CN117343167A - 抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒 - Google Patents
抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒,涉及抗体技术领域。本发明提供的抗乙型流感病毒抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体为乙型流感病毒的检测提供了重要的原料来源,且具有提高的活性。
Description
相关申请的交叉引用
本公开要求于2022年07月05日提交中国专利局的申请号为202210781908.5、名称为“抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,具体而言,涉及一种抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus,Flu),简称流感病毒,是正粘病毒科的代表种,包括人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒等,其中人流感病毒根据其核蛋白的抗原性可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,是流行性感冒的病原体。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病。其中可感染人主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒,主要引起上呼吸道的感染,也可引起儿童与成年人的下呼吸道感染,主要为肺炎,婴幼儿的重症流感常伴有支气管、高热。
乙型流感,是由乙(B)型流感病毒引起的流行性感冒,其特点是起病急骤,畏寒、发热,体温在数小时至24小时内升达高峰,39-40℃甚至更高。伴头痛,全身酸痛,乏力,食欲减退。呼吸道症状较轻,咽干喉痛,干咳,可有腹泻。颜面潮红,眼结膜外眦充血,咽部充血,软腭上有滤泡。可用金刚烷胺为M2离子阻断剂等药物治疗,也可用中药治疗。
乙型流感病毒会产生许多亚型,因为流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原易发生转变,其组成氨基酸位点均可发生变异。流感病毒每次大流行后,通过上述的氨基酸位点变异,从而产生新型的流感病毒,人体免疫系统对于变异的亚型普遍缺乏抵抗力,容易造成局部流行,在特殊的环境下可以引起大范围人群感染。流感病毒感染后临床症状不典型,临床诊断主要依赖于实验室检测,而可同时感染人类的呼吸道病毒大概有200余种,因此检测试剂的灵敏度和特异度对临床诊断至关重要。选取检测时间短、检出率高的流感病毒筛查技术是保障临床快速诊断和对症治疗的技术路径和前提保障。
针对流感病毒的实验室检测方法有多种,参照卫生部《流行性感冒诊断标准》的变化可知,早期检测依赖鸡胚接种,由于操作复杂、技术要求高临床已很少应用,现代检测技术包括抗原检测和核酸PCR检测,新技术具有快速、敏感、特异的特点,为临床诊断提供了很大的帮助。
荧光PCR扩增技术,该方法的优点是灵敏度和特异度均较高,但是PCR法对样品、试验环境、操作人员的要求较高,扩增方法学适用于批量标本的检测,出报告时间较长,无法很好的满足临床快速诊断的要求。而检测病毒抗原的免疫胶体金技术可以作为一种快速诊断乙型流感的优选方法,检测时间短,能有效地辅助临床诊断,很大程度上帮助临床尽早对症用药。因此,本领域对于有效结合乙(B)型流感病毒并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
发明内容
本申请提供一种活性提高的抗乙型流感病毒抗体,以改善乙型流感病毒的检测,为乙型流感病毒的检测提供重要的原料来源。
为了实现上述目的,本发明提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,所述抗体或其功能性片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链可变区的三个互补决定区。
可选地,所述互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、Lesk、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。
可选地,所述互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT或Lesk系统定义。
可选地,所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区:
HCDR1,其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或由其组成;
HCDR2,其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或由其组成;
HCDR3,其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,或由其组成;
LCDR1,其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,或由其组成;
LCDR2,其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,或由其组成;
LCDR3,其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,或由其组成。
可选地,所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:9或与其具有80%以上同一性所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10或与其具有80%以上同一性所示的轻链可变区。本发明提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,所述抗体或其功能性片段包括:a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和氨基酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区;或
c)氨基酸序列与b)所示序列具有80%以上同一性的重链可变区和轻链可变区,且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3;或
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
本发明提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,所述抗体或其功能性片段包括:a)氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
可选地,上文任一项所述的抗体或其功能性片段还包含恒定区。
可选地,所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
可选地,所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
可选地,所述恒定区选自IgM的重链恒定区。
可选地,所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
可选地,所述恒定区的种属来源为小鼠。
可选地,所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:7所示或与其具有至少80%同一性。
可选地,所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8所示或与其具有至少80%同一性。
可选地,上文任一项所述的抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
可选地,所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
本发明提供了一种抗体偶联物,所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。
可选地,所述抗体偶联至生物素或生物素衍生物。
