JPH0284197A - ヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 筐果よΩ月旦公団 本発明は、緑膿菌に対するヒトモノクローナル抗体とそ
の製造方法およびその用途に関する。具体的には、緑膿
菌リポ多糖（ＬＰＳ）分子中の血清型別を超えて、共通
性が高い外コアオリゴ糖部位に対するヒトモノクローナ
ル抗体で、２種類以上の血清型別の緑膿菌に結合するこ
とを特徴とするヒトモノクローナル抗体、その製造方法
と用途、および該抗体を産生ずるハイブリドーマに関す
る。

本発明の抗体は、緑膿菌を含む感染症の予防治療剤とし
て有用である。

従来の技術および解決すべき課題 細菌感染症の治療において問題とする病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。すなわち、臨床上用い
られる抗生物質の種類の変遷に伴ない細菌感染症を引き
起こす細菌、いわゆる起炎菌が交代してきた。従来、低
病原性または弱毒性といわれた細菌、なかでも、特に緑
膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
による感染例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原菌の
一つとなっている。緑膿菌感染は、免疫抑制剤の投与を
受は免疫能の低下している患者、又は癌患者や熱傷患者
および新生児などの免疫不全・低下症の患者において重
篤な症状を引き起こし死に至らしめる場合が多い細菌感
染として知られている。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多（はぶどう球菌を代表とするほとんどのグラム
陽性球菌や、大腸菌などのダラム陰性菌に感受性を示し
、著効な臨床効果を示してきた。しかしながら、今日ま
での多くの研究開発にもかかわらず、緑膿菌に感受性を
示す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、今日、
感受性を示すとされる薬剤でも、そのほとんどが、緑膿
菌に対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作
用するのみで、殺菌力に欠けており、臨床の場において
著効な治療効果を示すに至っていない。ところで、細菌
感染症を予防および治療することができる療法として、
免疫グロブリン製剤の投与、いわゆる抗体療法があり、
抗生物質療法と併用される、又は、それに代わるものと
して注目されている。ウマやウサギ等の動物を能動的に
免疫することによって抗体価の高い血清を得ることがで
き、その血清を投与する抗体療法は、各種の動物を用い
た実験的感染症において著効な治療効果を示すことが多
くの実勢にて実証されている。ヒト以外の動物由来の血
清を用いた抗体療法がヒトにおいても有効性を示すこと
は、ジフテリア毒素や蛇毒の例で周知のことである。し
かしながら、ヒト以外の動物から得られた異種蛋白をヒ
ト体内へ移入するこの方法は、アナフィラキシ−やその
他のアレルギー反応などの重篤な副作用を引きおこし一
般細菌感染症の治療法として採用されるに至っていない
。

かくして、細菌に対して高い抗体力価を有し、細菌感染
症の治療効果の大きいヒト免疫グロブリンの開発が望ま
れている。

従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人又は細菌感染
腹部患者から血液を採取し、既知の方法にて免疫グロブ
リン画分を分取・精製した後に、ポリエチレングリコー
ル添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、ＤＥＡＥ−カ
ラムクロマトグラフィー等の、凝集物を除去する方法に
より筋肉注射用のみならず、静脈注射用に製剤化された
ものである。

これらヒト免疫グロブリン製剤には、ヒト以外の異種動
物由来の免疫グロブリンを投与した時にみられるアナフ
ィラキシ−等の副作用は無い等の利点をもつが、幾つか
の欠点をもつ。第一に、細菌に対する抗体価が低く、必
ずしも充分な治療効果を期待しえない。第二に、高力価
の免疫グロブリンを大量に安定して供給することが難し
い。

健常人ボランティアや患者より採取された血液を材料に
製造されており、高い力価の血清を一定して入手するこ
とは極めて難しく、製造ロット毎に、抗体価が変動する
ことがある。第三に、任意のヒトの血液を材料に製造さ
れることにより、免疫グロブリン製剤にＨＢウィルスな
どの肝炎ウィルスやＡｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｅｕ
ｋａｅｍｉａｖｉｒｕｓ（ＡＴＬＶ、　ＨＴＬＶ）など
が混入することがあり得る。これらの問題を解決すべく
、従来のヒト免疫グロブリン製剤やマウスモノクローナ
ル抗体に代わるもとして、細菌感染症の予防および治療
に有効且つ有用なヒトモノクローナル抗体の作製および
その応用が望まれている。

抗体が細菌の表層へ結合すると、寅食細胞による細菌の
寅食が促進されたり（オプソニン化による童食能の促進
）、又は補体による細菌の溶解が惹起される。抗体療法
のターゲットとなる緑膿菌の表層抗原としては、ＬＰＳ
、外膜蛋白質、ペン毛および線毛が知られている。この
うち外膜蛋白についてはＳａｗａｄａらがこれらを認識
するマウスモノクローナル抗体はＬＰＳを認識するマウ
スモノクローナル抗体に比べ感染防御に対して極めて多
量の抗体量を必要とすることを示した（Ｊ、　Ｉｎｆｅ
ｃｔ。

Ｄｉｓ、、　１５０．５７０−５７６、１９８４）。

ＬＰＳは、〇−抗原を規定する〇−多糖体、菌種によっ
である程度の共通性がある外コア（ｏｕｔｅｒ　ｃｏｒ
ｅ）オリゴ糖、腸内細菌族に広く共通とされている内コ
ア（ｉｎｎｅｒ　ｃｏｒｅ）オリゴ糖、およびリピドＡ
より成る。

このうち、菌の菌体表層で最も外側に存在する、〇−抗
原（〇−多糖体）と呼ばれる多糖体の構造は２〜５残基
の糖から成る繰り返し単位が重合しており、多種多様で
ある。現在までに後述するいくつかの血清型標準法に対
して、その〇−抗原の構造が解析され報告されている（
Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１０６、６４３−６５１．１９８０；　Ｆｕｒ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、」幻。

２２９−２３７．　１９８６；　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１５０．　５４１−５５０、１
９８５；　Ｅｕｒ、　Ｊ、’Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５
５．６５９−６６９．１９８６；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、　１６７、５４９−５６１．１９８７
）。

しかしながら、〇−抗原の構造決定には、多大の労力を
必要とする為に、現在、緑膿菌の分類には、標準法の〇
−抗原に対して調製された抗血清又はマウスモノクロー
ナル抗体が利用されている。

すなわち、それらの抗体（抗血清）との免疫学的反応性
の差異によって分類される。血清型による分類と呼ばれ
る。

水量による血清型１〜１７　（１７種類）の分類（Ｊａ
ｐａｎ、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　４４．　　Ｌ
　　１９７４）　、Ｆｉｓｈｅｒによる血清型１〜７（
７種類）の分類（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｔ９８、８３
５．１９６９）、日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会
による血清型Ａ−Ｍ（１３種類）の分類（Ｊａｐａｎ、
　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　４６．３２９．１９７６
）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｇｅｎｉ
ｃ　　Ｔｙｐｉｎｇ　　ＳｙｔｅｍＣ［ＡＴＳ）ｌこよ
る血清型１〜１７（１７種類）の分類（Ｉｎｔ、　Ｊ、
　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　３３．２５６．１９８３）　
、等が知られている。各々の分類およびその相互関係を
表１に示す（Ｊａｐａｎ、　、１．　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ
、　４６．３２９．１９７６）。

表１　緑膿菌血清型別分類 ７、１２．１４．１７ 血清型特異抗原である〇−抗原に対する抗体は、対応す
る血清型の緑膿菌による感染症に対しては、優れた予防
・治療効果を示すこと、しかしながら、その他の対応し
ない血清型緑膿菌に対しては効果の無いことが知られて
いる。１３〜１７種類の血清型緑膿菌のすべてに効力を
発揮する為には、各々の１３〜１７種類のモノクローナ
ル抗体を混合して用いることが考えられるが、極めて煩
雑であり実用化は困難である。

