JPS6287090A - 培養株化細胞株 - Google Patents
培養株化細胞株Info
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- JPS6287090A JPS6287090A JP60227709A JP22770985A JPS6287090A JP S6287090 A JPS6287090 A JP S6287090A JP 60227709 A JP60227709 A JP 60227709A JP 22770985 A JP22770985 A JP 22770985A JP S6287090 A JPS6287090 A JP S6287090A
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- JP
- Japan
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- cell
- cells
- culture
- antibody
- mrl
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はヒトおよび動物のリウマチ、自己免疫疾患、免
疫不全症、各種感染症、がん等の診断および治療に用い
る抗体（さらにまたはそれのイディオタイプ抗体を産生
させる抗原としても有用な抗体）を産生ずる細胞に作用
しその分化に関与する因子を産生ずる新規に樹立した株
化細胞株に関する。更に本細胞は自己免疫疾患、免疫不
全症等の発症あるいは発がん等のメカニズムの解析にも
きわめて有用な手段を提供するものであり、本発明はこ
の新規に樹立された細胞株に関する。
疫不全症、各種感染症、がん等の診断および治療に用い
る抗体（さらにまたはそれのイディオタイプ抗体を産生
させる抗原としても有用な抗体）を産生ずる細胞に作用
しその分化に関与する因子を産生ずる新規に樹立した株
化細胞株に関する。更に本細胞は自己免疫疾患、免疫不
全症等の発症あるいは発がん等のメカニズムの解析にも
きわめて有用な手段を提供するものであり、本発明はこ
の新規に樹立された細胞株に関する。
従来の技術
自己免疫疾患等の病態、病因を明らかにし、その治療・
診断に役立てるため、また免疫反応のメカニズムの解析
のため自己免疫病マウス（ループスマウス、たとえばＮ
ＺＢマウス、ＮＺＢ／Ｗ Ｆｌマウス、ＭＲＬ／ＭＰ−
１ｐｒ／Ｉｐｒ （ＭＲＬ／ｌマウス、ＭＰＬ／Ｍｐ−
＋／＋ （ＭＲＬ／ｎ）マウス、ＢＸＳＢマウスなどが
知られている）などの自己免疫疾患動物の研究がさかん
に行われている。ＭＲＬ／ ＃マウスは１０週令頃から
著明なリンパ節腫脹をきたし、抗ＤＮＡ抗体を中心とす
る自己抗体の異常産生が見られ、高頻度にループス腎炎
を発症する。
診断に役立てるため、また免疫反応のメカニズムの解析
のため自己免疫病マウス（ループスマウス、たとえばＮ
ＺＢマウス、ＮＺＢ／Ｗ Ｆｌマウス、ＭＲＬ／ＭＰ−
１ｐｒ／Ｉｐｒ （ＭＲＬ／ｌマウス、ＭＰＬ／Ｍｐ−
＋／＋ （ＭＲＬ／ｎ）マウス、ＢＸＳＢマウスなどが
知られている）などの自己免疫疾患動物の研究がさかん
に行われている。ＭＲＬ／ ＃マウスは１０週令頃から
著明なリンパ節腫脹をきたし、抗ＤＮＡ抗体を中心とす
る自己抗体の異常産生が見られ、高頻度にループス腎炎
を発症する。
抗体産生の機構において、活性化され分裂増殖したＢ細
胞が抗体産生細胞へと分化する過程で、Ｔ細胞からの分
化誘導作用のある可溶性因子が関与することが明らかに
されており （Ｄｕｔｔｏｎ、 Ｒ，Ｗ。
胞が抗体産生細胞へと分化する過程で、Ｔ細胞からの分
化誘導作用のある可溶性因子が関与することが明らかに
されており （Ｄｕｔｔｏｎ、 Ｒ，Ｗ。
ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｇ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１＋
３５５＋ １９７Ｌ Ｓｃｈｉｍｐｌ。
３５５＋ １９７Ｌ Ｓｃｈｉｍｐｌ。
八、＆Ｗｅｃｋｅｒ、 Ｅ、、 Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ、＋ ２３７． １５＋１９７
２など）、このような作用因子はＴリンパ球代替因子（
Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、
ＴＲＦ）と称されている。ＴＲＦは主要組織適合抗原の
異なるリンパ球間で混合培養（ＭＬＲ）を行うか、コン
カナバリンＡ（ＣｏｎＡ）などのマイトゲンないしは不
特定の抗原でＴ細胞を刺激することによって産生される
。
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ、＋ ２３７． １５＋１９７
２など）、このような作用因子はＴリンパ球代替因子（
Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、
ＴＲＦ）と称されている。ＴＲＦは主要組織適合抗原の
異なるリンパ球間で混合培養（ＭＬＲ）を行うか、コン
カナバリンＡ（ＣｏｎＡ）などのマイトゲンないしは不
特定の抗原でＴ細胞を刺激することによって産生される
。
このＴＲＦはＢ細胞に作用するが、Ｂ細胞の分裂増殖は
誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液
性因子であると定義されＢ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ （ＢＣＤＦ）とも
言われている。
誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液
性因子であると定義されＢ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ （ＢＣＤＦ）とも
言われている。
ＢＣＤＦはＴ細胞ハイプリドーマ上清から精製されてい
る（Ｔａｋａｔｓｕ、 Ｋ、 ｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、＋ １３４＋３８２、１９８５）。またヒ
トＢＣＤＦはヒトＢ細胞由来細胞より生産されている（
特開昭６Ｏ−１６９４２４）。他方マイトゲンや抗原刺
激なしで、あるい＆訃ＬＲを行わずに産生される分化因
子としては、ヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の
動物モデルとされているＭＲＬ／ ＮマウスのＴ細胞由
来のものが報告されている（Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ、
Ｇ、Ｊ、 ｅｔ ａｔ、 Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、長Ｌ
７３０、１９８３）。
る（Ｔａｋａｔｓｕ、 Ｋ、 ｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、＋ １３４＋３８２、１９８５）。またヒ
トＢＣＤＦはヒトＢ細胞由来細胞より生産されている（
特開昭６Ｏ−１６９４２４）。他方マイトゲンや抗原刺
激なしで、あるい＆訃ＬＲを行わずに産生される分化因
