ES2359203A1 - Anticuerpo monclonal que reconoce la proteína gapdh de candida famata. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína GAPDH de Candida famata.La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con nº de acceso ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Gandida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos de hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo.
Description
Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína
GAPDH de Candida famata.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma
depositado con nº de acceso ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz
de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo,
la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la
proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho
anticuerpo monoclonal, a los usos de hibridoma, anticuerpo o
epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención
se refiere a un método para la detección de Candida famata o
para la determinación de la evolución de candidiasis producida por
dicho microorganismo.
El diagnóstico temprano de la candidiasis
invasiva es extremadamente difícil ya que los síntomas no son
específicos, lo que conduce a un retraso en la aplicación de una
terapia adecuada (Laín et al., 2008. Clin. Dev. Immunol.,
2008: art. ID 721950.). Esto ha impulsado el desarrollo de numerosas
técnicas de diagnóstico, que pueden clasificarse como observación
microscópica, métodos basados en cultivos microbiológicos y métodos
independientes de cultivo (White et al., 2005. J. Clin.
Microbiol., 43: 2181-2187).
La observación microscópica puede aportar, en
algunos casos, un diagnóstico tentativo, ya que la presencia de
determinadas estructuras puede asociarse con ciertos géneros o
especies. Sin embargo, aunque es una técnica rápida, pueden
confundirse elementos fúngicos con componentes celulares del propio
paciente, dando lugar a falsos positivos. Asimismo, presenta el
inconveniente de que, en ocasiones, se requieren procedimientos
invasivos que no pueden realizarse sin suponer un riesgo para el
paciente (Stevens, 2002. J. Antimicrob. Chemother., 49 [suppl.S1]:
11-19).
Otras técnicas microbiológicas tradicionales son
los cultivos sanguíneos, que producen frecuentemente falsos
negativos (Yeo y Wong, 2002. Clin. Microbiol. Rev., 15:
465-484). Una vez que el organismo es aislado, la
identificación puede tardar entre días y semanas, debido al lento
crecimiento de los hongos. Debido a estos inconvenientes, se han
desarrollado diferentes métodos independientes de cultivo, que se
distinguen en función de que estén basados en identificación
molecular, detección de componentes no antigénicos ó localización de
anticuerpos y antígenos (Stevens, 2002. J. Antimicrob. Chemother.,
49 [suppl.S1]: 11-19). Para aumentar la velocidad,
sensibilidad y especificidad del diagnóstico, están siendo
utilizados métodos moleculares basados en la PCR que permiten la
detección y amplificación del DNA fúngico presente en las muestras
(Weig y Brown, 2007. Trends Microbiol., 15:
310-317). Sin embargo, su alta sensibilidad puede
plantear problemas al obtener falsos positivos asociados con la
contaminación de la muestra. Para la detección de componentes no
antigénicos en la sangre se han descrito como marcadores de
infección el D-arabinitol y el
\beta-1,3-D-glucano.
El D-arabinitol es un metabolito producido por
ciertas especies de Candida, no encontrándose hasta el momento C.
famata entre ellas. Por su parte el
\beta-1,3-D-glucano
es un constituyente de la pared celular de levaduras y hongos
filamentosos. Sin embargo, ambos métodos pueden generar falsos
positivos. En el caso del D-arabinitol en pacientes
con insuficiencia renal y en el de
\beta-1,3-D-glucano
en individuos sometidos a hemodiálisis o a determinados tratamientos
terapéuticos (Gadea et al., 2007. Enferm. Infecc. Microbiol.
Clin., 25: 336-340).
Por otra parte, la detección de anticuerpos en
pacientes con candidiasis suele tener utilidad limitada, ya que no
distingue entre colonización e infección (Gadea et al., 2007.
Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 25: 336-340) y
suele tener resultados negativos cuando la sangre es recogida en las
primeras fases de la infección, antes de la activación de la
respuesta humoral. Además, los individuos inmunodeprimidos no
generan cantidades detectables de anticuerpos, incluso cuando
presentan candidiasis sistémicas (Shoham y Levitz, 2005. Br J
Haematol., 129: 569-582). Por este motivo se han
intentado desarrollar inmunoensayos para detectar antígenos de C.
albicans en el suero de individuos infectados (Laín et
al., 2008. Clin. Dev. Immunol., 2008: art. ID 721950.). Sin
embargo, ninguno de ellos ha resultado suficientemente predictivo
como para recomendarlo en una rutina de laboratorio clínico.
Otra de las patologías que podrían estar
causadas por alguna especie de Candida, como por ejemplo Candida
famata, es el AZOOR (Acute Zonal Occult Outer
Retionopathy). Este término ha sido propuesto recientemente para
describir un grupo heterogéneo de retinopatías de etiología
desconocida, cada una de las cuales tiene su propia identidad
clínica, pudiendo coincidir en el mismo paciente o ser formas
transicionales de una misma enfermedad. Este síndrome se caracteriza
por la pérdida aguda en una o más zonas de la función retinal
externa, fotopsias en algunos casos, cambios mínimos en el fondo de
ojo, que suelen implicar el estrechamiento de los vasos sanguíneos y
palidez o incluso color blanquecino alrededor de la papila. Carrasco
et al (Carrasco et al, 2005. J. Clin. Microbiol., 43:
635-640) abren la posibilidad a que Candida
famata pueda ser la causa de AZOOR.
