TWI787594B - 抗原結合分子和使用彼之方法 - Google Patents

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史都華 西弗斯
亞利安 佩雷斯加西亞
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Abstract

本發明提供一種經分離之抗原結合分子，該抗原結合分子特異性結合包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。該抗原結合分子可用於本發明提供之方法。

Description

抗原結合分子和使用彼之方法
CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS相關申請案之交叉引用[1]
本申請案主張2016年7月12日提交申請之美國臨時專利申請案號62/361420及2016年11月1日提交申請之美國臨時專利申請案號62/415786的優先權；彼等之全部內容係以引用方式併入本文。 SEQUENCE LISTING序列表[2]
本申請案含有序列表，該序列表已經以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容係以引用方式併入本文。該在2016年11月1日創建之ASCII副本稱為K1033_02txt且大小為571523字節。[3]
本發明關於抗原結合分子(諸如抗體)，該抗原結合分子特異性結合序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞、編碼該等抗原結合分子之多核苷酸，以及該抗原結合分子之人化形式；亦揭示使用該抗原結合分子之方法。
[4]
抗原結合分子(包括抗體)係用於免疫療法和基於固相之應用(諸如生物傳感器、親和力層析法和免疫分析)中。這些抗體和抗原結合分子憑藉彼等特異性結合其靶的之能力而取得其用途。[5]
當用於生物技術和生物治療應用中時，連接子序列(其通常係基於肽)可用於一系列與科學相關之應用中。例如，連接子可僅作為間隔子部分以賦予較大分子理想之結構及/或功能性質。於另一實例中，連接子可賦予較大分子很少或不賦予結構或功能性質，但可僅作為區別特性(例如“標記物”或“生物標記物”或“標籤”)以用於獨特鑑別較大分子。再於另一實例中，連接子可用於賦予可識別之特性，該可識別之特性可用來作為針對包含該連接子序列之較大分子的抗體之結合位點。[6]
當使用連接子序列作為較大分子(特異性結合該連接子序列之抗體)的區別性可檢測或可識別特性，而無其他序列存在於該較大分子中時，該抗體可作為檢測試劑。該等抗體可以能在某些條件下檢測到之部分標記。該等抗體之其他應用包括純化及分離包含該連接子之分子、決定在特定設定中之分子的特徵、增加包含及/或呈現該連接子之分子群體的濃度和治療應用。[7]
1993，Whitlow，等人揭示包含胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)之合成的連接子肽(Whitlowet al. ，(1993)Prot. Eng. 6(8):989-95)。 The disclosed peptide was studied as a component of a n scFv, and was designed to remove a proteolytic site identified in a previous linker peptide.該揭示之肽被研究作為scFv之組分且經過設計以去除在先前之連接子肽中鑑定出之蛋白水解位點。Whitlowet al. Whitlow等人歸結出相較於先前之連接子肽(該新設計之合成的連接子肽的序列係以此為基礎)，該新設計之合成的連接子肽在玻管內之蛋白水解反應中更穩定，且與相同之該相同之先前的連接子相較下亦顯示出較不會聚集。Whitlow等人未揭示任何針對其第二代連接子肽之抗原結合分子。[8]
本發明揭示抗原結合分子(包括抗體)，該抗原結合分子特異性結合序列 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞。本發明亦提供抗原結合分子之人化形式。Applications and uses thereof are also disclosed.本發明亦揭示彼等之應用和用途。
[9]
本發明提供經分離之抗原結合分子，該經分離之抗原結合分子特異性結合包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。於各種實施態樣中，該抗原結合分子係選自由下列所組成之群組:抗體、scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2 、dAb、非人抗體(例如兔子)、人抗體、人化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、IgE抗體、IgD抗體、IgM抗體、IgG1抗體、在鉸鏈區具有至少一個突變之IgG1抗體、IgG2抗體、在鉸鏈區具有至少一個突變之IgG2抗體、IgG3抗體、在鉸鏈區具有至少一個突變之IgG3抗體、IgG4抗體、在鉸鏈區具有至少一個突變之IgG4抗體、包含至少一個非天然產生之胺基酸的抗體及彼等之任何組合。於一特定之實施態樣中，該抗原結合分子包含抗體。[10]
於各種實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈(HC)且於一些實施態樣中，該HC包含選自由下列所組成之群組的重鏈可變區(VH)序列:SEQ ID NO:5和17。於其他實施態樣中，該重鏈可變區(VH)包含下列之一或多者:(a)CDR1、(b)CDR2及(c)CDR3。於一些實施態樣中，該抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的重鏈CDR1:SEQ ID NO:7和19；於其他實施態樣中，該抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的重鏈CDR2:SEQ ID NO:8和20，再於其他實施態樣中，該抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的重鏈CDR3:SEQ ID NO:9和21。於各種實施態樣中，抗原結合分子包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，各CDR包含第6和8圖中所示之胺基酸序列，且於進一步之實施態樣中，抗原結合分子包含VH胺基酸序列，該VH胺基酸序列與本文所提供之抗原結合分子(例如在所附之序列表及第6和8圖中者)的VH具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。[11]
於各種實施態樣中，該抗原結合分子包含輕鏈(LC)且於一些實施態樣中，該LC包含選自由下列所組成之群組的輕鏈可變區(VL)序列:SEQ ID NO:11和23。於其他實施態樣中，該輕鏈可變區(VL)包含下列之一或多者:(a)CDR1、(b)CDR2及(c)CDR3。於一些實施態樣中，該抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的輕鏈CDR1:SEQ ID NO:13和25；於其他實施態樣中，該抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的輕鏈CDR2:SEQ ID NO:14和26，再於其他實施態樣中，該抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的輕鏈CDR3:SEQ ID NO:15和27。於各種實施態樣中，抗原結合分子包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，各CDR包含第6和8圖中所示之胺基酸序列且於進一步之實施態樣中，抗原結合分子包含VL胺基酸序列，該VL胺基酸序列與本文所提供之抗原結合分子(例如在所附之序列表及第6和8圖中者)的VL具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。[12]
於一特定之實施態樣中，該抗原結合分子包含:(a)VH，其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及(b)VL，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。於進一步之特定的實施態樣中，該抗原結合分子包含: (a)(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列； (a)(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列； (a)(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列； (a)(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列； (a)(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；及 (a)(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。[13]
於一特定之實施態樣中，該抗原結合分子包含: (a)(a)VH，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及(b)VL，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。於進一步之特定實施態樣中，該抗原結合分子包含: (a)(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列； (a)(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列； (a)(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列； (a)(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列； (a)(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列；及 (a)(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列。[14]
於一些實施態樣中，本文提供之抗原結合分子進一步包含可檢測之標記，該可檢測之標記係選自由下列所組成之群組:螢光標記、光致變色化合物、蛋白質螢光標記、磁性標記、放射性標記及半抗原(hapten)。於一特定之實施態樣中，該可檢測標記包含螢光標記且係係選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素(coumarin)、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍(Cascade Blue)、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(R-Phycoerythrin)(PE)、PE-Cy5軛合物、PE-Cy7軛合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明(Rhodamine)、麗絲胺羅丹明B(Lissamine Rhodamine B)、德克薩斯紅(Texas Red)、別藻藍蛋白(Allophycocyanin)(APC)、APC-Cy7軛合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦(Azurite)、GFPuv、T-藍寶石(T-Sapphire)、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll) (PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。[15]
本發明亦提供包含該抗原結合分子之組成物、編碼該抗原結合分子之重鏈的多核苷酸及編碼該抗原結合分子之輕鏈的多核苷酸。xxxxx包含該多核苷酸之載體和包含該等載體之細胞形成本發明之另外的態樣。In various embodiments , a cell can be selected from the group consisting of a CHO cell, a Sp2/0 cell, a rabbit cell other mammalian cells, yeast cells, or bacterial cells, such as anE. coli cell.於各種實施態樣中，細胞可選自由下列所組成之群組:CHO細胞、Sp2/0細胞、兔子細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞或細菌細胞，諸如大腸桿菌細胞。本發明亦提供製造本文所揭示之抗原結合分子的方法，該方法可包含在合適之條件下培育該細胞。[16]
於另一態樣中，提供投予個體藥物劑量之方法，該劑量包含預選定數量之細胞，該細胞呈現治療性分子，該治療性分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於一實施態樣中，該方法包含:(a)提供已知體積之樣品，該樣品包含含有已知數目之細胞的群體，該細胞群已知或被懷疑將表現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之治療性分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)；(b)提供該樣品之等分試樣，該樣品包含細胞群，該細胞群呈現包含該選定之胺基酸序列之分子；(c)提供抗原結合分子，該抗原結合分子特異性結合該選定之胺基酸序列且包含可檢測之標記；(d)令(b)之等分試樣與(c)之抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含存在於該樣品中之細胞和抗原結合分子；(e)測定在該等分試樣中存在於(d)之結合複合物中之細胞的級分；(f)基於(e)所測定之細胞級分，測定該樣品中呈現包含該選定之胺基酸序列之分子的細胞之濃度；(g)測定該包含該選定之細胞數之樣品的體積；及(h)投予該個體(g)中所測定之樣品體積。[17]
於一些實施態樣中，(a)該治療性分子為CAR；且(b)該細胞為選自由下列所組成之群組的免疫細胞:CD8+T細胞、CD4+T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞及NK-T細胞。於特定之實施態樣中，the CAR comprises a molecule, or a fragment thereof, selected from the group consisting of CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8 α , CD8 β , CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain), CD79B (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、 CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、 CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、 CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158a (KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、 CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、 GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。於一些實施態樣中，該免疫細胞為T細胞，該T細胞可被配置在玻管內或活體內，且可在血液、萃取之組織、體外生長之組織及細胞培養基其中一者內。T細胞可為自體T細胞或同種異體T細胞。於一些實施態樣中，該劑量包含0.5×106 細胞/公斤個體、1.0×106 細胞/公斤個體、2.0×106 細胞/公斤個體、3.0×106 細胞/公斤個體、4.0×106 細胞/公斤個體、或5.0×106 細胞/公斤個體。於一特定之實施態樣中，該劑量包含1.0×106 細胞/kg。於其他實施態樣中，該可檢測之標記係選自由下列所組成之群組:螢光標記、光致變色化合物、蛋白質螢光標記、磁性標記、放射性標記及半抗原。當該可檢測標記為螢光標記時，該螢光標記可選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5軛合物、PE-Cy7軛合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7軛合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2 (“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate (TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。[18]
於另一態樣中，提供活化免疫細胞之方法，該免疫細胞表現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。於一實施態樣中，該方法包含(a)提供包含免疫細胞之樣品，該免疫細胞已知或被懷疑將表現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、 GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)；和(b)令抗原結合分子與樣品在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含抗原結合分子及二個包含該選定之胺基酸序列的分子，其中該包含該選定之胺基酸序列的分子係配置在二個不同之免疫細胞上。[19]
於一些實施態樣中，該免疫細胞係選自由下列所組成之群組:CD8+T細胞、CD4+T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞及NK-T細胞。於特定之實施態樣中，the molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) and KPGSG (SEQ ID NO: 500) is a CAR.該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子為CAR:GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG (SEQ ID NO:500)。於進一步之實施態樣中，該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、 CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、 CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、 CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。於一些實施態樣中，該免疫細胞為T細胞，該T細胞可配置在玻管內或活體內，且可在血液、萃取之組織、體外生長之組織及細胞培養基其中一者內AT cell can be an autologous T cell or an allogenic T cell.。該T細胞可為自體T細胞或同種異體T細胞。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。[20]
於另一態樣中，提供測定樣品中呈現分子之細胞數之方法，其中該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於一實施態樣中，該方法包含(a)提供包含細胞之樣品，該細胞已知或被懷疑將呈現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)；(b)令(a)之樣品與特異性結合該選定之胺基酸序列且包含可檢測之標記的抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含存在於該樣品中之細胞和該抗原結合分子；及(c)測定該樣品中存在於(b)之結合複合物中的細胞數。[21]
於一些實施態樣中，該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子為CAR: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於特定之實施態樣中，the CAR comprises a molecule, or a fragment thereof, selected from the group consisting of CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8 α , CD8 β , CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain), CD79B (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、 CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、 CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、 CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。In other embodiments , the cells are immune cells selected from the group consisting of CD8+ T cells, CD4+ T cells, tumor infiltrating lymphocytes (TILs), NK cells, TCR-expressing cells, dendritic cells, and NK-T cells.於其他實施態樣中，該細胞為選自由下列所組成之群組的免疫細胞:CD8+T細胞、CD4+T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞及NK-T細胞。於一些實施態樣中，該細胞為T細胞，該T細胞係配置在玻管內或活體內，且可在血液、萃取之組織、體外生長之組織及細胞培養基其中一者內AT cell can be an autologous T cell or an allogenic T cell.。該T細胞可為自體T細胞或同種異體T細胞。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。[22]
於另一態樣中，提供分離分子之方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。該分子可在N端、C端、結構域之間、環中或分子中任何可能會或可能不會破壞該結構的地方包含該選定之胺基酸。於一實施態樣中，該方法包含:(a)提供樣品，該樣品已知或被懷疑包含分子，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)及KPGSG (SEQ ID NO:500)；(b)提供特異性結合該選定之胺基酸序列的抗原結合分子，該抗原結合分子可選擇地包含可檢測之標記；(c)令該樣品與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含:包含該選定之胺基酸序列的分子和該抗原結合分子；和(d)令任何非結合複合物之一部分的分子與形成之結合複合物分開；及(e)令形成之結合複合物分成:(1)包含該選定之胺基酸序列的分子；和(2)抗原結合分子。[23]
於一些實施態樣中，該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子為CAR: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於特定之實施態樣中，the CAR comprises a molecule, or a fragment thereof, selected from the group consisting of CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8 α , CD8 β , CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain), CD79B (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、 CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、 CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、 CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、 CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、 CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。In other embodiments , the cells are immune cells selected from the group consisting of CD8+ T cells, CD4+ T cells, tumor infiltrating lymphocytes (TILs), NK cells, TCR-expressing cells, dendritic cells, and NK-T cells.於其他實施態樣中，該抗原結合分子被配置在選自由下列所組成之群組的表面上:瓊脂糖珠、磁珠、塑膠孔槽盤、玻璃孔槽盤、陶瓷孔槽盤及細胞培養袋。In other embodiments , the detectable label is selected from the group consisting of a fluorescent label, a photochromic compound, a proteinaceous fluorescent label, a magnetic label, a radiolabel, and a hapten.於其他實施態樣中，該可檢測之標記係選自由下列所組成之群組:螢光標記、光致變色化合物、蛋白質螢光標記、磁性標記、放射性標記及半抗原。當該可檢測之標記為螢光標記時，該螢光標記可選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5軛合物、PE-Cy7軛合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7軛合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。[24]
