JP4353974B2 - 通常のスタフィロコーカス抗原と反応する広い反応性のオプソニン抗体 - Google Patents
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Description
本発明は現在の方法に関連する問題および欠点を克服し、そしてブドウ球菌属(Staphylococcus) の感染の処置および予防のための新規な治療を提供する。ここにおいて広く記載するように、本発明は共通のブドウ球菌の抗原と反応する広く反応性のオプソニン抗体に関し、前記抗体から人間および動物におけるブドウ球菌属(Staphylococcus) の感染の処置および予防のためのワクチン、製剤組成物、および診断助剤をつくることができる。
ここにおいて具体化しかつ広く説明する、目的を達成するためにかつ本発明の目的に従い、本発明は、ブドウ球菌属(Staphylococcus)の感染を予防し、診断し、あるいは処置するために有用な免疫グロブリンおよび抗原の同定、生産、および単離からなる。本発明は、さらに、ここに記載する免疫グロブリンおよび調製物の組成物を包含する、製剤組成物の効能を試験するための生体内の動物モデルからなる。
本発明の1つの目的は、第1ブドウ球菌属(Staphylococcus) 微生物の調製物および第2ブドウ球菌属(Staphylococcus) 微生物の調製物と反応性である免疫グロブリンの同定である。標準の静脈内免疫グロブリン(IVIG)のIgG 画分をこれらの実験において使用して、大きい免疫グロブリンのプールを準備する。いくつかの会社からのIgG の種々のプールの調製物を比較のために分析した(Gamimmune, Cutter Labs., Inc. 、バークレイ、カリフォルニア州;Sandoglobuin, Sandoz、イーストハノーバー、ニュージャージイ州;Gammagard, Hyland 、ロサンジェルス、カリフォルニア州;Polygam, American Red Cross 、ワシントンDC)。
第2の免疫グロブリン結合の研究において、ほとんど100 人のヒト患者からの血漿の不規則的試料をELISA においてスクリーニングした。表皮ブドウ球菌(S.epidermidis) の4つの異なる株に対する抗体力価を決定した。1つの株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection) 米国マリイランド州ロックビレ)から入手した(ATCC 31423;血清型I)。
図1の試料が表皮ブドウ球菌(S. epidermidis) に対する多数の明確なかつ株特異的抗体を単に含有する可能性を除外するために、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis) の加熱死滅全細胞のワクチンまたは表皮ブドウ球菌(S. epidermidis) 調製物のTCA 調製ワクチンのいずれかで免疫化した。表皮ブドウ球菌(S. epidermidis) のTCA 処理調製物は前述したように調製した。この調製物の1mgを1.0 mlの通常の生理食塩水中に溶解し、そしてニュージーランド白ウサギに筋肉内投与した。
すべての抗体は、所定の微生物に対して向けられた抗体であってさえ、免疫性を増強することができず、そして感染からの増強される保護を提供することができない。換言すると、抗原に結合する抗体オプソニン化または感染した動物からの抗原のクリアランスを必ずしもこと増強することができるとは限らない。したがって、好中球仲介細菌アッセイを使用して、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)に対する機能的活性を決定した。
S.エピダーミジスに対するオプソニン抗体が血清型特異性S.エピダーミジス抗原に対して特異的であるか、又はそれらが共通のスタフィロコッカス抗原に特異的であるかを決定することは重要である。これらの択一性を調査するため、特定の高力価イムノグロブリンをS.エピダーミジスの調製品(Hay, ATCC 55133)に事前吸着させ、次いで3種のグラム陽性球菌に対するオプソニン活性について検査した。吸着細菌を血液寒天プレートの上で一夜増殖させ、プレートからかき取り、正常食塩水の中に懸濁し、そして0.5 mlのマクロフューズチューブの中でそのチューブの容量の1/5にまでペレット化した。
