WO2011054997A2

WO2011054997A2 - Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína gapdh de candida famata

Info

Publication number: WO2011054997A2
Application number: PCT/ES2010/070718
Authority: WO
Inventors: Diana PISA GARCÍA; Luís CARRASCO LLAMAS; Leonor KREMER BARÓN
Original assignee: Universidad Autónoma De Madrid (Uam); Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2011-05-12
Also published as: ES2359203B9; WO2011054997A3; ES2359203B1; ES2359203A1

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con nº de acceso ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos de hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL QUE RECONOCE LA PROTEÍNA GAPDH DE

CANDIDA FAMATA

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con n° de acceso ECACC09042201 . Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos de hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El diagnóstico temprano de la candidiasis invasiva es extremadamente difícil ya que los síntomas no son específicos, lo que conduce a un retraso en la aplicación de una terapia adecuada (Laín et al., 2008. Clin. Dev. Immunol., 2008: art. ID 721950.). Esto ha impulsado el desarrollo de numerosas técnicas de diagnóstico, que pueden clasificarse como observación microscópica, métodos basados en cultivos microbiológicos y métodos independientes de cultivo (White et al., 2005. J. Clin. Microbiol., 43: 2181 -2187).

La observación microscópica puede aportar, en algunos casos, un diagnóstico tentativo, ya que la presencia de determinadas estructuras puede asociarse con ciertos géneros o especies. Sin embargo, aunque es una técnica rápida, pueden confundirse elementos fúngicos con componentes celulares del propio paciente, dando lugar a falsos positivos. Asimismo, presenta el inconveniente de que, en ocasiones, se requieren procedimientos invasivos que no pueden realizarse sin suponer un riesgo para el paciente (Stevens, 2002. J. Antimicrob. Chemother., 49 [suppl.SI]: 1 1 -19). Otras técnicas microbiológicas tradicionales son los cultivos sanguíneos, que producen frecuentemente falsos negativos (Yeo y Wong, 2002. Clin. Microbiol. Rev., 15: 465-484). Una vez que el organismo es aislado, la identificación puede tardar entre días y semanas, debido al lento crecimiento de los hongos. Debido a estos inconvenientes, se han desarrollado diferentes métodos independientes de cultivo, que se distinguen en función de que estén basados en identificación molecular, detección de componentes no antigénicos ó localización de anticuerpos y antígenos (Stevens, 2002. J. Antimicrob. Chemother., 49 [suppl.SI]: 1 1 -19). Para aumentar la velocidad, sensibilidad y especificidad del diagnóstico, están siendo utilizados métodos moleculares basados en la PCR que permiten la detección y amplificación del DNA fúngico presente en las muestras (Weig y Brown, 2007. Trends Microbiol., 15: 310- 317). Sin embargo, su alta sensibilidad puede plantear problemas al obtener falsos positivos asociados con la contaminación de la muestra. Para la detección de componentes no antigénicos en la sangre se han descrito como marcadores de infección el D-arabinitol y el p-1 ,3-D-glucano. El D-arabinitol es un metabolito producido por ciertas especies de Candida, no encontrándose hasta el momento C. famata entre ellas. Por su parte el p-1 ,3-D-glucano es un constituyente de la pared celular de levaduras y hongos filamentosos. Sin embargo, ambos métodos pueden generar falsos positivos. En el caso del D- arabinitol en pacientes con insuficiencia renal y en el de p-1 ,3-D-glucano en individuos sometidos a hemodiálisis o a determinados tratamientos terapéuticos (Gadea et al., 2007. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 25: 336-340). Por otra parte, la detección de anticuerpos en pacientes con candidiasis suele tener utilidad limitada, ya que no distingue entre colonización e infección (Gadea et al., 2007. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 25: 336-340) y suele tener resultados negativos cuando la sangre es recogida en las primeras fases de la infección, antes de la activación de la respuesta humoral. Además, los individuos inmunodeprimidos no generan cantidades detectables de anticuerpos, incluso cuando presentan candidiasis sistémicas (Shoham y Levitz, 2005. Br J Haematol., 129: 569-582). Por este motivo se han intentado desarrollar inmunoensayos para detectar antígenos de C. albicans en el suero de individuos infectados (Laín et al., 2008. Clin. Dev. Immunol., 2008: art. ID 721950.). Sin embargo, ninguno de ellos ha resultado suficientemente predictivo como para recomendarlo en una rutina de laboratorio clínico.

