PT635132E - Anticorpos opsonicos amplamente reactivos que reagem com antigenios de estafilococos comuns - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS OPSONICOS AMPLAMENTE REACTIVOS QUE REAGEM COM ANTIGÉNIOS DE ESTAFILOCOCOS COMUNS"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a antigénios utilizados para prevenir, diagnosticar, ou tratar infecções por estafilococos. A invenção refere-se também a uma cultura purificada de organismos estafilococos e a um método para a obtenção de imunoglobulina opsónica amplamente reactiva, útil para o tratamento de uma infecção por estafilococos negativa para a coagulase.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Ao longo das duas últimas décadas, as infecções por estafilococos tornaram-se uma causa importante de morbidez e mortalidade humana, particularmente em pacientes hospitalizados. Devido à sua prevalência na pele e revestimentos das mucosas, os estafilococos estão no local ideal para produzir infecções, quer localizadas, quer sistémicas. Os pacientes debilitados ou imunossuprimidos estão em risco extremo de uma infecção sistémica.

As espécies de estafilococos mais frequentemente patogénicas em humanos são o Staphylococcus aureus e Staphvloccoccus epidermidis, e cada um destes inclui vários serotipos. Ambos os grupos desenvolveram resistência a antibióticos, o tratamento actual de escolha. Em anos recentes, o 5. epidermidis tornou-se a causa principal de infecção hospitalar em pacientes cujos tratamentos incluem a colocação 1 )

de objectos estranhos, tais como sistemas de desvio ("shunts") de fluido cerebrospinal, válvulas cardíacas, cateteres vasculares, próteses de articulações e outros implantes, no corpo. 0 S. epidermidis é também uma causa comum de infecções de feridas pós-operatórias e de peritonite em pacientes com diálise peritoneal ambulatória, contínua. Uma forma de tratamento para a falha renal acarreta a introdução de grandes volumes de fluido de diálise peritoneal na cavidade peritoneal, o que acarreta o risco de infecções frequentes e recorrentes. De um modo semelhante, os pacientes com imunidade diminuída e os que recebem nutrição parentérica através de cateteres venosos centrais também estão em risco de desenvolver sepsia por S. epidermidis (C. C. Patrick, J. Pediatr., 116:497 (1990)) . O S. epidermidis também se tornou uma causa comum de sepsia hospitalar neo-natal. As infecções ocorrem frequentemente em crianças prematuras que receberam alimentação parentérica, o que pode ser uma fonte de contaminação directa ou indirecta. Estas infecções são difíceis de tratar por vários motivos. A resistência aos antibióticos é comum. Num estudo, a maioria dos estafilococos isolados a partir de culturas de sangue de crianças com sepsia eram multiplamente resistentes a antibióticos (A. Fleer et al. , Pediatr. Infect. Dis. 2:426 (1983)). A estimulação do sistema imunitário proporciona pouco alívio, pois estas crianças têm uma imunidade diminuída, resultante de deficiências nos anticorpos, complemento e função dos neutrófilos. Além disso, a infusão de lípidos, que constitui actualmente um ingrediente convencional da terapia de alimentação parentérica, enfraquece ainda mais a resposta imunitária, já deficiente nestas crianças, à infecção bacteriana (G. W. Fischer et al., Lancet 2:819 (1980)).

Verificou-se que a terapia com imunoglobulinas suplementares permite alguma medida de protecção contra certas bactérias encapsuladas, tais como a Hemophilus influenzae e 2 ;

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Streptococcus pneumoniae. Já foram caracterizados anticorpos monoclonais específicos para proteínas de superfície de estafilococos negativos para a coagulase (C. B. Timmermann et al., J. Med Microbiol. 35 (1991), p. 65-71. A WO-A-93/17044 descreve uma imunoglobulina humana directa e composições suas derivadas para a prevenção ou tratamento de infecções por estafilococos. As crianças que são deficientes em anticorpos, são susceptíveis a infecções por estas bactérias e a bacteriémia e a sepsia são comuns. Quando estão presentes anticorpos anti-estreptococos e anti-hemófilos, estes proporcionam protecção promovendo a eliminação das respectivas bactérias pelo sangue. No caso de anticorpos contra estafilococos, a utilização potencial de imunoglobulinas suplementares para prevenir ou tratar a infecção tem sido muito menos clara.

Os estudos iniciais sobre a infecção por estafilococos focaram-se na utilização potencial de imunoglobulinas suplementares para reforçar as defesas peritoneais, tais como a actividade opsónica, em pacientes que recebem diálise peritoneal ambulatória, contínua. Verificou-se que num modelo neo-natal induzido por intralípidos, a imunoglobulina intravenosa com alta actividade opsónica melhora a eliminação do S. epidermidis do sangue (G. W. Fischer et al., Ped. Research 29/4, (1991), p. 281A, resumo no. 1670. Verificou-se que a imunoglobulina intravenosa convencional (IVIG) tem uma variabilidade de lote para lote quanto à actividade opsónica contra S. epidermidis (L. A. Clark e C. S. F. Easmon, J. Clin. Pathol. 39:856 (1986)). Neste estudo, um terço dos lotes de IVIG testados tinham uma opsonização fraca com o complemento, e apenas dois de catorze eram opsónicos sem complemento. Assim, apesar do facto de os lotes de IVIG serem feitos a partir de grandes conjuntos de dadores de plasma, não estavam uniformemente presentes bons anticorpos opsónicos contra S. epidermidis. Além disso, este estudo não avaliou o facto de o 3

IVIG poder ser utilizado para prevenir ou tratar infecções por S. epidermidis ou sepsia bacteriana.

Estudos recentes associaram a bacteriémia de estafilococos negativos para a coagulase, tal como S. peidermidis, como a espécie mais comum que provoca a bacteriémia em recém-nascidos que recebem infusão de emulsão de lípidos (J. Freeman et al., N. engl. J. Med. 23:301 (1990)). Estes recém-nascidos tinham níveis baixos de anticorpo opsónico contra S. epidermidis. apesar do facto de os soros terem níveis claramente detectáveis de anticorpos IgG contra o peptidoglicano de S. epidermidis (A. Fleer et al., J. Inf ect. Dis. 2:426 (1985)). Este facto era surpreendente dado que se pensava que os anticorpos anti--peptidoglicano eram os principais anticorpos opsónicos. Assim, apesar de sugerir que a susceptibilidade neo-natal contra o S. epidermidis pode estar relacionada com uma actividade opsónica diminuída, estes estudos também sugerem que muitos anticorpos direccionados contra o S. epidermidis não são opsónicos e não serão capazes de proporcionar protecção quando fornecidos de forma passiva a recém-nascidos.

Recentemente, utilizou-se um teste de ligação a antigénio para analizar anticorpos IgG contra S. epidermidis em pacientes com bacteriémia não complicada e com bacteriémia e endocardite (F. Espersen et al., Arch. Intern. Med. 147:689 (1987)). Este teste utilizou um extracto ultrassónico de S. epidermidis para identificar IgG específico de S. epidermidis. Nenhum dos pacientes com bacteriémia não complicada tinha anticorpos IgG contra S. epidermidis. Estes dados sugerem que a IgG não proporciona uma erradicação eficaz do S. epidermidis do sangue. Além disso, 89% dos pacientes bacteriémicos com endocardite desenvolveram níveis elevados de IgG contra S. epidermidis. Nestes pacientes, a IgG não era protectora, uma vez que os níveis elevados de anticorpo IgG estavam associados com bacteriémia e endocardite grave. Com base nestes estudos, o papel protector de IgG na sepsia por S. epidermidis e 4

endocardite era questionável, especialmente na presença de imaturidade, debilidade, infusão intralípidos ou imunosupressão.

Os estudos animais na literatura que demonstraram protecção por imunoglobulinas contra infecções por estafilococos, demonstraram existir uma especificidade para a estirpe, por meio de testes imuno-adsorventes ligados a enzimas (ELISA) e utilizaram ratinhos adultos normais em estudos de protecção. Estes estudos não mimetizam a doença tal como é observada em humanos. Os modelos animais têm utilizado tipicamente animais maduros com uma imunidade normal, aos quais se administram estirpes invulgarmente virulentas, ou doses enormes de desafio de bactérias. Os pacientes humanos são geralmente imunologicamente imaturos ou debilitados. Os pacientes humanos também contraem infecções de algum modo indolentes, com patogéneos de baixa virulência, tais como o S. epidermidis. sendo a morte normalmente atribuída a complicações secundárias. Os modelos que utilizaram estirpes invulgares ou doses enormes de bactérias, induzem, geralmente, uma morte fulminante rápida. Estes factores são importantes, uma vez que os anticorpos normalmente funcionam em sintonia com o sistema imunitário da célula hospedeira (neutrófilos, monócitos, macrófagos, e sistema reticuloendotelial fixo). A eficácia da terapia com anticorpos pode, portanto, depender das capacidades imunológicas funcionais do hospedeiro. A fim de serem preditivos, os modelos animais deverão emular a condição clínica em que a infecção iria ocorrer e permitir estabelecer as condições de terapia. Além disso, os estudos animais originaram resultados inconsistentes.

Está descrito um modelo que utilizou uma estirpe invulgarmente virulenta de S. epidermidis. Os ratinhos maduros infectados desenvolveram 90 a 100% de mortalidade dentro de 24 a 48 horas (K. Yoshida et al. , Japão, J. Microbiol. 20:209 (1976)). O anticorpo contra o polissacárido de superfície de S_;_ 5

epidermidis era protector nestes ratinhos. Verificou-se que a protecção ocorre com uma fracção de IgM, mas não a fracção IgG (K. Yoshida e Y. Ichiman, J. Med. Microbiol. 11:371 (1977)). Este modelo, no entanto, apresenta uma patologia que é muito diferente da que se observa em pacientes tipicamente infectados. Os ratinhos desafiados intraperitonealmente desenvolveram sintomas de sepsia em minutos após receberem a injecção e morreram dentro de 24 a 48 horas. Esta patologia particular não se observa em humanos infectados com estafilococos. A estirpe altamente virulenta de S. epidermidis pode representar um tipo de infecção atípica. Além disso, os isolados de S. epidermidis de humanos infectados não mataram os ratinhos neste modelo.

Em 1987, estes estudos animais foram alargados para incluir a avaliação de anticorpos no soro humano contra estirpes virulentas seleccionadas de S. epidermidis (Y. Ichiman et al., J. Appl. Bacteriol. 63:165 (1987)). AO contrário dos dados anteriores, o anticorpo protector foi encontrado nas fracçóes de imunoglobulina IgA, IgM e IgG. Não foi possível estabelecer nenhum papel definitivo para qualquer classe particular de imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA).

