TWI737918B

TWI737918B - 抗登革病毒抗體及其應用

Info

Publication number: TWI737918B
Application number: TW107120185A
Authority: TW
Inventors: 賴思佳; 黃郁茵; 林昌棋; 魏俊傑; 蔡孟宏
Original assignee: 國防醫學院
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2021-09-01
Also published as: TW202000696A

Abstract

本發明涉及抗登革病毒抗體及其應用。特定而言，本發明之抗病毒登革病毒抗體為血清型專一性，可用於生物樣本中各種登革病毒血清型的專一性檢測及分化。本發明還提供了用於檢測登革病毒之方法及套組，以及使用如本文所述之抗病毒登革病毒抗體診斷及治療登革病毒病之方法及組合物。

Description

抗登革病毒抗體及其應用

現今世界上約有39億人口生活在有登革熱傳播危險的地區。估計每年有1億例登革熱感染，包括250,000-500,000例重症病例及約25,000例死亡。登革熱為一種由蚊子傳播的病毒性疾病，由四種登革病毒血清型(DENV1、DENV2、DENV3及DENV4)中的任何一種傳播所引起。在全球範圍內，登革熱大多由兩種主要的蚊子傳播：埃及斑蚊(Aedes aegypti )(適應城市)及白線斑蚊(Aedes albopictus )。登革熱的迅速蔓延歸因於熱帶及亞熱帶國家的城市化、登革熱流行地區的國家內部及國家之間的旅行增加，以及無效的病媒控制策略。實際上，登革熱的疾病及經濟負擔已成為全球公共衛生問題。

迄今為止，尚未有有效的抗病毒藥物可用於治療登革感染，且疫苗仍處於評估階段。此外，一種登革病毒血清型的感染賦予相同血清型終身免疫力，但當感染另一種血清型時，增加了發生嚴重登革熱的風險。因此，早期診斷DENV對於疾病管理非常重要。登革病毒感染的早期診斷將干涉治療患者及控制流行病。感染登革病毒的人類表現出廣泛的臨床表現，從無症狀感染到嚴重的登革熱，使得準確的診斷變得困難。目前登革熱的實驗室診斷測試包括分離病毒、病毒RNA檢測、抗原檢測及血清學方法。病毒分離及病毒RNA檢測在疾病的前五(5)天內有效；這兩種方法都可以識別登革病毒的血清型。然而，病毒分離很耗時，且病毒RNA檢測需要特殊設備及培訓人員。抗DENV IgM或IgG抗體僅在疾病發作後5天出現在血液中，且可能與其他黃病毒交叉反應；因此，在症狀出現的前5天內檢測抗DENV IgM或IgG無法確認病毒的存在，並且可能經常發生偽陽性結果。

在該疾病的急性期(即，疾病發作後第1天及第7天之間)，登革病毒非結構蛋白1 (nonstructural protein 1，NS1)，一種50 kDa糖蛋白，在患者血清中分泌並積聚至高濃度。在感染後1至9天內可確認人類血清中NS1的存在。此外，當以RT-PCR檢測不到病毒RNA且在IgM抗體出現之前，可以檢測到NS1蛋白。NS1蛋白為早期診斷標記物的良好標的。NS1蛋白的抗原檢測試驗可以簡單、低成本、處理大量樣本，以及快速的方式進行DENV的早期診斷。然而，雖然有幾種市售NS1檢測試驗可用於在疾病的早期階段診斷登革熱，但它們都不能區分各種登革熱的血清型。

仍然需要開發能夠檢測及區分各種登革熱血清型的診斷方法。

本發明基於許多分離的抗體的鑑定，這些抗體出乎意料地表現出對各登革病毒血清型的優異專一性。本發明之每種血清型專一性抗體能夠檢測登革病毒的一種特定血清型而基本上不與其他血清型交叉反應。本發明提供了這樣的抗體及其抗原結合片段，以及包含它們的組合物及套組，以及使用它們的方法。本發明可用於專一性檢測樣本中的一種或多種登革病毒血清型，具體而言是來自懷疑被病毒感染的患者的樣本。本發明還提供了對登革病毒專一的交叉反應性抗體(所有血清型)，其可以與本文所述之任何血清型專一性抗體配對，用於免疫測定以檢測樣本中的登革病毒。

於一方面，本發明提供分離的抗體或其抗原結合片段，其中該分離的抗體係選自由下列所組成之群組： (i) 專一於登革病毒血清型第1型(DENV1)之第一抗體，包含 (a) 重鏈可變區(V_H )，包含如SEQ ID NO: 2所示之重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、如SEQ ID NO: 4所示之重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 6所示之重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b) 一輕鏈可變區(V_L )，包含SEQ ID NO: 9所示之輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)、SEQ ID NO: 11所示之輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 13所示之輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)； (ii) 專一於登革病毒血清型第2型(DENV2)之第二抗體，包含 (a)重鏈可變區(V_H )，包含SEQ ID NO: 16所示之重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、SEQ ID NO: 18所示之重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 20所示之重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V_L )，包含SEQ ID NO: 23所示之輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)、SEQ ID NO: 25所示之輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 27所示之輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)； (iii) 專一於登革病毒血清型第3型(DENV3)之第三抗體，包含 (a)重鏈可變區(V_H )，包含SEQ ID NO: 30所示之重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、SEQ ID NO: 32所示之重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 34所示之重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V_L )，包含SEQ ID NO: 37所示之輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)、SEQ ID NO: 39所示之輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 41所示之輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)； (iv) 專一於登革病毒血清型第4型(DENV4)之第四抗體，包含 (a)重鏈可變區(V_H )，包含SEQ ID NO: 44所示之重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、SEQ ID NO: 46所示之重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 48所示之重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V_L )，包含SEQ ID NO: 51所示之輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)、SEQ ID NO: 53所示之輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 55所示之輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)； (v)與登革病毒血清型第1型、第2型、第3型，以及第4型(DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4)交叉反應之第五抗體，包含 (a)重鏈可變區(V_H )，一如SEQ ID NO: 58所示之重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、SEQ ID NO: 60所示之重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 62所示之重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V_L )，包含SEQ ID NO: 65所示之輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)、SEQ ID NO: 67所示之輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 69所示之輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)；以及 (vi) 任何(i)至(v)之組合。

於某些具體實施例中，該第一抗體包含包含SEQ ID NO: 71的重鏈可變區(V_H )以及包含SEQ ID NO: 72的輕鏈可變區(V_L )。

於某些具體實施例中，該第二抗體包含包含SEQ ID NO: 73的重鏈可變區(V_H )以及包含SEQ ID NO: 74的輕鏈可變區(V_L )。

於某些具體實施例中，該第三抗體包含包含SEQ ID NO: 75的重鏈可變區(V_H )以及包含SEQ ID NO: 76的輕鏈可變區(V_L )。

於某些具體實施例中，該第四抗體包含包含SEQ ID NO: 77的重鏈可變區(V_H )以及包含SEQ ID NO: 78的輕鏈可變區(V_L )。

於某些具體實施例中，該第五抗體包含包含SEQ ID NO: 79的重鏈可變區(V_H )以及包含SEQ ID NO: 80的輕鏈可變區(V_L )。

本發明之登革病毒專一性抗體可為全長抗體。本發明抗體之抗原結合片段可為scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、F(ab’)² 。

另一方面，本發明提供了一種核酸，其包含編碼抗體重鏈可變區(V_H )或抗體輕鏈可變區(V_L )或兩者的核苷酸序列，其中該V_H 及V_L 如本文所述。

本發明還提供了包含本文所述之任何核酸的載體(例如，表現載體)及包含這種載體的宿主細胞。

本發明進一步提供了一種製備登革病毒專一性抗體之方法，包含(i)在允許表現抗體的條件下培養如本文所述之宿主細胞，及可選擇地(ii)從細胞陪養中收穫抗體。

於另一方面，本發明提供了一種組合物，其包含(a)本文所述之對登革病毒專一的任何抗體，如本文所述之任何核酸，或本文所述之任何載體；及(b)載體，例如，醫藥上可接受之載體。

於某些具體實施例中，本發明之組合物為用於治療登革病毒疾病之醫藥組合物。

於某些具體實施例中，本發明之組合物為用於診斷登革病毒疾病之診斷組合物。

於另一方面，本發明提供了一種在懷疑含有該登革病毒的樣本中檢測登革病毒之方法，包含使該樣本與如本文所述之專一於登革病毒的分離的抗體或其抗原結合片段接觸，並測定該抗體與該樣本的結合。該結合的結果用於確定樣本中各登革病毒血清型的存在。特定而言，(i)該第一抗體與該樣本的結合表示在該樣本中存在DENV1；(ii)該第二抗體與該樣本的結合表示在該樣本中存在DENV2；(iii)該第三抗體與該樣本的結合表示在該樣本中存在DENV3；及/或(iv)該第四抗體與該樣本的結合表示在該樣本中存在DENV4。於某些具體實施例中，本發明之相應血清型專一性抗體與配偶體抗體配對以進行夾心式測定。

於另一方面，本發明提供了一種用於在樣本中檢測一種或多種登革病毒血清型的存在之套組，包含一種或多種本文所述之登革病毒血清型專一性抗體及任選的配偶體抗體。該配偶體抗體可為登革病毒的血清型交叉反應抗體，例如，如本文所述之第五抗體。

於某些具體實施例中，該套組中的至少一種抗體包含可偵測到的標記。

該可偵測到的標記之實例包括，但不限於，酶標記、螢光標記、金屬標記，以及放射性標記。

於某些具體實施例中，該套組為免疫測定套組。

該免疫測定之實例包括，但不限於，酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫測定(radioimmunoassay，RIA)、螢光免疫測定(fluorescence immunoassay，FIA)、發光免疫測定(luminescence immunoassay，LIA)，或ILMA免疫螢光測定。

於某些具體實施例中，該免疫測定係以側流測定形式進行。

具體而言，該免疫測定為夾心式測定。

於下面的描述中闡述了本發明之一個或多個具體實施例之細節。從以下幾個具體實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍中，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。

本發明涉及血清型專一性的抗病毒登革病毒抗體。本發明提供了這樣的抗體及其抗原結合片段，其可用於在生物樣本中專一地檢測及分化各種登革病毒血清型。本發明進一步提供了製備抗體或其抗原結合片段的方法及載體，以及包含它們的套組及組合物，以及使用它們來檢測登革病毒及診斷及治療登革病毒病之方法。本發明進一步提供了對登革病毒專一的交叉反應性抗體，其可以與本文所述之任何血清型專一性抗體配對，用於免疫測定以檢測樣本中的登革病毒。