Por tanto, sería muy útil el desarrollo de un
método que fuese capaz de detectar y/o cuantificar microorganismos
causantes de candidiasis u otras patologías causadas por infección
por candidas patógenas, como por ejemplo AZOOR, con alta
sensibilidad, fiabilidad y rapidez.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma
depositado con nº ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de
reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la
presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la
proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho
anticuerpo monoclonal, a los usos del hibridoma, anticuerpo o
epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención
se refiere a un método para la detección de Candida famata o
para la determinación de la evolución de candidiasis producida por
dicho microorganismo, así como al uso de los anticuerpos
monoclonales de la presente invención con fines terapéuticos o para
diagnóstico por imagen de candidiasis.
La selección del hibridoma de la presente
invención, capaz de producir los anticuerpos que reconocen la
proteína GAPDH, no es obvia a tenor de los resultados que se han
obtenido y que se muestran en el apartado de ejemplos de la presente
invención. El hibridoma depositado con nº ECACC09042201 produce una
señal destacada en la detección de anticuerpos en comparación con el
resto de hibridomas ensayados, lo que supone un efecto sorprendente
y demuestra que la selección no es obvia. Otro efecto sorprendente
se refiere a la especificidad de dicho anticuerpo para la especie de
Candida famata de entre diversas especies ensayadas del
género Candida. La detección específica del antígeno en extractos
proteicos derivados de cultivos celulares se muestra efectiva tanto
en condiciones desnaturalizantes como en condiciones no
desnaturalizantes.
El hibridoma obtenido se depositó en la
European Collection of Cell Cultures (ECACC), con fecha 22 de
Abril de 2009 y con la referencia de depósito 09042201. La dirección
de la Autoridad Internacional de Depósito ECACC es: Health
Protection Agency/Centre for Emergency Preparedness and Response
Porton Down/Salisbury/SP4 0JG/UK.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
una célula del hibridoma depositado con nº 09042201 en la
European Collection of Cell Cultures (ECACC). En adelante
puede emplearse el término "hibridoma ECACC09042201" para hacer
referencia a una o más células de dicho hibridoma depositado. Un
hibridoma es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión
de un linfocito productor del anticuerpo específico de interés, con
una línea celular de mieloma. Los hibridomas obtenidos después de
fusionar células del bazo de ratones BALB/c, inmunizados con
proteínas extracelulares producidas por Candida famata, con
células de mieloma (X63.Ag.653 NP3), se han ensayado mediante ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y se ha
seleccionado el hibridoma ECACC09042201 que produce una señal
destacada en la detección de anticuerpos contra alguna de las
proteínas del extracto, de forma sorprendente, en comparación con el
resto de hibridomas ensayados.
El hibridoma de la presente invención tiene las
siguientes características:
Breve descripción: Hibridoma murino
anti-proteína de Candida famata.
Cultivo celular de ratón BALB/c.
Inmunógeno: Proteínas extraídas de Candida
famata.
Inmunocito donante: Ratón hembra BALB/c
inmunizada.
Célula inmortal para su fusión con el inmunocito
donante: Línea celular X63-Ag8.653.
Producto específico (antígeno): Proteína de 35
KDa aprox.
Tipo de Inmunoglobulina: IgG1.
Ensayo de screening: ELISA, Western blot,
inmunofluorescencia.
Condiciones de depósito:
- Concentración celular de 5 x 10^{6}/0,5 ml.
- Composición del medio de cultivo: 90% fetal calf serum + 10% DMSO.
Información adicional:
- Nombre de la línea celular: CF3.
- Morfología: células redondas.
- Nº de pases: 50 aprox.
Condiciones de cultivo:
- Medio de crecimiento: DMEM.
- Porcentaje de suero y tipo: 15% fetal calf serum.
- Suplementos: 1 mM Na piruvato, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES (penicilina/estreptomicina si es necesario).
- Temperatura: 37ºC.
- Fase gaseosa: 5% de CO_{2} en el aire.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus alotipos o
fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con nº de acceso
09042201, que reconoce la proteína de Candida famata SEO ID
NO: 1, o cualquiera de sus variantes. Un alotipo es el anticuerpo
resultante de pequeñas diferencias en la secuencia de aminoácidos en
la región constante de las cadenas ligeras y pesadas de los
anticuerpos originales. Mediante los datos divulgados en la presente
invención se podrían obtener anticuerpos con la misma especificidad
que los IgG1 pero con pequeños cambios en la secuencia que codifica
para la cadena pesada, es decir, IgG2, 3 y 4.
Los anticuerpos monoclonales son una población
idéntica de moléculas de anticuerpos, producidos por el mismo clon
de linfocitos B, por lo que todos presentan la misma especificidad,
reconociendo el mismo epítopo.