於進一步之態樣中，提供測定是否存有包含選自由下列所組成之群組之胺基酸序列的分子之方法:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於實施態樣中，該方法包含:(a)提供已知或被懷疑包含分子之樣品，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)；(b)提供特異性結合該選定之胺基酸序列的抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含可檢測之標記；(c) contacting the sample with the antigen binding molecule under conditions that permit the formation of a binding complex;(c)令該樣品與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸；(d)令任何非結合複合物之一部分的分子與形成之結合複合物分開；及(e)檢測是否存有結合複合物。
於實施態樣中，該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子為CAR:GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、 GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於進一步之實施態樣中，該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。於其他實施態樣中，該抗原結合分子被配置在選自由下列所組成之群組的表面上:瓊脂糖珠、磁珠、塑膠孔槽盤、玻璃孔槽盤、陶瓷孔槽盤及細胞培養袋。In other embodiments , the detectable label is selected from the group consisting of a fluorescent label, a photochromic compound, a proteinaceous fluorescent label, a magnetic label, a radiolabel, and a hapten.於其他實施態樣中，該可檢測之標記係選自由下列所組成之群組:螢光標記、光致變色化合物、蛋白質螢光標記、磁性標記、放射性標記及半抗原。當該可檢測之標記為螢光標記時，該螢光標記可選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5軛合物、PE-Cy7軛合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7軛合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP (Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP (Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP (S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。
本發明亦提供增加呈現分子之細胞的濃度之方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於一些實施態樣中，該方法包含:(a)提供包含已知或被懷疑包含分子之細胞的樣品，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)；(b)提供特異性結合該選定之胺基酸序列且可選擇地包含可檢測之標記的抗原結合分子；(c)令該樣品與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含:包含該選定之胺基酸序列之分子及該抗原結合分子；(d)移除任何非結合複合物之一部分的組分；及(e)重複期望次數之步驟(a)至(d)。
於實施態樣中，(a)該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子為CAR: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)；且(b)該細胞為選自由下列所組成之群組的免疫細胞:CD8+T細胞、CD4+T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞及NK-T細胞。於進一步之實施態樣中，該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、 CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。於一些實施態樣中，該細胞為T細胞，其可被配置在玻管內或活體內，且可在血液、萃取之組織、體外生長之組織及細胞培養基其中一者內。該T細胞丐為自體T細胞或同種異體T細胞。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。
再於進一步之態樣中，提供減除呈現分子之細胞群(例如免疫細胞)的方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG (SEQ ID NO:500)。於實施態樣中，該方法包含:(a)提供欲減除之免疫細胞群，其中該免疫細胞已知或被懷疑將表現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)；及(b)令該免疫細胞與特異性結合下列(a)和(b)之抗原結合分子在允許形成三元結合複合物之條件下接觸:(a)包含該選定之胺基酸序列的分子和(b)呈現在該免疫細胞表面上之不包含該選定之胺基酸序列的活化分子，該三元結合複合物包含:該包含該選定之胺基酸序列的分子、該活化分子及該抗原結合分子。
於特定之實施態樣中，該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子為CAR: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於進一步之實施態樣中，the CAR comprises a molecule, or a fragment thereof, selected from the group consisting of CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8 α , CD8 β , CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain), CD79B (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain), CD84 (SLAMF5), CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD該CAR包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、 CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、 CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。於一些實施態樣中，該免疫細胞為T細胞，其可被配置在玻管內或活體內，且可在血液、萃取之組織、體外生長之組織及細胞培養基其中一者內。T細胞可為自體T細胞或同種異體T細胞。再於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子為人化抗原結合分子。[30]
於一態樣中，本發明提供監控呈現分子之細胞群在活體內之分佈的方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。於一些實施態樣中，該細胞群為CAR細胞。於一些實施態樣中，本發明提供監控呈現分子之細胞群在活體內之分佈的方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)，該方法包含下列步驟:提供抗原結合分子；和進行正子發射電腦斷層(positron emission tomography)(PET)掃描。於一些實施態樣中，提供抗原結合分子以在活體內刺激或減除CAR T細胞。
發明之詳細描述
本發明關於特異性結合包含序列 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之部分的抗原結合分子(包括抗體)及該抗原結合分子之人化形式、包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子、呈現該等分子之細胞、編碼該分子之多核苷酸和包含該多核苷酸之載體；本發明亦揭示包含該多核苷酸和載體之玻管內細胞。
本發明提供使用本發明之抗原結合分子的方法。本文所描述之抗原結合分子、多核苷酸、載體、玻管內細胞和方法可用於一系列之應用中，例如作為試劑以檢測是否存有包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之分子和呈現該等分子之細胞、定量包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞的量、篩選包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞、純化包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞及聚焦在包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞的生物標記物研究。本發明亦提供治療用途，例如調節(增強或抑制)包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞的生物活性之應用以及與包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞的治療劑相關之劑量範圍的研究。
本發明揭示之抗原結合分子(抗體)係從雜交瘤產生，該雜交瘤係使用源自兔子之B細胞產生，但可使用本技藝之技術熟習人士已知之標準方法和本文所描述之方法輕易地人化。本文中提供該揭示之抗原結合分子之代表性人化形式。 I. I.Definitions 定義
為了使本發明可更容易地理解，首先定義某些術語。除非本文中另有明確說明，如本申請案中所使用之下列各術語應具有下文中所闡明之含義。另外之定義闡述於本申請案之全文中。本文所提供之標題並非用來限制本揭示內容之各種態樣，該等態樣可藉由整體參考本專利說明書來理解。
應理解的是，每當本文中以語言“包含”描述態樣時，亦提供依據“由......組成”及/或“基本上由......組成”描述之其他類似態樣。
本文所使用之單位、前置代號和符號係使用其國際單位制(SI)接受之形式提供。數值範圍包括界定該範圍之數目。
除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明相關之技藝中的一般技術人士所通常理解者相同的含義。例如Juo, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology，第2版(2001)，CRC出版社；The Dictionary of Cell & Molecular Biology，第5版(2013)，Academic出版社；及The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Cammack et al. eds.，第2版(2006)，牛津大學出版社提供本技藝中之技術熟習人士本發明所使用之許多術語的一般字典。
如本文所使用者，該二十種習知(例如天然產生的)胺基酸及彼等之縮寫係遵循常規用法。參見， 例如Immunology-A Synthesis(第2版), Golub and Green, eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass.(1991)，該篇以引用方式併入本文以用於任何目的。該二十種習知胺基酸之立體異構物(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸，諸如α-,α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知之胺基酸亦可為本發明多肽之合適組分。非習知胺基酸之實例包括:4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似之胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文所使用之多肽表示法中，根據標準用法和慣例，左手方向為胺基端方向而右手方向為羧基端方向。
除非上下文另有規定，如本文所使用之術語“一(a和an)”係依循標準慣例使用且意指一或多項。
如本文所使用之術語“約”係指在由本技藝之一般技術人士測定之特定數值或組成之可接受的誤差範圍內的數值或組成，其將部分取決於該數值或組成是如何測量或測定的，即，該測量系統之限制。例如，“約”或“基本上由…組成”可意指依照本技藝實行在一或一個以上之標準偏差內。或者，“約”或“基本上由…組成”可意指在高達10%之範圍內(即±10%)。例如約5mg可包括介於4.5mg至5.5mg之間的任何數值。再者，尤其當與生物系統或處理程序相關時，該術語可指至多一個數量級或至多為數值之5倍。除非另有說明，當本發明中提供特定之數值或組成時，“約”或“基本上由…組成”的含義應當被假定為在該特定數值或組成之可接受的誤差範圍內。
除非另外指明，如本文所描述之任何濃度範圍、百分比範圍、比例範圍或整數範圍應被理解為包括在該列舉之範圍內的任何整數之數值，且當適當時，包括該整數之分數(諸如整數的十分之一和百分之一)。
如本文所使用之術語“及/或”被認為係具體揭示該二個指定之特性或組分的各個特性或組分，加上或不加上另一特性或組分。因此，本文之短語，諸如“A及/或B”中所使用的術語“及/或”意圖包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨)和“B ”(單獨)。同樣地，短語，諸如“A、B及/或C”中所使用之術語“及/或”意圖包含下列各態樣:A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。
如本文所使用者，使用二中擇一之術語(例如“或”)，應被理解為意指該可供選擇之選項的其中一者、二者或彼等之任何組合。
如本文所使用之術語“同種異體” 係指源自一個個體，再被引入相同物種之另一個體的任何物質，例如同種異體T細胞移植。
如本文所使用之術語“抗體”(Ab)包括，但不限於特異性結合抗原之糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗體可包含藉由二硫鍵交互連接之至少二條重(HC)鏈和二條輕(LC)鏈，或其抗原結合分子。各HC鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恆定區。該重鏈恆定區包含三個恆定結構域，CH1、CH2和CH3。各LC鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區包含一個恆定結構域，CL。該VH和VL區可進一步細分為高可變區，稱為互補決定區(CDR)，各區之間穿插較被保留之區，稱為框架區(FR)。各VH和VL包含三個CDR和四個FR，從胺基端至羧基端依下列順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)和典型補體系統(體C1q)之第一組分結合。
除非另外指明，術語“抗體”亦包含完整之免疫球蛋白或其抗原結合部分，該抗原結合部分與完整抗體競爭特異性結合。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學裂解完整抗體來製備。抗原結合部分包括，尤其是Fab、Fab’、F(ab’)2 、 Fv、結構域抗體(dAb)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及含有至少一部分之免疫球蛋白的多肽，該至少一部分之免疫球蛋白足以提供該多肽特異性抗原結合。
術語“抗體”同時包括天然存在和非天然存在(重組產生)之抗體、人類和非人類抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、免疫球蛋白、合成之抗體、包含二條重鏈和二條輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體(參見、例如Stocks,(2004)Drug Discovery Today 9(22):960-66)、抗體融合物(該術語包含抗體-藥物軛合物且其在本文中有時稱為“抗體軛合物”)、異源軛合抗體、單結構域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fvs(scFv)、駱駝化抗體、親和體(affybody)、Fab片段、F(ab’)2 片段、二硫鍵連接之Fvs(sdFv)、抗獨特型(抗Id)抗體(包括、例如抗-抗-Id抗體)、微型抗體(微型抗體)、結構域抗體、合成之抗體(本文中有時稱為“抗體模擬物”)及彼等之抗原結合片段。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體係指多株抗體群。
如本文中所揭示之與特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列(特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500))、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞的抗體相關之非人抗體可使用重組方法人化以降低其在人體中之免疫原性。本文中提供人化抗體之實例。當未明確說明時，除非上下文另有說明，術語“抗體”亦包括上述任何免疫球蛋白之抗原結合分子的抗原結合片段且包括單價和二價片段或部分，及單鏈抗體(即，scFv)。
於各種實施態樣中，抗體特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞。於一些實施態樣中，該抗體特異性結合包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之CAR(或其組分)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞；呈現SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之細胞可為，但不必為免疫細胞，諸如T細胞。
如本文所使用之術語“抗原”意指引發免疫反應或能與抗體或其他抗原結合分子結合之任何分子。該免疫反應可涉及抗體產生或活化特異性免疫活性細胞或此二者。本技藝之技術熟習人士將可輕易地理解:任何大分子，包括幾乎所有蛋白質或肽(包括SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞)可作為抗原。通常，抗原可內源表現，即，由基因組DNA表現，或者其可重組表現，或者其可經化學合成。於一特定之實施態樣中，抗原包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或一部分、包含這些序列之分子，該抗原可選擇地與佐劑(諸如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH))軛合。
如本文所使用之術語“抗原結合分子”意指一種蛋白，其包含與抗原或靶蛋白結合之部分，及可選擇地，允許該抗原結合部分採用促進該抗原結合分子與抗原結合之構型的支架或框架部分。該抗原結合分子之代表性類型的實例包括scFv、人、小鼠或兔子抗體；人化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；雙功能抗體；三鏈抗體；四鏈抗體；Fab片段；F(ab’)2片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體及彼等之片段。
抗原結合分子可包含，例如替代之蛋白質支架或具有移植之互補決定區(CDR)或CDR衍生物的人工支架。該等支架包括，但不限於源自抗體之支架，其包含被引入之突變以，例如穩定該抗原結合分子之三維結構及包含，例如生物相容之聚合物的全合成支架。參見，例如Korndorfer et al., 2003,Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics , 53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol. Prog. 20:639-654(2004)。此外，可使用肽抗體模擬物(“PAMs”)及基於抗體模擬物之支架(其利用各種組分，例如纖連蛋白作為支架)。抗原結合分子可具有，例如天然存在之免疫球蛋白的結構。
抗原結合分子可具有一或多個結合位點。若其中具有一個以上之結合位點，該結合位點可彼此完全相同，亦可不同。例如天然存在之人免疫球蛋白通常具有二個完全相同之結合位點，而“雙特異性”或“雙功能”抗體具有二個不同之結合位點且能特異性結合二個不同的抗原(例如SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500和細胞表面活化分子)。
於各種實施態樣中，抗原結合分子為抗體或其片段，包括本文所揭示及顯示於第6和8圖中之一或多個互補決定區(CDR)，該互補決定區(CDR)特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之分子和呈現該等分子之細胞。於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子與包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之CAR結合且可表現在免疫細胞(諸如T細胞)上。
術語“自體”係指源自與其稍後被重新引入之個體為同一個體的任何物質。例如，本文所描述之經工程處理之自體細胞療法(eACTTM )的方法涉及從患者收集淋巴細胞，然後將其經工程處理以表現構建體(例如CAR構建體)，然後再投予回同一患者。
如本文所使用之術語“結合親和力”係指介於分子(例如抗原結合分子，諸如抗體)之單一結合位點與其結合伴侶(例如抗原)之間的非共價交互作用之總和強度。除非另外指明，如本文所使用之“結合親和力”係指內在結合親和力，其反映結合對之成員(例如抗體和抗原)之間的1:1交互作用。分子X對其伴侶Y之親和力通常可由解離常數(KD )表示。親和力可以本技藝已知之多種方式測量及/或表現，包括，但不限於平衡解離常數(KD )及平衡結合常數(KA )。KD 係從koff /kon 之商數計算得到，而KA 係從kon /koff 之商數計算得到。kon 係指，例如抗體與抗原之結合速率常數，而koff 係指，例如抗體與抗原之解離速率。該kon 和koff 可藉由本技藝之一般技術人士已知之標準技術，諸如BIAcore®或KinExA或表面等離子體共振測定。
如本文所使用之術語“互補決定區”或“CDR”意指有助於抗原結合特異性和親和力之胺基酸序列。框架區可協助維持CDR之正確確認以促進抗原結合分子與抗原之間的結合。重鏈和輕鏈之各個可變區中存有3個CDR，各可變區中之CDR被命名為CDR1、CDR2和CDR3。CDR之確切邊界已根據不同系統被不同定義。
常用之CDR定義有多種:Kabat編號、Chothia編號、AbM編號或接觸編號。AbM定義為Kabat和Chothia系統之間的折衷且為Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體所用。
該由Kabat描述之系統(Kabatet al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987)and(1991))提供適用於抗體之任何可變區的殘基編號系統，亦提供界定該3個CDR之精確殘基邊界。
Chothia和同事(Chothia and Lesk,(1987)J. Mol. Biol. , 196:901-917；及Chothiaet al. ,(1989)Nature , 342: 877-883)發現Kabat CDR內的某些亞部分採取幾乎相同的肽主鏈構象，儘管在胺基酸序列之層級具有很大的差異性。Chothia CDR具有與Kabat CDR重疊之邊界。其他界定與Kabat CDR重疊之CDR的邊界已由Padlan等人((1995)FASEB J. , 9:133-139)和MacCallum等人((1996)J. Mol. Biol. , 262(5):732-745)描述。還有其他CDR邊界定義可能未嚴格遵循已描述之系統其中一者，但仍將與Kabat CDR重疊，雖然它們可能鑑於預測或實驗發現特定之殘基或殘基群，甚至整個CDR並不會顯著影響抗原結合而縮短或延長。本文所使用之方法可利用根據這些系統任一者所定義之CDR，雖然示例性實施態樣係使用 Chothia 定義之CDR。
表A使用各編號系統定義CDR。接觸定義係基於對可用之複合物晶體結構的分析。
Figure 02_image001
術語“Kabat編號”及類似術語為本技藝所認可且係指將抗體或其抗原結合分子之重鏈和輕鏈可變區中之胺基酸殘基編號的系統。於某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統決定(參見，例如Kabatet al. 在Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD 1991)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35(其可在35之後可選擇性地包括一或二個額外之胺基酸，在Kabat編號方案中稱為35A和35B)(CDR1)、胺基酸位置50至65(CDR2)及胺基酸位置95至102(CDR3)。使用該Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常出現在胺基酸位置24至34(CDR1)、胺基酸位置50至56(CDR2)及胺基酸位置89至97(CDR3)。於一特定之實施態樣中，本文所描述之抗體的CDR可根據Kabat編號方案描述，儘管它們可使用表A之其他編號而輕易地推斷。
