出端的末端侧的序列是与连接用DNA区结合的一侧;
(3-2)来自上述3’端突出双链基因片段的一个可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能;
(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一个可缔合区包含与上述连接用双链DNA片段的另一个末端的可缔合区同源的核苷酸序列,但在连接用双链DNA片段的另一个可缔合的区中,添加有3’突出端的末端侧的序列是与连接用DNA区结合的一侧;
(3-4)来自上述3’端突出双链基因片段的另一个可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能;
(4)使用上述3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段,进行至少两次的热变性、再缔合和DNA合成反应,从而得到上述连接DNA片段。
在[1]记载的制备方法中,具体可以例示以下内容。
(a)以上述的一个可缔合区作为“区1”、以另一个可缔合区作为“区2”时,上述连接DNA片段是具有至少一个以区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1示意性地表示的序列的DNA片段。
(b)连接用DNA区包含序列A和序列B作为2个连接用DNA区,
上述3’端突出双链基因片段的可缔合区中一个从末端侧起具有序列P1和T1,另一个从末端侧起具有序列P2和T2,序列T1和序列T2中的至少一个具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列,
上述连接用双链DNA片段的可缔合区中一个从末端侧起具有序列VP1和VT1,另一个从末端侧起具有序列VP2和VT2,序列VP1和VT1与序列P1和T1分别具有同源的核苷酸序列,序列VP2和VT2与序列P2和T2分别具有同源的核苷酸序列。
(c)上述3’端突出双链基因片段以P1-T1-靶基因-T2-P2表示,上述连接用双链DNA片段以VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1表示,上述连接DNA片段是具有至少一个VT2-VP2(T2-P2)-序列B-序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因-VT2-VP2(T2-P2)-序列B-序列A-VP1-VT1(P1-T1)的DNA片段,其中,VT2-VP2(T2-P2)是指与T2-P2同源的VT2-VP2,VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1同源的VT1-VP1。
(d)位于序列P2的3’端的突出末端的、在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是与和上述序列B的VP2相邻的序列不同源的序列,位于序列P1的3’端的突出末端的、在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是与和上述序列A的VP1相邻的序列不同源的序列。
(e)上述突出末端是在3’端包含双脱氧核苷酸的序列。
[2] 以利用[1]中记载的方法制备的连接DNA片段为模板,以扩增连接DNA片段中所含的至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的所有序列的方式,使用在连接DNA片段中所含的不同的连接用DNA区发挥功能的正向引物和反向引物进行PCR,可以制备包含至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的所有序列的DNA片段。
制备DNA片段,包括:以利用[1]之(b)中记载的方法制备的连接DNA片段为模板,使用以朝向靶基因的方式在3’端包含序列A的一部分核苷酸序列的正向引物、和以朝向靶基因的方式在3’端包含序列B的一部分核苷酸序列的反向引物进行PCR,得到连接有序列A、靶基因的序列和序列B的DNA片段。
[3] (a) 在[1](b)、(c)和[2](a)、(b)所记载的制备方法中,可以进一步包括:使脱氧核苷酸末端转移酶与包含靶基因的序列的双链DNA片段和聚脱氧核苷酸作用,得到包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段。(其中,上述的包含靶基因的序列的双链DNA片段,在其各末端具有序列P1和序列P2,在上述序列P1的一部分内侧具有序列T1,在上述序列P2的一部分内侧具有序列T2,并且,上述序列T1和T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列)。
(b) 上述序列T1和序列T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列,或者,上述序列P1和序列P2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。
(c) 上述序列P1和P2独立为10个核苷酸以上。
[4] 在[1]~[3]中,上述靶基因是抗体基因,上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因的序列,以及,上述连接用双链DNA片段或具有上述序列A的连接用双链DNA片段中的上述区VP1和区VT1可以具有来自或不是来自抗体基因的序列。