現在までＬＰＳのコアに対する抗体に関し、ダラム陰性
閑のコア・グリコリピドに対する各種の抗血清およびモ
ノクローナル抗体の、ダラム陰性菌感染症、特にエンド
トキシンショックに対する効果が、動物を用いた実験的
感染症治療試験、または臨床において示されている。以
下に関連した出願明細書および報文のリストを示す。

特公表昭６０−５０１２４２（ｗ６０−５０１２４２（
、特公表昭６１−５００３５５（ｗ６１−５００３５５
（、特開昭６ｌ−７２８００（ＥＰ１７４２０４）、特
開昭６１−１３０３００　、Ｍｕｔｈａｒｉａ　ｅｔ　
ａｌ：　Ｉｎｆ、　Ｉｍｍｕｎ。

４５、６３１−６３６，１９８４；　Ｔｅｎｇ　ｅｔ　
ａｌ：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ、　　８２．１７９０−１７９４．１９８５
；　Ｇｉｇｌｉｏｔｔｉ＆　５ｈｅｎｅｐ：　Ｊ、　Ｉ
ｎｆ、Ｄｉｓ、　１５１．１００５−１０１１．１９８
５；Ｂｒａｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ、　Ｉｎｆ、　Ｄ
ｉｓ、　１３６（Ｓｕｐｐｌ）、５１６７−１７３、１
９７７；　Ｎｅ１ｌｅｓａｎｄ　Ｎｉｓｗａｎｄｅｒ：
　Ｉｎｆ、　Ｉｍｍｕｎ。

４６、６７７−６８１．１９８４；Ｐｏ１ｌａｃｋ　ｅ
ｔ　ａｌ：ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、７２．１
８７４−１８８１．１９８３；　Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａ
ｌ、　：　Ｃ１１ｎ。

Ｒｅｓ、　３０．５２２Ａ、　１９８２；　Ｙｏｕｎｇ
　ｅｔ　ａｌ：　Ｃ１１ｎ、　Ｒｅｓ、　３２．５１８
Ａ、　１９８４゜該抗血清もしくは、モノクローナル抗
体は、コア・グリコリピドを抗原としているが、多くの
ダラム陰性菌との結合を示し、そのエピトープは、ＬＰ
Ｓ中のへプトース、ＫＤＯなどから成る内コア部位もし
くはリピドＡ部位であることが容易に類推される。

叉、沢田らは、緑膿菌のコア抗原を認識するヒトモノク
ローナル抗体を取得したことを示している。

（沢田、第２１回緑膿菌研究会講演記録１６．１９８７
）しかしながら、実験動物試験において沢田らのモノク
ローナル抗体は感染防御効果がないことを示している。

以上に示した通り、坑外膜蛋白モノクローナル抗体は、
結合範囲は広いが治療効果は期待できず、従来のＬＰＳ
のコアに対する抗体についても同様である。一方、優れ
た効果が期待できる抗〇−抗原モツクローナル抗体につ
いては、対応する血清型緑膿菌に限られ、適用範囲が非
常に狭い。そこで、緑膿菌感染に対して、より幅広（、
著明な予防・治療効果を有する免疫グロブリン製剤の開
発が望まれる。

本課題を解決するひとつの方策は緑膿菌共通抗原の検索
と、その共通抗原を認識し、−血清型別緑膿菌のみでな
く、より幅広い結合スペクトルを有し、かつ複数の血清
型緑膿菌に対して優れた感染予防治療効果をもつヒトモ
ノクローナル抗体の開発である。

課凰脛火Ω土我 こうした状況に鑑み、本発明者らは、前述の問題点を改
善すべく、緑膿菌感染症に有効なヒトモノクローナル抗
体およびそれを含む高力価ヒト免疫グロブリン、および
それを安定的かつ大量に製造する方法を確立するために
鋭意研究し、緑膿菌ＬＰＳにおける血清型別に依存しな
い共通構造として、外コアオリゴ糖部位に着目し、該部
位を認識するヒト抗体産生株の樹立をヒトＢリンパ球を
用いて試みた。その結果、ある特定の化学構造をもつ外
コア部位を認識し、複数の血清型緑膿菌に対し、感染防
御および治療効果を有するヒトモノクローナル抗体を得
た。具体的には、該モノクローナル抗体は、血清型Ａ、
　　Ｆ、　Ｇ、　Ｈ，Ｋ及びＭに属する緑膿菌に特異的
に結合することを特徴とし、０抗原多糖を認識する、即
ち個々の血清型緑膿菌のみと反応する血清型別特異的な
モノクローナル抗体とは区別される。更に具体的には、
抗原決定基が緑膿菌ＬＰＳ中の外コア（ｏｕｔｅｒ　ｃ
ｏｒｅ）部位中のラムノース残基もしくはガラクトサミ
ン残基の近傍に存在する。さらに具体的には、血清型０
２６の大腸菌のＬＰＳに結合する。

本モノクローナル抗体は、マウスを用いた実験的感染症
治療試験において、有効に感染防御および治療効果を示
すことを特徴とする。

従来のＬＰＳのコアに対するモノクローナル抗体は、多
くのダラム陰性菌との結合を示し、そのエピトープが、
ＬＰＳ中の内コア部位もしくはリピドＡ部位であること
が類推される。また、動物を用いた感染実験における感
染防御効果は比較的弱い。一方、本発明におけるヒトモ
ノクローナル抗体は、緑膿菌に広く共通性のある外コア
部位を抗原としており、動物を用いた感染実験において
著効を示すことから、これら抗コア・グリコリピド抗体
とは区別されるものである。

また、沢田らの緑膿菌のコア抗原を認識するヒトモノク
ローナル抗体については、該抗体の緑膿菌への結合スペ
クトルについてＡ型閉７５％、Ｂ型開１００％、Ｅ型開
Ｏ％、Ｇ型閉４３％、Ｈ梨園ｉｏ。

％、■型菌６０％に結合することが示されており、本発
明によるモノクローナル抗体の結合スペクトルとは異な
り、明らかに別の抗原決定基を認識している。また、実
験動物試験において該モノクローナル抗体には感染防御
効果の認められないことが示されている。以上の点から
本発明によって得られる緑膿菌ＬＰＳ中の外コア部位を
認識するヒトモノクローナル抗体は、沢田のヒト抗コア
モノクローナル抗体とも区別され、更に優れた性質を有
するものである。

本発明は、緑膿菌ＬＰＳ中の外コアオリゴ糖部位を認識
し、複数の血清型緑膿菌に対して高頻度に結合し、かつ
、緑膿菌感染症に対する予防・治療効果のあるヒトモノ
クローナル抗体及びそれを少なくとも一種類含む高力価
免疫グロブリン製剤及び、その特異抗体を連続的に産生
じ得るヒト細胞株の取得方法及びその細胞を培養するこ
とを含む特異抗体の製造方法を提供する。

本発明によって得られる緑膿菌ＬＰＳ中の外コアオリゴ
糖部位を認識する抗体とは、複数の血清型別、特定する
に、血清型Ａ、　Ｇ、　Ｆ、　Ｈ，ＫおよびＭ緑膿菌に
高頻度に広く結合する能力をもつ、一つの抗体産生細胞
クローンが産生ずるヒトモノクローナル抗体である。方
法としては生体内又は生体外にて緑膿菌（生菌又はホル
マリンや加熱による死菌菌体）、〇−抗原多糖をもたな
い緑膿菌Ｒ（ラフ）−変異株、好ましくは、該Ｒ−変異
株に由来するＬＰＳによって感作されたヒトリンパ球Ｂ
細胞を骨髄腫細胞（ミエローマ：　ｍｙｅｌｏｍａ）又
はＢリンパ芽球様細胞（Ｂ！ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉ
ｄ　ｃｅｌｌ）と細胞融合することにより、試験管内に
て連続的に細胞増殖し、かつ所望の特異抗体を連続的に
産生ずる細胞株を樹立する。これらの樹立株を試験管内
培養し、培地中に分泌される抗体を精製することにより
抗体を大量に製造する。

