JPS59135898A - 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明＋ｄ、ｆ、を投グロブリン生産ｉｊＬ；”　ｋ異
しこする二種のヒトＢ−セル、とくしこ、免疫グロブリ
ン生産ｆｒｐ　’ｆ（−何するヒトＢ−セル（，４）と
免疫グロブリン生産能を実′Ｕ的に欠損しているヒｌ−
Ｂ−セル（Ｂ）との新しいタイプの融合細胞のクローン
紮ヒトＩＩ外で産生じ、該クローンから前記ヒトＢ−セ
ル（Ａ）と同形質の免疫グロブリン含有物質又Ｖ」免疫
グロブリン？採取する抗原特異的ヒト免疫グロブリンの
生産方法に関する。生産されるヒト免疫グロブリン（Ｌ
Ｊ、例えば、人の抗原性病気の予防、治療、診断などの
医学及び薬学分野や生化学的試薬、生体高分子の精製試
薬など２−理学分野、生化学分野等の如き広い分野に於
て有用である。 更に詳しくは、本発明は （１）　　免疫グロブリン生産能紮有するヒトＢ−セル
（Ａ）ｋ含イ■するヒト細胞群と、 （２）クイ）適当な培地中で自己増殖性忙ηし、（ロ）
！持重の試薬の會在「又シま′１−「カーの成分の不存
在Ｙ°で噌噴停止１．又に１死滅”Ｊ−１，感受性シー
１１し、ト１一つ （ハ）　免役グロブリン牛ν（ｔ　ｉ］ｌｕケ爽′Ｐ１
的シ′こ欠４〔１シている ヒトＢ−セル（Ｂ　）ゲ含有するヒト細胞！１［と牙、
（３）　　人間の庫外で融合し′ＣヒトＢ−セルｆ、４
）とヒ）　Ｂ　　＋　ル（Ｂ　）　トノｔ６１Ｉ１合＋
％ＩＩＩＪ泡ｋ　ｘ生し、？！ｆら′Ｉする融合・ＩＩ
ＩＩＩ　Ｉｔ説ケ、Ｊ−、記ｆｉｌのヒトｉ′１１１月
己７ノ「及びＪ二記（２）のヒト細胞群は増ｊｄ停止ｎ
又は夕り滅するが該融合細胞は増殖し１↓・する培地中
で」８謄１．　Ｔ：　＋ｄ’ｌｌ曾細胞クローンを取得
（〜、 （４）　　この＃１１！　ｆ＃　Ｈ旧ｉ；３Ｂクローン
かｔつ前記！♂−十ルセル）と同形質の免疫グロブリン
パ有゛吻、７ｆ又ｔ」免Ｊぐグロプリンケ採取する こと全特徴とする抗原特′Ｊ４的ヒト免疫グロブリンの
生産方法Ｖ（関する。 従来、抗原により′Ｃ感作されたマウスＢ−セルと骨１
ｊ病性白血病（ｍ、ｙｓｌｏｍａ　）マウスからのマウ
ス１♂−セルとの融合イ用胞をマウス体外で形成し、上
記抗原に対するマウス免疫グロブリン生産能ゲ有し且つ
自己増殖性をイ１するマウス／マウス融合細胞全形成し
／で、報告は知られている（Ｉ＋ｌＪえばＮａ、ｔｕｒ
ｅ　、　Ｖｏｌ、　　２５６．１９７５年、４９５〜４
９７頁：　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ。 Ｖｏｌ、７５．Ａ７．　１９７８年、３４０５〜３４０
９画、等）。又、抗原によって感作されたヒトＢ−セル
と・４隨性白血病マウスからのマウスＢ−セ／Ｌとの融
合細胞全体外で形成し、上記抗ｊμに対するヒト免疫グ
ロブリン生産ｈＦ、’ｃ七しくｔつ自己増殖性ケイイす
るヒト／マウス融合細胞を形成した報告も知られテｔ、
−＋る（１イ・１１えば、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ。 Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、　　　ＵＳＡ　　、　　Ｖｏ
ｌ、　　　７　７　　、Ｉ；；１．　１　　。 １９８　ｏａｔ：、６８４１〜６８４５０：　Ｔｈｅ　
Ｊｏ７Ｌｒ−ｎａｌ　　　ｏｆ　　Ｉｍｍ？ｂｎ、ｏｔ
ｏｇｙ、　　Ｖｏｌ、　　　１　２　５　　、＆３１９
８０年、１０３７〜１０４３１１’ｉ、吟）。 しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産卵紮有する融合
細胞を取得し７ようという上）１】後バの試みＶこ於て
ｔま、経時的Ｖこ染色体欠落ケ中い、前、＋（４ヒト免
疫グロブリン生産能が経時的に喪失し、免疫グロブリン
生産７ｉヒが極めて不安定でめる数品的な欠陥ケ■する
。 ヒト免役グロブリン生産能？ａｌイするヒト／ヒト融合
ｍ１１１胞を形成する試みとし２て、抗ｊうξとＪ２．
−’Ｃ−・・ンカ、ヒールス父＆、１）７−テ７　（ｈ
ａｐｔｅ、？ｔｌ　（２、４−ノニトロフェニル〕によ
って感作されたヒトｌイーセルゲドナーとじＣ便用し、
これと骨１１＋Ｎ　ｌ’ｌＦ白血病患者からのヒト免疫
グロブリン生ｐ”Ｖ能４有するセル・う・Ｉｙ＜ヒトＢ
−セル）（親１株）とのＰｙｌ！ＩＩｆ−￥細胞ケヒト
庫外で形成し、上記抗）帆ＶＣズ・１−するヒト免疫グ
ロブリン生産能忙イ１しはつ自己増殖性を・有するヒト
／ヒト融合細胞を形成１〜だ報告が知られている（Ｎａ
、ｔｔｔ、ｒｅ、　Ｖｏｌ、　２８８　、１９８０年、
４８３〜４　８　３　　＠　　：　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｌ）　ＳＡ。 Ｖｏｌ、’ｌＴ、篇９，１９８０年、５４２９−５４３
１臼）。 しかしながら、この報文の方法Ｖ

【二よれば、ｒ差渚の
親２株でｒ＋’）るセル・ライン（ヒトＢ−セル）が前
者のドナーであるヒトＢ−セルとは異なるヒト免疫グロ
ブリン生産能を有する／ζめに、↑（事られるヒト／ヒ
ト融合細胞は両者のヒ１４−セルの免疫グロブリン形質
？有するものの混８・体となる。このため’ｖＣかかる
ヒト／ヒト融合細胞から採取される免疫グロブリンは幾
つかの形質の免疫グロ７”　リンの混合体となり、リン
・９球（Ａ）と同形質の免疫グロブリンが一定の特異的
形質全維持し７ながらかつ牟−抗体として産生されるこ
とが不可能となる。 この結果、１ｆｌＪえげリンパ球（，４）と同形゛ｎの
抗原ｔ１ケ異的ヒト免役グロブリンヶ用いようとしても
、他の形質の免疫グロブリンが干渉することとなり、目
的とする治療、予防、回前、硝嫂等の１蓼行が困綽とな
る。 その上、」−：記の報文で用い１〕ｔ１だ親５株である
セ／ｌ・ライン（ヒｆ−Ｂ−セル）は・浴剤感受性が可
逆的であつ℃、ＩＸｌ＼受性を喪失ｊ−る頻度が篩く、
−且このＬうな現象が生じると所望の融合、ｒｍ胞ケド
ナー及び親株としＣ用いたヒトＢ−セルが１分Ｎｊｌｆ
Ｌ、、仔１１ゾするこ々が１４・イ呻となる。さら！／
Ｃ，親株で４りるセル・ラインの培養中Ｖ（凝集塊を・
形ｒ１．４　（、鳩く、その結呆融合Ｍ１１胞奮産／イ
：−するイ弼率がイｊ（いという何り点もある。 イぐ発ＩＪＪ、ｉ者ｔ−）−１＋°ナーとして用いるヒ
ドリン・ぐ球のＢ−セル〔以ＦＢ−セル（Ａ）ともいう
〕と同形質の４１１：原物異的ヒト免疫グロブリン令−
その−・定の形′ｆ１盆ｈｍ、持しつつ生産ｉｊｌ’１
屯のヒト／ヒ）　Ｍｌ！ｉ合卸１合金１砲生し、こｔｌ
から単一形質の免疫グロブリンを生産する目的でａｌｌ
’ｌ’ｉなで行った。 −を−の結果、免疫グロブリン牛産卵′に有するヒトＢ
