CN104245731A

CN104245731A - 抗乙型流感病毒的广泛保护性人单克隆抗体及其使用方法

Info

Publication number: CN104245731A
Application number: CN201380007562.2A
Authority: CN
Inventors: 安木真世; 久原基树; J·文-朗; 藤山和仁; 纐纈律子; 生田和良
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN; Osaka University NUC; Department OF MEDICAL SCIENCES
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; Osaka University NUC; Department OF MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: WO2013114885A1; EP2814841A1; EP2814841A4; JP2015512867A; CN104245731B; JP6170507B2; US20140377262A1; US9181328B2

Abstract

本发明提供了用于治疗人乙型流感病毒感染的材料和方法，提供了抗人流感病毒单克隆抗体及其抗原结合片段，具有抗人乙型流感病毒的中和活性，还提供了生产抗人乙型流感病毒的单克隆抗体的方法。抗体及其抗原结合片段可有效对抗广泛范围的乙型流感病毒株。本发明还提供了抑制或治疗人乙型流感感染的方法。抗乙型流感的治疗剂也可以用来制备抗乙型流感感染的有效药物，用来检测人受试者中人乙型流感，用于使用在药物组合物中，和用于使用在用于预防、治疗和检测人受试者中人乙型流感的至少一个的试剂盒中。

Description

抗乙型流感病毒的广泛保护性人单克隆抗体及其使用方法

技术领域

本发明涉及用于治疗人乙型流感病毒感染的材料和方法。

相关申请

本申请要求享有2012年1月31日提交的美国临时专利申请第61/592,657号的权益，其全部内容通过援引并入本文。

政府基金

本文所述的主题，至少部分，由日本科学技术振兴机构/日本国际协力机构，科学和技术研究伙伴关系促进可持续发展项目(Japan Science and TechnologyAgency/Japan International Cooperation Agency，Science and Technology ResearchPartnership for Sustainable Development，JST/JICA，SATREPS)；和日本学术振兴会(theJapan Society for the Promotion of Science)给予Mayo Yasugi的青年科学家(B)补助金(Grant-in-Aid for Young Scientists(B))支持。

背景技术

流感病毒通过快速的遗传漂变和重组以逃避免疫监视的能力，意味着它仍然是一个持续的公共健康威胁。在每年流行期间，每年通常全世界百分之五至十五的人口被感染，造成3百万至5百万例严重患病和25万至50万例死亡(Lambert等,The New England Journalof Medicine363:2036-2044；WHO,Influenza(Seasonal)Fact Sheet No.211)。像甲型流感病毒(A型流感病毒，influenza A virus)的H1和H3亚型一样，乙型流感病毒(B型流感病毒，influenza B virus)已经引起了人类的流行病(WHO,Influence(Seasonal)Fact Sheet No.211)。与甲型流感病毒相比，乙型流感病毒几乎无一例外都是在人类中发现的，并且具有比甲型流感病毒中所观测到的突变速率慢得多的突变速率(Carrat等,Vaccine25:6852-6862；Nobusawa等,Journal of Virology80:3675-3678；Webster等,The Journal ofGeneral Virology54:243-251)。然而，以B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87为代表的两种种族和抗原上不同的系的共流行，已经通过基因重组和来自突变累积的抗原漂移引起抗原变异，引发每年流行病(非专利文献1:Hay等，Philosophical Transactions of the RoyalSociety of London356:1861-1870；非专利文献2:Lin等,Virus Research103:47-52)。

最近，产生广泛活性的抗体的疫苗和使用有全局反应活性的人单克隆抗体(HuMAbs)的治疗策略的发展引起了极大的兴趣。神经氨酸苷酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir)(达菲(Tamiflu))和扎那米韦(zanamivir)(瑞乐沙(Relenza))已被广泛地用于治疗流感病毒感染。但是，当发病后超过48小时给药，它们的疗效有限(Aoki等,The Journal ofAntimicrobial Chemotherapy51:123-129)，并且广泛使用已经导致耐药病毒株的出现(Kiso等,Lancet 364:759-765；Lowen等,Infectious Disorders Drug Targets7:318-328；Reece,Journal of Medical Virology79:1577-1586)。因此，提供强有力和广泛的交叉保护宿主免疫的新的治疗策略是全球性的公共健康优先考虑的。因此，新的基于抗体的治疗方法的发展受到极大的关注(Marasco等，Nature Biotechnology25:1421-1434)。

具有广泛中和活性的几种人单克隆抗体(HuMAbs)经鉴定抗甲型流感病毒的血凝素(HA)蛋白，其包括与第1组病毒反应的C6261和F10(Ekiert等，Science324:246-251；Sui等,Nature Structural & Molecular Biology16:265-273)，以及中和第2组病毒的CR8020(Ekiert等，Science333:843-850)。另一种人单克隆抗体FI6v3，中和第1组和第2组的甲型流感病毒，于2011年分离出来(Corti等，Science333：850-856)。尽管乙型流感病毒的突变速率比像H1和H3亚型的甲型流感病毒中所观测到的突变速率慢得多，但是它每年引发人类的流行病(非专利文献1:Hay等,Philosophical Transactions of the RoyalSociety of London256:1861-1870；非专利文献2:Lin等,Virus Research103:47-52)。然而，对于乙型流感病毒，广泛中和的人单克隆抗体CR8033、CR8071和CR9114在2012年9月已首次报道(非专利文献3:Dreyfus等,Science337:1343-1348)。因此，对抗乙型流感病毒的广泛中和的人单克隆抗体存在需要。

[引用列表]

[非专利文献]

[非专利文献1]Hay等,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2001December29；356(1416):1861-1870.

[非专利文献2]Lin等,Virus Res.2004Jul；103(1-2):47-52.

[非专利文献3]Dreyfus等,Science.2012Sep14；337(6100):1343-8.doi:10.1126/science.1222908.Epub2012Aug9.

发明内容

技术问题

本研究制备了三种对乙型流感病毒的HA蛋白广泛发生反应的人单克隆抗体。命名为5A7、3A2和10C4的三种抗乙型流感病毒的人单克隆抗体使用来自已接种的志愿者的外周淋巴细胞进行制备。在体外，人单克隆抗体5A7广泛中和1985年至2006年分离的乙型流感病毒株，而3A2和10C4只对Yamagata系发生反应。表位作图显示，3A2和10C4识别血凝素(HA)蛋白中邻近受体结合位点的190-螺旋区。190-螺旋的氨基酸残基容易突变。5A7识别邻近HA1的C末端的315至324氨基酸位，其为乙型流感病毒的高度保守区。而且，即使在感染后72小时注射人单克隆抗体，5A7显示对小鼠的治疗效果。由全长可变基因转染的CHO-K1细胞合成的人单克隆抗体5A7也表现出抗乙型流感病毒的中和活性。这些结果表明，本发明的抗体，包括5A7，可用作抗乙型流感病毒的治疗剂。

因此，本发明的一个特征是提供包括能够预防、抑制和治疗乙型流感感染的抗体和其抗原结合片段的治疗剂。

本发明的另一个特征是提供用于生产这种治疗剂的方法。

本发明的再一个特征是提供有效对抗广泛范围的乙型流感病毒株的治疗剂。

本发明的另外的特征和优点部分将在以下说明中阐明，并且部分从该说明可显而易见，或者可以通过实施本发明而认识到。根据说明书和所附的权利要求书中特别指出的要素和组合，本发明的目的和其它优点将被实现和获得。

问题解决方案

为了实现这些以及其它优点，并且根据本发明的目的，如本文中具体实施和广泛描述的，本发明涉及抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，具有抗人乙型流感病毒的中和活性，其中，所述单克隆抗体可包括人单克隆抗体和/或人源化单克隆抗体。

本发明提供一种产生抗人乙型流感病毒单克隆抗体的方法。该方法可包括通过将来自人例如感染乙型流感病毒的患者或/和被接种者的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合产生杂交瘤细胞。该方法还可包括从所述杂交瘤细胞获得抗人流感病毒单克隆抗体。该方法中的乙型流感病毒可包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。所述融合伴侣细胞为SPYMEG细胞。因此，本发明进一步提供由上述方法产生的抗人流感病毒单克隆抗体。

本发明提供一种抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，包括：将有效治疗量的本发明的抗人乙型流感病毒人抗体或其抗原结合片段给药予人受试者。该方法还可包括：诊断感染乙型流感的患者。该方法可进一步包括：监测至少一种乙型流感感染症状的减轻。

本发明提供了本发明的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的药物中的用途。本发明还提供了一种检测人受试者中人乙型流感的方法，包括：将来自人受试者的样品与本发明的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段接触。本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本发明还进一步提供了一种用于人受试者中人乙型流感的预防、治疗和检测的至少一个的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段。所述试剂盒可包括药物组合物和/或一种或多种另外的乙型流感或其他拮抗剂。

附图并入本申请并组成本申请的一部分，说明本发明的一些具体实施例，并与说明书一起，用于解释本发明的原理。

附图说明

[图1]

图1示出了通过B/Florida/4/2006与HuMAbs温育选择的逃逸变异株的序列。将逃逸变异株中HA蛋白的氨基酸序列与原B/Florida/4/2006比较。星号表示原病毒和逃逸变异株之间不同的氨基酸残基。