子としては、ヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の
動物モデルとされているＭＲＬ／ ＮマウスのＴ細胞由
来のものが報告されている（Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ、
Ｇ、Ｊ、 ｅｔ ａｔ、 Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、長Ｌ
７３０、１９８３）。
発明が解決しようとする問題点
ＴＲＦないしＢＣＤＦの応用としては、前記特開昭６０
−１６９４２４の頁（２）にも開示されているように抗
ＢＣＤＦ抗体と組み合わせることによるＢＣＤＦのイム
ノアッセイ系を用いての病態の解析がある。またＴ細胞
のヘルパー機能低下に伴ってＢ細胞の抗体産生能の低下
した免疫不全症患者に投与することによる治療がある。
−１６９４２４の頁（２）にも開示されているように抗
ＢＣＤＦ抗体と組み合わせることによるＢＣＤＦのイム
ノアッセイ系を用いての病態の解析がある。またＴ細胞
のヘルパー機能低下に伴ってＢ細胞の抗体産生能の低下
した免疫不全症患者に投与することによる治療がある。
またｉｎ ｖｉｔｒｏで、モノクローン化したＢ細胞を
培養し、ＢＣＤＦを作用させることにより有用なモノク
ローナル抗体を産生せしめ、種々の疾患の治療・診断が
可能となる。
培養し、ＢＣＤＦを作用させることにより有用なモノク
ローナル抗体を産生せしめ、種々の疾患の治療・診断が
可能となる。
このように有用と考えられるＴＲＦないしはＢＣＤＦを
量的に確保しその特徴づけを充分に行うことと半永久的
に確実にそれを工業生産することが産業上必須であるが
、これまで報告されたＢＣＤＦを産生ずる細胞株は一般
に、安定にコンスタントにＢＣＤＦを産生することがで
きないのが実状である。たとえば、ＭＲＬ／ ／マウス
からＴＲＦを産生するＴ細胞株が今までの技術では未だ
樹立されていないため、このＴＲＦの精製・同定・特徴
づけは充分に行われていなかったし、工業的生産はなさ
れていない。
量的に確保しその特徴づけを充分に行うことと半永久的
に確実にそれを工業生産することが産業上必須であるが
、これまで報告されたＢＣＤＦを産生ずる細胞株は一般
に、安定にコンスタントにＢＣＤＦを産生することがで
きないのが実状である。たとえば、ＭＲＬ／ ／マウス
からＴＲＦを産生するＴ細胞株が今までの技術では未だ
樹立されていないため、このＴＲＦの精製・同定・特徴
づけは充分に行われていなかったし、工業的生産はなさ
れていない。
それ故このＴＲＦないしＢＣＤＦを産生ずる安定な、長
期継代培養可能な細胞株を樹立することが急務である。
期継代培養可能な細胞株を樹立することが急務である。
問題点を解決するための手段
本発明者は、自己免疫疾患動物は自己抗原に対する抗体
を選択的に異常に産生ずる動物であり、この動物の疾患
の病態を解析すれば、自己抗体の異常産生のメカニズム
、自己免疫疾患発症の機序も明らかにでき、自己免疫疾
患あるいはがんなどの疾患の治療に有用な方策が考案で
きると考えた。
を選択的に異常に産生ずる動物であり、この動物の疾患
の病態を解析すれば、自己抗体の異常産生のメカニズム
、自己免疫疾患発症の機序も明らかにでき、自己免疫疾
患あるいはがんなどの疾患の治療に有用な方策が考案で
きると考えた。
即ち本発明者は、ＭＲＬ／ ｌマウスのリンパ節腫脹が
が主にＴｈｙｔ” 、 Ｌｙｔｌ” Ｔ細胞の異常増殖
に基づくことから、これらリンパ節Ｔｆ−ｉ１１胞は自
己抗体産生に促進的に作用するなんらかの因子を産生じ
ているものと考え、まず自己免疫疾患動物の代表として
、ＭＲＬ／βマウスのリンパ節細胞の長期培養株を樹立
することを試みた。
が主にＴｈｙｔ” 、 Ｌｙｔｌ” Ｔ細胞の異常増殖
に基づくことから、これらリンパ節Ｔｆ−ｉ１１胞は自
己抗体産生に促進的に作用するなんらかの因子を産生じ
ているものと考え、まず自己免疫疾患動物の代表として
、ＭＲＬ／βマウスのリンパ節細胞の長期培養株を樹立
することを試みた。
そして培養開始後８ケ月で、自己増殖能を有するように
なる株化ＫＭＬＩ細胞株の樹立に成功した。
なる株化ＫＭＬＩ細胞株の樹立に成功した。
人工的なハイブリドーマを作成するのではなく、自己増
殖能を有する細胞株を、ＭＲＬ／ １リンパ節細胞を長
期間培養することにより樹立したこと、また零ＫＭＬＩ
細胞株がｎｕｌｌ ｃｅｌｌであることが判明した事実
は画期的なことであり、これまで文献未知のことである
。更に本株化細胞の培養上清あるいは本細胞自身の、Ｍ
ＲＬ／βマウス牌細胞のｉｎ ｖｉｔｒ。
殖能を有する細胞株を、ＭＲＬ／ １リンパ節細胞を長
期間培養することにより樹立したこと、また零ＫＭＬＩ
細胞株がｎｕｌｌ ｃｅｌｌであることが判明した事実
は画期的なことであり、これまで文献未知のことである
。更に本株化細胞の培養上清あるいは本細胞自身の、Ｍ
ＲＬ／βマウス牌細胞のｉｎ ｖｉｔｒ。
抗ＤＮＡ抗体産生に及ぼす効果を調べたところ、抗ＤＮ
Ａ抗体産生が３〜５倍増強されることが認められ、本Ｋ
ＭＬＩ細胞が抗体産生細胞の分化に関与する因子（ＴＲ
ＦないしＢＣＤＦ）を産生じていることが示唆され、本
発明の目標に到達した。またこの因子はＢ細胞のＤＮＡ
合成は促進させずＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）ではない
ことが確認された。本発明者は、本発明の一つの目的で
ある、長期継代培養可能なまた凍結保存後融解し、培養
を再開しても継代培養可能な安定な細胞株の取得を、自
己増殖能を有するＫＭＬＩ細胞の樹立により達成し、本
発明を完成した。
Ａ抗体産生が３〜５倍増強されることが認められ、本Ｋ
ＭＬＩ細胞が抗体産生細胞の分化に関与する因子（ＴＲ
ＦないしＢＣＤＦ）を産生じていることが示唆され、本
発明の目標に到達した。またこの因子はＢ細胞のＤＮＡ
合成は促進させずＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）ではない
ことが確認された。本発明者は、本発明の一つの目的で
ある、長期継代培養可能なまた凍結保存後融解し、培養
を再開しても継代培養可能な安定な細胞株の取得を、自
己増殖能を有するＫＭＬＩ細胞の樹立により達成し、本
発明を完成した。
本発明を以下、更に詳しく説明する。
本発明者は、ＭＲＬ／ Ｎマウスのリンパ節細胞の長期
培養により、株化細胞を樹立すべく、２０週令の雌マウ
スの腸間膜リンパ節のｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ５ｕｓ
ｐｅｎｓｉｏｎの細胞浮遊液を調製した。リンパ節細胞
としては腸間膜リンパ節のほかがっ下リンパ節、腋下リ
ンパ節、そけい部リンパ節等から採取したものも使用で
きる。培養液としてはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を本
発明者は主として用いたが、使用できる培養液としては
ＲＰＭ１１６４０培地、ＭＥＭなどがある。これらの培
養液に、５６℃で３０分非働化した牛胎児血清（ＦＣＳ
、 Ｇｉｂｃｏ社製）を１〜２０χ、好ましくは５％加
える。他の添加物として抗生物質がある。ペニシリンＧ
は培養液１ｍｌあたり約１０〜２５０単位、好ましくは
約１００単位、ストレプトマイシンも１ｍｌあたり約１
０〜２５０μｇ、好ましくは約１００μｇ添加する。更