La secuencia SEO ID NO: 1 corresponde a la
secuencia aminoacídica de la proteína GAPH
(Gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa) de Candida famata (microorganismo también
conocido como Debaryomyces hansenii).
El anticuerpo de la presente invención reconoce
cualquier variante de la secuencia SEO ID NO: 1, o de cualquiera de
sus fragmentos (siempre que contengan la secuencia aminoacídica
reconocida de forma específica por dicho anticuerpo). Tal como se
emplea en la presente invención, el término "variante" se
refiere a una secuencia aminoacídica sustancialmente homologa a la
secuencia SEO ID NO: 1. En general, una variante incluye adiciones,
deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término
"variante" incluye también a las proteínas resultantes de
modificaciones postraduccionales como, por ejemplo, pero sin
limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación. Cualquiera de
las modificaciones descritas se produce en una posición aminoacídica
que no afecta al reconocimiento de dicha proteína por medio del
anticuerpo de la presente invención.
Una secuencia aminoacídica es "sustancialmente
homologa" cuando tiene una identidad respecto a SEQ ID NO: 1 o
respecto de cualquiera de sus fragmentos de, al menos un 60%, al
menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al
menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99%, y además,
conservando la actividad biológica de dicha secuencia aminoacídica o
de cualquiera de sus fragmentos, o son funcionalmente equivalentes.
El término "funcionalmente equivalente", tal como se emplea en
la presente invención, se refiere a que secuencia aminoacídica o
cualquiera de sus fragmentos mantiene esencialmente sus propiedades
biológicas. Cualquier secuencia sustancialmente homologa a SEQ ID
NO: 1 puede ser identificada por un experto en la materia, por
ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para
comparar secuencias.
Una realización preferida se refiere al
anticuerpo monoclonal, que reconoce una secuencia aminoacídica de
dicha proteína de Candida famata que se selecciona de la
lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de
sus fragmentos.
Tal como puede verse en los ejemplos de la
presente invención, en la Fig. 2 se muestra la detección de
antígenos mediante la adición del anticuerpo de la invención a
extractos solubles (de proteínas) de Candida famata, C.
albicans, C. parapsilosis, C. glabrata,
Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa.
Los antígenos corresponden a una proteína de unos 35 KDa que se
detecta en los extractos de Candida famata, Saccharomyces
cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa, pero no en
especies más cercanas filogenéticamente como Candida
albicans, C. parapsilosis o C. glabrata. En base a
estos resultados, tras alinear las secuencias de Candida
albicans (SEQ ID NO: 11; de acceso XP_719909.12) y Candida
glabrata (SEQ ID NO: 12; GAPDH2 de Candida glabrata, Nº
de acceso Q6FSM4.1 y SEQ ID NO: 13; GAPDH1 de Candida
glabrata, Nº de acceso Q6FPW3.1) con la secuencia SEQ ID NO: 1
mediante ClustalW (programa de alineamiento múltiple
EMBL-EBI;
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, con
clustering NJ), se seleccionaron aquellos fragmentos con
cambios sustanciales en algunos de los aminoácidos. La lista de
secuencias SEQ ID NO: 2 a 10 corresponde a fragmentos de la
secuencia SEQ ID NO: 1 que han sido seleccionados en base a dichas
diferencias.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
ser sintetizados mediante tecnología recombinante de ADN. Para ello,
es necesario disponer de la secuencia nucleotídica que codifica para
cualquier anticuerpo de la presente invención y determinar el
fragmento o fragmentos de interés para ser amplificado/s mediante
PCR. Tras dicha amplificación puede llevarse a cabo su clonación
junto a otras secuencias nucleotídicas o por sí sola, en un vector
capaz de replicarse y obtener anticuerpos funcionales recombinantes.
De esta manera pueden obtenerse anticuerpos sin necesidad de
inmunizar a un animal. La obtención de dichos anticuerpos
recombinantes se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica de
clonación, aislamiento y/o purificación conocida en el estado de la
técnica.
En adelante, para hacer referencia a cualquier
anticuerpo monoclonal descrito en los párrafos anteriores, se
empleará el término "anticuerpo de la invención" o
"anticuerpo de la presente invención".
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un antisuero aislado que comprende el anticuerpo de la invención.
El antisuero de la invención es el suero de cualquier animal que
contiene el anticuerpo de la invención. Preferiblemente el animal es
un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.
\newpage
Un aspecto más de presente invención se refiere
a un epítopo de la secuencia aminoacídica de Candida famata
SEQ ID NO: 1, reconocido por el anticuerpo monoclonal de la
invención. El epítopo es el determinante antigénico que produce una
reacción específica con un anticuerpo. Dicho epítopo puede constar
de una secuencia de aminoácidos sobre la superficie del antígeno; de
una disposición o estructura terciaria concreta; o de una
modificación postraduccional.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere al epítopo de la secuencia aminoacídica que
codifica para la proteína GAPDH de Candida famata, SEQ ID NO:
1, que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID
NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.
En adelante, para hacer referencia a cualquier
epítopo descrito en los párrafos anteriores, se empleará el término
"epítopo de la invención" o "epítopo de la presente
invención".