Otra de las patologías que podrían estar causadas por alguna especie de Candida, como por ejemplo Candida famata, es el AZOOR (Acute Zonal Occult Outer Retionopathy). Este término ha sido propuesto recientemente para describir un grupo heterogéneo de retinopatías de etiología desconocida, cada una de las cuales tiene su propia identidad clínica, pudiendo coincidir en el mismo paciente o ser formas transicionales de una misma enfermedad. Este síndrome se caracteriza por la pérdida aguda en una o más zonas de la función retinal externa, fotopsias en algunos casos, cambios mínimos en el fondo de ojo, que suelen implicar el estrechamiento de los vasos sanguíneos y palidez o incluso color blanquecino alrededor de la papila. Carrasco et al (Carrasco et al., 2005. J. Clin. Microbiol., 43: 635-640) abren la posibilidad a que Candida famata pueda ser la causa de AZOOR.

Por tanto, sería muy útil el desarrollo de un método que fuese capaz de detectar y/o cuantificar microorganismos causantes de candidiasis u otras patologías causadas por infección por candidas patógenas, como por ejemplo AZOOR, con alta sensibilidad, fiabilidad y rapidez.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con n° ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos del hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo, así como al uso de los anticuerpos monoclonales de la presente invención con fines terapéuticos o para diagnóstico por imagen de candidiasis.

La selección del hibridoma de la presente invención, capaz de producir los anticuerpos que reconocen la proteína GAPDH, no es obvia a tenor de los resultados que se han obtenido y que se muestran en el apartado de ejemplos de la presente invención. El hibridoma depositado con n° ECACC09042201 produce una señal destacada en la detección de anticuerpos en comparación con el resto de hibridomas ensayados, lo que supone un efecto sorprendente y demuestra que la selección no es obvia. Otro efecto sorprendente se refiere a la especificidad de dicho anticuerpo para la especie de Candida famata de entre diversas especies ensayadas del género Candida. La detección específica del antígeno en extractos proteicos derivados de cultivos celulares se muestra efectiva tanto en condiciones desnaturalizantes como en condiciones no desnaturalizantes.

El hibridoma obtenido se depositó en la European Collection of Cell Cultures (ECACC), con fecha 22 de Abril de 2009 y con la referencia de depósito 09042201 . La dirección de la Autoridad Internacional de Depósito ECACC es: Health Protection Agency / Centre for Emergency Preparedness and Response Portón Down / Salisbury / SP4 0JG / UK. Un aspecto de la presente invención se refiere a una célula del hibridoma depositado con n° 09042201 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC). En adelante puede emplearse el término "hibridoma ECACC09042201 " para hacer referencia a una o más células de dicho hibridoma depositado. Un hibridoma es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito productor del anticuerpo específico de interés, con una línea celular de mieloma. Los hibridomas obtenidos después de fusionar células del bazo de ratones BALB/c, inmunizados con proteínas extracelulares producidas por Candida famata, con células de mieloma (X63.Ag.653 NP3), se han ensayado mediante ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y se ha seleccionado el hibridoma ECACC09042201 que produce una señal destacada en la detección de anticuerpos contra alguna de las proteínas del extracto, de forma sorprendente, en comparación con el resto de hibridomas ensayados.

El hibridoma de la presente invención tiene las siguientes características: Breve descripción: Hibridoma murino anti-proteína de Candida famata.

Cultivo celular de ratón BALB/c.

Inmunógeno: Proteínas extraídas de Candida famata.

Inmunocito donante: Ratón hembra BALB/c inmunizada.

Célula inmortal para su fusión con el inmunocito donante: Línea celular X63- Ag8.653.

Producto específico (antígeno): Proteína de 35 KDa aprox.

Tipo de Inmunoglobulina: lgG1 .

Ensayo de screening: ELISA, Western blot, inmunofluorescencia. Condiciones de depósito:

Concentración celular de 5 x 10⁶ / 0,5 mi.

Composición del medio de cultivo: 90% fetal calf serum + 10% DMSO. Información adicional:

Nombre de la línea celular: CF3.

Morfología: células redondas.

N° de pases: 50 aprox.

Condiciones de cultivo:

Medio de crecimiento: DMEM.

Porcentaje de suero y tipo: 15% fetal calf serum.

Suplementos: 1 mM Na piruvato, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES

(penicilina/estreptomicina si es necesario).