以下描述僅旨在說明本發明之各種具體實施例。因此，本文討論的具體具體實施例或修改不應解釋為對本發明範圍的限制。對於本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本發明之範圍的情況下，可以進行各種改變或等同物。

I. 定義

為了提供對本發明清楚及快速的理解，首先定義某些術語。在整個詳細描述中闡述了另外的定義。除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義之相同的含義。

如本文所用，單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指示物，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及「一個組件」包括多個這樣的組件及其本領域技術人員已知的等同物。

「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」等詞通常以包括(動詞)/包括(動名詞)的含義使用，其意味著允許存在一種或多種特徵、成分或組分。術語「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」包括術語「組成」或「由......組成」。

如本文所用，「多胜肽」乙詞係指由通過胜肽鍵連接的胺基酸殘基組成的聚合物。「蛋白質」乙詞通常係指相對較大的多胜肽。「胜肽」乙詞通常係指相對短的多胜肽(例如，含有至多100、90、70、50、30，或20個胺基酸殘基)。

如本文所用，「約」或「近似」等詞係指本領域普通技術人員將理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上變化，這取決於其所用之上下文。通常，「約」或「近似」可以表示在引用值附近具有±10%範圍的數值。

如本文所用，「基本上相同」乙詞係指兩個序列具有80%或更多，較佳為85%或更多，更佳為90%或更多，甚至更佳為95%或更多的同源性。

如本文所用，「抗體」乙詞(可互換地以複數形式使用)係指具有專一性結合特定目標抗原之能力的免疫球蛋白分子。如本文所用，「抗體」乙詞不僅包括完整的(即，全長的)抗體分子，還包括其保留抗原結合能力的抗原結合片段，例如，Fab、Fab'、F(ab')2及Fv。此類片段也是本領域熟知的，並且通常在體外及體內使用。「抗體」乙詞還包括人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體、多專一性抗體(例如，雙專一性抗體)，以及免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型，其包含具有所需專一性的抗原識別位點，包括抗體的糖基化變體、抗體的胺基酸序列變體，以及共價修飾的抗體。

一個完整或完全的抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。每條重鏈含有可變區(V_H )及第一、第二及第三恆定區(C_H 1、C_H 2及C_H 3)；每條輕鏈含有一可變區(V_L )及一恆定區(C_L )。抗體具有「Y」形狀，Y的莖部由透過雙硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二及第三恒定區所組成。Y的每個臂部包括與一單個輕鏈的可變區及恆定區結合的一單個重鏈的可變區及第一恆定區。該輕鏈的可變區及重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈中的可變區通常包含三個高度可變區，稱為互補決定區(complementarity determining regions，CDRs)；亦即，輕(L)鏈CDRs包括LC CDR1、LC CDR2，以及LC CDR3，以及重(H)鏈CDRs包括HC CDR1、HC CDR2，以及HC CDR3。三個CDRs由框架區(FR1、FR2、FR3，以及FR4)標記，其比該CDRs更高度保守並形成支持高變異區的支架。該重鏈及輕鏈的恆定區不負責抗原結合，但涉及各種效應子的功能。取決於其重鏈恆定結構域的抗體胺基酸序列，可以將免疫球蛋白分配到不同的類別。免疫球蛋白有五大類：IgA、IgD、IgE、IgG，以及IgM，其中一些可以進一步分為亞類(同種型)，例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ，以及μ。

如本文所用，「抗原結合結構域」或「抗原結合片段」等詞係指完整抗體分子中負責抗原結合的部分或區域。抗原結合片段能夠結合親本抗體結合的相同抗原。抗原結合片段的實例包括，但不限於：(i) Fab片段，其可以是由V_H -C_H 1鏈以及V_L - C_L 鏈組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段，其可以是由在鉸鏈區通過雙硫鍵連接的兩個Fab片段組成的二價片段；(iii) Fv片段，由透過非共價相互作用結合在一起的抗體分子的V_H 及V_L 結構域組成；(iv)單鏈Fv(scFv)，其可以是通過胜肽連接子由V_H 結構域及V_L 結構域組成的單一多胜肽鏈；(v) (scFv)₂ ，其可包含透過一胜肽連接子連接的兩個V_H 結構域，以及兩個V_L 結構域，其通過雙硫鍵與兩個V_H 結構域連結。

如本文所用，「嵌合抗體」乙詞係指含有來自不同來源(例如，不同物種)的多胜肽之抗體。於某些具體實施例中，在這些嵌合抗體中，輕鏈及重鏈的可變區可以模擬源自一種哺乳動物(例如，非人類哺乳動物，例如小鼠、兔及大鼠)的抗體的可變區，而恆定部分可以與衍生自另一種哺乳動物例如人類的抗體中的序列同源。

如本文所用，「人源化抗體」乙詞係指包含來自一人類抗體的一框架區以及來自一非人類(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一個或多個CDRs的抗體。

如本文所用，「人類抗體」乙詞係指其中基本上輕鏈及重鏈序列的完整序列(包括互補決定區(CDRs))來自人類基因的抗體。該人類抗體可包括一個或多個不由人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基，例如，透過一個或多個CDRs中的突變，或在一個或多個FRs中的突變，以便例如降低可能的免疫原性、增加親和力、消除可能導致不期望的折疊的半胱胺酸等。

如本文所用，「分離的」物質意指透過人類的手其已被從天然狀態改變。於某些具體實施例中，若本發明之多胜肽(例如，抗體)或核酸基本上不含細胞材料或化學前驅物或可能涉及胜肽/核酸製備過程的其他化學物/組成分時，則可以說它們是「分離的」或「純化的」。應當理解的是，「分離的」或「純化的」等詞不一定反映該胜肽被「絕對」分離或純化的程度，例如，透過去除所有其他物質(例如，雜質或細胞成分)。於某些情況下，例如，分離的或純化的多胜肽包括含有具有少於50%、40%、30%、20%或10% (按重量計)的其他蛋白質(例如，細胞蛋白質)的多胜肽的製劑，具有少於50%、40%、30%、20%或10% (按體積計)的培養基，或具有少於50%、40%、30%、20%或10% (按重量計)的化學前驅物或其他合成程序中涉及的化學物/組成分。

如本文所用，「專一性的結合」或「專一性地結合」等詞係指兩個分子之間的非隨機結合反應，例如抗體與其標靶抗原的表位之結合。「專一性地結合」標靶抗原或表位的抗體是本領域熟知的術語，確定這種專一性地結合的方法也是本領域熟知的。如果分子與其他標靶/表位相比更頻繁、更快速地、更長時間地及/或與特定標靶抗原或表位的親和力更強地反應或結合，則稱其表現出「專一性地結合」。如果抗體以比與其他物質結合的更大的親和力、親留力，更容易，及/或持續更長的時間結合，則抗體「專一性地結合」標靶抗原。換句話說，透過閱讀該定義還可以理解，例如，專一性結合第一標靶抗原的抗體可以或可以不專一性或優先的結合第二標靶抗原。因此，「專一性的結合」或「優先的結合」不一定需要(儘管它可以包括)排他性結合。通常但非必要地，對結合的提及意指專一性的/優先的結合。結合的親和力根據解離常數(K_D )來定義。通常，當針對抗體使用時專一性地結合可以指專一性地結合(識別)其標靶抗體，其KD值小於約10^~7 M，例如約10^~8 M或更低，例如約10^~9 M以下，約10^~10 M以下，約10^~n M以下，約10^~12 M以下，或甚至更低，以與K_D 對應的親和性結合特定標靶，比其與非專一性抗原(例如BSA或酪蛋白)結合的親和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍。

如本文所用，「交叉反應性」乙詞可以指抗體與不同蛋白質上的類似抗原位點反應的能力。例如，登革病毒血清型的交叉反應抗體可以意指這種抗體可以與登革病毒的一種以上血清型(例如，登革病毒的所有四種血清型)或甚至其它黃病毒例如茲卡病毒及/或日本腦炎病毒交叉反應(即結合抗體)，而不是僅與一種特定血清型的登革病毒發生專一性反應。

登革病毒是單鏈RNA病毒，其為黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)的成員。如本文所用，登革病毒係指登革病毒的任何血清型，包括登革病毒血清型第1型(DENV1)、登革病毒血清型第2型(DENV2)、登革病毒血清型第3型(DENV3)，以及登革病毒血清型第4型(DENV4)。那些不同的登革病毒血清型為遺傳相關的，但抗原性不同。免疫力為血清型專一性的，且血清型之間沒有交叉保護，即一種血清型的感染不能保護人類免受其他血清型的影響。血清型可透過本領域已知的常規方法測定，例如使用專一性引子組(TS1、TS2、TS3或TS4，連同D1)的RT-PCR，以擴增來自編碼登革病毒的衣殼及膜蛋白的區域的血清型專一性片段，例如Konogoi等人於Virology Journal (2016) 13:182所述。本技術中可獲得每種登革病毒血清型的典型菌株，例如DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241。

如本文所用，「登革病毒疾病」或「登革熱」等詞係指由登革病毒感染引起的疾病，通常由蚊子傳播。患有登革病毒感染的人類可能沒有任何徵兆，或有從輕微到嚴重的症狀。出現症狀時，通常在感染後3至14天開始。典型的登革熱(dengue fever，DF)經常出現發燒、頭痛、嚴重的肌肉及關節疼痛、噁心及皮疹，而嚴重形式(DHF/DSS)的特點是DF的所有症狀，伴隨出血表現(牙齦或鼻子，尿液，糞便或皮下出血)、嚴重的腹痛、持續性嘔吐、疲勞、煩躁或焦躁不安，如果不及時治療，可能會危及生命。