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la detección y/o cuantificación de Candida
famata que comprende:
- a.
- obtener el extracto soluble de una muestra biológica aislada,
- b.
- añadir el anticuerpo de la invención al extracto celular del apartado (a) y
- c.
- detectar y/o cuantificar el anticuerpo monoclonal añadido en el apartado (b) que esté unido al epítopo de la invención.
La obtención del extracto soluble se lleva a
cabo mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica.
Dicho extracto soluble contiene las proteínas totales de la muestra
biológica aislada. El término "muestra biológica aislada" se
refiere a una muestra aislada que puede proceder de un fluido
fisiológico como sangre, plasma, suero u orina y/o cualquier tejido
celular procedente de un organismo. Preferiblemente el organismo es
un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.
En el apartado (b) del método, se puede llevar a
cabo la inmovilización de las proteínas contenidas en el extracto
celular o la inmovilización del anticuerpo de la invención en un
soporte sólido mediante diferentes procesos de unión. Se entiende
por soporte sólido una gran variedad de materiales, como por
ejemplo, pero sin limitarse, la resina de intercambio iónico o
adsorción, el vidrio, plástico, látex, nylon, gel, esteres de
celulosa, esferas paramagnéticas o cualquiera de sus combinaciones.
Las proteínas pueden someterse a un proceso de separación en el
soporte en el que son inmovilizadas.
El anticuerpo de la invención puede marcarse con
un marcador seleccionado de la lista que comprende, pero sin
limitarse, radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula
susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o
cuantificada de forma directa. Asimismo, el anticuerpo de la
invención que esté unido al antígeno (proteína GAPDH) se puede
detectar de forma indirecta mediante la adición de anticuerpos
anti-ratón marcados con alguno de los marcadores de
la lista anterior. Los anticuerpos que no se hayan unido al antígeno
serán eliminados mediante al menos un lavado. La detección puede
llevarse a cabo mediante la adición de un sustrato indicador
cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente, específico para el
marcador. Preferiblemente el marcador es peroxidasa y el sustrato es
cromogénico como por ejemplo, pero sin limitarse,
tetrametilbencidina (TMB), ácido
azino-bis(3-etilbenzotiazolina
6-sulfónico) o fenilendiamina.
Por tanto, la detección del anticuerpo
monoclonal (detección indirecta del antígeno al que se une) se puede
llevar a cabo mediante cualquier técnica conocida en el estado de la
técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, ELISA o
radioinmunoensayo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la determinación de la evolución de candidiasis
producida por Candida famata que comprende:
- a.
- determinar, según el método anterior, una primera concentración de Candida famata en una muestra biológica aislada de un individuo,
- b.
- determinar, según el método anterior, una segunda concentración de Candida famata en otra muestra biológica del individuo del apartado (a), y
- c.
- comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración obtenida en el apartado (a) para determinar si hay o no alguna diferencia significativa.
La candidiasis es una infección producida por
una o más especies de levaduras del género Candida. La
candidiasis puede ser, pero sin limitarse, candidiasis crónica,
candidiasis diseminada (sistémica) o candidiasis crónica
muco-cutánea. En la presente invención, el término
"candidiasis producida por Candida famata" hace
referencia a cualquier tipo de candidiasis en la que intervenga el
microorganismo Candida famata sólo o en combinación con otros
microorganismos. Preferiblemente dichos microorganismos que pueden
causar candidiasis en combinación con Candida famata son del
género Candida.
En los ejemplos de la presente invención puede
observarse que, tras el análisis de sueros de personas infectadas
con Candida famata, se observó que el antígeno (GAPDH) puede
detectarse en el suero mediante análisis en slot blot, así
como que la cantidad de esta proteína varía o fluctúa a lo largo del
tiempo en un paciente infectado en el que se han analizado sueros
obtenidos a lo largo de varios años, es decir, dicho método es
válido para la monitorización de un tratamiento de candidiasis o
simplemente para observar la evolución de la enfermedad en relación
a la cantidad de proteína GAPDH producida por Candida famata,
medida indirecta de su presencia y/o actividad.
La determinación de la concentración de
Candida famata se lleva a cabo mediante el método para su
detección y/o cuantificación descrito en párrafos anteriores. La
comparación de las concentraciones determinadas permite establecer
si hay o no hay alguna diferencia significativa. El término
"diferencia significativa" tal como se emplea en la presente
invención hace referencia a que la diferencia observada no es el
resultado del azar. Para determinar la influencia del azar en cada
uno de los resultados obtenidos así como la determinación de alguna
diferencia significativa, se puede aplicar cualquier técnica de
estadística conocida en el estado de la técnica. Por ejemplo, pero
sin limitarse, puede llevarse a cabo la repetición de las
determinaciones al menos un nº de veces que permita, por ejemplo,
pero sin limitarse, establecer una desviación típica respecto del
valor promedio. Dicha diferencia significativa puede ser positiva o
negativa. La diferencia significativa es positiva cuando el valor de
la concentración de la primera determinación es mayor que el valor
de la segunda concentración. Por el contrario, la diferencia
significativa es negativa cuando el valor de la concentración de la
primera determinación es menor que el valor de la segunda
concentración.
