CN111423507A - 广谱性中和流感病毒的全人抗体 - Google Patents

广谱性中和流感病毒的全人抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗流感病毒的中和性单克隆抗体。具体地本发明公开了一株针对流感病毒的单克隆抗体，该抗体对流感病毒抗原具有显著的结合活性。

Description

广谱性中和流感病毒的全人抗体
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及两种抗流感病毒的中和性单克隆抗体。
背景技术
流行性感冒(Influenza)是流感病毒导致的强传染性疾病，一直是人类健康的重大威胁，造成了重大经济损失。世界范围内每年约有5％-15％的人口受季节性流感病毒感染，其中有25-50万人死亡。近年来各地不断爆发流感疫情，严重威胁人们的身体健康及生产安全。目前疫苗和抗病毒药物是预防和治疗流感的主要方法，但新型病毒株和抗药性病毒株的不断出现令新药物、广谱疫苗和广谱抗体的开发迫在眉睫。
目前，治疗流感的主要有两种处方药：奥司他韦和扎那米韦，为神经氨酸酶抑制剂，可以抑制病毒释放。近期，由日本福山化学研发的抗流感药物法匹拉韦获批上市，主要作用于流感病毒聚合酶，从而抑制病毒复制。目前大部分流感病毒仍对奥司他韦和扎那米韦敏感，但在日本等地区也已经逐渐出现耐药性毒株，耐药性毒株的出现限制了这些化学小分子药物的大规模使用。
接种疫苗是预防流感的最有效的方式。季节性疫苗成分主要包含A型H1N1、H3N2以及B型流感病毒成分，WHO每年定期对南北半球的流行毒株进行监测并预测即将流行的毒株，各大厂商据此制备流感疫苗。但是流感病毒极易发生变异，所以这种预测常常是不准的，导致新的流感病毒大肆流行。另一方面，疫苗的制备周期很长，从WHO公布预测的毒株结果到疫苗制备成功，大约需要9个月，而这根本无法迅速应对突然爆发的流感病毒。疫苗接种效果也取决于接种者本身的基础免疫条件，对于老人小孩及免疫缺陷者，流感疫苗并不能很好的诱导保护活性。
因此寻求新的广谱性治疗及预防手段迫在眉睫。本领域有必要针对流感病毒开发亲和性良好的治疗性中和抗体，以应对流感防控的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种流感病毒的中和性单克隆抗体及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明的第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.7所示的VL-CDR2，
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR3，
优选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明的第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗流感病毒HA蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为全人抗体。
在另一优选例中，所述的抗体能够结合全部Group2的流感病毒HA蛋白及H1亚型的HA蛋白。
在另一优选例中，所述的抗体能够中合H1,H3,H7,H4亚型的流感病毒毒株。
在另一优选例中，所述的抗体能够抑制HA0的酶切。
在另一优选例中，所述的抗体能够抑制低pH值诱导的HA的构象变化。
在另一优选例中，所述的抗体识别表位位于HA2 58-75位氨基酸。
在另一优选例中，所述的抗体识别H3N2 HA的线性表位。
在另一优选例中，所述的抗体识别H7N7及H1N1的构象表位。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明的第二方面所述的重链的序列、如本发明的第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明的第四方面所述的轻链的序列、或如本发明的第五方面所述的抗体的序列；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6×His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合流感病毒HA蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.5、10所示的序列。
本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物为喷剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗流感病毒感染的药物。
本发明的第十二方面，提供了如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测流感病毒。
在另一优选例中，所述药剂用于治疗或预防流感病毒感染。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中流感病毒血凝素HA蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在流感病毒血凝素HA蛋白。
本发明的第十四方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第五方面所述的抗体或本发明的第六方面所述的重组蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了志愿者血清学检测的结果。
A：一名志愿者血清对H3N2及H1N1 HA蛋白的结合活性检测。4℃过夜包被A/HongKong/01/1968(H3N2)及A/California/06/2009(H1N1)HA蛋白,第二天将血清样品稀释不同的倍数，并上样，anti-human Fc HRP检测。
B:一名志愿者血清对H3N2及H1N1病毒的中和活性检测。提前一天铺MDCK细胞入96孔板，将血清2倍梯度稀释，共9个梯度，并与病毒37℃孵育1h后加到用PBS清洗过的MDCK细胞上，24h后吸走培养液，用80％丙酮室温固定10min，通过ELISA用anti-NP抗体检测胞内病毒滴度。
图2显示了抗体获得实验流程示意图。从一接种过季节性三价疫苗的志愿者体内分离出PBMC，标记IgG+CD19+1968H3N2 HA+筛选出能特异性结合HA的单个记忆性B细胞，通过单细胞RT-PCR获得cDNA,nested-PCR获得抗体可变区基因片段,并将测序正确的抗体基因构建到相应的重轻链表达载体上。重轻链基因共转染CHO细胞表达抗体，Protein G纯化抗体，最终获得纯度较高的抗体并用于下一步的功能实验研究。