「NS1」、「NS1多胜肽」及「NS1蛋白」等詞在本文中可互換使用。NS1係指由登革病毒編碼的非結構性醣蛋白，其與細胞表面上的膜結合，且最早在症狀發作後1天釋放到體循環中，並且至少在感染後約9天可被偵測到。因此，NS1成為診斷登革熱感染的良好標記物，尤其是在早期階段。成熟形式的NS1含有352個胺基酸殘基，具有約40 kDa或更高的分子量，這取決於糖基化程度。NS1為血清型專一性的且來自不同登革病毒血清型的NS1的胺基酸序列為本領域已知且可獲得的，例如，來自DENV1的NS1 (DENV1 NS1)的SEQ ID NO: 91，來自DENV2的NS1 (DENV2 NS1)的SEQ ID NO: 92，來自DENV3的NS1 (DENV3 NS1)的SEQ ID NO: 93，以及來自DENV4的NS1 (DENV4 NS1)的SEQ ID NO: 94。NS1可以透過本領域已知的重組方法製備，或者可以從登革病毒的培養上清液中製備及收穫，例如，DENV1 Hawaii用於生產DENV1 NS1，DENV2 16681用於生產DENV2 NS1，DENV3 H87用於生產DENV3 NS1，DENV4 H241用於生產DENV4 NS1。

表1顯示了DENV1、DENV2、DENV3以及DENV4的NS1之示例性胺基酸序列。

「核酸」或「多核苷酸」等詞可以指由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如去氧核糖核酸(「DNA」)及核糖核酸(「RNA」)以及核酸類似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸類似物。多核苷酸可以例如使用自動DNA合成儀合成。應當理解的是，當核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示時，這也包括其中「U」取代的「T」 (即A、U、G、C)的RNA序列。「cDNA」乙詞係指以單鏈或雙鏈形式與mRNA互補或相同的DNA。

「互補」乙詞係指兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。因此，該兩個分子可以描述為互補的，此外接觸表面特徵彼此互補。當第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同時，第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列5'-TATAG-3'的多核苷酸與序列為5'-CTATA-3'的多核苷酸互補。

「編碼」乙詞係指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如，基因，cDNA，或mRNA)的固有特性，以作為在生物過程中合成其他聚合物及巨分子的模板，這些生物過程具有給定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或給定的胺基酸序列以及由此產生的生物學特性。因此，如果由基因產生的mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。本領域技術人員應當理解，由於遺傳密碼的簡併性，許多不同的多核苷酸及核酸可以編碼相同的多胜肽。還應理解的是，技術人員可以使用常規技術進行不影響由那裡描述的多核苷酸編碼的多胜肽序列的核苷酸取代，以反映其中表現多胜肽的任何特定宿主生物體使用的密碼子。因此，除非另有說明，「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此簡併形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。

「重組核酸」乙詞係指具有非天然連接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可以以載體的形式存在。「載體」可含有給定的目標核苷酸序列及調節序列。載體可用於表現給定的核苷酸序列(表現載體)或維持給定的核苷酸序列以使其複製、操作或在不同位置之間(例如，在不同生物體之間)轉移。為了上述目的，可以將載體引入合適的宿主細胞中。「重組細胞」係指已經向其中引入重組核酸的宿主細胞。「轉形細胞」係指通過重組DNA技術將編碼的目標蛋白質的DNA分子引入其中的細胞。

載體可以是各種類型，包括質體、黏質體、fosmids、附加體、人工染色體、噬菌體、病毒載體等。通常，在載體中，給定的核苷酸序列與調節序列可操作地連接，使得當載體導入宿主細胞時，給定的核苷酸序列可以在調節序列的控制下在宿主細胞中表現。調節序列可包含，例如但不限於，啟動子序列(例如，巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子、猿猴病毒40 (simian virus 40，SV40)早期啟動子、T7啟動子，以及醇氧化酶基因(AOX1 )啟動子)、起始密碼子、複製起點、增強子、分泌信號序列(例如，一α-交配因子信號)、終止密碼子，以及其他控制序列(例如，Shine-Dalgarno序列及終止序列)。較佳地，載體可以進一步含有標記序列(例如，一抗生素抗性標記序列)，用於隨後的篩選/選擇程序。為了蛋白質產生的目的，在載體中，給定的目標核苷酸序列可以與除上述調節序列之外的另一核苷酸序列連接，從而產生融合多胜肽並有益於隨後的純化過程。所述融合多胜肽包括用於純化的標籤，例如，His-tag。

本文所用之「個體」或「受試者」等詞包括人類及非人類動物，例如伴侶動物(例如狗，貓及其類似物)，農場動物(例如牛、羊、豬、馬及其類似物)，或實驗室動物(如大鼠、小鼠、豚鼠及其類似物)。

本文所用之「治療」乙詞係指將包括一種或多種活性劑的組合物施用或投予患有疾病、該疾病的症狀或病症或疾病進展的個體，目的為治療、治癒、減緩、緩解、改變、補救、改善，增進，或影響疾病、疾病的症狀或病症、由疾病引起的殘疾，或疾病的進展或其症狀或狀況。

本文所用之「有效量」乙詞係指在治療的個體或細胞中賦予所需生物效應的活性成分的量。有效量可以根據各種原因而改變，例如給藥途徑及頻率，接受所述藥物的個體的體重及種類，以及給藥目的。本領域技術人員可以基於本文的公開內容、已建立的方法及他們自己的經驗確定每種情況下的劑量。

II. 專一於登革病毒的抗體

本發明基於鑑定對登革病毒具有血清型專一性的許多分離的抗體，包括單株抗體12-4.1 (專一於DENV1)、單株抗體33-7.1 (專一於DENV2)、單株抗體43-1.3 (專一於DENV3)，以及單株抗體22-1.5 (專一於DENV4)。發現這些抗登革病毒抗體能夠識別登革病毒的一種特定血清型而不與其他血清型交叉反應。更特定而言，這些抗登革病毒抗體對不同血清型的登革病毒NS1蛋白具有專一性；即單株抗體12-4.1專一於源自DENV1的NS1多胜肽、單株抗體33-7.1專一於源自DENV2的NS1多胜肽、單株抗體43-1.3專一於源自DENV3的NS1多胜肽，而單株抗體22-1.5專一於源自DENV4的NS1多胜肽。發現這些抗登革病毒抗體在各種形式的免疫測定中是有效且可行的，用以檢測樣本中的登革病毒，具有優異的靈敏度及專一性。本發明還基於對登革病毒專一性交叉反應性抗體(單株抗體82-1.1)的鑑定，其與登革病毒的各種血清型交叉反應，包括DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4，並且可以與本文所述之任何血清型專一性抗體配對，該血清型專一性抗體用於免疫測定以檢測樣本中的登革病毒。

因此，本文描述了針對登革病毒的血清型專一性抗體，包括單株抗體12-4.1 (專一於DENV1)、單株抗體33-7.1 (專一於DENV2)、單株抗體43-1.3 (專一於DENV3)，以及單株抗體22-1.5 (專一於DENV4)，以及其功能變體。本文還描述了對登革病毒專一的交叉反應性抗體，包括單株抗體82-1.1 (與DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4交叉反應)及其功能變體。使用ELISA及西方墨點分析法測定這些單株抗體與DENV1-4的反應性。這些單株抗體的特徵如表2所示。單株抗體12-4.1、單株抗體33-7.1、單株抗體43-1.3、單株抗體22-1.5，以及單株抗體82-1.1各自的重鏈可變區(V_H )及輕鏈可變區(V_L )及其互補決定區(CDR1、CDR2、CDR3)的胺基酸序列如下表3所示。

單株抗體12-4.1的功能變體(專一於DENV1)(也稱為「對DENV1專一的第一抗體」，如本文所述)可包含： (a) 重鏈可變區(V_H )，其包含SEQ ID NO: 2的重鏈互補決定區(HC CDR1)，SEQ ID NO: 4的重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 6的重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b) 輕鏈可變區(V_L )，其包含SEQ ID NO: 9的輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)，SEQ ID NO: 11的輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 13的輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)，或其抗原結合片段。

於某些具體實施例中，該第一抗體包含含有SEQ ID NO: 71或與其基本上相同的胺基酸序列的V_H 以及含有SEQ ID NO: 72或與其基本上相同的胺基酸序列的V_L 。特定而言，該第一抗體包括含有與SEQ ID NO: 71具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_H ，以及含有與SEQ ID NO: 72具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_L 。該第一抗體還包括由編碼本文所述之相關V_H 或V_L 胺基酸序列的多核苷酸序列編碼的任何重組(工程化)衍生的抗體。

單株抗體33-7.1的功能變體(專一於DENV2)(也稱為「對DENV2專一的第二抗體」，如本文所述)可包含： (a) 重鏈可變區(V_H )，其包含SEQ ID NO: 16的重鏈互補決定區1(HC CDR1)，SEQ ID NO: 18的重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b) 輕鏈可變區(V_L )，其包含SEQ ID NO: 23的輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)，SEQ ID NO: 25的輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 27的輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)。

於某些具體實施例中，該第二抗體包含含有SEQ ID NO: 73或與其基本上相同的胺基酸序列的V_H 以及含有SEQ ID NO: 74或與其基本上相同的胺基酸序列的V_L 。特定而言，該第二抗體包括含有與SEQ ID NO: 73具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_H ，以及含有與SEQ ID NO: 74具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_L 。該第二抗體還包括由編碼本文所述之相關V_H 或V_L 胺基酸序列的多核苷酸序列編碼的任何重組(工程化)衍生的抗體。

單株抗體43-1.3的功能變體(專一於DENV3)(也稱為「對DENV3專一的第三抗體」，如本文所述)可包含： (a) 重鏈可變區(V_H )，其包含SEQ ID NO: 30的重鏈互補決定區1(HC CDR1)，SEQ ID NO: 32的重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 34的重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b) 輕鏈可變區(V_L )，其包含SEQ ID NO: 37的輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)，SEQ ID NO: 39的輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 41的輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)。

於某些具體實施例中，該第三抗體包含含有SEQ ID NO: 75或與其基本上相同的胺基酸序列的V_H 以及含有SEQ ID NO: 76或與其基本上相同的胺基酸序列的V_L 。特定而言，該第三抗體包括含有與SEQ ID NO: 75具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_H ，以及含有與SEQ ID NO: 76具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_L 。該第三抗體還包括由編碼本文所述之相關V_H 或V_L 胺基酸序列的多核苷酸序列編碼的任何重組(工程化)衍生的抗體。

單株抗體22-1.5的功能變體(專一於DENV4)(也稱為「對DENV4專一的第四抗體」，如本文所述)可包含： (a) 重鏈可變區(V_H )，其包含SEQ ID NO: 44的重鏈互補決定區1(HC CDR1)，SEQ ID NO: 46的重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 48的重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b) 輕鏈可變區(V_L )，其包含SEQ ID NO: 51的輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)，SEQ ID NO: 53的輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 55的輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)。