La diferencia significativa depende de la
técnica de detección que se emplee, en cualquier caso, puede
emplearse una técnica semi-cuantitativa mediante la
cual la determinación de la concentración se lleva a cabo por medio
de la determinación de la intensidad de la banda detectada en la
primera o segunda determinación de la concentración de C.
famata. Si la diferencia significativa es negativa, se
interpreta como que la candidiasis está remitiendo y si es positiva,
la candidiasis está empeorando. Asimismo, los resultados obtenidos
en cada una de las tomas de muestras se pueden comparar con los
valores obtenidos para un control negativo y/o positivo.
La determinación de la evolución de dicha
candidiasis comprende una serie de pasos que comienzan por la toma
de muestras seriales. Se entiende por toma de muestras seriales a la
extracción de las muestras biológicas mencionadas en la presente
invención a diferentes tiempos en el mismo paciente.
La presente invención también se refiere a un
método para la monitorización de un tratamiento de candidiasis
producida por Candida famata que comprende las mismas etapas
que el método descrito para la determinación de la evolución de
candididiasis producida por Candida famata. En este caso, los
pacientes han sido tratados para disminuir la infección con un
agente determinado.
Una realización preferida se refiere al método
para la detección y/o cuantificación de Candida famata o al
método para la determinación de la evolución de un tratamiento de
candidiasis producida por Candida famata, donde la muestra
biológica aislada es un fluido biológico. El fluido biológico puede
ser, pero sin limitarse, sangre, plasma, suero sanguíneo, orina,
humor acuoso, humor vítreo o líquido cefalorraquídeo. Según una
realización más preferida, el fluido biológico es suero
sanguíneo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de la célula del hibridoma depositado con nº de acceso
ECACC09042201 para la producción del anticuerpo monoclonal de la
invención.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del anticuerpo monoclonal de la invención para la
detección de Candida famata.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del anticuerpo de la invención para la determinación
de la evolución de candidiasis producida por Candida
famata.
En otro aspecto de la presente invención, el
anticuerpo monoclonal de la invención se usa para detectar,
cuantificar, aislar o purificar el antígeno que reconoce dicho
anticuerpo. El antígeno detectado, aislado o purificado es cualquier
antígeno que sea reconocido por el anticuerpo monoclonal de la
presente invención. El antígeno puede provenir de cualquier
organismo. Preferiblemente el antígeno proviene de un
microorganismo. Más preferiblemente el microorganismo se selecciona
de la lista que comprende, pero sin limitarse, Candida
famata, Saccharomyces cerevisiae o Rhodotorula
mucilaginosa. Preferiblemente el antígeno reconocido es la
proteína GAPDH, cualquier variante de la misma o cualquiera de sus
fragmentos.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del epítopo de la invención para la generación de
cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal. Preferiblemente el
anticuerpo es monoclonal. El epítopo de la invención debe estar
aislado. Dicho epítopo puede ser introducido, preferiblemente por
inyección intravenosa o intramuscular, en el cuerpo de un animal,
preferiblemente mamífero, provocando con ello una respuesta inmune
específica mediante la cual se generan anticuerpos específicos. De
esta manera puede obtenerse un antisuero que contiene un anticuerpo
capaz de reconocer al epítopo de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la
invención. Una realización preferida de la presente invención se
refiere a la composición farmacéutica, donde el anticuerpo
monoclonal está conjugado a un agente antibiótico, donde dicho
agente es antifúngico. Para que el anticuerpo pueda formar parte de
una composición farmacéutica que vaya a ser aplicada al tratamiento
de candidiasis en humanos, se deben generar previamente los
anticuerpos monoclonales de la invención quiméricos o humanizados
mediante ingeniería genética, evitando así el rechazo del sistema
inmune al ser introducidos en el organismo. De esta manera se
generan anticuerpos quiméricos o humanizados que incorporan parte
animal (por ejemplo, de ratón) y parte humana. La parte
correspondiente al ratón, es indispensable para que el anticuerpo
reconozca el antígeno de Candida famata en el cuerpo y la
parte humana es responsable de que el sistema inmunológico humano no
lo
rechace.
rechace.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende el epítopo de la
invención. Dicho epítopo es la secuencia aminoacídica reconocida por
el anticuerpo de la invención, aislada. Después de dicho
aislamiento, su secuencia nucleotídica puede clonarse junto a otras
secuencias nucleotídicas para formar parte de una secuencia
recombinante.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere a la composición farmacéutica según cualquiera
de los aspectos anteriores que además incluye excipientes
farmacéuticamente aceptables. Una realización más preferida se
refiere a la composición farmacéutica que además incluye otra
sustancia activa.
Varios aspectos de la presente invención se
refieren al anticuerpo o epítopo de la invención para su uso como
medicamento.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al anticuerpo de la invención para la elaboración de un
medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis
producida por Candida famata.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de una composición que comprende el epítopo de la invención
para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o
prevención de candidiasis producida por Candida famata.