[5] 在[1]~[3]中,上述靶基因是抗体基因,上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因的序列,以及,上述连接用双链DNA片段或具有上述序列B的连接用双链DNA片段中的上述区VP2和区VT2可以是来自或不是来自抗体基因的序列。
[6] 使用按照[4]或[5]记载的方法制备的连接DNA片段,可以制备抗体。使用此处得到的连接DNA片段来制备抗体的方法,例如可以采用阳离子型脂质体法等方法来实施。具体而言,将上述连接DNA片段导入293T细胞株等的细胞中,接着培养细胞,从而使抗体基因表达,即可制备抗体。
[抗体基因和肽]
本发明包含:利用上述本发明的方法新得到的、抗人胰岛素的豚鼠抗体的可变区和恒定区的基因和肽、以及抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体。
(1) 具有序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链恒定区的基因、编码具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链恒定区的肽的基因、以及具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链恒定区的肽。
(2)具有序列表的SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链恒定区的基因、编码具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链恒定区的肽的基因、以及具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链恒定区的肽。
(3) 具有序列表的SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的λ链恒定区的基因、编码具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的λ链恒定区的肽的基因、以及具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的λ链恒定区的肽。
(4) 具有序列表的SEQ ID NO: 7~SEQ ID NO: 18所示核苷酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的基因、编码具有SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的肽的基因、以及具有SEQ ID NO: 19~SEQ IDNO: 30所示核苷酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的肽。
(5) 具有序列表的SEQ ID NO: 31~SEQ ID NO: 42所示核苷酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的基因、编码具有SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的肽的基因、以及具有SEQ ID NO: 43~SEQ IDNO: 54所示氨基酸序列的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的肽。
(6) 抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,其具有γ链,所述γ链具有SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30中的任一个所示的氨基酸序列作为可变区,并且具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列作为恒定区。
(7) 抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,其具有κ链,所述κ链具有SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54中的任一个所示的氨基酸序列作为可变区,并且具有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列作为恒定区。
(8) 抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,其包含含有下述CDR1、CDR2和CDR3各一个的任意组合的κ链或γ链。
上述本发明的抗人胰岛素的豚鼠抗体的可变区和恒定区的基因和肽、以及抗人胰岛素的豚鼠单克隆抗体,可以利用已知的DNA和肽的制备方法,通过参照后述的实施例的记载来进行制备。
实施例
以下,通过实施例来进一步详细说明本发明。但这些实施例以例示为目的,用意不是限定本发明。
实施例1 大鼠单克隆抗体的制作
[材料和方法]
免疫动物使用6周龄的Wister系雌性大鼠。抗原为GFP。每隔一个月在大鼠尾根部的两侧肌肉注射3次50μg的GFP,进行免疫。免疫成立后,从大鼠中采集肠骨淋巴结。GFP用Alexafluor488进行荧光标记,再通过凝胶过滤进行纯化。