於某些In another embodiment, the invention is directed to an isolated polynucleotide encoding an antibody or an antigen binding molecule thereof that specifically binds to BCMA, wherein the antibody or the antigen binding molecule thereof comprises: (a) a heavy chain variable region (VH) complementarity determining region (CDR) 1 comprising, consisting of, or consisting essentially of the amino acid sequence GX2 X3 X4 X5 X6 X7 SY (SEQ ID NO: 145), wherein: X2 is not present or G;      態樣中，可根據Chothia編號方案決定抗體之CDR，該Chothia編號方案係指免疫球蛋白結構環之位置(參見，例如Chothia C & Lesk AM,(1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani Bet al., (1997)J Mol Biol 273: 927-948；Chothia Cet al., (1992)J Mol Biol 227: 799-817；Tramontano Aet al., (1990)J Mol Biol 215(1): 175-82；及美國專利案第7,709,226號)。通常，當使用Kabat編號規則時，該Chothia CDR-H1環係存在於重鏈胺基酸26至32、33或34，該Chothia CDR-H2環係存在於重鏈胺基酸52至56，且該Chothia CDR-H3環係存在於重鏈胺基酸95至102，而Chothia CDR-L1環係存在於輕鏈胺基酸24至34，該Chothia CDR-L2環係存在於輕鏈胺基酸50至56，且該Chothia CDR-L3環係存在於輕鏈胺基酸89至97。當使用Kabat編號規則進行編號時，該Chothia CDR-HI環之終端根據環之長度而在H32與H34之間變化(這是因為Kabat編號方案將插入子放在H35A及H35B；若35A和35B都不存在，則該環結束於32；若僅有35A存在，則該環結束於33；若35A和35B同時存在，則該環結束於34)。參見表A。於一特定之實施態樣中，本發明所描述之抗體的CDR已根據Chothia編號方案決定，如第6和8圖所示。
如本文所使用之“保守性胺基酸取代”為其中該胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。本技藝中已定義具有側鏈之胺基酸殘基之家族。這些家族包括具有下列側鏈之胺基酸:鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如甘胺酸、天門冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-分支之側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。於某些實施態樣中，在本文所提供之抗體或抗原結合分子(或其片段)之CDR內或框架區內之一或多個胺基酸殘基可被具有類似側鏈之胺基酸殘基替代。
本發明所涵蓋之保守性胺基酸取代可包含非天然存在之胺基酸殘基，該非天然存在之胺基酸殘基通常係藉由化學肽合成法併入，而非在生物系統中合成。這些包括肽模擬物及其他反轉或倒置形式之胺基酸部分。天然存在之殘基可根據共同之側鏈性質來區分類別: 疏水性的:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； 中性親水性的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； 酸性的:Asp、Glu； 鹼性的:His、Lys、Arg； 影響鏈方向之殘基:Gly、Pro；及 芳香族的:Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代可能涉及將這些類別之一的成員與來自另一類別之成員交換。該等經取代之殘基可被引入，例如與非人抗體同源之人抗體的區域中，或引入該分子之非同源區。示例性之保守性胺基酸取代闡述於下列表B中。
Figure 02_image003
如本文所使用之術語“恆定區”和“恆定結構域”可互換且具有本技藝中常用之含義。該恆定區為抗體之部分(例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分)，其不直接參與抗體與抗原之結合，但可顯示出各種不同之效應子功能(諸如與Fc受體交互作用)。相對於免疫球蛋白可變結構域，免疫球蛋白分子之恆定區通常具有較被保留之胺基酸序列。
如本文所使用之術語“交叉競爭”係指其中抗原與第一抗原結合分子或其結合片段之間的交互作用阻斷、限制、抑制或以其他方式降低參考抗原結合分子或其結合片段與抗原交互作用之能力的情況。交叉競爭可為完全的，例如結合分子與抗原之結合完全阻斷該參考結合分子與抗原結合之能力，或者交叉競爭可為部分的，例如該結合分子與抗原之結合降低該參考結合分子與抗原結合之能力。於某些實施態樣中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子係與該參考抗原結合分子結合至相同或重疊之抗原決定部位。於其他實施態樣中，該與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子係與該參考抗原結合分子結合至不同之抗原決定部位。多種類型之競爭性結合分析可用來測定一個抗原結合分子是否與另一分子競爭，該競爭性結合分析有，例如:固相直接或間接放射免疫分析(RIA)；固相直接或間接酶免疫分析(EIA)；夾心競爭分析(Stahliet al ., (1983)Method Enzymol 9:242-53)；固相直接生物素-親和素EIA(Kirklandet al ., (1986)J Immunol 137:3614-19)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I125 標記之固相直接標記RIA(Morelet al. , (1988)Molec Immunol 25:7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(Cheunget al ., (1990)Virology 176:546-52)；及直接標記之RIA(Moldenhaueret al ., (1990)Scand J Immunol 32:77-82)。
術語“衍生物”係指包含除了插入、缺失或取代胺基酸(或核酸)之外的化學修飾之分子。於某些實施態樣中，衍生物包含共價修飾，該共價修飾包括，但不限於與聚合物、脂質或其他有機或無機部分化學鍵結。於某些實施態樣中，經化學修飾之抗原結合分子(衍生物)可具有較未經化學修飾之抗原結合分子更長之循環半衰期。於一些實施態樣中，衍生之抗原結合分子係經共價修飾以包含一或多個水溶性聚合體連接物，該水溶性聚合體連接物包括，但不限於聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
如本文所使用之術語“雙功能抗體”或dAB意指包含二條多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包含藉由連接子連接之VH和VL結構域，該連接子太短以致於無法允許在同一鏈上的二個結構域之間形成配對，因而允許各結構域與另一多肽鏈上之互補結構域配對(參見，例如Holligeret al. ,(1993)Proc Natl Acad Sci U.S.A. 90:6444-48、Poljaket al. ,(1994)Structure 2: 1121-23和Perisicet al. ,(1994)Strucure 2(12): 1217-26)。若該雙功能抗體的二條多肽鏈完全相同，則由其配對所產生之雙功能抗體將具有二個完全相同之抗原結合位點。具有不同序列之多肽鏈可用來製造具有二個不同抗原結合位點之雙功能抗體。類似地，三鏈抗體和四鏈抗體分別為包含三條和四條多肽鏈之抗體，且分別形成三個和四個抗原結合位點，該抗原結合位點可為相同或不同。
如本文所使用之“抗原決定部位”為本技藝之術語且係指可與抗體特異性結合之抗原的局部區域。抗原決定部位可為，例如多肽之連續胺基酸(線性或連續抗原決定部位)或者抗原決定部位可，例如由來自二或更多個非連續之多肽區域集合在一起(構象的、非線性、不連續或非連續性抗原決定部位)。於某些實施態樣中，與抗體結合之抗原決定部位可藉由，例如NMR光譜法、X射線衍射結晶學研究、ELISA分析、與質譜分析(例如液相色層分析法、電噴霧質譜分析)聯用之氫/氘交換、基於陣列之寡肽掃描分析及/或誘變定位(例如定點誘變定位)。在X射線晶體學方面，結晶化可使用本技藝任何已知之方法完成(例如Giegeet al., (1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson, (1990)Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen, (1997)Structure 5: 1269-1274; McPherson, (1976)J Biol Chem 251: 6300-6303)。抗體:抗原晶體可使用為人周知之X射線衍射技術進行研究並可使用電腦軟體精修，諸如使用X-PLOR(Yale University, 1992, 由Molecular Simulations公司銷售；參見，例如Meth Enzymol (1985) 114 & 115冊, eds Wyckoffet al., )及BUSTER(Bricogne,(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne, (1997)Meth Enzymo l 276A: 361-423, ed. Carter；Roversiet al., (2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)。誘變定位研究可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何方法完成。參見，例如Champeet al., (1995)J Biol Chem 270: 1388-94及 Cunningham & Wells, (1989)Science 244: 1081-85之關於誘變技術之描述，包括丙胺酸和精胺酸掃描誘變技術。
如本文所用之術語“Fab片段”意指具有VL、VH、CL和CH結構域之單價片段；“F(ab’)2 片段”為二價片段，其具有二個藉由鉸鏈區之二硫橋連接之Fab片段；“Fv片段”具有抗體之單臂的VH和VL結構域；而“dAb片段”具有VH結構域、VL結構域或VH或VL結構域的抗原結合片段。
如本文所使用之術語“免疫特異性結合”、免疫特異性識別”、“特異性結合”和“特異性識別”為類似之術語且在抗原結合分子之背景下可互換使用且如本技藝之技術熟習人士所理解之該等結合，其意指指定之分子優先結合抗原(例如抗原決定部位或免疫複合物)。例如，特異性結合一種抗原之抗原結合分子可以相對較低之親和力與其他肽或多肽結合，此可藉由，例如免疫分析、BIAcore®、KinExA 3000儀器(Sapidyne儀器，Boise，ID)或本技藝中已知之其他分析測定。於一特定之實施態樣中，特異性結合一種抗原之分子係以至少2 log、2.5 log、3 log、4 log之KA 與該抗原結合或當該分子與另一抗原結合時則高於該KA 。
於另一實施態樣中，特異性結合一種抗原(例如GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)，GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)、及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子和呈現該等分子之細胞)的分子以約1×10-7 M之解離常數(Kd )與抗原結合。於一些實施態樣中，當該Kd 為約1×10-9 M至約5×10-9 M時，該抗原結合分子以“高親和力”特異性結合抗原(例如SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該序列之分子和呈現該等分子之細胞)。於一些實施態樣中，當該Kd 為約1×10-10 M至約5×10-10 M時，該抗原結合分子以“非常高之親和力”特異性結合抗原(例如SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該序列之分子和呈現該等分子之細胞)。
再於另一實施態樣中，該特異性結合抗原(例如SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞)之分子在類似之結合條件下不與其他蛋白質交叉反應。於另一特定之實施態樣中，該特異性結合抗原(例如SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞)之分子不與其他不包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之蛋白質、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞交叉反應。於特定之實施態樣中，本發明提供抗體或其片段，該抗體或其片段以較其與另一不相關之抗原結合之親和力為高的親和力與SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞結合。於某些實施態樣中，本發明提供抗原結合分子(例如抗體)或其片段，該抗原結合分子(例如抗體)或其片段以較其與另一不相關之抗原結合之親和力高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的親和力與SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞結合，該結合親和力係藉由，例如放射免疫分析、表面等離子體共振或動力學排除分析測量。於一特定之實施態樣中，與不包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之不相關蛋白質相比較，本文所描述之抗原結合分子、抗體或其抗原結合片段特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500、包含該等序列之分子和呈現該等分子之細胞的結合程度將少於該抗體與連接子片段蛋白之結合程度的10%、15%或20%，該結合親和力係藉由，例如放射免疫分析測量。
當相關於抗體使用時，如本文所使用之術語“重鏈”根據該恆定結構域之胺基酸序列可指任一不同類型，例如α、δ、ε、γ及μ，其分別導致抗體之IgA、IgD、IgE、IgG和IgM類別，包括IgG之子類別，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。
如本文所使用之術語“免疫球蛋白”係指來自任一眾所周知之同種型的免疫分子，包括，但不限於IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亞類亦為本技藝之技術人士所周知，包括，但不限於人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本文描述的許多分子為免疫球蛋白。如本文所使用之“同種型”意指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別或亞類(例如IgM或IgG1)。
免疫球蛋白為四聚體分子，通常由二對完全相同之多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50至70kDa)。每條鏈之胺基端部分包括具有約100至130或更多個胺基酸的可變區，其主要負責識別抗原。每條鏈之羧基端部分界定恆定區，其主要負責效應子功能。人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。重鏈被分類為μ、δ、γ、α或ε，且分別將抗體之同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。在輕透和重鏈之內，可變區和恆定區係藉由具有約12或更多個胺基酸之“J”區連接，該重鏈亦包括具有約10個以上之胺基酸的“D”區。大致上參見，Berzofsky & Berkower, Fundamental Immunology(Paul,(ed), Lippincott Williams & Wilkins(2012)；其章節和卷之全部內容以引用方式併入本文用於所有目的)。各輕/重鏈對之可變區形成該抗體結合位點，從而使完整免疫球蛋白具有二個主要的結合位點。
天然存在之免疫球蛋白鏈顯示出具有被相對保留之框架區(FR)的相同大致結構，該被相對保留之框架區係藉由三個高度可變區(亦稱為互補決定區或“CDR”)連接。從N端至C端，輕鏈和重鏈均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各結構域之胺基酸分配可根據Kabat之定義完成(參見，例如Kabatet al. , Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991))或Chothia(Chothia，本文所使用者(參見，例如Chothia & Lesk(1987),J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothiaet al. , 1989,Nature 342:878-883或Honegger & Pluckthun(2001),J Mol Biol 309:657-670)。Kabat、Chothia和AbM(牛津分子)編號系統在本文中有更完整的描述。
如本文所使用之術語“玻管內細胞”係指在體外培養之任何細胞。玻管內細胞可包括人類細胞，諸如T細胞或樹突細胞，或者其可包括CHO、sP2/0、兔子及其他非人類細胞。
當相關於抗體使用時，如本文所使用之術語“輕鏈”根據該恆定結構域之胺基酸序列可指任一不同類型，例如κ或λ。輕鏈胺基酸序列為本技藝所已知。於特定之實施態樣中，該輕鏈為人輕鏈。
術語“中和”係指與配體(例如，包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之部分)結合並防止或降低該配體之生物學效果的抗原結合分子、scFv、抗體或其片段。於一些實施態樣中，該抗原結合分子、scFv、抗體或其片段直接阻斷該配體上之結合位點或透過間接方式(諸如改變配體之結構或能量)改變配體之結合能力。於一些實施態樣中，該抗原結合分子、scFv、抗體或其片段防止與其結合之蛋白質執行生物功能。
如本文所使用之術語“患者”意指那些正接受治療異常生理狀況(諸如癌症)或已被正式診斷患有病症者、無被正式識別出之病症者、接受醫療護理者、處於發展出病症之風險中者，等。術語“個體”和“患者”在本文中可互換使用且同時包括人類和非人類動物個體。
如本文所使用之術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基所組成的化合物。多肽、蛋白質或肽必須含有至少二個胺基酸，但蛋白質或肽之胺基酸序列可包含之最多胺基酸數量沒有限制。如本文所使用者，該術語同時指短鏈(其通常亦稱為肽、寡肽和寡聚體)和較長之鏈(其通常稱為蛋白質)。“多肽”包括，例如生物活性片段、基本上同源之多肽、寡肽、二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白，等。術語“多肽”包括天然肽、重組肽、合成肽、或彼等之組合。
於In another embodiment, the invention is directed to an isolated polynucleotide encoding an antibody or an antigen binding molecule thereof that specifically binds to BCMA, wherein the antibody or the antigen binding molecule thereof comprises: (a) a heavy chain variable region (VH) complementarity determining region (CDR) 1 comprising, consisting of, or consisting essentially of the amino acid sequence GX2 X3 X4 X5 X6 X7 SY (SEQ ID NO: 145), wherein: X2 is not present or G;      一些態樣中，該多肽及/或蛋白質從抗原結合分子刪除、添加及/或取代一或多個胺基酸。有用之多肽片段可包括抗原結合分子之免疫功能性片段，包括，但不限於重鏈及/或輕鏈之一或多個CDR區、可變結構域、抗體鏈之其他部分的一部分，等。可被抗原結合分子之一或多個胺基酸替代的部分包括，例如D或L形式之胺基酸，與抗原結合分子之相同位置中通常發現之胺基酸不同的胺基酸(相對於在第6和8圖中所提供之序列，及其列出之SEQ ID NO)、胺基酸缺失、非天然存在之胺基酸及胺基酸之化學類似物。
肽類似物在製藥工業中常作為具有類似於模板肽之性質的非肽藥物且形成本發明一個態樣。這些類型之非肽化合物被稱為“肽模擬物”或“肽模擬物(peptidomimetic)”。參見，例如Fauchere,(1986)Adv. Drug Res. (Testa, ed.) 15:29-69；Veber & Freidinger,(1985)TINS , p.392；及Evanset al .,(1987)J. Med. Chem , 30:1229-39，這些文獻以引用方式併入本文以用於任何目的。
這些術語具體涵蓋包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之多肽、肽、蛋白質和類似分子、包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞。
如本文所使用之術語“百分比同一性” 意指在所比較之分子中的胺基酸或核苷酸之間的完全相同之殘基的百分比。在這些計算方面，比對中之間隙(若有的話)必須藉由特定之數學模型或電腦程式(即“演算法”)處理。可用於計算比對之核酸或多肽的同一性之方法包括那些描述於下列文獻中者:Computational Molecular Biology,(Lesk, ed.),(1988)New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith, ed.), 1993, New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data, Part I,(Griffin and Griffin, eds.), 1994, New Jersey: Humana Press；von Heinje,(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov and Devereux, eds.), 1991, New York: M. Stockton Press；及Carillo et al.,(1988)J. Applied Math. 48:1073。
為了計算同一性百分比，相比較之序列通常係以能使該序列之間產生最大匹配的方式對齊。可用於測定同一性百分比之電腦程式可為，例如MOE(Chemical Computing Group)或DNASTAR(威斯康辛大學，威斯康辛州Madison)。該電腦算法GAP可用於比對該二個欲測定序列同一性百分比之多肽或多核苷酸。比對該二個序列以使其各別胺基酸或核苷酸有最佳匹配(藉由該算法測定之“匹配之跨距”)。間隙開放懲罰(其計算值為3×平均對角線，其中該“平均對角線” 為所使用之比較矩陣的對角及物平均值；“對角線”為由特定比較矩陣分配給各完美胺基酸匹配的評分或數目)和間隙延伸懲罰(其通常為該間隙開放懲罰之1/10)，以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法一起使用。於某些實施態樣中，演算法亦使用標準比較矩陣(參見，例如Dayhoff et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix；Henikoff et al.,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)。
用於比對二個胺基酸序列的某些比對方案可導致僅二個序列之短區域匹配，且該小的比對區域可具有非常高之序列同一性，即使該二個全長序列之間沒有明顯的關係。因此，若需要時，可調整該選定之比對方法(例如GAP程式)以使比對能橫跨該靶的多肽之至少50個連續胺基酸。
如本文所使用之術語“單鏈抗體” 及“單鏈片段可變區(scFv)”可互換使用且意指其中VL和VH區係經由連接子連接以形成連續蛋白質鏈之抗原結合分子，其中該連接子足夠長以允許蛋白質鏈折疊回其自身，並形成單價抗原結合位點(參見，例如Birdet al. ,(1988)Science 242:423-26及Hustonet al. ,(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83(1988))。FMC63(Nicholsonet al. ,(1997)Mol. Immunol. 34:(16-17)1157-65)為scFv之一種具體實例且特異於CD19。
治療劑(例如包含SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之部分、包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞)之“ 治療有效量”、“有效劑量”、“有效量”或 “治療有效劑量”為當單獨使用該治療劑或將該治療劑與另一治療劑組合使用時可防止個體疾病發作或促進疾病消退的任何量，此可由疾病症狀之嚴重性降低、無疾病症狀期之頻率和期間增加或防止由於疾病折磨導致之損傷或殘疾證明。治療劑促進疾病消退之能力可使用技術熟習之從業人員已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人個體中評估、在用於預測在人體中之效力的動物模型系統中評估或經由在玻管內分析中分析該作用劑之活性評估。
術語“轉導”和“經轉導的”係指可憑藉用來將外源DNA經由病毒載體引入細胞的過程(參見Hartl and Jones(1997)Genetics: Principles and Analysis, 4th ed, Jones & Bartlett)。於一些實施態樣中，該載體為逆轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體(baculoviral vector)、埃巴病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多泡病毒載體(papovaviral vector)、牛痘病毒載體(vaccinia viral vector)、單純皰疹病毒載體(herpes simplex viral vector)、腺病毒相關載體(AAV)、慢病毒載體或彼等之任何組合。
本文所使用之術語“可變區”或“可變結構域”可互換使用且係指抗體之一部分，一般而言為輕或重鏈之一部分，通常在抗體之胺基端且包含重鏈中之約100至130個胺基酸和輕鏈中之約90至115個胺基酸，抗體序列之間的差異很大且用於特定抗體對特定抗原之結合及特異性中。序列中之變異性集中在那些稱為互補決定區(CDR)之區域，而在可變結構域中被更高度保留之區域稱為框架區(FR)。輕鏈和重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之交互作用和特異性。
於某些實施態樣中，該抗原結合分子之可變區為人可變區。於進一步之實施態樣中，該可變區包含囓齒動物、人或小鼠CDR及人框架區(FR)。於進一步之實施態樣中，該可變區為靈長類動物(例如非人類靈長類動物)可變區。再於進一步之實施態樣中，該可變區為兔可變區。於其他實施態樣中，該可變區包含人CDR和非人類(例如兔子、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物)框架區(FR)。於其他實施態樣中，該可變區包含非人類(例如兔子、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物)CDR和人類框架區(FR)。
術語“VH”、“VH結構域”和“VH鏈”可互換使用且係指抗原結合分子、抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區。