Un aspecto más de la presente invención es un
kit que comprende la célula del hibridoma depositado con nº de
acceso ECACC09042201. Otro aspecto de la invención se refiere al uso
del kit que comprende la célula del hibridoma depositado con nº de
acceso ECACC09042201 para la producción del anticuerpo de la
invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit
que comprende el anticuerpo de la invención. Según otro aspecto de
la invención, el kit que comprende el anticuerpo de la invención se
usa para la detección de Candida famata.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del kit que comprende el anticuerpo de la invención
para la determinación de la evolución de un tratamiento de
candidiasis producida por Candida famata. Otro aspecto de la
presente invención se refiere a un kit que comprende el epítopo de
la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere al
uso del kit que comprende el epítopo de la invención para la
generación de cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere al kit que comprende la célula del hibridoma depositado con
nº de acceso ECACC09042201, el anticuerpo monoclonal de la
invención, el epítopo de la invención, o cualquiera de sus
combinaciones.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Figura 1. Muestra el gráfico de barras de los
datos obtenidos mediante ELISA.
El eje de ordenadas representa los valores de
densidad óptica de un ensayo de ELISA de captura de anticuerpos por
el antígeno que en este caso son proteínas solubles secretadas por
Candida famata. En abcisas se indican los cinco hibridomas
generados. Se ensayaron los sobrenadantes (extracto soluble) de
diversos hibridomas frente a proteínas fijadas de C. famata
(CFA) y frente a BSA. A partir de estos resultados se seleccionó el
hibridoma denominado como CF3 (los anticuerpos monoclonales
generados por este hibridoma, también se llaman CF3, que muestran
una señal de reconocimiento más alta que el resto de hibridomas en
este ensayo).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2. Muestra el reconocimiento de
proteínas de levadura por el anticuerpo CF3 mediante ensayo
western blot con proteínas extraídas de diferentes especies
de levaduras: C. famata (CFA), C. albicans (ALB),
C. parapsilosis (PAR), C. glabrata (GLA),
Saccharomyces cerevisiae (SAC) y Rhodotorula
mucilaginosa (ROD).
Las proteínas obtenidas se separaron mediante
SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa. Esta membrana se incubó con el anticuerpo CF3 y se
utilizó como secundario un anticuerpo anti-ratón
unido a peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos. El
anticuerpo CF3 reconoce una proteína de unos 35 kDa de C.
famata, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula
mucilaginosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3. Muestra un ensayo de
slot-blot utilizando proteínas extraídas de
diferentes especies de levaduras: C. famata (CFA), C.
albicans (ALB), C. parapsilosis (PAR), C. glabrata
(GLA), Saccharomyces cerevisiae (SAC) y Rhodotorula
mucilaginosa (ROD).
Las proteínas obtenidas se fijaron a una
membrana de nitrocelulosa mediante vacío con un aparato de
slot-blot. Esta membrana se incubó con el anticuerpo
CF3 y se utilizó como secundario un anticuerpo
anti-ratón unido a peroxidasa para la detección
indirecta de los antígenos. El anticCF3 reacciona principalmente con
proteínas extraídas de C. famata, Saccharomyces
cerevisiae y Rhodotorula mucilaginosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4. Muestra un ensayo de
slot-blot en el que se fijaron a una membrana
de nitrocelulosa muestras serológicas de diferentes sujetos a
diferentes diluciones.
Dicha membrana se incubó con el anticuerpo CF3 y
se utilizó como secundario un anticuerpo anti-ratón
unido a peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos.
Existen diferentes cantidades de GAPDH de C. famata que
reaccionan con el anticuerpo en los diferentes sujetos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5. Muestra un ensayo de
slot-blot en el que se fijaron a una membrana
de nitrocelulosa diferentes diluciones de muestras serológicas de un
mismo sujeto obtenidas en diferentes fechas.
Se incubó con el anticuerpo CF3 y se utilizó
como anticuerpo secundario un anti-ratón unido a
peroxidasa para la detección indirecta de los antígenos. Se muestra
que existen diferentes cantidades de proteína GAPDH que reacciona
con el anticuerpo a lo largo del tiempo en un mismo sujeto.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6. Muestra el alineamiento de
secuencias aminoacídicas de la proteína GAPDH de tres especies de
levadura pertenecientes al género Candida.
Las secuencias que se han utilizado en dicho
alineamiento son las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 (candida)
perteneciente a Candida famata (microorganismo también
conocido como Debaryomyces hansenii), SEQ ID NO: 11
(albicans) perteneciente a Candida albicans con nº de acceso
XP_719909.1, SEQ ID NO: 12 (glabratal) perteneciente a Candida
glabrata con nº de acceso Q6FSM4.1 y SEQ ID NO: 13 (glabrata2)
perteneciente a Candida glabrata con nº de acceso
Q6FPW3.1.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores. Los siguientes
ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de
patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención.
Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han
de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se
reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos no pretenden limitar
el campo de aplicación de la misma.