−セル（Ａ）と、免疫グロブリン生産能を実ノｕ的に欠
損しているヒトＢ−セル（Ｂ）とを人間の体外で融合ｊ
ることバーより新規なヒト／ヒト融合にｌｉ１胞を産生
ずることができること、−含して産生されたこのヒト／
ヒト融合細胞は該ヒトＢ−セル（，４）の免疫学的形質
ケイイし月、っぞのような形質全安定に持続し得ること
をｇ３蟻した。史に、この新（〜いタイプのヒト／ヒト
融合細胞ケ効率よく産生ずることが容易であって、且つ
融合細胞形成確率も商く、そして体外でヒト免疫グロブ
リンの大ｍｌ生産金可能とするユニークなヒト／ヒト融
合細胞であることを知った。 上記の新しい諸知見に基いて咀にイ＋）ｆ究金進ｌ）た
結果、本発明によれば、 （１）　　免３更グロブリン生ｙｒＲｉ１＠　ｌニイ■
するヒトＢ−セＪし〔以下ヒトＢ−セル（Ａ）ともいつ
〕紮含有するヒト細胞イｉ１ミと、 （２）　　（イ）虐当な培地中で自己増殖性孕イＡし、
（ロ）特定の試檗の存イを１父は特定の成分の不イＩ在
下で増殖停止又は死滅−４“る感受性奮有し、目つ （／う　免疫グロブリン生ノソＰ萌ゲ実質的Ｖこ欠損し
。 ている ヒトＢ−セルＣＬ−，を下ヒト１３−セル（１）　）と
もいう）ｋ含有するヒトイ出回群 とケ人１０」の体外で１ｔｌｌｔ合して、ヒトＢ−Ｔセ
ノｔ（Ａ　）とヒトＢ−セル［ｊ’）との融合細胞ケＪ
■生じ、得られる融合ポ１１１ｎ説を、上記（１）のヒ
ト細胞群及び」二１１４（２）のヒト細胞群Ｖま増殖停
止又は死滅−するが該融合細胞ｅ」、増殖しイ４ｊる培
地中で培養して融合細胞クローンを取得し、この融合細
胞クローンからの前記Ｂ−セル（Ａ）と同形質の抗原特
異的ヒト免疫グロブリン含有物貿又Ｃ」免疫グロブリン
ケ採取することによって、所望の目、つ一定の免疫形質
全音するヒト免疫グロブリンを再現性よく１１ゾ得でき
ることケ発見し／こ。 かくして、−人の患者から採られたリン・ぐ球音用い゛
４本発明により生産した抗体がその本人（Ａｕｔｏｌｏ
ｇｏｕｓ　）の抗原及びこれと同形質のヒト抗原ＰＣ対
して特異的に反応することが実験的に判明した。 本発明者の知る限り、＾１■記（１）のヒトＢ−セルを
ドナーとしで用い、これケ内１目己（２）のヒトＢ−セ
ルの知く免疫グロブリン生産能を実フイ的に欠損し、て
いるイは株と、人間の体外で、１蝕介してヒト／ヒト融
合に＋ＩＩ胞を産生きせることりこＩノに功し、た例−
これ寸で全く知られていない。加えて、この融合細胞か
ら生産されるヒト免疫グロブリンが本人（患者）および
本人以外の−そ”れど同形質の抗原（組織）と特異的（
ｑ−反応することｆ、１、未だ報告さｔＬ’１１いない
。 しか４）に本発明者＆ｊ：　Ｆ￥ｉｌ記（１）の過当な
ヒトＢ−セルケドナーとして用い、これケ前４山２）の
免疫グロブリン生産「Ｉヒ？ｒ実′ｅ１的に欠損してい
るヒトＨ−セル（親株）と、人間の体外で融合すること
により融合細胞ケ戸Ｖ生ノーることかできること、−′
Ｃ’　Ｉ−、−Ｃ産生された融合細胞は親株のＢ−セ／
ＬとＶま試隋又は培地成分１１（Ｔ対する感受１′１：
が異７７１７、しかもドナーで・ｂるＢ−セルｔ」増殖
ｒ４？が乏しいためＰ４之等のＢ−セルと分離すること
がｉＪ能であること、さらに分離された融合細胞を・別
の培地で培促ｆるとイニの多くのものは増殖が停止し又
は死滅−）゛るが、−その一部ＶＣは安’ｘｌ　ｌｌ（
−増殖してクローン＞Ｊ出戊するものが、イりること、
ナし−ｆこのクローン治・形成）る融合細胞！ｄ長れ１
１間嶋４、代増殖が用能であることを発μするＶ′ｃ芋
つ／こ。 従って、本発明の１４的＆Ｊ、　ｓ　ｌａｉ　Ｌいタイ
プの融合イ１１（胞のクローン１．０用いて抗原性異的
ヒト炎免疫グロブリンケ生産するユニークな方法ケ提供
するＶＣある。 本発明に於て、融合細胞のイｒ牛に用いる免疫グロブリ
ン生産能ケ自するヒトＢ−セル（Ａ　）　ｔ：ｊ：、任
、はの抗原によって感作され／（ヒドリン・１球の免疫
グロブリン生産能ケ有するヒトツノ−セルであることが
で入る。このようなヒトＢ−セル（Ａ）は人間の体外で
ｄ継代的自己増殖性全実質的に有Ｉ〜ないものが好−ま
しい。該抗原は病原性抗原であってもよいし、或は又、
非病原性抗原であってもよい。又、ヒドリン・９球の採
取源は適宜に顆択でき、たと乏−ば、ヒドリン・５節、
ヒトリンノぞ腺、ヒト肝臓、ヒト血液、ヒト骨肺などを
挙げることができる。 本発明１／Ｃｌ１５では、ヒトＢ−セル（ｌｉ　）とシ
テ免疫グロブリン生産能ゲ実質的に欠４Ｊ（Ｌ、−（い
るヒトＢ−セル（１］）？ｒ−用い、ヒトｌゴーセルｔ
Ａ＞とじて免疫ｙロブリン生賄能ｒイ１するヒトフィー
士ルｆＡ）をｒ用いるので、こノＬが１つ生産され／ヒ
釧８沼１１胞のクローンから上記ヒトＢ−セル（Ａ）の
生産−Ｊ゛るヒト免ノヂグロプリンの形質ケ適宜Ａ択す
るこトｖｃ裏す、　Ｉ’９ｒｆＪの抗原特異的ヒト免役
グロブＩＪ　７を生産することができる利点がある。 本発明をて於て、用いる１３ｉ１　、′＋１″、ヒトＢ
−十ル（Ａ、　）とし、７−Ｃけ、・ぐりｊ゛リ−Ａ′
、菌’ｌ１１１、カビｌ皓　ビールス、寄生虫、自己４
＞’ＣＩい、ガン細胞）ｌの病原１′Ｆ抗原し１丁よっ
て感作さり、たヒｔ・リンパ節、ヒドリン・ぞ腺、ヒト
朋！Ｉ＋威父はヒト血液中のリンパ１求のＢ−セル；及
び酵素、ｙｌｅ　’Ｊベグチド、蛋白質、１帖脂ｔす、
多イ病り飢核酸、ハゲテン又は変性ハプテン−（（）交
作又は−結合抗原性物質、に１１１胞膜抗原性物質暮の
非病原件抗ハフｔｃよつ−Ｃ感作されたヒトリンパ節、
ヒドリン・（腺、ヒト朋ミ；絨父はヒト血液中のリン・
９球のＢ−セルを何４′１」示することができる。 本発明Ｖこ於て、ヒトＢ−セル（，４）は、前記１？！
１示の如き採取源から分離採取されたヒドリン・ぐ球の
Ｂ−セルであって胸よいし、或Ｖま又、採ｊ収されたヒ
トリンノＺ球のＢ−セル金、ヒト体外で、例えば、増殖
性因子によっ７　ｊｖＩ焔及び／又は抗１１．Ｉ、性物
質で感作する、などの手法ケ利用してイ坪られる免疫グ
ロブリン生産能が増強されたヒトＨ−セルであってもよ
い。このような増殖性因子のし１１としてｔｉｔ、　　
リポポリサッカライド１本　　レクチン類なトに例示で
き、又、抗原性物質とし−こり、ヒトＢ−セル（，４）
紮感作芒ぜる抗原として前に例示したような抗原性物質
ケリけることが′Ｃさる。 上記生産能増強の操作に１１＋ｌＩえばＦ目１シ文献Ｖ
ｃよりヂ［１られており、本発明において利用−）−る
ことができる。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　０．　Ｓ、　Ａ。 Ｖｏｌ、　　７７、ｐｐＨ３９−１１４３（１９８０）
、Ｍｉｃｈａｇｌ　ｌｌｏｆｆｍ、ａｎ　；　”Ｎａｔ