於某些具體實施例中，該第四抗體包含含有SEQ ID NO: 77或與其基本上相同的胺基酸序列的V_H 以及含有SEQ ID NO: 78或與其基本上相同的胺基酸序列的V_L 。特定而言，該第四抗體包括含有與SEQ ID NO: 77具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_H ，以及含有與SEQ ID NO: 78具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_L 。該第四抗體還包括由編碼本文所述之相關V_H 或V_L 胺基酸序列的多核苷酸序列編碼的任何重組(工程化)衍生的抗體。

單株抗體82-1.1的功能變體(也稱為「對DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4專一的第五抗體」，如本文所述)可包含： (a) 重鏈可變區(V_H )，其包含SEQ ID NO: 58的重鏈互補決定區1(HC CDR1)，SEQ ID NO: 60的重鏈互補決定區2 (HC CDR2)，以及SEQ ID NO: 62的重鏈互補決定區3 (HC CDR3)；以及 (b) 輕鏈可變區(V_L )，其包含SEQ ID NO: 65的輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)，SEQ ID NO: 67的輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)，以及SEQ ID NO: 69的輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)。

於某些具體實施例中，該第五抗體包含含有SEQ ID NO: 79或與其基本上相同的胺基酸序列的V_H 以及含有SEQ ID NO: 80或與其基本上相同的胺基酸序列的V_L 。特定而言，該第五抗體包括含有與SEQ ID NO: 79具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_H ，以及含有與SEQ ID NO: 80具有至少80% (例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列的V_L 。該第五抗體還包括由編碼本文所述之相關V_H 或V_L 胺基酸序列的多核苷酸序列編碼的任何重組(工程化)衍生的抗體。

「基本上相同」乙詞可以意指變體的相關胺基酸序列(例如，在FRs、CDRs、V_H 或V_L 中)與參考抗體相比無基本上不同，使得該變體具有基本相似於該參考抗體的結合活性(例如，親和力、專一性或兩者)及生物活性。這種變體可包括微小的胺基酸變化。可以理解的是，多胜肽可以具有有限數量的變化或修飾，這些變化或修飾可以在與其活性或功能無關的多胜肽的某一部分內進行，且仍然產生具有可接受水平的等同或類似生物活性或功能的變體。於某些實例中，胺基酸殘基的變化為保守胺基酸取代，係指與另一個胺基酸殘基相似的化學結構的胺基酸殘基及多胜肽的功能、活性或其他生物學效應對性質的影響較小或基本沒有影響。通常，與CDR區域相比，可以在FR區域中進行相對更多的取代，只要它們不會對抗體的結合功能及生物活性產生不利影響(例如，相較於原始抗體，降低結合親和力超過50%)。於某些具體實施例中，參考抗體及變體之間的序列同一性可為約80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%，或更高。可以根據本領域普通技術人員已知的改變多胜肽序列的方法製備變體，例如在依循這些方法的參考文獻中發現的那些，例如， Molecular Cloning：A Laboratory Manual, J. Sambrook等人編輯，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989年。例如，胺基酸的保守取代包括在下列群組中的胺基酸之間進行：(i) A、G；(ii) S、T；(iii) Q、N；(iv) E、D；(v) M、I、L、V；(vi) F、Y、W；以及(vii) K、R、H。

本文描述的抗體可為動物抗體(例如，小鼠衍生的抗體)、嵌合抗體(例如，小鼠-人類嵌合抗體)、人源化抗體，或人類抗體。本文描述的抗體可為單株抗體或多株抗體。「單株抗體」係指同源抗體群，「多株抗體」係指異源抗體群。本文描述的抗體還可包括其抗原結合片段，例如，Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段，單鏈Fv (scFv)及(scFv)₂ 。抗體或其抗原結合片段可通過本領域已知之方法製備。

III. 抗體之製備

本領域常規的許多方法可用於獲得抗體或其抗原結合片段。

於某些具體實施例中，本文提供的抗體可以通過常規融合瘤技術製備。通常，目標抗原，例如，登革病毒NS1蛋白，可選擇地與一載體蛋白耦合，例如，鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)及/或與佐劑混合，例如完全弗氏佐劑，可用於免疫宿主動物以產生與該抗原結合的抗體。收穫分泌單株抗體的淋巴細胞並與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。然後篩選以這種方式形成的融合瘤細胞株以鑑定及選擇分泌所需單株抗體的那些細胞株。

於某些具體實施例中，本文提供之抗體可以通過重組技術製備。在相關方面，還提供了編碼所公開的胺基酸序列的分離的核酸，以及包含此類核酸的載體及以該核酸轉型或轉染之宿主細胞。

例如，可以將包含編碼這種抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的核酸選殖到表現載體中(例如，細菌載體，例如大腸桿菌載體、酵母載體、病毒載體或哺乳動物載體)，通過常規技術，可以將任何載體引入合適的細胞(例如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞，或哺乳動物細胞)中以表現該抗體。編碼如本文所述之抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的實例如下表3中所示。哺乳動物宿主細胞株的實例為人類胚腎細胞株(293細胞)、幼倉鼠腎細胞(BHK細胞)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、非洲綠猴腎細胞(VERO細胞)，以及人類肝細胞(Hep G2細胞)。用於表現本文所述抗體的重組載體通常含有編碼該抗體胺基酸序列的核酸，該核酸與一啟動子，無論是組成型還是誘導型，可操作地連接。典型的載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列，以及可用於調節編碼抗體的核酸表現的啟動子。載體可選擇地含有原核及真核系統的選擇標記。於某些實例中，重鏈及輕鏈編碼序列都包括在相同的表現載體中。在其他實例中，將抗體的每個重鏈及輕鏈選殖到單個載體中並單獨產生，然後可以在合適的條件下培養抗體組裝。

用於表現本文所述抗體的重組載體通常含有編碼該抗體胺基酸序列的核酸，該核酸與一啟動子，無論是組成型還是誘導型，可操作地連接。重組抗體可以在原核或真核表現系統中產生，例如細菌、酵母、昆蟲及哺乳動物細胞。典型的載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及可用於調節編碼抗體的核酸表現的啟動子。載體可選擇地含有原核及真核系統的選擇標記。可以進一步分離或純化產生的抗體蛋白，以獲得基本上同質的製劑，用於進一步的測定及應用。合適的純化方法，例如，可包括在免疫親和或離子交換管柱上的分餾、乙醇沉澱、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、高效液相色層分析(high-performance liquid chromatography，HPLC)，硫酸銨沉澱，以及凝膠過濾。

當需要全長抗體時，本文所述之任何V_H 及V_L 鏈的編碼序列可以與免疫球蛋白的Fc區的編碼序列連接，且所得到的編碼全長抗體重鏈及輕鏈的基因可以在合適的宿主細胞中表現及組裝，例如植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞，或昆蟲細胞。

可以透過常規方法製備抗原結合片段。例如，可以透過胃蛋白酶消化全長抗體分子產生F(ab')₂ 片段，並且可以透過還原F(ab')₂ 片段的雙硫鍵來製備Fab片段。或者，此類片段的製備也可透過重組技術透過在合適的宿主細胞中表現重鏈及輕鏈片段並使它們在體內或體外組裝以形成所需的抗原結合片段。透過連接編碼重鏈可變區的核苷酸序列及編碼輕鏈可變區的核苷酸序列，可以透過重組技術製備單鏈抗體。較佳地，在兩個可變區之間引入柔性連接子。

IV. 抗體之應用

本發明之血清型專一性抗體對各登革病毒血清型是專一的，且每種血清型皆不與任何其他密切相關的黃病毒反應，如日本腦炎(JE)病毒以及滋卡病毒(ZIKV)。因此，本發明提供了一種使用任何揭露抗體或其任何組合之方法，其可以有效地用於檢測樣本中的登革病毒。

通常，本發明之方法包含使樣本與任何揭露抗體或其任何組合接觸，並測定抗體與該樣本的結合。具體而言，抗體與該樣本的結合包括(i)第一抗體與DENV1 NS1的結合並形成第一抗體-DENV1 NS1複合物，(ii)第二抗體與DENV2 NS1的結合並形成第二抗體-DENV2 NS1複合物，(iii)第三抗體與DENV3 NS1的結合並形成第三抗體-DENV3 NS1複合物，以及(iv)第四抗體與DENV4 NS1的結合並形成第四抗體-DENV4 NS1複合物。本發明之方法還包含基於抗體與樣本的結合確定是否存在特定血清型登革病毒，其中(i)第一抗體與DENV1 NS1的結合並形成第一抗體-DENV1 NS1複合物表示該樣本中存在DENV1，(ii)第二抗體與DENV2 NS1的結合並形成第二抗體-DENV2 NS1複合物表示該樣本中存在DENV2，(iii)第三抗體與DENV3 NS1的結合並形成第三抗體-DENV3 NS1複合物表示該樣本中存在DENV3，且(iv)第四抗體與DENV4 NS1的結合並形成第四抗體-DENV4 NS1複合物表示該樣本中存在DENV4。

本領域普通技術人員已知使用抗體以檢測樣本中的抗原或病原體的各種測定形式。使用對目標抗原/病原體專一的抗體的這些測定通常稱為免疫測定。免疫測定的實例包括，但不限於，酶聯結免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、螢光免疫測定(FIA)、發光免疫測定(LIA)，或ILMA免疫螢光測定。這些測定法可用於檢測生物樣本中登革病毒的存在，包括血液、血清、血漿、唾液、腦脊髓液、尿液及其他組織樣本。