血清型とは、緑膿菌の各血清型標準株に対して作製され
た特異的に反応する抗血清又はマウスモノクローナル抗
体を用いた、免疫化学的反応の差異に基づく緑膿菌の分
類法で、ここでは日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会
による分類を指す。

ＬＰＳとは、リポ多糖のことでダラム陰性菌外膜の主要
な構成成分であり、リピドＡと呼ばれる糖脂質に、２−
ケト−３−デオキシオフトン酸、ヘプトース、エタノー
ルアミン、リン酸等を構成成分とする内コアオリゴ糖部
分、および菌種によって異なる成分を有し、緑膿菌にお
いては、グルコース、ラムノース、ガラクトサミン、ア
ラニン等を構成成分としている外コアオリゴ糖部分が結
合しており、更にその先に血清型を規定し、ている〇−
抗原と呼ばれる多糖路が結合したものを指す。

緑膿菌共通抗原としてのＬＰＳの外コアオリゴ糖部位は
、〇−多糖体のつけ根に存在し、〇−多糖体に次いで菌
体の外側に存在すると考えられる。

外コアオリゴ糖の化学構造については、菌株によって組
成比や詳細な化学構造に違いのあることが示されている
（Ｗｉ　１ｋｉｎｓｏｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、
　Ｄｉｓ、　５゜５９４１−Ｓ９４９．１９８３）が、
構成成分は緑膿菌に広く共通であり、グルコース、ラム
ノース、ガラクトサミン、アラニンなどを特徴的な構成
成分とする。

モノクローナル抗体とは、細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ。

２５６、４９５．１９７５＞あるいは、ＥＢウィルス・
トランスフォーメーション法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　
Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ、、匹、　１．９０．１９７３）などにより得
られる、単一な抗体産生細胞クローンにより産生される
、均一な分子構造を有する抗体を指す。

本発明を以下、更に詳細に説明する。

本発明に含まれるヒトモノクローナル抗体の製造方法は
、基本的に、以下の諸過程にわけることができる。

■抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製、■無制限
増殖能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生細
胞株の樹立、■モノクローナルな特異抗体産生細胞株の
培養、■培養液からのモノクローナルな特異抗体の精製
、■モノクローナルな特異抗体を含む高力価免疫グロブ
リン製剤の調製。

順次、以下に説明する。

ヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、緑膿菌ＬＰＳ中の外コアオ
リゴ糖に対する抗体を産生ずるヒトリンパ系細胞で、主
として末梢血液よりリンフォプレップ、モノポリ分離液
などのリンパ球分離液を用いた遠心分離法によって分離
されるが、各種疾患の診断および治療の目的で摘出され
たリンパ節、肺臓などの臓器や渋帯血由来のリンパ球Ｂ
細胞を材料に用いることもできる。緑膿菌による感染症
を患ったごとがあり、生体内で感作された腹部症のヒ１
−由来のリンパ球Ｂ細胞を用いることが望ましい。あら
かじめ、血清中の緑膿菌ホルマリン死菌あるいは緑膿菌
由来のＬＰＳに対する抗体価を測定することにより適切
なリンパ球提供者を選別することができる。また、別の
方法として、緑膿菌症の有無を問わず、ヒトリンパ球Ｂ
細胞を採取し、試験管内にて緑膿菌ホルマリン死菌、好
ましくは緑膿菌ＬＰＳを混合することによって感作せし
めることができる。すなわち、抗原としての緑膿菌ホル
マリン死菌、好ましくは緑膿菌ＬＰＳをリンパ球Ｂ細胞
に添加する。更にアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ
）などの植物性レクチン、ＣＯｗａｎ　Ｉなどの菌体成
分、又はヒトリンパ球の混合培養液や肺臓、胸腺細胞や
請帯血細胞培養液など、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分
化因子等のリンフ才力イン類を含む溶液を同時に、又は
それぞれの組み合わせで添加することによって試験管内
にて抗原感作し、引き続き抗体産生細胞へと増殖・分化
させたヒトリンパ球Ｂ細胞を用いることができる。これ
らのヒトリンパ球Ｂ細胞は、その細胞表面に抗体分子を
有し、ある限られた期間少量の抗体を分泌することが可
能であるが、無制限に増殖することはできないことを特
徴とする。抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞を無限に
連続して増殖可能な細胞株とする方法としては、抗原感
作されたヒトリンパ球細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の存在下に細胞融合する方法を
用いる。用いられる骨髄腫細胞はＰ３Ｘ６３−Ａｇ　８
（Ｐ３）　、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ　８．６５３などの、マ
ウス骨髄腫細胞由来のヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリボンルトランスフェラーゼ（ＩＩＧＰＰＴと略）欠
（社）変異株、ヒト骨髄腫細胞Ｌｌ−２６６由来のＨＧ
ＰＰＴ欠如変異株又は、マウス骨髄腫細胞とヒト骨髄腫
細胞、もしくは、ＳＨＭ　Ｄ−３３などのマウス骨髄腫
細胞とヒトリンパ球Ｂ細胞との細胞融合により得られる
マウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞由来のＨＧＰＲＴ欠如変
異株なとを指す。骨髄腫細胞の代わりに、ヒｌ−Ｂリン
パ芽球細胞由来の１（ＧＰＲＴ欠如変異株を用いること
もできる。　ＰＥＧとしては、ＰＥＧ　１，０００〜６
．０００を３０〜５０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で用いる。レ
クチン、ポリＬ−リジンやＤＭＳＯなどを添加すること
により融合効率を高めることもできる。融合方法は、マ
ウス細胞同志を融合し、マウスモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマを取得したＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ
　Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６．
４９５．１９７５）に準する。簡単に記述すれば、抗原
感作されたヒトリンパ球細胞とＨＧＰＲＴの欠如した骨
髄腫細胞もしくはマウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞とを３
〜ｌ：１の割合にて混合し、４５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ　
　１５００〜６０００を０．５−１分間に少量ずつ加え
、３０秒〜３分間静置する。その後、５〜ｌＯ分間に１
０〜５０−の血清不含培地を加え、２ｄのＦＣＳを加え
、３７°Ｃにて１０〜６０分間インキュベートする。　
遠心後、培地を加え１０”〜ｌＯ″個細胞７／セの濃度
に調製し、９６穴マイクロプレートにｌウェルあたり２
Ｘ１０’〜２ＸｌＯ’個の細胞を播種する。翌日、ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン含有培地（ＨＡ
Ｔ培地と略）又は、ヒポキサンチン・アザセリン含有培
地（ＨＡｚ培地と略）に半量交換し、５％ＣＯ□、３２
〜３７°Ｃにて培養する。約１０〜２０日間新しいＨＡ
Ｔ培地又はＨＡｚ培地に、続いて約３〜５日間ヒポキサ
ンチン・チミジン含有培地（ＨＴと略）又は、ヒポキサ
ンチン含有培地（Ｈ培地と略）に、３日毎に半量ずつ交
換を続は約２〜３週間培養して、増殖してくるコロニー
、いわゆるハイブリドーマを得る。ＨＧＰＲＴ欠如変異
株を用いることはなく、代謝阻害剤を組み合わせること
によってハイブリドーマを選択することも可能である。

ハイブリドーマの培養液の１７種類の血清型別パネルか
ら成る１７種類の緑膿菌ホルマリン死菌あるいはＬＰＳ
に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法又はラジオイムノアソセ
、イ（ＲＩＡと略）によって測定し、更には、ウェスタ
ン・プロッティングの手法を併用することにより、緑膿
菌ＬＰＳの外コア部位に対する特異抗体産生株を選別す
る。