[图2]

图2示出了表达质粒中HA的一系列截断形式(a至f)，其制备成如图所示。用5A7对转染的293T细胞进行蛋白质印迹分析，采用来自感染B/Ibaraki/2/1985的小鼠的血清作为对照(Ms血清)。

[图3]

图3示出了携带采用B/Shanghai/361/2002(Sh/02)和B/Florida/4/2006(Flo/06)制备的嵌合HA蛋白的表达质粒。采用3A2对表达嵌合蛋白的293T细胞进行免疫荧光试验(IFA)(左侧)。白条代表Sh/02中的氨基酸序列，黑条代表Flo/06中的氨基酸序列。来自两个病毒株的HA蛋白中不同的氨基酸残基分别显示在顶部和底部的条中。

[图4]

图4示出了HA蛋白的三维结构中HuMAbs的表位图谱。

[图5]

图5示出了5A7在小鼠中的治疗效果。在用致死剂量(2.5x10⁴FFU/小鼠)的小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985攻击后4小时，向腹膜内给予5、10或15毫克/公斤HuMAb或者PBS治疗小鼠。每天检查存活和体重。每组5只小鼠。体重表示为五只小鼠的平均值+或–SEM。

[图6]

图6示出了5A7在小鼠中的治疗效果。在用致死剂量(2.5x10⁴FFU/小鼠)的小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985攻击后4小时，向腹膜内给予5、10或15毫克/公斤HuMAb或者PBS治疗小鼠。每天检查存活和体重。每组5只小鼠。体重表示为五只小鼠的平均值+或–SEM。

[图7]

图7示出了在用2.5x10⁴FFU/小鼠的小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985(左侧)和5.0x10³FFU/小鼠的B/Florida/4/2006(右侧)攻击后4小时给予10毫克/千克的5A7或者PBS治疗的小鼠。计算感染后3天和6天在肺中的滴度。每组三只小鼠。黑条是平均值。星号表示与PBS治疗组对比P<0.05。

[图8]

图8示出了在用小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985(2.5x10⁴FFU/小鼠)感染后经过的小时数(hours post-infection，hpi)为4、24、48或72小时时，小鼠被给予10毫克/千克的HuMAb或PBS。每天检查存活和体重。每组10只小鼠。体重表示为10只小鼠的平均值+或–SEM。

[图9]

图9示出了在用小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985(2.5x10⁴FFU/小鼠)感染后经过的小时数(hpi)为4、24、48或72小时时，小鼠被给予10毫克/千克的HuMAb或PBS。每天检查存活和体重。每组10只小鼠。体重表示为10只小鼠的平均值+或–SEM。

[图10]

图10示出了用由CHO-K1细胞合成的5A7进行的体外中和试验。测定存在来自CHO-K1细胞的合成的5A7时B/Florida/4/2006和B/Malaysia/2506/2004的感染性(5A7/CHO；实线)，并与存在来自杂交瘤细胞上清液的5A7时的感染性(5A7/杂交瘤细胞；虚线)进行比较。对HuMAbs(100微克/毫升(microgram/ml))进行4倍连续稀释(serially diluted four-fold)。

[图11]

图11示出了三个HuMAbs的V_H和V_L区的序列。除3A2和10C4的V_H区的D外，这三个HuMAbs来自不同种系。

[图12]

图12示出了三个HuMAbs的V_H和V_L区的序列。除3A2和10C4的V_H区的D外，这三个HuMAbs来自不同种系。

[图13]

图13示出了三个HuMAbs的V_H和V_L区的序列。除3A2和10C4的V_H区的D外，这三个HuMAbs来自不同种系。

附图并入说明书并组成说明书的一部分，阐明本发明的具体特征或具体实施例，并与详细说明相结合用来解释本发明的原理。

可以理解的是，前述的一般说明和下面的详细描述均仅为示例性的和解释性的，旨在对要求保护的本发明提供进一步的解释。

具体实施方式

本发明的详细说明

本发明提供了一种抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，具有抗人乙型流感病毒的中和活性，其中，单克隆抗体包括人单克隆抗体和/或人源化单克隆抗体。所述单克隆抗体或其抗原结合片段可具有抗B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、和B/Mie/1/1993病毒株中的至少一种的中和活性。所述单克隆抗体或其抗原结合片段可具有抗B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种的中和活性。该抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段可包括IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv或它们的任意组合。

所述抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段可包括至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区。该重链可变区可包括第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)、和第三互补决定区(CDR3)中的至少一个。该重链可变区的CDR1可具有包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13所示的序列的第一氨基酸序列。该重链可变区的CDR2可具有包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQID NO:14所示的序列的第二氨基酸序列。该重链可变区的CDR3可具有包含如SEQID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15所示的序列的第三氨基酸序列。该轻链可变区也可包括第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)、和第三互补决定区(CDR3)中的至少一个。该轻链可变区的CDR1可具有包含如SEQ ID NO:4、SEQID NO:10或SEQ ID NO:16所示的序列的第四氨基酸序列。该轻链可变区的CDR2可具有包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17所示的序列的第五氨基酸序列。该轻链可变区的CDR3可具有包含如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12或SEQID NO:18所示的序列的第六氨基酸序列。

该抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有：包含如SEQ ID NO:1所示序列的第一氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:2所示序列的第二氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:3所示序列的第三氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:4所示序列的第四氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:5所示序列的第五氨基酸序列，和包含如SEQ IDNO:6所示序列的第六氨基酸序列。例如：该抗人流感病毒单克隆抗体可包括抗体5A7。该抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有：包含如SEQ ID NO:7所示序列的第一氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:8所示序列的第二氨基酸序列，包括SEQ ID NO:9所示序列的第三氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:10所示序列的第四氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:11所示序列的第五氨基酸序列，和包含如SEQ ID NO:12所示序列的第六氨基酸序列。例如：该抗人流感病毒单克隆抗体可包括抗体3A2。该抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有：包含如SEQ ID NO:13所示序列的第一氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:14所示序列的第二氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:15所示序列的第三氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:16所示序列的第四氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:17所示序列的第五氨基酸序列，和包含如SEQ ID NO:18所示序列的第六氨基酸序列。例如：该抗人流感病毒单克隆抗体可包括抗体10C4。

该单克隆抗体可通过将来自人例如感染乙型流感病毒的患者或/和被接种者的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合形成的杂交瘤细胞产生。感染的乙型流感病毒可包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。该融合伴侣细胞可以为SPYMEG细胞。

相应地，本发明提供了一种产生抗人乙型流感病毒单克隆抗体的方法。该方法可包括通过将来自人例如感染乙型流感病毒的患者或/和被接种者的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合产生杂交瘤细胞。该方法还可包括从所述杂交瘤细胞获得抗人流感病毒单克隆抗体。该方法中的乙型流感病毒可包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。融合伴侣细胞可为SPYMEG细胞。因此，本发明还提供了根据上述方法产生的抗人流感病毒单克隆抗体。该单克隆抗体可包括：例如，人单克隆抗体和/或人源化单克隆抗体。

本发明提供了抗流感抗体及包含其抗原结合片段的多肽、以及使用其的方法、用途、组合物和试剂盒。本发明提供了一种形成对流感特异性的抗体或其多肽或片段的方法。该方法可包括：提供编码流感抗原多肽或包含其免疫特异性表位的多肽的核酸；从分离的核酸表达含有抗原氨基酸序列的多肽或含有其免疫特异性表位的多肽；和产生对所获得的多肽特异性的抗体或含有其抗原结合片段的多肽。本发明提供了通过上述的方法产生的抗体或含有其抗原结合片段的多肽。本发明提供了分离的抗体或分离的包含其抗原结合片段的多肽，其特异性结合流感抗原。上述抗体可以采用本领域已知的任何可接受的方法生产。抗体、以及使用抗体的试剂盒、方法和/或本发明的其它方面可包括以下一种或多种：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、单价抗体、双价抗体和/或人源化抗体。

自然产生的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这样的四聚体都可由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条全长“轻”链(如：约25000道尔顿分子量(25kDa))和一条全长“重”链(如：约50000～70000道尔顿分子量(50～70kDa))。每条链的氨基末端部分通常包含大约100～110个或更多氨基酸的可变区，其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定可能负责效应子功能的恒定区。人轻链通常被归类为K和λ轻链。重链通常被归类为μ，δ，γ，α或ε，并分别限定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM有亚类，包括但不限于：IgM1和IgM2。相似地，IgA细分为亚类，包括但不限于：IgA1和IgA2。在轻链和重链内，可变区和恒定区可通过约12个或更多氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。参见，例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(为所有的目的通过援引将其全部内容并入)。每条轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

可变区通常显示相同的基本结构，由三个超变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的框架区(FR)。通常，来自每一对的两条链的CDRs由框架区对齐，其能结合特异性表位。从氨基端到羧基端，轻链和重链的可变区通常都包含FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。通常根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))；或Chothia&Lesk J.MoI.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature342:878-883(1989)中的限定将氨基酸分配到每个结构域。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如：完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括：Fab、Fab1、F(ab')2和Fv片段；双价抗体；线性抗体(Zapata等,ProteinEng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有一个单个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的性能。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且还能够交联抗原。“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。该区包括紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体。单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个CDRs的Fv的一半)能够识别和结合抗原。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链。Fv多肽还可包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，能够使得sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994).