在某些具體實施例中，該測定為夾心式測定。

於某些具體實施例中，透過首先將捕獲抗體固定在固體支持物上來進行測定。然後將固定的抗體與生物樣本一起培養，且該登革病毒或其目標抗原例如，使NS1多胜肽(如果存在於樣本中)與該抗體結合，以形成抗體-病毒/抗原複合物或綴合物。然後可以透過以合適的緩衝液，例如含有0.05% Tween的PBS，洗滌該固體支持物來除去未結合的樣本，且添加偵測抗體至該固體支持物中，該偵測抗體可以結合該固定的抗體-病毒/抗原複合物並包含可偵測到的標記。特定而言，該捕獲抗體及該偵測抗體需要在不同表位結合該病毒/抗原，使得該病毒/抗原可以「夾在」這兩種抗體之間。較佳的可偵測到的標記包括酶標記(例如辣根過氧化物酶)、螢光標記、金屬標記以及放射性標記。可偵測到的標記的一些特定實例包括金奈米顆粒、有色乳膠珠、磁性顆粒、碳奈米顆粒，以及硒奈米顆粒。將偵測抗體與固定的抗體-病毒/抗原複合物一起培養至足以檢測結合的病毒/抗原的一段時間。然後除去未結合的偵測抗體，並基於可偵測到的標記檢測結合的偵測抗體。例如，通常可以透過添加基質，然後對反應產物進行光譜或其他分析來檢測酶標記。

為了確定樣本中目標登革病毒的存在或不存在，通常將從與固體支持物結合的可偵測到的標記檢測到的信號與對應於截斷值的信號進行比較。該截斷值通常是當固定化抗體與來自未感染個體的樣本一起培養時獲得的平均值信號。通常，產生高於截斷值信號的樣本被認為是對樣本中存在登革病毒的陽性反應。

本發明之血清型專一性抗體可作為捕獲或偵測抗體，與配偶體抗體配對，以形成抗體對而可進行夾心式測定。如本文所述之配偶體抗體還需要能夠結合目標病毒/抗原，但是與用於進行夾心式測定之配對的本發明之任何血清型專一性抗體不同的表位結合。於某些具體實施例中，用於進行夾心式測定的配偶體抗體可以是對不同於本文所述之登革病毒具有不同「血清型專一性」的抗體(亦即，不同於第一抗體、第二抗體、第三抗體及第四抗體)，該配偶體抗體也能夠與登革病毒的相應血清型結合但在不同的表位上結合。於某些具體實施例中，配偶體抗體可以是「血清型交叉反應性」抗體，其為多株或單株抗體，其可以識別所有登革病毒血清型但在不同於本發明之任何血清型專一性抗體的表位。這種交叉反應抗體的一個特定實例為第五抗體(例如，單株抗體82-1.1)，其與至少四種登革病毒血清型交叉反應並識別與本發明之任何血清型專一性抗體不同的單獨表位，從而與其形成配對，以進行夾心式測定。

於某些具體實施例中，用於檢測樣本中的登革病毒的本發明之方法包含 (i) 使該樣本與對登革熱NS1多胜肽(對於四種血清型)專一的交叉反應性抗體接觸(例如，對DENV1 NS1、DENV2 NS1、DENV3 NS1及DENV4 NS1專一的第五抗體)，作為捕獲抗體，形成交叉反應抗體-NS1 (任何血清型)複合物； (ii) 使交叉反應抗體-NS1多胜肽(任何血清型)複合物與如本文所述之血清型專一性單株抗體接觸(例如，專一於DENV1 NS1的第一抗體、專一於DENV2 NS1的第二抗體、專一於DENV3 NS1的第三抗體，或專一於DENV4 NS1的第四抗體)，作為偵測抗體，以形成交叉反應抗體-NS1 (任何血清型)-血清型專一性單株抗體複合物；以及 (iii) 檢測交叉反應抗體-NS1 (任何血清型)-血清型專一性單株抗體複合物的存在，從而檢測樣本中各自血清型登革病毒的存在。

於某些具體實施例中，用於檢測樣本中的登革病毒的本發明之方法包含 (i) 使該樣本與本文所述之血清型專一性單株抗體接觸(例如，專一於DENV1 NS1的第一抗體、專一於DENV2 NS1的第二抗體、專一於DENV3 NS1的第三抗體，或專一於DENV4 NS1的第四抗體)，作為捕獲抗體，以形成單株抗體-血清型專一性NS1複合物； (ii) 使該單株抗體-各自的血清型登革病毒複合物與對登革熱NS1多胜肽(對於四種血清型)專一的交叉反應性抗體接觸(例如，對DENV1 NS1、DENV2 NS1、DENV3 NS1及DENV4 NS1專一的第五抗體)，作為偵測抗體，以形成單株抗體-血清型專一性NS1-交叉反應抗體複合物；以及 (iii) 檢測該血清型專一性單株抗體-NS1-交叉反應性抗體複合物的存在，從而檢測樣本中各自血清型登革病毒的存在。

在一實例中，本發明之方法在ELISA夾心式測定中進行。在該測定中，將捕獲抗體包覆在ELISA板上。阻隔後，將該ELISA板與生物樣本一起培養、洗滌，然後與偵測抗體一起培養。例如，捕獲抗體為對登革熱NS1多胜肽(任何血清型)專一的多株或單株交叉反應抗體，且偵測抗體為專一於DENV1 NS1的第一抗體、專一於DENV2 NS1的第二抗體、專一於DENV3 NS1的第三抗體，或專一於DENV4 NS1的第四抗體，或其任何組合，如本文所述，且使用一ELISA比色的TMB試劑進行該ELISA板的顯色。

於另一實例中，本發明之方法以流通或側流形式進行。在該測定中，將具有可偵測到的標記，如比色標記(例如，膠體金)之偵測抗體固定在膜上，例如硝酸纖維素膜(作為條帶)。將懷疑含有所述登革病毒的生物樣本施加到存在偵測抗體的膜上。該生物樣本沿著該膜遷移，通過含有該偵測抗體的區域，其中如果該登革病毒存在於生物樣本中，該偵測抗體會與該登革病毒的NS1結合。然後，偵測抗體以及其所結合的抗原的複合物遷移到固定有捕獲抗體的測試區域，該捕獲抗體並結合登革病毒的NS1，從而形成偵測抗體、抗原及捕獲抗體的夾心。測試(捕獲)區域處的偵測抗體的濃度/聚集表示該樣本中存在專一性登革熱NS1。這種測試通常可以使用非常少量的生物樣本進行。

在一相關方面，本發明還提供了用於實施本發明方法之套組，其包含如本文所述之任何抗體或其組合。該套組可以進一步包含使用該套組檢測樣本中登革病毒的說明書。

於某些具體實施例中，該免疫測定為夾心形式。

具體而言，該套組包含一對登革病毒血清型專一性抗體，其選自由專一於DENV1 NS1的第一抗體、專一於DENV2 NS1的第二抗體、專一於DENV3 NS1的第三抗體，以及專一於DENV4 NS1的第四抗體，及其任何組合所組成之群組，每種抗體與配偶體抗體配對以進行夾心式測定。

於某些具體實施例中，至少一種血清型專一性抗體作為捕獲抗體，與作為偵測抗體的配偶體抗體配對。

於其他具體實施例中，至少一種血清型專一性抗體作為偵測抗體，與作為捕獲抗體的配偶體抗體配對。

作為一偵測抗體，該抗體可包含可偵測到的標記，例如酶標記、螢光標記、金屬標記及放射性標記。

於某些實例中，在一側向流動形式中，該套組包含測定條帶(例如，硝酸纖維素膜)；偵測抗體可以與該條帶的反應區結合，且捕獲抗體可以結合於該條帶的測試區中。該條帶還包含樣本墊，其中放置體液樣本，然後該樣本通過毛細管作用向條帶的相對端遷移，藉此該樣本首先在該反應區中與該偵測抗體結合，其中在該樣本中的抗原與該偵測抗體結合形成抗原-偵測抗體複合物，然後該抗原-偵測抗體複合物在該測試(捕獲)區中與該捕獲抗體結合。使用膠體金作為偵測抗體的可偵測到的標記，例如，在該測試(捕獲)區域的檢測標記的濃度/聚集顯示紅色，表示該樣本中存在專一性抗原。或者，該測試區可具有發色基質，且當該抗原-偵測抗體複合物與該捕獲抗體結合時，該發色基質轉化為可見的有色產物。

於某些實例中，在ELISA形式中，該套組包含微量滴定盤，其具有固定有捕獲抗體的孔；含有偵測抗體的溶液；以及發色顯影劑。

具體而言，該套組可以進一步包含額外的試劑或緩衝液、用於從個體收集生物樣本的醫療裝置，及/或用於保持及/或儲存樣本的容器。

於進一步的具體實施例中，本發明提供了包含一種或多種如本文所述抗體及醫藥上可接受的載體之組合物。

於某些具體實施例中，本發明之組合物係用於治療登革病毒疾病之醫藥組合物。

於某些具體實施例中，本發明之組合物係用於診斷登革病毒疾病之診斷組合物。

如本文所用，「醫藥上可接受的」係指載體與組合物中的活性成分相容，且較佳地可以穩定該活性成分並對接受治療的個體是安全的。該載體可以是活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或基質。合適的賦形劑的一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。該組合物可另外包含潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑，如甲基及羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；及調味劑。本發明之組合物可以在給予患者後提供活性成分的快速、持續或延遲釋放的效果。

根據本發明，該組合物的形式可以為片劑、丸劑、粉末、錠劑、小包、片劑、酏劑、懸浮液、洗劑、溶液、糖漿、軟及硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液及包裝粉末。

本發明之組合物可通過任何生理學上可接受的途徑遞送，例如口服、腸胃外(例如肌肉內、靜脈內、皮下及腹膜內)、透皮、栓劑及鼻內方法。關於腸胃外給藥，較佳以無菌水溶液的形式使用，其可包含足以使溶液與血液等滲的其他物質，例如鹽或葡萄糖。根據需要，可以適當地緩衝水溶液(較佳pH值為3至9)。在無菌條件下製備合適的腸胃外組合物可以使用本領域技術人員熟知的標準藥理學技術完成，且不需要額外的創造性勞動。

透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了說明而非限制。根據本發明公開的內容，本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下，可以對所公開的特定具體實施例進行許多改變並仍然獲得相同或相似的結果。

實施例

1.1 病毒株

登革病毒株DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241在補充有2% FBS的RPMI 1640培養基中在C6/36白線斑蚊中繁殖，並於28°C下培養直至觀察到細胞病變效應。作為對照組，日本腦炎病毒株JEV SA14-14-2在含有2% FBS的RPMI 1640培養基中的BHK-21細胞中繁殖。透過接種BHK-21細胞的噬斑測定法測定每種病毒的數量。