に５０μ門の２−メルカプトエタノール、１０闘のヘペ
ス緩衝液、１．−グルタミン０．５〜１０ｍＭ、好まし
くは２ｍＭを添加する。
培養により、株化細胞を樹立すべく、２０週令の雌マウ
スの腸間膜リンパ節のｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ５ｕｓ
ｐｅｎｓｉｏｎの細胞浮遊液を調製した。リンパ節細胞
としては腸間膜リンパ節のほかがっ下リンパ節、腋下リ
ンパ節、そけい部リンパ節等から採取したものも使用で
きる。培養液としてはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を本
発明者は主として用いたが、使用できる培養液としては
ＲＰＭ１１６４０培地、ＭＥＭなどがある。これらの培
養液に、５６℃で３０分非働化した牛胎児血清（ＦＣＳ
、 Ｇｉｂｃｏ社製）を１〜２０χ、好ましくは５％加
える。他の添加物として抗生物質がある。ペニシリンＧ
は培養液１ｍｌあたり約１０〜２５０単位、好ましくは
約１００単位、ストレプトマイシンも１ｍｌあたり約１
０〜２５０μｇ、好ましくは約１００μｇ添加する。更
に５０μ門の２−メルカプトエタノール、１０闘のヘペ
ス緩衝液、１．−グルタミン０．５〜１０ｍＭ、好まし
くは２ｍＭを添加する。
またＴ細胞系の長期継代培養には、一般的にインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）の添加が不可欠であるが、本発
明においてはそれに相当する添加物を以下のようにして
８周製した（Ｇｉｌｌｓ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ。
イキン−２（ＩＬ−２）の添加が不可欠であるが、本発
明においてはそれに相当する添加物を以下のようにして
８周製した（Ｇｉｌｌｓ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ。
囮本１５４．１９７７を参照）。即ちＤＢＡ／２マウス
（♀、４〜６週令）の肺細胞から得たｓｉｎｇｌｅ ｃ
ｅｌｌ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎを２ Ｘｌ０６／ｍｌの
細胞浮遊液とした。培養液は前記のＤＭＥＭを用い、添
加物は前記と同じものを処方した。これに更にコンカナ
バリンＡ （Ｃｏｎ Ａ）２．５μｇ／ｍｌを加え、３
７℃、２４時間、５χｃｏ２インキユベーター内で培養
した。この細胞浮遊液の培養上清を０．２μのフィルタ
ー（Ｎａｌｇｅｎ社製）で濾過滅菌した。この減菌濾液
をＩＬ−２に代わる添加物としく以下ＣＡＳと呼ぶ）、
使用直前まで一７０℃で凍結保存した。
（♀、４〜６週令）の肺細胞から得たｓｉｎｇｌｅ ｃ
ｅｌｌ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎを２ Ｘｌ０６／ｍｌの
細胞浮遊液とした。培養液は前記のＤＭＥＭを用い、添
加物は前記と同じものを処方した。これに更にコンカナ
バリンＡ （Ｃｏｎ Ａ）２．５μｇ／ｍｌを加え、３
７℃、２４時間、５χｃｏ２インキユベーター内で培養
した。この細胞浮遊液の培養上清を０．２μのフィルタ
ー（Ｎａｌｇｅｎ社製）で濾過滅菌した。この減菌濾液
をＩＬ−２に代わる添加物としく以下ＣＡＳと呼ぶ）、
使用直前まで一７０℃で凍結保存した。
ＭＲＬ／ ７！リンパ節細胞を２ ＸＩＯ’／ｍｌに調
製し、１０χＣＡＳの存在下培養した。培養容器は２５
ｃｒｌのコーニング社製Ｎｏ、２５１００フラスコで、
１０ｍ１の容量で細胞を培養し、細胞が大型化し、増殖
が安定するまでは５ｕｂｃｕ ｌ ｔｕｒｅは行わず、
３日毎に、全細胞を１５０Ｇ５分で遠心分離して集め、
新鮮培地で培養を継続した。培養開始３ケ月後に細胞は
大型細胞のみになったが、依然として増殖は遅（、その
ままの状態で、３ｓ毎に新鮮培地に替える操作を繰り返
した。その後、培養開始６ケ月時に、２４穴培養プレー
ト（コースタ−社製Ｎｏ、３４２４）に細胞を移し、５
Ｘ １０５／ｍｌ （各ｗｅｌｌ、２ｍ１）の細胞濃
度で培養した。
製し、１０χＣＡＳの存在下培養した。培養容器は２５
ｃｒｌのコーニング社製Ｎｏ、２５１００フラスコで、
１０ｍ１の容量で細胞を培養し、細胞が大型化し、増殖
が安定するまでは５ｕｂｃｕ ｌ ｔｕｒｅは行わず、
３日毎に、全細胞を１５０Ｇ５分で遠心分離して集め、
新鮮培地で培養を継続した。培養開始３ケ月後に細胞は
大型細胞のみになったが、依然として増殖は遅（、その
ままの状態で、３ｓ毎に新鮮培地に替える操作を繰り返
した。その後、培養開始６ケ月時に、２４穴培養プレー
ト（コースタ−社製Ｎｏ、３４２４）に細胞を移し、５
Ｘ １０５／ｍｌ （各ｗｅｌｌ、２ｍ１）の細胞濃
度で培養した。
この段階で細胞の増殖が好転し、その後大型フラスコ（
Ｃｏｒｎｉｎｇ 社製、７５ｄ、 ｌＪｏ、２５１１
０）で培養可能となった。培養開始後８ケ月のこの時点
で、ＣＡＳ非存在下でも、本細胞は増殖するようになり
、自己増殖性を獲得したと認めた。ｄｏｕｂｌｉｎｇ
ｔｉｍｅは約２０時間であった。本株化樹立細胞をＫＭ
ＬＩ細胞株と名づけた。本樹立細胞の安定性を調べるた
めに、長期培養を行うかたわら、一部細胞を液体窒素中
−１４０℃で凍結保存した後１ケ月目に培養系に戻した
ところ、順調に細胞は増殖、生育し、零ＫＭＬＩ細胞株
は安定な細胞であることが実証された。
Ｃｏｒｎｉｎｇ 社製、７５ｄ、 ｌＪｏ、２５１１
０）で培養可能となった。培養開始後８ケ月のこの時点
で、ＣＡＳ非存在下でも、本細胞は増殖するようになり
、自己増殖性を獲得したと認めた。ｄｏｕｂｌｉｎｇ
ｔｉｍｅは約２０時間であった。本株化樹立細胞をＫＭ
ＬＩ細胞株と名づけた。本樹立細胞の安定性を調べるた
めに、長期培養を行うかたわら、一部細胞を液体窒素中
−１４０℃で凍結保存した後１ケ月目に培養系に戻した
ところ、順調に細胞は増殖、生育し、零ＫＭＬＩ細胞株
は安定な細胞であることが実証された。
ＫＭＬＩ細胞株の特徴
培養開始１年を経過した時点で、本樹立株化細胞株の細
胞表面抗原の検索を、種々のリンパ球マーカーに対する
抗体（ＦＩＴＣ標識したもの、あるいはＦＩＴＣ標識ビ
オチン−アビジン系（抗体をビオチンと結合させ、アビ
ジンにＦｒＴＣを標識する系）を使用〕を用いて、レー
ザー・フロー・サイトメトリー（Ｏｒｔｈｏ社、５ＰＥ
ＣＴＲ聞■）にて行った。その結果、この自己増殖性Ｋ
ＭＬＩ細胞株はｒｈｙｌ−、Ｌｙｔｌ−。
胞表面抗原の検索を、種々のリンパ球マーカーに対する
抗体（ＦＩＴＣ標識したもの、あるいはＦＩＴＣ標識ビ
オチン−アビジン系（抗体をビオチンと結合させ、アビ
ジンにＦｒＴＣを標識する系）を使用〕を用いて、レー
ザー・フロー・サイトメトリー（Ｏｒｔｈｏ社、５ＰＥ
ＣＴＲ聞■）にて行った。その結果、この自己増殖性Ｋ
ＭＬＩ細胞株はｒｈｙｌ−、Ｌｙｔｌ−。
Ｌｙｔ２− 、ｓＩｇ〜（サーフェイスイムノグロブリ
ン）でいわゆるｎｕｌｌ ｃｅｌｌであった。Ｈ−２ハ
ブロタイブはｋでＭＲＬ／ Ａマウス由来細胞であるこ
とが！Ｉ′ｆｆｌ認され、一方１ａは陽性であることが
ねがった。またＥＡコロゼット法Ｈｕｄｓｏｎ、 Ｌ、
＆Ｈａｙ、 Ｆ、Ｃ，、ＰｒａｃｔｉｃａｌＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、 ０ｘｆｏｒｄ、