图3显示了12mAb氨基酸序列及胚系基因来源信息。
A：12mAb的氨基酸序列。黑色字体为framework区(FR区)，红色字体为CDR区。加粗字体为与胚系基因不同的体细胞突变氨基酸。
B：12mAb胚系基因来源信息。
图4显示了回复体细胞突变对抗体结合抗原活性的影响。
图5显示了12mAb可以结合并中和Group1及Group2的流感病毒。
A：12mAb可以结合Group1及Group2的不同的流感病毒HA。使用OCTET RED 96仪器检测12mAb对不同HA的亲和力。使用AHC sensor，按照以下程序进行：baseline 120s-loading Ab 300s-baseline 240s-association 900s-disassociation 900s-regenaration 5s-baseline 5s-regenaration 5s-baseline 5s-regenaration 5s-baseline 5s。12mAb抗体浓度为20ug/ml，抗原浓度设置六个：200nM-133nM-89nM-59nM-39nM-26nM。计算Kd值。
B：12mAb可以中和Group1及Group2的不同的流感病毒。流感病毒与不同浓度的抗体孵育1h后，加入到提前铺好的MDCK细胞上，培养24小时后将上清去掉，80％丙酮固定细胞30min,通过ELISA用anti-NP的抗体检测病毒滴度，计算IC50。
图6显示了12mAb可以保护小鼠不被流感病毒感染。
A：12mAb对H3N2的保护作用的体重曲线变化图；
B：12mAb对H3N2的保护作用的存活曲线变化图；
C：12mAb对H7N9的保护作用的体重曲线变化图；
D：12mAb对H7N9的保护作用的存活曲线变化图；
E：12mAb对H1N1的保护作用的体重曲线变化图；
F：12mAb对H1N1的保护作用的存活曲线变化图；
BalB/c小鼠共分为5组，每组5只，对照组接种PBS，实验组分别接种1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的12mAb,24h后攻击致死剂量的流感病毒。连续称取体重14天。
图7显示了12mAb通过抑制HA0酶切为HA1和HA2，以及抑制低pH诱导的HA的构象变化来抑制宿主胞膜与病毒包膜的融合，从而阻断病毒入侵细胞。
A：12mAb的HAI活性检测。4HA单位/25ul的流感病毒与不同浓度抗体等体积37度孵育1h，抗体从100ug/ml开始2倍梯度稀释。然后加到1％鸡红细胞里，室温等待30min，观察血凝情况。
B：12mAb抑制膜融合能力检测。Hela细胞转染H3N2及H1N1 HA，100ug/ml的抗体与细胞共孵育1h,2.5ug/ml的TPCK处理细胞10min,然后再用100ug/ml的抗体与细胞共孵育1h，pH＝5的柠檬酸处理细胞10min，培养液清洗过后培养2h,4％PFA固定，0.1％结晶紫染色，显微镜观察拍照。
C：12mAb抑制HA0酶切为HA1和HA2。HA蛋白与TPCK按照1:50比例酶切0、30、60、90、120min，Western Blot检测HA0。
D：12mAb抑制低pH诱导的HA构象变化。HA蛋白与TPCK按照1:50比例酶切处理使其酶切为HA1和HA2，再将其与不同抗体按照HA:Ab＝1:10混合孵育，并用pH＝5的柠檬酸诱导10min，发生构象变化后的HA通常对TPCK很不稳定，容易降解，所以最后用TPCK(HA:TPCK＝1:40)处理细胞，WB检测HA是否被降解掉。
图8显示了12mAb比MEDI8852及FI6v3表现出更好的结合及中和H3N2流感病毒的能力。
A-F：12mAb、MEDI8852及FI6v3对不同的H3N2 HA蛋白的结合活性比较。5ug/ml的HA蛋白包板，2％BSA封闭，然后分别加入12mAb、MEDI8852及FI6v3，从10ug/ml开始3倍梯度稀释，抗human-IgG Fc检测，OD450读取数值。
G：12mAb、MEDI8852及FI6v3对不同的H3N2流感病毒的中和活性比较。不同浓度的抗体与100TCID50的流感病毒孵育1h,抗体浓度从50ug/ml开始，2倍梯度稀释。之后将抗体病毒复合物加到MDCK细胞上，37度培养24h后，吸走上清，80％丙酮固定，用anti-NP-HRP抗体通过ELISA检测病毒含量。
图9显示了12mAb识别了H3N2 HA的一段线性表位。
A-C：12mAb对线性化的不同亚型的HA的结合能力检测。HA蛋白事先进行变性处理，0.1％SDS及50mM的DTT，100度煮样5min，然后1ug/ml HA变性蛋白及未变性蛋白包ELISA板过夜，第二天5ug/ml的抗体上样，anti-human-Fc-HRP检测。
D-F：12mAb对线性化的多株H3N2 HA的结合能力检测。方法同上。
G和H：截短表达实验寻找12mAb结合H3N2 HA的线性表位。293T细胞上表达截短表达载体，Western Blot检测。
具体实施方式
为进一步获得疗效更好的、全新的流感抗体药物及寻找新的流感抗体识别表位，本发明人通过广泛而深入的研究，利用独特的单细胞RT-PCR技术，意外地从一名志愿者体内(外周血PBMC)成功分离到一株广谱性中和抗体12mAb。这株针对广谱流感病毒的单克隆抗体具有特定的CDR1、CDR2、CDR3以及VH和VL序列。亲和力实验表明12mAb对H1/H3/H4/H7/H10/H14/H15等亚型血球凝集素(HA)具有较高亲和力和显著的结合活性，病毒微中和实验进一步验证了12mAb具有对H1/H3/H7/H4亚型流感病毒的广谱中和能力。在小鼠水平上的实验也证实12mAb能够在体内发挥抗H1N1、H3N2及H7N9亚型流感病毒的效果。同时发明人发现12mAb结合及中和H3N2 HA的能力要优于已经报道过的最好的2株广谱性中和抗体MEDI8852及FI6v3。机制研究表明12mAb是通过抑制低pH值诱导的HA的构象变化，进一步抑制宿主胞膜与病毒包膜的融合，从而抑制病毒入侵宿主细胞。同时，发明人发现12mAb识别了H3N2 HA的一段新的线性表位，该段表位位于HA2 58-75位氨基酸。本发明新的抗体一方面为广谱中和抗体治疗应用提供了新的选择，为攻克流感提供新的候选预防及治疗药物；另一方面新的表位或线性表位的发现为广谱疫苗的开发提供了新的思路。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
流感病毒