抗体可用作探针、治疗处理及其他用途。可通过将翻译产物或其合成多肽片段注射到小鼠、兔、山羊或其他动物体内来制得抗体。这些抗体用于诊断测试，或作为药物组合物中的活性成分。

可将施用的抗体或多肽偶联到官能剂上以形成免疫偶联物。官能剂可以是细胞毒素剂如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、或放射性同位素(即放射性偶联物)、抗生素、溶核酶、或它们的任意组合。化学治疗剂可以用于产生免疫偶联物，例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂、酶、和/或它们的片段，如溶核酶、抗生素、和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括：例如，白喉A链(diphtheria A chain)、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(exotoxin A chain)(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思豆毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)，α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白，石竹素蛋白(dianthin protein)，美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石碱草(saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、和单端孢霉烯族毒素类(tricotheeenes)。本领域已知或可用的任何合适的放射性核苷酸或放射性试剂均可用于产生放射性偶联的抗体。

可用各种双官能蛋白偶联剂将抗体与细胞毒素剂偶联。双官能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫代杂环戊烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛(glutareldehyde))、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸盐(酯)(例如甲苯(tolyene)2,6-二异氰酸盐(酯))、双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、马来酰亚胺己酰(Maleimidocaproyl,MC)、缬氨酸-瓜氨酸、蛋白酶可裂解接头(VC)中的二肽位点、2-氨基5-脲基戊酸PAB＝对氨基苯甲基氨基甲酰(p-aminobenzylcarbamoyl)(接头的“自脱落”部分)(Citrulene)、N-甲基-缬氨酸瓜氨酸，其中接头肽键已被修饰以防止被组织蛋白酶B裂解(Me)；马来酰亚胺己酰基-聚乙二醇，连接于抗体半胱氨酸；N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)；和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以根据Vitetta等在Science，238：1098(1987)中所述的方法来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的代表性螯合剂，参见WO 94/11026。抗体可以偶联到“受体”(如抗生蛋白链菌素)用于肿瘤预靶向，其中，将所述抗体-受体偶联物施用给受试者，随后使用清除剂从循环中清除未结合的偶联物，然后施用偶联到细胞毒素剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。

本发明的抗体可以通过本领域公知的技术直接或间接地偶联至可检测标记物。可检测标记物是一种例如通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的试剂。有用的可检测标记物包括，但不限于，荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、电子密集试剂、酶、有色颗粒、生物素或地高辛(dioxigenin)。可检测标记物往往会产生可测量的信号，如放射性、荧光、颜色或酶活性。与可检测试剂偶联的抗体可用于诊断或治疗目的。可检测试剂的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属、和非放射性顺磁金属离子。可检测物质可以采用本领域已知技术直接地与抗体、或间接地通过中间体如本领域已知的接头，连接或偶联。参见，美国专利第4,741,900号，记载了金属离子与抗体的偶联用于诊断。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的一个实例包括发光氨；生物发光材料的实例包括虫荧光素和发光蛋白质。

实施本发明有用的抗体可用下述方法在实验室动物中或重组DNA技术来制备。可通过多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射基因产物分子或其片段并联合佐剂如弗氏佐剂(完全或不完全)而在动物中产生多克隆抗体。为了提高免疫原性，可用双功能或衍生剂，例如，马来酰亚氨基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、氯化亚砜(SOCl)等，先将含有靶氨基酸序列的基因产物分子或片段偶联到在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白上，例如：钥孔戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，可能是很有用的。或者，具有免疫原性的偶联物可作为融合蛋白重组生成。

通过将约1毫克或约1微克偶联物(分别对兔子或小鼠)与约3倍体积的弗氏完全佐剂结合，并皮内多点注射该溶液，实现用具有免疫原性的偶联物或衍生物(例如含有此靶氨基酸序列的片段)，对动物进行免疫。大约7至14天后，采集动物的血液，并对血清进行抗体滴度检测。用抗原反复对动物进行加强免疫直至到达滴度平台处。可以用与最初免疫所用的相同的分子或其片段对动物进行加强免疫，但其与不同蛋白偶联和/或通过不同交联剂偶联。此外，可将例如明矾等聚集剂用于注射液中以提高免疫应答。

施用的抗体可包括嵌合抗体。施用的抗体可包括人源化抗体。施用的抗体可包括完全人源化抗体。该抗体可以是人源化的或部分人源化的。非人抗体可以使用本领域中已知的任何适用的方法进行人源化。人源化抗体可使用免疫系统已经被部分或完全人源化的转基因动物来制备。本发明的任何抗体或其片段可以是部分或完全人源化的。嵌合抗体可以使用本领域中任何已知的技术来制备。参见，例如美国专利第5169939、5750078、6020153、6420113、6423511、6632927和6800738号。

施用的抗体可包括单克隆抗体，即，本发明的抗流感抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤方法，如Kohler和Milstein在Nature，256:495(1975)中所记载的那些方法，来进行制备。在杂交瘤方法中，用免疫剂对小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物进行常规免疫，以激发淋巴细胞，这些淋巴细胞产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。可用如下所述方法筛选单克隆抗体，例如，Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies,Principles and Practice(2d ed.)Academic Press,New York(1986)。可测试单克隆抗体与翻译产物的特异性免疫反应性和与相应的原型基因产物的免疫反应性缺乏。

单克隆抗体可以通过从免疫动物中取出脾细胞，以传统方式例如通过与骨髓瘤细胞融合使细胞无限增殖来进行制备。然后筛选出表达期望抗体的那些克隆。单克隆抗体优选与其他基因产物没有交叉反应。在鉴定出所需杂交瘤细胞后，将这些克隆用有限稀释程序进行亚克隆并用标准方法使其生长。适于此目的的培养基，包括：例如，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基，Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可作为腹水在哺乳动物体内生长。亚克隆分泌的单克隆抗体可用常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白质A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基或腹水中分离或纯化。

单克隆抗体也可以通过使用重组DNA方法，例如美国专利第4816567号所述的那些方法进行制备。可用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序编码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞可作为此类DNA的优选来源。一旦分离，所述DNA可置于表达载体中，然后将该载体转染到不会以其它方式产生免疫球蛋白的宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可通过，例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列，或者通过将免疫球蛋白编码序列共价结合于非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来对DNA进行修饰。此类非免疫球蛋白多肽可替代本发明抗体的恒定结构域，或可替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。采用重组DNA方法例如噬菌粒展示方法(phagemiddisplay method)制备抗体可使用市售的试剂盒来完成，例如，从Pharmacia(Uppsala,Sweden)可得的重组噬菌粒抗体体系，或SurfZAP^TM噬菌体展示系统(Stratagene Inc.,LaJolla,Califorinia).

本发明还包括：产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系、转化的B细胞系、宿主细胞；这些杂交瘤、转化的B细胞系和宿主细胞的子代或衍生物；以及等同或类似的杂交瘤、转化的B细胞系和宿主细胞。

该抗体可以是双价抗体。术语“双价抗体(diabody)”是指含有两个抗原结合位点的小抗体片段，片段包含一条与同一多肽链中的轻链可变结构域(V_L)相连的重链可变结构域(V_H)(Vn-V_L)。通过使用太短的连接物以致无法允许相同链上的两个结构域之间进行配对，能够迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，形成两个抗原结合位点。例如在欧洲专利EP 404,097、W093/11161和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中对双价抗体有更为全面的论述。

施用的抗体可包括单链抗体。该抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰重链。一般来说，可在Fc区的任何一点将重链截断，以防止重链交联。或者，以另一氨基酸残基替代相关的半胱氨酸残基或去掉相关的半胱氨酸残基以防止交联。体外方法也是合适用于产生单价抗体。可使用本领域已知常规技术来实现抗体消化，以产生抗体片段，特别是Fab片段。

抗体可以是双特异性的。双特异性抗体(bispecific antibody)特异性结合一个蛋白质，并特异性结合与病理和/或治疗相关的其它抗原，可使用文献中记载的标准程序制备、分离和测试双特异性抗体。(参见：例如，Pluckthun和Pack,Immunotechnology,3:83-105(1997)；Carter等,J.Hematotherapy,4:463-470(1995)；Renner和Pfreundschuh,Immunological Reviews,1995,No.145,pp.179-209；Pfreundschuh的美国专利第5643759号；Segal等,J.Hematotherapy,4:377-382(1995)；Segal等,Immunobiology,185:390-402(1992)；和Bolhuis等,Cancer Immunol.Immunother.,34:1-8(1991))。

本文公开的抗体可构建为免疫脂质体。包含抗体的脂质体可用本领域已知的方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)以及美国专利第4,485,045和4,544,545号所描述的。美国专利第5,013,556号公开了循环时间延长的脂质体。可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法制备特别有用的脂质体。可以通过确定孔径的滤膜挤出以得到具有理想直径的脂质体。本发明抗体的Fab'片段可通过二硫化物互换反应偶联到脂质体上，如Martin等，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)所述。可选地，化学治疗剂(如阿霉素(Doxorubicin))可以包裹到脂质体内。参见，Gabizon等，J.National Cancer Inst.,81(19):1484(1989)。