１９８０）により、Ｆｃリセプクー陰性（ＦｃＲ−）
であった。−力木ＫＭ［，１細胞をヌードマウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ）に移植するとリンパ腫の形成が
認められ、ＫＭＬＩ細胞は腫瘍細胞としてヌードマウス
に生着することが６１１ＦＬ’２＋された。
ン）でいわゆるｎｕｌｌ ｃｅｌｌであった。Ｈ−２ハ
ブロタイブはｋでＭＲＬ／ Ａマウス由来細胞であるこ
とが！Ｉ′ｆｆｌ認され、一方１ａは陽性であることが
ねがった。またＥＡコロゼット法Ｈｕｄｓｏｎ、 Ｌ、
＆Ｈａｙ、 Ｆ、Ｃ，、ＰｒａｃｔｉｃａｌＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、 ０ｘｆｏｒｄ、
１９８０）により、Ｆｃリセプクー陰性（ＦｃＲ−）
であった。−力木ＫＭ［，１細胞をヌードマウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ）に移植するとリンパ腫の形成が
認められ、ＫＭＬＩ細胞は腫瘍細胞としてヌードマウス
に生着することが６１１ＦＬ’２＋された。
ＫＭＬＩ細胞株の産生ずるＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）
ａ） ＢＣＤＦ？容′／夜の調製 フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ 社製、７５ｃａｆ、 Ｎ
ｏ、２５１１０）で、５ ！ＦＣ５を含むＤＭＥＭ培地
に５×１０６〜１０７個／ｃｕｌｔｕｒｅＯ本ＫＭＬＩ
細胞株を浮遊させ、３７℃、５χＣＯｚインキユベータ
ー内で、２４〜４８時間培養した。
ａ） ＢＣＤＦ？容′／夜の調製 フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ 社製、７５ｃａｆ、 Ｎ
ｏ、２５１１０）で、５ ！ＦＣ５を含むＤＭＥＭ培地
に５×１０６〜１０７個／ｃｕｌｔｕｒｅＯ本ＫＭＬＩ
細胞株を浮遊させ、３７℃、５χＣＯｚインキユベータ
ー内で、２４〜４８時間培養した。
直ちに、２．５０Ｏｒｐｍで５分この細胞浮遊液を遠心
し、その上清を集め、０．２μの滅菌フィルター（アク
ロディスク、Ｎａｌｇｅｎ 社製）で濾過し、ＢＣＤ
Ｆ溶液とした。
し、その上清を集め、０．２μの滅菌フィルター（アク
ロディスク、Ｎａｌｇｅｎ 社製）で濾過し、ＢＣＤ
Ｆ溶液とした。
ｂ） Ｂ細胞分化作用（Ｂ細胞抗体産生の促進効果）
の測定 ４ケ月令の雌ＭＲＬ／ Ｊマウスの牌細胞を５χＦＣＳ
を含むＤＭＥＭ培養液に種々の割合のａ）のＢＣＤＦ溶
液を加えた培養液に浮遊させ１０６／ｍｌの細胞濃度に
なるようにし、４日培養した。そして各培養上清の５０
χ飽和硫安画分の、単位蛋白質濃度あたりの抗一本領（
ｓｓ）ＤＮＡ抗体価を測定し、対照と比較した。抗体の
蛋白Ｎ？Ｒ度測定は、前記培養上清を５ｍｌとり、等量
の飽和硫安を加え、５０χ飽和硫安画分を得、マイクロ
フユージ（Ｈｅｒａｅｕｓ社製、Ｈａｅｍｏｆｕｇｅ
７８０型）で遠心分離（１７，０００ｒｐｍ、３分、２
℃）し、上清の吸光度（波長２８０ｎｍ 、 Ａ２８０
）を測り、行った。抗体活性の測定は酵素抗体法により
実施し、基本的に特開昭５８−５６６９４、特願昭５９
−１０８６４２および特願昭６０−６０９７０に示され
た方法に準じて行った。抗原の５ｓＤＮＡはｄｓＤＮＡ
を１００℃で５分間加熱後、急冷して作成した。５ｓＤ
ＮＡを付着させたＴｍｍｕｌｏｎ Ｎｏ、２マイクロタ
イタープレー） （Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製）の各−ｅｌ
ｌに、前記５０χ飽和硫安画分を各々５０μｍずつ加え
、室温で１時間振盪した。その後、プレートをＴｗｅｅ
ｎ／ＴＢＳ （塩化ナトリウム加トリス緩衝液／２５ｍ
Ｍ１−リスー塩酸塩＋１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
７，４）で３回洗浄し、未反応の抗体を除去した。
の測定 ４ケ月令の雌ＭＲＬ／ Ｊマウスの牌細胞を５χＦＣＳ
を含むＤＭＥＭ培養液に種々の割合のａ）のＢＣＤＦ溶
液を加えた培養液に浮遊させ１０６／ｍｌの細胞濃度に
なるようにし、４日培養した。そして各培養上清の５０
χ飽和硫安画分の、単位蛋白質濃度あたりの抗一本領（
ｓｓ）ＤＮＡ抗体価を測定し、対照と比較した。抗体の
蛋白Ｎ？Ｒ度測定は、前記培養上清を５ｍｌとり、等量
の飽和硫安を加え、５０χ飽和硫安画分を得、マイクロ
フユージ（Ｈｅｒａｅｕｓ社製、Ｈａｅｍｏｆｕｇｅ
７８０型）で遠心分離（１７，０００ｒｐｍ、３分、２
℃）し、上清の吸光度（波長２８０ｎｍ 、 Ａ２８０
）を測り、行った。抗体活性の測定は酵素抗体法により
実施し、基本的に特開昭５８−５６６９４、特願昭５９
−１０８６４２および特願昭６０−６０９７０に示され
た方法に準じて行った。抗原の５ｓＤＮＡはｄｓＤＮＡ
を１００℃で５分間加熱後、急冷して作成した。５ｓＤ
ＮＡを付着させたＴｍｍｕｌｏｎ Ｎｏ、２マイクロタ
イタープレー） （Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製）の各−ｅｌ
ｌに、前記５０χ飽和硫安画分を各々５０μｍずつ加え
、室温で１時間振盪した。その後、プレートをＴｗｅｅ
ｎ／ＴＢＳ （塩化ナトリウム加トリス緩衝液／２５ｍ
Ｍ１−リスー塩酸塩＋１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
７，４）で３回洗浄し、未反応の抗体を除去した。
次に抗マウス（ＩｇＧ ＋ ＩｇＭ）アルカリフォスフ
ァターゼコンジュゲート（Ｓｔｇｍａ社製）を５０μｌ
、各ｗｅｌｌに加えさらに室温で１時間、同様に反応さ
せた。その後、プレートをＴｗｅｅｎ／ＴＢＳで３回洗
浄し、各−ｅｌｌに酵素の基質である１００μｌの２゜
５ｍＭ Ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（Ｐ−Ｎ
ＰＰを、２ｍＭ門ｇｃ！２含む５０ｍＭのナトリウムカ
ーボネート緩衝液（ｐＨ９，５）中で１ｍｇ／ｎ＋１に
なるように溶解した）を加えて、３７℃の恒温器で６０
分間反応させた。このようにして、抗原付着プレートに
結合した抗体活性は、二次抗体に結合させたアルカリフ
ォスファターゼの酵素活性（波長４０５０ｍでの吸光度
、八４０５、Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ
Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒｓ Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製で測定）を指標にして求めた。
ァターゼコンジュゲート（Ｓｔｇｍａ社製）を５０μｌ
、各ｗｅｌｌに加えさらに室温で１時間、同様に反応さ
せた。その後、プレートをＴｗｅｅｎ／ＴＢＳで３回洗
浄し、各−ｅｌｌに酵素の基質である１００μｌの２゜
５ｍＭ Ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（Ｐ−Ｎ
ＰＰを、２ｍＭ門ｇｃ！２含む５０ｍＭのナトリウムカ
ーボネート緩衝液（ｐＨ９，５）中で１ｍｇ／ｎ＋１に
なるように溶解した）を加えて、３７℃の恒温器で６０