将来自肠骨淋巴结的淋巴细胞悬浮在PBS-0.5%牛血清白蛋白溶液中,之后加入GFP (0.5µg/ml),在4℃下搅拌30分钟,进行细胞的抗原标记。将细胞离心分离后悬浮在DMEM培养基中,向其中加入ER-Tracker (1µM),在室温下放置5分钟,由此将内质网染色。用PBS清洗细胞后,以抗原特异性浆细胞组分作为GFP阳性且ER-tracker强阳性细胞、以抗原非特异性浆细胞组分作为GFP阴性且ER-tracker强阳性细胞,利用细胞分选仪进行分离。
[结果]
将由肠骨淋巴结制备的淋巴细胞用抗大鼠IgG(绿)和ER-tracker染色后,在荧光显微镜下观察。其结果,在ER-tracker强阳性的浆细胞表面确认到了IgG的表达,但较弱(图1)。
接下来,尝试着能否通过使GFP与该膜型IgG作用来鉴定抗原特异性浆细胞。将来自肠骨的大鼠淋巴细胞悬浮液用Alexafluor488标记GFP和ER-tracker进行染色,使用流式细胞仪对其进行分析。其结果,如图2的A所示,存在GFP阳性细胞群。这些GFP阳性细胞群中,多数是来自非特异性吸附GFP、表达低亲和性膜型抗体的B细胞的信号。为了从中鉴定抗原特异性浆细胞,以GFP强阳性且ER-tracker强阳性的细胞作为抗原特异性浆细胞、以GFP阴性且ER-tracker强阳性的细胞作为非特异性浆细胞,使用细胞分选仪进行分离(图2的A的高和低)。对分离的细胞进行固定·细胞膜增溶处理,使用抗大鼠抗体进行染色,结果,分离收集的细胞在其细胞质内表达大量的抗体,由此判明其是浆细胞(图2的B)。
cDNA合成
cDNA合成和免疫球蛋白基因扩增根据“反应治具和反应方法、以及cDNA的合成方法”(WO2009/091048)中记载的方法来进行(图3)。
将通过细胞分选仪分离的各个大鼠浆细胞加入到添加有3μg结合了oligo dT25的磁珠(ダイナピーズ)的3μL细胞溶解液(100mM的TrisHCl(pH7.5)、500mM的LiCl、1%的十二烷基硫酸Li(LiDS)、5mM的二硫苏糖醇)中,使细胞内的mRNA与磁珠结合。接下来,将磁珠用3μL的mRNA清洗用溶液A(10mM的TrisHCl(pH7.5)、0.15M的LiCl、0.1%的LiDS)、接着用3μL的mRNA清洗用溶液B(75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂)清洗1次,之后进行cDNA合成。向清洗后的磁珠中加入3μL cDNA合成用溶液(50mM的TrisHCl(pH8.3)、75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX-100、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂、l0单位的SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen),在37℃下反应1小时。接下来,用3μL的3’加尾清洗溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)、0.5mM的dGTP、0.1%的TritonX-100、4mM的氯化镁)清洗磁珠,重新加入3μL的3’加尾反应溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)、0.5mM的dGTP、0.1%的TritonX-100、4mM的氯化镁、10U的末端脱氧核苷酸转移酶),在37℃下反应30分钟。
大鼠γ、κ链可变区基因片段的扩增
用3μL的TE溶液(10mM的TrisHCl(pH7.5)、1mM的EDTA、0.1%的TritonX-100)清洗磁珠,之后利用5’-RACE PCR法进行人免疫球蛋白γ链和κ链基因的扩增。第1次的PCR反应是向磁珠中加入25μL的PCR反应溶液(含有各0.2μM的引物、0.2 mM的dNTP、lU的タカラバイオPrimeSTAR耐热性DNA聚合酶),进行35个循环的94℃ 30秒-68℃ 40秒的反应。使用的引物是(a),退火到通过TdT添加在cDNA的3’端的polyG。引物序列是(b),来自大鼠免疫球蛋白γ链基因的恒定区。引物序列是(c),来自大鼠免疫球蛋白κ链基因的恒定区。
反应后,向PCR溶液中加入225μL水,以1μL稀释了10倍的溶液为模板,使用引物(d)和引物(e),在与第1次的PCR相同的条件下进行大鼠免疫球蛋白γ链基因的可变区的扩增反应。同样,使用引物(d)和引物(f),进行大鼠免疫球蛋白κ链基因的可变区的扩增反应。
使用的引物如下:
第1次PCR有义引物
5-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3 (a)(SEQ ID NO: 55)
第1次PCR γ链扩增用反义引物
5-GCAGGTGACGGTCTGGCTGGRCCAGGTGCTGGA-3 (b)(SEQ ID NO: 56)
第1次PCR κ链扩增用反义引物
5-TCGTTCAGTGCCATCAATCTTCCACTTGAC-3 (c)(SEQ ID NO: 57)
第2次PCR扩增用有义引物
5-CGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCC-3 (d)(SEQ ID NO: 58)
第2次PCR γ链扩增用反义引物