ｕｒｅ　”、ｔ’Ｏｌ、２８２、（１９７９）、１Ｘｏ
ｂｉｎん、　Ｃ’ａｌｌａｒｄｏ好チしい−ｉｐ、；’
ｉ　）峡ＶＣＬ　ｉ［ば、上記の如き増殖性因子にとえ
ば／ｊＺ’Ａ／ｌ−１６４ＯｆＩＯ％仔牛匍清倉−５）
♀Ａ−有する。夜体陪地で、Ｍｉｔ記の如き採取諒から
分離採取さノしたヒ［・Ｂ−セル（／Ｉ）’に培養し、
仄いで該培′讐条件とし′７ｄまたとえ、ば、３７゛Ｃ
で約５〜７［１の如き条件奮１＋ｌ示できる。 本〉ネ明に於て用いる前記ヒトＢ−セル（Ｈ）　ｉｌ、
−Ｆ７″１ｉｉ（イ）〜（ハ）の沙件をｌ凶足するヒ１
．１３−セルで４）れは如何なるイ）のでもよく、〕ノ
ζ宜ＶＣ・′）■１１〈利用することができる。 （イ）１１電当な培１１１Ｌ中で自己増５１へ性ケｆ１
シ２、（ロ）特定の試楽の付在Ｆ又口、　％　’？の成
分の不存在トで増殖停止又は死滅ず４）１１べ・ψ目・
含−ｆ−４ｔ、、目、り （ハ）免役グロブリン生産能イ実質的Ｖ（欠］（オして
い６゜ 一ト、う己ヒ　ト　Ｉメーセル　（Ｂ）ｔ、ｊ、ｊ灼尚
な（呆取源、　／？−とえばピトリンパ１≧白、ヒドリ
ン・ぞ１１Ｖ、ヒトＩＩＱｊ　ｄ、ヒト血液、ヒト骨；
Ｉ１１イ、などのリン・′ｅ球かｌ−１４Ａ９Ｆゾし、
又ｅ、１こ扛ヶヒト体外で増り１１＜、Ｌ、＜Ｎ増殖が
ひ分化したものから選択することができる。上記（イ）
、（ロ）及び（ハ）の要件ケ満足するヒ１４−セルｌＢ
）’（ｒ直接１ぺ択一）′ることかできるが、操作上の
見地からＶユ、上記（イ）、（ロ）及び（ハ）の要件中
、−″′）Ｉ１１シ〈は二つの°易性のみ紮４１￥４足
するヒトＢ−セル全最初に採取し、欠如している他の要
件ケ満足する壕で、増殖又は分化等の処理ケ施すのが好
兼しい。 例えば、（イ）適当な培地中で自己増殖性ゲ勺し目つ（
ハ）免疫グロブリン生産能？実゛Ｐ（的に欠４１１シて
いるが（ロ）の性′ｍ紮イ１（７ないヒト＃−セルケＰ
１月ゾし、こｈに（ロ）憤定の試薬の存在下又１ｔ」、
”ｌ’＋宇の成分の不存在Ｆで増殖停［ト父Ｑま死滅す
る感受性ケ、ヒト体外で賦与することができる。この１
ｅｉ１様の実施に際しては、例えば下記文献により公知
の手法全利用することができる。Ｉｉｙｂｒｉｄｏｍ、
ａ　ｉｎ　ＣａｎｃｇｒＤｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎ、ｄ
　Ｔｒｇａｔｍ、ｅｎ、ｔ　ｃｄ、　Ｍ、　Ｓ、　Ｍｉ
ｔ−ａｈｅｌｌ　ａｎｄ　１１．　Ｆ、Ｏｅｔｔｇｅｎ
　Ｒａ、ｖｇｎ　ＰｒｅｓｓＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９
８２）、ｐ７１１２５−１３２゜たとλば、上記文献Ｖ
Ｃ紀截の手法を利用して、和１【康なヒト）１１セ１）
藏からパイオグシ−（ＢｉｏｐｓＶ　）により、リンパ
芽球、骨髄性白血病患者のリン・ぞ球などの如きリン・
セ系細胞をとり、イの中の免疫グロブリン生ＰＣ能ケ笑
′１り的しこ有しないＢセルリン・ぐ球ゲ選別分離し、
たとえば６−チオグアニン、８−７ｆグーγニン、５−
プロモデオキンウリソンの如きｍ宋変異原含有堵地で培
誉すると、適当な培地中で自己増殖性ケイ」し、免疫グ
ロブリンケ産生せずｆＴ４．１ｉＡＴ培地中でｔま死滅
する感受性分有するヒトＨ−セルｌ）？１１−１％るこ
とができる。１列λば、後記実施例で利用したヒトＢセ
ルＵに７２９−６１上記リン・ぞ芽球を用いて６−チオ
グアニン含有培地で培養して得ることができる。 上記ヒトＢセルＵＣ７２９−６は下梁技術院微生物工業
技術研究所長発行の寄ｉＬ営託拒否ｉｆｆ！知書ケ蛍け
た。 又、例えば、（イ）適当な培地中で自己増殖性分有Ｅ〜
、←）及び（ハ）の性質含有しないヒトＢ−セルを採取
し、これに上記と同様な手法で←）の性質を賦与したの
ち、それケ培養増殖させ、増殖物？それ自体公知のサブ
・クローニングの手法によりスクリーニングして０うの
性質を満足するヒトＢ−セルケえらび出すことができる
。 ヒトＢ−セル（Ｂ　）の要件（イ）の自己増殖性１ま、
ヒトＢ−セル（，４）とヒトＢ−セル（１−１）　トの
融合＋１ｌＩＩ胞に受部がれる形質でのるので、できる
限り長期間の自己増殖性、好ましくは実１べ的に永久的
な自己増殖性孕イ１′するヒトＢ−セルｆＢ）ｋ選択す
るのが好捷しい。工業的には、少なくとも１００回、よ
り好ｆｔ、＜ｔま少なくとも２００１す１１と（ＶＣは
少なくと１，５００回以上の自己増殖ケ繰りかえすもの
？選択するのがよい。 史に、−特性（イ）の自己増殖性ＶＣ関連し１ハ　自記
増殖の倍加時間（ダブリング・タイム）が約４８時間以
下、２　ｖにｔま約２０時曲以下で、＋−）るような自
己増殖性を刊するヒ）Ｂ−セル（Ｂ）の利ハ」が好まし
い。この倍加時間が小で、つるという性７１も、ヒトＢ
−セル（Ａ）とヒトＢ−セル（Ｂ）との融合細胞に蛍継
がれる形質であるので、融合＋ｒｌｌ胞のクローンの生
産する所望のヒト免疫グロブ＋）ン（７）生産ｉ１の増
大全達成できることになる。従って、４ｉＪ記自己増殖
性が長期１（１１維持され目、つ上記倍加時１１４１ニ
ア６．１、Ｔ６６Ｍ　）　Ｂ−ｔｙ。（Ｂ　）　ｆ　、
’ｊ。、−ｊ、’ｐｃ、！：［’よって１、とくに浸れ
たヒト免疫グロブリンの生産方法全提供することができ
る。 父、特性（ロ）の％定の試・餌の存在下で又Ｖ、↓特定
の□ 成分の不存在下で増殖停止又は死滅する感受性ｅま、ｆ
麦Ｖこ詳しく・ホベるＪ有望の融合１１ｆｌ　Ｊ抱りロ
ーン全取得するグξめのスクリーニングケ可能とするた
めＶＣ必９ｆｒ件＋（７４である。Ｊ：身３特定の試薬
の１列どしてＣ」、アミノグチリン、アラノシン、ウア
バインなど會ｌ＋ｌｌ承−することかできる。 −」二配感受Ｆｌ：　６：）、ヒトＢ−セル（Ａ）とヒ
トＢ−セル（Ｂ　）と力・ら産生されたＦ、Ｉ　Ｏ、；
→；）胞ＶＣ於て、可逆的に要件（ロ）を満柚１−．な
い状９１１に戻るＪｙ＋謂“バラ　　　　　１り・ミュ
ーテインヨン″（？Ｍ帰突然変異）？生ずる場ばがある
ので、本発明においては、特５Ｉの試薬の存在下で又Ｃ
−１特定の成分の不存在下てＪＷ　５１ｉ停止又は死滅
する非ＦｊＪ逆的な感受性ｋ　４ｉ−ｊるヒトＢ−セル
ＣＢＶｋ選ぶのがＨ利で４りる。 本発明で融廿細胞（）・イブリドーマ）を産生ずるのＶ
こ用いる上述のヒトＢ−セル（Ｂ　）　ｉＪ％適当な培
地及び培養条件下でシングルセルと１７て増殖可能なも
の、ずな７１−）ちセル凝集塊を・形成しないことが望
ましい。ヒトＢ−セル（Ｂ）の培１也と１〜では、例え
ば、仔牛血イＲ、ヒト血清、新生仔牛血清、’７７血ｍ
ｆｘ　トノ如き血清含有ＲＰｈ３１−１６４０培地など
をＢ’ｌｌ示できる。父、培養榮件として０−ま、例え
ば、５％ＣＯ，の存在下、ａ　７　Ｃの条件ゲド１１示