流感病毒属于正粘病毒科单链RNA病毒，可分为A、B、C(甲、乙、丙)三种亚型。对A型流感病毒，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白抗原性的不同，又可进一步分为不同的亚型。目前，A型流感病毒有18种HA亚型(H1–H18)和9种NA亚型(N1–N9)。A型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，每个RNA片段编码一至多个蛋白。其中，HA蛋白在结合细胞表面受体和介导病毒包膜与宿主胞膜融合起重要作用。在感染细胞前，HA会水解成HA1和HA2，其中位于HA1上的受体结合区(receptor binding domain，RBD)的附近区域，在不同流感病毒株中高度变异(RBD本身比较保守)，是重要的中和性表位所在区域，目前发现的多种中和性抗体所针对的表位大多位于HA1蛋白的RBD附近区域，例如S139/1及5j8，但是这些抗体大多不具备中和不同亚型或同一亚型不同毒株流感病毒的能力。
WHO的调查显示，全球每年约5-10％的成人和20-30％的儿童罹患季节性流感，导致300-500万住院病例和25-50万人死亡。季节性流行的毒株主要是H1N1、H3N2以及B型流感病毒。以上数据还不包括几次著名的流感大流行造成的数以百万计的死亡，以及诸如H7N9、H5N1、H5N6甚至H1N1在内的禽流感病毒引发的疫情。流感病毒感染的病程在14天左右，重症病人在发病后的20几天内病情迅速恶化直至死亡，虽然也给与了特异性抗病毒药物如达菲等进行治疗，但由于发病后期病毒快速复制，滴度过高，达菲的抑制效果有限，无法挽救生命。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗流感病毒HA蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗流感病毒HA蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗流感病毒HA蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗流感病毒HA蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab”)2片段；抗体重链；抗体轻链。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
VH-CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
VH-CDR2，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
VH-CDR3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在另一优选例中，所述重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
VL-CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6；
VL-CDR2，其氨基酸序列为SEQ ID NO.7；
VL-CDR3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
在另一优选例中，所述的轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合流感病毒的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗流感病毒HA蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少约90％同源性，较佳地至少约95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有流感病毒HA蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0001941454460000131
Figure BDA0001941454460000141
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.5、10所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.5、10所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunologyand Immunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合流感病毒HA蛋白分子，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，通过流式-单细胞PCR技术从志愿者外周血中的记忆B细胞中筛选获得；通过噬菌体展示系统获得；通过免疫转基因人源化小鼠，从该小鼠中获得。
单克隆抗体可通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种针对流感病毒的单克隆抗体，特别是针对流感病毒HA蛋白的单克隆抗体。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明抗体是全人源抗体，避免临床上的鼠源抗体引起的免疫排斥反应。
(2)本发明抗体可以广谱性的中和多种Group1及Group2的甲型流感病毒，有效应对流感病毒的变异及不同亚型的交替流行。
(3)本发明抗体中和H3N2亚型的流感病毒的中和效果要优于目前最好的流感抗体MEDI8852抗体及FI6v3抗体，为H3N2的预防提供更好的策略。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料和方法
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
1、实验材料
1.1动物
6－8周龄的BalB/c雌性小鼠，购自灵畅公司。
1.2疫苗
2015年季节性流感病毒三价裂解疫苗购自华兰生物股份有限公司，主要成分包括A/California/7/2009(H1N1)pdm09-like virus，A/Victoria/361/2011(H3N2)-likevirus及B/Wisconsin/1/2010-like virus。
1.3载体、菌株及细胞