5-CTGCAGGACAGCTGGGAAGGTGTGCAC-3 (e)(SEQ ID NO: 59)
第2次PCR κ链扩增用反义引物
5-TAACTGTTCCGTGGATGGTGGGAAGAT-3 (f)(SEQ ID NO: 60)
反应后,取各1μL的PCR溶液,通过琼脂糖凝胶电泳法确认κ和γ链免疫球蛋白基因片段转变成了表达单元(参照图3上)。
大鼠免疫球蛋白线状化表达载体的制作
大鼠γ链基因、κ链基因表达单元的制作根据“包含来自靶基因的序列的连接DNA片段的特异性制作方法”(WO2011/027808)的方法来进行。
即,向1μL通过5’-RACE-PCR法扩增的各PCR产物中加入2单位的末端脱氧核苷酸转移酶,在37℃下反应30分钟,之后在94℃下加热5分钟,由此停止酶反应。
向上述制备的添加了3’端多核苷酸的大鼠γ链基因溶液中加入10ng大鼠γ链基因连接用双链DNA片段、各10pmol的引物(g)(h)、10nmol的dNTP,使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶,在25μl的反应液中进行5个循环的94℃ 40秒、70℃ 4分钟的反应,接着进行30个循环的94℃ 40秒、60℃ 40秒、72℃ 4分钟的反应,由此制作大鼠γ链基因表达单元。
同样,向大鼠κ链基因溶液中加入大鼠κ链基因连接用双链DNA片段进行反应,制作大鼠κ链基因表达单元。
5-AGAGAAACCGTCTATCAGGGCGATGGC-3 (g)(SEQ ID NO: 61)
5-AGAGACCCTTTGACGTTGGAGTCCACG-3 (h)(SEQ ID NO: 62)
反应后,取各1μL的PCR溶液,利用琼脂糖凝胶电泳法确认κ和γ链免疫球蛋白基因片段转变成了表达单元(参照图3下)。
基因连接用双链DNA片段
大鼠γ链基因连接用双链DNA片段由大鼠γ链恒定区(1-873)连接序列II(1-54)、polyA添加信号(1045-1051)、CMV启动子(1577-2172)、连接序列1(2173-2201)组成(SEQ IDNO: 63)。
基因连接用双链DNA片段
大鼠κ链基因连接用双链DNA片段由大鼠κ链恒定区(1-325)、连接序列II(1-53)、polyA添加信号(507-513)、CMV启动子(1038-1633)、连接序列1(1634-1662)组成(SEQ IDNO: 64)。
将上述实验中扩增的全长大鼠γ链、κ链基因表达单元遗传导入到293FT细胞中,培养2天,由此使重组大鼠抗体分泌到细胞培养液中。利用ELISA法对由抗原特异性浆细胞和非特异性浆细胞得到的重组大鼠单克隆抗体的抗原结合能力进行研究(图4)时,由抗原特异性浆细胞得到的重组大鼠单克隆抗体,其12个克隆中有9个克隆对GFP显示出强的结合力。相对于此,由全浆细胞组分得到的重组大鼠单克隆抗体,其12个克隆中仅有1个克隆对GFP显示出强的结合。由以上的结果可知:通过只是使标记抗原和ER-tracker与淋巴细胞悬浮液作用的操作,即可鉴定抗原特异性浆细胞,并可由其高效率地制作抗原特异性大鼠单克隆抗体。
实施例2 抗人胰岛素豚鼠单克隆抗体的制作
胰岛素是重要的激素,其与存在于肝脏、肌肉或脂肪组织的细胞表面的胰岛素受体结合,控制葡萄糖摄入到细胞内,从而担负着调节体内的能量代谢的作用。测定血中胰岛素浓度,这在把握糖尿病、肥胖等病态方面也具有极其重要的意义。除豚鼠外,哺乳动物的胰岛素的结构具有高度同源性,因此难以使用小鼠来制作单克隆抗体。因此,在人胰岛素的血中浓度测定中,使用由豚鼠血清得到的多克隆抗体。但多克隆抗体在免疫动物个体间的批间差异大,难以维持恒定的品质,希望开发抗人胰岛素豚鼠单克隆抗体。因此,利用本发明,制作抗人胰岛素豚鼠单克隆抗体。
[材料和方法]
免疫动物使用6周龄的雌性豚鼠。抗原是人胰岛素。每隔一个月在豚鼠尾部的两侧肌肉注射4次50μg的人胰岛素,进行免疫。免疫成立后,从豚鼠中采集肠骨淋巴结。胰岛素用Alexafluor594进行荧光标记,再通过凝胶过滤进行纯化。
[结果]
将来自肠骨淋巴结的淋巴细胞悬浮在PBS-0.5%牛血清白蛋白溶液中,之后加入荧光色素标记抗豚鼠抗体,在4℃下搅拌30分钟。将细胞离心后悬浮在DMAM培养基中,向其中加入ER-Tracker (1µM),在室温下放置5分钟,由此将内质网染色,在荧光显微镜下进行观察。其结果,在ER-tracker强阳性的浆细胞表面确认到了IgG的表达(图5)。
接下来,尝试着能否通过使荧光标记抗原与该膜型IgG作用来鉴定抗原特异性浆细胞。将肠骨豚鼠淋巴细胞悬浮液用Alexafluor594标记胰岛素和ER-tracker进行染色,利用流式细胞仪对其进行分析。其结果,如图6所示,存在标记胰岛素阳性且ER-tracker强阳性的细胞群(图6的R1)。将其作为抗原特异性浆细胞组分。
cDNA合成
cDNA合成和免疫球蛋白基因扩增根据“反应治具和反应方法、以及cDNA的合成方法”(WO2009/091048)中记载的方法进行。