できる。 本発明ノｊ法ＶＣ於−ＣｒＪ　、上述の如き免疫グロブ
リン生産能を有するヒトＢ−セル（，４）ｋ含有するヒ
ト贅Ｉ胞イｊ「と、」二連の如き（イ）、（ロ）及び（
ハ）を満足するヒトＢ−セルｌ）ケ邑゛有するヒト１１
川川Ｕｉ「とを二、人間の体外で副（合（２−ζヒトＢ
−セル（／ｉ）とヒトＢ−−セル（Ｂ）とのｌＡ’ａ　
ｆ層′’ｌｌ　ｌ包り：　ｒｉｆｊ生Ｊ−る。 この融合細胞ケ産生ずる融合操作に１公知の如何なる方
法でもよい。融７４．操作Ｐｉ、溶媒中、融合促進剤の
存在−トに、ヒトＢ−セル（Ａ）とヒトＢ−セルＩＢ）
とな・接触させて行うことができる。このような融合促
進剤の例と（）Ｃは、仙台ビールス（ＨＶＪ）、ポリエ
チレングリコールなどを例示することができる。例えば
、水性媒体中、上記例示の如き融合回進剤の＜：ｐ（′
ｉＥ　ｌ；−１所竿Ｖ（よりおだやかな↑Ｗ、拌を加え
て系全均一にし、次いで、ヒトＢ−七〕（（Ａ）の１ケ
とｊニドＢ−セル（Ｂ）の１ケから成る融合Ａ１１１胞
が産生逼れる時間、たとえば数分間のオーダーで静置す
ることにより、１９［望の融合細胞が産生できる。液媒
の例としては水、生理食塩水、５％ツメチルスルホキシ
ド水溶ｉ、５％グリセロール水心液などｋ　１＋！ｌ示
することができる。 １）ｒ望のｌａ合細胞がｐｔ：狙された系を、例えば、
遠心分離して、ｒｘＨ＋＋：樋ｆｉｆを・採取し、再び
適当な培地Ｖ（、たと乏ば前記例示の如き血清代有ＲＰ
Ｍｉ−Ｌ６４０液体培地中に前記ｉ＆ｌＪ示の！ｙｕき
試薬ケ加え、採１１′Ｉした該Ａ’ｔｌｌ　Ｉ胞群奮分
１枚７＼ぜ、この分数液ケ例えばマイクロ・ｌイターパ
ｆレートの穴ＶＣ１夫々、一定１昔ずつつ分散注入し、
例え（・、Ｖ、５％ＧＯ７の合作下、３７゛Ｃで培養ゲ
行う。各穴中の陪僅液〒、１伺えば３目毎に１五しい′
Ｊ＠俣液と１１ゾりか乏−１汐ｌ」えば２週間培養ケ続
け／このち、Ｓ１皓散１見下で融合細胞の有無を倹べ、
コロニーの認められ／と試料の培養液を採１１Ｖし、ヒ
ト免疫グロブリンの１１・煙ケ、例えば＋ｉ″）　＞、
−Ｉｎいたラシ゛オ・イミュノ・アッセイによりイ寅出
することができる。 このようにし−Ｇ、ヒト免疫グロブリンの牛Ｉ）なの認
められたコロニー金、新しい培ｌｔ液に移して培養し、
融合イ１１胞を増殖させることにより融合４１４１１包
クローン紮取イ（Ｊすることができる。史Ｉ／Ｃ１必要
に応じて、ヤブ・クローニングし２て、ノー９１ｇのヒ
トＢ−セル（，４）と同Ｊ１そ實の抗原特異的ヒト免疫
グロブリン生産性クローンｈ−イυすることができる。 本４ら明方法ＶＣよｔｌば、上述のようにしで？？）ら
れる融合細胞クローン業適当な培地、たとえば１゜チ血
清會有１１．ＰＭＩ　−１６４０培地で培養し、培養液
ケ採取−ＪることＶ（よりヒトＢ−セル（Ａ）と同形質
の抗原特異的免疫グロブリン含有′Ｆ／ｌＩＪ質を得る
ことができる。史に、Ｈ１望により、精製して精製免疫
グロブリンとすることもできる。精製は、たとえは、硫
安分画法、アフイニディークロマトグラフイー、グルｐ
過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳！ｌ］／Ｊ
法などの如き生体液から免疫グロブリンを採取、精製す
る１県に利用できると同様な精製手段を利用ｒることが
できる。 本発明Ｉ／（−よれば、ｉ’（ｉＪ述しｋ　１．’＋！
Ｉｔ　ｆ３６′ｉｌ砲りｃｌ−ン又けその培養液からヒ
トＢ−セル（／ｉ）と同形質の抗原ｑｂ異的ヒト免疫グ
ロブリン含有物質又は該免疫グロブリンケ取得する場合
、抗原が分離できる場Ｂ　ｐ（ｔよその抗原と反応する
ヒト免疫グロブリン（抗体）♀探し出し５、また抗原が
分ｑトでき汽い場Ｏｖｃ　ｔま抗原性組織（例えば癌組
織）ｆ−ＩＢ−１免疫物質生産卵紮欠如１゛るか若しく
は極めて弱い生体例え−はヌ−ト−マウス（ｎ、ｔｂｄ
ｅ　ｍｏｕ、ｓｅ　）等に植えつけ組織ケイイ（：持し
７た鏝、その組織に対して或いは培１を系にもどされた
組織ＶＣ対し一〇反応するヒト免疫グロブリン（抗体）
♀１ｆｆｉＬ出し、こシＬを分離するのが慣利でりる。 本発明によれば、かくすることり（−より、抗原、殊に
病原性ｔＡ　７Ｊ旧・（−ゾ・４して！］イ異的ヒ）　
ｒｑｘ−免疫グロブリンを・生産することができる。 本発明方法の′実施ＶＣ際して、ヒｌ−Ｂ−セル＜、４
）ｔｊ：、既述のようＶＣ１任意の抗原Ｖこよって感作
されｆｒ　ヒ）　ｌ）ン・ぐ球の免疫グロブリン生産能
をイずするＢ−セルでめつＣもよい。 このようなヒトＢ−セル（Ａ　）　ｉｉ人１■ｌの体夕
１でｅま自己増殖性を一′鵠質的ＶＣ７ドさす、／（と
えば、１）事々敬回の分裂定行う場合がある４７１Ｂ−
の＜）のがＩｆま（〜い。 しかしながら、本発明に於−Ｃ目、ヒトＢ−セル（Ａ）
として、体外で自己増殖性ｋ］するヒトＢ−セル（Ａ）
、たとえば骨髄性日血病患背のリンパ球のＢ−セルも利
用できる。このような用台には、例えはヒトＢ−セル（
Ａ　）　＆（ｍ対する抗血清で且つヒト１３−セル（１
３）とｔユ結合しない抗血清をさらに含有する上記培地
ケ用いて、上記と同様に行うことができる。 本発明の好適態様によれば、前記（１）として抗原特異
的免疫グロブリン生産能をイＪ゛するヒトＢ−セル（Ａ
）を含有するヒト細胞群？用いる。このようなヒトｌ）
−セル（，４）はヒト体外でｔｉ実′η的な自己増殖性
を示さないものが１１利である。該抗原ｒ↓病原性（４
，原でべ一１′−）でも非病原性抗原でΔ）−ジてもよ
い。このような好適態様の一例とし−しＦ記の如き方法
に＋＋！ｌ示することができる。 （１）′抗原特異的、＆−，Ｆ　−ｆｆｉ　Ｌ　＜は病
原性抗原ＩＩ′コｆ昼的、さらに好′ｆｌ、＜ｒま腫瘍
（癌を包含する最も広義の意味である）特醍的免疫グロ
ブリン生産能を角するヒトＢ−セル（Ａ、　）を沈自Ｊ
−るヒト細胞群さ、 （２）′（イ）′適当な培［（ＩＬ中でＨ４しくは、昆
期出１自己増殖性好まり、　＜　Ｐ、ｊ実質的に水続的
な自己１曽殖性ケ有し、 （ロ）′好ましくｉｄ特定の試薬の存在士で増殖停止Ｆ
又は死滅する感受性をイイし、且つ（ハ）′免疫グロブ
リン生産能全実質的に欠損している ヒトＢ−セル（Ｂ）ｋ含有するヒト細胞１年と（３）′
　人間の体外で崎に１してヒトＢ−セル（，４）とヒト
Ｂ−セル（Ｂ）とのｉ？Ｖｌ！！１コ細胞を１′）１″
生し、イＬＩられる融合＾′（ＩＩ胞’ｆｈ上記（【）
　’の特定の試薬を３）ｊする培地中で培養して融合細
胞クローンを取得（〜、 （４）　　この融合細胞り１１−ンから前記Ｂ−セル（
／１）と同形質の抗原７１テ異的ヒト免疫グロブリンハ
イ１物質又ｔまかかるヒト免疫グロブリン金採１１ｖす
る ことヲ！１ヶ徴と−Ｊ゛るヒト免疫グロブリンの生産方