De forma general, para producir anticuerpos
monoclonales, primero se extraen células B del bazo de un animal que
ha sido expuesto al antígeno. Estas células B son fusionadas con
células tumorales de mieloma múltiple (un tipo de cáncer) que pueden
crecer indefinidamente en cultivo celular. Estas células fusionadas
híbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rápida e
indefinidamente, puesto que son células tumorales después de todo y
pueden producir gran cantidad de anticuerpos. Los hibridomas son
suficientemente diluidos y cultivados para obtener un número
diferente de determinadas colonias, las cuales producen sólo un tipo
de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados
para conocer su capacidad de unirse a un antígeno determinado, por
ejemplo con el tipo de test llamado ELISA, y para seleccionarse y
aislarse de la manera más efectiva.
En la presente invención se inmunizaron ratones
de la cepa BALB/c con extractos proteicos solubles de Candida
famata obtenidos de la siguiente forma: la levadura C.
famata se creció hasta una densidad óptica a 600 nm de 0.8. Las
levaduras se centrifugaron y el medio de cultivo se liofilizó para
concentrar las proteínas segregadas al medio. El liofilizado se
resuspendió en PBS y se dializó frente a PBS. Después de
centrifugar, este extracto proteico se dividió en alícuotas y se
utilizó para inmunizar ratones, utilizando protocolos estándar de
inmunización y de fusión celular (Kremer y Márquez. 2003. Methods
and Protocols. Ed.: D'Ambrosio D. y Sinigaglia, F. Humana Press,
Pps.
243-260).
243-260).
Tras la fusión, la selección de hibridomas se
realizó por ensayos de inmuno-absorción enzimática
(ELISA). Como antígeno inmovilizado sobre la fase sólida se
emplearon proteínas solubles de C. famata. En estos ensayos
se utilizó el antígeno referido como tapiz específico y la proteína
albúmina de suero bovino (BSA) como control negativo.
Como método de detección se añadió un anticuerpo
anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado a
peroxidasa seguido del sustrato de la reacción colorimétrica
(detección cromogénica). De esta forma, se seleccionaron los
hibridomas secretores de anticuerpos más específicos para el
antígeno. La especificidad de todos los hibridomas fue evaluada
mediante ensayos de ELISA (Fig. 1), Western blot (Fig. 2) y
slot blot (Fig. 3) frente a extractos proteicos de otras
levaduras. Como resultado de los análisis realizados se
seleccionaron los mejores hibridomas entre los que destacó el
hibridoma CF3 (Fig. 1), depositado en la colección de cultivos ECACC
-European Collection of Animal Cell Culture- el 22 de abril
de 2009 con el nº de acceso 09042201, que expresa establemente
inmunoglobulinas del isotipo IgG1, correspondientes al anticuerpo
monoclonal (mAb) anti-GAPDH de C. famata
CF3.
La proteína detectada en los ensayos de
Western blot fue inmunoprecipitada y analizada por
MALDI-TOF, consiguiendo secuenciar 3 péptidos que
correspondieron a la proteína GAPDH de la levadura Debaryomyces
hansenii (Candida famata) con nº de acceso Q6BMK0.1.
Mediante los ensayos de slot blot (no
desnaturaliza la proteína), el anticuerpo CF3 es capaz de detectar
la presencia de GAPDH en el suero de personas infectadas con C.
famata. De esta manera se está demostrando que tanto en
condiciones desnaturalizantes para la proteína detectada (Western
blot) como en condiciones no desnaturalizantes, se detecta el
mismo antígeno con la sensibilidad similar, por tanto, todo parece
indicar que el epítopo reconocido por el anticuerpo de la invención
reconoce una secuencia de aminoácidos concreta en lugar de una
determinada conformación o estructura de dicha proteína.
El anticuerpo CF3 no detecta la proteína GAPDH
de C. famata en sueros de personas que no padecen infección
por este microorganismo (Fig. 4). Puesto que este anticuerpo no
reconoce la GAPDH de otras especies del género Candida, puede servir
como diagnóstico diferencial de infecciones de C. famata.
Mediante la detección del anticuerpo de la
invención CF3 se detecta la fluctuación de GAPDH en sueros de un
paciente infectado con C. famata tomados a lo largo de varios
años (Fig. 5), es decir, desde el 24/04/06 hasta el 07/04/08. Por lo
tanto, el CF3 puede servir para seguir la evolución de la infección
de C. famata y para detectar la eficacia de los tratamientos
antifúngicos contra esta levadura, es decir, para monitorizar dicho
tratamiento.
Para la determinación de los epítopos más
probables se alinearon diversas secuencias aminoacídicas de la
proteína GAPDH de los microorganismos Candida famata,
Candida albicans y Candida glabrata. Las secuencias
que se han utilizado en dicho alineamiento son las secuencias
aminoacídicas SEQ ID NO: 1 (candida) perteneciente a Candida
famata (microorganismo también conocido como Debaryomyces
hansenii), SEQ ID NO: 11 (albicans) perteneciente a Candida
albicans con nº de acceso XP_719909.1, SEQ ID NO: 12 (glabratal)
perteneciente a Candida glabrata con nº de acceso Q6FSM4.1 y
SEQ ID NO: 13 (glabrata2) perteneciente a Candida glabrata
con nº de acceso Q6FPW3.1.