流感拮抗剂可包括结合乙型流感病毒的血凝素(HA)蛋白的适配子。适配子可在与本文所述的抗体相同的位置/表位和/或其它位置/表位结合HA。适配子可包含一个或多个核酸、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)和氨基酸。可用任何适宜的技术或方案选择和产生适配子。例如，具有18至50个核苷酸长度的可变区的寡核苷酸文库可用作失控转录反应的模板，以产生RNA适配子的随机池。随后，该适配子池可暴露于未偶联的基质以除去非特异性相互作用的物质。然后将剩余的池与固定化的靶物质进行温育。在该池中的大多数适配子物质具有低亲和力，因为可洗掉靶物质，留下与基质结合的更小更特异性的池。随后，该池可被洗脱、沉淀、逆转录，并用作失控转录的模板。经过五轮筛选，被克隆和测序的部分可被移除。筛选可以一直持续直到相似的序列被重复地回收。

可用珠粒筛选体系实现适配子生产。在这个过程中，产生一个珠粒文库，其中每个珠粒包被有大量的具有相同序列的适配子，该序列由天然和修饰的核苷酸组成。该珠粒文库，可包含大于100,000,000条独特的序列，可与偶联标签例如荧光染料的血凝素(HA)蛋白、或其部分如细胞外结构域对应的肽进行温育。洗涤后，可将显示出最高结合亲和力的珠粒分离，并可确定适配子序列用于后续的合成。

本发明提供一种抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，包括：将有效治疗量的本发明的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段给药予人受试者。该方法还包括：诊断感染乙型流感的患者。可在诊断患者感染流感之前、当中、和/或之后施用本发明的抗流感抗体或其抗原结合片段。

该方法还包括：监测至少一种乙型流感感染症状的减轻。例如，至少一种症状可包括：发烧、头痛、乏力、畏寒、全身不适，肌痛、关节痛、鼻塞、咽痛、咳嗽、呼吸困难、胃痛或它们的任意组合。抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合联合针对乙型流感和/或其他流感如甲型流感和/或丙型流感的一种或多种另外的治疗方法施用，该联合可以协同作用以抑制或治疗乙型流感感染。上述一种或多种另外的治疗可包括，例如，神经氨酸酶抑制剂、红细胞凝集素抑制剂、抗炎剂、或者它们的任意组合。神经氨酸酶抑制剂可包括，例如，扎那米韦(zanamivir)、奥塞米韦(oseltamivir)、帕拉米韦(peramivir)、那尼纳米韦(laninamivir)、其任何药学上可接受的盐、或它们的任意组合。

按照本发明，可以施用两种或两种以上的流感拮抗剂。至少一种流感拮抗剂可包括乙型流感拮抗剂。所述至少一种乙型流感拮抗剂可联合一种或多种甲型流感拮抗剂和/或一种或多种丙型流感拮抗剂。至少一种流感拮抗剂可联合一种或多种另外的直接抗流感病毒感染的治疗方法施用。两种或两种以上治疗方法，包括一种或多种流感拮抗剂，其实施可以是同时的、连续的或联合的。因此，当施用两种或两种以上治疗方法，他们不必同时、或以相同的方式、或按相同的剂量施用。当同时施用时，两种或两种以上治疗方法可以施用相同的组合物或不同的组合物。两种或两种以上治疗方法可以使用相同或不同的给药途径进行施用。当在不同时间施用时，一种治疗方法可在另一种治疗方法之前或之后施用。两种或两种以上治疗方法的施用顺序可以交替。一种或多种治疗方法的各自的剂量可随时间而变化。一种或多种治疗方法的类型可随时间而变化。当在间隔的时间施用时，两种或两种以上施用的间隔可以是任何时间段。如果多次施用，时间周期的长度可以变化。两种或两种以上两种或两种以上治疗方法的施用之间的间隔可以是0秒、1秒、5秒、10秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、7.5小时、10小时、12小时、15小时、18个小时、21小时、24小时、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、3周、4周、1个月、6周、8周、3个月、6个月、1年或更长的时间。

两种或两种以上的流感拮抗剂可协同作用以治疗或减轻流感感染或其症状，例如发烧。流感拮抗剂可以是单独的一种或多种抗流感抗体，或联合一种或多种其它的流感拮抗剂，例如小的药物制剂，或其它抗流感的治疗方法。两种或两种以上的抗流感抗体或至少一种抗流感抗体，和一种或多种另外的治疗方法可以协同作用以治疗或减轻乙型流感病毒感染。两种或两种以上治疗方法，包括一种或多种抗流感抗体，可以以协同剂量施用。因此，无论是同时、顺序或以任何联合施用，两种或两种以上治疗方法的施用可对减轻流感感染的一种或多种症状产生协同作用。第一种治疗方法可以提高第二种治疗方法的疗效，比第二种治疗方法单独施用时的疗效更好；或者，第二种治疗方法提高第一种治疗方法的疗效；或者，两者兼而有之。施用两种或两种以上治疗方法的效果可以是这样的：减轻流感感染的一种或多种症状的效果大于每种疗法单独施用的效果的总和。当以协同剂量给药时，一种治疗方法可以提高一种或多种其它治疗方法在减轻流感感染的一种或多种症状上的效果，即使一种或多种治疗方法单独施用该剂量对于流感感染的一种或多种症状没有实质的影响。协同作用的测量和计算，可根据Teicher在"Assays for In Vitro and In VivoSynergy,"in Methods in Molecular Medicine,vol.85:Novel Anticancer Drug Protocols,pp.297-321(2003)中的记载，和/或通过使用CalcuSyn软件计算联合指数(combinationindex,CI)来实现。

本发明提供了本发明的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的药物中的用途。本发明还提供了一种检测人受试者中人乙型流感的方法，可包括：将来自人受试者的样品与本发明的抗人乙型流感病毒人抗体或其抗原结合片段接触。该方法还可包括：根据抗体是否结合人乙型流感病毒的血凝素(HA)蛋白，检测人受试者中存在或不存在人乙型流感病毒。本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗人流感病毒人抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本发明还进一步提供了一种用于人受试者中人乙型流感的预防、治疗和检测的至少一个的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段。所述试剂盒可包括药物组合物和/或一种或多种另外的抗乙型流感或其他的拮抗剂。

确切的制剂、给药途径和剂量可由每个医生考虑患者的状况来选择(参见：例如，Fingl等，在The Pharmacological Basis of Therapeutics,1975,Ch.1p.I.中)。主治医生可根据毒性或器官功能障碍确定何时终止、中断或调整给药。相反地，如果临床反应不充分，在排除毒性的情况下，主治医生也可以将治疗调整到更高的等级。在对感兴趣的病症的处理中，给药剂量的大小根据待治疗的病症的严重程度和给药途径而有所不同。疾病的严重程度可以，例如，某种程度上通过标准预后评价方法进行评估。剂量和给药频率可根据患者个体的年龄、体重和反应而变化。兽医学中也可以使用与以上讨论相似的程序。

使用药学上可接受的载体以将在此公开的用于实践本发明的化合物配制成适合全身给药的剂型，这属于本发明的范围。通过适当选择载体和合适的制造实践，与本发明相关的组合物，具体而言，那些配制成溶液的组合物，可以不经肠胃给药，诸如静脉注射。使用本领域熟知的药学上可接受的载体可以很容易将这些化合物配制成适合口服的药剂。这些载体能使本发明相关化合物配制为片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、片剂、糖衣丸剂、溶液、悬浮液等，用于待治疗患者口服。

所述治疗剂可以制备为长效剂(depot)形式，以允许对所施用的身体中的释放时间和位置的控制(参见，例如，美国专利第4,450,150号)。治疗剂的长效剂形式可以是，例如，包含治疗剂和多孔或无孔材料如聚合物的可植入组合物，其中治疗剂被材料包封或通过所述材料和/或无孔材料的降解而扩散。然后将长效剂植入体内所需位置，并且治疗剂以预定的速率从植入体释放。

本发明中使用的治疗剂可以为组合物的形式，如包含有载体和治疗化合物的药物组合物。包含治疗剂的药物组合物可包括一种以上的治疗剂。或者，药物组合物可包含治疗剂和其他药物活性剂或药的组合。

载体可以是任何合适的载体。例如，载体可以是药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以是任何考虑化学-物理因素例如溶解性和缺少与活性化合物的反应性并通过给药途径常规使用的那些载体。除了或替代下述药物组合物，本发明方法的治疗化合物可被配制为包合物，如β-环糊精包合物，或脂质体。

本文所述的药学上可接受的载体，例如运载体(vehicle)、佐剂、赋型剂和稀释剂，为本领域技术人员所熟知并且公众易于获得。药学上可接受的载体可以是化学上对活性剂为惰性的和在使用条件下没有有害的副作用或毒性的载体。载体的选择可部分地由特定的治疗剂，以及由用于施用治疗化合物的特定方法来决定。本发明的药物组合物有多种合适的制剂。以下的制剂用于口服、喷雾、肠胃外、皮下、经皮、经粘膜、肠、髓内注射、直接心室内、静脉内、鼻内、眼内、肌内、动脉内、鞘内、腹膜内、直肠和阴道给药为示例性的，并且决不是限制性的。一种以上的途径可用于施用治疗剂，并且在某些情况下，特定途径可以比另一种途径提供更快速和更有效的应答。根据治疗的具体病症，可以配制此类药剂并且全身或局部地给药。制造和给药的技术可在Remington's PharmaceuticalSciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)中找到。