法。 木光明方法に於て、前記ヒ）　Ｂ−セル（，４）てヒト
Ｂ−セル（Ｂ）とを人間の体外で融合して産生される融
合細胞（ハイブリドーマ）の例と（〜て、ｆ麦に実）商
例（ｌＣ示すとヒドンヒトバイブリドニマ（Ｈｕｍａｎ
　ｈｙｂｒｉｒｌｏｍａ　）　ＣＬＮ　／　Ｓ　ＵＺＩ
Ｉ　５株及びヒト／ヒトバイブリド−マＣＬＮ／５ＵＺ
ｉｉ　１１株Ｏｆｆ、ｌｌＩ胞学的併′ｔノ１．孕Ｌ１
下しＣ示す。 ヒト／ヒトノーイブリ　ドーマＣＬ　Ｎ　／　、８Ｕ　
Ｚ　Ｉｆ　ｓ　ニー（１）　　染色体数９２ （２）ヒト中１投グロブリンＭ　（Ｉ　ｇ　Ｍ　）分泌
（生産）ｆ３）　　倍加時間（ダブリング・タイム）３
７時間＋４＋　　ＩＪン／ξ球糸ンングルセルヒト／ヒ
トハイブリ　ドー　マＣＬＮ／５ＵＺＩｉｌ　１　ニー
（１）染色体数９２ （２）　　ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分泌（牛１
ゝＲ）（３）　　倍加時間３７１Ｑ間 （４）　　リンノソ球系ンングルセル 上記両渚のヒ］・・ノ・イブリドーマｔ、′、ｒ　、工
“省技術院倣生物工業技術ＩＪｒ長発行の寄託受ｉＬ中
否通知卦を受けたＪ辿知１ｂ’号：５７微寄文第６３７
号及び第６３８号］。 本発明方法ＫＣよれば、臨床及び、、！ル礎Ｉ宍学分野
をｒよじめ製薬及び・薬理学的分野、生１１ツ学分野そ
の曲の広い分野においてユニークｆ！［」一つ注目すベ
キ４１用件ケ有するヒト免疫グロブリンを、とくにｊ９
ｉ　窒の１１つ一定形質の抗原１４♀畏的ヒト免疫グロ
ブリンケ、体外に於て工業的に有利シこＵｔｕ倍するこ
とができる。 かくして、本発明方法しこ従って、ヒト／ヒト・ハイブ
リドーマから牛７）７２される単一抗体（モノクロナル
抗体）は、例えば痛に代表されるような人ｆｉｌｌ　ｋ
ｃ起る治療附雌な疾患の部首および治療を包含する製薬
、医学、薬」４１ｊ学、生化学その他の広い分！ｌＪｆ
　Ｉｔｃ−お・いて１訂規１つ注目すべきイ１用性ケイ
］する。 ＋−＞＋＋　＊−ハ、マウス／マウス・モノクロナル抗
１本では、人間にマウス抗体金投轢することｅ（なるか
ら、当然、アレルギ症状やショック症状ケ併う危険が予
＾ｉされるし、又、ヒト／マウス・モノクロナル抗体で
は、上記と同イ子の危険のほかＶこ）・イブリドーマの
安定性ｖｃＨ，点があるため、均一の標品ヲ侵期にわた
って生ν四Ｓ観ること（，１できない。中に、ヒト／ヒ
ト・モノクロナル抗体の場Ｒしこ於−ても、細胞１７Ｉ
１１！汁に用いる親株で４５るヒトＢ−セル（Ｂ）ＶＣ
該当するＢ−セルが抗体生１狛ｈ１（ゲ有する場合＆Ｃ
ｔ、１、そ−のような抗体金光分ｌ／Ｃ除去するのが好
ｆ　ｔ＝い。しか１〜ながヒト／′ヒトモノクロナール
抗体でめるので、他人ＶＣ１１り少りしこもその抗原性
Ｖま低く、［）ＩＪ記のマウス／マウスモノクロナール
抗１．ｌｌ：＋ｔｃおりるような重大な危険＆、１ない
。 最も望まれるｌ［￥性は、患者本人のリン・ぐ糸が牛ｐ
νする抗体と同−形・νｆの抗原’ｌ’ｌ：異的抗Ｂ（
免疫グロブリン）ケヒト１本夕Ｌ−でｔｒｉ産さぜ、内
ひ本人の１水内Ｖこ、何等の則作用の危１↓−（なしに
戻すことを＋’Ｊ’　ｆｉヒとすることである。士して
、本発明ツノ法にして二）てＯ」しめて、そのようｋ・
抗原’ｔ４ｆ異的免）をグ【１プリン４・ヒト体外で王
斜的ン（牛産さ（−（ることが可能どなった。 本〜１“、明方法ｉ・ｃｊｊｌｌｄ：、１り１１えは、
以ト−に例示するような広汎な分野ｖＣ二おいて利用で
きる抗１ｊｉ　ｌｌい°）宣１り１ヒト免疫グロブリン
イ１−・ヒト体外で生１〉ｋすることがでさる。 １ノ・１１λ−ハ、ウィルス、バクテリア、寄生虫など
の外来の抗原に対する抗体をヒト体夕１で生産すること
かできる。史Ｖこ、癌などの自己体内で変化し／てｇ４
Ｊ’ｇ、　（ａｌｔｇｒｅｄ　５ｅｌｆ’　）に対する
抗体ヲヒト体外で生産することができ、また史に、アレ
ルギー性疾患Ｖｃみられるような低分子乃至高分子イし
学物質（ケミカル・メゾ・ｆエータ−）で惹き起される
アレルギー性疾患に対して、それら物質の作用を抑制す
る抗体？ヒト体外で生産することが可能となる。 苦に対する（（ＱＪ　Ｖｃついて、県に詳しく例示する
々、ヒト体外で堝産されたＩＭ　ｌｒヶ異的抗体それ自
体の作用で尚細胞の増殖抑制、癌細胞の死載金行わせた
り、ヒト体外でｈ″Ｌ芹さ〕［た涌組織ｄ、−１とわ）
、体ＶＣＣ棒体しくＱ」７°−リン・９球の助ｋｊ紮か
りて尚・）用１１攬の１曽殖抑制や％’ｖｉ　＃ｌｔｌ
胞死滅のｅ、またらきケさげ／こりすることができる。 史に−また、ヒト１本外で、１部され／ヒ癌！１イ異的
１１ｔ体合！キャリーｒ−とじて利用してｌ＋ＩＪλは
化学療法剤結ｆ干＝　ヒト・モノクロナル抗体、インタ
ーフェロン結−ｔ′ｉ−ヒト・モノクロナル抗１４’　
＋　＋９７ｉ　分子毒素結む−ヒト・モノクロナル抗体
、薬物入りｙ＋ｒソーム結台−ヒト・モノクロナル４Ａ
　１４７’Ｚ　トの形で癌細胞の増殖抑制や死滅のｔｉ
ｋｈさ１′さぜたりするのｅこイ１用である。捷だ、本
発明方法でイ（すられるヒトモノクロナール抗体をギヤ
リアーとして利用し、これに放射線感受性物質ケ結付さ
せて患ＫＶＣ投与Ｅ−５（１ｙ１細胞に選択的しこ集捷
る性質会−利用（−で、ｑＡ部を検知し、放射線療法？
Ｃ利用することができる。このような痛ｅ（対する利用
（（際しては、ヒト・モノクロナル抗体として冗全な抗
体音用いてもよいし７、抗体全化学的な手法で特異的抗
原認識部位ケ含むより小さな分子Ｖ（切断して用いたり
、或Ｖｉそのような小さな分子もしくは特異的抗原認識
部位のみケ他の抗体の非背〜゛６的抗原認識部分と結合
させて１、ｒり有効性のある修飾ヒト・モノクロナル抗
体ケ化学的手法で創製することもできる。 さらＶ（、イ（発明方法で得ることのできるヒト免疫グ
ロブリンケ利用して人の抗原性疾患の診断、予防などし
こ利用することができる。この利用や■様ＶＣよれば、
病原体あるいは疾、供ＶＣ（１′−っで牛体内げ現われ
る生体高分子Ｖこ対するｌ侍異的抗体ケ本発明方法によ
り作製し、得られた抗１本に列えはアイソトープ°もし
くは類似の追跡物質（感受性物質）を結はをぜ、１咳抗
体の存在牙瑛出でさるようＶｃシておき、こね全体内し
こｒＥ人してぞの結１−１」扇ｐＪｔケ１−出すること
ｅこより庫内の病果、病源体紮倹Ｊ１１シ、ｌ（す、体
内で、ｆｉ［１織の抽出液の中（′（存在する抗原金＋
すｓ出定１１ｔｌ、、　ｆｊすする方法で病気の診ｊ９
ｉ、予防ＶＣ利用することができる。このようなノｊ法
ＶＣより゛こ、同えは禎、智者の手術イ々の転移の様子
ケ七二ｉ−１，，ｆ（’、、す、癌の１−４期発’ｊｉ
、　ＩＩ（利用したり、或はまた崩の治ゆの桿１＋＋”
ｋ確認し〕こりすることができる。 まｆこ、組織培養されたヒト細１１説ｅ（一対して、本