分間反応させた。このようにして、抗原付着プレートに
結合した抗体活性は、二次抗体に結合させたアルカリフ
ォスファターゼの酵素活性（波長４０５０ｍでの吸光度
、八４０５、Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ
Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒｓ Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製で測定）を指標にして求めた。
この結果、ＭＲＬ／ １マウス牌細胞のｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ抗５ｓＤＮＡ抗体産生は約３倍増強されることがわか
った（実験例２参照）。本発明者の用いた測定系では、
抗体産生細胞の増加といったことではなく抗体量の増加
を直接測定できるのであり、この３倍の抗体産生量の増
大は、きわめて大きいものと言える。
ｏ抗５ｓＤＮＡ抗体産生は約３倍増強されることがわか
った（実験例２参照）。本発明者の用いた測定系では、
抗体産生細胞の増加といったことではなく抗体量の増加
を直接測定できるのであり、この３倍の抗体産生量の増
大は、きわめて大きいものと言える。
ｃ） Ｂ細胞増殖活性の有無の測定
４ケ月令の雌ＭＲＬ／ ｎマウスの肺細胞浮遊液にａ）
で調製したＢＣＤＦ溶液を種々の割合で加え３日間培養
した。培養終了前１８時間前に３Ｈ−チミジンを１μＣ
３／ｍｌとなるようにこの培養液に添加した。培養終了
後細胞を集め３Ｈ−チミジンの取り込みがこのＢＣＤＦ
溶液添加により増強されるか否かをみたが、その効果は
ないことがわかった。
で調製したＢＣＤＦ溶液を種々の割合で加え３日間培養
した。培養終了前１８時間前に３Ｈ−チミジンを１μＣ
３／ｍｌとなるようにこの培養液に添加した。培養終了
後細胞を集め３Ｈ−チミジンの取り込みがこのＢＣＤＦ
溶液添加により増強されるか否かをみたが、その効果は
ないことがわかった。
即ち本ＫＭＬＩ細胞培養上清にはＢ細胞増殖因子は（Ｂ
ＣＧＦ）は含まれないことが確認された。
ＣＧＦ）は含まれないことが確認された。
ＭＲＬ／ ｌ！マウスあるいはＭＲＬ／ｎマウス牌細胞
のＫＭＬＩ細胞株との混合培養による抗ＤＮＡ抗体産生
の増強 に？ＩＬ１細胞自身の直接的な作用を知るために、４ケ
月令雌ＭＲＬ／ ６マウスあるいは９ケ月令雌ＭＲＬ／
ｎマウス（ＭＲＬ＃！マウスとｃｏｎｊｅｎｉｃであり
、ｌｐｒ遺伝子が欠損している。ＭＲＬ／ ＆マウスの
ように早期にＳＬＥ症状を示さない（リンパ節膨張を伴
わぬ）が、１年後には抗核抗体の産生等が見られるマウ
ス。白木正妃、胚原道夫、臨床免疫、長、１５．１９８
３参照）の１０６／ｍｌの牌細胞と各細胞濃度のＫＭＬ
Ｉ細胞株を混合培養（ＭＬＲ） した。
のＫＭＬＩ細胞株との混合培養による抗ＤＮＡ抗体産生
の増強 に？ＩＬ１細胞自身の直接的な作用を知るために、４ケ
月令雌ＭＲＬ／ ６マウスあるいは９ケ月令雌ＭＲＬ／
ｎマウス（ＭＲＬ＃！マウスとｃｏｎｊｅｎｉｃであり
、ｌｐｒ遺伝子が欠損している。ＭＲＬ／ ＆マウスの
ように早期にＳＬＥ症状を示さない（リンパ節膨張を伴
わぬ）が、１年後には抗核抗体の産生等が見られるマウ
ス。白木正妃、胚原道夫、臨床免疫、長、１５．１９８
３参照）の１０６／ｍｌの牌細胞と各細胞濃度のＫＭＬ
Ｉ細胞株を混合培養（ＭＬＲ） した。
ＭＲＬ／βマウスの場合は２日間培養し、ＭＲＬ／ｎマ
ウスの場合は４日間培養した。ｌ’ｌＲＬ／ Ａマウス
においては、ＢＣＤＦ溶液を添加する場合よりもＭＬＲ
の方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの抗５ｓＤＮＡ抗体産生の増
強の程度が大きく、ＫＭＬＩ細胞非添加に比べ５倍はど
増大した（実験例３参照）。ＭＲＬ／ｎマウスにおいて
も、抗５ｓＤＮＡ抗体産生の増強が見られた（実験例４
参照）。このことはＴ細胞の異常増殖に関与すると考え
られているｌｐｒ遺伝子が欠損していることにより、Ｔ
細胞因子の援助がないために疾患が発症しないとも考え
られるＭＲＬ／ｎマウスのリンパ球に、Ｉｐｒ遺伝子が
反映していると考えうるＫＭＬＩ細胞由来の因子が作用
して抗体産生が促進されたと解釈できる。このことを含
め、本ＫＭＬＩ細胞より産生されるＢＣＤＦは、抗体産
生能力の低い免疫不全症患者の治療に通用しうると考え
られる。
ウスの場合は４日間培養した。ｌ’ｌＲＬ／ Ａマウス
においては、ＢＣＤＦ溶液を添加する場合よりもＭＬＲ
の方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの抗５ｓＤＮＡ抗体産生の増
強の程度が大きく、ＫＭＬＩ細胞非添加に比べ５倍はど
増大した（実験例３参照）。ＭＲＬ／ｎマウスにおいて
も、抗５ｓＤＮＡ抗体産生の増強が見られた（実験例４
参照）。このことはＴ細胞の異常増殖に関与すると考え
られているｌｐｒ遺伝子が欠損していることにより、Ｔ
細胞因子の援助がないために疾患が発症しないとも考え
られるＭＲＬ／ｎマウスのリンパ球に、Ｉｐｒ遺伝子が
反映していると考えうるＫＭＬＩ細胞由来の因子が作用
して抗体産生が促進されたと解釈できる。このことを含
め、本ＫＭＬＩ細胞より産生されるＢＣＤＦは、抗体産
生能力の低い免疫不全症患者の治療に通用しうると考え
られる。
本発明開示のＫＭＣＩ細胞株の如き株化細胞株を取得す
るための自己免疫疾患動物リンパ系細胞としては、ＭＲ
Ｌ／ １マウスリンパ節細胞のほか本明細書第２頁に記
載したようなＮＺＢマウス、ＮＺＢ／Ｗ Ｆｌマウス、
ＢＸＳＢマウスおよびＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄマウス、
ＳＬ／Ｎｉマウス等の各リンパ節細胞、自己免疫疾患患
者の末梢血リンパ球、扁桃腺リンパ系細胞、肺臓細胞な
どの中から選ばれる。またＣＡＳの如き、マイトゲン存
在下で動物のリンパ系細胞を培養して得た上清を取得す
るためには、ＤＢＡ／２マウス牌細胞、リンパ節細胞の
ほか、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、Ｃ５
７ＢＬ／６マウス等のマウス牌細胞、リンパ節細胞、ま
た唱５ｔａｒラット、Ｄｏｎｒｙｕラット、ＳＤラット
等のラット牌細胞、リンパ節細胞、またモルモット、ウ
サギ、イヌ、ネコ等の牌細胞、リンパ節細胞、更にヒト
の末梢血リンパ球、牌細胞、リンパ節細胞などから選ば
れるリンパ系細胞を用いる。
るための自己免疫疾患動物リンパ系細胞としては、ＭＲ
Ｌ／ １マウスリンパ節細胞のほか本明細書第２頁に記
載したようなＮＺＢマウス、ＮＺＢ／Ｗ Ｆｌマウス、
ＢＸＳＢマウスおよびＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄマウス、
ＳＬ／Ｎｉマウス等の各リンパ節細胞、自己免疫疾患患
者の末梢血リンパ球、扁桃腺リンパ系細胞、肺臓細胞な
どの中から選ばれる。またＣＡＳの如き、マイトゲン存
在下で動物のリンパ系細胞を培養して得た上清を取得す
るためには、ＤＢＡ／２マウス牌細胞、リンパ節細胞の
ほか、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、Ｃ５
７ＢＬ／６マウス等のマウス牌細胞、リンパ節細胞、ま
た唱５ｔａｒラット、Ｄｏｎｒｙｕラット、ＳＤラット