Neste modelo animal, utilizaram-se ratinhos adultos normais e determinou-se a mortalidade. Considerou-se que a morte estava relacionada com o efeito de toxinas bacterianas específicas e não com a sepsia (K. Yoshida et al., Japan J. Microbiol. 20:209 (1976) ) . A maioria dos isolados clínicos não originaram infecções letais, e não se realizaram culturas de sangue quantitativas. Além disso, este estudo não proporcionou grandes esclarecimentos sobre o facto de o anticorpo poder prevenir ou tratar com sucesso a sepsia por S. epidermidis em pacientes imaturos ou imunosuprimidos.

Num estudo posterior, testaram-se anticorpos específicos do serotipo, direccionados contra polissacáridos de cápsula de S_;_ 6

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epidermidis. no modelo animal. Os resultados mostraram que os anticorpos específicos do serotipo eram protectores, mas que cada anticorpo era direccionado contra um serotipo, tal como avaliado por ELISA. A protecção era igualmente específica do serotipo. A protecção contra estirpes heterólogas não ocorreu. Além disso, concluiu-se que a protecção era conseguida pelo anticorpo IgM.

Em resumo, não tem havido nenhuma evidência clara de que o IVIG possa ser eficaz no tratamento de infecções por S. epidermidis ou sepsia, particularmente quando os pacientes são imaturos ou imunosuprimidos, ou quando estão envolvidos múltiplos serotipos de S. epidermidis. Assim, por exemplo, uma revisão recente e exaustiva sobre a patogénese, diagnóstico e tratamento de infecções por S. epidermidis não inclui a imunoglobulina como um agente profilático ou terapêutico potencial (c.C. Patrick, J. Pediatr. 116:497 (1990)).

Além disso, não se desenvolveu nenhum modelo animal que seja comparável aos pacientes humanos com infecções por S. epidermidis, particularmente os que são imaturos ou imuniosuprimidos. Isto é crítico, pois estes pacientes têm um nível baixo de complemento, bem como uma função de neutrófilos e macrófagos enfraquecida. Assim, mesmo que a actividade opsónica da imunioglobulina possa parecer adequada sob condições óptimas in vitro, a protecção poderá não ocorrer em pacientes como bebés recém-nascidos, ou pacientes com cancro. Além disso, os modelos anteriores mostraram não ser satisfatórios, na medida em que utilizam animais que não possuem factores de risco semelhantes aos de um paciente humano de alto risco, típico.

Actualmente, a terapia com antibióticos é o tratamento de escolha para a prevenção e cura de infecções por estafilococos. Embora se estejam a desenvolver constantemente novos antibióticos, tem-se tornado cada vez mais claro que a terapia 7 7

apenas com antibióticos é insuficiente. Os dados relativos a vacinações passivas com ·imunoglobulinas são, no mínimo, pouco claros. Os modelos animais em que esta terapia foi testada têm pouca relação com infecções humanas e, até agora, não proporcionaram soluções definitivas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, e tal como aqui descrito em termos gerais, um objecto da presente invenção é uma preparação de antigénios, isolável a partir da estirpe Hay ATCC 55133 de Staphylococcus epidermidis, em que a referida preparação produz anticorpos opsónicos amplamente reactivos que reagem especificamente num teste com os serotipos I, II e III de Staphylococcus epidermidis.

Tal como aqui utilizado, o termo antigénio isolado significa qualquer antigénio individual, qualquer mistura de difrentes antigénios, ou qualquer combinação de antigénios que são separados de um ou mais organismos de estafilococos diferentes. 0 antigénio isolado pode ser utilizado directamente como uma composição farmacêutica, tal como uma vacina de estafilococos, e indirectamente para produzir anticorpos, quer monoclonais, quer policlonais, para tratar ou prevenir infecções por estafilococos no homem e animais.

Numa forma de concretização preferida, a preparação de antigénios de acordo com a invenção pode ser obtida por um método que compreende os passos de: (a) isolar uma cultura de células bacterianas de estafilococos, (b) suspender as células isoladas numa mistura que compreende uma solução de ácido tricloroacético, (c) agitar a mistura a aproximadamente 4 °C, (d) centrifugar a mistura e guardar o sobrenadante resultante, (e) combinar o sobrenadante com um álcool, (f) incubar a combinação de álcool-sobrenadante a aproximadamente 4 °C para precipitar o antigénio e (g) isolar o antigénio precipitado. 8 Γ\ Β7

Um outro objecto da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende: (a) uma preparação de antigénio isolada de acordo com a invenção; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável.

Um outro objecto da presente invenção é uma cultura purificada de organismos estafilococos, que compreende a estirpe Hay ATCC 55133 de Staphylococcus epidermidis.

Um outro objecto da presente invenção é um método para a obtenção de uma imunoglobulina opsónica amplamente reactiva, útil para tratar uma infecção por estafilococos, negativa para a coagulase, compreendendo os passos de: (a) imunizar um mamífero com a preparação de antigénios de acordo com a reivindicação 1; e (b) isolar a imunoglobulina do referido mamífero.

Outros objectos e vantagens da presente invenção serão apresentados em parte na descrição que se segue, e em parte serão óbvios a partir desta descrição, ou podem ser apreendidos a partir da prática da presente invenção. As figuras e tabelas juntas, que são incorporadas e constituem parte deste pedido, ilustram e, juntamente com esta descrição, servem para explicar o princípio da invenção.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS

Figura 1. Títulos de anticorpo de plasma humano testado quanto à ligação aos serotipos I, II, III e Hay de S. epidermidis

Figura 2. Títulos ELISA pré- e pós-imunização de soros de coelhos imunizados com uma preparação de S. epidermidis (Hay ATCC 55133) preparada em TCA, testada quanto à ligação aos serotipos I, II, III e Hay de S. epidermidis. 9

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 6.

Figura 7.

Figura 8.

Títulos ELISA pré- e pós-imunização de soros de coelhos imunizados com uma preparação de células totais de S. epidermidis (Hay ATCC 55133), testada quanto à ligação aos serotipos I, II, III e Hay de S. epidermidis. Testes de opsonização de organismos S. epidermidis, S. aureus, e Streptococcus agalactiae, mediada por neutrófilos, utilizando uma imunoglobulina seleccionada pela capacidade de se ligar a uma preparação de S. epidermidis e uma imunoglobulina seleccionada que foi pré-adsorvida com uma preparação de S. epidermidis. 0 contolo negativo são neutrófilos mais complemento sozinho. Actividade opsónica medida como a percentagem de resposta bactericida do soro de coelho, pré- e pós- - imunização com uma preparação de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) preparada em TCA, contra os serotipos I, II, III e Hay de S. epidermidis. Actividade opsónica medida como a percentagem de resposta bactericida do soro de coelho, pré- e pós- - imunização com uma preparação de células totais de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133), contra os serotipos I, II, III e Hay de S. epidermidis. Actividade opsónica de soro pré- e pós-imunização com S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) preparada em TCA ou preparação de células totais de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133), contra S. aureus tipo 5. Os testes opsónicos foram calculados utilizando duas diluições da mistura reaccional antes de fazer a sub-cultura em agar sólido. Níveis de bacteriémia de S. epidermidis em amostras de sangue de ratos de amamentação, tratados ou com imunoglobulina de título elevado, seleccionada pela capacidade de se ligar a uma preparação de S. epidermidis, ou a imunoglobulina de título baixo, não seleccionada. 10

Figura 9. Efeito de imunoglobulina direccionada (título elevado, seleccionada) e injecções salinas na sobrevivência em ratos de amamentação tratados com intralípidos mais S. epidermidis Figura 10. Efeito da imunoglobulina direccionada (seleccionada, título elevado), imunoglobulina direccionada pré--adsorvida com uma preparação de S. epidermidis e injecções salinas, na sobrevivência em ratos de amamentação, tratados com intralípidos mais S. epidermidis.

Figura 11. Efeito de imunoglobulina direccionada (seleccionada, título elevado), imunoglobulina direccionada pré--adsorvida com uma preparação de S. epidermidis e injecções salinas nos níveis de bacteriémia no sangue de ratos de amamentação tratados com intralípidos mais S. epidermidis.

Figura 12. Relação entre a actividade opsónica medida in vitro e a sobrevivência, no modelo de rato de amamentação com imunoglobulina direccionada (seleccionada, título elevado), imunoglobulina de baixo título, não seleccionada, imunoglobulina direccionada que foi pré-adsorvida com uma preparação de S. epidermidis, e solução salina

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE CONCRETIZAÇÃO PREFERIDAS A fim de alcançar os objectivos e de acordo com o fim da invenção, tal como aqui é amplamente descrito, a presente invenção compreende a identificação, produção e isolamento de um antigénio útil para prevenir, diagnosticar ou tratar infecções por estafilococos. Descreve-se aqui um modelo animal in vivo para testar a eficácia de composições farmacêuticas, incluindo composições de imunoglobulina e preparações. O antigénio da presente invenção, e como descrito a seguir, pode ser utilizado num método de identificação de 11

imunoglobulinas, para o tratamento de uma infecção por estafilococos, compreendendo os passos de realizar um primeiro teste para identificar uma imunoglobulina que é reactiva com uma preparação de um primeiro organismo estafilococos, realizar um segundo teste para identificar a imunoglobulina que é reactiva com uma preparação de um segundo organismo estafilococos e seleccionar a imunoglobulina que é reactiva com as preparações tanto do primeiro, como do segundo organismo estafilococos. A imunoglobulina pode ser derivada a partir de amostras reunidas, ou individuais, de plasma, soro, sangue total ou tecido, como placenta. Embora o isolamento de imunoglobulina não seja necessário, caso se determine que é necessário, estes procedimentos são bem conhecidos dos peritos na arte. Os primeiro e segundo testes podem ser quaisquer testes imunológicos e são de preferência testes de ligação, testes de opsonização, testes de eliminação, ou qualquer combinação destes testes. De preferência, o primeiro e segundo organismos estafilococos são de diferentes serotipos, ou de diferentes espécies.

As primeira e segunda preparações de um organismo estafilococos podem ser quaisquer preparações de um organismo estafilococos, incluindo células intactas, células fraccionadas por meios químicos ou físicos, ou extractos celulares e é de preferência um extracto de células totais ou de superfície celular. Uma das preparações é de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) . Uma preparação de um organismo estafilococos é constituída por polissacáridos, proteínas, lípidos e outros componentes de células bacterianas. Prefere-se que a preparação seja uma preparação de polissacáridos e proteínas, i.e., uma preparação que contém predominantemente misturas ou combinações de polissacáridos, proteínas e glicoproteínas. Pode-se preparar uma preparação adequada isolando uma cultura de células bacterianas de Staphylococcus epidermidis (Hay ATCC 55133), suspendendo as células isoladas numa mistura constituída por uma solução de ácido tricloroacético, agitando a mistura a 12

aproximadamente 4 °C, centrifugando a mistura e guardando o sobrenadante resultante, combinando o sobrenadante com um álcool, de preferência etanol absoluto, incubando a combinação de álcool-sobrenadante a aproximadamente 4 °C para precipitar uma preparação e isolando a preparação precipitada.