Temperatura: 37°C. Fase gaseosa: 5% de CO2 en el aire.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus alotipos o fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con n° de acceso 09042201 , que reconoce la proteína de Candida famata SEQ ID NO: 1 , o cualquiera de sus variantes. Un alotipo es el anticuerpo resultante de pequeñas diferencias en la secuencia de aminoácidos en la región constante de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos originales. Mediante los datos divulgados en la presente invención se podrían obtener anticuerpos con la misma especificidad que los lgG1 pero con pequeños cambios en la secuencia que codifica para la cadena pesada, es decir, lgG2, 3 y 4.

Los anticuerpos monoclonales son una población idéntica de moléculas de anticuerpos, producidos por el mismo clon de linfocitos B, por lo que todos presentan la misma especificidad, reconociendo el mismo epítopo.

La secuencia SEQ I D NO: 1 corresponde a la secuencia aminoacídica de la proteína GAPH (Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) de Candida famata (microorganismo también conocido como Debaryomyces hansenii).

El anticuerpo de la presente invención reconoce cualquier variante de la secuencia SEQ ID NO: 1 , o de cualquiera de sus fragmentos (siempre que contengan la secuencia aminoacídica reconocida de forma específica por dicho anticuerpo). Tal como se emplea en la presente invención, el término "variante" se refiere a una secuencia aminoacídica sustancialmente homologa a la secuencia SEQ ID NO: 1 . En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postraduccionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación. Cualquiera de las modificaciones descritas se produce en una posición aminoacídica que no afecta al reconocimiento de dicha proteína por medio del anticuerpo de la presente invención. Una secuencia aminoacídica es "sustancialmente homologa" cuando tiene una identidad respecto a SEQ ID NO: 1 o respecto de cualquiera de sus fragmentos de, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99%, y además, conservando la actividad biológica de dicha secuencia aminoacídica o de cualquiera de sus fragmentos, o son funcionalmente equivalentes. El término "funcionalmente equivalente", tal como se emplea en la presente invención, se refiere a que secuencia aminoacídica o cualquiera de sus fragmentos mantiene esencialmente sus propiedades biológicas. Cualquier secuencia sustancialmente homologa a SEQ ID NO: 1 puede ser identificada por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

Una realización preferida se refiere al anticuerpo monoclonal, que reconoce una secuencia aminoacídica de dicha proteína de Candida famata que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.

Tal como puede verse en los ejemplos de la presente invención, en la FIG. 2 se muestra la detección de antígenos mediante la adición del anticuerpo de la invención a extractos solubles (de proteínas) de Candida famata, C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa. Los antígenos corresponden a una proteína de unos 35 KDa que se detecta en los extractos de Candida famata, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa, pero no en especies más cercanas filogenéticamente como Candida albicans, C. parapsilosis o C. glabrata. En base a estos resultados, tras alinear las secuencias de Candida albicans (SEQ ID NO: 1 1 ; N° de acceso XP_719909.12) y Candida glabrata (SEQ ID NO: 12; GAPDH2 de Candida glabrata, N° de acceso Q6FSM4.1 y SEQ ID NO: 13; GAPDH1 de Candida glabrata, N° de acceso Q6FPW3.1 ) con la secuencia SEQ ID NO: 1 mediante ClustalW (programa de alineamiento múltiple EMBL- EBI; http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, con clustering NJ), se seleccionaron aquellos fragmentos con cambios sustanciales en algunos de los aminoácidos. La lista de secuencias SEQ ID NO: 2 a 10 corresponde a fragmentos de la secuencia SEQ ID NO: 1 que han sido seleccionados en base a dichas diferencias.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser sintetizados mediante tecnología recombinante de ADN. Para ello, es necesario disponer de la secuencia nucleotídica que codifica para cualquier anticuerpo de la presente invención y determinar el fragmento o fragmentos de interés para ser amplificado/s mediante PCR. Tras dicha amplificación puede llevarse a cabo su clonación junto a otras secuencias nucleotídicas o por sí sola, en un vector capaz de replicarse y obtener anticuerpos funcionales recombinantes. De esta manera pueden obtenerse anticuerpos sin necesidad de inmunizar a un animal. La obtención de dichos anticuerpos recombinantes se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica de clonación, aislamiento y/o purificación conocida en el estado de la técnica.

En adelante, para hacer referencia a cualquier anticuerpo monoclonal descrito en los párrafos anteriores, se empleará el término "anticuerpo de la invención" o "anticuerpo de la presente invención".

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un antisuero aislado que comprende el anticuerpo de la invención. El antisuero de la invención es el suero de cualquier animal que contiene el anticuerpo de la invención. Preferiblemente el animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.