全人抗体表达载体IgG1，Igκ和Igλ(分别表达抗体heavy链、kappa链、lambda链)由Patrick Wilson实验室馈赠，载体序列见NCBI GenBank:FJ475055(IgG1)、FJ475056(Igκ)和FJ517647(Igλ)；A/HongKong/01/1968(H3N2)HA序列及A/Washington/05/2011(H1N1)HA序列均购自北京义翘神州生物技术有限公司；DH5α化学感受态购自擎科生物技术有限公司；实验用细胞人胚肾上皮细胞系HEK 293T、马-达二氏犬肾细胞系MDCK为本实验室自己保存(原始购买于ATCC)，中国仓鼠卵巢细胞CHO购自Thermo Fisher Scientific。
1.4抗体及蛋白
羊抗人IgG(Fab特异性)抗体[Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)An tibody]，羊抗人IgG(Fc特异性)-过氧化物酶抗体[Goat Anti-Human IgG(Fc specific)-Peroxidase antibody]，羊抗人IgG(Fab特异性)过氧化物酶抗体[Go at Anti-Human IgG(Fab specific)-Peroxidase antibody]购自Sigma；Human IgG购自Pierce；SA-HRP购自R&D Systems；FITC-鼠抗人CD19(FITC Mouse Anti-Human CD19)和APC鼠抗人IgG(APC MouseAnti-Human IgG)购自BD Bioscience；链霉亲和素-Cy3缀合物(Streptavidin-Cy3conjugate)购自Sigma-Aldrich；鼠抗体6X His-HRP(Mouse antibody 6X His-HRP)购自Proteintech；抗兔NP-HRP(Anti-rabbit NP-HRP)由中科英沐制备(制备方法为常规兔多抗制备方法)；A/HongKong/01/1968(H3N2)HA蛋白,A/Aich i/02/1968(H3N2)HA蛋白,A/Netherlands/178/1995(H3N2)HA蛋白,A/Brisban e/10/2007(H3N2)HA蛋白,A/victorial/210/2009(H3N2)HA蛋白,A/Hanoi/EL1 34/2008(H3N2)HA蛋白,A/Missouri/09/2014(H3N2)HA蛋白,A/Netherlands/219/2003(H7N7)HA蛋白,A/swine-ontario/01911-1/1999(H4N6)HA蛋白,A/Mallard/Astrakhan/263/1982(H14N5)HA蛋白,A/duck/AUS/341/1983(H15N8)HA蛋白,A/California/06/2009(H1N1)HA蛋白,A/Jiangxi-Donghu/346/2013(H10N8)HA蛋白,A/CK/NX/S6/2014(H5N6)HA蛋白均购自北京义翘神州生物技术有限公司。
1.5流感病毒
A/Sichuan/1/2009(H1N1),A/California/01/2009(H1N1)，A/Donghu/312/2006(H3N2)；A/duck/Hunan/8-19/2009(H4N2)；PR8-A/Shanghai/02/2013(H7N9)重组毒株及PR8-A/HongKong/01/1968(H3N2)；A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)；A/Brisbane/10/2007(H3N2),A/Victorial/210/2009(H3N2),A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)。
1.6试剂耗材
PrimeSTAR HS DNA Polymerase、连接酶Solution I购自Takara公司；EcoRI、KpnI等DNA限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific；AgeI、SalI和BsiWI等DNA限制性内切酶购自NEB；MarkerⅡ和Marker IV购自北京Transgen生物技术有限公司；普通DNA离心柱型PCR产物纯化/凝胶DNA回收两用试剂盒购自擎科生物技术有限公司；FavorPrepTM离心柱型质粒小提试剂盒购自Favorgen；质粒大抽试剂盒Nucleobond xtra Maxiplus购自MACHEREY-NAGELMN公司；RNA抽提试剂盒Rneasy MiNi Kit购自Qiagen；反转试剂盒ReverTra
Figure BDA0001941454460000191
qPCR RT Kit购自TOYOBO；纯化cDNA试剂盒
Figure BDA0001941454460000192
SV Gel and PCRClean-Up System购自Promega；KOD Fx Neo Polymerase购自TOYOBO公司，Taq ExPolymerase购自Takara公司；脂质体LipofectamineTM2000和LipofectamineTM3000购自Invitrogen；Gibco ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒购自Thermo Fisher Scientific；2mL一次性注射器购自上海米沙瓦医科工业有限公司；链霉亲和素SA购自Prospec bio；Biotin购自Sigma；蛋白酶抑制剂购自Roche；细胞培养基Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自GIBCO；FreeStyleTM 293Expression Medium购自GIBCO；ExpiTMCHO expression medium购自Thermo Fisher Scientific；可变区基因PCR引物参考Novagen Ig-Primer Sets设计，由杰瑞生物技术(上海)有限公司合成，PAGE纯化；
Figure BDA0001941454460000201
-T Easy Vector Systems购自Promega；X-Gal购自翊圣生物；填料Protein G Agarose 4FF及填料Protein A Agarose 4FF购自AOGMA；层析柱Poly-Prep Chromatography Columns购自BIO-RAD；
Figure BDA0001941454460000202
Sulfo-NHS-LC-Biotin购自Thermo Fisher Scientific；SuperScriptTMIII First-Stand Synthesis System for RT-PCR购自Invitrogen；