Um teste preferido é um teste de ligação em que a imunoglobulina é reagida com uma preparação de um organismo estafilococos. O teste de ligação é de preferência um teste imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA), ou um radioimunoensaio (RIA), mas pode ser também um teste de aglutinação, um teste de co-aglutinação, um teste colorimétrico, um teste de ligação fluorescente ou qualquer outro teste de ligação adequado. Pode ser realizado por processos competitivos ou não competitivos, sendo os resultados determinados directa ou indirectamente.

No teste de ligação, a preparação de um organismo estaf ilococos pode ser fixada a um suporte sólido que pode ser qualquer superfície adequada para o suporte da preparação. De preferência, o suporte sólido é uma placa, poço, esfera, micro--esfera, pá, hélice ou vareta de vidro, ou plástico e é de preferência uma placa de titulação. A preparação fixa é incubada com imunoglobulina, que pode ser isolada ou ser parte de um fluido biológico, e a quantidade de ligação é determinada. Uma reacção positiva ocorre quando a quantidade de ligação observada é maior do que a quantidade de ligação de um controlo negativo. Um controlo negativo é qualquer amostra que se sabe não conter imunoglobulinas específicas de antigénio. A ligação positiva pode ser determinada a partir de uma reacção simples negativo/positivo, ou a partir do cálculo de uma série de reacções. Esta série pode incluir amostras que contêm quantidades medidas de imunoglobulina que se ligam especificamente ao antigénio fixado, criando uma curva padrão, a partir da qual se pode determinar a quantidade de imunoglobulina específica de antigénio numa amostra desconhecida. Alternativamente, o teste pode ser realizado 13

substancialmente do mesmo modo, sendo o anticorpo fixado ao suporte sólido e a imunoglobulina identificada pela sua capacidade de ser retida numa preparação ligada aos anticorpos fixados.

Um outro teste preferido é um teste de opsonização que pode ser um teste colorimétrico, um teste quimioluminescente, um teste de absorção fluorescente ou marcado radioactivamente, um teste bactericida mediado por células, ou qualquer outro teste adequado que mede o potencial opsónico de uma substância. Num teste de opsonização, um agente infeccioso, uma célula eucariótica, e a substância opsonizante a ser testada ou uma substância opsonizante mais uma substância que potência a opsonização, são incubadas em conjunto. Mais preferencialmente, o teste de opsonização é um teste bactericida mediado por células. Neste teste in vitro, um agente infeccioso, tipicamente uma bactéria, uma célula fagocítica e uma substância opsonizante, neste caso uma imunoglobulina, são incubadas em conjunto. Embora se possa utilizar qualquer célula eucariótica com capacidade fagocícita ou de ligação, num teste bactericida mediado por células, prefere-se um macrófago, um monócito, um neutrófilo ou qualquer combinação destas células. Podem-se incluir proteínas do complemento para garantir a opsonização por ambas as vias, clássica e alternativa. A actividade opsónica da imunoglobulina é determinada a partir da quantidade ou número de agentes infecciosos que permanecem após incubação. Num teste bactericida mediado por células, isto é conseguido comparando o número de bactérias sobreviventes entre dois testes semelhantes, sendo que apenas um deles contém a imunoglobulina opsonizante, ou medindo os números de organismos viáveis, antes e após a incubação. Um número reduzido de bactérias após a incubação na presença da imunoglobulina, indica uma actividade opsonizante positiva. No teste bactericida mediado por células, a opsonização positiva é determinada por cultura da mistura de incubação sob condições 14

de crescimento bacteriano adequadas. Qualquer redução significativa no número de bactérias viáveis, comparando amostras pré- e pós-incubação, ou entre amostras que contêm imunoglobulinas e as que não contêm, é uma reacção positiva.

Outro método preferido de identificação de imunoglobulinas para o tratamento de uma infecção por estafilococos utiliza um teste de eliminação. De preferência, o teste de eliminação é realizado num modelo animal. Um modelo animal particularmente útil compreende os passos de administrar uma composição farmacêutica, um imunosupressor e um organismo estafilococos a um animal imaturo e avaliar se a composição farmacêutica reduz a mortalidade do animal, ou aumenta a eliminação do organismo estafilococos pelo animal. Este teste pode utilizar qualquer animal imaturo incluindo o coelho, o porquinho da índia, o ratinho, o rato, ou qualquer outro animal de laboratório adequado. 0 rato de amamentação é o mais preferido. Um imunosupressor é qualquer substância que enfraquece o sistema imunitário do animal ao qual é administrado e é seleccionado a partir do grupo constituído por esteróides, agentes anti-- inflamatórios, prostaglandinas, imunosupressores celulares, ferro, sílica, partículas, esferas, emulsões de lípidos e qualquer outro imunosupressor eficaz. De preferência, o imunosupressor é ciclosporina, dexametasona, triamcinolona, cortisona, prednisona, ibuprofen ou qualquer outro composto ou combinação de compostos. Mais preferencialmente, o imunosupressor é uma emulsão de lípidos e a emulsão de lípidos de eleição é de intralípido. Quando a composição farmacêutica é uma imunogobulina, o teste mede o potencial de eliminação da imunoglobulina administrada. A eliminação é avaliada determinando se a composição farmacêutica aumenta a eliminação do agente infeccioso pelo animal. Isto é tipicamente determinado a partir de uma amostra de fluido biológico, tal como sangue, fluido peritoneal, ou fluido cerebro-espinal. Faz-se a cultura do agente infeccioso a 15

? partir do fluido biológico de um modo adequado ao crescimento ou identificação do agente infeccioso sobrevivente. A partir de amostras de fluido retiradas durante um período de tempo após o tratamento, o perito na arte pode determinar o efeito da composição farmacêutica na capacidade do animal eliminar o agente infeccioso. No entanto, podem-se obter outros dados medindo a sobrevivência de animais a que se administrou a composição farmacêutica durante um período de tempo, de preferência um período de dias. Tipicamente, utilizam-se ambos os conjuntos de dados. Os resultados são considerados positivos se a composição farmacêutica aumenta a eliminação ou decresce a mortalidade. Em situações em que há uma eliminação aumentada pelo organismo, mas o animal teste continua a morrer, indica-se à mesma um resultado positivo. A imunoglobulina isolada pode ser isolada a partir de unidades reunidas, ou individuais, de sangue, plasma, soro ou tecido, como a placenta, ou a partir de qualquer preparação de imunoglobulina derivada destes, tal como imunoglobulina intravenosa (IVIG). Os processos para o isolamento de imunoglobulina a partir destas substâncias é bem conhecido dos peritos na arte. Em resumo, um método compreende os passos de remover todas as células e restos celulares do fluido e fraccionar a porção de imunoglobulina do fluido por métodos como a cromatografia, precipitação ou extracção. Os pormenores destes procedimentos e outros estão descritos em Protein Purification: Principies and Practice (R.K. Scopes, Springer-Verlag, Nova Iorque, 1987). A imunoglobulina isolada pode ser um ou mais anticorpos de qualquer isotipo, incluindo IgG, IgM, IgD, IgA ou IgE. A imunoglobulina isolada inclui anticorpos policlonais, de preferência da fracção IgG. A imunoglobulina isolada inclui também anticorpos monoclonais, de preferência do isotipo IgG. Os processos para a identificação e isolamento de uma fracção ou isotipo particular de anticorpo são bem conhecidos na arte. 16

Descrevem-se vários métodos, a título de exemplo, no Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1991). A presente invenção inclui também métodos para a produção destes anticorpos.

Um método para a produção de anticorpos policlonais para o tratamento de uma infecção por estafilococos, compreende os passos de introduzir uma preparação de um organismo estafilococos num mamífero, remover o soro do mamífero e isolar anticorpos policlonais que reagem num primeiro teste com uma preparação de um primeiro organismo estafilococos e num segundo teste com uma preparação de um segundo organismo estafilococos. 0 primeiro e segundo testes podem ser qualquer teste imunológico e de preferência testes de ligação, testes de opsonização, testes de eliminação ou qualquer combinação destes testes. A primeira e segunda preparações de um organismo estafilococos podem ser quaisquer preparações de um organismo estafilococos, incluindo células intactas, células fraccionadas por meios químicos ou físicos, ou extractos celulares e é de preferência um extracto de células totais ou de superfície celular. A preparação de um organismo estafilococos introduzido num mamífero pode ser também qualquer preparação de um organismo estafilococos, incluindo células intactas, células fraccionadas por meios químicos ou físicos, ou extractos celulares e é de preferência um extracto de células totais ou de superfície celular. De acordo com a presente invenção, a preparação é de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) . Uma preparação deste organismo estafilococos é constituída por polissacáridos, proteínas, lípidos e outros componentes de células bacterianas. É preferido que a preparação seja uma preparação de polissacáridos e proteínas, i.e. uma preparação que contém predominantemente misturas ou combinações de polissacáridos, proteínas e glicoproteínas. Pode-se preparar uma preparação adequada, isolando uma cultura de células bacterianas de Staphylococcus epidermidis (Hay, ATCC 55133), suspendendo as células isoladas numa mistura constituída por 17

\y- uma solução de ácido tricloroacético, agitando a mistura a aproximadamente 4 °C, centrifugando a mistura e guardando o sobrenadante resultante, combinando o sobrenadante com um álcool, de preferência etanol absoluto, incubando a combinação de álcool-sobrenadante a aproximadamente 4 °C para precipitar uma preparação e isolando a preparação precipitada. A preparação de estafilococos introduzida num mamífero e utilizada para produzir anticorpos policlonais pode incluir adjuvantes específicos e não específicos. Os adjuvantes não específicos são substâncias que estimulam de forma não específica a resposta imunitária a um antigénio e incluem Freund, emulsões água-óleo, tensioactivos, óleos minerais, polímeros sintéticos, hidróxido de alumínio, acrilamida e outras substâncias potenciadoras de resposta, adequadas. Os adjuvantes específicos incluem estimuladores de células T e B específicos que potenciam a produção de anticorpos por células que produzem anticorpos.