Un aspecto más de presente invención se refiere a un epítopo de la secuencia aminoacídica de Candida famata SEQ ID NO: 1 , reconocido por el anticuerpo monoclonal de la invención. El epítopo es el determinante antigénico que produce una reacción específica con un anticuerpo. Dicho epítopo puede constar de una secuencia de aminoácidos sobre la superficie del antígeno; de una disposición o estructura terciaria concreta; o de una modificación postraduccional.

Una realización preferida de la presente invención se refiere al epítopo de la secuencia aminoacídica que codifica para la proteína GAPDH de Candida famata, SEQ ID NO: 1 , que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.

En adelante, para hacer referencia a cualquier epítopo descrito en los párrafos anteriores, se empleará el término "epítopo de la invención" o "epítopo de la presente invención".

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la detección y/o cuantificación de Candida famata que comprende:

a. obtener el extracto soluble de una muestra biológica aislada, b. añadir el anticuerpo de la invención al extracto celular del apartado (a) y

c. detectar y/o cuantificar el anticuerpo monoclonal añadido en el apartado (b) que esté unido al epítopo de la invención.

La obtención del extracto soluble se lleva a cabo mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. Dicho extracto soluble contiene las proteínas totales de la muestra biológica aislada. El término "muestra biológica aislada" se refiere a una muestra aislada que puede proceder de un fluido fisiológico como sangre, plasma, suero u orina y/o cualquier tejido celular procedente de un organismo. Preferiblemente el organismo es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.

En el apartado (b) del método, se puede llevar a cabo la inmovilización de las proteínas contenidas en el extracto celular o la inmovilización del anticuerpo de la invención en un soporte sólido mediante diferentes procesos de unión. Se entiende por soporte sólido una gran variedad de materiales, como por ejemplo, pero sin limitarse, la resina de intercambio iónico o adsorción, el vidrio, plástico, látex, nylon, gel, esteres de celulosa, esferas paramagnéticas o cualquiera de sus combinaciones. Las proteínas pueden someterse a un proceso de separación en el soporte en el que son inmovilizadas.

El anticuerpo de la invención puede marcarse con un marcador seleccionado de la lista que comprende, pero sin limitarse, radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Asimismo, el anticuerpo de la invención que esté unido al antígeno (proteína GAPDH) se puede detectar de forma indirecta mediante la adición de anticuerpos anti-ratón marcados con alguno de los marcadores de la lista anterior. Los anticuerpos que no se hayan unido al antígeno serán eliminados mediante al menos un lavado. La detección puede llevarse a cabo mediante la adición de un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente, específico para el marcador. Preferiblemente el marcador es peroxidasa y el sustrato es cromogénico como por ejemplo, pero sin limitarse, tetrametilbencidina (TMB), ácido azino-bis(3-etilbenzotiazolina 6-sulfónico) o fenilendiamina. Por tanto, la detección del anticuerpo monoclonal (detección indirecta del antígeno al que se une) se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, ELISA o radioinmunoensayo. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata que comprende:

a. determinar, según el método anterior, una primera concentración de Candida famata en una muestra biológica aislada de un individuo, b. determinar, según el método anterior, una segunda concentración de Candida famata en otra muestra biológica del individuo del apartado (a), y

c. comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración obtenida en el apartado (a) para determinar si hay o no alguna diferencia significativa.

La candidiasis es una infección producida por una o más especies de levaduras del género Candida. La candidiasis puede ser, pero sin limitarse, candidiasis crónica, candidiasis diseminada (sistémica) o candidiasis crónica muco- cutánea. En la presente invención, el término "candidiasis producida por Candida famata" hace referencia a cualquier tipo de candidiasis en la que intervenga el microorganismo Candida famata sólo o en combinación con otros microorganismos. Preferiblemente dichos microorganismos que pueden causar candidiasis en combinación con Candida famata son del género Candida.

En los ejemplos de la presente invención puede observarse que, tras el análisis de sueros de personas infectadas con Candida famata, se observó que el antígeno (GAPDH) puede detectarse en el suero mediante análisis en slot blot, así como que la cantidad de esta proteína varía o fluctúa a lo largo del tiempo en un paciente infectado en el que se han analizado sueros obtenidos a lo largo de varios años, es decir, dicho método es válido para la monitorización de un tratamiento de candidiasis o simplemente para observar la evolución de la enfermedad en relación a la cantidad de proteína GAPDH producida por Candida famata, medida indirecta de su presencia y/o actividad.