限界希釈法又は軟寒天法によって、２〜３回クローニン
グを繰り返し、増殖の早い、特異抗体産生量の多い、安
定した細胞株を得る。

以上、細胞融合法（ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈ
ｏｄ；ｈｙｂｒｉｄｏｍａｍｅｔｈｏｄ）を用いて、抗
原感作ヒトリンパ球Ｂ細胞より樹立された細胞株は、連
続的に増殖することができること、しかも、特異抗体を
安定的に、かつ大玉に産生じ得ることを特徴とする。

これら樹立されたハイブリドーマ（０，５〜５ＸｌＯ’
個細胞／′ｄ）を通常の動物細胞培養培地にて００２イ
ンキユベーターを使用して２〜ｌＯ％ＣＯ□、３２〜３
７°Ｃの条件のもとて培養フラスコやプレート等の容器
内で静置培養又は回転培養する。特に大量に培養する時
は、動物細胞用に設計されたジャーファーメンタ−やホ
ロファイバーシステム等を用いることもできる。通常の
動物細胞培養用培地とは、ウシ胎児、仔ウシ、ウシ、ウ
マおよびヒトなどの血清を２〜２０％含有するＲＰＭＩ
　１６４０　、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭに代表される培
地、又は、インシュリン、トランスフェリン、エタノー
ルアミン、セレナイ！・、ウシアルブミン、リピドなど
細胞の増殖に必要な微量成分を含む無血清培地を指す。

上記の試験管内細胞培養以外に、ハイブリドーマをヌー
ドマウスなどの動物体内へ接種することによって細胞を
腹腔などの体内にて培養することも可能である。マウス
やヌードマウスの場合、１匹あたり０．５〜２．５Ｘ１
０’個の細胞を腹腔内投与する。この場合、細胞接種前
に、ブリスタンや抗アンアロＧＭ、抗体を投与すること
が望ましい。

Ｘ線照射や摘牌手術も有効の場合がある。

抗体の精製は通常の生化学的手法を組み合わせることに
よってなされる。すなわち、硫安沈澱分画法、エタノー
ル沈澱分画法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー
、高速液体クロマトクラフィー、電気泳動法等である。

精製過程において、凝集物の形成や抗体活性の低下を防
ぐ工夫が必要である。例えば、ヒト血清アルブミン（Ｈ
３Ａと略）を０．０５〜２％のｌ農産で添加する。その
他グリンンやし一アラニンなどのアミン酸類、特にリジ
ン、アルギニンやヒスチジンの塩基性アミノ酸、グルコ
ースやマンニトールなどの糖類、塩化ナトリウムなどの
塩類を添加することが好ましい場合がある。　ＩｇＭ抗
体の場合、特に凝集しやすいことが知られている。β−
プロピオニラクトンや無水酢酸などで処理することは、
凝集を阻止することができ静脈内投与も可能とする。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、生物学的製剤の
製剤化に通常用いられる方法によって製剤化される。基
本的には、メンブレンフィルター等による濾過除菌操作
の後に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥され
る。

該ヒトモノクローナル抗体製剤は、緑膿菌感染予防・治
療剤として緑膿菌ＬＰＳ外コア部位に対する１種類のヒ
トモノクローナル抗体より成ることも可能であるが、更
に好ましくは、緑膿菌■７ＰＳの外コアオリゴ糖部分の
異なる化学構造を有する抗原決定部位を認識しうる、２
種類以−ヒのヒ）−モノクローナル抗体と混合して用い
られる。また、これら以外の緑膿菌表層抗原、例えばＬ
ＰＳ中の〇−抗原、′Ｉト膜蛋白、ペン毛あるいは線毛
、さらには、緑膿菌由来の病原因子である、外毒素、エ
ラスターゼ、プロテアーゼなどの外酵素などを認識する
ヒトモノクローナル抗体あるいは従来型のヒト免疫グロ
ブリン製剤と混合して使用される。

更には、緑膿菌以外の細菌、ウィルス、真菌、原虫、癌
細胞に対するヒトモノクローナル抗体、あるいは、従来
型のヒト免疫グロブリン製剤と混合して使用することも
可能である。

従来のヒト免疫グロブリン製剤に、本発明により得られ
るヒトモノクローナル抗体を添加して、緑膿菌に対する
高力化免疫グロブリン製剤とされる。

該ヒトモノクローナル抗体は、緑膿菌に共通性の高い抗
原であるＬＰＳ中の外コア部位への結合を介して緑膿菌
表ＪＮ”−結合して、菌体をオプソニン化することによ
り賞金細胞による賞金・殺菌作用の増強、又は補体を活
性化することによる溶菌作用等により緑膿菌による実験
的マウス感染症を治療することができる。

緑膿菌による感染症およびその細菌を含む混合細菌感染
症の治療・予防に用いられる時、該ヒトモノクローナル
抗体は、通常、成人に対し約０．５〜５００ｍｇ　、好
ましくは５〜５０ｍｇが投与される。

以上、詳しく述べたように、本発明によって得られるヒ
トモノクローナル抗体は同抗原に対して、高い抗体価を
有し、マウス実験的感染症の系で優れた治療効果を示し
、また、該抗体が複数の血清型別緑膿菌に対して有効で
あることが第一の特徴である。その他、ヒト由来の蛋白
であることより、異種蛋白の投与時にみられるアナフィ
ラキシ−等の副作用の少ないことが期待されるし、特定
の細胞より生産・精製される抗体であることより、不特
定多数のヒト血液より製造された従来の免疫グロブリン
製剤にくらべ、未知のバイオハザードが混入してくる可
能性の低いことが特徴である。又、本モノクローナル抗
体の製造方法としては、生体外で、大量に、高力価の抗
体を安定して製造することが特徴であり、従来のヒト血
液より製造する方法にくらべ高力価など生物活性の点で
、安定的供給ができるなど品質管理の点で優れる。

以上、本発明の基本となるものである。

次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

実施例１ ヒト・マウス細胞融合によるヒトモノクローナル抗体Ｍ
Ｈ−４Ｈ７産生株の樹立 （１）ヒト末梢血からのリンパ球の調製、及び培養血清
中の緑膿菌表層に対する抗体価が高い健常人ボランティ
ア、ドナーより末梢血１０ｆＷを採取した。遠心管（住
友ベークライト、５〇−容積）に１５、ｄのモノポリ分
離液（Ｆｌｏｗ、　Ｌａｂ、）を入れ、その上に更に末
梢血２０−を静かに重層した。低速遠心機（トミー精工
、　Ｒ３−２０ＢＨ）を用い、１，５００ｒｐｍ　（。

−ターＴＳ−７）で、室温３０分間遠心分離し、赤血球
とリンパ球を分離した。リンパ球を含む部分を回収し、
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ＭＥＭ（以下
Ｄ−１ｉ１６Ｍと略す）で、３回洗浄した後、細胞数を
計算した。その結果、　！、２ＸＩＯ’　ケのリンパ球
を得た。

得られた末梢血リンパ球６ＸＩＯ’細胞を、抗原として
ホルマリン処理緑膿菌死菌（ＩＩＤ１００ＩＣＡ型）。

＋１０１０２０　（Ｇ型）各０．０００２％）を含む６
６−のリンパ球培養用培地（後述）に懸濁し、１ウエル
あたり１．５Ｘｌｏ’　ケのリンパ球細胞となるように
、２４ウエルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、　＃３
４２４）に分注し、５％ＣＯ，，３７℃にて、６日間培
養した。