Um método para a produção de anticorpos monoclonais para o tratamento de uma infecção por estafilococos compreende a criação de células de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais. Estes processos são bem conhecidos na arte. Alguns métodos, a título de exemplo, são especificamente descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane, Cold Spring Harbor Lab., 1988). Um método compreende o isolamento de células que produzem anticorpos, a fusão das células que produzem anticorpos com células de mieloma, para formar células de hibridoma e a pesquisa das células de hibridoma resultantes quanto à existência de uma célula que produz o anticorpo monoclonal reivindicado. As células que produzem anticorpo isoladas são seleccionadas a partir do grupo constituído por células que foram sensibilizadas por infecção de um organismo estafilococos in vivo, i.e. um infecção, células que foram sensibilizadas por exposição a uma preparação de um organismo estafilococos como aqui descrito, in vivo, i.e. uma imunização, 18 *7

células que foram sensibilizadas por exposição directa das células in vitro, ou células que foram sensibilizadas por qualquer outro meio adequado. As células que produzem anticorpo isoladas são fundidas com células de mieloma utilizando processos bem conhecidos do perito na arte. Prefere-se um processo de fusão que utilize polietilenoglicol ou vírus Epstein-Barr. Os parceiros de fusão de células de mieloma das células que produzem anticorpos, são quaisquer células adequadas para a produção de células de hibridoma. Estas incluem células de mieloma que são de origem genética semelhante ou diferente. A título de exemplo, alguns parceiros de fusão de células de mieloma adequados são as linhas de células de murídeo P3-X63Ag8, X63Ag.653, SP2/0-Agl4, FO, NSI/1--Ag4-a, NSO/l e FOX-NY, as linhas de células de rato Y3--Agl.2.3, YB2/0 e IR983F e as linhas celulares humanas U-266, FU-266 e HFB-1. As células de hibridoma, imortalizadas por fusão, são seleccionadas a partir da mistura de células fundidas e não fundidas utilizando uma técnica de selecção adequada, tal como selecção com hipoxantinaguanina fosforibosil transferase (HGPRT), como descrito em Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (J.W. Goding, Academic Press, San Diego, 1986) . Num método alternativo, as células que produzem anticorpo podem ser imortalizadas utilizando citomegalovírus ou outro vírus adequado. As células de hibridoma resultantes, ou células produzidas utilizando o método alternativo, são pesquisada quanto a uma célula que produz um anticorpo monoclonal que reage num primeiro teste com uma preparação de um primeiro organismo estafilococos e num segundo teste com uma preparação de um segundo organismo estafilococos. O primeiro e segundo testes podem ser quaisquer testes imunológicos e de preferência testes de ligação, testes de opsonização, testes de eliminação ou qualquer combinação destes testes. A primeira e segunda preparações de um organismo estafilococos podem ser quaisquer preparações de um organismo estafilococos incluindo células intactas, células fraccionadas por meios químicos ou físicos, ou extractos celulares e é de preferência um extracto 19

de células totais ou de superfície celular. É preferido que as primeira e segunda preparações de um organismo estafilococos sejam de diferentes serotipos ou espécies e mais preferencialmente em que o primeiro organismo estafilococos seja Staphylococcus epidermidis (Hay, ATCC 55133). A sequência de ADN do gene que codifica para o anticorpo monoclonal isolado pode ser identificada, isolada, clonada e transferida para uma célula procariótica ou uma célula eucariótica, para expressão por processos que são bem conhecidos na arte. Alguns processos, a título de exemplo, estão descritos de forma geral em Current Protocols in Molecular Bioloqy (F. W. Ausubel et ai., eds., John Wiley & Sons, 1989). É preferido produzir os anticorpos monoclonais do isotipo IgG, quer por isolamento directo de uma célula de hibridoma que produz IgG, quer por manipulação genética. Um método para a alteração do isotipo do anticorpo monoclonal envolve a identificação da sequência de ADN que codifica para o local de ligação ao antigénio da molécula de anticorpo original. Esta sequência de ADN é isolada ou sintetizada quimicamente e clonada adjacente à sequência de ADN da porção estrutural de uma molécula de imunoglobulina diferentes, que pode também ser isolada ou sintetizada quimicamente. 0 produto de fusão resultante expresso a partir deste clone teria uma capacidade de ligação ao antigénio do anticorpo original e a porção estrutural do novo gene de imunoglobulina escolhido, por outras palavras, o novo isotipo.

Também se prefere um método em que se produzem anticorpos monoclonais humanos. Os anticorpos monoclonais puramente humanos são produzidos por fusão de células que produzem anticorpos e células de mieloma humanas. Os anticorpos monoclonais parcialmente humanos são produzidos utilizando parceiros de fusão não humanos de células que produzem 20 é é

,¾ n .. ^ Γ 07 anticorpos humanos ou células de mielomas humanos. Os anticorpos não humanos ou parcialmente humanos podem ser tornados mais humanos por quimerização, em que uma célula de hibridoma não humana é fundida com uma célula humana que resulta num hibridoma, que é de origem genética dupla ou tripla (ou superior). Alternativamente, um anticorpo não humano ou parcialmente humano pode ser tornado mais humano por manipulação genética. Tipicamente, isto requer a clonagem ou síntese química de ADN que codifica para os aminoácidos do local de ligação ao antigénio. Esta sequência de ADN é clonada ou colocada adjacente à sequência de AND que codifica para a porção estrutural de um anticorpo ou sequência de aminoácidos diferente. Deste modo, é possível alterar a estrutura antigénica global da molécula de anticorpo, mantendo ao mesmo tempo a capacidade de ligação específica ao antigénio. Pode-se alterar um anticorpo de murídeo de modo a parecer antigenicamente mais humano. Isto será vantajoso para reduzir ou eliminar uma resposta imunitária prejudicial, possível. Além disso, colocando a sequência de ADN do local de ligação ao antigénio adjacente à sequência de ADN de outra proteína, a proteína de fusão resultante expressa é antigenicamente direccionada. Este facto pode ser especialmente útil para o direccionamento de antibióticos, complemento, ou factores imunológicos.

Outra forma de concretização da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma preparação de antigénio isolada de acordo com a invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é o transportador preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e de glicerol também podem ser utilizadas 21 como transportadores líquidos, particularmente para soluções injectáveis. Os transportadores farmacêuticos adequados estão descritos em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (A. Genaro, ed. Mack Pub., Easton, Pa., 1990).

Descreve-se aqui um método para tratar um paciente infectado, ou que se suspeita estar infectado com um organismo estafilococos, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende imunoglobulina, anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais, e um veículo farmaceuticamente aceitável. O paciente pode ser um humano ou um animal, incluindo o cão, gato, vaca, ovelha, porco, cabra e qualquer outro mamífero adequado, mas é preferencialmente um humano. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são aqui descritos. Uma quantidade farmaceuticamente aceitável é a quantidade de imunoglobulina que se pensa proporcionar alguma medida de alívio ou assistência no tratamento de uma infecção por estafilococos. Esta terapia pode ser principal ou suplementar a um tratamento adicional, tal como terapia com antibióticos, para uma infecção por estafilococos, uma infecção causada por um agente diferente, ou uma doença não relacionada.

Descreve-se aqui um método para prevenir a infecção por um organismo estafilococos que compreende a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição farmacêutica, uma vacina passiva, compreendendo imunoglobulina, anticorpos policlonais, ou anticorpos monoclonais e um veículo farmaceuticamente aceitável. O tratamento pode ser sistémico ou localizado. O tratamento sistémico compreende a administração da composição farmacêutica por injecção intravenosa, intraperitoneal, intracelial, intracorporal, ou por qualquer outro método eficaz, de administração de uma quantidade profilaticamente eficaz. Alternativamente, a composição fisiológica pode ser dada localmente. Isto pode ser também por injecção na área particular infectada, tal como 22

Γ\

intramuscularmente e também subcutaneamente. 0 tratamento localizado compreende também a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de imunoglobulina, esfregando, imergindo, ensopando ou raspando, quer directamente num paciente, quer em objectos que serão colocados no paciente, tais como cateteres permanentes, válvulas cardíacas, sistemas de desvio ("shunts") de fluido cerebro-espinal,' próteses de articulações, outros implantes no corpo e quaisquer outros objectos, instrumentos ou aplicações que acarretam o risco de se tornar infectados com, ou de introduzir uma infecção por estafilococos, num paciente.

Outra forma de concretização da presente invenção é uma preparação de antigénio, como definido na reivindicação 1. A preparação de antigénio pode ser compreendida por proteínas, polissacáridos, lípidos, glicoproteínas ou quaisquer outros materiais antigénicos adequados. De preferência, uma preparação de antigénio contém proteínas, polissacáridos e glicoproteínas. Particularmente de preferência, uma preparação de antigénio contém proteínas e glicoproteínas. Também é particularmente preferido que uma preparação de antigénios seja um antigénio purificado único, ou um pequeno número de antigénios purificados que podem ser proteínas, polissacáridos, glicoproteínas ou moléculas sintéticas. Os métodos de purificação macromolecular incluem filtração, fraccionamento, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, HPLC, FPLC, electroforese e qualquer outra técnica de separação adequada. Os métodos para a purificação de proteínas são bem conhecidos na arte. De preferência, a preparação de antigénio é purificada por um método que compreende isolar uma cultura de células bacterianas de estafilococos, suspender as células isoladas numa mistura que compreende uma solução de ácido tricloroacético, agitar a mistura a aproximadamente 4 °C, centrifugar a mistura e guardar o sobrenadante resultante, combinar o sobrenadante com um álcool, incubar a combinação álcool-sobrenadante a aproximadamente 4 °C, para precipitar o 23

antigénio e isolar o antigénio precipitado. As células bacterianas utilizadas são S. epidermidis (ATCC 55133). A título de exemplo, são descritos vários métodos de purificação de proteínas em Proteins:Structures and Molecular Properties (T.E. Creighton, W.H. Freeman and Co., New York, 1984). São bem conhecidos na arte vários métodos para a purificação de polissacáridos. A título de exemplo, alguns destes métodos são descritos em Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, 2nd Edition (D. Rickwood, ed., IRL Press, Oxford England, 1984). Também são bem conhecidos na arte métodos para a identificação, produção e utilização de antigénios sintéticos. A título de exemplo, vários destes métodos estão descritos em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Synthetic Polypeptides as Antigens (R.H. Burden and P.H. Knippenberg, eds. Elsevier, New York, 1988). A preparação de antigénios por introdução num hospedeiro, produz um anticorpo que pode ser policlonal ou monoclonal, que reage num primeiro teste com uma preparação de um primeiro organismo estafilococos e num segundo teste com uma preparação de um segundo organismo estafilococos. As primeira e segunda preparações de um organismo estafilococos podem ser quaisquer preparações de um organismo estafilococos, incluindo células intactas, células fraccionadas por meios químicos ou físicos, ou extractos celulares e é de preferência um extracto de células totais ou de superfície celular. De preferência, os primeiro e segundo organismos estafilococos são de diferentes serotipos ou de diferentes espécies. Também se prefere que uma preparação seja de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133). Uma preparação de organismos estafilococos é compreendida por polissacáridos, proteínas, lípidos e outros componentes de células bacterianas. É preferido que a preparação seja uma preparação de polissacárido e proteína, i.e. uma preparação que contém predominantemente misturas ou combinações de polissacáridos, proteínas e glicoproteínas. Pode-se preparar uma preparação adequada por isolamento de uma cultura de 24