可选地,所述抗体偶联至固相。
可选地,所述抗体偶联至标记物。
可选地,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
可选地,所述标记物优选为胶体金。
本发明提供了一种检测乙型流感病毒的试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。
本发明提供了一种检测乙型流感病毒的方法,包括:使上述任一项所述的抗体或其功能性片段、偶联物、试剂或试剂盒与待检测样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物。
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与乙型流感病毒结合。
本发明提供了一种核酸,其编码上述任一项所述的抗体或其功能性片段。
本发明还提供一种载体,其含有上文所述的核酸。
本发明还提供一种细胞,其含有上文所述的核酸或载体。
本发明还提供一种制备上文任一项所述的抗体或其功能性片段的方法,其包括:培养上文所述的细胞。
本发明还提供上文任一项所述的抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测乙型流感病毒、制备检测乙型流感病毒的产品、诊断乙型流感病毒感染中的用途。
本发明还提供一种诊断受试者感染乙型流感病毒的方法,包括:
a)使上述任一项所述的抗体或其功能性片段、偶联物、试剂或试剂盒与来自所述受试者样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物;和
b)检测所述免疫复合物的存在,所述复合物的存在指示所述受试者样品中所述乙型流感病毒的存在。
可选地,在步骤a)中,所述免疫复合物中还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
可选地,在步骤a)中,所述免疫复合物中还包括第二抗体,所述第二抗体与所述乙型流感病毒结合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-FluB 9B8mut1的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
在本发明中,如本文所用,术语“抗体”在最广义上使用,其可以包括全长单克隆抗体,双特异性或多特异性抗体,以及嵌合抗体,只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中,如本文所用,术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区,指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中,CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中,重链互补决定区用“HCDR”表示,其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3;轻链互补决定区用“LCDR”表示,其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明实施方式提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,抗体或其功能性片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链可变区的三个互补决定区。
本领域常用的CDR标示方法包括:Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中,序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建,Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本公开采用Kabat注释标准标示CDR区,但其他方法标示的CDR区也属于本公开的保护范围。
CDR的定义方法是本领域公知的,CDR定义方法包括:Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Contact定义和AbM定义。如本文所述,“Kabat定义”是指Kabat等,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的定义系统。“Chothia定义”参见Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)。还有其他CDR定义方法可能不严格遵循上述方案之一,但仍会与Kabat定义的CDR区的至少一部分重叠,尽管根据特定残基或残基组的预测或实验结果可能会缩短或延长它们。示例性的定义的CDR列于下表1中,不同文献中的定义略有不同。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下,本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。需要说明的是,不限于表1中的其他方法定义的CDR也属于本公开的保护范围。
表1:CDR定义1
CDR | Kabat | AbM2 | IMGT | Chothia |
HCDR1 | H31~H353 | H26~H353 | H26~H33..55 | H26~H32..344 |
HCDR2 | H50~H65 | H50~H58 | H51~H57 | H52~H56 |
HCDR3 | H95~H102 | H95~H102 | H93~H102 | H95~H102 |
LCDR1 | L24~L34 | L24~L34 | L27~L32 | L24~L34 |
LCDR2 | L50~L56 | L50~L56 | L50~L51 | L50~L56 |
LCDR3 | L89~L97 | L89~L97 | L89~L97 | L89~L97 |
1表1中所有CDR定义的编号是依据Kabat编号系统(参见下文),重链上的氨基酸编号用“H+数字”表示,轻链上的氨基酸编号用“L+数字”表示。本领域普通技术人员可以明确地将该Kabat编号系统对应到任何可变区序列,而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所述,“Kabat编号”是指Kabat等,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的编号系统。
2如表1中使用的“AbM”具有小写“b”,是指通过Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
3如果H35A和H35B都不存在时,那么CDR-H1结束在35位;如果只有H35A存在时,那么CDR-H1结束在35A位;如果H35A和H35B同时存在,那么CDR-H1结束在35B位。
4如果H35A和H35B都不存在时,那么CDR-H1结束在32位;如果只有H35A存在时,那么CDR-H1结束在33位;如果H35A和H35B同时存在,那么CDR-H1结束在34位。
5如果H35A和H35B都不存在时,那么CDR-H1结束在33位;如果只有H35A存在时,那么CDR-H1结束在34位;如果H35A和H35B都存在时,那么CDR-H1结束在35位。
在可选的实施方式中,互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、Lesk、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、Lesk系统定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由Kabat系统定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由Chothia系统定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由IMGT系统定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由AbM系统定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由Contact系统定义。