上記のリンパ球培養用培地とは、非動化したウシ胎児血
清（以下ＦＣ３と略す）を２０％（ｖ／ｖ）　、ピルビ
ン酸ナトリウム（０，０５ｍｇ／ｉ　）、　２−メルカ
プトエタノール（５Ｘ　１０−’Ｍ）、ウシ血漿由来ト
ランスフェリン（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｒｐ、　）　３０ｇｇ／ｄ、ア
メリカヤマゴボウ由来植物レクチン（以下ＰＷＭと略す
）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、　）　０．０１％（ｖ／ｖ）
を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を指す。

（２）細胞融合 ヒト・マウス・ヘテロ・ミエローマ細胞ＳＨＭ−Ｄ３３
（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１６６８）をＤ−！、ｌε
Ｍ（１５％ＦＣ３を含む）で継代しておき、そのうち２
．５ＸｌＯ’　ケの細胞をＤ−ＭＥＭにて２回洗浄した
。

一方、実施例！−（１）の記載通り、末梢血１）ンパ球
を６日間培養後、２４ウエルマイクロプレートより回収
し、細胞数を計算したところ、７．４ｘｌＯ’ケのリン
パ球が回収された。　このリンパ球をＤＭＥＭにて３回
洗浄し、上記のヒト・マウス・ヘテロ・ミエローマ細胞
と混合し、遠心により細胞を沈査とした。

この沈査に、ｌ−のポリエチレングリコール（ＰＥＣ）
　　溶ｌ夜（０，４５ｇ　　ＰＥＧ４０００　　Ｍｅｒ
ｃｋ、　　０．４５ｄ　　ＰＢＳ（−）。

０、ｌｄジメチルスルフすキンド）を約１分かけて遠心
管を回転しつつ添加し、室温にて１分間静置した。

次に、Ｄ−ＭＥＭを１分間２７ｎｌの割合で遠心管を回
転しつつ添加し、これを４回繰り返し、更に、ｌＯ％Ｆ
Ｃ３を含むＤ−ＭＥＭで同様の操作を３回繰り返す。

最後に１．５ｍｌ！ＦＣ３を加えた後、３７℃にて２０
分間静置した。静置後、遠心により細胞を沈査として集
め、１５％ＦＣ３，０，０５ｍｇ／ｄピルビン酸ナトリ
ウム、０．２０／−インスリン、０．１５ｍｇ／−オキ
ザロ酢酸、１００μＭアザセリン、　１００μＭヒポキ
サンチンを含む４０−のＤ−ＭＥＭ培地（以下）ＩＡｚ
選択培地と略す）に懸濁して、ｌウェルあたり６．５Ｘ
ＩＯ’　ケのミエローマ細胞となるように、９６ウエル
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３０４０）に１０
０μｊ７ずつ分注した。マイクロプレートには、あらか
じめ、保護細胞として各ウェルマウスＢＡＬＢ／Ｃ肺臓
細胞ｌＸｌ０’　ケ、及びマウスＢＡＬＢ／Ｃ腹腔浸出
細胞ｌＸｌ０’　ケとなる様に前出の培地に対する懸濁
液を１００μβずつ分注し、５％Ｃ０□３７°Ｃにて１
日培養しておく。このマイクロプレートを、５％ＣＯｔ
　３７℃にて培養し、２〜３日ごとにＨＡｚ選択培地に
て半量を培地交換した。１週間後に、ＨＡｚ選択培地に
替えて、ＨＡｚ選択培地よりアザセリンを除いたＨ−培
地にて、半量を培地交換した。その後は、アザセリン・
ヒポキサンチンを含まないハイプリドーマ培養用Ｄ−Ｍ
ＥＭ培地（１５％ＦＣ３，０，０５ｍｇ／−ピルビン酸
ナトリウム、　０．２ｕ／−インスリン、０．１５ｍｇ
／ｍ／オキザロ酢酸を含むＤ−４ＥＭ培地）にて、２〜
３日ごとに半量を培地交換した。融合後約３週間の時点
に増殖のみられたウェルの培養上清について、緑膿菌を
グルグルアルデヒドにより固定した９６ウエルマイクロ
プレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３９１２）を用いて酵素免
疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍａｎｏ
　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ：ＥＬＩＳＡ）により、
緑膿菌表層抗原に対する抗体産生の有無を調べた。緑膿
菌は車間の分類による１７種類の血清型の標準法（ＡＴ
ＣＣおよび東大阪科学研究所微生物株保存施設から入手
可）を用いた。ｌウェルで複数の緑膿菌血清型別標準株
を強く反応するＩｇＭ抗体を産生じていることが確認で
きた。このウェル中のへテロ・ハイブリドーマを拡大培
養および、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｔｉｎｇ　ｄｉｌｕ
ｔｉｏｎ）によりクローニングを行い安定にヒトＩｇＭ
抗体を産生ずる細胞株ＭＨ−４Ｈ７が得られた。以下、
細胞株Ｍｌ−１−４Ｈ７の産生ずるヒトモノクローナル
抗体に対してもＭＨ−４Ｈ７の名称を用いる。ハイブリ
ドーマＭＨ−４１１７は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第２４０２号として寄託した。ヒトモノ
クローナル抗体Ｍ　Ｈ−４１］７はＩｇＭ（μ、λ）で
あった。

また、血清中の緑膿菌表層に対する抗体価が高い別のド
ナーからも、上記と同様のリンパ球調製、試験管内特異
Ｂ細胞活性化及び細胞融合を行うことにより、同様の性
質をもつＩｇＭ産生ノ１イブリドーマ細胞株が得られた
。

実施例２ ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７のＥＬＩＳＡによ
る結合スペクトラムの検討 ＋１）　ＥＬＩＳＡによる抗緑膿菌抗体価の測定抗緑膿
菌表層抗原抗体価の測定は以下の方法で行なった。波長
６００ｎｍにおける吸光度が０．２となる様に緑膿菌を
燐酸緩衝液（ｐＨ７，２、組成ＮａＣ１（８ｇ＃’）、
ＫＣＬ（０，２ｇ／　１’　）、ＮａＨＰｏ、　１２Ｈ
２０（２，９９ｇ／ｌ）およびＫＨ２ＰＯ，（０，２ｇ
＃　）　：　Ｐ　Ｂ　Ｓと略）へ懸濁し、９６ウエルマ
イクロプレート（ファルコン＃３９１２）　（マイクロ
プレートと略）にｌウェル当り５０７１Ｎずつ分注、２
．０００ｒｐｍ１５分間遠沈した。２％ゲルタールアル
デヒドをｌウェル当り５０μβずつ添加し菌体をマイク
ロプレートに固定した。

マイクロプレートから菌体溶液を除去した後３２６ウシ
血清アルブミン（以下Ｂ　Ｓ　Ａと略称する）ＰＢＳ溶
液をｌウェルあたり１２０μβずつ分注し３７℃にて３
０分間インキュベートすることにより菌体の未吸着部分
をブロッキングした。マイクロプレートを抗原吸着プレ
ートとして以後の操作に用いた。必要に応してこの段階
で一２０°Ｃに保存した。

アッセイ前に抗原吸着プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ　（以下ＰＢＳＴと略）で３回洗滌した
。

その後１％ＢＳＡａ有ＰＢＳＴをｌウェルあたり５０μ
１分注、必要に応し１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで適宜希釈
した試料（血清腹水又は培養上清）をｌウェルあたり５
０゛μｐ加え、３７°Ｃで２時間インキュベート・シた
。その後試料を除去し、ＰＢＳＴで３回洗滌した。続い
て第２抗体液をｌウェルあたり１００μｐずつ加え、３
７℃で２時間インキュベートした。第２抗体として１％
ＢＳＡ含有ＰＢＳて５００〜１．０００倍希釈したホス
ファターセ標識アフィニティ精製抗ヒト免疫グロブリン
抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ
、　　Ｉｎｃ、　）を用いた。