La determinación de la concentración de Candida famata se lleva a cabo mediante el método para su detección y/o cuantificación descrito en párrafos anteriores. La comparación de las concentraciones determinadas permite establecer si hay o no hay alguna diferencia significativa. El término "diferencia significativa" tal como se emplea en la presente invención hace referencia a que la diferencia observada no es el resultado del azar. Para determinar la influencia del azar en cada uno de los resultados obtenidos así como la determinación de alguna diferencia significativa, se puede aplicar cualquier técnica de estadística conocida en el estado de la técnica. Por ejemplo, pero sin limitarse, puede llevarse a cabo la repetición de las determinaciones al menos un n° de veces que permita, por ejemplo, pero sin limitarse, establecer una desviación típica respecto del valor promedio. Dicha diferencia significativa puede ser positiva o negativa. La diferencia significativa es positiva cuando el valor de la concentración de la primera determinación es mayor que el valor de la segunda concentración. Por el contrario, la diferencia significativa es negativa cuando el valor de la concentración de la primera determinación es menor que el valor de la segunda concentración.

La diferencia significativa depende de la técnica de detección que se emplee, en cualquier caso, puede emplearse una técnica semi-cuantitativa mediante la cual la determinación de la concentración se lleva a cabo por medio de la determinación de la intensidad de la banda detectada en la primera o segunda determinación de la concentración de C. famata. Si la diferencia significativa es negativa, se interpreta como que la candidiasis está remitiendo y si es positiva, la candidiasis está empeorando. Asimismo, los resultados obtenidos en cada una de las tomas de muestras se pueden comparar con los valores obtenidos para un control negativo y/o positivo.

La determinación de la evolución de dicha candidiasis comprende una serie de pasos que comienzan por la toma de muestras seriales. Se entiende por toma de muestras seriales a la extracción de las muestras biológicas mencionadas en la presente invención a diferentes tiempos en el mismo paciente.

La presente invención también se refiere a un método para la monitorización de un tratamiento de candidiasis producida por Candida famata que comprende las mismas etapas que el método descrito para la determinación de la evolución de candididiasis producida por Candida famata. En este caso, los pacientes han sido tratados para disminuir la infección con un agente determinado.

Una realización preferida se refiere al método para la detección y/o cuantificación de Candida famata o al método para la determinación de la evolución de un tratamiento de candidiasis producida por Candida famata, donde la muestra biológica aislada es un fluido biológico. El fluido biológico puede ser, pero sin limitarse, sangre, plasma, suero sanguíneo, orina, humor acuoso, humor vitreo o líquido cefalorraquídeo. Según una realización más preferida, el fluido biológico es suero sanguíneo.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la célula del hibridoma depositado con n° de acceso ECACC09042201 para la producción del anticuerpo monoclonal de la invención.

Un aspecto más de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo monoclonal de la invención para la detección de Candida famata.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo de la invención para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata.

En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la invención se usa para detectar, cuantificar, aislar o purificar el antígeno que reconoce dicho anticuerpo. El antígeno detectado, aislado o purificado es cualquier antígeno que sea reconocido por el anticuerpo monoclonal de la presente invención. El antígeno puede provenir de cualquier organismo. Preferiblemente el antígeno proviene de un microorganismo. Más preferiblemente el microorganismo se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Candida famata, Saccharomyces cerevisiae o Rhodotorula mucilaginosa. Preferiblemente el antígeno reconocido es la proteína GAPDH, cualquier variante de la misma o cualquiera de sus fragmentos. Un aspecto más de la presente invención se refiere al uso del epítopo de la invención para la generación de cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal. Preferiblemente el anticuerpo es monoclonal. El epítopo de la invención debe estar aislado. Dicho epítopo puede ser introducido, preferiblemente por inyección intravenosa o intramuscular, en el cuerpo de un animal, preferiblemente mamífero, provocando con ello una respuesta inmune específica mediante la cual se generan anticuerpos específicos. De esta manera puede obtenerse un antisuero que contiene un anticuerpo capaz de reconocer al epítopo de la invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención. Una realización preferida de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica, donde el anticuerpo monoclonal está conjugado a un agente antibiótico, donde dicho agente es antifúngico. Para que el anticuerpo pueda formar parte de una composición farmacéutica que vaya a ser aplicada al tratamiento de candidiasis en humanos, se deben generar previamente los anticuerpos monoclonales de la invención quiméricos o humanizados mediante ingeniería genética, evitando así el rechazo del sistema inmune al ser introducidos en el organismo. De esta manera se generan anticuerpos quiméricos o humanizados que incorporan parte animal (por ejemplo, de ratón) y parte humana. La parte correspondiente al ratón, es indispensable para que el anticuerpo reconozca el antígeno de Candida famata en el cuerpo y la parte humana es responsable de que el sistema inmunológico humano no lo rechace.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el epítopo de la invención. Dicho epítopo es la secuencia aminoacídica reconocida por el anticuerpo de la invención, aislada. Después de dicho aislamiento, su secuencia nucleotídica puede clonarse junto a otras secuencias nucleotídicas para formar parte de una secuencia recombinante. Una realización preferida de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica según cualquiera de los aspectos anteriores que además incluye excipientes farmacéuticamente aceptables. Una realización más preferida se refiere a la composición farmacéutica que además incluye otra sustancia activa.