発明に上り范することのできるヒト／ヒト単−抗昨かど
のような作用紮示すかを調べることＱ仁よつ一〇。 抗体の医療への応用に役立つ基礎知識、たとえば＃Ｉｌ
ｌ　ｌ泡の増シ１αや分化にあ・よぼす因子の解明、＋
１１ｔｌ　ｈａ構成成分の重性とｖ絹などのＴｉ１ｌ　
＠生物学的基礎知識の１管明にイｊ用で４うり、さらに
、酵素、蛋白□ＩＬ核目ツの精・↓・、２、牛体畠分子
の＋ｊ”Ｉ　１反とｔ攪ｆ屯の）１１１１斤、Ｉ）ＮＡ
、ＲＮＡの抽出などν、いｔｔ三（ヒ学’ｉｉＱ域Ｖこ
おいて刊Ｊ士ｒることもできる。 以下、実が（ｊＩ＋１Ｉｅ（より、本発明方法実施の数
列ヤさらに詳しく述べる。 実　　］崩　　１列　　１ 子宮頚部しこ（扁平−４ユ皮釉紮イ）つ）忠渚から、を
官本全体」７・よ（）・リン・ぐ節イ嫡出ｊ′−る十ａ
ｌｌの１祭に、癌組織およびリンノセ質゛１倉人１１シ
八一つ後−／１の９７７９節４−ハザミで細く切りきき
み、内部のリンノぐ球金培養液（ＩｄＰＭＩ−１６４ｏ
ｆ中しく分散させ、続いて２　ｆｉｒのガーゼ？ｊ１］
いてｐ過をイイい、脂肪層を除いた後１．／？ｌｐ液中
の細胞（リンノソ球ン８０チ）全遠心法ｅこよって、小
める〔ヒトＨ−Ｃｅｌｌドナーケ含むヒト９フフ９球分
両（ドナーＢ−セル）Ｌ−ｔ（７）？＆このリン・ぞ球
分画全ＩＯ％仔牛血清および１０％のグリセロール分含
むＲＰＡ（１−１６４ｏ培地中で凍結（−７０’Ｃ）ｔ
、、細胞融合全行う日壕で保存した。 ドナーリン・ぐ球と免疫グロブリン生産能を実質的に欠
「Ｒ１ノている親ヒトＢ−セル（ＵＣＴ２９−６）のそ
ｊしぞれ全ｔｘｉｏ’個および５Ｘ１０’個混合し、３
５％ポリエヂレングリコールの存在下ＩＣ１０％の仔牛
血清ケ含むＩｄＰＭＩ　−１６４０培」世中で融むゲ完
ｊ′させる。その後、８００　Ｇ、１０分間の俺心処理
紫行ってポリエチレングリコール奮除き、新たに１０多
仔牛血清♀ａ゛む／？　７’　Ａ４１−１６４０および
ヒポギサンヂン／−ｒミノグチリン／チミソン（Ｉｉ　
Ａ　ｉ’　）葡含む培地を・加える。この細胞群ケ含む
培養液２００μｔ（この中に−１、、５Ｘ　１０　’　
！ｌ”ｉｆのし’ａｌｌ　ｆ含む）　ッツｙ、＜ｙ　９
６個の穴ケもつミクロプ゛レートＶＣ５＋注Ｌ、約２岡
間３７′Ｇ、５％ＣＯ２インキュベータで培養Ｌ７ｉ。 この間、ＨＡ　Ｔ　ｒ、−含む１０％仔牛血清−ＲＰＭ
Ｉ−Ｌ６４０培地ケ３日Ｖｃ１回交替した。ｑＢ−セル
（ＵＯ３２９−６）　Ｆｉアミノグチリン台在で＆、ｉ
ヒ、Ｉ？キサンチンホスホリボシールトランスフェラー
ゼｒ欠損しているに、め、生きることが出来ない。１／
（、リン・９球（Ａ　）　ｒ：ｊ通常の培地たとえばＩ
Ｉ！Ｐ　／ｌグＩ−１６４０４−１０％仔子牛血清中は
永４・左曲に増殖し生きのびることができない。よって
、ＩＩＡＴ′ｆｊ：３゛む培地で永続的建増殖し／こに
ＩＨ胞釘１リン／ぐ球（，４）とＢ−Ｃｅｌｌ　　（Ｂ
）の融合した細胞である。２個間培養の後、９６個のミ
クログレート６個にハイブリドーマのクローンが見られ
た。この６個のハイブリドーマのうち２個のハイブリド
ーマ（そｔｔぞれ、ＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ５及びＣＬＮ
／ＳＵＺ　Ｈりと称す）がヒト免疫グロブリン（〃ｕ、
Ｉｖ）ｋ産生していることケ固定化うソオイムノアッセ
イおよび固定化酵素抗体法を用いて確めた。以下その方
法を説明する。 ガラスフィルターの上に、ハイブリドーマの培養液ケ？
１所下（５０ｕｌ）ｌ、、乾燥することにＪ、りて、培
養液中の蛋白預金固定化する。その後、＋０　Ｊ結合抗
ヒト免疫グロブリン血清（ラグオイムノアツセイ法）あ
るいｉ、ｌニー＜ルオキシダーゼ結合４ノｔヒト免ｊケ
グロブリン面端ケ１両ト（５０ｗｌンし−Ｃ（＋酵素抗
体法）、唱償ｌ仮中しし七）、イ）べさヒトＩＱと結行
さぜるっ室ｔｌＡで３０分間反応１−・４、生理９１嘉
水でよく、元ったＧソ、ラソオイムノγツセイの」ｔ）
台はグラスフィルターの上に残９／ζ１２５１の枚射叱
奮γ−カウンターでボはすることＶ（よって、ハイブリ
ドーマ；汀僕液中に代４）しるヒトＩｇの１ｉ台−Ｊｆ
ｌる。一方、酵素抗体法の褐片Ｃ７↓、さらに過嘴イじ
水素とＯ−フェニレンジアミン棒金む基質ｌ′ｉ′４液
ケ力１１え、暗′室で３０分間反応させる。も１〜グラ
スフイルターの上Ｖこベルオギシダ−ゼ結合抗ピトＩｑ
血清が残っている噛合、ずｌわちグラスフィルターの上
でヒトＩσ、抗ヒトＩｇ血清が反応し／こ揚台には１吸
）’ｔｌＬ４９０ｎηｌで１屯川さＩする黄色の基ｍ反
応物が生産される。この１ｄケ吸ｌｉｔ計ゲ用いること
Ｖこよって測定し、・・イブリドーマ培＃液中ＶＣ含れ
るヒトＩｇのＷ、　ｋ　’ｉ、’ｌ］る。ハイブリドー
マ培養液中にヒトＩｇが存Ｚ’ＥＬ、ないＰ；Ａ台にに
ｊ、抗ヒトＩｇ血清は洸・滌の段階でグラスフィルター
’ｃ　１ｆｅ、　Ｌ　’Ｃ（ｋい流される。 以上の測定方法音用いた結果、ＣＬＮ／５ＵＺＨ５はヒ
ト１ｇＡ４１７生産し１．おり、ＣＬＮ／ＳＵＺ＃１１
はヒトＩ　ＯＧ７．（生産していることが分った（ドナ
ーＢ−、−＋ルと１ぽ１形竹のＩｖ）。２週間両ＶＣ３
ＣＬＮ／５（ＩＺ　ｌｉ５及び（：ＬＮ／、’；ＵＺ／
１１１のイーれぞれ倉２４イ固の穴を−もつミクログレ
ート（２−／穴）に植えかえた後さらにト１引Ｈ１培か
を続＆フた。（湖合後３週間目に、培養液のと清孕採取
、（１１ｉｈの株化細胞？標的細胞としてヒト／・・イ
ブリドーマから生産されるＩｇの特異性ｆ　ｌＶ４べた
（一定の形′−１孕もつ１９寸たけ！１ヶ市の形′目ケ
もつＩｇ）。 −１の方法を以下税、明する。 人間の撞々の株化培養細胞（これらはＡ　１’　ＣＣよ
り入手可能）ゲＤＭＥ：Ｆ“−１２＝に１の合成培地Ｋ
ｔｏ％仔牛血（Ｍヶ加えた培地で培養する。 細胞の級が５Ｘ１０’　〜ｌＸ１０’１７こなった段階
で、トリグンンク二用いずＶＣ屏ＩＪ１１ペケンヤーレ
の）条面から剥がし、底部Ｑ（、ガラスフィルターケも
つ９６穴のミクロタイターグレー　トを用いて一定数（
約５Ｘ１０’）ｉグラスフィルレターの一トＣ（載せ、
乾燥Ｉ７て、細胞ケグラスフィルターの上ｐｔＨ１１？
ｌ定化する。ぞの後、ＣＬＮ／ＳＵＺ　ＨｓおよびＣＬ
Ｎ／ＳＵＺ　ｌｉ　Ｉ　１のそれぞれについて、培養土
ｒ’＋’ｔ　（５゜ｕｌ）ケ細ｊ處の上ｐｃ　ン１冷下
し、室１品で反応させた優、１２′Ｉ−結合ヒト１ｇ血
７ｆｔ　＊　４：ｖるいｖｆペルオキシダーゼ結合ヒト
Ｉｇ血Ｉｆｆケ滴トし、て室温で反−いせる。光分しＣ
洸滌金訃こなった後、先述のラジオイムノアッセイ法お
よび酵素抗体法で祁べた方法によって細胞ＶＣ結付した
培ａ液中のヒト１リν月ｉ（音測定する。 以下の方法によってＣＬＮ／５ＵＺｌｉｓのＩｇＭの標