1.2 NS1 蛋白之製備

在5天後收穫感染病毒(DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87及DENV4 H241)的Vero細胞的細胞培養物上清液，並以UV照射不活化。為了純化細胞培養物上清液中可溶形式的NS1蛋白，我們根據製造商的說明書進行了管柱免疫親和層析。為此，將已經固定在HiTrap^TM NHS活化的HP管柱(GE Healthcare公司，Uppsala，瑞典)上的抗NS1單株抗體(針對所有血清型)用於從每種登革熱血清型中純化NS1蛋白。以5倍體積的PBS平衡管柱，將病毒細胞培養物上清液通過免疫親和管柱，以10倍體積的PBS洗去未結合的蛋白質，並使用pH為2.8的甘胺酸溶液洗脫結合的NS1，然後緩衝至中性pH。然後通過西方墨點分析檢測純化的DENV NS1蛋白，並使用Pierce BCA蛋白質測定套組(Thermo Fisher Scientific公司，伊利諾州，美國)測定NS1蛋白質濃度。

1.3 專一於 DENV1-4 NS1 的血清型專一性單株抗體之產生及特徵描述

所有實驗均使用購自國家實驗動物中心並在預防醫學研究所的動物飼養設施中飼養的BALB/c小鼠。使用動物的實驗由國際實驗動物管理評估及認證協會(IACUC編號AN-104-12、AN-105-05)許可。將4週齡的BALB/c小鼠進行腹腔免疫，以存在於完全弗氏佐劑中的15 μg免疫親和純化的NS1蛋白進行第一次接種，然後以存在於不完全弗氏佐劑中的15 μg NS1蛋白針對各自的血清型免疫小鼠，用於隨後的加強免疫。在連續攻擊後從小鼠獲得DENV專一性抗血清。簡言之，除去免疫小鼠的脾臟。將脾細胞與NSI/1-Ab4-1骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤細胞，其根據標準程序選擇(Kohler及Milstein，1975年)。融合細胞以RPMI洗滌兩次，然後在15 ml錐形管中混合，並於1分鐘內在溫和攪拌下加入1 ml 50% (w/v) PEG 1500 (Roche公司，Penzberg，德國)。透過緩慢(1分鐘)加入1 ml RPMI稀釋混合物兩次，然後緩慢加入(2分鐘) 8 ml無血清RPMI。然後將混合物在400 xg下離心5分鐘。將融合的細胞沉澱物重新懸浮於補充有20% FBS的HAT培養基(Life technologies公司，Burlington，安大略省，加拿大)以及HFCS溶液(Roche公司，Mannhein，德國)的RPMI中。接下來，以每孔200 μl的量將重新懸浮混合物分配在96孔板中。透過間接ELISA (使用純化的DENV NS1作為每種血清型的包覆抗原)鑑定分泌針對NS1的專一性抗體的融合瘤細胞株。通過有限稀釋產生單株細胞。進行來自以DENV感染的C6/36細胞的裂解物的西方墨點分析以確定(a) 抗NS1單株抗體的專一性，以及(b) 抗體識別的表位是否為構象或線性的。使用市售的小鼠單株抗體同種型套組(IsoStrip^TM ，Roche公司，Mannheim，德國)對單株抗體進行同種型分型。將融合瘤細胞注射到姥鮫烷引發的BALB/c小鼠中以產生腹水。然後根據製造商的說明書使用蛋白G-sepharose管柱(HiTrap protein G，GE Healthcare公司，Uppsala，瑞典)從腹水中純化單株抗體。

1.4 HRP 結合

為了將單株抗體與HRP (Innova Biosciences公司，劍橋，英國)綴合，將100 μg HRP及20 μl等分試樣的修飾試劑與200 μl 1mg/ml單株抗體混合。在室溫(20-25°C)下將混合物培養3小時後，以20 μl等份的猝滅劑終止反應。在室溫下再作用30分鐘後，加入260 μl甘油，最終溶液於-20°C保存。單株抗體-HRP的終濃度為400 μg/ml。

1.5 開發四種血清型專一性 NS1 捕獲 ELISA

基於抗NS1單株抗體的特徵選擇幾種血清型專一性及高反應性單株抗體。通過與血清型-交叉反應性單株抗體的相容性測試四種血清型專一性單株抗體的捕獲ELISA形式的血清型專一性抗體。為了確定捕獲ELISA關於測定靈敏度的最佳組合，將血清型專一性單株抗體及血清型-交叉反應性單株抗體作為捕獲或偵測抗體。特定而言，選擇血清型-交叉反應性單株抗體作為捕獲抗體，並確定與作為偵測抗體的相應四種血清型專一性單株抗體(單株抗體12-4.1、單株抗體33-7.1、單株抗體43-1.3及單株抗體22-1.5)的最佳配對，組裝登革熱四種血清型NS1的ELISA，如圖1A、圖1B、圖2A及圖2B所示。透過棋盤滴定測定最合適的實驗條件，例如包覆濃度及單株抗體-HRP的稀釋度。將微孔板(Costar Corning公司，Corning，紐約)以100 μl的10 μg/ml捕獲交叉反應性單株抗體包覆，並於4°C培養整夜。隨後以封閉緩衝液(PBS，0.05% Tween，5%脫脂奶粉)於37°C下阻隔孔井1小時，並以洗滌緩衝液(PBS，0.05% Tween)洗滌。然後以阻隔緩衝液連續稀釋病毒培養上清液或NS1蛋白，並於37°C下培養1小時。洗滌孔板後，加入100 μl的0.8 μg/ml血清型專一性單株抗體-HRP，將孔板於37°C下培養1小時。然後，再次洗滌孔板，加入100 μl TMB試劑，將孔板於室溫下培養10分鐘。然後以1N硫酸終止反應，並使用微孔板自動讀取儀在450 nm波長處讀取吸光度。

1.6 臨床樣本

本研究共使用146份臨床血清樣本；85例樣本包含已向台北市衛生署疾病控制中心報告的確診登革熱病例，以及61例樣本為2016-2017年期間從三家醫院所收集(國軍高雄總醫院、國軍高雄總醫院左營分院，以及國軍高雄總醫院岡山分院)。在急性期(疾病發病後1-7天)收集所有臨床血清樣本，並以血清型專一性一步法SYBR green I即時RT-PCR，登革病毒專一性IgM/IgG捕獲ELISA及市售Platelia Dengue NS1 Ag ELISA套組(Bio-Rad公司，Marnes-la-Coquette，法國)進行測試。研究方法經國軍高雄總醫院機構審查委員會(IRB編號KAFGH 104-048)批准。

1.7 使用血清型專一性 NS1 捕獲 ELISA 檢測 NS1 的臨床血清

將微孔板以100 μl的10 μg/ml的交叉反應性單株抗體包覆，並於4°C培養整夜。隨後以阻隔緩衝液(PBS，0.05% Tween，5%脫脂奶粉)阻隔孔井，並與50 μl在阻隔緩衝液中以1：1比例稀釋的血清於37°C下培養1小時。然後將孔板以0.05% PBS/T洗滌四次，於37°C下與100 μl的0.8 μg/ml血清型專一性單株抗體-HRP (單株抗體12-4.1、單株抗體33-1.7、單株抗體43-1.3及單株抗體22-1.5)一起培養1小時，再次洗滌四次。臨床血清測試中涉及的後續步驟如前一節所述。正常人類血清樣本(Sigma-Aldrich公司，Saint Louis，美國)作為陰性對照組。對於每種血清型，超過參考截斷值的樣本(以陰性對照的雙倍平均值計算)在NS1捕獲ELISA中被認為是陽性的。

1.8 透過市售的 Platelia Dengue NS1 Ag ELISA 套組檢測 NS1 抗原 (Bio-Rad 公司， Marnes-la-Coquette ，法國 )

根據製造商的說明，使用市售的Platelia Dengue NS1 Ag ELISA套組(Bio-Rad公司，Marnes-la-Coquette，法國)在臨床血清樣本中檢測DENV NS1蛋白。簡言之，將陽性、陰性，校準及樣本的稀釋液在具有HRP綴合的單株抗體的孔板上於37°C培養90分鐘。將孔板洗滌六次後，向每個孔中加入160 μl TMB，並將孔板在室溫下遠離光線下培養30分鐘。通過加入100 μl終止溶液終止酶反應，並在OD 450/620 nm波長下測量光密度。

1.9 再現性

於另一天由第二位操作者以四血清型NS1捕獲ELISA測試總共58個DENV陽性血清樣本(16個DENV1血清樣本、17個DENV2血清樣本、16個DENV3血清樣本，以及9個DENV4血清樣本)以及50個陰性血清樣本。

1.10 統計分析

使用GraphPad Prism 6.0版(GraphPad軟體公司，San Diego，加州)進行每種ELISA的診斷準確性、靈敏度、專一性及相應的95%信賴區間(CI95)，顯著性標準設定為P值＜0.05。

1.11 膠體金探針 之製備

使用35±5nm的膠體金(TANBead NanoGold-40，Taiwan Advanced Nanotech公司)進行IgG的綴合。以0.2N NaOH調節膠體金溶液(1% w/v)的pH值，並將抗登革熱的NS1單株抗體82-1.1(在PBS中，pH7.4)加入到pH調節的膠體金溶液中。每種血清型綴合的最合適的pH值為：D1條帶，pH 7.8；D2、D3及D4條帶，pH7.4。用於綴合的優化抗體濃度為1 μg/條帶。將抗體/膠體金混合物輕輕混合90分鐘，以2% BSA溶液阻隔30分鐘，並以7000 rpm離心15分鐘。離心後以2% BSA (含有2%[w/v] BSA的20 mM Tris/HCl緩衝液[pH7.2])洗滌一次後，將金顆粒懸浮在2% BSA中。將這種抗登革熱NS1單株抗體82-1.1塗層膠體金探針放入墊中乾燥，然後於4°C下保存整夜。

1.12 側流試紙 之製備

對照線如下製備：0.2 (針對D1、D3及D4)至0.32 (針對D2) μg/條帶的山羊抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch公司，賓州，美國)。如下製備測試線(捕獲抗體)：單株抗體12-4.1、單株抗體43-1.3、單株抗體22-1.5作用強度為0.75 μg/條帶(針對D1、D3、D4條帶)在PBS (pH 7.4)中，以及單株抗體33-7.1作用強度為0.8 μg/條帶(針對D2條帶)在PBS (pH 7.4)中，分別施加到醋酸纖維素負載的硝酸纖維素膜條帶(孔徑：12 μm直徑)的頂端附近，並在室溫下乾燥1小時。組成分處理後，組裝登革熱血清型NS1側流試驗裝置。