在可选的实施方式中,互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact系统组合定义。
在可选的实施方式中,Kabat、Chothia、AbM或IMGT系统定义的互补决定区的氨基酸序列对应的Kabat编号位置如下:
在可选的实施方式中,HCDR1的氨基酸序列对应的Kabat编号位置为H31~H35,HCDR2的氨基酸序列对应的Kabat编号位置为H50~H65,HCDR3的氨基酸序列对应的Kabat编号位置为95~H100B,LCDR1的氨基酸序列对应的Kabat编号位置为L24~L34,LCDR2的氨基酸序列对应的Kabat编号位置为L50~L56,LCDR3的氨基酸序列对应的Kabat编号位置为L89~L95。
在可选的实施方式中,重链可变区SEQ ID NO:9的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示,则抗体或其功能性片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列也依次如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
在可选的实施方式中,轻链可变区SEQ ID NO:10的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示,则抗体或其功能性片段的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列也依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
在可选的实施方式中,抗体或其功能性片段包括如下互补决定区:
HCDR1,其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或由其组成;
HCDR2,其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或由其组成;
HCDR3,其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,或由其组成;
LCDR1,其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,或由其组成;
LCDR2,其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,或由其组成;
LCDR3,其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,或由其组成。
在可选的实施方式中,抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:9或与其具有80%以上同一性所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10或与其具有80%以上同一性所示的轻链可变区。
本发明实施方式提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,抗体或其功能性片段包括:
a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和氨基酸序列如SEQID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区;或c)氨基酸序列与b)所示序列具有80%以上同一性的重链可变区和轻链可变区,且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3;或
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
本发明实施方式提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,抗体或其功能性片段包括:
a)氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在可选的实施方式中,抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:9或与其具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%以上同一性所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%以上同一性所示的轻链可变区。
本发明提供了一种抗乙型流感病毒的抗体或其功能性片段,抗体或其功能性片段包括:
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
在本发明中,“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区,是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域;其中,重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域,包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区;轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域,包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中,重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4;轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
本发明提供了一种抗乙型流感病毒的抗体或其功能性片段,抗体或其功能性片段包括:
c)氨基酸序列与b)所示序列具有80%以上同一性的重链可变区和轻链可变区,且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3。
在可选的实施方式中,抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:9所示的重链可变区中的重链框架区,和SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中的轻链框架区。
在可选的实施方式中,抗体或其功能性片段的框架区氨基酸序列可以与上述框架区具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
在可选的实施方式中,抗体或其功能性片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中,恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中,重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区,轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中,重链恒定区选自IgM的重链恒定区。
在可选的实施方式中,恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中,恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中,重链恒定区的序列(CH)如SEQ ID NO:7所示,轻链恒定区(CL)的序列如SEQ ID NO:8所示。
需要说明的是,在其他的实施方式中,恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ ID NO:7或8)具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
在可选的实施方式中,功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到,上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明提供了完整抗体的结构基础上,本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪,比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