等のラット牌細胞、リンパ節細胞、またモルモット、ウ
サギ、イヌ、ネコ等の牌細胞、リンパ節細胞、更にヒト
の末梢血リンパ球、牌細胞、リンパ節細胞などから選ば
れるリンパ系細胞を用いる。
上記のような性質を有するＫＭＬＩ細胞株の樹立、ＢＣ
ＤＦの産生に関する本発明について、以下に実施例、実
験例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限
定されない。
ＤＦの産生に関する本発明について、以下に実施例、実
験例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限
定されない。
実施例Ｉ ＫＭＬＩ細胞株の樹立
２００週令ＭＲＬ／１ （♀）マウスの腸間膜リンパ節
細胞のｓｉｎｇｌｅ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎの２ Ｘｌ
０６／ｍｌ細胞浮遊液を、前記のＤ門Ｍを培養液として
用い作成した。一方５週令ＤＢＡ／２ （♀）マウスの
牌細胞から得たｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ５ｕｓｐｅｎ
ｓｉｏｎの２ Ｘｌ０６／ｍｌ細胞浮遊液を聞ＨＭを培
養液として用い作成し、Ｃｏｎ Ａ ２．５ μｇ／ｍ
ｌを加え３７℃、２４時間、５χＣＯ□インキユベータ
ー内で培養し、培養上清を０．２μのアクロディスクフ
ィルター（Ｎａ Ｉｇｅｎ社製）で濾過滅菌した。この
滅菌濾液（ＣＡＳ）をＭＲＬ／ ｌマウスのリンパ節細
胞浮遊液に１０χの割合で加え、計１０ｍ１を２５ｃｍ
”のコーニング社製Ｎｏ、２５１１０フラスコ内で培養
開始した。細胞が大型化し、増殖が安定するまでは５ｕ
ｂｃｕｌｔｕｒｅは行わず、３日毎に、全細胞を１５０
Ｇ５分で遠心分離して集め、新鮮培地で培養を継続した
。培養開始３ケ月後に細胞は大型細胞のみになったが、
依然として増殖は遅く、そのままの状態で、３日毎に新
鮮培地に替える操作を繰り返した。その後、培養開始６
ケ月時に、２４穴培養プレート（コースタ−社製Ｎｏ、
３４２４）に細胞を移し、５ Ｘ １０’／ｍｌ （
各１ｖｅｌｌ、 ２ｍ１）の細胞濃度で培養した。この
段階で細胞の増殖が好転し、その後大型フラスコ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社製、７５ｃｍ２、Ｎｏ、２５１１０）で培
養可能となった。
細胞のｓｉｎｇｌｅ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎの２ Ｘｌ
０６／ｍｌ細胞浮遊液を、前記のＤ門Ｍを培養液として
用い作成した。一方５週令ＤＢＡ／２ （♀）マウスの
牌細胞から得たｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ５ｕｓｐｅｎ
ｓｉｏｎの２ Ｘｌ０６／ｍｌ細胞浮遊液を聞ＨＭを培
養液として用い作成し、Ｃｏｎ Ａ ２．５ μｇ／ｍ
ｌを加え３７℃、２４時間、５χＣＯ□インキユベータ
ー内で培養し、培養上清を０．２μのアクロディスクフ
ィルター（Ｎａ Ｉｇｅｎ社製）で濾過滅菌した。この
滅菌濾液（ＣＡＳ）をＭＲＬ／ ｌマウスのリンパ節細
胞浮遊液に１０χの割合で加え、計１０ｍ１を２５ｃｍ
”のコーニング社製Ｎｏ、２５１１０フラスコ内で培養
開始した。細胞が大型化し、増殖が安定するまでは５ｕ
ｂｃｕｌｔｕｒｅは行わず、３日毎に、全細胞を１５０
Ｇ５分で遠心分離して集め、新鮮培地で培養を継続した
。培養開始３ケ月後に細胞は大型細胞のみになったが、
依然として増殖は遅く、そのままの状態で、３日毎に新
鮮培地に替える操作を繰り返した。その後、培養開始６
ケ月時に、２４穴培養プレート（コースタ−社製Ｎｏ、
３４２４）に細胞を移し、５ Ｘ １０’／ｍｌ （
各１ｖｅｌｌ、 ２ｍ１）の細胞濃度で培養した。この
段階で細胞の増殖が好転し、その後大型フラスコ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社製、７５ｃｍ２、Ｎｏ、２５１１０）で培
養可能となった。
培養開始後８ケ月のこの時点で、ＣＡＳ非存在下でも、
本細胞は増殖するようになり、自己増殖性を獲得したと
認めた。本株化樹立細胞を）［ＭＬ１細胞株と名付けた
。
本細胞は増殖するようになり、自己増殖性を獲得したと
認めた。本株化樹立細胞を）［ＭＬ１細胞株と名付けた
。
実施例２ ＫＭＬＬ細胞の凍結融解後の培養本ＫＭＬ
Ｉ細胞株を液体窒素中−１４０℃で凍結保存した。１ケ
月後に本細胞の凍結を融解し、培養を再開したところ、
継代培養している細胞株とその性質は変わらず、安定に
増殖した。
Ｉ細胞株を液体窒素中−１４０℃で凍結保存した。１ケ
月後に本細胞の凍結を融解し、培養を再開したところ、
継代培養している細胞株とその性質は変わらず、安定に
増殖した。
実施例３ ヌードマウスでのリンパ腫形成本にＭＬＬ細
胞１０７個を６週令の雌ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−
ｎｕ／ｎｕ）の腹腔内に注射により移植したところ、２
ケ月後にリンパ腫の形成を認められ、ＫＭＬ１細胞は腫
瘍細胞としてヌードマウスに生着することが確認された
。
胞１０７個を６週令の雌ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−
ｎｕ／ｎｕ）の腹腔内に注射により移植したところ、２
ケ月後にリンパ腫の形成を認められ、ＫＭＬ１細胞は腫
瘍細胞としてヌードマウスに生着することが確認された
。
実施例４８ＣＤＦ溶液の調製
フラスコ（Ｃｏｒｎ ｉｎｇ 社製、７５ｃｍ２、Ｎ
ｏ、２５１１０）で、５ ＄ＦＣ５を含むＤＭＥＦＩ培
地に５ Ｘｌ０６〜１０’個／Ｃｕ１ｔｕｒｅの本ＫＭ
ＬＩ細胞株を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯｚインキュヘ
ーター内で、４８時間培養した。直ぢに、２．５０Ｏｒ
ｐｍで５分この細胞浮遊液を遠心し、その上清を集め、
０．２ ｊノのアクロディスクフィルターで濾過滅菌し
、ＢＣＤＦ溶液を調製した。
ｏ、２５１１０）で、５ ＄ＦＣ５を含むＤＭＥＦＩ培
地に５ Ｘｌ０６〜１０’個／Ｃｕ１ｔｕｒｅの本ＫＭ
ＬＩ細胞株を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯｚインキュヘ
ーター内で、４８時間培養した。直ぢに、２．５０Ｏｒ
ｐｍで５分この細胞浮遊液を遠心し、その上清を集め、
０．２ ｊノのアクロディスクフィルターで濾過滅菌し
、ＢＣＤＦ溶液を調製した。
実験例１ 細胞表面抗原の解析
リンパ球の各種細胞表面マーカーに対する抗体、即ち抗
ｒｈｙｉ抗体（Ｍｉ １ｅｓ−Ｙｅｄａ社製）、抗Ｌｙ
ｔｌ抗体、抗Ｌｙｔ２抗体（ともにＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ社製）および抗ｒｇｈ抗体（東大・医科
学研究所・免疫学研究部製）を用いて、零ＫＭＬＩ細胞
の細胞表面抗原の検索をレーザー・フロー・サイトメト
リー（Ｏｒｔｈｏ社、５ＰＥＣＴＲ聞■）にて行ったと
ころ、ｒｈｙド、 Ｌｙｔｌ−。
ｒｈｙｉ抗体（Ｍｉ １ｅｓ−Ｙｅｄａ社製）、抗Ｌｙ