将利用细胞分选仪分离的各个豚鼠浆细胞加入到添加有3μg结合了oligo dT25的磁珠(ダイナピーズ)的3μL细胞溶解液(100mM的TrisHCl(pH7.5)、500mM的LiCl、1%的十二烷基硫酸Li(LiDS)、5mM的二硫苏糖醇)中,使细胞内的mRNA与磁珠结合。接下来,将磁珠用3μL的mRNA清洗用溶液A(10mM的TrisHCl(pH7.5)、0.15M的LiCl、0.1%的LiDS)、接着用3μL的mRNA清洗用溶液B(75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂)清洗1次,之后进行cDNA合成。向清洗后的磁珠中加入3μL cDNA合成用溶液(50mM的Tris HCl(pH8.3)、75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX-100、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂、l0单位的SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen),在37℃下反应1小时。接下来,用3μL的3’加尾清洗溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)、0.5mM的dGTP、0.1%的TritonX-100、4mM的氯化镁)清洗磁珠,重新加入3μL的3’加尾反应溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)、0.5mM的dGTP、0.1%的TritonX-100、4mM的氯化镁、10U的末端脱氧核苷酸转移酶),在37℃下反应30分钟。
豚鼠γ、κ、λ链可变区基因片段的扩增
用3μL TE溶液(10mM的TrisHCl(pH7.5)、1mM的EDTA、0.1%的TritonX-100)清洗磁珠,之后利用5’-RACE PCR法进行人免疫球蛋白γ链和κ链基因的扩增。第1次的PCR反应是在磁珠中加入25μL的PCR反应溶液(含有各0.2μM的引物、0.2mM的dNTP、lU的タカラバイオPrimeSTAR耐热性DNA聚合酶),进行35个循环的94℃ 30秒-68℃ 40秒的反应。使用的引物是(a),退火到通过TdT添加在cDNA的3’端的polyG。引物序列是(i),来自豚鼠免疫球蛋白γ链基因的恒定区。引物序列是(j),来自豚鼠免疫球蛋白κ链基因的恒定区。引物序列是(k),来自豚鼠免疫球蛋白λ链基因的恒定区。
反应后,向PCR溶液中加入225μL水,以1μL稀释了10倍的溶液为模板,使用引物(d)和引物(l),在与第1次的PCR相同的条件下进行大鼠免疫球蛋白γ链基因的可变区的扩增反应。同样,使用引物(d)和引物(m),进行大鼠免疫球蛋白κ链基因的可变区的扩增反应。同样,使用引物(d)和引物(n),进行大鼠免疫球蛋白λ链基因的可变区的扩增反应(图7)。
使用的引物如下。
第1次PCR γ链扩增用反义引物
5-GGTGCTGCTGGCCGGGTGGGCTACATTGCA-3 (i)(SEQ ID NO: 65)
第1次PCR κ链扩增用反义引物
5-CAGAGCCATCCACCTTCCACTTGACGG-3(j)(SEQ ID NO: 66)
第1次PCR λ链扩增用反义引物
5-CTGCTGGCCATGTATTTGTTGTCGCTCTG-3(k)(SEQ ID NO: 67)
第2次PCR扩增用有义引物
5-CTGAAGGACGGCCGGGAAGGTGTGCAC-3(l)(SEQ ID NO: 68)
第2次PCR κ链扩增用反义引物
5-GGAAGAGGGAGATAGTTGGCTTCTGCACACTC-3(m)(SEQ ID NO: 69)
第2次PCR λ链扩增用反义引物
5-AGAAGGAATTCAGGAGACACACCACTGT-3(n)(SEQ ID NO: 70)
由于豚鼠的抗体基因的结构尚未明确,所以使用由豚鼠脾细胞制备的cDNA,克隆豚鼠γ链基因恒定区、κ链基因恒定区和λ链基因恒定区,确定它们的核苷酸序列。具体而言,向加入有3μg结合了oligo dT25的磁珠(ダイナピーズ)的3μL细胞溶解液(100mM的TrisHCl(pH7.5)、500mM的LiCl、1%的十二烷基硫酸Li(LiDS)、5mM的二硫苏糖醇)中加入豚鼠脾细胞,使细胞内的mRNA与磁珠结合。接下来,将磁珠用3μL mRNA清洗用溶液A(10mM的TrisHCl(pH7.5)、0.15M的LiCl、0.1%的LiDS)、接着用3μL mRNA清洗用溶液B(75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂)清洗1次,之后进行cDNA合成。向清洗后的磁珠中加入3μL cDNA合成用溶液(50mM的Tris HCl(pH8.3)、75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX-100、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂、l0单位的SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen),在37℃下反应1小时。
使用上述制备的cDNA作为模板,用引物(o)和(p)扩增γ链恒定区,用引物(q)和(r)扩增κ链恒定区,用引物(s)和(t)扩增λ链恒定区。将所扩增的DNA片段插入pBlucscriptSK载体的XhoI/NotI位点,之后确定核苷酸序列。
(o)5-AGAGACTCGAGTGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGA-3(SEQ ID NO: 71)
(p)5-GAGAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGAT-3(SEQ ID NO: 72)