ＩｇＧ　、　ＩｇＭ抗体価の測定にはそれぞれホスタフ
７ターセ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒト　ＩｇＭ抗体を
用いた。第２抗体を除去し、ＰＢＳＴで３回洗滌後発色
基質溶液（３ｍｇのＰ−ニトロフェニルリン酸−２−ナ
トリウム塩を７’のＮａＮ＋　（０，２ｍｇ／ｂｒ＋Ａ
’）ＭｇＣ１＋　・６Ｈ２０（０，１ｍｇ／Ｊ　）を含
む１０％ジェタノールアミン緩衝液ｐＨ９，１に溶解し
た水溶液）をｌウェルあたり　１００μβずつ加え、３
７°Ｃて反応させた。反応後の００．。、をマルチスキ
ャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）で測定した。

（２）緑膿菌血清型別標準株との結合性！ＩＩＨ−４Ｈ
７と緑膿菌血清型別標準株（東京大学医科学研究所菌株
保存施設より分与）との反応を実施例２−（１）のごと
＜　　Ｅｌ、ＩＳＡ法で調べた。菌株はノ＼−トインフ
ユージョン寒天培地を用いて培養した。

血、青型別 菌株 ＥＬＩＳＡ値 ＩＩｏ　５００４ ！１Ｄ　５１４１ ［１０５０１８ Ａ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｈ型およびに型の緑膿菌血清型別標
準株に選択的に結合した。

（３）緑膿菌臨床分離株との結合性 ＭＨ−＝ＩＨ７は、Ａ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｈ型およびに型
録膿菌標準株との結合が確認された。そこで、これら６
種血清型、更に臨床分離頻度の高いＢ型。

Ｅ型、Ｉ型およびＭ型に関し、各々の複数の臨床分離株
との反応を検討した。その結果、Ａ型株７０？６．Ｆ型
株８０％、Ｇ型株８６％、Ｈ型株６０％、に型株７５％
およびＭ型株・１５％と結合した（表３）。また、Ｂ型
、Ｅ型およびＩ型臨床分離株＆２０株についてＭｌｌ−
４Ｈ７の結合性を検討したが、結合は全く見られなかっ
た。

表３　　　ＭＨ−４Ｈ７の臨床分離株への結合性血清型
　　　　菌　株　　ＥＬＩＳＡ値（００，、、）Ａ　　
　　　５Ｐ６７４５　　　０５３ＳＰ　６７４６　　　
１４６ ＳＰ　６７８３　　　１１０ ＳＰ　６８１８　　　２０３ ＳＰ　６８３０　　　０１３ ＳＰ　６８・１０　　　１１７ ＳＰ　６７０８ａ　　　　１８２ ＳＰ　９７１０　　　１６７ ＳＰ　９７１１　　　１０７ ＳＰ　９７３１　　　　　０ ＳＰ　９７６２　　　　　０ ＳＰ　９７６３　　　　　０ ＳＰ　９７６８　　　１．２６ ＳＰ　９７８０　　　１．７５ ＳＰ　１００２９　　　０．３３ ＳＰ　＋００４０　　　　０ ＳＰ　１００６０　　　０．３９ ＳＰ　１０６４Ｈ　　　１．７８ Ｓｌ’　１０６７６　　　　０ Ｆ　　　　　　　ＳＰ　６７７０　　　　　２．１５Ｓ
Ｐ　６７７１　　　　　　　０ ＳＰ　６８０８　　　　　０．４９ ＳＰ　６８５１　　　　　２．２４ ＳＰ　６９２１　　　　　１．５３ ＳＰ　９７０９ ＳＰ　９７１２ ＳＰ　９７１４ ＳＰ　９７１７ ＳＰ　９７１８ ＳＰ　９７３８ ＳＰ　９７８５ ＳＰ　９７４３ ＳＰ　９７９２ ＳＰ　９７５５ ＳＰ　９７６１ ＳＰ　９７６７ ＳＰ　９７７２ ＧＮ　　１１１８７ ＴＬ　２３７８ ＴＬ　２４２４ ＳＰ　６７８８ ＳＰ　９７２８ａ ２．３１ ２．２９ ０．０６ ２．２８ ２．２３ １．２９ ２．３１ １．９８ ２．２６ ２．４５ ２．３３ ２．４４ ２．３３ ２．４３ ２．４・１ ２．４□１ ＳＰ　６８９６ ＳＰ　６９３１ ＳＰ　７５０３ ＳＰ　７５０７ ＳＰ　７５１４ ＳＰ　７５２０ ＳＰ　７５２２ ＳＰ　７５３２ ＳＰ　７５５５ ＳＰ　　１００５４ ＳＰ　　１００６８ ＳＰ　　１０６７８ ＳＰ　　１０６８１ ２．２３ ２．４４ ２．４２ ２．４０ ２．４２ ０．０４ ２．０６ １．７１ ＳＰ　９７５１ ＳＰ　７８６１ ＳＰ　７８７３ １．９６ ０．０６ １．９６ に懸濁し、これを５０μβずつＵ字型９６ウエルマイク
ロプレート（住人ベークライト）に分注した。

そこに、２倍希釈系列をとったＭＨ−４Ｈ７溶液または
、対照として、Ｂ型Ｏ抗原を認識するヒトモノクローナ
ル抗体ａｎｔｉ−旧１’ｐｅ　ｈＭｃＡｂ　（ｉｇＭ）
溶液を５０μβずつ添加した。反応液を４°Ｃで一夜放
置した後、凝集の有無を見た。結果を表４に示す。

表４　　Ｍｌ（−、ｉＨ７の菌体最小凝集濃度抗　体　
　　　菌株（血清型）　最小凝集濃度ＳＰ　６９０８　
　　　　１．０２ 実施例３ ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７の各種血清型別標
準株に対する凝集活性の検討 ＭＨ−４Ｈ７の凝集活性を血清型別標準株のホルマリン
死菌を用いて、最小凝集抗体濃度として求めた。

表４に列記しである各標準法をハートインフユーンヨン
寒天培地を用いて培養し、菌体を１％ホルマリンで３７
°Ｃ１−夜装置した。得られたホルマリン死菌を６００
ｎｍの吸光度が０．２になる様にＰＢＳ（−）”　ｎ、
ｄ、　　；　　＞２５μｇ／＋ｎ／以上の結果よりＭＨ
−４Ｈ７は菌株によってばらつきがみられるが、抗Ｂ型
Ｏ抗原抗体ａｎｔｉ−Ｂｔｙｐｅ　ｈＭｃＡｂと同程度
の凝集活性が認められた。

実施例４ ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７が認識する抗原の
ウェスタン・プロッティングによる解析（１）リポ多糖
標品を用いたウェスタン・プロッティングによる分析 緑膿菌血清型別標準球１１Ｄ　１００１　（Ａ型）、Ｉ
ＩＤ　１０２０（Ｇ型）のリポ多糖はＷｅｓｔｐｈａｌ
と、Ｊａｎｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒ、　Ｃｈｅｍ、、　５．８３−９１　１９６５）に
準じて行った。即ち、まず緑膿菌をハート・インフュー
ジョン・ブイヨン培地（日永製薬）を用いて対数増殖後
期まで培養し、遠心によって菌体を集めた。湿菌体を４
５％フェノールで６８℃にて処理した後、３０００ｒｐ
ｍ、　ｔｏｏＣ，１５分遠心分離し、水層にリポ多糖を
抽出した。この水溶性画分を臭化セチルトノメチルアン
モニウムで脱核酸した後、エタノール沈澱をリポ多糖標
品とした。