ｔｌ抗体、抗Ｌｙｔ２抗体（ともにＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ社製）および抗ｒｇｈ抗体（東大・医科
学研究所・免疫学研究部製）を用いて、零ＫＭＬＩ細胞
の細胞表面抗原の検索をレーザー・フロー・サイトメト
リー（Ｏｒｔｈｏ社、５ＰＥＣＴＲ聞■）にて行ったと
ころ、ｒｈｙド、 Ｌｙｔｌ−。
Ｌｙｔ２− 、 ｓｌｇ−であり、本細胞はｎｕｌｌ
ｃｅＩＩであった。ト２ハブロタイブはｋで（Ｌｉｔｔ
ｏｎ−Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ社製の抗Ｈ−２Ｋｋ抗体を使
用して解析した）、ＭＲＬ／ Ｊマウス由来細胞である
ことが確認され、またＩａは陽性であった（Ｃｅｄａｌ
ａｎｅ社製の抗１ａ抗体を使用）。ＥＡコロゼット法よ
る検索で本細胞はＦｃ’Ｊセブター陰性（ＦｃＲ” ）
であった。
ｃｅＩＩであった。ト２ハブロタイブはｋで（Ｌｉｔｔ
ｏｎ−Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ社製の抗Ｈ−２Ｋｋ抗体を使
用して解析した）、ＭＲＬ／ Ｊマウス由来細胞である
ことが確認され、またＩａは陽性であった（Ｃｅｄａｌ
ａｎｅ社製の抗１ａ抗体を使用）。ＥＡコロゼット法よ
る検索で本細胞はＦｃ’Ｊセブター陰性（ＦｃＲ” ）
であった。
実験例２ ８ＣＤＦ溶液のＭＲＬ／１マウス牌細胞の抗
細胞生促進 ４ケ月令の雌ＭＲＬ／Ｉマウスの肺細胞を５％ＦＣＳを
含むＤＭＥＭ培養液に、種々の割合の実施例４で得たＢ
ＣＤＦ溶液を加えた培養液に浮遊させ１０６／ｍｌの細
胞濃度になるようにし、２５ｃｍ２のコーニング社製Ｎ
ｏ、２５１１０フラスコ内で４日培養した。培養上清中
の抗一本領（ｓｓ）ＤＮＡ抗体価（Ａ４０５）を測定し
た。抗体価は抗体の単位蛋白１！ （ＩＡ２８０）あた
りの活性で表わした。
細胞生促進 ４ケ月令の雌ＭＲＬ／Ｉマウスの肺細胞を５％ＦＣＳを
含むＤＭＥＭ培養液に、種々の割合の実施例４で得たＢ
ＣＤＦ溶液を加えた培養液に浮遊させ１０６／ｍｌの細
胞濃度になるようにし、２５ｃｍ２のコーニング社製Ｎ
ｏ、２５１１０フラスコ内で４日培養した。培養上清中
の抗一本領（ｓｓ）ＤＮＡ抗体価（Ａ４０５）を測定し
た。抗体価は抗体の単位蛋白１！ （ＩＡ２８０）あた
りの活性で表わした。
加えたＫＭＬ １細胞 抗５ｓＤＮΔ抗体価培養
土清（ａｔ、Ｖ／Ｖ） Ａ４０５／ｌＡ２８００
０．１０３ １０ ０、１９６ ２０ ０．２５２ ４０ ０．１９７ 即ちこのＢＣＤＦ溶液は抗ＤＮＡ抗体産生を約２．５倍
はど増強する活性を有することがわかった。
土清（ａｔ、Ｖ／Ｖ） Ａ４０５／ｌＡ２８００
０．１０３ １０ ０、１９６ ２０ ０．２５２ ４０ ０．１９７ 即ちこのＢＣＤＦ溶液は抗ＤＮＡ抗体産生を約２．５倍
はど増強する活性を有することがわかった。
実験例３ 北Ｌ／７！マウス牌細胞のＫＭＬｌ、細胞株
との混合培養による抗体産生の増強 ４ケ月令の雌ＭＲＬ／ ７！マウスの肺細胞１０’／ｍ
ｌと各細胞濃度のＫＭＬＩ細胞株を５％ＣＯ２インキュ
ベーター内で３７℃、２日間混合培養した。抗体価は実
験例２と同様に表わした。
との混合培養による抗体産生の増強 ４ケ月令の雌ＭＲＬ／ ７！マウスの肺細胞１０’／ｍ
ｌと各細胞濃度のＫＭＬＩ細胞株を５％ＣＯ２インキュ
ベーター内で３７℃、２日間混合培養した。抗体価は実
験例２と同様に表わした。
加えたＫＭＬＩ ＭＲＬ／ １マウス 抗５ｓＤ
ＮＡ抗体価細胞数／ｍｌ 牌細胞数／ｍｌ Ａ
４０５／ＬＡ２８００ １０６０．２５８ １０’ １０６０．８２３ ５ ＸＩＯ’ １０６０．９３０１０’
１０６１．１８５ １０ｂ０ ０．０３２ 即ちｉｎ ｖｉｔｒｏの抗５ｓＤＮへ抗体産生は実施例
２のＢＣＤＦ溶液添加の場合よりも、増強の程度が大き
く、ＫＭＬＩ細胞非添加に比べて約５倍はど増大した。
ＮＡ抗体価細胞数／ｍｌ 牌細胞数／ｍｌ Ａ
４０５／ＬＡ２８００ １０６０．２５８ １０’ １０６０．８２３ ５ ＸＩＯ’ １０６０．９３０１０’
１０６１．１８５ １０ｂ０ ０．０３２ 即ちｉｎ ｖｉｔｒｏの抗５ｓＤＮへ抗体産生は実施例
２のＢＣＤＦ溶液添加の場合よりも、増強の程度が大き
く、ＫＭＬＩ細胞非添加に比べて約５倍はど増大した。
実験例４ ＭＲＬ／ｎマウス牌細胞のＫＭＩ、１細胞
株との混合培養による抗体産生の増強 ９ケ月令の雌ＭＲＬ／ｎマウスのの肺細胞１０’／ｍｌ
と各細胞濃度のＫＭＬＩ細胞株を、実験例３と同じ条件
で４日間培養した。抗体価は実験例２と同様に表わした
。
株との混合培養による抗体産生の増強 ９ケ月令の雌ＭＲＬ／ｎマウスのの肺細胞１０’／ｍｌ
と各細胞濃度のＫＭＬＩ細胞株を、実験例３と同じ条件
で４日間培養した。抗体価は実験例２と同様に表わした
。
加えたＫＭＬＩ ＭＲＬ／ｎマウス 抗５ｓＤＮ
Ａ抗体価細胞数／ｍｌ 牌細胞数／ｍｌ Ａ４
０５／ＬＡ２８００ １０６０．０６２ １０’ １０６０．０７４ ５ ＸＩＯ’ １０６０．１４０１０ｓ１０
６０．１００ １０’ ０ ０．０２０即ち
ＭＲＬ／ｎ ７ウスにおいてもｉｎ ｖｉｔｒｏの抗５
ｓＤＮＡ抗体産生は増大した。
Ａ抗体価細胞数／ｍｌ 牌細胞数／ｍｌ Ａ４
０５／ＬＡ２８００ １０６０．０６２ １０’ １０６０．０７４ ５ ＸＩＯ’ １０６０．１４０１０ｓ１０
６０．１００ １０’ ０ ０．０２０即ち
ＭＲＬ／ｎ ７ウスにおいてもｉｎ ｖｉｔｒｏの抗５
ｓＤＮＡ抗体産生は増大した。
作用
本発明のＫＭＬＩ細胞株は継代培養しても、凍結融解し
て培養しても安定に増殖する細胞であり、又ＢＣＤＦを
産生ずる細胞であることから、ＢＣＤＦを工業的に大量
に生産することが可能となりあらかじめ分離調製された
抗原特異的なり細胞に作用して抗原特異的な抗体を生産
させることができ、価値ある細胞である。また零ＫＭＬ
Ｉ細胞株の産生ずるＢＣＤＦは、場合によって抗原特異
的なり細胞のみに、選択的に作用して、その抗原に対す
る特異抗体のみを産生せしめる可能性もあり有用である
。更にまた一般に細胞融合技術において、免疫した動物
の肺細胞をあらかじめ本発明のＫＭＬＩ細胞株由来のＢ
ＣＤＦＣＤ下で培養し、抗体産生細胞をふやし、しかる
のちに細胞融合を行い、目的とする抗体産生を行うハイ
ブリドーマの形成頻度を高めることも可能である。一方
また本ＢＣＤＦに対する抗体を作成し、異常な抗体産生
促進を阻止することも可能となる。
て培養しても安定に増殖する細胞であり、又ＢＣＤＦを
産生ずる細胞であることから、ＢＣＤＦを工業的に大量
に生産することが可能となりあらかじめ分離調製された
抗原特異的なり細胞に作用して抗原特異的な抗体を生産
させることができ、価値ある細胞である。また零ＫＭＬ
Ｉ細胞株の産生ずるＢＣＤＦは、場合によって抗原特異
的なり細胞のみに、選択的に作用して、その抗原に対す
る特異抗体のみを産生せしめる可能性もあり有用である
。更にまた一般に細胞融合技術において、免疫した動物
の肺細胞をあらかじめ本発明のＫＭＬＩ細胞株由来のＢ
ＣＤＦＣＤ下で培養し、抗体産生細胞をふやし、しかる
のちに細胞融合を行い、目的とする抗体産生を行うハイ
ブリドーマの形成頻度を高めることも可能である。一方
また本ＢＣＤＦに対する抗体を作成し、異常な抗体産生
促進を阻止することも可能となる。
更に本ＢＣＤＦに対する阻害剤を探索することも可能と
なり、新しい治療方法に道を開くことになる。
なり、新しい治療方法に道を開くことになる。
加えて本ＫＭＬＩ細胞株は自己増殖能を有するという際