(q)5-AGAGACTCGAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGA-3(SEQ ID NO: 73)
(r)5-GAGAGAGCGGCCGCCTAGCACTCGCTCCTGTTGATGGTCT-3(SEQ ID NO: 74)
(s)5-AGAGACTCGAGGAGGAGCTCCAGGACAACAAGGC-3(SEQ ID NO: 75)
(t)5-GAGAGAGCGGCCGCTAAGAACACTCTGACGGGGCCAC-3(SEQ ID NO: 76)
γ链恒定区序列(SEQ ID NO: 1)
γ链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)
κ链恒定区序列(SEQ ID NO: 2)
κ链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)
λ链恒定区序列(SEQ ID NO: 3)
λ链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)
豚鼠γ链基因、κ链基因、λ链基因表达单元的制作根据“包含来自靶基因的序列的连接DNA片段的特异性制作方法”(WO2011/027808)中记载的方法进行。
即,向1μL利用5’-RACE-PCR法扩增的各PCR产物中加入2单位的末端脱氧核苷酸转移酶,在37℃下反应30分钟,之后在94℃下加热5分钟,由此停止酶反应。
向上述制备的添加了3’端多核苷酸的豚鼠γ链基因溶液中加入10ng豚鼠γ链基因连接用双链DNA片段、10pmol引物、10nmol dNTP,使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶,在25μL反应液中进行5个循环的94℃ 40秒、70℃ 4分钟的反应,接着进行30个循环的94℃ 40秒、60℃ 40秒、72℃ 4分钟的反应,由此制作豚鼠γ链基因表达单元。
同样,在豚鼠κ链基因溶液中加入豚鼠κ链基因连接用双链DNA片段进行反应,制作豚鼠κ链基因表达单元。同样,在豚鼠λ链基因溶液中加入豚鼠λ链基因连接用双链DNA片段进行反应,制作豚鼠λ链基因表达单元。
表达单元扩增中使用的引物是(g)(h)。
反应后,取各1μL的PCR溶液,利用琼脂糖凝胶电泳法确认κ和γ链免疫球蛋白基因片段转变成了表达单元(参照图8)。
豚鼠γ链基因连接用双链DNA片段由豚鼠γ链恒定区(1-911)、连接序列II(1-96)、polyA添加信号(912-1118)、CMV启动子(1628-2093)、连接序列1(2094-2123)组成(SEQID NO: 77)。
豚鼠κ链基因连接用双链DNA片段由豚鼠κ链恒定区(1-345)、连接序列II(1-55)、polyA添加信号(346-548)、CMV启动子(1058-1652)、连接序列1(1653-1682)组成(SEQ IDNO: 78)。
豚鼠λ链基因连接用双链DNA片段(序列)由豚鼠λ链恒定区(1-272)、连接序列II(1-52)、polyA添加信号(53-410)、CMV启动子(985-1579)、连接序列1(1580-1609)组成(SEQID NO: 79)。
将上述实验中扩增的全长豚鼠γ链、κ链、λ链基因表达单元遗传导入到293FT细胞中,培养2天,由此使重组豚鼠抗体分泌到细胞培养液中。利用ELISA法研究由抗原特异性浆细胞和非特异性浆细胞得到的重组豚鼠单克隆抗体的人胰岛素结合能力(图9)。其结果,由抗原特异性浆细胞得到的241种单克隆抗体中,有146个克隆显示出阴性对照的10倍的胰岛素结合能力,有77个克隆显示出阴性对照的50倍的强结合力。由以上的结果可知:在豚鼠中,通过只是使标记抗原和ER-tracker与淋巴细胞悬浮液作用的操作,也可以鉴定抗原特异性浆细胞,并可由其制作抗原特异性单克隆抗体。
从得到的241种重组抗体中选出与人胰岛素的结合能力特别高的12种克隆,确定其核苷酸序列。如此操作得到的抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的基因序列见序列表的SEQ ID NO: 7~SEQ ID NO: 18。另外,抗人胰岛素的豚鼠抗体的γ链可变区的肽的氨基酸序列见SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30。而且,抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的基因序列见序列表的SEQ ID NO: 31~SEQ ID NO: 42。抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链可变区的肽的氨基酸序列见SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54。
而且,关于上述的抗人胰岛素的豚鼠抗体的κ链和γ链可变区的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4,分别利用与人免疫球蛋白可变区的同源性来进行确定。得到的12种豚鼠单克隆抗体的κ链和γ链的FR1~FR4和CDR1~CDR3的氨基酸序列见下表。
[表1]
实施例3 抗卵清蛋白兔单克隆抗体的制作