Çp c>-^7 células bacterianas de Staphylococcus epidermidis (Hay, AT CC 55133), suspensão das células isoladas numa mistura constituída por uma solução de ácido tricloroacético, agitação da mistura a aproximadamente 4 °C, centrifugação da mistura e armazenamento do sobrenadante resultante, combinação do sobrenadante com álcool, de preferência etanol absoluto, incubação da combinação álcool-sobrenadante a aproximadamente 4 °C, para precipitar a preparação e isolamento da preparação precipitada. 0 primeiro e segundo testes podem ser quaisquer testes imunológicos e de preferência testes de ligação, testes de opsonização, testes de eliminação, ou qualquer combinação destes testes. Um método preferido utiliza um teste de ligação, que é aqui descrito, em que o anticorpo gerado pelo antigénio isolado, é reagido num teste de ligação com uma preparação de um organismo estafilococos. O teste de ligação é de preferência um teste ELISA ou RIA, mas pode ser também um teste de aglutinação, um teste de co-aglutinação, um teste colorimétrico, um teste de ligação fluorescente, ou qualquer outro teste de ligação adequado. Pode ser realizado por processos competitivos ou não competitivos, sendo os resultados determinados directa ou indirectamente. Outro método preferido utiliza um teste de opsonização in vitro que pode ser um teste colorimétrico, um teste quimioluminescente, um teste de absorção fluorescente ou marcado radioactivamente, um teste bactericida mediado por células ou qualquer outro teste adequado, que meça o potencial opsónico de uma substância. Um teste de opsonização preferido é o teste bactericida mediado por células que é aqui descrito. Este teste de opsonização pode utilizar um anticorpo, que pode ser policlonal ou monoclonal, que foi produzido por um antigénio isolado. Neste caso, o teste iria medir a actividade opsónica do anticorpo produzido, proporcionando assim uma determinação indirecta do potencial de opsonização do antigénio isolado. 25

Outro método preferido de identificação da imunoglobulina para o tratamento de uma infecção por estafilococos utiliza um teste de eliminação. Um teste de eliminação preferido é realizado num modelo animal que foi aqui descrito. Um modelo animal particularmente útil compreende os passos de administrar uma composição farmacêutica, um imunosupressor, e um organismo estafilococos a um animal imaturo e avaliar se a composição farmacêutica reduz a mortalidade do animal ou potência a eliminação do organismo estafilococos do animal. A composição farmacêutica pode compreender um antigénio isolado ou anticorpo gerado pelo antigénio, que pode ser policlonal ou monoclonal. Quando se administra a composição farmacêutica que compreende o anticorpo produzido, o teste mede o efeito do anticorpo administrado. Este teste pode utilizar qualquer animnal imaturo, incluindo o coelho, o porquinho da índia, o ratinho, o rato ou qualquer animal de laboratório adequado. 0 rato de amamentação é o mais preferido.

Podem-se combinar o antigénio isolado e um veículo farmaceuticamente aceitável numa vacina que, por introdução num hospedeiro, produz um anticorpo que protege contra a infecção por um organismo estafilococos. Descreve-se aqui um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 antigénio isolado é aqui descrito e é qualquer antigénio individual, qualquer mistura de diferentes antigénios, ou qualquer combinação de antigénios que são separados de um ou mais organismos. As vacinas serão particularmente benéficas para os indivíduos que se sabe, ou suspeita estarem em risco de infecção por estafilococos. Isto inclui pacientes que se preparam para ser submetidos a cirurgia, que envolve o corte ou dano da pele ou tecido mucoso, alguns funcionários de saúde e pacientes cujo sistema imunitário é esperado se torne enfraquecido devido a qualquer forma de terapia, como a quimioterapia, ou terapia de radiação para o tratamento do cancro. 26

Esta composição farmacêutica pode ser utilizada num método de tratamento. Um método para o tratamento de um humano ou qualquer animal, infectado, ou que se suspeita estar infectado por um organismo estafilococos compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica. Um método para a prevenção da infecção por um organismo estafilococos num humano, ou qualquer animal, compreende a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz da composição farmacêutica. Em qualquer situação, a administração da composição farmacêutica pode envolver doses individuais ou múltiplas, fornecidas sistemicamente a todo o indivíduo. A administração pode ser por injecção, tal como intravenosa, intraperitoneal ou sub-cutânea. Os métodos para a administração terapêutica e profilática de composições farmacêuticas são bem conhecidos na arte, ou podem ser determinados com um grau razoável de experimentação. No The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 8a edição (A.G. Goodman et al., editores, Pergamon Press, Nova Iorque, 1990), que é aqui especificamente incorporado para referência, estão descritos vários exemplos.

Um método para avaliar a eficácia de uma composição farmacêutica utilizada para tratar um agente infeccioso compreende os passos de administrar a composição farmacêutica, um imunossupressor, e um agente infeccioso a um animal imaturo, que é de preferência um rato de amamentação, e avaliar se a composição farmacêutica reduz a mortalidade do animal ou aumenta a eliminação do agente infeccioso pelo animal. Pode-se utilizar este método, em que o agente infeccioso é seleccionado de entre o grupo constituído por uma bactéria, de preferência uma bactéria gram positiva, um parasita, um fungo e um vírus. Um imunossupressor é qualquer substância que enfraquece o sistema imunitário do animal ao qual é administrado e é seleccionado de entre o grupo constituído por esteróides, agentes anti-inflamatórios, prostaglandinas, imunossupressores celulares, ferro, sílica, partículas, esferas, emulsões de 27

lípidos e qualquer outro imunossupressor eficaz. De preferência, o imunossupressor é ciclosporina, dexametasona, triamcinolona, cortisona, prednisolona, ibuprofeno, ou qualquer outro composto relacionado ou combinação de compostos. Mais preferencialmente, o imunossupressor é uma emulsão de lípidos e a emulsão de lípidos de eleição é de intralípidos. A composição farmacêutica é preferencialmente administrada profilaticamente, de modo a avaliar a eficácia da composição farmacêutica em melhorar a resistência a um agente infeccioso, ou terapeuticamente, para avaliar a eficácia da composição farmacêutica em matar directamente o agente infeccioso ou aumentar a resposta imunitária de um animal infectado, contra a infecção. 0 antigénio da presente invenção pode ser utilizado num método para a detecção de uma composição farmacêutica numa amostra biológica. Quando a composição farmacêutica compreende uma imunoglobulina, o método compreende a adição de uma amostra biológica que contém a composição farmacêutica com o antigénio isolado e a determinação da quantidade de ligação da composição farmacêutica ao antigénio isolado. Alternativamente, quando a composição farmacêutica compreende o antigénio isolado, este método compreende a adição de uma amostra biológica que contém a composição farmacêutica com um anticorpo específico para a composição farmacêutica e a determinação da quantidade de ligação da composição farmacêutica ao anticorpo. Estes métodos podem ser utilizados inter alia, para determinar a semi-vida, seguir a via de distribuição e identificar os produtos de degradação de uma composição farmacêutica particular. Com esta informação, pode-se proporcionar um melhor cuidado, determinando a melhor via de tratamento com a composição farmacêutica.

Exemplo 1 28

Descreve-se aqui a identificação da imunoglobulina reactiva num teste com uma preparação de um primeiro organismo estafilococos e com uma preparação de um segundo organismo estafilococos. Utilizaram-se as fracções de IgG de imunoglobulina intravenosa convencional (IVIG) nestas experiências, para representar grandes conjuntos de imunoglobulinas. Analisaram-se preparações de vários conjuntos de IgG de várias firmas, para comparação (Gamimmune, Cutter Labs., Inc., Berkeley, Califórnia: Sandoglobuin, Sandoz, East Hanover, N.J.; Gammagard, Hyland, Los Angeles, Califórnia, Polygam, American Red Cross, Washington, D.C.)

Testaram-se amostras de cada um destes conjuntos e uma amostra de um paciente individual (SAM), quanto à ligação num imunoensaio enzimático, especificamente um teste imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA), contra uma preparação de S. epidermidis. Embora se possa utilizar qualquer estirpe de S. epidermidis, utilizaram-se nestas experiências a estirpe Hay, uma estirpe clínica isolada a partir do sangue de uma criança com sepsia por S. epidermidis. Esta estirpe está depositada na Amercian Type Culture Collection (ATCC) e foi-lhe atribuído o número 55133. Em resumo, cresceu-se uma cultura de S. epidermidis (Hay ATCC 55133) até à fase log (18-36 horas) a 37 °C, em alíquotas de 1600 ml de caldo de soja tríptico (Difco Labs., Detroit, Mi.). A cultura foi centrifugada a 5000 rpm durante 10 minutos e os botões celulares foram ressuspendidos num pequeno volume (10-25 ml) de ácido tricloroacético a 2% (TCA) a pH 2,0. As suspensões de TCA foram combinadas e agitadas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, a suspensão combinada foi centrifugada a 5000 rpm durante 10 minutos, os sobrenadantes foram aspirados e guardados e os botões celulares foram desprezados. Os sobrenadantes foram combinados com quatro volumes de etanol absoluto e armazenados durante a noite a 4 °C. Esta solução foi centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos, os sobrenadantes foram aspirados e desprezados e os precipitados de antigénio foram ressuspendidos em solução 29