Varios aspectos de la presente invención se refieren al anticuerpo o epítopo de la invención para su uso como medicamento.

Un aspecto más de la presente invención se refiere al anticuerpo de la invención para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por Candida famata.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende el epítopo de la invención para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por Candida famata.

Un aspecto más de la presente invención es un kit que comprende la célula del hibridoma depositado con n° de acceso ECACC09042201 . Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit que comprende la célula del hibridoma depositado con n° de acceso ECACC09042201 para la producción del anticuerpo de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende el anticuerpo de la invención. Según otro aspecto de la invención, el kit que comprende el anticuerpo de la invención se usa para la detección de Candida famata.

Un aspecto más de la presente invención se refiere al uso del kit que comprende el anticuerpo de la invención para la determinación de la evolución de un tratamiento de candidiasis producida por Candida famata. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende el epítopo de la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del kit que comprende el epítopo de la invención para la generación de cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere al kit que comprende la célula del hibridoma depositado con n° de acceso ECACC09042201 , el anticuerpo monoclonal de la invención, el epítopo de la invención, o cualquiera de sus combinaciones.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra el gráfico de barras de los datos obtenidos mediante ELISA.

El eje de ordenadas representa los valores de densidad óptica de un ensayo de ELISA de captura de anticuerpos por el antígeno que en este caso son proteínas solubles secretadas por Candida famata. En abcisas se indican los cinco hibridomas generados. Se ensayaron los sobrenadantes (extracto soluble) de diversos hibridomas frente a proteínas fijadas de C. famata (CFA) y frente a BSA. A partir de estos resultados se seleccionó el hibridoma denominado como CF3 (los anticuerpos monoclonales generados por este hibridoma, también se llaman CF3, que muestran una señal de reconocimiento más alta que el resto de hibridomas en este ensayo). Figura 2. Muestra el reconocimiento de proteínas de levadura por el anticuerpo CF3 mediante ensayo western blot con proteínas extraídas de diferentes especies de levaduras: C. famata (CFA), C. albicans (ALB), C. parapsilosis (PAR), C. glabrata (GLA), Saccharomyces cerevisiae (SAC) y Rhodotorula mucilaginosa (ROD).

Las proteínas obtenidas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Esta membrana se incubó con el anticuerpo CF3 y se utilizó como secundario un anticuerpo anti-ratón unido a peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos. El anticuerpo CF3 reconoce una proteína de unos 35 kDa de C. famata, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa.

Figura 3. Muestra un ensayo de slot-blot utilizando proteínas extraídas de diferentes especies de levaduras: C. famata (CFA), C. albicans (ALB), C. parapsilosis (PAR), C. glabrata (GLA), Saccharomyces cerevisiae (SAC) y Rhodotorula mucilaginosa (ROD).

Las proteínas obtenidas se fijaron a una membrana de nitrocelulosa mediante vacío con un aparato de slot-blot. Esta membrana se incubó con el anticuerpo CF3 y se utilizó como secundario un anticuerpo anti-ratón unido a peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos. El anticCF3 reacciona principalmente con proteínas extraídas de C. famata, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa.

Figura 4. Muestra un ensayo de slot-blot en el que se fijaron a una membrana de nitrocelulosa muestras serológicas de diferentes sujetos a diferentes diluciones. Dicha membrana se incubó con el anticuerpo CF3 y se utilizó como secundario un anticuerpo anti-ratón unido a peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos. Existen diferentes cantidades de GAPDH de C. famata que reaccionan con el anticuerpo en los diferentes sujetos.