的Ｉｌ′Ｉ’ｄ　ｕ、　％異１′１′、１．−よｔ、ｊ
−ＣＬＮ／　Ｓ　ｔ７　Ｚ　Ｉｌ　１１のＩｇＧの標的
両＋ｉ１１胞特異性忙攬れぞれ６１．１ぺた結果、ＣＬ
Ｎ／ＳＵＺ　Ｈｓの」音誓計中のＩｇ）ＩＪ、およびＣ
ＬＮ　／　５ＩＩＺ　ｌ−１１１の培養液中のＩｇＧ目
、いずれも子宮頚部癌由来の株化細胞１１ｅｌσおよび
Ｃａ５ｋＶ（一対して結合力をイｊしており、本発明者
の険討によれば子は頚部癌以外の株化細胞Ａ、　４　ａ
　１（肺゛ｊ酌）、リンパ性帥瘍およびＷｌ・３８（正
常ヒト線維芽州Ｊｌ１ｍ）等とは結合力全イ】してぃな
かった。 −ｒなわち、ドナーＢ−セルは、１４に内に子宮頚部尚
孕もつ患者から採取されたものでａ５るので、細胞融合
法によって作り出された自己増殖性分もつハイブリドー
マのクローンがうｉｔ　、ドナーＢ−セルと同形質のか
つ特足の抗原決定部位ケもつモノクローナル（単一）抗
体全生産していることケ示し、ている。一般に、痛紮も
っ患者の体内で癌組織し１、抗りルとして１φＩＪき、
回想にの免Ｊｔ　’ｉ！：＝ず伯ぶ、宿Ｆｊよって、ｊ
ｔＶｉ特異的抗ｌ−ド会・生ν（Ｓしうる能力かりるこ
と４・しめしている。 同、轍−賃より、採取し／こ局組、誠ケ培養に怪し／Ｃ
■１ハζ１ヶ標的細胞として１１］いて、ＣＬＮ／ＳＵ
Ｚ　ＩＩ　５及びＣＬＮ／ＳＵＺ　＃１１のｔ持異＋′
１．牙ヒ記と同１虫の方法で調べた結４↓、結合力を有
し、ていることが分つ女−０ 約３　ｊｉ、ｉ１曲後しく−、ハイブリドーマの培地か
ら１ＪＡＴを除き１ｌＰＡｌｌ−Ｌ６４０＋ＬＯ％仔牛
血清で培養１倍力（１時間３７時間でＣＬＮ／５ＵＺ１
１　５　ｆｉ　　２．　４　　ｔｔ　　Ｙ　のＩｇＭ（
ｌｌｕＭｏ　　Ｉ　　ｇＡｉ　　）　　／　　１　０’
セル／ゴ／ｄａｙのｌでヒトＩ　１ｇ、ルｆｉ生産し続
けてオリ、ＣＬＮ／ＳＵＺ　　＃ｔ　１ｉｒ、１２．６
　μ？０）Ｉ　（７（Ｊ−（１１ｕＡｆｏ　Ｉ　ｇＧ　
）　／　１０’　セル／ｍ１．／　ｄａｙＯ団でヒトＩ
ＱＧ介・牛Ｉａｐし続けている。 ハイグリドーマの多ｋＨ培養液ケ５０％のＩＩ！ｌ　１
ｍ安−ｒンモニウムで沈殿させ、ｊ′１１ｇ分画を集め
た。得（−）れた沈殿を生理食亀７ｋにｆｒ；かし、Ｉ
ＯＧはヒツジの４）“［５ヒトＩｇＧ而７Ｈ中のＩｇＧ
ケ用い、ＩｇＭはヒツジの抗ヒトＩｇＭ血清中のＩＱＧ
ゲ結合させたセファロ−スケ用いてアフィニイティクロ
マトグラフイーの手法で精製さｔ）だ。収率はＣＬＮ／
　Ｓ　Ｕ　Ｚ　Ｈ５ｔ７）　培’Ｎ液１ｔか６２２ｍ２
のＩＱＭ。 ＣＬＮ／ＳＵＺ　ｌ１１１　（Ｄ培養液ｌｔ力）ら３．
０＋１１ｉｉ’＋７）ＩｇＧが１！すられ／こ。これら
のアフィニイディクロマトグラフィケ用いて精製した、
Ｉａｊｉ＠品をＳＩ）　Ｓ−電気泳１！ＩｊＪ法で分析
した結呆、ヒトＩｇと同形’＋’ｒの分子晴１５万のＩ
　ｇＧ　Ｉ　ＣＬＮ／ＳＵＺ！ｉ　５　）　ｂ−よび分
子１１１８万（単量体）のＩｇＡｆ（ＣＬＮ／ＳＵＺ　
／／　ｌｔ　）を生産していることが確めらｈた。葦だ
、両ヒトハイブリドーマｔま、Ｎｕｄｅ　　ｍ、ｏｕｓ
ｅの物腔内で増殖させることがｉｉＪ能であり、腹水５
ｍｌ中Ｖこ；３〜１ｏｍｙのヒトＩＱゲ生戸ｆミさせる
ことかでｔｊる。 実姉′向２ 子宮頚部ｖ【二上皮性腺尚ケもつ患者から、手術の際に
リンパ節を一人・に、実姉ＩＪＩＩ　ｌでハＪいた方法
と同様の方法でリンパ球ケ調ｌし／仁。本実ｈｉｌｉ　
Ｉ’ｌｌでに：Ｌ　ｌ）ン・ぞ球を凍結保存することな
しＶ（ＩＩ！Ｐ　Ｍ　Ｉ　−１６４０＋１０％仔牛血／
に中で１日培養した侍、親Ｂ−セル（ＵＣ７２９−６＞
紮用いて、夷メ１ｉｔｉ汐１１１と同様の方法で＋１（
ｌｌ　ＩＩＩ！’、融↑−１４・行′）だ。イの結果、
９６穴のりＩ−）１６個にハイブリドーマのり１７−ン
が認められ、うジオイムノアッセイを用いる検出方法Ｖ
よテ−りて１６個のうち５個がヒト１ｇＭ−ｑ生＃：：
してお゛す、１６１１ノ１１のうち２個がヒト１ｇＧｒ
生産していることが（、’（ｔ：　ａ７′）らノ）、た
。 実　　ツバ（１８シ１１　３ 子ざ頚部Ｐ（：　ｌ桶平上皮癌イ・もつ患者からヘパリ
ン台在下末梢血（５０ｍ／りケ採１１ソし、フイコール
レ（よ一つ′Ｃ未梢血中のリン／Ｆ球を・分離し、実／
４ｊけ１１１で述べたノｊＶノミによって、イｑｔｌ　
ｌ１ｉｉ　ｆＡ’ｌ！ｆ千日斗で凍糸吉１呆イｆ介・イ
ーｒつ／こ。　　ｍｌｔ　ｆｒ　　日　Ｖ（−、＋Ａｉ
！　＋１イｆ　し　て　ノ？Ｐ　　１１４１　−　１　
　６　４　０でドナーＢ−セルを・２回続′て）だ仔、
”Ｊ（ｈｆｌｉｔな１１１と同村での方法でイ叱１謂ｒ
、ｔ＋ｌ　ｆｆ１４・Ｔ−１）／チー。マの結果９６昭
のミクロタイター／ル−　トＬ７）うち４１固（）（：
ハイブリドーマのクローンが４Ｆ、出され、４個のうち
１イ１＾１（〆（−ヒト１σＡ４の牛Ｊ）ｖが検出さｒ
ｌた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　ｆｉｌ　　免疫グロブリン生顔能含イｊするヒ
   トＢ−セル（Ａ）′にてＧ　’ｆｉするヒトボ１旧ｌ：
   ！１群と、（２）　　（イ）適当な培地中で自己１曽殖
   性を・有し２、（ロ）　特定の試薬の存在−ト又ｉ−１
   ％定の成分の不存任−トでｌ’＋Ｃ＋Ｉ、１α停市又は
   死（威する感受性ケ↑ｆシフ、且つ （ハ）　免疫グロブリン生産能イ実（−１的に欠損して
   いる ヒトＢ−セル（Ｂ）２訝１１するヒト細）３．４群とを
   、 （３）人間の体外で融合してヒトＢ−セル（，４）とヒ
   トＢ−セル（／ｊ’）との融で１細胞牙産生し、得１っ
   れる融合細胞を、上４二；（１）のヒト細胞１群及び−
   に記（２）のヒト細胞群は増殖停市又は死滅するが該融
   合細胞Ｑま増殖し得る培地中で培養して融合細胞クロー
   ン全取得し、 （４）　　このｊ触合細胞クローンから前記Ｂ−セル（
   Ａ）と同形ノＥの免疫グロブリン含有物質又は免疫グロ
   プリンケ採取する こと’ｃ　Ｗ　Ｃ＆とするヒト免疫グロブリンの生産方
   法。 ２　該ヒトＢ−セル（Ａ）ｔユ、抗原によって感＆　該
   ヒトＢ−セル（，４）は、病原性抗原によって感作され
   たヒドリン・ぐ節、１壬トリン・（腺、ヒト骨腫又はヒ
   ト）拌１減に奮発されているＢ−セルである特許請求の
   範１２旧］）１項記載の方法。 ４　該ヒトＢ−セル（Ａ）は、病原性抗原によって感作
   されたヒト血液中のリン・９球の８−＋ルである特許請
   求のｌｌ１ｌχｌ１ｌχ囲第１）叔の方法。 ５．　該ヒトＢ−セルｆ　Ａ　）　ｔ；↓、非病原性抗
   原Ｖ〔＝よって感作されたヒドリン・ぞ節、ヒトリンパ
   節腺、ヒト朋１臓、ヒト・冴１ｊ后又ｅまヒト血液中の