Γ\\ji (~*7 fi ___\ j ' salina e cultivados para assegurar esterilidade. As suspensões salinas foram liofilizadas e armazenadas a 4 “C. 0 antigénio de TCA para teste ELISA foi feito a partir de cada serotipo, por dissolução de 1,0 mg de extracto liofilizado em 40 ml de tampão de revestimento. 0 tampão de revestimento foi preparado por combinação de 1,59 g de Na2C03, 2,93 g de NaHC03 e 0,2 g de NaN3 e adição de água destilada até um volume final de 1000 ml. Esta solução foi ajustada até pH 9,6. Adicionaram-se alíquotas de 100 microlitros de solução contendo antigénio a cada poço de placas de microtítulo de 96 poços, utilizando placas separadas para cada serotipo. As placas foram incubadas durante a noite a 4 °C, após o que se esvaziaram os poços e lavaram quatro vezes com PBS-Tween. O PBS-Tween foi preparado combinando 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KH2P04, 2,9 g de Na2HP04, 0,2 g de KCl, 0,2 g de NaN3 e 0,5 ml de Tween-20 e adicionando água destilada até um volume final de 1000 ml. A solução foi ajustada para pH 7,4. Adicionaram-se amostras de 100 μΐ de cada conjunto de imunoglobulina aos poços. As placas que continham antisoros foram incubadas a 4 °C durante 2 horas, após o que foram novamente esvaziados e lavados quatro vezes com PBS-Tween. Preparou-se uma diluição 1/400 de IgG anti-coelho de cabra conjugada com fosfatase alcalina (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.) em PBS-Tween. Adicionaram-se alíquotas de 40 μΐ a cada poço das placas de microtítulo e as placas foram incubadas durante duas horas a 4 °C. As placas foram mais uma vez esvaziadas e lavadas quatro vezes com PBS-Tween. Preparou-se uma solução de lmg/ml de p-nitrofenil fosfato (Sigma Chem Co. , St. Louis, Mo) em tampão dietanolamina e adicionaram-se alíquiotas de 100 μΐ desta solução a cada poço das placas de microtítulo. O tampão dietanolamina foi preparado combinando 97 ml de dietanolamina e 0,2 g de NaN3 e adicionando água destilada a um volume final de 1000 ml. A solução foi ajustada para pH 9,8. estas placas foram incubadas a 37 °C durante duas horas. Mediu-se a absorvência a 405 nm utilizando um aparelho Multiskan® MCC/340 (Flow Labs., Lugano Switzerland). 30

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TABELA I

Actividade de ligação ao antigénio de imunoglobulina humana para Staphylococcus epidermidis (ATCC 55133)

Imunoqlobulina Densidade 0609 0,707 163 0,731 0224 0,648 40R07 1,014 110 0,786 2801 0,666 40R09 1,026 069 0,901 SAM 1,002

Como indicado na tabela I, houve uma diferença acentuada na actividade de ligação de cada conjunto testado. A maioria das amostras continha níveis baixos de anticorpo contra S. epidermidis. De notar que uma amostra com uma das actividades mais baixas (2801) e a amostra com a mais elevada (40R09) são ambas da mesma fonte, Cutter Laboratories. De entre os conjuntos de ligação mais elevados, o 069 e 40R09 foram obtidos de diferentes firmas. Estes dados indicam que nenhum método individual para a preparação de imunoglobulinas pode assegurar a presença de um título elevado de anticorpos contra S. epidermidis, apesar do facto de cada um dos conjuntos testados representar grandes colecções de soros humanos. As variações no conteúdo de anticorpo reactivo ocorreram entre preparações preparadas pela mesma firma e entre lotes da mesma preparação, indicando que todos os conjuntos de imunoglobulina são distintos e que as diferenças no conteúdo de um anticorpo identificável específico podem ser surpreendentes.

Exemplo 2 31

Γ\ \ .1

Num segundo estudo de ligação imunoglobulinas, pesquisaram--se amostras de plasma ao acaso, de quase uma centena de pacientes humanos, num teste ELISA. Determinaram-se os títulos de anticorpo contra quatro estirpes de S. epidermidis. Uma das estirpes foi obtida da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC 31423; serotipo I). Duas outras (serotipos II e III) foram fornecidas pelo Dr. Y. Ichiman da St. Marianna University Sçhool of Medicine, Japão e foram anteriormente descritas (Y. Ichiman, J. Appl. Bacteriol. 56:311 (1984) . Prepararam-se preparações de cada, como anteriormente. O ELISA foi realizado como anteriormente descrito, excepto que se utilizaram 40 μΐ de cada amostra. Como se pode ver na Figura 1, um número significativo de amostras continha anticorpo para cada estirpe de S. epidermidis, incluindo a estirpe clínica, Hay (ATCC 55133). Estes dados indicam que embora houvesse uma grande variabilidade na ligação, poderão existir anticorpos com reacção cruzada numa mesma amostra.

Exemplo 3

Para eliminar a possibilidade de as amostras da Figura 1 conterem simplesmente grandes números de anticorpos distintos e específicos da estirpe, contra S. epidermidis, imunizaram-se coelhos ou com uma vacina de células totais mortas pelo calor, ou com uma vacina preparada em TCA, de uma preparação de S. epidermidis. As preparações de S epidermidis tratadas com TCA foram preparadas como descrito. Dissolveu-se um miligrama desta preparação em 1,0 ml de solução salina normal e administrou-se intramuscularmente a coelhos brancos da Nova Zelândia. Após uma semana de repouso, foi dada uma nova dose de 1,0 ml. Uma dose final dada uma semana mais tarde completou a série de imunização principal. Pode-se incluir um terceiro , (P3), quarto (P4) ou quinto (P5) processo de imunização e podem-se utilizar séries de reforço adicionais, como acima, para elevar ainda mais os níveis de anticorpos específicos. Deram-se novas 32 \ \!

-Γ imunizações de reforço a intervalos adicionais. A vacina de células bacterianas totais foi preparada como se segue. Inoculou-se caldo de soja tríptico com S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) e incubou-se durante três horas a 37 °C.

Centrifugou-se uma alíquota de 20 ml desta preparação a 3000 rpm durante 10 minutos, desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pelete celular em solução salina normal. Realizou-se uma segunda lavagem com solução salina após uma centrifugação repetida e preparou-se a suspensão final em solução salina, de modo a se obter um volume total de 10 ml. As bactérias foram aquecidas a 56 °C durante 60 minutos para produzir a vacina de células totais mortas pelo calor, que foi cultivada para assegurar a esterilidade. Administrou-se um mililitro (cerca de 109 células) desta preparação de células totais intravenosamente a coelhos brancos da Nova Zelândia, diariamente durante cinco dias. Após uma semana de repouso os coelhos foram novamente imunizados diariamente durante cinco dias. Pode-se incluir um terceiro (P3), quarto (P4) ou quinto (P5) processo de imunização e pode-se utilizar uma série de reforço adicional como acima, para aumentar ainda mais os níveis de anticorpo específico. Foram dadas novas imunizações de reforço a intervalos adicionais.

Os soros obtidos após imunização com a preparação de células totais mostraram um aumento marcado de anticorpos contra S. epidermidis, enquanto que a magnitude total da resposta imunitária foi reduzida no soro obtido após a imunização do antigénio de TCA (Figuras 2 e 3) . No entanto, tanto os soros tratados com TCA, como os soros tratados com células totais produziram anticorpos muito reactivos contra todos os três serotipos de S. epidermidis, mais a estirpe de vacina. Uma vez que apenas havia uma única estirpe à qual estes animais foram originalmente expostos e havia um nível base de ligação equivalente antes da imunização, é claro que ambas as preparações de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) produziram 33

anticorpos reactivos com vários seroptipos de S. epidermidis. Exemplo 4

Todos os anticorpos, mesmo os direccionados contra um dado organismo, podem não aumentar a imunidade e proporcionar uma protecção aumentada contra a infecção. Dito de outro modo, os anticorpos que se ligam a um antigénio poderão não aumentar necessariamente a opsonização ou eliminação desse antigénio pelo animal infectado. Assim, utilizou-se um teste bactericida mediado por neutrófilos para determinar a actividade funcional do anticorpo contra S. epidermidis. Isolaram-se neutrófilos de sangue venoso de adultos por sedimentação com dextrano e centrifugação de densidade em Ficoll-Hypaque. Adicionaram-se neutrófilos lavados a poços de fundo redondo de placas de microtítulo (aproximadamente 106 células por poço) com aproximadamente 3 x 104 bactérias em fase mid-log (S. epidermidis Hay, ATCC 55133). Utilizou-se soro de coelhos recém-nascidos (10 μΐ) pesquisado para assegurar a ausência de anticorpos contra S. epidermidis, como fonte de complemento activo. Adicionaram-se quarenta microlitros de imunoglobulina (ou soro) a várias diluições e as placas foram incubadas a 37 °C com agitação constante, vigorosa. Recolheram-se amostras de 10 μΐ de cada poço ao tempo zero e após 2 horas de incubação. Diluiu-se cada um agitou-se no vortex vigorosamente, para dispersar as bactérias e fez-se a cultura em placas de agar de sangue durante a noite a 3 7 °C, para quantificar o número de bactérias viáveis. Os controlos consistiam de neutrófilos mais complemento sozinho. Os resultados são apresentados como redução percentual no número de colónias de bactérias observadas, comparado com amostras de controlo. 34

f θ'7

TABELA II

Actividade opsónica de conjuntos de imunoglobulina humana contra Staphylococcus epidermidis (ATCC 55133) actividade opsónica

Imunoqlobulina Percen 0609 18 163 8 0224 54 40R07 92 110 12 2801 45 40R09 90 069 15 2926 0 004 54 100 3 2807 23 SAM 97 controlo* 0 (* = neutrófilos mais complemento sozinho) A actividade opsónica variou de 0% a 23% para algumas amostras e de 90% a 97% para outras. Como observado no teste de ligação, não foi possível estabelecer nenhuma correlação entre as técnicas preparativas utilizadas e a actividade funcional observada. No entanto, algumas das imunoglobulinas que tinham um grau elevado de ligação na tabela I (O.D. > 1,0), tinham também um nível elevado de actividade opsónica na tabela II (e.g. 40R07, 40R09 e SAM) . Por outras palavras, apenas algumas imunoglobulinas que se ligaram às preparações de S. epidermidis tratadas com TCA promoveram a fagocitose e morte de S. epidermidis. Assim, pela primeira vez, a utilização de testes de pesquisa in vitro permitiu selecionar a imunoglobulina que 35

η, _

^:./W

contém níveis elevados de anticorpos para S. epidermidis. que teriam também níveis de confiança de anticorpos para prevenir e tratar as infecções por S. epidermidis

Exemplo 5

Era importante determinar se os anticorpos opsónicos contra S. epidermidis eram especificamente direccionados contra antigénios de S. epidermidis específicos do serotipo, ou se eram direccionados contra antigénios de estafilococos comuns. Para analisar estas alternativas, pré-absorveram-se imunoglobulinas de título elevado seleccionadas com uma preparação de S. epidermidis (Hay ATCC 55133) e testaram-se quanto à actividade opsónica contra três cocci gram positivos, diferentes. Cresceram-se as bactérias absorventes durante a noite em placas de agar de sangue, rasparam-se das placas, suspenderam-se em solução salina normal e sedimentaram-se em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml, até um quinto do volume do tubo. Após adição de 0,4 ml de imunoglobulina a cada, os tubos foram agitados no vortex e rodados a uma velocidade baixa num tambor basculante (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pa.) a 4 °C, durante a noite. As bactérias foram sedimentadas no dia seguinte num tubo de microcentrífuga e o sobrenadante foi removido e filtrado através de um filtro de membrana de 0,2 μπι. A imunoglobulina estéril não continha anticorpos de ligação de S. epidermidis detectáveis e foi utilizada quer directamente, quer após armazenamento a 70 °C. A imunoglobulina de título elevado seleccionada (imunoglobulina direccionada) mostrou opsonização das duas espécies de estafilococos e da espécie de estreptococos testada (Figura 4). Com a imunoglobulina seleccionada que foi pré--absorvida com uma preparação de S. epidermidis, a actividade opsónica de S. epidermidis foi completamente removida (95% a 0% de actividade bactericida). No entanto, a actividade opsónica contra Streptococcus agalactiae, um género diferente, não foi 36