術語“VL​​”、“VL結構域”和“VL鏈”可互換使用且係指抗原結合分子、抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區。
本發明之各種態樣更詳細地描述於下列小節中。 II. II. 抗原結合分子和編碼彼等之多核苷酸
本發明針對抗原結合分子(包括抗體)，該抗原結合分子特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞，及/或與本文所描述之一或多個抗原結合分子(即，該描述於第6和第8圖中之一或多者及/或揭示於所附之序列表中者)交叉競爭的抗原結合分子。本發明亦提供編碼該抗原結合分子之多核苷酸，並形成本發明之態樣。
本發明之經編碼的抗體或抗原結合分子可為單鏈或雙鏈。於一些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子為單鏈。於某些實施態樣中，該抗原結合分子係選自由下列所組成之群組:scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2 、 dAb及彼等之任何組合。於一特定之實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含scFv。
於某些實施態樣中，抗原結合分子(諸如抗體)包含單鏈，其中該重鏈可變區和輕鏈可變區係藉由連接子連接(scFv)。於一些實施態樣中，該VH係位於該連接子之N端，而VL係位於該連接子之C端。於其他實施態樣中，該VL係位於該連接子之N端且該VH係位於該連接子之C端。於一些實施態樣中，該連接子包含至少約5、至少約8、至少約10、至少約13、至少約15、至少約18、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100個胺基酸。於一些實施態樣中，該連接子包含約8個胺基酸至約18個胺基酸(例如10個胺基酸)。
於一些實施態樣中，本發明之抗原結合分子特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、 GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞。於某些實施態樣中，本發明之抗原結合分子以小於1×10-6 M、小於1×10-7 M、小於1×10-8 M或小於1×10-9 M之KD 特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500，及包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞。於一特別之實施態樣中，抗原結合分子以小於1×10-7 M之KD 特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500，及包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞。於另一實施態樣中，抗原結合分子以小於1×10-8 M之KD 特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500，及包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞。於一些實施態樣中，抗原結合分子以約1×10-7 M、約2×10-7 M、約3×10-7 M、約4×10-7 M、約5×10-7 M、約6×10-7 M、約7×10-7 M、約8×10-7 M、約9×10-7 M、約1×10-8 M、約2×10-8 M、約3×10-8 M、約4×10-8 M、約5 ×10-8 M、約6×10-8 M、約7×10-8 M、約8×10-8 M、約9×10-8 M、約1×10-9 M、約2×10-9 M、約3×10-9 M、約4 ×10-9 M、約5×10-9 M、約6×10-9 M、約7×10-9 M、約8×10-9 M、約9×10-9 M、約1×10-10 M或約5×10-10 M之KD 與scFv FMC63，及包含該序列之分子和呈現該等分子之細胞結合。KD 可使用如本文所描述之標準方法計算。
於特定之實施態樣中，本發明之抗原結合分子為本文中鑑定為選殖株8或選殖株16之抗體，該選殖株8和選殖株16各自包含如下文中提供和標記之重鏈和輕鏈胺基酸、編碼、可變和CDR序列:
Figure 02_image005
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Figure 02_image009
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Figure 02_image015
於一實施態樣中，本發明之抗原結合分子為抗體及其抗原結合片段。於一實施態樣中，本發明之抗體包含至少一個第6和8圖中闡述之CDR。於另一態樣中，本發明提供如本文所描述和本技藝中已知之能夠產生本發明之抗體的雜交瘤及從雜交瘤產生抗體之方法。
本文描述人化抗體且可藉由已知技術製備。於一實施態樣中，人化之單株抗體包含小鼠或兔子抗體之可變結構域(或其抗原結合位點之全部或部分)和源自人抗體之恆定結構域。或者，人化抗體片段可包含源自人抗體之小鼠或兔子單株抗體之抗原結合位點及可變結構域片段(缺少抗原結合位點)。用於產生經工程處理之單株抗體的程序包括那些描述於下列文獻中者:Riechmannet al. ,(1988)Nature 332:323、Liuet al. ,(1987)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439、Larricket al. ,(1989)Bio/ Technology 7:934及Winteret al. ,(1993)TIPS 14:139。於一實施態樣中，該嵌合抗體為經移植CDR之抗體。用於人化抗體之技術討論於，例如下列文獻中:美國專利案第5,869,619；5,225,539；5,821,337；5,859,205；6881557號；Padlan et al.,(1995)FASEB J. 9:133-39；Tamura et al., (2000)J. Immunol . 164:1432-41；Zhanget al. ,(2005)Mol. Immunol. 42(12):1445-1451；Hwanget al. ,Methods . (2005)36(1):35-42；Dall’Acquaet al. ,(2005)Methods 36 (1):43-60；及Clark,(2000)Immunology Today 21(8):397-402。
本發明之抗原結合分子亦可為全長人單株抗體。全長人單株抗體可由本技藝之一般技術人士藉由任何數量之熟悉的技術產生。該等方法包括，但不限於:以埃巴病毒(EBV)轉化人外周血細胞(例如含有B淋巴細胞)在玻管內將人B細胞免疫化、融合來自經免疫化之轉基因小鼠的脾細胞，該經免疫化之轉基因小鼠攜帶插入之人免疫球蛋白基因、自人免疫球蛋白V區噬菌體集合庫中分離或其他如本技藝已知之程序及基於本揭示內容之程序。
用於在非人類動物中產生人單株抗體之程序已研發出。例如其中一或多個內源性免疫球蛋白基因已藉由各種方式去活化的小鼠已被製造出。人免疫球蛋白基因已被引入小鼠中以取代該經去活化之小鼠基因。在該技術中，人重鏈和輕鏈基因座之成分被引入小鼠品系中，該小鼠品系源自含有被靶向破壞之內源性重鏈和輕鏈基因座的胚胎幹細胞系(亦參見Bruggemannet al. ,(1997)Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58)。
用於產生和使用轉基因動物以產生人或部分人抗體之技術的實例描述於下列文獻中:美國專利案第5,814,318、5,569,825和5,545,806號；Daviset al. , Antibody Engineering: Methods and Protocols,(Lo, ed) Humana Press, NJ, 191-200(2003)；Kellermannet al. , (2002)Curr Opin Biotechnol. 13:593-97；Russelet al. , (2000)Infect Immun. 68:1820-26；Galloet al. ,(2000)Eur J. Immun. 30:534-40；Daviset al. ,(1999)Cancer Metastasis Rev . 18:421-25；Green,(1999)J Immunol Methods 231:11-23；Jakobovits,(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42；Greenet al. ,(1998)J Exp Med . 188:483-95；Jakobovits,(1998)Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14；Tsudaet al. ,(1997)Genomics, 42:413-21；Mendezet al. ,(1997)Nat. Genet. 15:146-56；Jakobovits,(1994)Curr Biol. 4:761-63；Arboneset al. ,(1994)Immunity 1:247-60；Greenet al. ,(1994)Nat. Genet. 7:13-21；Jakobovitset al. ,(1993)Nature 362:255-58；Jakobovitset al. ,(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:2551-55；Chenet al. ,(1993)Intl Immunol 5:647-656；Choiet al. ,(1993)Nature Genetics 4:117-23；Fishwildet al. ,(1996)Nature Biotechnology 14:845-51；Lonberget al. ,(1994)Nature 368: 856-59；Lonberg,(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101；Neuberger,(1996)Nature Biotech 14:826；Tayloret al. ,(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-95；Taylor et al.,(1994)Intl Immunol 6:579-91；Tomizukaet al. ,(1997)Nature Genetics 16:133-43；Tomizukaet al. ,(2000)Proc Nat Acad Sci USA 97:722-27；Tuaillonet al. ,(1993)Proc Nat Acad Sci USA 90:3720-24；Tuaillonet al. ,(1994)J Immunol 152:2912-20.；Lonberget al. ,(1994)Nature 368:856；Tayloret al. ,(1994)Intl Immunol 6:579；美國專利案第5,877,397號；Bruggemannet al. ,(1997)Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58；Jakobovitset al. ,(1995)Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35。
用於取得本發明之抗原結合分子的另一方法係使用噬菌體展示庫，該噬菌體展示庫係經完善建立以用於此目的。參見，例如Winteret al. ,(1994)Ann. Rev. Immunol. 12:433-55；Burtonet al. ,(1994)Adv. Immunol 57:191-280。人或小鼠免疫球蛋白可變區基因組合庫可在噬菌體載體中創建，其可經過篩選以選擇與scFv FMC63及包含該序列之分子和呈現該等分子之細胞結合的Ig片段(Fab、Fv、sFv或其多聚體)。參見，例如美國專利案第5,223,409號；Huseet al. ,(1989)Science 246:1275-81；Sastry et al.,(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32；Alting-Meeset al. ,(1990)Strategies in Molecular Biology 3:1-9；Kanget al. ,(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66；Hoogenboomet al. ,(1992)J. Mol. Biol. 227:381-388；Schlebuschet al. ,(1997)Hybridoma 16:47-52和其中引用之文獻。例如，可將含有多個編碼Ig可變區片段之多核苷酸序列的集合庫插入絲狀噬菌體(諸如M13或λ噬菌體(λImmunoZapTM (H)和λImmunoZapTM (L)載體(Stratagene，加州拉荷亞)或其變體亦可用於該方法中)的基因組中，與編碼噬菌體外套蛋白之序列同框。
簡單地說，從B細胞群分離出mRNA並用於在λImmunoZapTM (H)和λImmunoZapTM (L)和類似載體中創建重鏈和輕鏈免疫球蛋白cDNA表現集合庫。這些載體可經個別篩選或共同表現以形成Fab片段或抗體。隨後可將陽性噬斑轉化成非裂解質粒以允許來自大腸桿菌之單株抗體片段高度表現。
於一實施態樣中，使用核苷酸引物擴增在雜交瘤中表現所欲單株抗體之基因的可變區。這些引物可由本技藝之一般技術人士合成，或可從商業來源購得，該商業來源亦出售用於小鼠和人可變區之引物(包括，尤其是用於VH 、 VL 、CH 和 CL 區之引物)。該等引物可用於擴增重鏈或輕鏈可變區，然後這些重鏈或輕鏈可變區可再插入載體中。然後，這些載體可被引入用於表現之大腸桿菌、酵母或基於哺乳動物的系統中。使用這些方法可製造大量含有VH 和 VL 結構域之融合物的單鏈蛋白質。
一旦使用任何上述之免疫化和其他技術來取得本文提供之產生抗原結合分子的細胞，該特定抗體之基因可根據如本文所描述之標準程序藉由分離和擴增來自彼等之DNA或mRNA選殖。由此產生之抗體可經測序並鑑定CDR，編碼該CDR之DNA可依先前之描述操作以產生其他抗體。
本技藝之技術熟習人士將理解一些蛋白質(諸如抗體)可接受各種轉譯後修飾。這些修飾之類型和程度通常取決於用於表現該蛋白質之宿主細胞系及培養條件。該等修飾可包括糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天門冬胺酸異構化和天門冬醯胺脫醯胺中之變化。常見之修飾為由於羧肽酶之作用而損失羧基端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸)(如描述於，例如Harris,(1995)J Chromatog 705:129-34中者)。
用於產生小鼠單株抗體的另一種方法為將雜交瘤細胞注射入同基因小鼠(例如已經過處理之小鼠(例如經降植烷(pristane)致敏的))的腹膜腔中以促進形成含有該單株抗體之腹水。單株抗體可藉由各種完善建立之技術分離並純化。該等分離技術包括以蛋白A瓊脂糖凝膠進行之親和力層析、尺寸排阻層析和離子交換層析(參見，例如Baines and Thorpe,(1992)，Methods in Molecular Biology, 10:79-104(The Humana Press))。單株抗體可使用根據該抗體之特別性質(例如重鏈或輕鏈同種型、結合特異性，等)選擇之適當配體，藉由親和力層析法純化。固定在固體支撐上之合適配體的實例，包括蛋白A、蛋白G、抗恆定區(輕鏈或重鏈)抗體和抗獨特型抗體。
儘管該揭示之抗原結合分子係在兔子系統中產生，人、部分人或人化抗體可能適用於多種應用，特別是那些涉及投予人類個體該抗體者，其他類型之抗原結合分子將適合用於某些應用。該等抗體可依本文之描述製備並形成本發明之一種態樣。
本發明提供特異性結合下列群組之抗原結合分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞。與本發明之抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子形成本發明之另一態樣。
於某些實施態樣中，該抗原結合分子與包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之參考抗體交叉競爭:SEQ ID NO:5、11、17和23。於某些實施態樣中，該抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中該參考抗體包含VH CDR1，該VH CDR1包含SEQ ID NO:13或19之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中該參考抗體包含VH CDR2，該VH CDR2包含SEQ ID NO:14或20之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中該參考抗體包含VH CDR3，該VH CDR3包含SEQ ID NO:15或21之胺基酸序列。
於其他實施態樣中，該抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中該參考抗體包含VL CDR1，該VL CDR1包含SEQ ID NO:13或25之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中該參考抗體包含VL CDR2，該VL CDR2包含SEQ ID NO:14或26之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該抗原結合分子與參考抗體交叉競爭，其中該參考抗體包含VL CDR3，該VL CDR3包含SEQ ID NO:15或27之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500之抗體或抗原結合分子與本文揭示之參考抗體結合相同或重疊之抗原決定部位(例如那些含有第6和8圖中呈現之序列者)。於某些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子與參考抗體結合相同或重疊之抗原決定部位。 IIa. 選殖株 8
於一些實施態樣中，該特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR1，該VH CDR1包含胺基酸序列GFTISNL(SEQ ID NO:7)、由胺基酸序列GFTISNL (SEQ ID NO:7)所組成或基本上由胺基酸序列GFTISNL (SEQ ID NO:7)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR2，該VH CDR2包含胺基酸序列DIDGRGDIYCATWAK(SEQ ID NO:8)、由胺基酸序列DIDGRGDIYCATWAK(SEQ ID NO:8)所組成或基本上由胺基酸序列DIDGRGDIYCATWAK(SEQ ID NO:8)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR3，該VH CDR3包含胺基酸序列DGDGSGWGDFNF(SEQ ID NO:9)、由胺基酸序列DGDGSGWGDFNF(SEQ ID NO:9)所組成或基本上由胺基酸序列DGDGSGWGDFNF(SEQ ID NO:9)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含重鏈VH，該重鏈VH包含:(a)VH CDR1，其包含胺基酸序列GFTISNL(SEQ ID NO:7)、由胺基酸序列GFTISNL(SEQ ID NO:7)所組成或基本上由胺基酸序列GFTISNL(SEQ ID NO:7)所組成；及/或(b)VH CDR2，其包含胺基酸序列DIDGRGDIYCATWAK(SEQ ID NO:8)、由胺基酸序列DIDGRGDIYCATWAK(SEQ ID NO:8)所組成或基本上由胺基酸序列 DIDGRGDIYCATWAK(SEQ ID NO:8)所組成；及/或(c)VH CDR3，其包含胺基酸序列DGDGSGWGDFNF(SEQ ID NO:9)、由胺基酸序列DGDGSGWGDFNF(SEQ ID NO:9)所組成或基本上由胺基酸序列DGDGSGWGDFNF(SEQ ID NO:9)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3包含第6和8圖中所呈現之VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列的胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含重鏈可變區序列，該重鏈可變區序列包含第6和8圖之胺基酸序列(例如(SEQ ID NO:5))。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所描述之VH框架區(FR)。於特定之實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VH FR，該VH FR為如第6和8圖中所闡述者、或可源自第6和8圖中呈現之序列(例如在第6或8圖之一個序列中的一、二、三或四個FR)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所揭示之重鏈序列(例如第6圖中之SEQ ID NO:6)。於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。
於各種實施態樣中，該重鏈可變區與SEQ ID NO:5之重鏈可變區序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR1，該VL CDR1包含胺基酸序列QASQSISTALA(SEQ ID NO:13)、由胺基酸序列QASQSISTALA(SEQ ID NO:13)所組成或基本上由胺基酸序列QASQSISTALA(SEQ ID NO:13)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR2，該VL CDR2包含胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:14)、由胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:14)所組成或基本上由胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:14)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR3，該VL CDR3包含胺基酸序列QQGWSTVNVDNV(SEQ ID NO:15)、由胺基酸序列QQGWSTVNVDNV(SEQ ID NO:15)所組成或基本上由胺基酸序列QQGWSTVNVDNV(SEQ ID NO:15)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含輕鏈VL，該輕鏈VL包含:(a)VL CDR1，其包含胺基酸序列QASQSISTALA(SEQ ID NO:13)、由胺基酸序列QASQSISTALA(SEQ ID NO:13)所組成或基本上由胺基酸序列QASQSISTALA(SEQ ID NO:13)所組成；及/或(b)VL CDR2，其包含RASTLAS(SEQ ID NO:14)、由胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:14)所組成或基本上由胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:14)所組成；及/或(c)VL CDR3，其包含胺基酸序列 QQGWSTVNVDNV(SEQ ID NO:15)、由胺基酸序列QQGWSTVNVDNV(SEQ ID NO:15)所組成或基本上由胺基酸序列QQGWSTVNVDNV(SEQ ID NO:15)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中該VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含第6和8圖中呈現之VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含輕鏈可變區序列，該輕鏈可變區序列包含第6和8圖之胺基酸序列(例如SEQ ID NO:11)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所描述之VL框架區(FR)。於特定之實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VL FR，該VL FR為如第6和8圖中所闡述之序列、或源自第6和8圖中呈現之序列(例如在第6或8圖之一個序列中的一、二、三或四個FR)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所揭示之輕鏈序列(例如第6圖或第8圖中之SEQ ID NO:12)。於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。
於各種實施態樣中，該輕鏈可變區與SEQ ID NO:11之輕鏈可變區序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VH CDR序列。於某些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的胺基酸序列。於一些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VL CDR序列。於某些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其分別具有本文所揭示之任一VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含:(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
於一實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子(SEQ ID NO:1)之細胞、包含該序列之分子及呈現該序列之細胞的抗體或抗原結合分子包含:(a)VH CDR1區;(b)VH CDR2區；(c)VH CDR3區；(d)VL CDR1區；(e)VL CDR2區；和(f)VL CDR3區，其中該VH CDR和VL CDR顯示於第6和8圖中。
該特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該序列之細胞的抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之重鏈可變區序列(例如在第6和8圖中)和本文所揭示之輕鏈可變區序列(例如在第6和8圖中)。
於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含:(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列；和(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。編碼該重鏈可變區和輕鏈可變區之核苷酸序列提供於第6圖中。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之重鏈序列(例如在第6和8圖中)和本文所揭示之輕鏈序列(例如在第6和8圖中)。