本发明提供了一种抗乙型流感病毒的抗体或其功能性片段,包括:
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。本发明提供一种抗体偶联物,抗体偶联物包括上述的抗体。其中,所述抗体直接或间接共价偶联至待偶联物。或者,所述抗体以非共价吸附的方式偶联至待偶联物。
在可选的实施方式中,抗体偶联物中所述抗体偶联至生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中,抗体偶联物中所述抗体偶联至标记物。
在可选的实施方式中,标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质,通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中,标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中,本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物,无论使用何种标记物,其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中,荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中,酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中,放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中,化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中,纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中,胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中,胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。
在可选的实施方式中,胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中,抗体偶联物中所述抗体偶联至固相。
在可选的实施方式中,固相选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中,固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中,固相为硝酸纤维素膜。
本发明提供一种检测乙型流感病毒的试剂或试剂盒,试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。
本发明提供上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测乙型流感病毒、制备检测乙型流感病毒的产品、诊断乙型流感病毒感染中的用途。
本发明提供一种检测乙型流感病毒的方法,包括:使上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒与待检测样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物。在可选的实施方式中,免疫复合物还包括第二抗体,第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
在可选的实施方式中,免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与乙型流感病毒结合。
本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
本发明提供含有上述核酸分子的载体。
本发明提供含有上述载体的细胞。
本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法,其包括:培养如上所述的细胞。
本发明提供了一种诊断受试者感染乙型流感病毒的方法,包括:
a)使上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒与来自受试者样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物;和
b)检测免疫复合物的存在,复合物的存在指示受试者样品中乙型流感病毒的存在。
在可选的实施方式中,在步骤a)中,免疫复合物中还包括第二抗体,第二抗体与抗体或其功能性片段结合。
在可选的实施方式中,在步骤a)中,免疫复合物中还包括第二抗体,第二抗体与乙型流感病毒结合。
本发明提供一种抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒,该抗体可以特异性结合乙型流感病毒,对其具有改善的活性和/或亲和力,用该抗体检测乙型流感病毒具有改善的灵敏度和特异性。本公开为乙型流感病毒的检测提供了更为丰富的抗体选择。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上,本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段,例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段,这对本领域技术人员来说是容易实现的,基于此,无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段,其均属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试,但现在描述一些方法和材料。除非另有说明,否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明,否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-FluB 9B8单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-IL-6 7H9单克隆抗体的杂交瘤细胞株为已有的杂交瘤细胞株,复苏备用。
1.重组质粒的构建
(1)抗体基因制备
从分泌抗乙型流感病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,通过RT-PCR方法获得DNA产物,该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中,长出菌落后分别取重链及轻链基因克隆,各4个克隆送基因测序公司进行测序。
(2)Anti-FluB 9B8抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析,并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的,其中轻链扩增出的基因片段中,VL基因序列为321bp,其前方有57bp的前导肽序列;重链引物对扩增出的基因片段中,VH基因序列为360bp,属于VH1基因家族,其前方有57bp的前导肽序列。
(3)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM 3.4载体(vector)为构建的重组抗体真核表达载体,该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点,并命名为pcDNA3.4A表达载体,后续简称3.4A表达载体;根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果,设计该抗体的VL和VH基因特异性引物,两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基,通过PCR扩增方法扩出0.73kb的轻链基因片段和1.80kb的重链基因片段。
重链和轻链基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切,3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切,将片段和载体纯化回收后重链基因和轻链基因分别连接3.4A表达载体中,分别得到重链和轻链的重组表达质粒。