Γ\ \ ;i R? diminuída (93% a 94%). Surpreendentemente, a actividade opsónica de S. aureus (gentilmente cedida pelo Dr. Mendiola do Walter Reed Army Medicai Center), que estava presente na imunoglobulina seleccionada, em cerca de metade do nível como actividade de anticorpo contra S. epidermidis, estava reduzida, sugerindo também que há anticorpos contra antigénios partilhados pelo S. epidermidis e S. aureus. Assim, esta preparação de imunoglobulina seleccionada promoveu a opsonização por anticorpos anti-estafilococos comuns, que podiam ser identificados por absorção com S. epidermidis. Na ausência de anticorpos, não se demonstrou actividade bactericida contra nenhuma das bactérias (neutrófilo mais complemento apenas). Assim, pode-se concluir que os anticorpos anti-estafilococos eram direccionados contra antigénios estafilococos chave, que podiam proporcionar tanto uma protecção específica contra o S. epidermidis, como uma protecção ampla contra outros serotipos e espécies de estafilococos.

Exemplo 6

Determinou-se a actividade opsónica do soro de coelhos imunizados com a preparação tratada com TCA e a preparação de células totais. Imunizaram-se coelhos, quer com a preparação de S. epidermidis tratada com TCA, quer com a de células totais (Hay, ATCC 55133). Recolheram-se os soros como anteriormente e testaram-se quanto â actividade de opsonização contra três estirpes de serotipos diferentes de S. epidermidis mais a estirpe de vacina no teste bactericida mediado por neutrófilos. Como se pode ver nas Figuras 5 e 6, tanto a preparação tratada com TCA, como a de células totais induziram uma resposta de anticorpos com uma actividade opsónica muito elevada contra todos os três serotipos. Embora o soro pré-vacinado utilizando a preparação tratada com TCA tenha, de facto, apresentado alguma actividade contra o serotipo I (Figura 5) , a actividade opsonizante praticamente duplicou após a inoculação, indicando 37

que os anticorpos de estafilococos comuns eram, de facto, responsáveis. Estes dados mostram que os anticorpos contra antigénios de cápsula de S. epidermidis são importantes para a imunidade e que um ou mais antigénios podem ser antigenicamente semelhantes, entre diferentes serotipos.

Exemplo 7 A actividade opsonizante dos soros de coelhos vacinados foi mais uma vez determinada utilizando S. aureus tipo 5, como bactéria teste (Figura 7) . A actividade opsonizante global contra S. aureus não era tão elevada como as actividades observadas contra as estirpes de S. epidermidis, mas as amostras de soro de animais imunizados originaram uma actividade significativa, em comparação com amostras não vacinadas. Estes dados indicam que os anticorpos opsonizantes contra S. epidermidis são também protectores contra S. aureus e sugerem mais uma vez que estes anticorpos podem ser direccionados contra um ou mais antigénios de estafilococos comuns.

Exemplo 8

Muitas bactérias como o S. epidermidis, não são patogénicas em humanos normais. No entanto, em crianças com um sistema imunitário imaturo e nos indivíduos com um sistema imunitário enfraquecido, o S. epidermidis pode originar sepsia e mesmo a morte. Assim, em qualquer modelo animal de sepsia é crítico incluir estes factores. Determinou-se que utilizando um animal com um sistema imunitário imaturo e submetendo esse animal a um imunossupressor, se pode estudar a situação observada com os pacientes humanos com sepsia. 0 modelo de rato de amamentação provou ser muito útil para estes estudos e é o modelo animal preferido. Ratos bebé normais, injectados com S. epidermidis tornaram-se bacteriémicos dentro de duas horas e começam a eliminar lentamente a infecção, pouco depois. 38

TABELA III Níveis de bacteriémia de Staphvlococcus epidermidis em ratos de amamentação, tratados com solução salina normal

Tempo após Número de Percentagem de Nível de infeccão bacteriémicos bacteriémicos bacteriémia 2 horas 8/8 100 3,8 x 102 4 horas 7/8 87,5 1,3 x 102 6 horas 8/8 100 7,5 x 102 14 horas 6/8 75 8,8 x 101 18 horas 3/8 37,5 0,5 x 101 22 horas 0/8 0 0

Todos os animais eliminaram a bacteriémia dentro de 72 horas após a infecção (Tabela III) , sugerindo que sob circunstâncias normais, a imunidade neo-natal, apesar de enfraquecida, pode eventualmente controlar o S. epidermidis. No entanto, alguns estudos em ratos infectados com S. epidermidis pouco depois do nascimento demonstraram que se pode ainda desenvolver uma infecção letal (dados não apresentados).

Exemplo 9

Testou-se o efeito de intralípidos na mortalidade de S. epidermidis nos ratos de amamentação. Injectaram-se ratos Wistar com intralípidos, um imunossupressor, imediatamente após do nascimento. Administraram-se os intralípidos aos animais começando no dia dois de vida, administrando-se duas doses em cada dia durante dois dias. Com a dose final de intralípido também se forneceu aos animais a imunoglobulina seleccionada ou solução salina. Após esta dose final, os animais foram infectados por injecção subcutânea com uma preparação de S. epidermidis (Hay, ATCC 55133). Fez-se a sub-cultura de amostras de sangue em placas, para assegurar que a bacteriémia era 39

causada por estafilococos e para seguir a eliminação após a terapia. Todos os animais foram seguidos durante cinco dias, para determinar a sobrevivência.

TABELA IV

Modelo animal: Efeito da dose de intralípidos na mortalidade por Staphylococcus epidermidis em ratos de amamentação. Sobrevivência Dose de intralípido Infectado Controlo 4 mg/kg 10/10 100% 7/7 100% 8 mg/kg 10/13 76% 9/9 100% 12 mg/kg 7/12 58% 11/11 100% 16 mg/kg 6/13 46% 11/11 100% *16 mg/kg 2/6 33% 5/5 100% * = dose de intralípidos iniciada no dia um de vida com infecção após dose final no dia dois. Os animais que receberam apenas S. epidermidis ultrapassaram com sucesso a infecção e sobreviveram. Apenas os animais que foram tratados com intralípidos antes da infecção, apresentaram um decréscimo acentuado na sua capacidade de resistir ao S. epidermidis. A morte ocorreu com uma frequência aumentada, que estava correlacionada com uma dose aumentada de intralípidos.

Exemplo 10 A eficácia da imunoglobulina de título elevado (direccionada) seleccionada em proporcionar uma protecção contra uma infecção letal por S. epidermidis (Hay, ATCC 55133) foi determinada no modelo de rato de amamentação. Forneceu-se a ratos Wistar de dois dias de idade, duas injecções intraperitoneais de 0,2 ml de 2 0% de intralípidos. No dia seguinte, forneceu-se mais uma vez aos animais a mesma série de 40 7

injecções de 20% de intralípidos, mais imunoglobulina ou soro de animais vacinados. Após a última injecção, injectaram-se subcutaneamente, aproximadamente 5 x 107 células de s. epidermidis (Hay, ATCC 55133) na base da cauda. Determinou-se a mortalidade durante cinco dias.

Tabela V

Eficácia da imunoglobulina direccionada contra Staphylococcus epidermidis em proporcionar protecção contra uma infecção letal

Imunoq1obu1ina Exp. #1 Tratados Morreram Mortalidade 40R09 24 0 0% Padrão 20 4 20% controlo - não tratado 13 7 54% não infectado 11 0 0%

Exp. #2 40R09 13 2 8% Induzido por vacina 11 2 18% controlo - sol. salina 19 11 42% A imunoglobulina direccionada, seleccionada pela capacidade de se ligar a, ou opsonizar, uma preparação de S. epidermidis (lot. No. 40R09), proporcionou uma protecção completa contra uma infecção letal num modelo animal de imunidade enfraquecida. Estes resultados são idênticos aos resultados obtidos a partir de animais não infectados. A imunoglobulina de baixo título, não seleccionada (também designada por imunoglobulina convencional), demonstrou uma mortalidade de 20% e os outros controlos eram como esperado. Os animais não tratados e não infectados apresentavam uma mortalidade superior a 50%. Numa segunda experiência semelhante, a imunoglobulina humana de título elevado, direccionada e o soro de coelho de titulo 41 elevado induzido por vacina, ambos fortemente protectores, produziram resultados quase idênticos, enquanto que o controlo de solução salina apresentava uma mortalidade superior a 40%. No global, estes dados sugerem que são de facto os anticorpos direccionados contra o S. epidermidis que são protectores no modelo do rato de amamentação.

Exemplo 11

Testou-se a imunoglobulina que se ligou a uma preparação de S. epidermidis num teste ELISA e a organismos de S. epidermidis opsonizados no teste bactericida mediado por células (imunoglobulina direccionada) , quanto à sua capacidade para promover a eliminação de S. epidermidis no modelo do rato de amamentação. Recolheram-se amostras de sangue de animais infectados a intervalos regulares (Figura 8) . Apenas a imunoglobulina direccionada, que foi anteriormente identificada num teste ELISA ou opsónico, diminuiu os níveis de bactérias ao longo do tratamento e foram estes animais que apresentaram um maior índice de sobrevivência, na tabela V. A imunoglobulina que não opsonizou, nem se ligou a uma preparação de S. epidermidis, não promoveu a eliminação de bactérias a partir do sangue de animais infectados.