Figure BDA0001941454460000203
核糖核酸酶抑制剂(
Figure BDA0001941454460000204
Ribonuclease Inhibitor)购自Promega；2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix II购自北京Transgen；正十二烷基β-D-麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside)购自Sigma；Papain购自Sigma；来自牛肺的抑肽酶(Aprotinin from bovine lung)购自Sigma；ZebaTM旋转脱盐柱(ZebaTMSpin DesaltingColumns)购自Thermo Fisher Scientific；4％鸡红细胞购自上海榕柏生物技术公司；Amicon Ultra-0.5离心过滤装置[Amicon Ultra-0.5Centrifugal Filter Unit(10kDa、30kDa及50kDa截留)]购自Merck公司。
1.7基因序列
MEDI8852(Kallewaard等人,2016,Cell)、FI6v3(Davide Corti等人,2011,Science)、F10(Jianhua Sui等人,2009,NS&MB)、CR8020(Damian C.Ekiert等人,2011,Science)、S139/1(Peter S.Lee等人,2012,PANS)、5j8(Jens C.Krause等人,2011,Journalof virology)抗体的重轻链可变区氨基酸序列分别从以上相应文章中获得，并经过密码子优化获得基因序列，由捷瑞生物技术有限公司全基因合成；A/Yunnan-Hongta/11097/2015(H3N2)HA(Isolate ID:EPI_ISL_207766)，A/Guizhou-xinxi/11038/2017(H3N2)HA(Isolate ID:EPI_ISL_296978)及A/Tianjin-nankai/17/2018(H3N2)HA(Isolate ID:EPI_ISL_296975)的基因序列分别从GISAID Epiflu中下载，并经过密码子优化获得基因序列，由杰瑞生物技术有限公司全基因合成。
1.8实验所用溶液
1)50×TAE Buffer:Tris base(三羟甲基氨基甲烷)242g，冰醋酸57.1mL，EDTA0.05mol，pH＝8.5，ddH2O定容到1000mL。
2)LB液体培养基：Tryptone(蛋白胨)10g，Yeast Extract(酵母粉)5g，NaCl 10g，加ddH2O至总体积为1000mL，121℃，20min。
3)LB板固体培养基：Tryptone(蛋白胨)10g，Yeast Extract(蛋白胨)5g，NaCl10g，Agar(琼脂粉)15g，加dd H2O至总体积为1000mL，121℃，20min。冷却至室温加入抗生素。
4)100mg/ml氨苄青霉素：称取1g氨苄青霉素，加dd H2O定容至10mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃冻存。
5)1.5％(wt/vol)琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖至100mL TAE，微波炉加热溶解，冷却至60℃时，加入5μL Gel Stain(购自北京Transgen生物技术有限公司，10000×)，充分混匀。
6)30％甘油：30mL丙三醇(甘油)，定容至100mL，混匀，灭菌。
7)PBS缓冲液(20×)：NaCl 170g，Na2HPO4 11.3g，KH2PO4 2.7g，加水定容至1L，调节pH值至7.0。
8)ELISA包被液：NaHCO3 0.738g，Na2CO3 0.397g加水定容至250mL，pH＝9.5。
9)ELISA封闭液：2％BSA/PBS(wt/vol)，2g牛血清白蛋白至100mL PBS中，混匀。
10)ELISA洗涤液：1L PBS加入500μL Tween-20，混匀。
11)ELISA显色液：1×TMB ELISA基质溶液(ELISA Substrate Solution)，购自ebioscience。
12)SDS凝胶上样缓冲液：50mM Tris–HCl pH 6.8，2％SDS，10％甘油(glycerol)，1％β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)和0.1％溴酚蓝(bromophenol blue)。
13)10×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris base(三羟甲基氨基甲烷)30g，甘氨酸(Glycine 144g)，SDS10g，定容至1L。
14)10×转移缓冲液：10×SDS-PAGE电泳缓冲液100mL，200mL甲醇，加ddH2O至1L，混匀使用。
15)TBST缓冲液：50mM Tris，150mM NaCl和0.1％Tween-20，pH 7.5。
16)显影液：超级信号West Pico化学发光底物(Super Signal West PicoChemiluminescent Substrate)(Thermo Fisher Scientific)。
17)20％乙醇：100mL乙醇和400mL蒸馏水混合。
18)结合缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液(Sodium Phosphate Buffer),pH 7.0；4.372gNa2HPO4·7H2O，先用800mL蒸馏水溶解，用1M HCl或1M NaOH调pH至7.0，再加入蒸馏水定容至1L。
19)洗脱缓冲液：0.1M Glycine(甘氨酸)，pH 2.8，500mL 3.75g Glycine加入400mL蒸馏水溶解，再加入约1.4mL浓HCl调整pH为2.8，再用蒸馏水定容至500mL。
20)中和缓冲液：1M Tris，PH 9.0，12.1g Tris base先用80mL蒸馏水溶解，用1MHCL调整pH至9.0，再加入蒸馏水定容至100mL。
21)细胞冻存液：10％DMSO(二甲亚砜)+90％FBS。
22)2.5ug/ml TPCK-Trypsin：12.5mg加到50ml PBS中，制成100*2.5ug/ml TPCK-Trypsin溶液。Trypsin需避光保存。
23)pH4.8柠檬酸：首先用PBS把柠檬酸配成很高浓度的溶液，然后往转动中的PBS中滴加柠檬酸，调pH值到4.8.