1.13 條帶上 NS1 抗原之檢測及檢測靈敏度

透過將樣本(50 μl)的適當測試DENV NS1蛋白溶液及50 μl運行緩衝液(0.1% Tween-20/0.85% NaCl)施加到裝置的樣本墊來進行測定。測試DENV NS1及檢測試劑的組合溶液升高膜，並且在室溫下20分鐘後膠體金沉積在固相抗體的位點。

1.14 DENV 血清型 NS1 條帶的交叉反應性

以DENV血清型NS1條帶測定以病毒(DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87、DENV4 H241、日本腦炎病毒以及茲卡病毒)感染的Vero細胞的細胞培養物上清液以評估交叉反應性。

1.15 單株抗體可變區之序列分析

來自融合瘤12-4.1、33-7.1、43-1.3、22-1.5及82-1.1的融合瘤細胞。使用RNeasy mini套組(Qiagen公司，Valencia，加州，美國)根據製造商的方法從融合瘤細胞株中分離總RNA，然後使用oligo dT引子進行反轉錄以產生cDNA。使用PCR擴增抗體的重鏈及輕鏈可變鏈，並確認該序列為功能可變區。四種融合瘤細胞的V_H 及V_L 基因，參見附件之序列。

2. 結果

2.1 針對 DENV 的單株抗體之產生及特徵描述

製備來自各種血清型DENV的NS1蛋白，並注射到BALB/c小鼠中進行免疫。從免疫小鼠中取出脾臟，分離脾細胞並與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤細胞。透過ELISA使用純化的DENV NS1作為每種血清型的包覆抗原鑑定分泌針對NS1的專一性抗體的融合瘤細胞株。另外，進行來自以DENV感染的C6/36細胞的裂解物的西方墨點分析以確定(a)抗NS1單株抗體的專一性及(b)抗體識別的表位是否為構象或線性的。此外，使用商業套組對單株抗體進行同種型分型。

表2. 與DENV血清型(D1-4)的NS1蛋白反應的單株抗體之特徵描述

^a 以不同登革病毒血清型感染的C6/36細胞裂解物以SDS-PAGE樣本緩衝液處理，並以每種單株抗體進行墨點分析。^b 從以不同血清型DENV感染的Vero細胞的細胞培養物上清液中免疫親和純化不同的NS1抗原。以專一性NS1抗原包覆微孔板並與每種單株抗體反應。

如表2所示，第1至第4選殖株12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5分別為DENV1、DENV2、DENV3及DENV4專一性血清型，而第5選殖株，單株抗體82- 1.1，與DENV1、DENV2、DENV3以及DENV4交叉反應。

四種血清型專一性單株抗體(12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5)及交叉反應性單株抗體(82-1.1)的胺基酸序列，包括互補決定區1-3 (測定V_H 及V_L 結構域的CDR 1-3)及框架區1-4 (FW1-4)及相應的核酸序列，並提供於以下表3中。

表3. 四種血清型專一性單株抗體(12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5)及交叉反應性單株抗體(82-1.1)的胺基酸序列及相應的核酸序列。

2.2 夾心 ( 捕獲 )ELISA

2.2.1 以血清型專一性單株抗體作為捕獲抗體

將本發明之四種血清型專一性單株抗體作為夾心(捕獲)ELISA中的捕獲抗體。圖1A顯示了使用本發明之血清型專一性單株抗體作為捕獲抗體的夾心(捕獲)ELISA的基本設計，其與交叉反應性單株抗體作為偵測抗體配對。

將微孔板以本發明之血清型專一性單株抗體包覆作為捕獲抗體，並於4°C培養整夜。然後將孔井阻隔並洗滌。以不同血清型DENV (DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241)或流行性日本腦炎(JE)病毒感染的Vero細胞的細胞培養物上清液或未感染的Vero細胞的細胞培養物上清液(陰性對照組)分開加入孔中，於37°C培養1小時。洗滌後，將以辣根過氧化物酶(HRP)標記的交叉反應性單株抗體加入孔中，並於37°C下培養1小時。再次洗滌孔井，並向孔中加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'- tetramethylbenzidine，TMB)作為HRP的基質。於450 nm波長處讀取吸光度。如圖1B所示，證明本發明之血清型專一性單株抗體在夾心(捕獲) ELISA中成功地作為捕獲抗體，表現出優異的血清型專一性而不與其他黃病毒(日本腦炎(JE)病毒)交叉反應。

2.2.2 以血清型專一性單株抗體作為偵測抗體

將本發明之四種血清型專一性單株抗體作為夾心(捕獲) ELISA中的偵測抗體。圖2A顯示了使用本發明之血清型專一性單株抗體作為偵測抗體的夾心(捕獲)ELISA的基本設計，其與交叉反應性單株抗體作為捕獲抗體配對。

將微孔板以交叉反應性單株抗體包覆作為捕獲抗體，並於4°C下培養整夜。然後將孔井阻隔並洗滌。以不同血清型DENV (DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87及DENV4 H241)或流行性日本腦炎(JE)病毒感染的Vero細胞的細胞培養物上清液或未感染的Vero細胞的細胞培養物上清液(陰性對照組)分開加入孔中，於37°C下培養1小時。洗滌後，將以辣根過氧化物酶(HRP)標記的本發明血清型專一性單株抗體加入孔井中，並於37°C下培養1小時。再次洗滌孔井，並向孔中加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)作為HRP的基質。於450 nm波長處讀取吸光度。如圖2B所示，本發明之血清型專一性單株抗體在夾心(捕獲) ELISA中成功地作為偵測抗體，表現出優異的血清型專一性而不與其他黃病毒(日本腦炎(JE)病毒)交叉反應。

2.2.3 檢測極限

以每種DENV血清型的連續稀釋及純化的NS1蛋白進行捕獲ELISA，以確定本發明血清型專一性單株抗體的檢測極限。表4及圖3顯示了結果。

表4. 本發明之四種血清型專一性NS1捕獲ELISA及市售Platelia Dengue NS1 AG ELISA的檢測極限

結果顯示，使用本發明之血清型專一性單株抗體的捕獲ELISA實現了優異的靈敏度，範圍為1至4 ng/ml的DENV1-4 NS1蛋白，與市售的DENV ELISA套組(Pleterlia NS1 Ag ELISA，Bio-Rad公司)相當，雖然該市售套組無法區分血清型。

2.3 條帶

本發明之四種血清型專一性單株抗體也用於開發DENV檢測的條帶。圖4顯示了使用本發明之血清型專一性單株抗體作為捕獲抗體(上圖)或偵測抗體(檢測組)與交叉反應性單株抗體配對的血清分型NS1條帶的基本設計。

如圖5所示，本發明之血清型專一性單株抗體(12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5)被證明成功地作為捕獲抗體，與本發明交叉反應性單株抗體(82.1.1)配對作為偵測抗體，在血清分型NS1條帶中，分別對DENV1、DENV2、DENV3及DENV4(從上到下)表現出優異的血清型專一性，而不與其他黃病毒(日本腦炎(JE)病毒及滋卡病毒(ZIKV))交叉反應。

此外，測定了條帶中本發明血清型專一性單株抗體的檢測極限。表5顯示了結果。

表5 四種血清型專一性NS1條帶、Bio-Rad公司登革熱NS1 AG快速檢測，以及SD登革熱NS1 Ag快速檢測的檢測極限

結果顯示使用本發明之血清型專一性單株抗體的NS1條帶實現了優異的靈敏度，範圍為62.5至125 ng/ml的DENV1-4 NS1蛋白，與市售的DENV條帶套組相當，而這些市售套組不能區分血清型。

2.4 臨床試驗

收集總共146個臨床血清樣本以確定使用本發明之四種血清型專一性單株抗體的夾心(捕獲) ELISA的靈敏度及專一性。

在疾病發作後一(1)及七(7)天之間收集146份臨床血清樣本，並透過常規血清分型RT-PCR、登革熱專一性IgM/IgG捕獲ELISA、市售登革熱NS1 Ag ELISA方法及本發明之血清型-專一性NS1捕獲ELISA進行分析。表6顯示了結果。圖6顯示了用於測試急性發熱患者血清的本發明之夾心(捕獲) ELISA的專一性。

表6. 透過RT-PCR、IgM/IgG、Platelia Dengue NS1 AG ELISA及本發明之四種血清型專一性NS1捕獲ELISA分析急性臨床血清

結果顯示，146份臨床血清樣本被證實包括十七(17)個DENV1血清型樣本，十九(19)個DENV2血清型樣本，十六(16)個DENV3血清型樣本，以及九(9)個DENV4血清型樣本；透過RT-PCR測定五(5)個樣本為陰性，但登革病毒專一性IgM/IgG捕獲ELISA測定陽性；透過Platelia NS1 Ag ELISA確定五十五(55)個樣本陽性；八十(80)個樣本由所有測試方法確定為陰性。

結果顯示使用本發明之四種血清型專一性單株抗體的夾心(捕獲) ELISA表現出優異的靈敏度及專一性，其中D1 ELISA (單株抗體12-4.1)能夠檢測來自17個DENV1樣本的15個DENV1樣本，D2 ELISA (單株抗體33- 7)能夠檢測來自19個DENV2樣本的18個DENV2樣本，D3 ELISA (單株抗體43-1.3)能夠檢測來自16個DENV3樣本的12個DENV3樣本，以及D4 ELISA (單株抗體22-1.5)能夠檢測來自9個DENV1樣本的6個DENV4樣本；透過血清型RT-PCR未檢測到的五(5)個樣本被確定為陽性並鑑定為DENV2；且所有八十(80)個陰性樣本也被確定為陰性而沒有偽陽性結果。圖6A至圖6F顯示了用於測試急性發熱患者血清的本發明之夾心(捕獲) ELISA的專一性。

表8.1及8.2總結了使用本發明之四種血清型專一性單株抗體的夾心(捕獲) ELISA的靈敏度及專一性的結果。

表8.1

表8.2

結果顯示基於本發明之四種血清型專一性單株抗體的夾心(捕獲) ELISA能夠檢測及區分血清樣本中的四種登革病毒血清型，甚至在疾病發作後的五(5)天後，顯示總體100%專一性及84.8%靈敏度。