适于口服给药的制剂可以包括(a)液体溶液，如溶解在稀释剂如水、盐水或橙汁中的有效量的抑制剂；(b)胶囊、囊剂、片剂、锭剂(lozenge)和锭剂(troche)，其各自含有预定量的固体或颗粒的活性成分；(c)粉剂；(d)在合适液体中的悬浮液；和(e)合适的乳剂。液体制剂可以包括稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，同时添加或不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是常规的硬壳或软壳明胶类型，其含有，例如，表面活性剂、润滑剂、和惰性填料，如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括以下各项中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、和其他药学上相容的赋形剂。锭剂(lozenge)形式可以包含在调味剂通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的抑制剂，以及在惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶、乳剂、凝胶中包含抑制剂的锭剂(pastille)，和类似物，其除了抑制剂还包含本领域已知的赋形剂。

可用于口服的药物制剂包括由明胶制备的推合胶囊(push-fit capsule)以及由明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制备的软、密封胶囊。推合胶囊可含有活性组分与填料例如乳糖、粘结剂如淀粉、和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁、以及可选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。

单独使用或与其它合适的组分联合使用的治疗剂可被制成经由吸入给药的气雾剂制剂。这些气雾剂制剂可以置于加压可用的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。它们也可以制成用于非加压制剂的药物，如在喷雾器或雾化器中。这样的喷雾制剂也可用于粘膜喷雾。局部制剂是本领域技术人员众所周知的。这样的制剂特别适合用于在本发明的上下文中涂敷至皮肤。

可注射制剂是符合本发明的。用于可注射组合物的有效药物载体的参数是本领域技术人员熟知的(参见：例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers编辑,238-250页(1982),以及ASHP Handbook onInjectable Drugs,Toissel,第4版，622-630页(1986))。用于注射时，本发明的药剂可以配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜给药，适用于渗透屏障的渗透剂用于制剂中。该渗透剂通常是本领域已知的。

适用于肠胃外给药的制剂可以包括含水的和无水的、等渗无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受体的血液等渗的溶质，以及含水的和无水的无菌悬浮液，该无菌悬浮液可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。治疗剂可以在药物载体中在生理上可接受的稀释剂中进行施用，该稀释剂如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液、醇如乙醇或十六醇、二醇如丙二醇或聚乙二醇，聚(乙二醇)400、丙三醇、二甲亚砜、缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，如脂肪酸盐(soap)或去垢剂、助悬剂如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素、或乳化剂和其他药物佐剂。

可以用于肠胃外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石蜡油和矿物油。适用于肠胃外制剂的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。

适用于肠胃外制剂中的脂肪酸盐(soap)包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，而合适的去垢剂包括(a)阳离子去垢剂，例如，二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶，(b)阴离子去垢剂如，例如，烷基、芳基和烯烃磺酸酯(或盐)、烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸酯(或盐)和磺基琥珀酸酯(或盐)，(c)非离子去垢剂如，例如，脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去垢剂如，例如，烷基-β-氨基丙酸酯(或盐)，和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。

肠胃外制剂在溶液中可含有约0.5重量％至约25重量％的药物。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射位点处的刺激，所述组合物可以包含一种或多种非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。表面活性剂在所述制剂中的量通常为约5重量％至约15重量％。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯，如单油酸脱水山梨醇酯、和环氧乙烷与通过缩合环氧丙烷和丙二醇形成的疏水基质的高分子量加合物。肠胃外制剂可以置于单位剂量或多剂量的密封容器如安瓿和小药瓶中，并且可以存储在冷冻干燥(低压冻干)条件下，其仅需要在使用前即刻添加注射用无菌液体赋形剂，例如，水。临时注射溶液和悬浮液可以制备自之前所述类型的无菌粉剂、粒剂和片剂。

所述治疗剂可以通过与各种基质，例如乳化基质或水溶性基质，混合制成栓剂。适于阴道给药的制剂可以为含有活性成分和本领域已知适用的载体的阴道栓剂、塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。

预期用于细胞内给药的制剂可使用本领域技术人员熟知的技术给药。例如，这些制剂可以包封在脂质体中。脂质体为具有含水内部的球形脂质双层。脂质体形成时水溶液中存在的分子被并入该含水内部。脂质体内含物被保护免受外部微环境影响，且由于脂质体与细胞膜融合而被有效地输送至细胞质。另外，由于其疏水性，有机小分子可直接细胞内给药。所述的用于本发明的一个方面的材料和方法也可以用于本发明的其它方面。例如，材料如描述用于筛选分析的核酸或抗体也可用作治疗剂，反之亦然。

本发明包括任意次序和/或任意组合的以下方面/实施例/特征：

1.本发明涉及一种抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，具有抗人乙型流感病毒的中和活性，其中，所述单克隆抗体包括人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。

2.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有抗B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、和B/Mie/1/1993病毒株中的至少一种的中和活性。

3.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有抗B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种的中和活性。

4.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒人单克隆抗体，其中，所述人单克隆抗体是通过将来自感染乙型流感病毒的人的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合形成的杂交瘤细胞产生。

5.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒人单克隆抗体，其中，所述乙型流感病毒包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。

6.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人乙型流感病毒人单克隆抗体，其中，所述融合伴侣细胞为SPYMEG细胞。

7.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，包括IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dsFv。

8.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：

重链可变区，其包括：

第一互补决定区(CDR1)，具有包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:13所示的序列的第一氨基酸序列；

第二互补决定区(CDR2)，具有包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:14所示的序列的第二氨基酸序列；和

第三互补决定区(CDR3)，具有包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:15所示的序列的第三氨基酸序列；和

轻链可变区，其包括：

第一互补决定区(CDR1)，具有包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:16所示的序列的第四氨基酸序列；

第二互补决定区(CDR2)，具有包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:17所示的序列的第五氨基酸序列；和

第三互补决定区(CDR3)，具有包含如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:18所示的序列的第六氨基酸序列。

9.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二氨基酸序列包含如SEQ ID NO:2所示的序列，所述第三氨基酸序列包含如SEQ ID NO:3所示的序列，所述第四氨基酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第五氨基酸序列包括SEQID NO:5所示的序列，所述第六氨基酸序列包括SEQ ID NO:6所示的序列。

10.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人流感病毒单克隆抗体包括抗体5A7。

11.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一氨基酸序列包含如SEQ ID NO:7所示的序列，所述第二氨基酸序列包含如SEQ ID NO:8所示的序列，所述第三氨基酸序列包含如SEQ ID NO:9所示的序列，所述第四氨基酸序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列，所述第五氨基酸序列包括SEQ ID NO:11所示的序列，所述第六氨基酸序列包括SEQ ID NO:12所示的序列。

12.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人流感病毒单克隆抗体包括抗体3A2。

13.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一氨基酸序列包含如SEQ ID NO:13所示的序列，所述第二氨基酸序列包含如SEQ ID NO:14所示的序列，所述第三氨基酸序列包含如SEQ ID NO:15所示的序列，所述第四氨基酸序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列，所述第五氨基酸序列包括SEQ ID NO:17所示的序列，所述第六氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示的序列。

14.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人流感病毒单克隆抗体包括抗体10C4。

15.一种药物组合物，包含任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体.

16.一种用于人受试者中人乙型流感的预防、治疗和检测的至少一个的试剂盒，所述试剂盒包含任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段。

17.一种抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，包括：将有效治疗量的任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段给药予人受试者。

18.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，还包括：诊断感染乙型流感的患者。

19.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，还包括：监测至少一种乙型流感感染症状的减轻。

20.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，其中，至少一种症状包括：发烧、头痛、乏力、畏寒、全身不适，肌痛、关节痛、鼻塞、咽痛、咳嗽、呼吸困难或胃痛、或者它们的任意组合。

21.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，其中，将如权利要求1所述的抗人流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段联合针对乙型流感的一种或多种另外的治疗方法施用。

22.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，其中，所述联合协同作用以抑制或治疗乙型流感感染。

23.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，其中，所述一种或多种另外的治疗方法包括神经氨酸酶抑制剂、红细胞凝集素抑制剂、抗炎剂或者它们的任意组合。

24.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的方法，其中，所述神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦(Zanamivir)、奥塞米韦(Oseltamivir)、帕拉米韦(Peramivir)、那尼纳米韦(Laninamivir)、其任何药学上可接受的盐或它们的任意组合。

25.任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人乙型流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的药物中的用途。

26.一种检测人受试者中人乙型流感的方法，包括：将来自人受试者的样品与任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段接触；和根据抗体是否结合人乙型流感病毒的血凝素(HA)蛋白，检测人受试者中存在或不存在人乙型流感病毒。

27.一种产生抗人乙型流感病毒人单克隆抗体的方法，包括：通过将来自感染乙型流感病毒的人的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合产生杂交瘤细胞；和从所述杂交瘤细胞获得抗人流感病毒单克隆抗体。

28.一种产生任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人乙型流感病毒人单克隆抗体的方法，其中，所述乙型流感病毒包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。