Figura 5. Muestra un ensayo de slot-blot en el que se fijaron a una membrana de nitrocelulosa diferentes diluciones de muestras serológicas de un mismo sujeto obtenidas en diferentes fechas.

Se incubó con el anticuerpo CF3 y se utilizó como anticuerpo secundario un anti-ratón unido a peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos. Se muestra que existen diferentes cantidades de proteína GAPDH que reacciona con el anticuerpo a lo largo del tiempo en un mismo sujeto.

Figura 6. Muestra el alineamiento de secuencias aminoacídicas de la proteína GAPDH de tres especies de levadura pertenecientes al género Candida.

Las secuencias que se han utilizado en dicho alineamiento son las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 (candida) perteneciente a Candida famata (microorganismo también conocido como Debaryomyces hansenii), SEQ ID NO: 1 1 (albicans) perteneciente a Candida albicans con n° de acceso XP_719909.1 , SEQ ID NO: 12 (glabratal ) perteneciente a Candida glabrata con n° de acceso Q6FSM4.1 y SEQ ID NO: 13 (glabrata2) perteneciente a Candida glabrata con n° de acceso Q6FPW3.1 .

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos no pretenden limitar el campo de aplicación de la misma. EJEMPLO 1. Obtención del anticuerpo monoclonal de la invención, CF3.

De forma general, para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen células B del bazo de un animal que ha sido expuesto al antígeno. Estas células B son fusionadas con células tumorales de mieloma múltiple (un tipo de cáncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Estas células fusionadas híbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rápida e indefinidamente, puesto que son células tumorales después de todo y pueden producir gran cantidad de anticuerpos. Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un número diferente de determinadas colonias, las cuales producen sólo un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de unirse a un antígeno determinado, por ejemplo con el tipo de test llamado ELISA, y para seleccionarse y aislarse de la manera más efectiva.

En la presente invención se inmunizaron ratones de la cepa BALB/c con extractos proteicos solubles de Candida famata obtenidos de la siguiente forma: la levadura C. famata se creció hasta una densidad óptica a 600 nm de 0.8. Las levaduras se centrifugaron y el medio de cultivo se liofilizó para concentrar las proteínas segregadas al medio. El liofilizado se resuspendió en PBS y se dializó frente a PBS. Después de centrifugar, este extracto proteico se dividió en alícuotas y se utilizó para inmunizar ratones, utilizando protocolos estándar de inmunización y de fusión celular (Kremer y Márquez. 2003. Methods and Protocols. Ed.: D'Ambrosio D. y Sinigaglia, F. Humana Press, Pps. 243-260).

Tras la fusión, la selección de hibridomas se realizó por ensayos de inmuno- absorción enzimática (ELISA). Como antígeno inmovilizado sobre la fase sólida se emplearon proteínas solubles de C. famata. En estos ensayos se utilizó el antígeno referido como tapiz específico y la proteína albúmina de suero bovino (BSA) como control negativo. Como método de detección se añadió un anticuerpo anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado a peroxidasa seguido del sustrato de la reacción colorimétrica (detección cromogénica). De esta forma, se seleccionaron los hibridomas secretores de anticuerpos más específicos para el antígeno. La especificidad de todos los hibridomas fue evaluada mediante ensayos de ELISA (FIG. 1 ), Western blot (FIG. 2) y slot blot (FIG. 3) frente a extractos proteicos de otras levaduras. Como resultado de los análisis realizados se seleccionaron los mejores hibridomas entre los que destacó el hibridoma CF3 (FIG. 1 ), depositado en la colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal Cell Culture- el 22 de abril de 2009 con el n° de acceso 09042201 , que expresa establemente inmunoglobulinas del isotipo lgG1 , correspondientes al anticuerpo monoclonal (mAb) anti-GAPDH de C. famata CF3.

La proteína detectada en los ensayos de Western blot fue inmunoprecipitada y analizada por MALDI-TOF, consiguiendo secuenciar 3 péptidos que correspondieron a la proteína GAPDH de la levadura Debaryomyces hansenii (Candida famata) con n° de acceso Q6BMK0.1 .

Mediante los ensayos de slot blot (no desnaturaliza la proteína), el anticuerpo CF3 es capaz de detectar la presencia de GAPDH en el suero de personas infectadas con C. famata. De esta manera se está demostrando que tanto en condiciones desnaturalizantes para la proteína detectada ( Western blot) como en condiciones no desnaturalizantes, se detecta el mismo antígeno con la sensibilidad similar, por tanto, todo parece indicar que el epítopo reconocido por el anticuerpo de la invención reconoce una secuencia de aminoácidos concreta en lugar de una determinada conformación o estructura de dicha proteína.