24)4％多聚甲醛：称12g多聚甲醛粉末于30ml PBS中制成，用NaOH调pH为7.0-8.0之间。
25)考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 0.75g，100％乙醇135ml,冰醋酸30ml,ddH2O 135ml,搅拌均匀。
26)考马斯亮蓝脱色液：冰醋酸100ml,甲醇100ml,用dd H2O定容至1L，混匀备用。
1.9实验仪器
1)高速冷冻离心机：购自Eppendorf公司。
2)Olympus IX71倒置荧光显微镜：上海巴斯德研究所图像解析平台所有。
3)PCR仪：购自Eppendorf公司。
4)核酸电泳仪及水平式电泳槽：购自上海天能科技有限公司。
5)凝胶成像系统：购自上海天能科技有限公司。
6)隔水式电热恒温水槽：购自上海一恒科技有限公司。
7)恒温培养箱：购自上海实验仪器厂有限公司。
8)蛋白质电泳仪：购自上海天能科技有限公司。
9)高温加热器(GL-150)：购自其林贝尔仪器制造有限公司。
10)振荡培养箱(ZQWY-200)：购自上海知楚仪器有限公司。
11)恒温振荡培养箱(HZ-2210)：购自太仓华利达实验设备公司。
12)振荡混匀器(VORTEX-5)：购自其林贝尔仪器制造有限公司。
13)超低温冰箱(-80℃)：购自SANYO公司。
14)纯水仪(Milli-Q)：购自Merck公司。
15)pH计(delta 320pH Meter)：购自Mettler Toledo公司。
16)紫外可见分光光度计(NanoDrop ND1000)：购自Thermo公司。
17)电子称量天平(PL602-S)：购自Mettler Toledo公司。
18)酶标仪(Multiskan MK3)：购自Thermo公司。
19)超净工作台(SW-CJ-1FD)：购自苏州净化公司。
20)Octet RED 96蛋白质相互作用工作站：使用中科院上海生化与细胞所公共平台仪器，购自ForteBio。
21)二氧化碳恒温细胞培养箱购自Thermo。
22)二氧化碳恒温震荡细胞培养箱购自Thermo。
2、实验方法
2.1特异性记忆B细胞的获得
首先将A/HongKong/1968H3N2的HA进行biotin标记，biotin-HA从而可以跟Cy3-Streptavidin结合，以此达到用Cy3标记HA的目的。从志愿者体内抽取外周血，采用常规Ficoll-Paque密度梯度离心，得到外周血单核细胞(PBMC)。使用FITC-CD19+/APC-IgG+/Cy3-HA为标志物，经流式细胞仪获得特异性结合HA的B细胞至96孔RT-PCR板中，每孔一个细胞。
2.2抗体基因获得及载体构建
将获得的单个记忆B细胞通过RT-PCR获得cDNA,然后通过nested-PCR获得抗体基因可变区，跑琼脂糖核酸凝胶，将重轻链可以配对的胶块回收并将其连接到T-载体上，测序并通过IgBLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)检索获得抗体基因序列。接下来通过AgeI及SalI酶切位点，AgeI及BsiwI酶切位点，AgeI及XhoI酶切位点将抗体基因分别连接到相应的IgG1，Igκ和Igλ表达载体上。
2.3抗体表达
瞬时转染CHO细胞，进行全人抗体表达。转染前一天(第–1天)，分种ExpiCHO-STM细胞，最终密度为3×10^6–4×10^6个活细胞/mL，使细胞过夜生长。次日(第0天)，测定活细胞密度和存活率百分比。细胞密度应达到约7×10^6–10×10^6个活细胞/mL。存活率应为95–99％，方可继续转染。将细胞稀释至最终密度为6×10^6个活细胞/mL。使用预冷的试剂(4℃)配制ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA复合物。室温孵育ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA复合物1–5分钟，然后将溶液慢慢转移至CHO细胞培养瓶中，在添加过程中轻轻晃动培养瓶。将细胞置于轨道摇床上(37℃培养箱含8％CO2的湿化空气条件下)培养。培养7-11天，待细胞死亡一半时即可收上清，开始纯化抗体。
2.4抗体纯化
使用Protein G Agarose 4FF填料纯化抗体。首先将收集的CHO细胞悬液4000rpm,4℃离心30min，将收集的上清再用0.45um filter过滤，待纯化。取重力型离心柱，加入Protein G Agarose 4FF填料，使用3倍柱体积的20％乙醇稳定填料，之后用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子，然后上样品，再用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子，最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱子，向洗脱下来的抗体溶液中加入中和buffer使洗脱下来的样品pH达7.5左右。将抗体溶液在5L 1XPBS中透析3次，即可将抗体浓缩保存至-80℃了。
2.5 ELISA检测抗体结合抗原的活性