29.一种产生任一前述或以下的实施例/特征/方面的抗人流感病毒人单克隆抗体的方法，其中，所述融合伴侣细胞为SPYMEG细胞。

30.根据任一前述或以下的实施例/特征/方面的方法产生的抗人流感病毒人单克隆抗体。

本发明可以包括在以上和/或以下的句子和/或段落中阐述的这些各种特征或实施例的任意组合。本文公开的特征的任意组合均视为本发明的一部分，并且对于能组合的特征没有任何限制。

本发明将通过以下实施例进一步阐明，这些实施例仅为本发明的示例，并不意图限制本发明。使用经大阪大学微生物疾病研究所的机构审查委员会批准的方案(#19-8-6)收集人体材料。动物研究是依据大阪大学微生物疾病研究所对于实验动物的护理和使用的准则和适用的法律进行的。它们由大阪大学微生物疾病研究所动物实验委员会批准(#H21-24-0)，由2006年通过的日本文部科学省所管辖下的学术研究机构正确进行动物实验及相关活动的基本准则所规定。国家传染病研究所和Shin-ichi Tamura博士(国家传染病研究所)提供病毒株。Natsuko Fukura、Azusa Asai、Tadahiro Sasaki和Yohei Watanabe提供了有益的建议和技术帮助。数据表示为平均值+或-平均值的标准误差(SEM)。经学生t检验(Student's t test)进行统计分析。P值<0.05被认为是显著的。

使用了八种乙型流感疫苗株(B/Victoria/2/198病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Malaysia/2506/2004病毒株、和B/Florida/4/2006病毒株)和小鼠适应株B/Ibaraki/2/1985。B/Malaysia/2506/2004和B/Florida/4/2006病毒株由日本东京的国家传染病研究所友好提供。小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985病毒株由国家传染病研究所的S.Tamura博士提供(Chen等,Vaccine19:1446-1455)。病毒在Madin-Darby犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)或9日龄鸡胚中繁殖。感染性通过病灶形成试验(focus-forming assay)进行滴定。

[实施例]

本发明将通过以下实施例进一步阐明，这些实施例仅为本发明的示例，并不意图限制本发明。

[实施例1]

根据Kubota-Koketsu等，Biochemical and Biophysical Research Communications387:180-185(2009)中所述的步骤制备人单克隆抗体(HuMAbs)。健康志愿者接种HA裂解疫苗，包括：A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Uruguay/716/2007(H3N2)和B/Florida/4/2006病毒株。一至二周后，将取自被接种者的PBMCs与SPYMEG细胞融合，在筛选和克隆后构建出三个杂交瘤克隆，产生HuMAbs，分别记为5A7、3A2和10C4。HuMAbs的反应性通过IFA和蛋白质印迹法(Western blotting)检测。

简而言之，从在2008/2009冬季接种包括A/Brisbane/59/2007、A/Uruguay/716/2007和B/Florida/4/2006的三价HA裂解疫苗(一般财团法人阪大微生物病研究会，香川，日本)的健康志愿者抽取10毫升血液，然后通过Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)进行密度梯度离心收集PBMCs。由小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14和人巨核细胞系MEG-01构建的SPYMEG细胞用作融合伴侣细胞。SPYMEG细胞为人类和鼠免疫球蛋白的非分泌细胞。使用聚乙二醇#1500(Roche Diagnostics，Mannheim,Germany)将PBMCs与SPYMEG细胞融合。在添加15％胎牛血清和次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基，Invitrogen,Carlsbad,CA)培养该融合细胞。通过免疫荧光测定(IFA)进行流感病毒特异性单克隆抗体的第一次筛选。关于IFA，将被感染的细胞用无水乙醇固定，然后与杂交瘤上清液在37℃反应30分钟，接着与FITC-偶联的抗人IgG在37℃温育45分钟。通过有限稀释对特异性单克隆抗体阳性孔中的细胞进行克隆，然后通过IFA进行第二次筛选。取自于IFA阳性孔(每个孔都有一个单一集落)的杂交瘤细胞在杂交瘤-SFM(Invitrogen)中进行培养和扩大。用HiTrap蛋白G HP柱(GE Healthcare)通过亲和层析法对100毫升杂交瘤细胞培养上清液中的单克隆抗体进行纯化，然后用Slide-A-Lyzer^(R)透析盒(Thermo Scientific,Waltham,MA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析。

关于IgG同种型，在0.05M的碳酸氢钠缓冲液(pH8.6)中4℃下用山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc,West Grove,PA)包被ELISA微孔板(Maxsorp；Nunc,Copenhagen,Denmark)过夜。用含0.1％Tween-20的PBS洗涤后，在PBS中在37℃用0.5％BSA将孔封闭1小时。再次洗涤后，用杂交瘤细胞上清液或对照血清在37℃将孔温育2小时。接下来继续洗涤，用HRP-偶联的抗人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(SouthernBiotech,Birmingham,AL)在37℃将孔温育1小时。将孔洗涤5次，然后用TMB过氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,MD)在室温下在黑暗中温育。20分钟后，用2N H2SO4溶液使反应停止。用ELISA光度计(Biotek ELISA Reader；Biotek,Winooski,VT)在450nm处读取显色读数。所有样品均重复三次。

对于HuMAb可变区的测序，使用PrimeScript RT试剂盒(Takara,滋贺,日本)和oligo(dT)引物，对使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen公司)从杂交瘤细胞中提取的总RNA进行RT-PCR。使用以下引物对HuMAb的H-和L-链的编码区进行PCR扩增：5'-ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT-3'(H-链正向)(SEQ ID NO.19)和5'-CTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTA-3'(H-链反向)(SEQ ID NO.20)；和5'-ATGGCCTGGRYCYCMYTCYWCCTM-3'(L-链正向)(SEQ ID NO.21)和5'-TGGCAGCTGTAGCTTCTGTGGGACT-3'(L-链反向)(SEQ ID NO.22)。将PCR产物连接到pGEM-T Easy载体(Promega)中，并使用BigDye终止v3.1循环测序试剂盒(BigDyeTerminator v3.1Cycle Sequencing Kit)和ABI Prism3100遗传分析仪(ABI Prism3100Genetic Analyzer)(Applied Biosystems,Foster City,CA)对它们的序列进行了分析。

使用具有各种H-和L-链的可变区基因的T Easy载体构建IgG质粒，其中使用下列引物对(限制性内切酶位点以下划线示出)对各种H-和L-链的可变区基因进行PCR来添加限制性酶切位点和Kozak序列：5'-ATTTGCGGCCGCCATGGAGTTTGGGCTGAG-3'(HC_5Fw_NotI；H-链正向)(SEQ ID NO.23)和5'-ATACTCGAGGGTGCCAGGGGGAAGACCGATG-3'(HC_Reverse_XhoI；H-链反向)(SEQ ID NO：24)；和5'-ATTTGCGGCCGCCATGGCCTGGGCTCTGCT-3'(5A7Lambda_18Fw_NotI；L-链正向)(SEQ ID NO：25)和5'-ATACTCGAGGGCGGGAACAGAGTGACCGTGG-3'(Lambda_Reverse_XhoI；L-链反向)(SEQ ID NO：26)。H-和L-链的编码区的PCR产物分别用限制性内切酶Not I和Xho I进行消化，然后与分别具有γ和λ链的人免疫球蛋白恒定区的pQCXIP-hCH和pQCXIH-hCλ(MBL)表达载体连接。

所有三个HuMAbs与乙型流感病毒的HA蛋白均发生反应(表1)。人单克隆抗体5A7和10C4均为IgG1同种型，3A2为IgG3(表1)。三个HuMAbs的V_H和V_L区的测序分析显示，在包括互补决定区(CDRs)的抗原区各自具有不同的氨基酸残基(表2和表3)。

表1

表1：HuMAbs的反应模式

	靶标	同种型	IFA	还原型蛋白质印迹测定
					5A7	乙型流感的HA蛋白	IgG1	+¹	+
3A2	乙型流感的HA蛋白	IgG3	+	-²
					10C4	乙型流感的HA蛋白	IgG1	+	-

¹阳性结果²阴性结果

表2

表2：三个HuMAbs的V_H中CDR的氨基酸推导序列

表3

表3：三个HuMAbs的V_L中CDR的氨基酸推导序列

人单克隆抗体的中和活性如下测定。病毒中和(VN)的测定按照Okuno等28:1308-1313(1990)的方法来进行，并略做改动。采用必需基本培养基(MEM；Invitrogen)对浓度为100微克/ml的单克隆抗体进行4倍连续稀释，并与200病灶形成单位(FFU)的病毒在37℃温育1小时。然后，MDCK细胞在37℃用混合物吸收1小时。在温育12小时后，将细胞固定并进行IFA。抑制50％的病毒生长的单克隆抗体的最低浓度设为VN₅₀滴度。在病灶形成测定(focus formation assay)中，96孔板中的MDCK细胞在37℃用10倍连续稀释的病毒吸收1小时。然后用PBS洗涤细胞并在37℃温育12小时。将细胞固定并进行IFA。