已知用兔可以制作在其他动物中无法得到的高亲和性的抗体。因此,利用本发明,制作兔单克隆抗体。
[材料和方法]
免疫动物使用6周龄的雌兔。抗原是卵清蛋白。每隔1个月在兔尾部的两侧肌肉注射4次300μg的卵清蛋白,进行免疫。免疫成立后,采集肠骨淋巴结。卵清蛋白用Alexafluor488进行荧光标记,再通过凝胶过滤进行纯化。
[结果]
将来自肠骨淋巴结的淋巴细胞悬浮在PBS-0.5%牛血清白蛋白溶液中,之后加入Alexafluor488荧光标记卵清蛋白,在4℃下搅拌30分钟。将细胞离心后再次悬浮在PBS中,向其中加入ER-Tracker (1μM),在室温下放置5分钟,由此将内质网染色,使用流式细胞仪进行分析。其结果,存在卵清蛋白阳性且ER-tracker强阳性的细胞群(图10)。将其作为抗原特异性浆细胞组分。
cDNA合成
cDNA合成和免疫球蛋白基因扩增根据“反应治具和反应方法、以及cDNA的合成方法”(WO2009/091048)中记载的方法进行。向加入有3μg结合了oligo dT25的磁珠(ダイナピーズ)的3μL细胞溶解液(100mM的TrisHCl(pH7.5)、500mM的LiCl、1%的十二烷基硫酸Li(LiDS)、5mM的二硫苏糖醇)中加入利用细胞分选仪分离的各个兔浆细胞,使细胞内的mRNA与磁珠结合。接下来,将磁珠用3μL的mRNA清洗用溶液A(10mM的TrisHCl(pH7.5)、0.15M的LiCl、0.1%的LiDS)、接着用3μL的mRNA清洗用溶液B(75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂)清洗1次,之后进行cDNA合成。向清洗后的磁珠中加入3μL cDNA合成用溶液(50mM的Tris HCl(pH8.3)、75mM的KCl、3mM的MgCl2、0.1%的TritonX-100、0.5mM的dNTP、5mM的DTT、2单位的RNase抑制剂、l0单位的SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen),在37℃下反应1小时。接下来,用3μL的3’加尾清洗溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)、0.5mM的dGTP、0.1%的TritonX-100、4mM的氯化镁)清洗磁珠,重新加入3μL的3’加尾反应溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)、0.5mM的dGTP、0.1%的TritonX-100、4mM的氯化镁、10U的末端脱氧核苷酸转移酶),在37℃下反应30分钟。
兔γ、κ链可变区基因片段的扩增
用3μL的TE溶液(10mM的TrisHCl(pH7.5)、1mM的EDTA、0.1%的TritonX-100)清洗磁珠,之后利用5’-RACE PCR法进行人免疫球蛋白γ链和κ链基因的扩增。第1次的PCR反应是在磁珠中加入25μL PCR反应溶液(含有各0.2μM的引物、0.2 mM的dNTP、lU的タカラバイオPrimeSTAR耐热性DNA聚合酶),进行35个循环的94℃ 30秒-68℃ 40秒的反应。使用的引物是(a),退火到通过TdT添加在cDNA的3’端的polyG。引物序列是(u)),来自兔免疫球蛋白γ链基因的恒定区。引物序列是(v),来自兔免疫球蛋白κ链基因的恒定区。
反应后,向PCR溶液中加入225μL水,以1μL稀释了10倍的溶液作为模板,使用引物(d)和引物(w),在与第1次的PCR相同的条件下进行兔免疫球蛋白γ链基因的可变区的扩增反应。同样,使用引物(d)和引物(x),进行兔免疫球蛋白κ链基因的可变区的扩增反应(图11)。
使用的引物如下:
第1次PCR γ链扩增用反义引物
5-GCTGGCTGCTTGAGGTCACGCTCACCAC-3 (u)(SEQ ID NO: 80)
第1次PCR κ链扩增用反义引物
5-CAGTTGTTTGGGTGGTGCCATCCAC-3 (v)(SEQ ID NO: 81)
第2次PCR γ链扩增用反义引物
5-CTGCCGGACGGACGGGAAGGTGCGTAC-3 (w)(SEQ ID NO: 82)
第2次PCR κ链扩增用反义引物
5-ACACACGATGGTGACTGTTCCAGTTG-3 (x)(SEQ ID NO: 83)
兔免疫球蛋白线状化表达载体的制作
兔γ链基因、κ链基因表达单元的制作根据“包含来自靶基因的序列的连接DNA片段的特异性制作方法”(WO2011/027808)的方法来进行。即,向1μL通过5’-RACE-PCR法扩增的各PCR产物中加入2单位的末端脱氧核苷酸转移酶,在37℃下反应30分钟,之后在94℃下加热5分钟,由此停止酶反应。
在上述制备的添加有3’端多核苷酸的兔γ链基因溶液中加入10ng兔γ链基因连接用双链DNA片段、各10pmol的引物(g)(h)、10nmol dNTP,使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶,在25μL的反应液中进行5个循环的94℃ 40秒、70℃ 4分钟的反应,接着进行30个循环的94℃ 40秒、60℃ 40秒、72℃ 4分钟的反应,由此制作兔γ链基因表达单元。
同样,在兔κ链基因溶液中加入兔κ链基因连接用双链DNA片段进行反应,制作兔κ链基因表达单元。
表达单元扩增中使用的引物是(g)(h)。
反应后,取各1μL的PCR溶液,利用琼脂糖凝胶电泳法确认κ和γ链免疫球蛋白基因片段转变成了表达单元(图12)。