Exemplo 12

Analisaram-se os anticorpos contra S. epidermidis quanto à capacidade de proporcionar protecção contra um grupo de estirpes de S. epidermidis, internacionais, geograficamente diversas no teste de eliminação do rato de amamentação (Figura 9). A imunoglobulina direccionada aumentou a sobrevivência contra um isolado clínico dos Estados Unidos (ATCC 55133), um protótipo de estirpe laboratorial (ATCC 31423, serotipo I capsular) e duas estirpes Japonesas distintas (serotipos II e III capsulares). A imunoglobulina direccionada pré-absorvida 42

contra uma preparação de S. epidermidis não apresentou nenhum aumento na sobrevivência (Figura 10). As contagens de bactérias de amostras de sangue, recolhidas ao longo deste estudo, também mostraram que a imunoglobulina direccionada elimina rapidamente a bacteriémia por estafilococos. Os ratos tratados com solução salina ou imunoglobulina pré-absorvida tinham bacteriémia persistente e uma mortalidade aumentada (Figura 11). A fim de determinar se a sobrevivência estava relacionada com a actividade funcional anti-estafilococos, as preparações de imunoglobulina com vários níveis dé actividade bactericida opsonofagocítica contra S. epidermidis (imunoglobulina direccionada) foram comparados com a solução salina e imunoglobulina pré-absorvida (que não tinha actividade bactericida contra S. epidermidis). Observou-se uma relação significativa entre a actividade bactericida opsonofagocítica do anticorpo e a sobrevivência na sepsia por estafilococos (Figura 12) . Enquanto que a solução salina, imunoglobulina convencional e imunoglobulina direccionada pré-absorvida, proporcionaram uma protecção fraca semelhante (cada um apresentava poucos ou nenhuns anticorpos bactericidas opsonofagocíticos) , a imunoglobulina direccionada não absorvida proporcionou uma sobrevivência uniformemente boa, indicando que os anticorpos anti-estafilococos opsónicos presentes estavam associados com a sobrevivência.

Exemplo 13

As descrições anteriores sugeriram que existem múltiplos serotipos de S. epidermidis. Além disso, há muitos outros estafilococos negativos para a coagulase, além do S. epidermidis. De modo a que os anticorpos amplamente reactivos sejam mais eficazes, estes deverão idealmente, cobrir todos os estafilococos patogénicos negativos para a coagulase,. Muitos estafilococos negativos para a coagulase, no entanto, raramente, ou nunca, causam infecções em humanos. Assim, seria 43 importante saber se os anticorpos amplamente reactivos seriam capazes de se ligar a todas as bactérias negativas para a coagulase, patogénicas, humanas.

Imunizaram-se coelhos com estafilococos de uma de três estirpes de S. epidermidis (ATCC-31432, S. epidermidis 360 e S. epidermdis 10) . 0 S. epidermidis 360 é do mesmo serotipo que a estirpe tipo, Hay (ATCC 55133). Os antisoros foram identificados como se segue: o Anti-I foi produzido contra a estirpe ATCC 31432; o anti-I foi produzido contra a estirpe S. epidermidis 360 e o anti-III foi produzido contra a estirpe S. epidermidis 10.

Os estafilococos negativos para a coagulase isolados de pacientes foram classifiçados por espécie e caracterizados como patogéneos, quando num determinado paciente existiam > 2 culturas positivas de locais normalmente estéreis (culturas obtidas a diferentes tempos ou de diferentes locais). Estas culturas foram então reagidas com antisoros de coelho (anti-I, anti-II e anti-III) num teste ELISA.

Teste ELISA

Preparação de placas ELISA. Adicionaram-se antigénios extraídos de alíquotas de 100 λ de S. epidermidis a placas de microtítulo de 96 poços (Nunclon®, Nunc, Dinamarca) e estas foram armazenadas durante a noite, a 4 °C. Os poços foram lavados suavemente com Tween (0,5 ml Tween 20/1 H20 desionizada) antes de utilização.

Preparação dos anti-soros. Produziram-se antisoros de coelho designados por anti-I, anti-II e anti-III de acordo com o método geral de Fischer G. W. et al., J. Exper. Med. 148:776-786 (1978). As preparações de antisoro são então diluídas 100 vezes em PBS-Tween, antes de utilização. Também se realizam novas diluições em série em PBS-Tween. Os antisoros de coelho 44

ν' ν

(anti-I, anti-II, anti-III) foram perparados por absorção com as duas estirpes heterólogas para remover anticorpos de estafilococos comuns, não específicos para uma das estirpes.

Análise da reactividade de anticorpos. Prepararam-se placas de microtítulo utilizando 40λ de antisoro a várias diluições (1/100-1/12800). Os antisoros foram adicionados aos poços adequados das placa de microtítulo. Utilizou-se solução salina normal como controlo e esta foi diluída de forma semelhante. Incubaram-se as placas a 4 °C durante duas horas. Preparou-se IgG anti-coelho de cabra, conjugada com fosfatase alcalina (Sigma, St Louis, MO) numa diluição 1/400 com PBS Tween. Adicionaram-se 40λ desta preparação a cada poço, em colunas adequadas. O PBS-Tween sozinho foi adicionado a uma única coluna de poços. As placas foram mais uma vez incubadas a 4 °C durante duas horas. Utilizou-se 4-nitrofenilfosfato como substrato para a reacção enzimãtica e este foi preparado dissolvendo um comprimido de 5 mg de substrato (104 comprimidos de substrato fosfato, Sigma) em 5 ml de tampão dietanolamina a 10% (veja-se a seguir). Adicionaram-se então 100λ desta preparação de substrato a cada poço, como adequado, após incubação a 37 °C e mediu-se a absorvência a 405 nm a 120 minutos, utilizando o aparelho Titertek® Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories, Lugano, Suiça).

Preparação de reagentes. Preparação de tampões a partir dos métodos de Voller, D. et al., Buli. W.H.O. 53:55-64 (1976) 1. Tampão de revestimento (pH 9,6)

Na2C03 1,59 g NaHC03 2,93 g NaN3 0,2 ç 3 H20 1000 ml 45

2. PBS-Tween (pH 7,4)

NaCl cn o 00 kh2po4 0,2 g Na2HP04 2,9 g KC1 0,2 g Tween 20 0,5 ml NaN3 CN o h2o 1000 ml 3. Tampão dietanolamina (pH 9,8)

Dietanolamina 97 ml

NaN3 0,2 g H20 para 1000 ml

Os resultados destes estudos são apresentados na tabela VI.

Foram identificados como patogéneos humanos, três estafilococos negativos para a coagulase, além do S. epidermidis. Cada um destes estafilococos patogénicos reagiu com antisoros de coelho obtidos após imunização com uma única estirpe de S. epidermidis (S. epidermidis 360). A absorção deste antisoro com as outras duas estirpes de S. epidermidis (utilizadas para produzir os outros antisoros, mas não este antisoro) não removeu os anticorpos reactivos com estafilococos induzidos por esta única estirpe de S. epidermidis. Os anticorpos produzidos contra as outras estirpes, no entanto, não reagiram a qualquer estirpe patogénica após absorção com S. epidermidis 360. Além disso, o S. epidermidis Hay (ATCC 55133) reagiu com os antisoros amplamente reactivos, mostrando ainda que os antigénios deste organismo se ligam a anticorpos nos antisoros amplamente reactivos.

Ichiman e Yoshida dividiram o S. epidermdis em 3 serotipos (J. Appl. Bacteriol. 51:229 (1981)). No entanto, não conseguiram demonstrar que a patogenicidade estava associada com qualquer estirpe ou estirpes específicas, utilizando testes 46

de virulência em ratinhos (Ichiman, J. Appl. Bacteriol. 56:311 (1984)). Os resultados apresentados neste exemplo demonstram que todos os estafilococos negativos para a coagulase, humanos, patogénicos, reagiram com os anticorpos produzidos por imunização com uma única estirpe de S. epidermidis, mas não com outras duas estirpes, constituindo uma nova observação. A estirpe de S. epidermidis imunizante e de S. epidermidis Hay (ATCC 55133), reagiram ambas com os antisoros com que todos os patogéneos humanos reagiram. Os resultados demonstram claramente que os antigénios de superfície dos patogéneos humanos e a estirpe imunizante e o S. epidermidis Hay (ATCC 55133) são semelhantes. Assim, os anticorpos contra um único S. epidermidis com os constituintes adequados (tal como S. epidermidis Hay (ATCC 55133)) puderam conferir uma protecção ampla contra os estreptococos negativos para a coagulase. Além disso, os anticorpos produzidos contra estes determinantes antigénicos são úteis para distinguir entre estafilococos patogénicos e não patogénicos em isolados laboratoriais. Estes anticorpos podem também ser utilizados para detectar estafilococos patogénicos e antigénios seus derivados ou anticorpos para eles direccionados, em fluidos corporais de mamífero, tal como o fluido cerebro-espinal, sangue, fluido peritoneal e urina.

TABELA VI

Os estafilococos negativos para a coagulase que são patogéneos humanos* reagem com anticorpos derivados da imunização com um _único estafilococos negativo para a coagulase_

Organismo No. Isolado Reacção positiva S. epidermidis 16 (57%) 16/16 (100%) S. haemolvticus 8 (29%) 8/8 (100%) S. hominis 3 (11%) 3/3 (100%) S. simulans 1 ( 3%) 1/1 (100%) S. warneri 0 - S. capitis 0 - 47 * Os isolados foram seleccionados apenas de pacientes com > 2 culturas positivas de locais estéreis (diferentes tempos ou diferentes fontes)

Outras formas de concretização e utilizações da invenção serão evidentes para os peritos na arte, tendo em conta o pedido e prática da invenção, aqui descritos. O pedido e exemplos pretendem ser apenas exemplificativos, sendo o verdadeiro âmbito e espírito da invenção descrito pelas reivindicações seguintes.

Lisboa, 29 de Dezembro de 2000 Cagentkoficial da proprjedade industrial 48

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Preparação de antigénios, isolável a partir de Staphylococcus epidermidis, estirpe Hay ATCC 55133, em que a referida preparação produz anticorpos opsónicos amplamente reactivos, que reagem especificamente num teste com os serotipos I, II e III de Staphylococcus epi dermi di s.
2. 2. Preparação de antigénios de acordo com a reivindicação 1, que se obtém por um método que compreende os passos de: (a) isolar uma cultura de células bacterianas de estafilococos (b) suspender as células isoladas numa mistura compreendida por uma solução de ácido tricloroacético, (c) agitar a mistura a aproximadamente 4 °C, (d) centrifugar a mistura e guardar o sobrenadante resultante, (e) combinar o sobrenadante com um álcool, (f) incubar a combinação álcool-sobrenadante a aproximadamente 4 °C, para precipitar o antigénio, e (g) isolar o antigénio precipitado.
3. 3. Composição farmacêutica compreendendo: (a) a preparação de antigénio isolada de acordo com a reivindicação 1; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. 4. Cultura purificada de organismos estafilococos, compreendendo Staphylococcus epidermidis estirpe Hay ATCC 55133. 1 I
5. 5. Método para a obtenção de imunoglobulinas opsónicas amplamente reactivas, úteis para o tratamento de uma infecção de estafilococos negativa para a coagulase, compreendendo os passos de: (a) imunizar um mamífero com uma preparação de antigénios de acordo com a reivindicação 1 e (b) isolar as imunoglobulinas a partir do referido mamífero imunizado. Lisboa, 29 de Dezembro de 2000

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