無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及本發明之以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在附圖中示出了目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所示的精確佈置及手段。

於附圖中：

圖1A所示為使用本發明之血清型專一性單株抗體(mAbs)作為捕獲抗體，並與一作為偵測抗體的登革病毒的血清型交叉反應抗體配對的夾心式(捕獲) ELISA之基本設計。

圖1B所示為使用本發明之血清型專一性單株抗體(mAbs)，12-4.1、33-7.1、43-1.3，以及22-1.5作為捕獲抗體，並與一作為偵測抗體的登革病毒的血清型交叉反應抗體配對的夾心式(捕獲) ELISA中的檢測結果。在該測定中，以來自被DENV1、DENV2、DENV3、DENV4或JEV感染的Vero細胞的細胞培養上清液作為NS1抗原之來源，並以來自未感染的Vero細胞的上清液作為陰性對照組。

圖2A所示為使用本發明之血清型專一性單株抗體(mAbs)作為偵測抗體，並與一作為捕獲抗體的登革病毒的血清型交叉反應抗體配對的夾心式(捕獲) ELISA之基本設計。

圖2B所示為使用本發明之血清型專一性單株抗體(mAbs)，12-4.1、33-7.1、43-1.3，以及22-1.5作為偵測抗體，並與一作為捕獲抗體的登革病毒的血清型交叉反應抗體配對的夾心式(捕獲) ELISA中的檢測結果。在該測定中，以來自被DENV1、DENV2、DENV3、DENV4或JEV感染的Vero細胞的細胞培養上清液作為NS1抗原之來源，並以來自未感染的Vero細胞的上清液作為陰性對照組。

圖3所示為使用本發明之血清型專一性單株抗體(mAbs)，12-4.1、33-7.1、43-1.3，以及22-1.5作為偵測抗體，並與一作為捕獲抗體的登革病毒的血清型交叉反應抗體配對的夾心式(捕獲) ELISA中的靈敏度。以每種DENV血清型的連續稀釋及純化的NS1蛋白進行捕獲ELISA，以確定本發明血清型專一性單株抗體(mAbs)的偵測極限。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)建立基線。每個數據點代表三次重複測試的平均值±標準差(SD)。

圖4所示為使用本發明之血清型專一性單株抗體(mAbs)作為捕獲抗體(上圖)或偵測抗體(下圖)，並與一登革病毒的血清型交叉反應抗體(單株抗體82-1.1)配對的夾心式條帶的基本設計。

圖5所示為本發明之夾心式條帶之特性。將血清型專一性單株抗體(mAbs) 12-4.1、33-7.1、43-1.3，以及22-1.5與登革病毒的血清型交叉反應抗體(單株抗體82-1.1)配對，作為捕獲及偵測抗體，然後測試結合專一性。在該測定中，以來自被DENV1、DENV2、DENV3、DENV4或JEV感染的Vero細胞的細胞培養上清液作為NS1抗原的來源，並以來自未感染的Vero細胞的上清液作為陰性對照組。

圖6A至圖6F包括顯示用於測試急性發熱患者血清的本發明之夾心式(捕獲) ELISA的專一性的圖表。圖6A所示為以DENV1感染的17名患者的血清的ELISA測試結果。圖6B所示為以DENV2感染的19名患者的血清的ELISA測試結果。圖6C所示為以DENV3感染的16名患者的血清的ELISA測試結果。圖6D所示為以DENV4感染的9名患者的血清的ELISA測試結果。圖6E所示為以DENVs感染的5名患者的血清的ELISA測試結果。圖6F所示為80名其他發熱患者血清的ELISA試驗結果。通過將患者血清的OD450值除以所有陰性健康正常血清樣本的OD450平均值(即，患者血清OD450/陰性健康正常血清的平均OD450)來計算T/N比。如果樣本的OD450值至少為陰性對照組的平均值的兩倍，則認為該樣本為陽性的。

圖7所示為本發明之抗體的重鏈及輕鏈的CDR序列。

圖8所示為本發明抗體的重鏈及輕鏈序列。

無

Claims

一種對抗登革病毒之抗體組合，其包括登革病毒血清型專一性抗體或其抗原結合片段，其中該血清型專一性抗體包括：(i)第一抗體，其係專一於登革病毒血清型第1型(DENV1)，包含(a)重鏈可變區(V_H)，包含如SEQ ID NO：2所示之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、如SEQ ID NO：4所示之重鏈互補決定區2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO：6所示之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及(b)輕鏈可變區(V_L)，包含如SEQ ID NO：9所示之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、如SEQ ID NO：11所示之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO：13所示之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)；(ii)第二抗體，其係專一於登革病毒血清型第2型(DENV2)，包含(a)重鏈可變區(V_H)，包含如SEQ ID NO：16所示之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、如SEQ ID NO：18所示之重鏈互補決定區2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO：20所示之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及(b)輕鏈可變區(V_L)，包含SEQ ID NO：23所示之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、如SEQ ID NO：25所示之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO：27所示之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)；(iii)第三抗體，其係專一於登革病毒血清型第3型(DENV3)，包含(a)重鏈可變區(V_H)，包含如SEQ ID NO：30所示之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、如SEQ ID NO：32所示之重鏈互補決定區2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO：34所示之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V_L)，包含SEQ ID NO：37所示之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、如SEQ ID NO：39所示之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO：41所示之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)；以及(iv)第四抗體，其係專一於登革病毒血清型第4型(DENV4)，包含(a)重鏈可變區(V_H)，包含如SEQ ID NO：44所示之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、如SEQ ID NO：46所示之重鏈互補決定區2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO：48所示之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及(b)輕鏈可變區(V_L)，包含SEQ ID NO：51所示之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、如SEQ ID NO：53所示之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO：55所示之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
如請求項1之抗體組合，其進一步包括登革病毒血清型交叉反應抗體或其抗原結合片段，其中該血清型交叉反應抗體為：(v)第五抗體，其係與登革病毒血清型第1型、第2型、第3型，以及第4型(DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4)交叉反應，包含(a)重鏈可變區(V_H)，包含如SEQ ID NO：58所示之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、如SEQ ID NO：60所示之重鏈互補決定區2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO：62所示之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及(b)輕鏈可變區(V_L)，包含SEQ ID NO：65所示之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、如SEQ ID NO：67所示之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO：69所示之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
如請求項1之抗體組合，其中 (i)該第一抗體包含包含SEQ ID NO：71的重鏈可變區(V_H)以及包含SEQ ID NO：72的輕鏈可變區(V_L)；(ii)該第二抗體包含包含SEQ ID NO：73的重鏈可變區(V_H)以及包含SEQ ID NO：74的輕鏈可變區(V_L)；(iii)該第三抗體包含包含SEQ ID NO：75的重鏈可變區(V_H)以及包含SEQ ID NO：76的輕鏈可變區(V_L)；及/或(iv)該第四抗體包含包含SEQ ID NO：77的重鏈可變區(V_H)以及包含SEQ ID NO：78的輕鏈可變區(V_L)。
如請求項2之抗體組合，其中(v)該第五抗體包含包含SEQ ID NO：79的重鏈可變區(V_H)以及包含SEQ ID NO：80的輕鏈可變區(V_L)。
如請求項1至4中任一項之抗體組合，其中該抗原結合片段係選自由所述之抗體的scFv、(scFv)2、Fab、Fab'，以及F(ab')2所組成之群組。
一種組合物，包含如請求項1至5中任一項之抗體組合。
如請求項6之組合物，其係醫藥或診斷組合物，用於治療或診斷登革病毒疾病。
如請求項6或7之組合物，其包含醫藥上可接受之載體。
一種在懷疑含有登革病毒的樣本中檢測登革病毒之方法，包含使該樣本與如請求項1、3或5中任一項所述之抗體組合中的血清型專一性抗體或其抗原結合片段接觸，並測定該血清型專一性抗體或其抗原結合片段與該樣本的結合。
如請求項9之方法，其中該血清型專一性抗體係與配偶體抗體配對。
如請求項10之方法，其中該配偶體抗體為登革病毒的血清型交叉反應抗體。
如請求項11之方法，其中該血清型交叉反應抗體為如請求項2或4所述之第五抗體。
如請求項9至12中任一項之方法，其中(i)該第一抗體與該樣本的結合表示在該樣本中存在DENV1；(ii)該第二抗體與該登革病毒的結合表示在該樣本中存在DENV2；(iii)該第三抗體與該登革病毒的結合表示在該樣本中存在DENV3；及/或(iv)該第四抗體與該登革病毒的結合表示在該樣本中存在DENV4。
一種用於在樣本中檢測登革病毒的存在之套組，其中該套組包含如請求項1、3或5中任一項所述之抗體組合中的血清型專一性抗體或其抗原結合片段；以及可視需要的配偶體抗體。
如請求項14之套組，其中該配偶體抗體為登革病毒的血清型交叉反應抗體。
如請求項15之套組，其中該血清型交叉反應抗體為如請求項2或4所述之第五抗體。
如請求項14至16中任一項之套組，其中該血清型專一性抗體或該配偶體抗體包含可偵測到的標記。
如請求項17之套組，其中該可偵測到的標記係選自由酶標記、螢光標記、金屬標記，以及放射性標記所組成之群組。
如請求項17之套組，其中該可偵測到的標記係選自由金奈米顆粒、有色乳膠珠、磁性顆粒、碳奈米顆粒，以及硒奈米顆粒所組成之群組。
如請求項14至16中任一項之套組，其中該套組為免疫測定套組。
如請求項20之套組，其中該免疫測定係選自由酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫測定(radioimmunoassay，RIA)、螢光免疫測定(fluorescence immunoassay，FIA)、發光免疫測定(luminescence immunoassay，LIA)，及ILMA免疫螢光測定所組成之群組。
如請求項20之套組，其中該免疫測定係以側流測定形式進行。
如請求項20之套組，其中該免疫測定為夾心式測定。
一種核酸組合，其中該核酸係分別包含編碼重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)之核苷酸序列，其中該重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)係分別為如請求項1、3或5中任一項所述之抗體組合中的第一抗體的重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)、第二抗體的重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)、第三抗體的重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)、及第四抗體的重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)，以及可視需要之如請求項2或4所述之抗體組合中的第五抗體的重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)。
一種宿主細胞組合，其中該宿主細胞係分別包含如請求項24所述之核酸。