2.稳定细胞株筛选
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞,确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至40μg/100μL,调节CHO细胞1.43×107个细胞/mL于离心管中,100μL质粒与700μL细胞混合,转入电转杯,电转,第3、5、7天取样计数,第7天收样检测。
包被液(主要成分NaHCO3)稀释羊抗鼠IgM 1μg/mL进行微孔板包被,每孔100μL,4℃过夜;次日,洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次,拍干;加入封闭液(20%BSA+80%PBS),每孔120μL,37℃,1h,拍干;加入稀释后的细胞上清,100μL/孔,37℃,60min;甩掉板内液体,拍干,加入20%鼠阴性血封闭,每孔120μL,37℃,1h;甩掉板内液体,拍干,加入稀释的流感B重组抗原,每孔100μL,37℃,40min;洗涤液清洗5次,拍干;加入抗流感B单克隆抗体HRP标记物,每孔100μL,37℃,30min;加入显色液A液(50μL/孔),加入显色液B液(50μL/孔),10min;加入终止液,50μL/孔;酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0,未加细胞上清孔反应OD小于0.1,表明质粒瞬转后产生的抗体流感B重组抗原有活性。
(2)重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂:Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μL、无菌水补至500μL,37℃水浴酶切过夜;先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1,再用氯仿(水相)依次进行抽提;0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀,70%乙醇漂洗沉淀,去除有机溶剂,待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融,最后进行浓度的测定。
(3)重组抗体表达质粒稳定转染,加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至40μg/100μL,调节CHO细胞1.43×107个细胞/mL于离心管中,100μL质粒与700μL细胞混合,转入电转杯,电转,次日计数;25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度;取培养上清,送样检测;挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔,3天左右转6孔;3天后保种批培,调整细胞密度0.5×106个细胞/mL,2.2mL进行批培养,细胞密度0.3×106个细胞/mL,2mL进行保种;7天6孔批培上清送样检测,挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3.重组抗体生产
(1)细胞扩培
细胞复苏之后先在125mL规格的摇瓶中培养,接种体积为30mL,培养基为100%Dynamis培养基,放置于转速120r/min,温度为37℃,二氧化碳为8%的摇床中。培养72h,以50万个细胞/mL接种密度接种扩培,扩培体积根据生产需求进行计算,培养基为100%Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时,严格控制接种密度为50万个细胞/mL左右进行生产。
(2)摇瓶生产及纯化
摇瓶参数:转速120r/min,温度为37℃,二氧化碳为8%。流加补料:在摇瓶中培养至72h时开始每天补料,HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3%,Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一,一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE,电泳图如图所示,在还原性SDS-PAGE后显示两条带,1条Mr为70KD(重链),另一条Mr为23KD(轻链)。
实施例2活性优化
实施例1得到的Anti-FluB 9B8单克隆抗体虽然具备结合乙型流感病毒抗原的能力,但抗体活性均不够理想,因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计,根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物,合成目的DNA两端引物,进行高保真PCR反应,将PCR产物克隆至载体,再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选,得到抗体活性显著提升的单克隆抗体,并命名为:Anti-FluB9B8mut1,其重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
实施例3抗体的活性和性能检测
1.活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释羊抗鼠IgM(购自菲鹏生物)1μg/mL进行微孔板包被,每孔100μL,4℃过夜;次日,洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次,拍干;加入封闭液(20%BSA+80%PBS),每孔120μL,37℃,1h,拍干;加入稀释后的纯化抗体,100μL/孔,37℃,60min;甩掉板内液体,拍干,加入20%鼠阴性血封闭,每孔120μL,37℃,1h;甩掉板内液体,拍干,加入稀释的流感B重组抗原,每孔100μL,37℃,40min;洗涤液清洗5次,拍干;加入抗流感B单克隆抗体HRP标记物,每孔100μL,37℃,30min;加入显色液A液(50μL/孔),加入显色液B液(50μL/孔),10min;加入终止液,50μL/孔;酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见下表。
表2活性数据
样品浓度(ng/mL) | 250.00 | 125.00 | 62.50 | 31.25 | 15.63 | 0.00 |
对照 | 1.602 | 1.225 | 0.672 | 0.351 | 0.181 | 0.063 |
Anti-FluB 9B8mut1 | 1.901 | 1.563 | 1.129 | 0.588 | 0.356 | 0.064 |
2.抗体在胶体金检测上的应用
2.1胶体金检测试纸的制备
2.1.1硝酸纤维素膜的制备
硝酸纤维素膜的制备:用包被缓冲液将流感B抗体(购自菲鹏生物)稀释到1~5mg/mL,调整机器,划线为T线,即为检测线,T线靠近金标垫端;用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到1~5mg/mL,调整机器,划线为C线,即为控制线,C线靠近吸收垫。两线距离5~8mm,均匀。37℃烘干,封装备用。
2.1.2胶体金、金标记单克隆抗体的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,置电炉煮沸,按每100mL 0.01%氯金酸加入2mL1%柠檬酸三钠,继续煮沸,直到液体呈亮红色即停止加热,冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2,分别加入纯化抗体Anti-FluB 9B8mut1和对照,磁力搅拌器混匀30min,搅拌下加入BSA至终浓度为1%静置1小时。13000rpm、4℃离心30min,弃上清,沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次,用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬,置4℃备用。
2.1.3金标垫的制备。
将金标垫浸泡于封闭液中30min后,于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上,每毫升溶液铺20平方厘米,冷冻干燥,封装,置4℃备用。