於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含:(a)重鏈，其包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列；和(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。
於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含:(a)重鏈，其包含與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列；和(b)輕鏈，其包含與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列。 IIb. 選殖株 16
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR1，該VH CDR1包含胺基酸序列GSDISSY((SEQ ID NO:19)、由胺基酸序列GSDISSY((SEQ ID NO:19)所組成或基本上由胺基酸序列GSDISSY((SEQ ID NO:19)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR2，該VH CDR2包含胺基酸序列IIVSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:20)、由胺基酸序列IIVSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:20)所組成或基本上由胺基酸序列IIVSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:20)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR3，該VH CDR3包含胺基酸序列NQYSGYGFSF(SEQ ID NO:21)、由胺基酸序列NQYSGYGFSF(SEQ ID NO:21)所組成或基本上由胺基酸序列 NQYSGYGFSF(SEQ ID NO:21)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含重鏈VH，該重鏈VH包含:(a)VH CDR1，其包含胺基酸序列GSDISSY(SEQ ID NO:19)、由胺基酸序列GSDISSY(SEQ ID NO:19)所組成或基本上由胺基酸序列GSDISSY(SEQ ID NO:19)所組成；及/或(b)VH CDR2，其包含胺基酸序列IIVSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:20)、由胺基酸序列IIVSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:20)所組成或基本上由胺基酸序列 IIVSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:20)所組成；及/或(c)VH CDR3，其包含胺基酸序列NQYSGYGFSF(SEQ ID NO:21)、由胺基酸序列NQYSGYGFSF(SEQ ID NO:21)所組成或基本上由胺基酸序列NQYSGYGFSF(SEQ ID NO:21)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3包含第6和8圖中所呈現之VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列的胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含重鏈可變區序列，該重鏈可變區序列包含第6和8圖之胺基酸序列(例如SEQ ID NO:17)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所描述之VH框架區(FR)。於特定之實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VH FR，該VH FR為如第6圖中所闡述之序列、或可源自呈現在第6圖中之序列(例如在第6或8圖之一個序列(例如SEQ ID NO:17)中的一、二、三或四個FR)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所揭示之重鏈序列(例如第6圖中之SEQ ID NO:18)。於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列。
於各種實施態樣中，該重鏈可變區與SEQ ID NO:17之重鏈可變區序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR1，該VL CDR1包含胺基酸序列QSSHSVYYGDWLA(SEQ ID NO:25)、由胺基酸序列QSSHSVYYGDWLA(SEQ ID NO:25)所組成或基本上由胺基酸序列QSSHSVYYGDWLA(SEQ ID NO:25)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR2，該VL CDR2包含胺基酸序列RASNLAS(SEQ ID NO:26)、由胺基酸序列RASNLAS(SEQ ID NO:26)所組成或基本上由胺基酸序列RASNLAS(SEQ ID NO:26)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR3，該VL CDR3包含胺基酸序列LGGYDDDGETA(SEQ ID NO:27)、由胺基酸序列LGGYDDDGETA(SEQ ID NO:27)所組成或基本上由胺基酸序列LGGYDDDGETA(SEQ ID NO:27)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含輕鏈VL，該輕鏈VL包含:(a)VL CDR1，其包含胺基酸序列QSSHSVYYGDWLA(SEQ ID NO:25)、由胺基酸序列QSSHSVYYGDWLA(SEQ ID NO:25)所組成或基本上由胺基酸序列QSSHSVYYGDWLA (SEQ ID NO:25)所組成；及/或(b)VL CDR2，其包含RASTLAS(SEQ ID NO:26)、由胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:26)所組成或基本上由胺基酸序列RASTLAS(SEQ ID NO:26)所組成；及/或(c)VL CDR3，其包含胺基酸序列LGGYDDDGETA(SEQ ID NO:27)、由胺基酸序列LGGYDDDGETA(SEQ ID NO:27)所組成或基本上由胺基酸序列LGGYDDDGETA(SEQ ID NO:27)所組成。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中該VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3包含第6或8圖中呈現之VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含輕鏈可變區序列，該輕鏈可變區序列包含第6或8圖之胺基酸序列(例如SEQ ID NO:23)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所描述之VL框架區(FR)。於特定之實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VL FR，該VL FR為如第6和8圖中所闡述者、或可源自第6和8圖中呈現之序列(例如在第6或8圖之一個序列中的一、二、三或四個FR)。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子或抗體包含本文所揭示之輕鏈序列(例如第6圖或第8圖中之SEQ ID NO:24)。於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。
於各種實施態樣中，該輕鏈可變區與SEQ ID NO:23之輕鏈可變區序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VH CDR序列。於某些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別具有本文所揭示之任一VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的胺基酸序列。於一些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之任一、二及/或三個VL CDR序列。於某些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別具有本文所揭示之任一VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含:(a)VH CDR1區，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列。
於一實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子(SEQ ID NO:1)之細胞、包含該序列之分子及呈現該序列之細胞的抗體或抗原結合分子包含:(a)VH CDR1區;(b)VH CDR2區；(c)VH CDR3區；(d)VL CDR1區；(e)VL CDR2區；和(f)VL CDR3區，其中該VH和VL CDR顯示於第6和8圖中。
於一些一實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之重鏈可變區序列(例如在第6和8圖中)和本文所揭示之輕鏈可變區序列(例如在第6和8圖中)。
於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含:(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；和(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。編碼該重鏈可變區和輕鏈可變區之核苷酸序列提供於第6圖中。
於一些實施態樣中，該特異性結合 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子包含本文所揭示之重鏈序列(例如在第6和8圖中)和本文所揭示之輕鏈序列(例如在第6和8圖中)。
於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含:(a)重鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列；和(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
於一實施態樣中，該抗體或抗原結合分子包含:(a)重鏈，其包含與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列；和(b)輕鏈，其包含與SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %、96%、97%、98%或99%同一性之胺基酸序列。 III III 編碼抗體和抗原結合分子之多核苷酸
本發明亦針對多核苷酸，該多核苷酸編碼特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體和抗原結合分子。
於一些實施態樣中，本發明之多核苷酸編碼抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含重鏈可變區胺基酸序列，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO:5和17所組成之群組的重鏈可變區胺基酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性。
於一些實施態樣中，本發明之多核苷酸編碼抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含輕鏈可變區胺基酸序列，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO:11和23所組成之群組的輕鏈可變區胺基酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性。
於某些實施態樣中，該多核苷酸包含選自由SEQ ID NO:4和16所組成之群組的重鏈編碼序列。於另一實施態樣中，該多核苷酸包含選自由SEQ ID NO:10和22所組成之群組的輕鏈編碼序列。
本技藝之技術熟習人士將可理解:該揭示之多核苷酸序列的變化可能是由於遺傳密碼的簡併性。該揭示之多核苷酸序列的該等變體因而形成本發明的一個態樣。 IV. 載體、細胞和醫藥組成物
於某些態樣中，本發明提供包含本發明之多核苷酸的載體。於一些實施態樣中，本發明針對包含多核苷酸之載體或一組載體，該多核苷酸編碼如本文所描述之特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、 GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子。
本技藝中已知之任何載體可適合用於表現本發明之抗體和抗原結合分子。於一些實施態樣中，該載體為病毒載體。於一些實施態樣中，該載體為逆轉錄病毒載體、DNA載體、小鼠白血病病毒載體、SFG載體、質粒、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、埃巴病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關載體(AAV)、慢病毒載體或彼等之任何組合。
於其他態樣中，本文提供包含本發明之多核苷酸或載體之細胞。於一些實施態樣中，本發明針對細胞，玻管內細胞，該細胞包含編碼如本文所描述之抗原結合分子的多核苷酸。於一些實施態樣中，本發明針對細胞，例如玻管內細胞，該細胞包含編碼抗體或其抗原結合分子之多核苷酸，該抗體或其抗原結合分子特異性結合如本文所揭示之GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)、及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞。
任何細胞均可作為編碼本發明之抗體和抗原結合分子的全部或片段之多核苷酸和載體的宿主細胞。於一些實施態樣中，宿主細胞可為原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞。合適之原核細胞包括，但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌(E.coli)；桿菌，諸如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌；假單胞菌，諸如綠膿桿菌；和鏈黴菌。於一些實施態樣中，該宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如人細胞。於一些實施態樣中，該宿主細胞為CHO細胞，而於其他實施態樣中，該宿主細胞為sP2/0或其他小鼠細胞。本發明之宿主細胞可透過本技藝已知之任何來源獲得。
本發明之其他態樣係針對包含本文所描述之多核苷酸、本文所描述之載體、本文所描述之抗體和抗原結合分子，及/或本文所描述之玻管內細胞的組成物。於一些實施態樣中，該組成物包含醫藥上可接受之載體、稀釋劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。於一些實施態樣中，該組成物包含賦形劑。
於一實施態樣中，該組成物包含多核苷酸，該多核苷酸編碼特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗體或抗原結合分子。於另一實施態樣中，該組成物包含抗原結合分子，該抗原結合分子特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500和包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞。於另一實施態樣中，該組成物包含玻管內細胞，該玻管內細胞包含多核苷酸，該多核苷酸編碼由本文所揭示之多核苷酸編碼之抗體或其抗原結合分子。
於一些實施態樣中，該組成物包含一個以上之不同抗體或抗原結合分子，該抗體或抗原結合分子特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG (SEQ ID NO:500)、包含這些序列之分子及呈現該等分子之細胞。於一些實施態樣中，該組成物包括一個以上之抗體或抗原結合分子，該抗體或抗原結合分子特異性結合SEQ ID NO:1、2、3、499及/或500，及包含這些序列之分子和呈現該等分子之細胞，其中該抗體或抗原結合分子與一個以上之抗原決定部位結合。於一些實施態樣中，該抗體或抗原結合分子將不會彼此競爭結合該抗原決定部位。於一些實施態樣中，本文提供之二或更多種抗體或抗原結合分子被一起組合在醫藥組成物中。較佳地，該等組成物將適合用於投予個體，包括人。 V. 示例性方法
下列章節描述使用本發明之抗原結合分子的各種示例性方法。本發明之任一抗原結合分子及其片段(包括那些由圖形和所附之序列表提供者)可用於本發明之方法中。
於一些本發明之方法中可採用T細胞。該等T細胞可來自本技藝已知之任何來源。例如，T細胞可在玻管內從造血幹細胞群分化，或可從個體取得T細胞。T細胞可從，例如外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾臟組織及腫瘤取得。此外，T細胞可源自一或多個本技藝中可用之T細胞系。T細胞亦可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何數目的技術(諸如FICOLLTM 分離及/或血液成分分離術(apheresis))自個體收集之血液單位取得。分離用於T細胞療法之T細胞的另外方法揭示於美國專利刊物第2013/0287748號(其全部內容以引用方式併入本文)中。
於各種實施態樣中，該抗原結合分子特異性結合包含胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)或子序列(包含胺基酸序列GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)或SGKPGSGE(SEQ ID NO:499))之分子、包含這些序列之分子及呈現該等序列之細胞。於進一步之實施態樣中，該抗原結合分子包含下列一或多者:(a)輕鏈CDR1、(b)輕鏈CDR2、(c)輕鏈CDR3、(d)重鏈CDR1、(e)重鏈CDR2及(f)重鏈CDR3。於另外之實施態樣中，該抗原結合分子包含SEQ ID NO:9或21之重鏈CDR3、或SEQ ID NO:15或27之輕鏈CDR3、或同時包含該重鏈和輕鏈。於其他實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7或19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8或20)、或輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13或25)、或輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14或26)。於各種實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，各CDR包含第6圖中所示之胺基酸序列。
於各種實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈(HC)，該HC可包含含有SEQ ID NO:5之重鏈可變區(VH)序列。於各種實施態樣中，該重鏈包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，各CDR包含第6和8圖中所示之胺基酸序列。再者，於一些實施態樣中，可採用包含VH胺基酸序列之抗原結合分子，該VH胺基酸序列與本發明之申請專利範圍之抗原結合分子(例如包含含有SEQ ID NO:5之可變區(VH)序列的抗原結合分子)的VH具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。
於各種實施態樣中，該抗原結合分子包含輕鏈(LC)，該LC可包含含有SEQ ID NO:11之輕鏈可變區(VL)序列。於各種實施態樣中，該輕鏈包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，各CDR包含第6和8圖中所示之胺基酸序列。再者，於一些實施態樣中，可採用包含VL胺基酸序列之抗原結合分子，該VL胺基酸序列與本發明之申請專利範圍之抗原結合分子(例如包含含有SEQ ID NO:11之可變區(VL)序列的抗原結合分子)的VL具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。
於各種實施態樣中，該抗原結合分子可特異性結合包含胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)或子序列(包含胺基酸序列GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)或KPGSG(SEQ ID NO:500))之分子。於本發明之方法的進一步實施態樣中，該抗原結合分子包含下列一或多者:(a)輕鏈CDR1、(b)輕鏈CDR2、(c)輕鏈CDR3、(d)重鏈CDR1、(e)重鏈CDR2、和(f)重鏈CDR3。於本發明之方法的另外之實施態樣中，該抗原結合分子包含SEQ ID NO:21之重鏈CDR3、或SEQ ID NO:27之輕鏈CDR3、或同時包含該重鏈和輕鏈。於本發明之方法的其他實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、或重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、或輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、或輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)。
於各種實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，各CDR包含第6和8圖中所示之胺基酸序列。
於本發明之方法的各種實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈(HC)，該HC可包含含有SEQ ID NO:17之重鏈可變區(VH)序列。參考附圖，於本發明之方法的各種實施態樣中，該重鏈包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，各CDR包含第6圖中所示之胺基酸序列。再者，於本發明之方法的各種實施態樣中，可採用包含VH胺基酸序列之抗原結合分子，該VH胺基酸序列與本發明之申請專利範圍之抗原結合分子(例如包含含有SEQ ID NO:17之可變區(VH)序列的抗原結合分子)的VH具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。
於本發明之方法的各種實施態樣中，該抗原結合分子包含輕鏈(LC)，該LC可包含含有SEQ ID NO:23之輕鏈可變區(VL)序列。參考附圖，於本發明之方法的各種實施態樣中，該輕鏈包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，各CDR包含第6和8圖中所示之胺基酸序列。再者，於本發明之方法的各種實施態樣中，可採用包含VL胺基酸序列之抗原結合分子，該VL胺基酸序列與本發明之申請專利範圍之抗原結合分子(例如包含含有SEQ ID NO:23之可變區(VL)序列的抗原結合分子)的VL具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性。。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
鑑於上文中可用於本發明之方法中的抗原結合分子之描述，現在將更加詳細地討論代表性方法。 Va. 投予個體藥物劑量之方法
於一態樣中，提供投予個體藥物劑量之方法，該劑量包含預選定數量之細胞，該細胞呈現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之治療性分子: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該劑量包含0.5×106 細胞/公斤個體、1.0×106 細胞/公斤個體、2.0×106 細胞/公斤個體、3.0×106 細胞/公斤個體、4.0×106 細胞/公斤個體或5.0×106 細胞/公斤個體，雖然該方法可使用任何劑量來採用。較佳之劑量為1.0×106 細胞/公斤個體。
與本文提供之定義相一致，於各種實施態樣中，該個體為人或非人類個體。當該個體為人時，該個體可為，例如下述之任何人:正接受治療異常生理狀況(諸如癌症)或已被正式診斷患有病症者、無被正式識別出之病症者、接受醫療護理者、處於發展出病症之風險中者、正被研究是否存有病症者，等。
首先，提供包含含有已知數目之細胞群的樣品，該細胞群已知或被懷疑將表現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之治療性分子: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於一實施態樣中，該選定之胺基酸序列包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於另一實施態樣中，該選定之胺基酸序列包含GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於另一實施態樣中，該選定之胺基酸序列包含GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於另一實施態樣中，該選定之胺基酸序列包含SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；而於另一實施態樣中，該選定之胺基酸序列包含KPGSG(SEQ ID NO:500)。
與本文提供之定義相一致，於各種實施態樣中，該個體為人或非人類個體。當該個體為人時，該個體可為，例如下述之任何人:正接受治療異常生理狀況(諸如癌症)或已被正式診斷患有病症者、無被正式識別出之病症者、接受醫療護理者、處於發展出病症之風險中者、正被研究是否存有病症者，等。
首先，提供已知體積之樣品，該樣品包含已知數目之細胞群，該細胞群已知或被懷疑將呈現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子。該細胞之數目可使用任何已知之方法測定。於較佳之實施態樣中，該細胞群係藉由使用自動裝置，諸如細胞分選儀(例如FACS)計算該樣品中之細胞數來測定，然而亦可採用傳統之非自動細胞計數方法。