使用ELISA检测表达的抗体是否识别不同亚型的流感病毒HA蛋白。包被HA蛋白ELISA板，5μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。次日PBST洗板3次。2％BSA封闭,每孔200μL，37℃,2h。再次PBST洗板3次。上样，每孔100μL，37℃，2h。PBST洗板3次。Goat Anti-Human IgG(Fcspecific)-Peroxidase antibody，1:2000稀释，每孔100μL，37℃，1h。PBST洗板3次。加底物TMB 100μL/孔显色，若颜色较浅可37℃避光反应15min。加入2M H2SO4终止反应，每孔50μL。测定OD450，并进行数据处理。
2.6病毒TCID50测定
MDCK铺至96孔板(1-11列，A-H行),12h后生长至90％备用。12h后在96孔板用DMEM+0.2％BSA+1μg/ml TPCK稀释病毒原液(1-10列10-1～10-10，A-H行8个重复)。MDCK细胞吸去培养液，PBS洗一遍，1-10列每孔加入相应稀释度病毒100μl。11列为空白对照，加入DMEM+0.2％BSA+1μg/ml TPCK。A-H行8个重复。37℃,5％CO2培养20h.吸去孵育上清，PBS洗两遍.预冷的80％丙酮-PBS溶液100μl/well固定30min。通过ELISA用anti-NP抗体测吸光值。大于(空白对照+3×空白对照标准差)的孔记为阳性。Reed-Muench法计算TCID50。
2.7病毒微中和实验
MDCK铺至96孔板,12h后生长至90％备用。抗体12mAb从100ug/ml开始稀释，用DMEM+0.2％BSA倍比稀释八个梯度，终体积50μl/well。每孔加入50μl含100个TCID50的病毒(预先用DMEM+0.2％BSA稀释至100TCID50/50μl)。
病毒对照(PC):(11列A-D)50μl DMEM+0.2％BSA+50μl virus；
细胞对照(NC):(11列E-H)100μl DMEM+0.2％BSA。
37℃,5％CO2孵育1h。每个抗体浓度重复两组。MDCK细胞吸去培液，PBS洗两遍，加100μl DMEM+0.2％BSA+2μg/mlTPCK。将血清-病毒孵育混合物100μl全部对应移至MDCK细胞上。37℃,5％CO2培养20h。吸掉上清，用PBS洗细胞一遍，预冷的80％丙酮-PBS溶液100μl/well固定30min。通过ELISA用anti-NP抗体测吸光值。分析数据。
2.8动物实验
预防效果检测：
6-8周龄的BalB/c雌鼠分为5个组，4-6只/组，day0天5个组小鼠分别接种30mg/kg，10mg/kg，3mg/kg，1mg/kg的12mAb抗体及PBS。24h后，用0.5％戊巴比妥钠麻醉小鼠，对小鼠经鼻腔攻击致死剂量的流感病毒(PR8-A/HongKong/01/1968(H3N2),PR8-A/Shanghai/02/2013(H7N9),A/Sichuan/01/2009(H1N1))。然后对小鼠连续称体重14天。当小鼠体重下降25％时，即认为小鼠已经死亡，按照动物伦理原则将小鼠断颈处死。
2.9抗体亲和力(Kd值)检测
本实验在中科院上海生化与细胞所的分子平台使用OCTET RED 96仪器完成。首先将AHC sensor放到有PBS的96孔黑板中浸泡至少10min,在此时间段内稀释抗原抗体，loading 12mAb，浓度为20ug/ml；抗原设置浓度梯度，1.5倍梯度稀释：200nM-133nM-89nM-59nM-39nM-26nM；将抗体抗原及再生buffer及PBS buffer加到另一块黑板中，置于仪器上；设定程序，开始运行，程序为：baseline 120s-loading Ab 300s-baseline 240s-association 900s-disassociation 900s-regenaration 5s-baseline 5s-regenaration5s-baseline 5s-regenaration 5s-baseline 5s；软件分析数据，计算抗原抗体亲和力Kd值。
2.10抗体抑制HA0酶切实验
准备新鲜纯化的A/HongKong/01/1968(H3N2)HA蛋白1ug，分成两份各0.5ug,其中一份与15ug 12mAb抗体37度孵育2h；此后，在不加抗体组与抗体组同时按质量比Trypsin：HA＝1：50加入TPCK-Trypsin,室温(22度)下进行酶切；加入Trypsin时刻记作0min,每组取出0.1ug HA蛋白或者0.1ug HA蛋白与1ug 12mAb抗体的复合物，取出后加入蛋白加载缓冲液(loading buffer)，100度煮样10min；然后分别在酶切0min,30min,60min,90min,120min时，取出蛋白或复合物，加入蛋白加载缓冲液(loading buffer)，100度煮样10min；通过Western Blot,6xHis抗体检测His显影情况判断HA蛋白酶切情况。
12mAb抗体抑制A/California/06/2009(H1N1)HA酶切的实验步骤同上。
2.11抗体抑制HA构象变化实验