立った特徴を持つことから、各種細胞との細胞融合を行
える親細胞（パートナ−細胞）として用いることができ
、有用なハイブリドーマを形成することによって、様々
な有用な生理活性物質やモノクローナル抗体を産生させ
ることができる。
立った特徴を持つことから、各種細胞との細胞融合を行
える親細胞（パートナ−細胞）として用いることができ
、有用なハイブリドーマを形成することによって、様々
な有用な生理活性物質やモノクローナル抗体を産生させ
ることができる。
かくの如く本ＫＭＬＩ細胞株の種々の性質を明らかにす
ることにより、また本ＫＭＬＩ細胞株由来のＢＣＤＦほ
か各種因子を用いることにより自己免疫疾患、免疫不全
、発がんなどのメカニズムを、より適確に解析すること
が可能となり、本ＫＭＬＩ細胞株は各種疾患の診断・治
療にきわめて有用な手段を特徴する
ることにより、また本ＫＭＬＩ細胞株由来のＢＣＤＦほ
か各種因子を用いることにより自己免疫疾患、免疫不全
、発がんなどのメカニズムを、より適確に解析すること
が可能となり、本ＫＭＬＩ細胞株は各種疾患の診断・治
療にきわめて有用な手段を特徴する
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 自己免疫疾患動物リンパ系細胞を、動物のリンパ系細胞
をマイトゲン存在下で培養した上滑とともに培養し、培
養開始後８ヶ月で該上清なしでも増殖するようになる下
記の性質を有する新規な株化細胞株。 （１）抗体産生細胞の分化に関与する因子を産生する。 （２）細胞増殖活性因子を産生しない。 （３）自己増殖能を有する。 （４）ｎｕｌｌ ｃｅｌｌである。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60227709A JPH0763361B2 (ja) | 1985-10-15 | 1985-10-15 | 培養株化細胞株 |
| DE86307921T DE3688822T2 (de) | 1985-10-15 | 1986-10-14 | Aufgebaute Zellinie. |
| EP86307921A EP0220045B1 (en) | 1985-10-15 | 1986-10-14 | Established cell line |
| US07/798,043 US5132222A (en) | 1985-10-15 | 1991-11-27 | Established cell line, kml1-7, which produces b-cell differentiation factor (bcdf) |
| US07/878,451 US5250661A (en) | 1985-10-15 | 1992-05-05 | Established cell line |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60227709A JPH0763361B2 (ja) | 1985-10-15 | 1985-10-15 | 培養株化細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6287090A true JPS6287090A (ja) | 1987-04-21 |
| JPH0763361B2 JPH0763361B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=16865122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60227709A Expired - Lifetime JPH0763361B2 (ja) | 1985-10-15 | 1985-10-15 | 培養株化細胞株 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5132222A (ja) |
| EP (1) | EP0220045B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0763361B2 (ja) |
| DE (1) | DE3688822T2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5250661A (en) * | 1985-10-15 | 1993-10-05 | Mitsui Toatsu Chemicals Incorporated | Established cell line |
| SE8701004D0 (sv) * | 1987-03-11 | 1987-03-11 | Astra Ab | Method for therapy of leukemias and certain other malignancies |
| US5462870A (en) * | 1993-04-23 | 1995-10-31 | Wayne State University | Human diploid salivary gland epithelial cell lines |
| WO2016025804A1 (en) * | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Medimmune, Llc | Detecting residual host cell proteins in recombinant protein preparations |
-
1985
- 1985-10-15 JP JP60227709A patent/JPH0763361B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-10-14 DE DE86307921T patent/DE3688822T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-14 EP EP86307921A patent/EP0220045B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-11-27 US US07/798,043 patent/US5132222A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EXPL CELL BIOL=1981 * |
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY=1985 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0220045A2 (en) | 1987-04-29 |
| JPH0763361B2 (ja) | 1995-07-12 |
| DE3688822D1 (de) | 1993-09-09 |
| EP0220045A3 (en) | 1989-03-08 |
| US5132222A (en) | 1992-07-21 |
| EP0220045B1 (en) | 1993-08-04 |
| DE3688822T2 (de) | 1993-11-25 |
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