＋１Ｄ　ｆｏｏｌ及びＩＩＤ　１０２０のリポ多糖をサ
ンプルバッフｙ　　（３１ｍＭ　トリスバッフｙ　−ｐ
Ｈ６，８／１．５ＸＳＤＳ／゛５Ｘグリセロール／２．
５％メルカプトエタノール７０、００５ＸＢＰＢ）で１
００°Ｃ，５ｍ１ｎ処理後、０．２％ＳＯ３を含む１２
．５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動後、デュラ
ポア・フィルター（ミリポア）にトランスファーした。

このフィルター上でアルカリホスファターセ標識ヤギ抗
ヒトＩｇＭ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆　Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　　Ｉｎｃ、、
）を用いた酵素抗体染色法により、ヒトモノクローナル
抗体〜ＩＨ４Ｈ１が認識している抗原を同定した。対照
として同一試料を泳動し、ゲルを銀染色法（Ｂｉｏ　Ｒ
ａｄ製キット）により染色した。

銀染色の結果、高分子量部分に〇−多糖を有するスムー
ス型ＬＰＳのハシゴ状の一連のバンドが見られた。この
ＬＰＳに特徴的なバンドは、Ｏ多糖の繰り返し単位の数
の不均一さに起因している。

更に、低分子量部分には、ブロードなシングルバンドも
しくは数本のバンドが見られ、これらはＯ多糖をもたな
いもしくは繰り返しを数単位しかもたないラフ型、セミ
ラフ型ＬＰＳのバンドである。

その結果、［（Ｄ　１００１．　　ＩＪＤ　１０２０両
株のリポ多糖共に、低分子量部分、即ちＯ多糖が短いか
全く存在しないセミラフもしくはラフ型リポ多糖の位置
に強い発色が認められた。銀染色で見られるＯ多糖縁り
返し構造を有するスムース型リポ多糖のハシゴ状のバン
ドに相当する部分には、ＭＨ−・１）１７による反応は
全く見られないが、ごく僅かな発色しか認められなかっ
た。

（２１Ｓ　Ｄ　Ｓ処理菌体を用いたウェスタンブロッテ
ィングによる分析 緑膿菌血清型別標準法［ＩＤ　１００１　（Ａ型）、　
ＩＩＤ　１００６（Ｆ型）、　１１０１００８　（Ｇ型
）、　＋１０１０２０　（Ｇ型）、＋１０１００９　ｆ
Ｈ型）、＋１０１０１２　（Ｋ型）のＳＤＳ処理した菌
体を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。各菌
株をハートインフュージョンブイヨン培地を用いて培養
し、菌体を実施例３−（Ｌ）と同様のサンプリングバッ
ファーに懸濁して、１００８Ｃ１３０分熱ＳＤＳ処理を
行った。このサンプルを０．２％ＳＤＳを含む１２．５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。アプライ
環は、湿菌体２ｍｇ相当量であった。実施例３−（１）
と同様に、デュラポア・フィルターにトランスファー後
、酵素抗体染色法を行った。その結果ＭＨ−４Ｈ７によ
っていずれの菌株においても低分子量のラフ型もしくは
セミラフ型リポ多糖相当の位置にのみ発色が見られ、高
分子量部分には全く発色が認められなかった。

実施例５ 緑膿菌リポ多糖の多糖画分およびリピドＡ画分の単離お
よび分画とヒトモノクローナル抗体Ｍｌ（−４Ｈ７の各
画分に対する結合性の検討 （１）緑膿菌１１Ｄ　１００１株ＬＰＳの多糖部分の単
離及び分画 緑膿菌１１０１００１株のＬＰＳからＷｉｌｋｉｎｓｏ
ｎとＧａ１ｂｒａｉｔｈの方法（Ｓ、Ｇ、Ｗｉｌｉｎｓ
ｏｎ　＆　Ｌ、　Ｇａ１ｂｒａｉｔｈ。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　　５２．３３１　（１９
７５））により多糖部分の単離及び分画を行った。すな
わち、ＬＰＳ（１０ｍｇ）を１０７ｎｌの１％酢酸に溶
解し、１００℃で９０分の条件で処理をして、ＬＰＳの
内コア中のケトデオキシオフトン酸（ＫＤＯ）残基のケ
トシト結合を選択的に加水分解をした。更に、反応溶液
を等量のクロロホルムによって抽出し、このクロロホル
ム画分をリピドＡ標品とした。遊離リピドＡを抽出除去
した水溶性画分を５０ｍＭピリジン・酢酸緩衝液（ｐＨ
５，５）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ＠　Ｇ−５０（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｕｐｐｓａｌａ）のデキストランを担体とするカラムク
ロマトグラフィー（カラムサイズＩＸ７０ｃｍ）によっ
て分画した。多糖、セミラフ型コアオリゴ糖及びラフ型
コアオリゴ糖の溶出位置は以下に示す比色定量法で検出
した。中性糖はフェノール・硫酸法（Ｍ、　Ｄｕｂｏｉ
ｓ、　ｅｔ、ａｔ、、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２
８．３５０゜１９５６）、アミノ糖は試料を２規定硫酸
で、　１００°０１２時間加水分解した後ＭＢＴＨ（３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩）
法（Ａ、Ｔｓｕｊｉｅｔ、ａｌ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈ
ａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　１７２１７．１９６９）によ
った。多糖、セミラフ型コアオリゴ糖及びラフ型コアオ
リゴ糖はそれぞれの画分を凍結乾燥し回収した。

（２）ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ’７のリポ多
糖由来各画骨への結合性 ＥＬＩＳＡにおける競合反応によって、実施例４−（１
）で得られた緑膿菌１１０１００１株由来の、多糖、セ
ミラフ型コアオリゴ糖、ラフ型オリゴ糖およびリビドＡ
各画分を競合物質として用いて、ＭＨ−４Ｈ７との結合
を検討した。方法は、競合物質と抗体を混和し、３７℃
、１時間インキュベートした後、緑膿菌１１０１００１
菌体を固定した９６穴プレートでＥＬＩＳＡを行い、阻
害の割合を測定した。結果を表５に示す。

競合物質の量は、実施例４−＋１１にあるフェノール・
硫酸法によって中性糖の量として１００１００ｎ相当を
用いた。

競合物質 阻害率（％） 競合物質の量は中性糖１０１００ｎ　ｌ相当リピドＡ標
品を競合物質として用いた場合、５０μｇ／−の濃度で
もＥＬＩＳＡの発色阻害が認められず、　ＭＨ−４Ｈ７
のリピドＡへの結合は認められない。

以上の結果、Ｍ）ｌ−４Ｈ７は、〇−多糖をもたないラ
フ型コアまたは、〇−多糖の繰り返しを一単位しかもた
ないセミラフ型コアオリゴ糖両分への結合が認められ、
ＭＨ−４Ｈ７の抗原決定基は緑膿菌ＬＰＳのコア部位に
あることが示された。

また、実施例５−（１）に示した多糖画分単離時の酢酸
処理によって、ＫＤＯ残基が加水分解されている。コア
画分で朋−４Ｈ７との結合が見られることは、ＭＨ−４
１−１７のエピトープに内コア部位のＫＤＯ残基は関与
していないことを示している。

実施例６ ヒトモノクローナル抗体！１１８−４）１７の各種グラ
ム陰性菌ＬＰＳへの結合性 ＭＨ−４Ｈ７の緑膿菌以外のグラム陰性菌ＬＰＳへの結
合性を実施例５−（２１にある如く、競合反応によって
検討した。同相抗原は、緑膿菌１１０１０２０　（Ｇ型
）菌体を固定した９６穴プレートを用いた。結果を表６
−１に示す。結合の割合は、ＥＬ［ＳＡ全発色阻害率で
表した。競合物質は５０μｇ／−の濃度で用いた。　　
大腸菌Ｊ５．０００１：Ｂ４およびサルモネラ・ミネソ
タＲ５９５，ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ由来ＬＰＳは、Ｌｉｓ
ｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｐｂｅｌｌより入手、緑膿菌１１０
１００１　（Ａ型）および＋１０１０２０　（Ｇ型）由
来ＬＰＳは実施例４−（１）に示したフェノール抽出法
によって得た。