2.1.4检测试纸的组装
将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上,切成3mm宽的小条。每十小条一包,加入干燥剂,真空封装,得到所述检测试纸。
2.2抗体在胶体金检测中的应用
利用上述组装好的检测试纸条检测被检材料中是否含有流感B病毒抗原,从而确定专利中所得抗体对流感B病毒抗原检测的作用性。利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有流感B病毒抗原。检测时,流感B病毒抗原先和胶体金标记的流感B抗体结合形成流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体复合物,由于毛细管作用,流感B抗原-胶体金标记流感B抗体复合物沿硝酸纤维素膜向前泳动,到达检测线时,流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体复合物会与上述实施例制备得到的流感B抗体结合,形成流感B抗体-流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体的复合物,从而富集在检测线上,形成红色沉淀线。未结合检测线上流感B抗体的流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体复合物则通过检测线,被羊抗鼠IgG抗体捕获,富集在质控线上,形成红色沉淀线。当检测线与质控线同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有流感B病毒抗原,未结合流感B病毒抗原的胶体金标记的流感B抗体到达检测线时,不会形成流感B抗体-流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体的复合物,未结合流感B抗原的胶体金标记的流感B抗体复合物通过检测线,仅富集在质控线上形成红色沉淀线,此时判为阴性结果。
备注:金标显色以C加数字组成,C后面的数字越小表示显色越强,活性越高;C后面的数字越高表示显色越弱,活性越低;数字后带“+”比不带显色略强0.5-1C,数字后带“-”比不带显色略低0.5-1C,“B”代表阴性。
表3检测性能数据
3.稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天,取7天、14天、21天样品进行状态观察,并对21天样品进行活性检测,结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化,活性也未随考核温度的升高呈下降趋势,说明上述抗体稳定。下表为抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。
表4稳定性数据
样品浓度(ng/ml) | 125.00 | 62.50 | 0.00 |
4℃,21天样品 | 1.512 | 1.182 | 0.027 |
-80℃,21天样品 | 1.517 | 1.157 | 0.028 |
37℃,21天样品 | 1.521 | 1.131 | 0.027 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下表5所示:
表5氨基酸序列
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Claims (11)
1.一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,所述抗体或其功能性片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链可变区的三个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段,其特征在于,所述互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、Lesk、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义;
可选地,所述互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT或Lesk系统定义。
3.一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段,其特征在于,所述抗体或其功能性片段包括:
a)氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区,和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区;或c)氨基酸序列与b)所示序列具有80%以上同一性的重链可变区和轻链可变区,且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3;或
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链;
可选地,所述抗体或其功能性片段还包含恒定区;
可选地,所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区;
可选地,所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区;
可选地,所述恒定区选自IgM的重链恒定区;
可选地,所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人;
可选地,所述恒定区的种属来源为小鼠;
可选地,所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:7所示或与其具有至少80%同一性;
可选地,所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8所示或与其具有至少80%同一性;
可选地,所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
4.一种抗体偶联物,其特征在于,所述抗体偶联物包括权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段;
可选地,所述抗体偶联至生物素或生物素衍生物;
可选地,所述抗体偶联至固相;
可选地,所述抗体偶联至标记物;
可选地,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物;
可选地,所述标记物为胶体金。
5.一种检测乙型流感病毒的试剂或试剂盒,其特征在于,所述试剂或试剂盒包括权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求4所述的抗体偶联物。
6.一种检测乙型流感病毒的方法,其特征在于,包括:
使权利要求1至3任一项所述的抗体其功能性片段、权利要求4所述的抗体偶联物或权利要求5所述的试剂或试剂盒与待检测样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物;
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合;
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与乙型流感病毒结合。
7.一种核酸,其特征在于,其编码权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段。
8.一种载体,其特征在于,其含有权利要求7所述的核酸。
9.一种细胞,其特征在于,其含有权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体。
10.一种制备权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段的方法,其特征在于,其包括:培养权利要求9所述的细胞。
11.权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段、权利要求4所述的抗体偶联物,或者权利要求5所述的试剂或试剂盒在检测乙型流感病毒或制备检测乙型流感病毒的产品中的用途。
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