基因连接用双链DNA片段
兔γ链基因连接用双链DNA片段由兔γ链恒定区(1-893)、连接序列II(1-93)、polyA添加信号(1065-1071)、CMV启动子(1606-2195)、连接序列1(2196-2230)组成(SEQ IDNO: 84)。
基因连接用双链DNA片段
兔κ链基因连接用双链DNA片段由兔κ链恒定区(1-312)、连接序列II (1-95)、polyA添加信号(507-513)、CMV启动子(1050-1633)、连接序列1(1640-1675)组成(SEQ IDNO: 85)。
将上述实验中扩增的全长兔γ链、κ链基因表达单元遗传导入到293FT细胞中,培养2天,由此使重组兔抗体分泌到细胞培养液中。利用ELISA法对由抗原特异性浆细胞和非特异性浆细胞得到的重组兔单克隆抗体的抗原结合能力进行研究(图13)时,由抗原特异性浆细胞得到的重组兔单克隆抗体对卵清蛋白显示出强结合力。由以上的结果可知:通过只是使标记抗原和ER-tracker与淋巴细胞悬浮液作用的操作,可鉴定抗原特异性浆细胞,并可由其高效率地制作抗原特异性兔单克隆抗体。
产业实用性
本发明在抗体制备的相关领域中有用。
Claims (5)
1.选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法,该方法包括:
从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,用靶抗原对非人动物进行免疫;
从免疫成立后的非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞;
将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合;以及
选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞,
此时,选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质是对细胞内质网的染色选择性高于对内质网以外的细胞器或细胞质基质的染色选择性的荧光探针,
上述选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质选自:(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质;以及(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质,
上述两亲性的两亲性指数(AI)为+6>AI>0,中等程度的脂溶性的疏水性指数(logP)为+6>logP>0,一定以上的亲和性的解离常数为0.1nM~0.1µM的范围。
2.选择与靶抗原特异性结合的人的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法,该方法包括:
从人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞,或者,从具有抗靶抗原抗体的人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞;
将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合;以及
选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞,
此时,选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质是对细胞内质网的染色选择性高于对内质网以外的细胞器或细胞质基质的染色选择性的荧光探针,
上述选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质选自:(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质;以及(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质,
上述两亲性的两亲性指数(AI)为+6>AI>0,中等程度的脂溶性的疏水性指数(logP)为+6>logP>0,一定以上的亲和性的解离常数为0.1nM~0.1µM的范围。
3.靶抗原特异性抗体或抗体片段的制备方法,该方法包括:
利用权利要求1或2所述的方法选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞;
从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因,鉴定其核苷酸序列;以及
根据鉴定的基因的核苷酸序列,制备上述抗体或抗体片段。
4.权利要求1或2所述的方法,其中,上述内质网以外的细胞器或细胞质基质是质膜、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、细胞核、中心体、吞噬体、核内体或者聚集体、或细胞质基质。
5.权利要求1或2所述的方法,其中,上述荧光探针选自荧光标记格列本脲、荧光标记布雷菲德菌素A、ER-Tracker Blue white DPX和荧光蛋白。
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