对三个HuMAbs进行VN测定。与人单克隆抗体3A2和10C4相比，人单克隆抗体5A7的VN₅₀较低(6.25-25微克/毫升)。然而，5A7中和1985～2006年分离的Yamagata和Victoria系。人单克隆抗体3A2和10C4对于Yamagata系的VN₅₀为0.02-6.25微克/毫升，但它们几乎不中和除小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985之外的任何Victoria系，3A2稍微中和小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985(表4)。为了阐明三个HuMAbs的中和机理，还进行了HI和融合抑制测定。血凝素抑制(HI)测定中，病毒滴度由血凝实验测定。简而言之，用PBS对病毒进行2倍连续稀释，并与0.7％(体积/体积)人O-型红细胞混合。在室温温育1小时后，估计血凝单位(HAUs)。接着，进行如下HI滴定。对浓度为100微克/ml的单克隆抗体进行2倍连续稀释，并与8HAU/50升的病毒样本混合。在37℃温育1小时后，在室温下将混合物与0.7％(体积/体积)人红细胞进一步温育1小时。完全抑制血凝的单克隆抗体的最低浓度设为HI滴度。

对于融合抑制测定，如前(Okuno等,Journal of Virology67:2552-2558)所述进行细胞-细胞融合。简而言之，使猴肾细胞系CV-1细胞以0.3的感染复数(multiplicity of infection，MOI)感染B/Florida/4/2006。温育24小时后，用MEM洗涤细胞，然后在37℃下在添加了2.5微克/毫升的乙酰化胰蛋白酶(Sigma,St.Louis,MO)的MEM中温育15分钟。洗涤后，将细胞与稀释的人单克隆抗体温育30分钟。之后，在37℃下使用添加了10mM MES和10mM HEPES(pH5.5)的MEM对细胞进行处理2分钟。在通过洗涤将培养基完全除去后，将细胞温育3小时。然后，用无水甲醇固定细胞，并用Giemsa(Wako,大阪,日本)染色。

表4

表4：人单克隆抗体的鉴定

¹结果显示为在体外抑制50％的病毒生长的纯化人单克隆抗体的最低浓度。

²结果显示为完全抑制血凝的纯化人单克隆抗体的最低浓度。

³结果显示为表现细胞融合抑制的纯化人单克隆抗体的最低浓度。

因此，所有三个HuMAbs均具有HI活性，并且也能抑制细胞-细胞融合(表4)。然而，3A2和10C4表现出比5A7(25微克/毫升)显著更高的HI滴度(0.39微克/毫升)。这些结果表明：所有三个HuMAbs都应抑制病毒结合到细胞膜上。

[实施例2]

为了确定由三个HuMAbs识别的B/Florida/4/2006的表位区，选择逃逸变异株。逃逸变异株通过B/Florida/4/2006与HuMAbs温育选择。通过在存在单克隆抗体的情况下培养B/Florida/4/2006来选择逃逸变异株，如前(Gulati等,Journal of Virology76:12274-12280)所述，并略做改动。将病毒与经10倍连续稀释的单克隆抗体(以使最终浓度为0.0025～2.5微克/毫升)在37℃温育1小时。然后，给MDCK细胞接种混合物，并在添加有0.4％牛血清白蛋白(BSA)、抗生素和2微克/毫升乙酰化胰蛋白酶的DMEM/F-12+GlutaMAX^TM-I中培养。培养72小时后，收集上清液，并进行VN和HI测定分析。对表现出降低的VN₅₀和HI滴度的病毒样品进行整个HA基因的直接测序分析。

以下进行直接测序分析。对用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen，Hilden,Germany)提取的病毒RNA，采用以下HA引物对进行一步法RT-PCR(Superscript^TM III One-StepRT-PCR System with Platinum^(R)Taq High Fidelity；Invitrogen)：5'-CAGAATTCATGAAGGCAATAATTGTACTAC-3'正向(SEQ ID NO：27)和5'-CTCCGCGGCCGCTTATAGACAGATGGAGCATGAAACG-3'反向(SEQ ID NO：28)。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)对PCR产物进行纯化。电泳后，使用Qiaquick凝胶回收试剂盒(Qiagen)提取分离条带并测序。

如下进行HA质粒构建。通过一步法RT-PCR对B/Florida/4/2006的HA基因进行扩增，并插入到pGEM-T Easy载体(Promega,Madison,WI)中。使用插入到pGEM-T easy载体中的B/Florida/4/2006的HA质粒，分别通过定点诱变PCR(GeneTailor^TM Site-DirectedMutagenesis System；Invitrogen)和常规PCR(Expand High Fidelity^PLUS PCR System；Roche)产生突变和截断HA基因。各质粒亚克隆到表达载体pCAGGS/MCSII中(Ueda等,Journal ofVirology84:3068-3078)。按照制造商的说明书用lipofectamine2000(Invitrogen)将表达质粒转染到人胚肾293T细胞中。

将逃逸变异株中HA蛋白的氨基酸序列与原B/Florida/4/2006进行比较。图1中星号表示原病毒和逃逸变异株之间不同的氨基酸残基。有趣的是，3A2和10C4的每个逃逸变异株在相同位置194D和196T均有氨基酸替换；氨基酸编号从信号肽后开始(Wang等,Journal ofVirology82:3011-3020)。这些位置位于邻近受体结合位点的190-螺旋抗原位点(Wang等,Journal of Virology82:3011-3020)。值得注意的是，在连续稀释的5A7的存在下，甚至在病毒传代10次后，也无法产生逃逸变异株，这意味着5A7识别的氨基酸序列对于病毒存活是必需的。在还原条件下，通过蛋白质印迹法将人单克隆抗体5A7与HA0蛋白发生反应，表明5A7有连续的表位。因此，使用含有不同长度HA片段的HA截断载体对5A7的表位区作进一步的研究。用5A7对用截断HA表达载体转染的293T细胞进行蛋白质印迹分析。人单克隆抗体5A7与包括氨基酸残基1至324的截断HA片段发生反应，但与包括氨基酸残基1至314的截断HA片段不发生反应(图2)。这些结果表明：5A7识别HA蛋白中的氨基酸残基315至324，IGNCPIWVKT(SEQ ID NO：44)，其位于HA1蛋白的C末端附近。值得注意的是，该区域是乙型流感病毒的高度保守的结构域。

[实施例3]

人单克隆抗体3A2表现出对B/Shanghai/361/2002的低反应性，因此对另外的不同的表位区进行研究。为此，从B/Florida/4/2006和B/Shanghai/361/2002构建不同的HA嵌合序列，其区别在于七个残基(位置37、40、88、131、227、249、456)，在质粒中表达，并转染到293T细胞中。293T细胞中表达的嵌合HA蛋白的IFA显示，131P和227S是与3A2进行反应所必需的(图3)。这些结果表明，3A2的表位是依赖在位置131、194、196和227的残基，以及10C4的表位是依赖在位置194和196的残基。这三个HuMAbs定位的表位区显示在图4的HA三聚体的三维模型图中。人单克隆抗体3A2和10C4识别包括190-螺旋抗原位点的球状头部的顶端，而5A7与远离病毒膜的茎状区发生反应。

人单克隆抗体5A7识别HA蛋白的茎状区，几乎所有的用于甲型流感病毒的广谱中和单克隆抗体都是如此。茎状区的氨基酸序列是高度保守的，表明氨基酸残基不会轻易发生变异。事实上，在经5A7治疗的情况下，甚至病毒传代10次，表位区的氨基酸残基没有发生突变，而在3A2或10C4存在下突变体形成迅速。在5A7存在下逃逸变异株未能成功产生，这是该人单克隆抗体作为候选治疗剂的优点。虽然5A7与Yamagata和Victoria系都发生反应，但是用于VN₅₀所需的浓度比3A2和10C4的高得多。这样的结果可由人单克隆抗体对于表位区的亲和力或物理可达性的差异来解释。尽管本研究没有考察亲和力，但是使用表位作图可以估算可达性。人单克隆抗体3A2和10C4识别远离病毒膜的190-螺旋位点，而5A7的表位区定位于茎状区，这表明5A7物理上将更难到达HA蛋白。人单克隆抗体结构的修饰和亲和力的改善会导致发展更好的治疗抗体。

识别球状头部的单克隆抗体表现出强HI活性，而识别茎状区的那些单克隆抗体通常没有表现出任何HI活性。因此，可以认为：识别球状头部的单克隆抗体抑制受体结合步骤，而识别茎状区的单克隆抗体抑制病毒复制的融合步骤。识别邻近受体结合位点的球状头部中190-螺旋的人单克隆抗体3A2和10C4，实际上的确具有强HI活性，这表明这些人单克隆抗体抑制与受体结合。出人意料的是，5A7也表现出微弱的HI活性，说明5A7也会抑制结合步骤。这归因于5A7识别远离病毒膜的茎状区，而没有表现出HI活性的单克隆抗体识别茎状区的更近端位置。这三个HuMAbs还表现出融合抑制活性。与HA蛋白结合的人单克隆抗体能够继发扰乱HA的结构变化，这取决于低pH值。

[实施例4]