該方法之細胞可包含任何類型之細胞，以免疫細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞、朗格漢斯(Langerhans)細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞和少突膠質細胞)為較佳者。T細胞(包括細胞毒性T細胞、T輔助細胞和Treg細胞)為特佳者。於特定之實施態樣中，該細胞為T細胞，其可依本文之描述及藉由本技藝已知之方法取得。該方法中可使用任何類型之細胞且該細胞可為人或非人細胞(包括原核和真核細胞)。示例性細胞包括，但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞和NK-T細胞。T細胞可為自體的、同種異體的或異源的，或者其可為活體內T細胞或玻管內T細胞，且可為CD4+T細胞或CD8+T細胞。於另外之實施態樣中，該細胞為呈現CAR之T細胞。再者，該細胞係配置在能夠將該細胞維持在存活形式之任何環境(諸如血液、組織或任何其他從個體取得之樣品、細胞培養基、在活體外生長之組織，等)或係從該類環境中分離出。梯度純化、細胞培養選擇及/或細胞分選可用來取得細胞。
由該細胞表現之治療性分子可包含任何已知或被懷疑可提供治療益處給予該經投予治療性分子之個體的分子。因此，治療性分子可為具有任何結構或設計之肽或多肽。較佳地，包含該選定之胺基酸序列(SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之治療性分子部分係至少部分表現或配置在細胞外，即，達到可被胞外交互作用伴侶(諸如本發明之抗原結合分子)識別的程度。
於特定之實施態樣中，該治療性分子為CAR。當該治療性分子為CAR，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19 (B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
接著，提供該樣品之等分試樣，該樣品包含細胞群，該細胞群呈現包含該選定之胺基酸序列之分子。該等分試樣可使用任何方便的方式取得，諸如藉由細胞分選儀、藉由僅將物質從樣品吸移出來，等。
此外，提供特異性結合該選定之胺基酸序列且包含可檢測之標記的抗原結合分子。較佳地，該抗原結合分子為本發明之抗原結合分子(例如在圖形、序列表或本揭示內容中)。該方法中可採用任何可檢測之標記且合適之標記可使用理想之準則設定來選擇。可檢測標記之類型的實例包括螢光染料，該螢光標記可選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5軛合物、PE-Cy7軛合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7軛合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。其他類型之可檢測標記包括光學染料(其描述於Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11th Edition, Life Technologies,(2010)中(此篇以引用方式併入本文))、放射性標記(例如同位素標記物，諸如3 H、11 C、14 C、15 N、18 F、35 S、64 CU、90 Y、99 Tc、111 In、124 I、125 I、131 I)、光致變色化合物、磁性標記(例如DYNABEADS)，等。用於標記蛋白質之策略為本技藝所已知且可用於本發明之方法中。
該標記可在分子中之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳為在該分子之結合性質未被修改之點的位置相聯結(或多個位置，若採用多個標記)(除非該等經修飾之結合活性為所需的)。可採用特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的任何抗原結合分子。本文提供(例如提供在所附之序列表和第6和8圖中)合適之抗原結合分子及其組分之實例。於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明之方法的其他特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且該緩衝液-抗原結合分子可與樣品接觸。或者，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
接著，令該樣品之等分試樣與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含存在於該樣品中之細胞和該抗原結合分子。因此，該方法此步驟之結果為形成結合複合物，在該結合複合物中，該與可檢測之標記聯結之抗原結合分子與表現該治療性分子之細胞結合，該治療性分子包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)。因此，該結合複合物本身為可檢測的。允許形成結合複合物之條件將取決於多種因素，然而一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如在磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中)將有利於形成結合複合物且為本發明方法中之較佳者。
測定存在於該等分試樣中之結合複合物中之細胞的級分。該計算可藉由比較帶有可檢測之標記的細胞數與那些不帶有可檢測之標記的細胞數進行，且可以百分比表示。可測定該結合複合物中之細胞數。用於測定存在於結合複合物中之細胞數的具體方法將取決於該選定之標記之性質。例如，當選擇螢光標記時，可採用FACS；當選擇同位素標記時，可採用質譜法、NMR或其他技術；當選擇磁性標記時，可採用基於磁性之細胞分選；亦可採用顯微鏡。該樣品中之細胞數量是從一開始就知道， 因此存在於該結合複合物中之細胞的級分可輕易地測定出。
接著，測定在該初始樣品中表現分子之細胞的濃度，該分子包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)；該測定係基於測定出之存在於該結合複合物中，從而表現該攜帶可檢測標記之治療性蛋白質之細胞的級分。
已知呈現該治療性蛋白質之細胞的級分並已知該等分試樣之體積；因此，在治療性分子/體積基礎上簡單比較從其中取出等分試樣之樣品中表現該治療性分子之細胞數與該較大樣品之體積可提供在該樣品中攜帶治療性分子之細胞的級分(即，在該較大樣品中之攜帶治療性分子的細胞的濃度)。
基於存在於樣品中之攜帶治療性分子之細胞的濃度可藉由外推法測定包含該選定之細胞數的樣品之體積。
最後，將包含所需細胞數之樣品體積投予該個體。該投予可包含治療方案的一種態樣，該治療方案係基於存在於該樣品中且由樣品中之細胞表現的治療性分子。
雖然投予可進行一次或一次以上，該方法的優點為藉由投予包含預選定之細胞數的劑量(該細胞數將根據已知或預期之功效測定)，可避免不必要地投予呈現該治療性分子的細胞；即，該個體接受正確之細胞數以提供理想之治療益處，而沒有過多或過少之細胞。 Vb. 活化細胞之方法
本發明之活化免疫細胞的方法可與任何免疫細胞一起使用，該免疫細胞呈現包含選自由下列所組成之群組的序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。於本發明之方法的背景下，呈現該等分子之T細胞(包括細胞毒性T細胞、T輔助細胞和Treg細胞)為較佳者且將用於示例本發明之方法，然而，在本發明之方法中亦可使用其他呈現該等分子的免疫細胞(例如淋巴細胞，諸如腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、細胞毒性T淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、或T輔助細胞、Treg細胞、樹突細胞、B細胞、造血幹細胞、巨噬細胞、單核細胞、朗格漢斯細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞，及少突膠質細胞和NK細胞)。
T細胞之活化(該術語可與術語“刺激”互換使用)係依賴透過抗原特異性T細胞受體識別及T細胞上之附加受體傳遞之信號。例如CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ蛋白質之成簇進一步與T細胞受體(TCR)之其他組分聯結，誘導T細胞活化並使其為免疫活性的。因此，本文所使用之“活化”或“刺激”係指由分子與配體(其可為該相同分子之另一副本，例如CD3ζ與CD3ζ之另一副本相聯結)結合引起之初級反應，其中該結合介導信號轉導事件。
於一實施態樣中，T細胞係在玻管內藉由本文提供之抗原結合分子活化，該根據本發明方法活化之T細胞可接著在活體外擴增並用於各種應用中，包括本文中所揭示者。
於另一實施態樣中，活化係在活體內藉由本文提供之抗原結合分子和根據本發明方法活化之T細胞發生；擴增係在其中配置該經活化之細胞的生物體內發生。活體內活化可形成治療方案的一個組分，該治療方案之實例描述於本文中。
活化之前，從個體(例如哺乳動物，諸如人、狗、貓、小鼠、大鼠、兔子或彼等之轉基因物種)取得免疫細胞(諸如T細胞)；源自人工系統之細胞，諸如人工胸腺類器官(ATO；參見，例如Seet et al., Nature Methods 14(5):521(2017)，此篇以引用方式被併入本文)亦可用於本發明之活體內及活體外活化方法中。免疫細胞(包括T細胞)可從如本文所描述之許多來源取得，包括PBMC、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、脾組織、腫瘤或T細胞系。T細胞亦可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何數目的技術(諸如FICOLL分離法)自個體收集之血液容積取得。亦可採用梯度純化、細胞培養選擇及/或細胞分選。
鑑於此，提供活化呈現分子之免疫細胞(例如T細胞)的方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
首先，提供包含免疫細胞之樣品，該免疫細胞已知或被懷疑將呈現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。於特定之實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於其他實施態樣中該選定之胺基酸序列為SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；而於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該細胞為T細胞，其可依本文之描述和藉由本技藝中已知之方法取得。該細胞可為人或非人細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。當在本發明之方法中採用T細胞時，該T細胞可為活體內T細胞或玻管內T細胞。再者，可將該細胞配置在能夠將該細胞維持在存活形式之任何環境(諸如血液、組織或任何其他從個體取得之樣品、細胞培養基、在活體外生長之組織、合適之緩衝液，等)或係從該類環境中分離出。
於特定之實施態樣中，包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子為CAR。當該分子為CAR，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
然後，令抗原結合分子與該樣品在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含抗原結合分子和二個包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子，其中該包含該選定之胺基酸序列的分子被配置在二個不同的免疫細胞上。該結合事件具有令該二個免疫細胞更接近彼此之效果，而在多個結合事件之後將有多個細胞聚集在一起。
較佳地，該抗原結合分子(或其片段)為本發明之抗原結合分子(例如在本發明之圖形、序列表或章節中)。可採用特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的任何抗原結合分子。本文提供多個合適之抗原結合分子的實例，例如第6和8圖中所示之具有一或多個CDR者。該呈現在結合複合物之各免疫細胞上之包含該選定之序列的分子可為相同或不同，只要其可被抗原結合分子特異性識別。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)及輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明之方法的其他特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)及輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，在活體內應用中，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且可藉由將該抗原結合分子注射入個體內來達成接觸，當該抗原結合分子與呈現分子之細胞接觸時將發生活化，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。
將達成理想之活化水準的抗原結合分子之精確量可憑經驗決定且將取決於各種個體特異性標準。為了在活體內活化，該抗原結合分子之量可為，例如25μg/kg/天、20μg/kg/天、15μg/kg/天、10μg/kg/天或5μg/kg/天。可投予個體所需天數之抗原結合分子，例如5、4、3、2或1天。在決定需要投予個體多少抗原結合分子時，可使用其他活化抗體作為指導。例如，當執行本發明之方法時，使用抗CD3活化抗體OKT3之臨床經驗可為說明性且是有益的。
本技藝之技術熟習人士將認別特定之治療方案可經修改成適合指定之個體，而給藥量和條件可取決於臨床醫師通常考慮的多種因素。當測定抗原結合分子之合適劑量漢用於活體內活化時，可考慮之實例包括個體之整體健康和強度、個體之體重、所需之總體活化程度、呈現該具有所選定之序列的分子之細胞的效力和活體內效力。
在玻管內活化中，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且該緩衝液­-抗原結合分子可與樣品接觸。或者，於一些實施態樣中，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
允許形成結合複合物之條件將取決於多種因素，然而，一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS))將有利於形成結合複合物且在本發明之方法中為較佳者。
在實行中，當該特異性結合包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子之抗原結合分子與在二個不同免疫細胞之各個細胞上的分子結合時，該二個細胞被更拉近彼此。此種接近或成簇具有活化免疫細胞的作用。 Vc. 測定呈現所欲分子之細胞數的方法
在一些情況下可能需要測定存在於樣品中之表現所欲分子的細胞數。例如，可能需要測定存在於自個體取得之樣品中的表現所欲分子的免疫細胞數。或者，可能需要測定經轉染和表現所欲分子之細胞數，此可作為轉染效率之水準的測量方法。本發明之方法可用於這些及其他其中需要測定存在於樣品中之表現所欲分子的細胞數之應用中。
因此，提供測定樣品中呈現分子之細胞數的方法，其中該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於一實施態樣中，提供包含細胞之樣品，該細胞已知或被懷疑將表現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之所欲分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；於其他實施態樣中該選定之胺基酸序列為KPGSG(SEQ ID NO:500)。
該細胞可為任何類型且可為人或非人細胞(例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠，等)。於一較佳之實施態樣中，該細胞為免疫細胞。該方法之免疫細胞可為任何類型之免疫細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞和少突膠質細胞)。T細胞(包括細胞毒性T細胞、T輔助細胞和Treg細胞)為特佳者。於特定之實施態樣中，該細胞為T細胞，其可依本文之描述及藉由本技藝已知之方法取得。本發明之方法之本實施態樣中可採用任何類型之細胞。示例性細胞包括，但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞和NK-T細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。該T細胞可為CD4+T細胞或CD8+T細胞。當本發明之方法採用T細胞時，該T細胞可為活體內T細胞或玻管內T細胞。再者，該細胞可被配置在能夠將該細胞維持在存活形式之任何環境(諸如血液、組織或任何其他自個體取得之樣品、細胞培養基、在活體外生長之組織，合適之緩衝液，等)中或係從該類環境中分離出。
於特定之實施態樣中，該所欲分子為CAR。當該分子為CAR時，該CAR可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
然後，令該樣品與特異性結合所欲分子且包含可檢測標記之抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含存在於樣品中之細胞和抗原結合分子。較佳地，該抗原結合分子為本發明之抗原結合分子(或其片段)(例如，在本發明之圖形、序列表或本章節中)。特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的任何抗原結合分子可用於本發明之方法中。本文提供多個合適之抗原結合分子的實例，例如第6和8圖中所示之具有一個或多個CDR者。
該方法中可採用任何可檢測之標記且合適之標記可使用理想之準則設定來選擇。可檢測標記類型之實例包括螢光染料，該螢光染料可選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5軛合物、PE-Cy7軛合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7軛合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。其他類型之可檢測標記包括光學染料(其描述於Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11th Edition, Life Technologies,(2010)中(此篇以引用方式併入本文中))、放射性標記(例如同位素標記物，諸如3 H、11 C、14 C、15 N、18 F、35 S、64 CU、90 Y、99 Tc、111 In、124 I、125 I、131 I)、光致變色化合物、磁性標記(例如DYNABEADS)，等。用於標記蛋白質之策略為本技藝所已知且可用於本發明之方法中。
該標記可在該分子之任何點與抗原結合分子聯結，但較佳為在該分子之結合性質未被修改之點的位置相聯結(或多個位置，若採用多個標記)(除非該等經修飾之結合活性為所需的)。本發明之方法可採用特異性結合包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的所欲分子之任何抗原結合分子或其片段。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明之方法的其他特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且該緩衝液-抗原結合分子可與樣品接觸。或者，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
允許形成結合複合物之條件將取決於多種因素，但一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如在磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中)將有利於形成結合複合物且為本發明之方法中之較佳者。
接著，測定存在於該樣品中之結合複合物中的細胞數。用於測定存在於結合複合物中之細胞數的具體方法將取決於該選定之標記之性質。例如，當選擇螢光標記時，可採用FACS；當選擇同位素標記時，可採用質譜法、NMR或其他技術；當選擇磁性標記時，可採用基於磁性之細胞分選；亦可採用顯微鏡。這些檢測方法之輸出可為細胞數之形式或者該輸出可為允許根據該輸出來計算細胞數之形式。 Vd. 分離分子之方法
將不同分子群(特別是生物學相關之分子)彼此分開的能力具有巨大的價值。使用本發明提供之抗原結合分子可達成該等分離，並用於一系列生物技術、生物製藥和治療應用中。
於本發明之一態樣中，提供分離包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子的方法:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於一實施態樣中，該方法包含提供已知或被懷疑包含分子之樣品，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該所欲分子為CAR。當該分子為CAR時，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
提供特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2或3)且可選擇地包含可檢測標記之抗原結合分子。當決定採用可檢測標記時，如本文所描述之方法中可採用任何可檢測之標記，且合適之標記可使用理想之準則設定來選擇。可檢測標記類型之實例包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘(pyrene)、孔雀綠(Malachite green)、芪(stilbene)、螢光黃、瀑布藍、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白(PE)(Molecular Probes公司)、FITC、羅丹明和德克薩斯紅(Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham生命科學公司))。合適之光學染料，包括螢光團(描述於Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11th Edition, Life Technologies,(2010)中(此篇明確以引用方式併入本文中))、放射性標記(例如同位素標記物，諸如3 H、11 C、14 C、15 N、18 F、35 S、64 CU、90 Y、99 Tc、111 In、124 I、125 I、131 I)。亦可使用光致變色化合物、鹵素-標籤、Atto染料、Tracy染料、蛋白質螢光標記(例如蛋白質螢光標記亦包括，但不限於綠色螢光蛋白，包括海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或GFP之水母物種(Chalfie et al.,(1994)Science 263:802-805)、EGFP (Clon-tech Labs公司，Genbank登錄號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies公司；Stauber,(1998)Biotechniques 24: 462-471；Heim et al.,(1996)Curr. Biol. 6: 178-182)、增強之黃色螢光蛋白(Clontech Labs公司)、螢光素酶(Ichiki et al.,(1993)J. Immunol. 150:5408-5417))、磁性標記(例如DYNABEADS)，等。用於標記蛋白質之策略為本技藝所周知且可用於本發明之方法中。
該標記可在分子之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳為在該分子之結合性質未被修改之點的位置相聯結(或多個位置，若採用多個標記)(除非該等經修飾之結合活性為所需的)。可使用特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的任何抗原結合分子或其片段，諸如本文所揭示者，例如第6和8圖中所示之具有一或多個CDR者。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明方法之其他特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且該緩衝液-抗原結合分子可與樣品接觸。或者，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
令該樣品之等分試樣與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含含有該選定之胺基酸序列的分子及該抗原結合分子。允許形成結合複合物之條件將取決於多種因素，但一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如在磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中)將有利於形成結合複合物且為本發明之方法中之較佳者。由於結合複合物之組成部分可配置在如本文所描述之表面上，形成之結合複合物亦可配置在表面上。
在此階段，可能尚未形成結合複合物，或可能已形成多個包含一或多個與分子(其包含該選定之胺基酸序列，即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)結合之抗原結合分子的結合複合物。包含該選定之胺基酸序列之未經結合之分子及/或未經結合之抗原結合分子亦可存在於具有任何形成之結合複合物的局部環境中。
然後，令任何非為結合複合物之一部分的分子與任何形成之結合複合分開。移除之方法將取決於該結合複合物之結構及/或局部環境。例如，若該抗原結合分子被配置在小珠、盤或袋上，該反應混合物之未經結合之組分可使用能使形成之結合複合物保持完好的溶液沖走。若結合複合物被配置在小珠上，該小珠本身可位於柱或其他結構中並可使用相同方法。
例如，可使用用於誘導形成結合複合物之溶液作為洗滌溶液以除去未經結合之組分。任何不會破壞形成之結合複合物的合適緩衝液或溶液均可使用。通常，當執行該方法之此步驟時較佳為避免具有高鹽濃度、非生理pH值、含有離液劑或變性劑之緩衝液。
然後，將形成之結合複合物分成(a)包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子，和(b)抗原結合分子。該分離可使用本技藝之技術熟習人士已知之標準方法來達成。例如，具有合適pH值和組成之溶液可在複合物上進行洗滌。常用於此目的之溶液為0.1 M鹽酸甘胺酸，pH 2.5-3.0且該溶液可用來達成分離。其他可採用之溶液包括100 mM檸檬酸，pH 3.0、50-100 mM三乙胺或三乙醇胺，pH 11.5；150 mM氫氧化銨，pH 10.5；0.1 M甘胺酸•NaOH，pH 10.0；5 M氯化鋰、3.5 M氯化鎂或氯化鉀、3.0 M氯化鉀、2.5 M碘化鈉或碘化鉀、0.2-3.0 M硫氰酸鈉、0.1 M Tris-醋酸加2.0 M NaCl，pH 7.7；2-6 M鹽酸胍、2-8 M尿素、1.0 M硫氰酸銨、1%脫氧膽酸鈉1%SDS；和10%二噁烷50%乙二醇，pH 8-11.5。
分離後，若包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)之分子為最想要的，則可收集該分子；或者，若該抗原結合分子為最想要的，則可收集該抗原結合分子。 Ve. 測定是否存有分子之方法