TCA 処理した及び全血調製品で免疫したウサギ由来の血清のオプソニン活性を決定した。ウサギを、S.エピダーミジス(Hay, ATCC55133)のTCA 処置した又は全血調製品のいづれかで免疫した。前述の通りに血清を回収し、そして好中球媒介型殺菌アッセイにおいて、S.エピダーミジスの3種の血清型株とワクチン株に対するオプソニン化活性について検査した。
ワクチン化ウサギ血清のオプソニン活性を、試験細菌としてS.アウレウス タイプ5を用いて再度決定した(図7)。S.アウレウスに対する全体的なオプソニン活性はS.エピダーミジスの株に対して認められた活性ほど高くなかったが、免疫動物由来の血清サンプルはワクチンしていないサンプルに比して有意な活性を供した。このデーターは、S.エピダーミジスに対するオプソニン抗体がS.アウレウスに対しても防御的であることを示唆し、更にこれらの抗体が1又は数種のスタフィロコッカス共通抗原に対して特異的でありうることを再び示唆する。
数多くの細菌、例えばS.エピダーミジスは正常なヒトにおける病原体ではない。しかしながら未熟な免疫系を有する幼児及び損傷した免疫系を有する個体においては、S.エピダーミジスは敗血症、そして死の原因となりうる。従って、任意の敗血症動物モデルにおいて、これらの原因を含ませることは重要である。未熟な免疫系を有する動物を利用し、そしてその動物を免疫抑制にかけることにより、敗血症ヒト患者について認められる状況が研究できることがわかっている。これらの研究にとって授乳ラットモデルが最も有効であることが実証されており、従って好適な動物モデルである。S.エピダーミジスを注射した正常な赤ん坊のラットは2時間以内に菌血症にかかり、そしてその直後に感染症をゆっくりと排除し始める。
授乳ラットにおけるS.エピダーミジス死に対するイントラリピッド効果をアッセイした。Wistarラットにイントラピリッド、免疫抑制剤を生後直ちに注射した。動物にイントラリピッドを生後2日目から投与した。2日間にわたり1日2回投与した。イントラリピッドの最後の投与と共に、動物に一定の特定のイムノグロブリン及び食塩水も付与した。この最後の投与の後、それらの動物にS.エピダーミジス(Hay, ATCC 55133)の調製品を皮下注射により感染せしめた。血液サンプルをプレート上に継代培養し、スタフィロコッカスにより菌血症が生じたかどうかを確認及び治療後の排除を追った。全ての動物を、生存性を調べるために5日間追跡した。
S.エピダーミジス(Hay, ATCC 55133)の致死感染症に対する防御を供するうえでの特定の高力価(特異的)イムノグロブリンの効果を授乳ラットモデルにおいて決定した。生後2日目のWistarラットに20%のイントラリピッドの腹腔膜内注射0.2 mlを2回付与した。翌日、動物に再び同一の一連の20%のイントラリピッドと、ワクチン済動物由来のイムノグロブリン又は血清の注射を施した。最後の注射の後、約5×107 の細胞のS.エピダーミジス(Hay, ATCC55133)を尾のねもとに皮下注射した。死を5日間にわたって調べた。
ELISA アッセイにおいてS.エピダーミジスの調製品に結合し、そして細胞媒介殺菌アッセイ(特異的イムノグロブリン)においてS.エピダーミジス生物をオプソニン化するイムノグロブリンを、授乳ラットモデルにおいてS.エピダーミジスの排除を助長するその能力について試験した。一定間隔で血液サンプルを感染動物から採取した(図8)。ELISA 又はオプソニンアッセイにおいて事前に同定された特異的なイムノグロブリンのみ処置にわたって経時的に細菌のレベルを下げ、そしてこれらの動物が表Vにおいて上昇生存率を示した。S.エピダーミジスの調製品をオプソニン化しない又はそれに結合しないイムノグロブリンは感染動物の血液からの細菌の排除を助長しなかった。
S.エピダーミジスに対する抗体を、授乳ラット排除アッセイにおいて、S.エピダーミジスの国際幾何学分類グループに対する防御性を供する能力について分析した(図9)。特異的なイムノグロブリンは米国株(ATCC 55133) 、プロトタイプ研究室株(ATCC31423 、莢膜血清型I)及び2種の日本株(莢膜血清型II及びIII )に対する生存率を高めた。
これまでの報告は、多数のS.エピダーミジス血清型があることを示唆する。更に、S.エピダーミジスの他に多数のコアギュラーゼ陰性スタフィロコッカスがある。広域反応性抗体が最も有効となるには、全ての病原性コアギュラーゼ陰性スタフィロコッカスを理想的にカバーするべきである。しかしながら、数多くのコアギュラーゼ陰性スタフィロコッカスはめったにヒトに感染症を及ぼすことはない。従って、広域反応性抗体が全ての病原性コアギュラーゼ陰性細菌に結合可能であるかどうかを知ることは重要であろう。