以上の結果、ＭＨ−４Ｈ７は、大腸菌Ｊ５．　　サルモ
ネラ・ミネソタＲ５９５のラフ型ＬＰＳおよび大腸菌０
００１：８４　　、　サルモネラ・ミネソタのスムース
型ＬＰＳのいずれにも結合が認められなかった。

更に、他のグラム陰性菌ＬＰＳに対する１、１）１−４
１１７の結合性を検討した。実験は同様にＥＬＩＳＡに
よる競合反応の測定によって行い、使用したＬＰＳ標品
は、　Ｌｉ５ｔ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　　Ｉｎｃ、。

（Ｃａｍｐｂｅ　ｌ　ｌ　）ヨリ、シュードモナス・フ
ルオレッセンスについては、Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ。

（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）より購入した。結果を表６−２に
示す。

競合反応に用いたＬＰＳａ度はすべて５０μｇ／−であ
る。

ＬＰＳへの由来菌 阻害率 （％） 以上の結果から、ＭＨ−４Ｈ７は、緑膿菌以外では、大
腸菌０２６：Ｂ６由来ＬＰＳに強（，０５５：　８５由
来ＬＰＳに弱く交差反応するが他のＬＰＳには全く結合
しないことが示された。　　このことは大腸菌０２６：
Ｂ６．０５５　：　Ｂ５Ｈ７のＬＰＳ中、ことに血清型
０２６大腸菌のＬＰＳ中に、緑膿菌のＬＰＳ外コア部位
と共通した化学構造を有しており、ヒトモノクローナル
抗体ＭＨ−４Ｈ７が結合できることを示している。

実施例７ ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７によるマウス実験
的緑膿菌感染症の治療効果 緑膿菌臨床分離株血清型Ａ型２株、Ｇ型４株について、
マウス実験的感染系でのヒトモノクローナル抗体ＭＨ−
４Ｈ７の治療効果を検討した。５％ムチンを共存させた
菌の懸濁液をＩＣＲマウス（４退会。

雄、−群１０匹）の腹腔内に接種し、感染させた。

感染１時間後にヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４）１７
を０、１　ｕ　ｇ／ｈｅａｄ腹腔内投与口腔内投与後の
生存率をもって、治療効果を判定した。その結果を表７
および表８に示す。ＭＨ−４Ｈ７は、Ａ型、Ｇ型いずれ
においても複数の異なる菌株に対して、実験的感染症に
おいて、有効な治療効果を示した。

認識するＬＰＳの外コア部位中の抗原決定基を同定した
。ＰＡＣＩ、ＰＡＣＩＲおよび一連の欠損株はＰａｕｌ
ｉｎｅ　Ｍ、Ｍｅａｄｏｗ（Ｌｏｎｄｏｎ　ＩＪｎｉｖ
ｅｒｃｉｔｙ　ＣｏｌＣｏ１１ｅより人手した。各菌体
を実施例１−　（１）に従って９６穴プレートに固定し
、Ｅ［ＩＳＡ法によって！、ＩＨ−４Ｈ７の結合性を検
討ＬＪ＝、結果を表９に示す。

表９　１Ｐｓ外コア部位に欠損をもつ緑膿菌ＰＡＣＩ由
来変異株へのＭＨ−４Ｈ７の結合性実施例８ ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４１１７が認識する抗原
決定基の同定 （１）緑膿菌ＰＡＣｌ由来のＬＰＳに欠損をもつ変異株
へのヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７の結合性緑膿
菌ＰＡＣＩもしくはＰＡＣＩを親株としたＰＡＣＩＲに
由来する外コア部位の一部を欠損している菌株（ＰＡＣ
６０Ｂ、ＰＡＣ５５７、ＰＡＣ５５６およびＰＡＣ６１
１）を用いてＭＨ−４１（７が＊　陽性対照 緑膿菌ＰＡＣＩＲおよび各変異株由来ＬＰＳの外コア部
位の構造は既知である（Ｐ、　Ｓ、　Ｎ、　Ｒｏｗｅ　
＆　Ｐ、　Ｍ。

ｌｄｅａｄｏｗ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９
８３）１３２．３２９−３３７）。

親株のＰＡＣＩＲ由来ＬＰＳの外コアはガラクトサミン
／、アラニン、グルコース、ラムノースから成っており
、結合性のみとめられなかったＰＡＣ５５６は親株ＬＰ
Ｓの外コアからラムノース残基が欠損しているのみであ
る。従ってＭｌ＋−４１（７の抗原決定基はラムノース
残基もしくはラムノースが結合しているガラクトサミン
残基の近傍にあると決定した。

（２）単糖およびその誘導体へのＭＨ−４Ｈ７の結合特
異性 Ｍｌ＋−１ＩＩ＋７の抗原決定基はへのラムノースの関
与を検討するために単糖およびその誘導体への結合特異
性をこれらを競合物質として実施例５−（２）にある如
＜　、　ＥＬＩＳＡの競合反応によって検討した。固相
抗原は、緑膿菌１１Ｄ　１００１　（血清型Ａ型）菌体
を固定した９６穴プレートを用いた。競合物質のうちメ
チルラムノンドはラムノースを１％ＨＣＩを含むメタノ
ール中で１００８Ｃ１４時間の反応によって得た。この
メチルラムノンド標品はα−アノマを約９０％含有して
いる。結果を表ＩＯに示す。

メチル−Ｌ−ラムノンド　　　　　５００　　　ｔｏ。

以上の結果は、ＩＪＩ（−４Ｈ７が、メチルラムノシト
更にはラムノースに特異的に結合することを示している
。従って、’、４Ｈ−４Ｈ７の抗原決定基にはある種の
緑膿菌における外コア部位中のラムノース−残基が重要
に関与している。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）緑膿菌感染症に予防・治療効果があり、抗原決定
   基が、緑膿菌ＬＰＳ中の外コア部位に存在することを特
   徴とするヒトモノクローナル抗体
2. （２）日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会によって分
   類される血清型別Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＫおよびＭの緑膿菌
   ＬＰＳ中の共通する抗原決定基を認識することを特徴と
   する第１請求項記載のヒトモノクローナル抗体
3. （３）抗原決定基が緑膿菌ＬＰＳ中の外コア部位中のラ
   ムノース残基もしくはガラクトサミン残基の近傍に存在
   することを特徴とする第１または第２請求項記載のヒト
   モノクローナル抗体
4. （４）ＩｇＭであることを特徴とする第１、第２または
   第３請求項記載のヒトモノクローナル抗体
5. （５）ヒトモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７
6. （６）第１、第２、第３、第４または第５請求項記載の
   ヒトモノクローナル抗体を少なくとも一種類含有するヒ
   ト免疫グロブリン製剤
7. （７）第１、第２、第３、第４または第５請求項記載の
   ヒトモノクローナル抗体を少なくとも一種類含有する緑
   膿菌感染症予防・治療剤
8. （８）第１、第２、第３または第４請求項記載のヒトモ
   ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマおよびその
   子孫細胞系
9. （９）ハイブリドーマＭＨ−４Ｈ７（微工研条寄第２４
   ０２号）およびその子孫細胞系
10. （１０）第１、第２、第３、第４または第５請求項記載
    の抗体を産生する能力をもつヒトリンパ球Ｂ細胞とヒト
    ・マウス由来のヘテロ・ミエローマ細胞とを細胞融合さ
    せることにより、両細胞間のハイブリドーマを形成させ
    、このハイブリドーマを培養し、その培養上清より抗体
    を回収、精製することから成るヒトモノクローナル抗体
    の製造方法