如本文所揭示者，有時可能需要分離該包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:SEQ ID NO:1、2、499或500。在其他情況中，僅知道來自樣品之分子是否包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列的信息即已足夠:SEQ ID NO:1、2、499或500。例如，知道該等分子將被表現，而不管表現水準可能是有益的。在其他情況中，可能需要知道設計用來除去該等分子之純化過程或步驟是否有效。因此，定性測定是否存有包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子可用於多種應用中:SEQ ID NO:1、2、499或500。
鑑於此，提供測定樣品中是否存有包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子的方法:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE (SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於一實施態樣中，該方法包含提供已知或被懷疑包含分子之樣品，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；且於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)的分子為CAR。當該分子為CAR，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
提供包含可檢測標記之抗原結合分子，該抗原結合分子特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)。合適之標記可使用理想之準則設定來選擇。可檢測之標記類型的實例包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、芪、螢光黃、瀑布藍、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白(PE)(Molecular Probes公司)、FITC、羅丹明和德克薩斯紅(Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham生命科學公司))。合適之光學染料，包括螢光團(描述於Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11th Edition, Life Technologies, (2010)中(此篇明確以引用方式併入本文中))、放射性標記(例如同位素標記物，諸如3 H、11 C、14 C、15 N、18 F、35 S、64 CU、90 Y、99 Tc、111 In、124 I、125 I、131 I)。光致變色化合物、鹵素-標籤、Atto染料、Tracy染料、蛋白質螢光標記(例如蛋白質螢光標記亦包括，但不限於綠色螢光蛋白，包括海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或GFP之水母物種(Chalfie et al., (1994)Science 263:802-805)、EGFP (Clon-tech Labs公司，Genbank登錄號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies公司；Stauber,(1998)Biotechniques 24:462-471；Heim et al.,(1996)Curr. Biol. 6: 178-182)、增強之黃色螢光蛋白(Clontech Labs公司)、螢光素酶(Ichiki et al.,(1993)J. Immunol. 150:5408-5417))、磁性標記(例如DYNABEADS)，等。用於標記蛋白質之策略為本技藝所周知且可用於本發明之方法中。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明之方法的其他特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
該標記可在分子之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳為在該分子之結合性質未被修改之點的位置相聯結(或多個位置，若採用多個標記)(除非該等經修飾之結合活性為所需的)。可使用特異性結合包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的任何抗原結合分子，諸如本文所揭示者，例如第6和8圖中所示之具有一或多個CDR者。
接著，令該樣品與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含存在於該樣品中之細胞及該抗原結合分子。該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且該緩衝液-抗原結合分子可與樣品接觸。或者，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
令該樣品與該抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含含有該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子及該抗原結合分子。允許形成結合複合物之條件將取決於多種因素，但一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如在磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中)將有利於形成結合複合物且為本發明之方法中之較佳者。由於結合複合物之組成部分可配置在如本文所描述之表面上，形成之結合複合物亦可被配置在表面上。
在此階段，可能尚未形成結合複合物，或可能已形成多個結合複合物，該結合複合物包含一或多個與包含該選定之胺基酸序列，(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子結合之抗原結合分子(或一或多個與抗原結合分子結合之包含該選定之胺基酸序列的分子)。包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之未經結合的分子及/或未經結合之抗原結合分子亦可存在於具有任何形成之結合複合物的局部環境中。
然後，令任何非為結合複合物之一部分的分子與任何形成之結合複合分開。移除方法將取決於該結合複合物之結構及/或局部環境。例如，若該抗原結合分子被配置在小珠、盤或袋上，該反應混合物之未經結合之組分可使用能使形成之結合複合物保持完好的溶液沖走。若結合複合物被配置在小珠上，該小珠本身可位於柱或其他結構中並可使用相同方法。
例如，可使用用於誘導形成結合複合物之溶液作為洗滌溶液以除去未經結合之組分。亦可使用任何不會破壞形成之結合複合物的合適緩衝液或溶液。通常，當執行該方法之此步驟時應避免具有高鹽濃度、非生理pH值、含有離液劑或變性劑之緩衝液。
最後，檢測是否存有結合複合物--該結合複合物將包含含有該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)的分子和抗原結合分子。用於檢測是否存有結合複合物之特定方法將取決於該選定之標記的性質。例如，當選擇螢光標記時，可採用FACS；當選擇同位素標記時，可採用質譜法、NMR或其他技術；當選擇磁性標記時，可採用基於磁性之細胞分選；亦可採用顯微鏡。該方法之最終結果為定性評估是否存有該包含可檢測之標記的抗原結合分子，因此可評估是否存有其結合伴侶，該包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)的分子。
如在本發明之所有方法的情況中，該包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)的分子可被配置在任何環境中。於較佳之實施態樣中，該包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、499或500)的分子係表現在細胞之表面上。於本實施態樣中，該細胞可為任何類型且可為人或非人細胞(例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠，等)。於一較佳之實施態樣中，該細胞為免疫細胞。該方法之免疫細胞可為任何類型之免疫細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞和少突膠質細胞)。T細胞(包括細胞毒性T細胞、T輔助細胞和Treg細胞)為特佳者。於特定之實施態樣中，該細胞為T細胞，其可依本文之描述及藉由本技藝已知之方法取得。本發明之方法之此實施態樣中可採用任何類型之免疫細胞且該細胞可為人或非人細胞。示例性細胞包括，但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞和NK-T細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。於另外之實施態樣中，該T細胞可為呈現CAR之T細胞。該T細胞可為CD4+T細胞或CD8+T細胞。當本發明之方法採用T細胞時，該T細胞可為活體內T細胞或玻管內T細胞。
於另外之實施態樣中，該細胞可被配置在能夠將該細胞維持在存活形式之任何環境(諸如血液、組織或任何其他自個體取得之樣品、細胞培養基、在活體外生長之組織，合適之緩衝液，等)中或係從該類環境中分離出。 Vf. 增加分子濃度之方法
所欲分子經常以低於所需量存在於樣品中。例如，當以外源基因轉染細胞時，由該外源基因編碼之蛋白質的表現水準低。同理可推測，從細胞分泌出之分子的水準低；該等分子之存在量通常低(但若該分子包含該經揭示之SEQ ID NO:1、2或3的胺基酸序列的其中一者，則仍可使用本文提供之方法進行檢測)。低表現水準之問題的一種解決方案為增加所欲分子之濃度，該所欲分子在溶液中可為游離的，或表現在細胞表面上。亦可提高該胞內表現之所欲分子的濃度，然而首先必須先將該細胞裂解以釋出該分子。
為了解決此問題，提供增加呈現分子之細胞濃度的方法，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於一實施態樣中，該方法包含提供包含細胞之樣品，該細胞已知或被懷疑包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於其他實施態樣中該選定之胺基酸序列為SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；而於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子為CAR。當該分子為CAR，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19 (B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
提供特異性結合該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)且可選擇地包含可檢測標記之抗原結合分子。當採用可檢測之標記較佳時，如本文所描述之方法中可採用任何可檢測之標記且合適之標記可使用理想之準則設定來選擇。可檢測之標記類型之實例包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、芪、螢光黃、瀑布藍、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白(PE)(Molecular Probes公司)、FITC、羅丹明和德克薩斯紅(Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham生命科學公司))。合適之光學染料，包括螢光團(描述於Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11th Edition, Life Technologies, (2010)中，此篇明確以引用方式併入本文中)、放射性標記(例如同位素標記物，諸如3 H、11 C、14 C、15 N、18 F、35 S、64 CU、90 Y、99 Tc、111 In、124 I、125 I、131 I)、光致變色化合物、鹵素-標籤、Atto染料、Tracy染料、蛋白質螢光標記(例如蛋白質螢光標記亦包括，但不限於綠色螢光蛋白，包括海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或GFP之水母物種(Chalfie et al.,(1994)Science 263:802-805)、EGFP (Clon-tech Labs公司，Genbank登錄號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies公司；Stauber, (1998)Biotechniques 24:462-471；Heim et al.,(1996)Curr. Biol. 6: 178-182)、增強之黃色螢光蛋白(Clontech Labs公司)、螢光素酶(Ichiki et al.,(1993)J. Immunol. 150:5408-5417))、磁性標記(例如DYNABEADS)，等。用於標記蛋白質之策略為本技藝所周知且可用於本發明之方法中。
該標記可在分子之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳為在該分子之結合性質未被修改之點的位置相聯結(或多個位置，若採用多個標記)(除非該等經修飾之結合活性為所需的)。可使用特異性結合包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的任何抗原結合分子；或一或多個與抗原結合分子或其片段結合之分子(該分子包含該選定之胺基酸序列)，諸如本文所揭示者，例如第6和8圖中所示之具有一或多個CDR者。
於本發明之方法的特定之實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明之方法的其他特定之實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)和輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，該抗原結合分子可存在於緩衝液中且該緩衝液-抗原結合分子可與樣品接觸。或者，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
表現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的細胞可為任何類型且可為人或非人細胞(例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠，等)。於一較佳之實施態樣中，該細胞為免疫細胞。該方法之免疫細胞可為任何類型之免疫細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞和少突膠質細胞)。T細胞(包括細胞毒性T細胞、T輔助細胞和Treg細胞)為特佳者。於特定之實施態樣中，該細胞為T細胞，其可依本文之描述及藉由本技藝已知之方法取得。可採用任何類型之免疫細胞，且該細胞可為人或非人細胞。示例性細胞包括，但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞和NK-T細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。於另外之實施態樣中，該細胞為呈現CAR之T細胞。該T細胞可為CD4+T細胞或CD8+T細胞。當本發明之方法中採用T細胞時，該T細胞可為活體內T細胞或玻管內T細胞。再者，該細胞可被配置在能夠將該細胞維持在存活形式之任何環境(諸如血液、組織或任何其他自個體取得之樣品、細胞培養基、在活體外生長之組織，合適之緩衝液，等)中或係從該類環境中分離出。
令該包含細胞之樣品與抗原結合分子在允許形成結合複合物之條件下接觸，該結合複合物包含含有該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子及抗原結合分子。允許形成結合複合物之條件將取決於多種因素，但一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如在磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中)將有利於形成結合複合物且為本發明之方法中之較佳者。由於結合複合物之組成部分可依本文描述被配置在表面上，形成之結合複合物亦可被配置在表面上。
在此階段，可能尚未形成結合複合物，或可能已形成多個結合複合物，該結合複合物包含一或多個與包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子結合之抗原結合分子。包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之未經結合之分子及/或未經結合之抗原結合分子亦可存在於具有任何形成之結合複合物的局部環境中。
然後，令任何非為結合複合物之一部分的分子與任何形成之結合複合分開。移除方法將取決於該結合複合物之結構及/或局部環境。例如，若該抗原結合分子被配置在小珠、盤或袋上，該反應混合物之未經結合之組分可使用能使形成之結合複合物保持完好的溶液沖走。若結合複合物被配置在小珠上，該小珠本身可位於柱或其他結構中並可使用相同方法。
例如，可使用用於誘導形成結合複合物之溶液作為洗滌溶液以除去未經結合之組分。亦可使用任何不會破壞形成之結合複合物的合適緩衝液或溶液。通常，當執行該方法此步驟時，較佳為避免具有高鹽濃度、非生理pH值、含有離液劑或變性劑之緩衝液。
在該方法之此階段，呈現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的細胞群將存在。若使用可檢測之標記，可輕易地測定與該標記之性質一致之細胞的濃度。不表現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的細胞將不存在，因此，呈現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的細胞群(或濃度)的量將較執行該方法之前的量增加。
若包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的濃度不是在理想之水準，可重複進行理想次數之上述步驟。在該方法之此步驟的背景下，若已存有理想之細胞濃度，該理想次數亦可為零。 Vg. 減除免疫細胞群之方法
當個體具有由免疫細胞介導之病症時，及時控制該病症以防止對個體之傷害是很重要的。例如，當個體具有自體免疫反應時，可能需要藉由減除免疫細胞群來抑制由免疫細胞介導之反應，以努力防止傷害。於另一實例中，接受免疫療法之個體可能對該療法反應太強烈而處於受到傷害之風險中；對個體施行減除免疫細胞群可能為減輕該個體對該免疫療法之反應的有效方法。鑑於對控制由個體免疫細胞介導之反應的方法之需求，提供減除免疫細胞群之方法，該免疫細胞群呈現包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)和KPGSG(SEQ ID NO:500)。本發明之方法中可採用特異性識別GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)，更具體地，該子序列GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、子序列GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、子序列SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)或子序列KPGSG(SEQ ID NO:500)的抗原結合分子(諸如本文所提供者，例如第6和8圖中所示之具有一或多個CDR者)。
於本發明之方法的特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:19)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:20)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:21)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:25)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:26)及輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:27)。於本發明方法之其他特定實施態樣中，該抗原結合分子包含重鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:7)、重鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8)、重鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:9)、輕鏈CDR1(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:13)、輕鏈CDR2(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:14)及輕鏈CDR3(其包含胺基酸序列SEQ ID NO:15)。
於一實施態樣中，該方，法包含提供欲減除之免疫細胞群，其中該細胞已知或被懷疑呈現分子，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)、 GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)；於其他實施態樣中，該選定之胺基酸序列為KPGSG(SEQ ID NO:500)。
於特定之實施態樣中，該包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子為CAR。當該分子為CAR，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段:CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合。
於一些實施態樣中，殺死表現分子(諸如CAR)之細胞可能是有益的。如上述，於一些實施態樣中，治療性細胞，諸如CAR T細胞可用於治療用途且隨後需要在患者體內被減除。於一實施態樣中，本發明提供除去這些T細胞之方法，該方法包含使用T細胞殺死其他表現CAR之T細胞。呈現包含可被特定抗原結合分子(諸如本文所揭示者，即，抗連接子選殖株8及/或16，及彼等之片段)識別之特定抗原決定部位之分子的細胞可使用雙功能抗體(包含與特定抗原結合scFv連接之人CD3-結合scFv的雙特異性分子，諸如由如本文所描述之選殖株8及/或16之片段所組成者)來滅殺。於某些實施態樣中，該雙功能抗體與表現分子(其包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、 GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500))之細胞及人T細胞結合，以形成免疫突觸並促進細胞死亡。
呈現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的免疫細胞可為任何類型且可為人或非人細胞(例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠，等)。該方法之免疫細胞可為任何類型之免疫細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞和少突膠質細胞)。T細胞(包括細胞毒性T細胞、T輔助細胞和Treg細胞)為特佳者。於特定之實施態樣中，該細胞為T細胞，其可依本文之描述及藉由本技藝已知之方法取得。本發明之方法的本實施態樣中可採用任何類型之細胞且該細胞可為人或非人細胞。示例性細胞包括，但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、TCR表現細胞、樹突細胞和NK-T細胞。該T細胞可為自體的、同種異體的或異源的。於另外之實施態樣中，該細胞為呈現CAR之T細胞。該T細胞可為CD4+T細胞或CD8+T細胞。當本發明之方法採用T細胞時該T細胞可為活體內T細胞或玻管內T細胞。再者，該細胞可被配置在能夠將該細胞維持在存活形式之任何環境(諸如血液、組織或任何其他自個體取得之樣品、細胞培養基、在活體外生長之組織，合適之緩衝液，等)中或係從該類環境中分離出。由於本發明之方法可用於治療設置中，於較佳之實施態樣中，該免疫細胞群被配置在個體中，更佳為人個體。
接著，令免疫細胞與抗原結合分子在允許形成三元結合複合物之條件下接觸，該抗原結合分子特異性結合(a)包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2或3)的分子，及(b)表現在免疫細胞之表面上的活化分子，該免疫細胞不表現包含該選定之胺基酸序列的分子，該三元結合複合物包含含有該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子、活化分子和抗原結合分子。該抗原結合分子可配置在任何表面上或完全不在表面。例如，該抗原結合分子(其亦可包含欲減除之免疫細胞群及/或可存在於緩衝液中)和緩衝液-抗原結合分子可與該樣品接觸。或者，該抗原結合分子可與表面聯結。合適之表面包括瓊脂糖珠、磁珠(諸如DYNABEADS)或塑膠盤、玻璃盤或陶瓷盤(諸如孔槽盤)、袋，諸如細胞培養袋，等。該表面本身可被配置在另一結構中，諸如柱。
令該免疫細胞在允許形成三元結合複合物之條件下與抗原結合分子接觸，該三元結合複合物包含含有該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子、抗原結合分子和表現在免疫細胞之表面上的活化分子，該免疫細胞不表現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子。允許形成結合複合物的條件將取決於多種因素，然而，一般而言，為生理pH和離子強度之水性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS))將有利於形成結合複合物且在本發明之方法中為較佳者。由於結合複合物之組成部分可配置在如本文所描述之表面上，形成之結合複合物亦可被配置在表面上。
於較佳之實施態樣中，該接觸係藉由直接投予個體抗原結合分子進行。於該實施態樣中，該個體將已具有欲被減除之細胞群，其中該細胞表現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子。因此，這些細胞以及呈現活化分子之細胞將在對個體投予該抗原結合分子之前存在於個體中。人類血液、淋巴和組織環境將允許形成三元結合複合物。該抗原結合分子與包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的結合可用來“標記”那些呈現分子之細胞(即，欲被減除之細胞)，該分子包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)。此結合事件可能會或可能不會導致其本身被減除。然而，當該抗原結合分子與活化分子結合以形成三元結合複合物時，該結合事件使二種細胞(即，表現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的細胞及表現活化分子之細胞)靠近。該結合事件之生理結果為滅殺該表現包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)之分子的細胞。因此，藉由在個體全身發生之多次結合事件，攜帶該包含該選定之胺基酸序列(即，SEQ ID NO:1、2、3、499或500)的分子之免疫細胞被減除並降低該個體疾病之傷害風險。 Vh. 監控活體內分子之方法