ELISA プレートの用意。S.エピダーミジス抽出抗原の100 λアリコートを96穴マイクロアッセイプレート(Nunclon (商標、Nunc,Demark) のウェルに加え、そしてこれらを4℃で一夜保存した。ウェル使用前にツイーン(0.5 mlのツイーン20/1lの脱イオン水)で緩やかに洗った。
抗−I、抗−II及び抗III と称したウサギ抗血清をFischer G. W. ら、J. Exper. Med. 148 : 776-786 (1978) の一般方法に従って作った。抗血清調製品を次に使用前にPBS-ツイーンの中で100 倍に希釈した。更に、系列希釈をPBS-ツイーンで同様に行った。このウサギ抗血清(抗−I、抗−II、抗−III )を更に、2種の異種株との吸着により調製して、これらの株のうちの一方に特異的でない一般のスタフィロコッカス抗体を除去した。
Claims (3)
- 広範囲反応性のオプソニン性ポリクローナル抗体の作製方法であって、
(a)スタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133から取得可能な抗原調製物で非ヒト哺乳動物を免疫する段階;
(b)該哺乳動物から血清を採取する段階;および
(c)ポリクローナル抗体を単離する段階、
を含み、
ここで、該抗体は第1の結合アッセイにおいて第1のスタフィロコーカス生物の調製物と反応し、第2の結合アッセイにおいて第2のスタフィロコーカス生物の調製物と反応し、かつ、第1のオプソニン化アッセイにおいて該第1のスタフィロコーカス生物と反応し、第2のオプソニン化アッセイにおいて該第2のスタフィロコーカス生物と反応し、そして、該第1もしくは第2のスタフィロコーカス生物はスタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133である、方法。 - 広範囲反応性のオプソニン性モノクローナル抗体の作製方法であって、
(a)スタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133から取得可能な抗原調製物で非ヒト哺乳動物を免疫する段階;
(b)抗体産生細胞を取得する段階;
(c)モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を形成するために該抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる段階;および
(d)モノクローナル抗体を単離する段階、
を含み、
ここで、該抗体は第1の結合アッセイにおいて第1のスタフィロコーカス生物の調製物と反応し、第2の結合アッセイにおいて第2のスタフィロコーカス生物の調製物と反応し、かつ、第1のオプソニン化アッセイにおいて該第1のスタフィロコーカス生物と反応し、第2のオプソニン化アッセイにおいて該第2のスタフィロコーカス生物と反応し、そして、該第1もしくは第2のスタフィロコーカス生物はスタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133である、方法。 - 広範囲反応性のオプソニン性モノクローナルもしくはポリクローナル免疫グロブリンの製造方法であって、
(a)スタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133と反応する免疫グロブリンを誘導することのできるスタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133由来の抗原調製物を取得する段階;
(b)免疫グロブリンの試料を該抗原調製物と接触させる段階;および
(c)免疫グロブリンを単離する段階、
を含み、
ここで、該免疫グロブリンは第1の結合アッセイにおいて第1のスタフィロコーカス生物の調製物と反応し、第2の結合アッセイにおいて第2のスタフィロコーカス生物の調製物と反応し、かつ、第1のオプソニン化アッセイにおいて該第1のスタフィロコーカス生物と反応し、第2のオプソニン化アッセイにおいて該第2のスタフィロコーカス生物と反応し、そして、該第1もしくは第2のスタフィロコーカス生物はスタフィロコーカスエピダーミジスHay株ATCC55133である、方法。
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