El anticuerpo CF3 no detecta la proteína GAPDH de C. famata en sueros de personas que no padecen infección por este microorganismo (FIG. 4). Puesto que este anticuerpo no reconoce la GAPDH de otras especies del género Candida, puede servir como diagnóstico diferencial de infecciones de C. famata.

Mediante la detección del anticuerpo de la invención CF3 se detecta la fluctuación de GAPDH en sueros de un paciente infectado con C. famata tomados a lo largo de varios años (FIG. 5), es decir, desde el 24/04/06 hasta el 07/04/08. Por lo tanto, el CF3 puede servir para seguir la evolución de la infección de C. famata y para detectar la eficacia de los tratamientos antifúngicos contra esta levadura, es decir, para monitorizar dicho tratamiento.

Para la determinación de los epítopos más probables se alinearon diversas secuencias aminoacídicas de la proteína GAPDH de los microorganismos Candida famata, Candida albicans y Candida glabrata. Las secuencias que se han utilizado en dicho alineamiento son las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 (candida) perteneciente a Candida famata (microorganismo también conocido como Debaryomyces hansenii), SEQ ID NO: 1 1 (albicans) perteneciente a Candida albicans con n° de acceso XP_719909.1 , SEQ ID NO: 12 (glabratal ) perteneciente a Candida glabrata con n° de acceso Q6FSM4.1 y SEQ ID NO: 13 (glabrata2) perteneciente a Candida glabrata con n° de acceso Q6FPW3.1 .

Se han seleccionado aquellas secuencias con diferencias significativas entre la secuencia de Candida famata SEQ ID NO: 1 y el resto de secuencias SEQ ID NO: 11 -13.

Claims

REIVINDICACIONES

Célula del hibridoma depositado con n° ECACC09042201 .

Anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido de la célula del hibridoma según la reivindicación 1 , que reconoce la proteína de Candida famata SEQ ID NO: 1 , o cualquiera de sus variantes.

Anticuerpo según la reivindicación 2, que reconoce una secuencia aminoacídica de dicha proteína de Candida famata que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.

Antisuero aislado que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

Epítopo de la secuencia aminoacídica de Candida famata SEQ ID NO: 1 , reconocido por el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.

Epítopo según la reivindicación 5 que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.

Método para la detección y/o cuantificación de Candida famata que comprende:

a. obtener el extracto soluble de una muestra biológica aislada, b. añadir el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, al extracto soluble del apartado (a) y c. detectar y/o cuantificar el anticuerpo monoclonal añadido en el apartado (b) que esté unido al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.

8. Método para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata que comprende:

a. Determinar, según el método de la reivindicación 7, una primera concentración de Candida famata en una muestra biológica aislada de un individuo,

b. determinar una segunda concentración de Candida famata en otra muestra biológica del individuo del apartado (a), y

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde la muestra biológica aislada es un fluido biológico. 10. Método según la reivindicación 9, donde el fluido biológico es suero sanguíneo.

1 1 . Uso del hibridoma según la reivindicación 1 para la producción del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

12. Uso del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la detección de Candida famata.

13. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata.

14. Uso del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para detectar, cuantificar, aislar o purificar el antígeno que reconoce dicho anticuerpo.

15. Uso del epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 para la generación de cualquier anticuerpo.

16. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, donde el anticuerpo monoclonal está conjugado a un agente antifúngico.

18. Composición farmacéutica que comprende el epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.

19. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 que además incluye excipientes farmacéuticamente aceptables.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19 que además incluye otra sustancia activa.

21 .Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para su uso como medicamento.

22. Epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 para su uso como medicamento.

23. Uso del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por Candida famata.

24. Uso del epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por Candida famata.

25. Kit que comprende la célula del hibridoma según la reivindicación 1.

26. Uso del kit según la reivindicación 25 para la producción del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

27. Kit que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

28. Uso del kit según la reivindicación 27 para la detección de Candida famata.

29. Uso del kit según la reivindicación 27 para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata.

30. Kit que comprende el epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.

31 . Uso del kit según la reivindicación 30 para la generación de cualquier anticuerpo.

32. Kit que comprende la célula del hibridoma según la reivindicación 1 , el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, el epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, o cualquiera de sus combinaciones.