正子發射斷層掃描(PET)成像通常用於腫瘤學研究和患者照護。在頭部、胸部、腹部和骨盆中之佔位性病變(space-occupying lesion)方面，文件記載之PET的最佳應用之一為區別良性和惡性起因。特別是，18 F-氟脫氧葡萄糖(FDG)已在所有這些應用中用於為葡萄糖攝取的分佈照像。此外，為不同面向之腫瘤代謝和生長照像的其他放射性示踪劑的研發進一步增添能力範圍。這些示踪劑包含用於測量納入之胺基酸的11 C-蛋胺酸、用於測量納入之核苷酸的18 F-胸苷(測量細胞增殖)及測量組織缺氧之18 F-氟硝基咪唑。
本發明提供在PET分析中使用抗原結合分子以增加FDG攝取之特異性。特別是，本文提供之方法除了監控、檢測、刺激、活化或減除CAR T細胞外，可在以CAR細胞治療後早期評估變化。具體而言，本發明提供之方法可協助使用PET 進行全身掃描。使用此技術來將癌症分期，藉由增加FDG積累可能檢測幾乎身體之任何區域的隱匿性轉移性疾病。
於一些實施態樣中，本發明提供活體內檢測分子之方法，該分子包含該選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、2、499或500。 例如，於特殊之實施態樣中，該抗原結合分子可用於追踪或監控存活之個體中是否存有包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:SEQ ID NO:1、2、499或500。於一些實施態樣中，該存活之個體為人。於一些實施態樣中，提供存活之個體包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之分子:SEQ ID NO:1、2、499或500，並使用本文提供之抗原結合分子和正子發射斷層(PET)掃描來測定是否存有該分子。
於一些實施態樣中，本發明提供之抗原結合分子可用於在活體內控制CAR T細胞。於一些實施態樣中，本發明提供之抗原結合分子可用於在活體內活化或刺激CAR T細胞。 於一些實施態樣中，本發明提供之抗原結合分子可用於在活體內減除CAR T細胞。 於一些實施態樣中，本發明提供之抗原結合分子可用於在活體內監控CAR T細胞。 具體而言，當與PET組合時，本文提供之抗原結合分子(例如抗連接子抗體)可用於監控或追踪表現包含該選定之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO:1、2、499或500)之分子的細胞在活體內之分佈。 以引用方式併入
所有本說明書中提及之出版物、專利和專利申請案在此以引用方式併入本文，其程度如同各個別出版物、專利或專利申請案被具體且個別地指明將藉由引用方式併入。然而，本文之參考資料的引用不應被解釋為承認該等參考文獻為本發明之先前技藝。以引用方式併入之參考文獻中所提供之任何定義或術語與本文所提供之術語和討論有不同時，以本發明之術語和定義為主。
上述之書面說明書被認為足以使本技藝之技術熟習人士能夠實行本發明。前述內容和接下去之實施例詳細描述本發明之某些較佳實施態樣並描述本發明者所考量之最佳模式。然而，應理解的是，無論前述內容可能多麼詳細地出現在文本中，本發明可以許多方式實行，且本發明應當根據所附之申請專利範圍及其任何等效物來解釋。 實施例
本發明進一步藉由下列實施例說明，其不應被解釋為進一步限制。本申請案全文中所列舉之所有參考文獻的內容以引用方式明確併入本文中。實施例 1: 產生抗原結合分子
使用與載體蛋白KLH軛合之18聚體肽，GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)作為免疫原，透過將兔子免疫化來產生單株抗體。使用與卵白蛋白軛合之全長的連接子肽，GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)，藉由ELISA，經由篩選多株血清來測定滴度。使用經由流式細胞術分析之CAR T細胞進行第二次篩選(第2和3圖)。一旦取得滴度，殺死經免疫化之兔子並使用標準的雜交瘤生成和分殖技術來衍生單株抗體。雜交瘤分殖株之最終篩選係經由將增殖之CAR T細胞或源自CAR T細胞之固定的細胞沉澱小丸分別進行另外之流式細胞術運作回合及免疫組織化學(IHC)分析完成。藉由雜交瘤分殖株之標準Sanger測序來測定所選定之最後二個分殖株之序列。實施例 2: 免疫組織化學 (IHC)
在免疫組織化學分析(IHC；第4圖)中篩選候選抗體之用途。為了創建用於IHC染色之固定的細胞沉澱小丸，將〜2e6 CAR T細胞離心並以PBS洗滌之。將細胞重新懸浮於含有0.45%多聚甲醛(PFA)之PBS中並在室溫下，將細胞在搖動平台上培育2小時。培育後，再以PBS洗滌細胞一次，並再懸浮於具有5% BSA之PBS中。如第4圖中所示，經CAR轉導之細胞可被本文所提供之示例性抗連接子抗體明確識別。實施例 3: 抗原決定部位測繪
使用全長肽，GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:1)及在N-或C-端被截斷並在N端含有生物素部分或在C端具有離胺酸殘基加生物素部分之變體，經由ELISA定位該抗體(即，抗原結合分子)之抗原決定部位。使用預先以蛋白G(Pierce)塗層之盤將該抗體捕捉在96孔盤格式中。在PBST緩衝液中將盤洗滌6次，再與靶肽一起培育。以PBST再另外洗滌6次並將抗體與鏈親和素-HRP進一步培育。在PBST中洗滌最後6次時，經由增強之化學發光套組(ECL，來自GE Healthcare)和Varioskan Flash盤式分析儀(Thermo Fisher)檢測及定量信號。抗原決定部位定位工作之結果顯示於第5、7和9圖中。實施例 4: 從兔子抗體選殖株 8-4 和選殖株 16-6 產生人化序列
使用由Chemical Computing Group(CCG)研發之The Molecular Operating Environment(MOE)軟體分別產生兔子抗體選殖株8-4和16-6與來自下列二個數據庫之可變輕鏈和重鏈，VL和VH對之間的比對: (1)(1)Abysis人數據庫:具有約2000個來自IMGT-LigM DB之已知的人VL/VH序列對的數據庫；和 (2)(2)人種系數據庫:種系序列之數據庫。 人化模型顯示具有最少間隙之最佳序列比對(與VL和VH結構域二者具最高同一性)。輸出來自各人類數據庫的前100組抗體對並使用kClust(Hauser, Mayer, & Soding,(2013)BMC Bioinformatics , 248)成簇。下表中呈現該二種抗體8-4(表1-8)和8-16(表9-16)各自之VL和VH序列表，來自該二個數據庫之各數據庫的序列之成簇百分比為90%(表1、2、5、6、9、10、13、14)和95%(表3、4、7、8、11、12、15、16)。結果呈現於本文中和第8圖中。
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實施例 5: 使用抗連接子抗體純化大分子和細胞
本發明之抗原結合分子為，諸如特異性結合GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)、包含該等序列之分子及呈現該等分子之細胞的抗原結合分子(諸如抗體)、編碼該等抗原結合分子之多核苷酸分子及該抗原結合分子之人化形式。因此，本發明之抗原結合分子(例如抗體)可用於純化顯示出可被本發明之抗原結合分子識別之抗原決定部位(例如 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500))的分子，諸如大分子、聚合物、細胞、物質，等。
於一實施態樣中，本發明之抗原結合分子(例如選殖株8及/或16和其片段)可黏附在小珠上、黏附在樹脂或與樹脂聯結，該樹脂可被配置在柱或其他結構中。然後，可將包含分子之樣品與其上黏附該抗原結合分子或與抗原結合分子聯結之小珠、樹脂，等接觸，該分子包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或片段。這允許形成包含抗原結合分子與分子(其包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、 GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或片段)之聯結或結合複合物。然後，可以具有經選定之pH值的合適溶液，諸如緩衝液(例如PBS、HEPES、MOPS、Tris、Tricine，等)洗滌小珠或樹脂，該合適之溶液的經選定之pH值可維持該包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或片段之分子的穩定性。洗滌可除去樣品之不要和未結合之組分。在洗滌步驟之後，可使用洗提緩衝液和選定之條件來破壞任何形成之聯結或結合複合物，以從該抗原結合分子洗提出該包含 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或片段的分子。合適之洗提緩衝液的實例包括與莫耳過量之肽抗原決定部位、0.1M甘胺酸，pH 2.5-3.0和0.1M檸檬酸，pH 3.0、50-100mM三乙胺或三乙醇胺，pH 11.5、3.5-4.0M氯化鎂，pH 7.0(在10mM Tris中)、2-6M胍和2-8M尿素一起培育，或含有游離肽GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之約pH 7-8的緩衝溶液，包括，但不限於10mM Tris、HEPES或1X PBS。在洗提步驟期間，收集包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或片段之洗提出的分子、細胞和所欲部分，隨後藉由將樣品在SDS聚丙烯醯胺凝膠上泳行來檢查純度。
於另一實施態樣中，抗原結合分子可與任何顯示出抗原決定部位之分子實體一起配置在溶液中，從混合之分子、細胞，等群體中純化並藉由以300-500 mM氯化鈉洗滌或以1M Tris(用於蛋白質)或磷酸鹽緩衝液降低該pH值並中和、或以含有游離肽(諸如 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之緩衝液將該抗原結合分子從小珠、樹脂或游離抗體洗提出。接著，可使用透析以使物質回到所需之緩衝液條件。
於一特定之實施態樣中，可將顯示出包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之全部或片段之分子的細胞與磁珠(例如DYNABEADS)一起培育，該磁珠已與本發明之抗原結合分子聯結。較佳地，培育係在允許同時形成結合複合物/聯結物之條件下(諸如在生理條件下)，在選定之用於該目的之培養基(例如RPMI-1640)的存在下進行。
然後，將與小珠結合之細胞(其將呈現包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之分子)與未顯示出包含 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之分子的細胞分開。於一實施態樣中，可在磁體之存在下，以培養基(諸如補充有10%FBS之RPMI-1640)洗滌該小珠。
然後，可將該選定之細胞(即，那些呈現包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之分子的細胞)與小珠分開:首先，在培養基中生長該選定之細胞。細胞長出後48小時，可將磁珠與溶液中之細胞分開並丟棄，留下呈現所需分子之純的細胞群。
於一替代之實施態樣中，該小珠沒有磁性，於該實施態樣中，亦可遵循上述步驟並調整之使其適合維持細胞之完整性，但亦允許與小珠結合之細胞與未與小珠結合之細胞分開。
於一替代之實施態樣中，本發明之抗原結合分子(例如選殖株8及/或16和其片段)可為經His標籤(即，以短多聚組胺酸序列標記)，以藉此協助使用包含過渡金屬離子(例如Ni2+ 、Co2+ 、Cu2+ 或Zn2+ ,)之樹脂分離細胞，該過渡金屬離子係被固定在樹脂上。然後，可將該抗原結合分子與已知或被懷疑呈現分子(其包含 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500))之細胞在適合形成包含該細胞及該抗原結合分子之複合物的條件下一起培育。在培育之後，將細胞與可被配置在固體結構(諸如孔槽盤、柱或其他結構)中之樹脂接觸。然後可藉由以咪唑洗滌將該抗原結合分子-細胞複合物彼此分離，該咪唑之濃度將較用於形成諼結合複合物中所使用之任何溶液所包含的任何咪唑更高。然後，將洗提出之細胞離心下來，在RPMI或其他合適之培養基中洗滌，然後再懸浮於培養基中。實施例 6:CAR 陽性 T 細胞之分選
根據製造商之指示，使用Ficoll-Paque密度離心，從健康供體之白血球濃縮物(leukopak)(HemacareTM )分離出PBMC。使用在R10培養基+IL-2(300IU/ml，Proleukin®，Prometheus® Therapeutics and Diagnostics)中之OKT3(50ng/ml，Miltenyi BiotecTM )刺激PBMC。刺激後2天，透過病毒轉導這些經活化之初代人T細胞來產生CAR T細胞。根據在篩選中使用之CAR的來源使用逆轉錄病毒(pMSVG載體)或慢病毒(pGAR載體)來執行轉導。使用與藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸螢光素(FITC)軛合之蛋白L來確認CAR構建體表現並測定病毒轉導效率。
從培養物中取出培養之CAR T細胞，以PBS洗滌 並與該與PE軛合之抗連接子抗體在染色緩衝液中一起培育30分鐘，該染色緩衝液包含PBS(pH 7.4)、0.2%(w/v)牛血清白蛋白和0.09%疊氮化鈉。將細胞在染色緩衝液中洗滌二次，再懸浮後以BD Aria細胞分選儀分選。分選後分析負門控和正門控之細胞的組成(第10圖)。實施例 7: 使用抗原結合分子刺激 / 活化 CAR 陽性 T 細胞
通常係使用抗CD3抗體(諸如選殖株OKT3，此為小鼠抗CD3抗體)連同抗CD28抗體透過T細胞受體(TCR)刺激T細胞以提供第二信號或共刺激信號。當與同源抗原交互作用時，CAR T細胞可透過其胞內CD3ζ和共刺激結構域(諸如CD28)提供二種信號。
因此，亦提供活化CAR陽性T細胞之方法，該CAR陽性T細胞呈現分子，該分子包含可被特定之抗原結合分子(例如可識別包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之分子的抗原結合分子，諸如抗體(諸如本文所揭示者:選殖株8及/或16，及其片段))識別之特定抗原決定部位。該方法可調整成適合用於任何可識別T細胞上之所欲蛋白的抗體，該T細胞含有活化結構域，諸如嵌合抗原受體(CAR)，其包含 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)。活化可使用特異性識別CAR或類似分子之胞外組分的與盤結合、與小珠結合、與聚合物結合或其他形式之抗體達成。
於本實施例中，我們證明CAR+T細胞可在玻管內視需要地以抗連接子抗體(諸如本文所提供者)刺激。為了用於比較，使用通常用於在玻管內活化T細胞之OKT3抗體(參見，例如Landegrenet al. ,(1984)Eur. J. Immunol. 14(4):325-28)來刺激所有T細胞。可使用用於生長之袋、燒瓶、盤或其他容器來刺激T細胞，或依本文之描述，亦可使用孔槽盤刺激。
於一情況中，依實施例4(第10圖)中之描述進行CAR-T細胞分選並混合以形成具固定百分比之CAR陽性細胞的細胞群；然後允許這些細胞在37℃，OpTmizer培養基中從分選恢復24小時。將經組織培養處理之12孔槽盤與OKT3或抗連接子抗體(1.5μg/mL，在HBSS中)在37℃下一起培育2小時並以HBSS洗滌三次。將在2mL具有IL-2的OpTmizer培養基中之0.5e6經界定的T細胞群加入預先以抗體塗層的盤中並將細胞在37℃下培育長達1週並在不同時間點採取樣品。
藉由流式細胞術分析樣品以檢查是否存有CAR和各種活化標記物，包括CD25、CD69和4-1BB。隨著時間推移，我們觀察到OKT3抗體刺激所有T細胞且CAR陽性細胞的百分比不變。相反地，當與抗連接子抗體一起培育時，為CAR-陽性之T細胞接受刺激並增殖，變成佔該群體之較大百分比(第11圖)。此外，藉由觀察T細胞表面上之CD69和4-1BB的量，我們觀察到OKT3刺激所有T細胞。相反地，以抗連接子抗體刺激時係選擇性地刺激CAR陽性細胞(第12A和12B圖)。
因此，可在玻管內選擇性地刺激呈現分子之細胞，該分子包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)。實施例 8: 使用抗原結合分子在活體內刺激 / 活化 CAR 陽性 T 細胞
在此實施例中，以本文所提供之抗連接子抗體選擇性地在活體內刺激CAR+T細胞。將MM1S細胞植入雌性NSG小鼠中。為了清除MM1S細胞，在第6天注射包含肽GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)之CAR-T細胞。在第13天，進行氟脫氧葡萄糖正子發射斷層掃描(FDG-PET)實驗以評估基線代謝。將選殖株8之抗連接子抗體注射入每隻小鼠中並在24小時後重複FDG-PET實驗。如第13圖所示，在後肢中可觀察到抗體治療後FDG-PET信號增加最多，這表明對活體內注射抗連接子抗體產生反應而刺激CAR+T細胞。實施例 9: 使用雙功能抗體 減除 表現含有特定肽之分子的細胞
本實施例中，可在玻管內以抗連接子/抗人CD3雙功能抗體(包含抗連接子結合部分，諸如在選殖株8和16 中)選擇性地殺死CAR+T細胞。將以含有特定抗原決定部位GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)之CAR (CAR1)轉導之T細胞、以不包含抗原決定部位之CAR(CAR2)轉導之T細胞或未經轉導之T細胞(Mock)在具有T細胞補充劑、青黴素、鏈黴素、麩胺醯胺和IL-2之OpTmizer培養基中在96孔U型底盤中培養。每個孔含有20000 個T細胞。將濃度從1.28pM至100nM之雙功能抗體加入各個經CAR-和Mock轉導的T細胞樣品中。16小時後，以Live/Dead Violet(Molecular Probes)和重組蛋白L/鏈親和素-PE將細胞染色以評估死亡細胞之數目和CAR+T細胞之百分比，此為雙功能抗體濃度之函數。如第14A圖所示，在CAR1樣品中，與具有破裂之膜的細胞結合之染料的量增加，而對照組CAR或無CAR之表現未導致螢光染料顯著增加(分別參見CAR2和Mock)。此可藉由CAR1 T細胞之百分比較CAR2 T細胞之百分比降低進一步觀察到(第14B 圖)。CAR1細胞開始時約40%陽性，但在最高濃度之雙功能抗體下被減除到約為總T細胞之10%，而CAR2 T細胞則保持在固定之20% CAR+。因此，可在玻管內以特異於T細胞和特定之肽的雙功能抗體選擇性地減除呈現包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)和其子序列，特別是GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO:3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO:499)及/或KPGSG(SEQ ID NO:500)之分子的細胞。
[[31] 第1A圖]為包含SEQ ID NO:1之連接子序列的scFv序列之條帶圖而第1B圖為其空間填充圖；該連接子以灰色顯示。
[第2圖]之一系列圖形顯示使用呈現嵌合抗原受體(CAR)之細胞進行之流式細胞術實驗的結果，該嵌合抗原受體(CAR)包含SEQ ID NO:1之連接子序列；該結果係使用1、10或100ng之抗體產生，該抗體從二個不同之選殖株(選殖株8，左；和選殖株16，右)產生，且結果顯示出所有三種量之該抗體特異性結合該表現之CAR。
[第3圖]之一系列圖形顯示使用呈現5種不同CAR之細胞進行之流式細胞術實驗的結果，該CAR包含SEQ ID NO:1之連接子序列；且結果顯示出該抗體特異性結合該表現之CAR。
[第4圖]之一系列照片描繪使用呈現CAR之細胞進行之免疫組織化學(IHC)研究的結果；上圖顯示抗體選殖株8特異性結合該呈現CAR之細胞且針對包含SEQ ID NO:1之連接子序列的CAR，而下圖顯示抗體選殖株16特異性結合該呈現CAR之細胞且針對包含SEQ ID NO:1之連接子序列的CAR。
[第5圖]之直方圖描繪在抗體選殖株8和選殖株16上進行之抗原決定部位定位ELISA實驗的結果；結果顯示出雖然所有抗體與全長18聚體(SEQ ID NO:1)結合，選殖株8特異性結合10聚體序列GSGKPGSGEG(SEQ ID NO:2)，而選殖株16特異性結合8聚體序列GKPGSGEG (SEQ ID NO:3)。按出現之順序，該圖形分別揭示SEQ ID NO:1、485-488、1和489-491。
[第6圖]之一系列表格顯示由選殖株8和16分泌之抗體的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的CDR1、2和3區；顯示之重鏈和輕鏈CDR為使用Kabat(按出現的順序，分別為SEQ ID NO:492、8、9、493、20、21、13-15和25-27)、Chothia(按出現的順序，分別為SEQ ID NO:7-9、19-21、13-15和25-27)和IMGT(按出現的順序，分別為SEQ ID NO:494、8、9、495、20、21、13-15和25-27)編號系統之各抗體的重鏈和輕鏈CDR。
[第7圖]之表格顯示18聚體序列 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)及該序列上之抗原決定部位，其中選殖株8之抗體與(GSGKPGSGEG；SEQ ID NO:2和SGKPGSGE；SEQ ID NO:499)結合，且其中選殖株16之抗體與(GKPGSGEG；SEQ ID NO:3和KPGSG；SEQ ID NO:500)結合。
[第8圖]之一系列表格顯示出本文所提供之抗原結合分子的人化形式。
[第9圖]之條形圖指明本發明之抗原結合分子被發現經由抗原決定部位與SEQ ID NO:1結合之區域，該抗原決定部位係藉由ELISA定位。該分析使用聚焦在先前實驗中所鑑定之區域的更小範圍之肽序列來進一步縮小第5圖所示之從ELISA實驗定位之連接子抗體抗原決定部位。
[第10圖]為螢光活化之細胞分選(FACS)繪圖的結果，其顯示出使用本發明之抗原結合分子產生之負-門控及正-門控CAR-T細胞。
[第11圖]之一系列長條圖顯示使用OKT3抗體和本發明之抗連接子抗體在玻管內刺激CAR-T細胞之結果。雖然OKT3活化指定群體中之所有T細胞，使用CAR+對CAR-細胞群比例梯度證明抗連接子MAb優先活化CAR-T群，從而隨時間增加CAR-T細胞群。
[第12A和12B圖]之一系列長條圖和繪圖顯示玻管內刺激CAR-T陽性細胞之效果；該圖形顯示OKT3抗體刺激所有T細胞，而本發明之抗原結合分子僅選擇性地刺激CAR-T陽性細胞。
[第13圖]顯示雌性NSG小鼠之FDG-PET成像，該雌性NSG小鼠在以抗連接子選殖株8 Mab刺激之前和之後，預先注射CAR T細胞。
[第14A和14B圖]顯示與包含肽 GSTSGSGKPGSGEGSTKG之CAR構建體一起培育的雙功能抗體導致細胞死亡增加。如第14A圖所示，當雙功能抗體濃度增加時，在含有該特定肽之CAR構建體的三個複製組的平均結果中可見到較大之中位數螢光強度。當將經對照組CAR或Mock轉導之細胞與雙功能抗體一起培育時，細胞毒性染料螢光的量並未顯著增加。在第14B圖中，CAR+T細胞之百分比的測量值為增加之雙功能抗體濃度的函數。
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Claims (9)

  1. 一種雙功能抗體於製備用於減除個體的呈現分子之免疫細胞群的藥物之用途，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：1)、GSGKPGSGEG(SEQ ID NO：2)、GKPGSGEG(SEQ ID NO：3)、SGKPGSGE(SEQ ID NO：499)及KPGSG(SEQ ID NO：500)，其中該雙功能抗體特異性結合(1)包含選自該群組的胺基酸序列之該分子和(2)呈現在T細胞的表面上之分子或其片段，該分子係選自由下列所組成之群組：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、 CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、第1類MHC分子、第2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞因子受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體及彼等之組合，以允許形成三元結合複合物，該三元結合複合物包含：包含選自該群組的胺基酸序列之該分子、呈現在該T細胞的表面上之該分子或其片段、及該雙功能抗體，其中該雙功能抗體包含：(1)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)CDR1；包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)CDR1；包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VL CDR2；及，包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VL CDR3；或 (2)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VL CDR2；及，包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VL CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中(a)包含選自該群組的胺基酸序列之該分子為CAR；且(b)該T細胞係選自由下列所組成之群組：CD8+T細胞及NK-T細胞。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該CAR包含CD3δ、CD3ε或CD3γ。
  4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該T細胞係配置在玻管內。
  5. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該T細胞係配置在活體內。
  6. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該T細胞係在血液、萃取之組織、體外生長之組織及細胞培養基中一者內。
  7. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該T細胞為自體T細胞。
  8. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該T細胞為同種異體T細胞。
  9. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該雙功能抗體係呈人化形式。
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