   Ｂ−セルである特許、清水のｉｌｒ＞、囲第１項記載の
   方法。 ６、　該ヒトＢ−セル（，４）ｉ、ｉ、バクテリヤ、菌
   類、カビ類、ビーノ【、ス、寄生虫、自己抗原ノρびガ
   ン細胞から成る群から顆ばＪしる少くとも１伸の病原ゼ
   １抗原にＪ：、９てＷ作されたヒトリンパ節、ヒトリン
   ノぐ腺、ヒトＩＰ！！　ＩＩ藏、ヒト骨胚父はヒト面前
   中のリン・ぞ球のＢ−セルである特許請求の佃）ｌｊｌ
   ｌ第１伯ｄＣ載の方法。 ７、該ヒトＢ−セル（Ａ）目、酵素、７１？リベグチド
   、蛋白質、糖脂′凡、多糖類、核酸、ハゲテン又は変性
   ハゲテン−７１＆作又は−結合抗原ｔＩｆ：物′ＬＡ及
   び細胞膜抗原性物質から成る群から選ばれる少くと１３
   １種の非病原性抗原ｅこよつ′Ｃ感作さｉしたヒドリン
   ・ぐ節、ヒドリン・ぐ腺、ヒト１１″ｌｊ　Ｉｉ先　　
   ヒト骨１１１ｎ又Ｑ」ヒ）　ＪｒＩｌ液中のリン・ぞ球
   のＢ−セル［でＡｊ、る特許請求の範囲第１　’１４　
   ｉｉｉ、４載の方法。 ｇ、該ヒトＢ−セル（Ａ　ｌ　＆、１、ヒトリンノぞ球
   のＢ−セル飢　ヒト体外で、増殖外因ｆによって増殖及
   （少／又（・ユ抗原性物實で１・・Ｎ作することＶ（よ
   り免疫グロブリン生産Ｉ止が増強さＪｌ−たヒトＢ−−
   一−ヒルで必る特π１−請求Ｇり・ｔｉ＋ｊ囲、、’ｊ
   ％　ｌ項記載の方法。 ９、　該ヒトＢ−セル（Ｂ　）　ｋＪ：、ヒトリンノぞ
   節、ヒトリフ　Ａｊ　腺、ヒ）　１ｆｆｊ＋ｉｔｆ、？
   　ｌ−刊・１ｌｉｉ′７１−１　ヒ）　−１’＋４中の
   リンパ球から採取し、又Ｑ、［これケヒト体外で増殖し
   ブこものから選択したものでめる特許請求の範囲第１　
   Ｉｎ記載の方法。 １０、　　酸ヒトＢ−セルｌ）をま、 （イ）　適当な培地中で増殖の倍加時間（ダブリング・
   タイム）が４８時間以内、好−ｆ　Ｌ、　＜け２０時間
   以内の自己増殖性に：イイし７、（ロ）　　’１１’ｊ
   ポの試薬の任在下で又ｖ１臂定のノ戎分の不存在下で増
   殖停止又Ｃ」、死滅する実′ｉツ的に非１り辿的な感受
   性に’ＯＬ、且つ （ハ）　免疫グロブリン生産【′ｊヒ？実質的ＶＣ欠損
   している ヒトＢ−セルで、Ｆ）るｌｌ−１Ｋ′「請求Ｃ壇１ｉ１
   ｊ、囲亀１１Ｍ　＊ｉｉコ載の方法。 １１、　　該ヒトＢ−セル（ｌｌ）ｔ、ｊｌ】ＩＶ′１
   当な培地及び培養条件下で単一、ｆｉｌ旧１へ（ンング
   ル十ル）トシテ、増殖可能なものであるＱ、ｒ豹：、請
   求の叩間第１項記載の方法。 １ｚ　ヒトＢ−セル（，４）とヒトＢ−セル（Ｂ）とヲ
   、仙台ビールス或Ｉ／、Ｊポリ、Ｉ−ヂレングリコール
   の存（ｆ−Ｆで１■ｌｌ１合して、ヒトＢ−セル（Ａ）
   とヒトＢ−セル（Ｂ）との融合細胞（）・イブリ　ドー
   マ）を陀狙する特許請求のｉｉｉ＋）間第１墳記載の方
   法。 １３、　　ヒトＢ−−ヒル（，４）とヒトＢ−セルＣＢ
   ）ト’ｆｆｉ、仙９ビールス或はポリエチレングリコー
   ル及び血清の存在下で融合してヒ）Ｂ−セル（Ａ）とヒ
   ト１ｌ−−−ヒル（Ｂ）との［埼虫ａ九（１１月視紮ハ
   婬嵐する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４、ｆｌｌ　　腫゛瘍を含む病原性抗原特異的免疫グ
   ロブリン生産能葡儒するヒトＢ−セル（Ａ）１月１する
   ヒト細胞群と、 （２）（イ）適当な培地中で自己増殖＋’ｔ　ＩＫ有し
   、 （ロ）特定の試薬の存在下又は特定の 成分の不存在下で増殖停止又Ｃま死滅する感受性を有し
   、且つ （ハ）免疫グロブリン生産能？実質的 に欠損している ヒトＢ−セル（Ｂ）ｋ、含有するヒト細胞群を、 （３）　　人間の体外で融合してヒトＢ−セル（，４）
   とヒト１ノーセルｔＢ＞との融Ｒ廁ＩＪ胞含ノη−ソ［
   シ、１瞳られるＦＭＩＩＩ台尉１：Ｉ　１１己会二、］
   二す己（１）のヒト翁Ｉｌｌ抱群及び上記］２）のヒト
   細ルス群汀増幼停止Ｆ父は死滅するが該１触合削胞は増
   り１αし得る培地中で培養して融介卸ｊ胞りローンケＩ
   ｔ’ｊ１４ナシ、 【４）　　この＃、ＩＩ！　ｓ　ｕｎ　ｓｓ、りＤ　−
   ７かｒ　１）ｉＪ　ｔｔａ　Ｂ−セルＦＡ、ｌと同形質
   の免役グロブリン含有物質又ｔ、Ｊ′免疫グロブリンを
   採収すること全特徴とする病原性抗原特昇的ヒト免疫グ
   ロブリン汗有物′ｎ又ｒＪ該ヒト免投グロブリンの生産
   力法。 １５、　　（Ｊ）　　１ｐ１！磨ケ會む病原性抗原性異
   的免疫グロブリン生産能紮有するヒ）Ｂ−セル（Ａ）を
   汁有１゛るヒト細胞／ＩＩ’と、 （２）（イ）適当な培地中で自己増りｉ［性イイ１し、 （１−１）　　＋ｉテ定の試薬の存在下又は勤゛足のノ
   攻分の不イ１任下で増殖停止又（ｄ死滅する感受性を有
   し、月つ （ハ）　免疫グロフ゛リン生産能全実情的に欠損してい
   る ヒト／）−セル（Ｂ　）を含自するヒ日（ｏ胞群全、 （３）　　人間の体外で融合してと）Ｂ−セル（，４）
   とヒトＢ−セル（Ｂ　）七の融合に（１１胞を１）！・
   生（２、イ与られる１ゴ゛１虫介イ］（１胞乞゛、」二
   Ｉ己ｉ１１のヒト細胞Ｌｆ及び上ｔピ１２）のヒト卸ノ
   胞群は増頌停止又Ｖま死滅するが該融合細胞は増＋１１
   　Ｌ　？ｉ＃る培地中で培ｊｔシて融合；ｒ’、ＩＩＩ
   胞クローンを二取イ″峯　し、 ＋４１　　、、乞漕台細胞クローン又はその培養液から
   、前記病原性抗原が分野できる場合しこはその病原性抗
   九支と反応する前１４１ｆｆｉヒトＢ−セル（Ａ）と同
   形質のヒト免疫グロブリンケ探し出し、１だ前記病原性
   抗原が分離できない場合にＶ′Ｊ、その病原性抗原組織
   ケ免役忙Ｐ′１勿′肖生産目１シケイｎ（，７ｘい勺Ｕ
   イ（しこ１１［１えつけ、該組織ゲ（（Ｉ持し／こイ々
   、その組織に対し−Ｃ或は培養系にもどされたｘｉｌ域
   に対して反応する前記ヒトＢ−セル（Ａ、　）と同形質
   のヒト免疫グロブリンケ陳し出し１．Ｍ亥ヒト免疫グロ
   ブリン全１７１÷取する前記’Ｉ”Ｊ’　ｒ’ｆ　１ｉ
   １〜求のφ１）、間第１４珀記載の病原性抗原１）鴇的
   ヒト単−免投グロブリンの生産力法。 １Ｇ、　　前記ヒ）　Ｂ−セル（Ａ　）　Ｉｔ、Ｌ、’
   Ｉ＊　ＩＧｊ　思８、殊に尚患者のリン・ぐ市、リン・
   ξ腺、Ｉｌ’ｌ’　１区、骨肺父は血液から採取された
   病原性わＬ原１１１異的免疫グロブリン生産能を・有す
   るヒ１．　Ｂ−セルで、（）る特７Ｉ−請求の仲、間第
   １４珀又は第１５珀記載の方法。