Se han seleccionado aquellas secuencias con
diferencias significativas entre la secuencia de Candida
famata SEQ ID NO: 1 y el resto de secuencias SEQ ID NO:
11-13.
<110> Universidad Autónoma de Madrid
(70%)
\hskip1cmConsejo Superior de investigaciones Científicas (CSIC) (30%)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo monoclonal que reconoce
la proteína GAPDH de Candida famata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1595.3bis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces hansenii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Candida albicans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Candida glabrata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Candida glabrata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
Claims (32)
1. Célula del hibridoma depositado con nº
ECACC09042201.
2. Anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus
fragmentos, obtenido de la célula del hibridoma según la
reivindicación 1, que reconoce la proteína de Candida famata
SEQ ID NO: 1, o cualquiera de sus variantes.
3. Anticuerpo según la reivindicación 2, que
reconoce una secuencia aminoacídica de dicha proteína de Candida
famata que se selecciona de la lista de secuencias que comprende
SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.
4. Antisuero aislado que comprende el anticuerpo
según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.
5. Epítopo de la secuencia aminoacídica de
Candida famata SEQ ID NO: 1, reconocido por el anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 2.
6. Epítopo según la reivindicación 5 que se
selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a
10, o cualquiera de sus fragmentos.
7. Método para la detección y/o cuantificación
de Candida famata que comprende:
- a.
- obtener el extracto soluble de una muestra biológica aislada,
- b.
- añadir el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, al extracto soluble del apartado (a) y
- c.
- detectar y/o cuantificar el anticuerpo monoclonal añadido en el apartado (b) que esté unido al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método para la determinación de la evolución
de candidiasis producida por Candida famata que
comprende:
- a.
- Determinar, según el método de la reivindicación 7, una primera concentración de Candida famata en una muestra biológica aislada de un individuo,
- b.
- determinar una segunda concentración de Candida famata en otra muestra biológica del individuo del apartado (a), y
- c.
- comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración obtenida en el apartado (a) para determinar si hay o no alguna diferencia significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, donde la muestra biológica aislada es un
fluido biológico.
10. Método según la reivindicación 9, donde el
fluido biológico es suero sanguíneo.
11. Uso del hibridoma según la reivindicación 1
para la producción del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3.
12. Uso del anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la detección de
Candida famata.
13. Uso del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3 para la determinación de la evolución de
candidiasis producida por Candida famata.
14. Uso del anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para detectar, cuantificar,
aislar o purificar el antígeno que reconoce dicho anticuerpo.
15. Uso del epítopo según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6 para la generación de cualquier
anticuerpo.
16. Composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó
3.
17. Composición farmacéutica según la
reivindicación 16, donde el anticuerpo monoclonal está conjugado a
un agente antifúngico.
18. Composición farmacéutica que comprende el
epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.
\newpage
19. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 16 ó 17 que además incluye excipientes
farmacéuticamente aceptables.
20. Composición farmacéutica según la
reivindicación 19 que además incluye otra sustancia activa.
21. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de
las reivindicaciones 2 ó 3 para su uso como medicamento.
22. Epítopo según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6 para su uso como medicamento.
23. Uso del anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la elaboración de un
medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis
producida por Candida famata.
24. Uso del epítopo según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6 para la elaboración de un medicamento útil en
el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por
Candida famata.
25. Kit que comprende la célula del hibridoma
según la reivindicación 1.
26. Uso del kit según la reivindicación 25 para
la producción del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3.
27. Kit que comprende el anticuerpo monoclonal
según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.
28. Uso del kit según la reivindicación 27 para
la detección de Candida famata.
29. Uso del kit según la reivindicación 27 para
la determinación de la evolución de candidiasis producida por
Candida famata.
30. Kit que comprende el epítopo según
cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.
31. Uso del kit según la reivindicación 30 para
la generación de cualquier anticuerpo.
32. Kit que comprende la célula del hibridoma
según la reivindicación 1, el anticuerpo monoclonal según cualquiera
de las reivindicaciones 2 ó 3, el epítopo según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, o cualquiera de sus combinaciones.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930966A ES2359203B9 (es) | 2009-11-06 | 2009-11-06 | Anticuerpo monclonal que reconoce la proteína gapdh de candida famata. |
| PCT/ES2010/070718 WO2011054997A2 (es) | 2009-11-06 | 2010-11-05 | Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína gapdh de candida famata |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930966A ES2359203B9 (es) | 2009-11-06 | 2009-11-06 | Anticuerpo monclonal que reconoce la proteína gapdh de candida famata. |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000052053A1 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | Research And Development Institute, Inc. | Antibodies against phosphomannan that are protective against candidiasis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DELGADO M.L. ET AL., "Candida albicans TDH3gene promotes secretion of internal invertasewhen expressed in Saccharomyces cerevisiaeas a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-invertasefusion protein." Yeast. 2003 Jun;20(8):713-22.todo el documento. * |
Also Published As
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