检测5A7作为乙型流感病毒感染的被动转移疗法在小鼠中的活性。被动转移实验中，感染前，用戊巴比妥钠(Somnopentyl；Kyoritsu Seiyaku Corporation,东京,日本)向腹腔内给药对小鼠实施麻醉。使用日本SLC公司的六周龄雌性BALB/c小鼠。在用25mcl(微升)的小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985病毒以致死剂量(2.5x10⁴FFU/小鼠)攻击后，在4、24、48或72小时对小鼠向腹腔内给予5、10或15mg/kg的人单克隆抗体。每天称重小鼠，并且如果它们体重下降到起始体重的60％即被处死。为了滴定感染的肺部内的病毒，B/Ibaraki/2/1985或B/Florida/4/2006分别以2.5x10⁴或5.0x10³FFU/小鼠进行感染。感染后3-6天收集肺，并且采用病灶形成测定法确定在肺组织匀浆中的病毒滴度。

在用致死剂量的小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985攻击后4小时，向腹膜内给予5、10或15毫克/公斤5A7治疗小鼠。每天检查存活率和体重变化，并且当体重下降到低于起始重量的60％时，处死小鼠。可以看到测试的5A7的每个剂量的完全的抗病毒治疗效果(图5)。用10或15毫克/公斤的5A7治疗的组里体重变化特别轻微(图6)。在用10毫克/千克5A7治疗的小鼠中，在小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985或B/Florida/4/2006感染后三天和六天滴定在肺部的病毒载量。与未经治疗的两种病毒感染对照组相比，经5A7治疗的小鼠的病毒滴度显著降低(图7)。最后，在用致死剂量的小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985攻击后4、24、48或72小时，将5A7以10毫克/公斤向腹膜内给予小鼠。监测存活率和体重变化。当感染后四小时注射，5A7治疗表现出完全的治疗效果。值得注意的是，在感染后24小时5A7治疗组中大部分的小鼠均存活。而且，甚至在感染后超过48小时，用5A7治疗后一些小鼠仍存活(图8和图9)。这些结果表明，5A7有潜力发展为抗乙型流感病毒感染的治疗剂。

小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985用来研究被动转移实验中存活率和体重变化的动力学，因为其他病毒株对于小鼠不是致死的，即使在体内传代数次。尽管5A7在体内已经表现出对于小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985的最低敏感性，但是，即使在感染后72小时给药，人单克隆抗体5A7保护小鼠免受小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985攻击。这些结果表明5A7将具有抗广谱乙型流感病毒的治疗效果，并且实际上在经5A7治疗的情况下，小鼠适应的B/Ibaraki/2/1985和B/Florida/4/2006的肺病毒滴度均显著降低。

[实施例5]

在体外检测CHO-K1-衍生的5A7的中和效力。在CHO-K1细胞中合成5A7并且检测其抗乙型流感病毒的中和效力。用在pQC载体中的5A7的全长可变区基因转染CHO-K1细胞，以建立稳定的分泌5A7的细胞系(5A7/CHO-K1)。为了使用哺乳动物细胞进行稳定表达，在5％CO₂中在含10％胎牛血清的DMEM中在37℃培养CHO-K1细胞。将生长于6孔培养板(Corning,Corning,NY)的细胞用于转染，转染使用pQCXIP-hCH和pQCXIH-HCλ表达载体和Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen)。转染的细胞在5％CO₂中在含1微克/毫升嘌呤霉素和100微克/毫升潮霉素的DMEM中在37℃温育三周。然后将细胞重新平板接种到15厘米的培养皿(Corning)中并温育，挑取菌落并且作为稳定表达IgG的推定细胞系进行培养。在15厘米的培养皿上90％的汇合处的转化株的培养基改变为无血清营养混合物F-12Ham's(Sigma)，然后在5％CO₂和37℃下培养细胞一周。使用HiTrap Protein G HP柱从培养基纯化重组的IgG。用PBS对纯化的IgG进行透析，然后用Amicon超离心过滤器(Millipore,Billerica,MA)进行浓缩。用纯化的5A7/CHO-K1在体外进行病毒中和试验，并发现抗检测的两种病毒株(B/Florida/4/2006和B/Malaysia/2506/2004)的中和活性。值得注意的是，5A7/CHO-K1的中和活性与由杂交瘤细胞产生的5A7的中和活性是相似的(图10)。

[实施例6]

对人单克隆抗体5A7、3A2和10C4进行表面等离子体共振分析，以检测它们的结合亲和力。每个人单克隆抗体都被固定在传感器芯片的表面上。将疫苗抗原、B/Florida/4/2006的HA蛋白，以12.5、25、50、100和200nM的浓度依次注射在芯片表面，并监测其结合和解离阶段。因为5A7很难从HA解离，故无法精确计算其KD值(表5)。

表5

人单克隆抗体与乙型流感病毒来源的HA结合的动力学常数

¹结合速率常数

²解离速率常数

在NCBI数据库中使用IgBlast软件将三个HuMAbs的V_H和V_L区的序列与最接近的种系序列进行比对和分析。除3A2和10C4的V_H区的D外，这三个HuMAbs来自不同种系(图11-13)。

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申请人明确地将所有引用的参考文献的全部内容合并到此公开内容中。此外，当数量、浓度或其他值或参数作为范围、优选范围、或一列优选上限值和优选下限值的列表给出时，要理解为明确公开了由任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的任何一对所组成的所有的范围，无论范围是否单独公开。当此文引用数值范围时，除非另作说明，该范围旨在包括其端点、以及该范围内的所有整数和分数。但并不意味着本发明的范围局限于界定范围时列举的特定值。

从这里披露的本说明书和本发明的实施考虑，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。意味着本说明书和实施例仅视为示例性的，本发明的真实范围和精神由以下权利要求以及其等同物表示。

Claims

1.一种抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，具有抗人乙型流感病毒的中和活性，其特征在于，所述单克隆抗体包括人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有抗B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、和B/Mie/1/1993病毒株中的至少一种的中和活性。

3.如权利要求1所述的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有抗B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种的中和活性。

4.如权利要求1所述的抗人流感病毒人单克隆抗体，其特征在于，所述人单克隆抗体是通过将来自感染乙型流感病毒的人的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合形成的杂交瘤细胞产生。

5.如权利要求4所述的抗人流感病毒人单克隆抗体，其特征在于，所述乙型流感病毒包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。

6.如权利要求4或5所述的抗人乙型流感病毒人单克隆抗体，其特征在于，所述融合伴侣细胞为SPYMEG细胞。

7.如权利要求1所述的抗人乙型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，包括IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dsFv。

8.如权利要求1所述的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：

重链可变区，其包括：

轻链可变区，其包括：

9.如权利要求8所述的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二氨基酸序列包含如SEQ ID NO:2所示的序列，所述第三氨基酸序列包含如SEQ ID NO:3所示的序列，所述第四氨基酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第五氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示的序列，所述第六氨基酸序列包括SEQ ID NO:6所示的序列。

10.如权利要求8所述的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一氨基酸序列包含如SEQ ID NO:7所示的序列，所述第二氨基酸序列包含如SEQ ID NO:8所示的序列，所述第三氨基酸序列包含如SEQ ID NO:9所示的序列，所述第四氨基酸序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列，所述第五氨基酸序列包括SEQ ID NO:11所示的序列，所述第六氨基酸序列包括SEQ ID NO:12所示的序列。

11.如权利要求8所述的抗人流感病毒单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一氨基酸序列包含如SEQ ID NO:13所示的序列，所述第二氨基酸序列包含如SEQ ID NO:14所示的序列，所述第三氨基酸序列包含如SEQ ID NO:15所示的序列，所述第四氨基酸序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列，所述第五氨基酸序列包括SEQ ID NO:17所示的序列，所述第六氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示的序列。

12.一种药物组合物，包含如权利要求1所述的抗人流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

13.一种用于人受试者中人乙型流感的预防、治疗和检测的至少一个的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1所述的抗人流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段。

14.如权利要求1-11任一所述的抗人乙型流感病毒人单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制或治疗人受试者中人乙型流感感染的药物中的用途。

15.一种检测人受试者中人乙型流感的方法，包括：

将来自人受试者的样品与如权利要求1-11任一所述的抗人乙型流感病毒抗体或其抗原结合片段接触；和

根据抗体是否结合人乙型流感病毒的血凝素(HA)蛋白，检测人受试者中存在或不存在人乙型流感病毒。

16.一种产生抗人乙型流感病毒人单克隆抗体的方法，包括：

将来自感染乙型流感病毒的人的外周血单核细胞(PBMC)与能够有效细胞融合的融合伴侣细胞进行融合产生杂交瘤细胞；和

从所述杂交瘤细胞获得抗人流感病毒单克隆抗体。

17.如权利要求16所述的产生抗人乙型流感病毒人单克隆抗体的方法，其特征在于，所述乙型流感病毒包括B/Florida/4/2006病毒株、B/Shanghai/361/2002病毒株、B/Johannesburg/5/1999病毒株、B/Yamanashi/166/1998病毒株、B/Mie/1/1993病毒株、B/Malaysia/2506/04病毒株、B/Shandong/7/1997病毒株、和B/Victoria/2/1987病毒株中的至少一种。

18.如权利要求16或17所述的产生抗人流感病毒人单克隆抗体的方法，其特征在于，所述融合伴侣细胞为SPYMEG细胞。

19.根据权利要求16-18任一所述的方法产生的抗人流感病毒人单克隆抗体。