将0.7ug 1968HK H3N2 HA按照1:50与TPCK混合，终体积70ul，用PBS补齐，室温放置2h，使HA0转变为HA1-HA2，变为激活状态；加入抑肽酶Aprotinin(货号：A1153)终止酶切反应，Aprotinin：TPCK＝1:2，之后使用脱盐柱脱盐；将激活的HA与抗体按照一定的比例混合(HA:Ab＝1:50)；将以上激活后的HA溶液分为3份，其中一份与12mAb抗体混合，一份与对照抗体混合，最后一份不加抗体，加入PBS补齐体积。37度2h；酸处理：2h后取以上3份样品的一半进行酸处理，脱盐柱置换buffer为100mM醋酸钠pH＝4.8(添加1％的DDM防止融合后的HA聚集)，37度1h；用pH＝9的中和buffer中和以上酸性样品到pH8.0；向以上6组样品中按照HA:TPCK＝1:40的量加入TPCK，室温放置30min或1h；向以上各样品中加入非还原SDS-PAGE上样缓冲液(non-reduced SDS-PAGE loading buffer)，100度煮样10min；跑胶，5％牛奶block，上抗体6XHis HRP 10000倍稀释加入，显影。
2.12抗体抑制膜融合实验
转染细胞表达HA蛋白：
Hela细胞长至80-90％时转染FUGW-HA质粒体系如下：
质粒：80ul opti-MEN+2ug/well质粒,
Lipo：80ul opti-MEN+2ul/well Lipofectamine 2000(脂质体2000),
4h后换液为Gibco DMEM+10％FBS+P/S,2mL/well,培养2天
细胞处理：
抗体孵育：去除上清，用Hyclone DMEM清洗细胞两遍，孵育12mAb抗体及对照抗体及对照不加抗体组，抗体浓度是100ug/ml，孵育1小时；酶切处理：收集掉抗体，用HycloneDMEM清洗细胞两遍然后用2.5ug/ml的TPCK孵育细胞10min，500ul/well；抗体孵育：酶切后用Hyclone DMEM清洗细胞两遍，再进行抗体孵育，孵育12mAb抗体及对照抗体及对照不加抗体组，抗体浓度是100ug/ml，孵育1小时；酸处理：用Hyclone DMEM清洗细胞两遍后，用pH4.8的柠檬酸溶液孵育细胞10min，500ul/well；培养融合：用Hyclone DMEM清洗细胞两遍后，加入Gibco DMEM+10％FBS+P/S陪液培养2h；2h后观察细胞是否融合；固定：2h后若细胞融合的差不多则用PBS清洗细胞，尽量除去死细胞，然后用4％PFA固定细胞半小时，37度固定；染色：用PBS清洗细胞两遍，加入结晶紫染液，37度染色至少2h；拍照：去除细胞板内的染色液，BF下，分别为物镜放大10倍及20倍拍照，自动调节曝光度。
2.13 HA蛋白变性实验
通过ELISA检测12mAb对正常HA及变性HA的结合活性。变性蛋白处理办法：小体积稀释蛋白，然后加入0.1％SDS及50mM的DTT，100度煮样5min。用1ug/ml的正常HA蛋白及变性HA蛋白包板过夜；PBST洗板3次，2％BSA buffer封闭2h；上样，12mAb，5ug/ml,孵育2h；PBST洗板3次，anti-human-Fc–HRP 5000倍稀释上样检测，TMB底物显色，检测OD450读值。
2.14使用papain酶切12mAb IgG获得Fab片段
配制溶解木瓜蛋白酶的活化buffer，1×PBS，加入20mM Cys,此buffer新鲜配制，冰上保存〈10h；木瓜蛋白酶的活化，取50μl 10mg/ml木瓜蛋白酶液溶(储存液，10mg/ml,溶于ddH2O)加入1ml活化溶液中，0.5mg/mL的溶液，37℃活化20min；木瓜蛋白酶酶切抗体：将活化的木瓜蛋白酶与抗体溶液按质量比为l：200的比例混合，在37℃下反应6h；6h后，配置1mL 0.3M的碘乙酰胺加入反应液中，终浓度为30mM，室温避光40min终止反应；过夜透析到PB缓冲液中或者浓缩置换buffer；第二天进行protein G的纯化，收集穿透液，即Fab；通过凝胶过滤层析进一步纯化Fab。
2.15凝胶过滤层析纯化蛋白
实验前一天准备好ddH2O、缓冲液(20mM HEPES,50mM NaCl,PH＝8.0)，以上各300ml,需0.22um滤膜过滤，之后水浴超声30min，放4度过夜，样品提前浓缩到500ul，第二天方可使用；实验当天，开机，装柱(GE Superdex 75)，先通水清洗柱子，再通缓冲液平衡柱子，流速设置为0.5ml/min，各通至少一个柱体积；用平台提供的0.22um过滤离心管，13000rpm 4度离心25-30min，以去除杂质及气泡，同时准备好56个0.6ml的离心管，置于样品收集架上；上样：用注射器吸取样品，赶走气泡，打入仪器，大约40-50min；收集样品：参照峰图收集样品，标记样品管；通水清洗柱子，流速设置为0.5ml/min，至少一个柱体积；收集好的样品分别跑SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，鉴定蛋白纯度。
实验结果
1，志愿者血清学检测，发现该志愿者血清可以结合并中和H1N1及H3N2流感病毒。
志愿者事先接种过华兰生物有限公司生产的季节性三价流感疫苗，该疫苗的主要成分包括A/California/7/2009(H1N1)pdm09-like virus，A/Victoria/361/2011(H3N2)-like virus，B/Wisconsin/1/2010-like virus。疫苗接种后第55天抽取志愿者血液(2016年3月5日，上海)，收集血清。为了检测该志愿者血清中是否含有可以结合Group1及Group2的流感HA的抗体，发明人选取了H3N2(Group2)及H1N1(Group1)的HA蛋白，并通过ELISA检测血清中的抗体滴度，结果显示该志愿者血清中存在可以识别H3N2及H1N1的HA的抗体(图1，A)。为了进一步确定这些可以识别H3N2及H1N1的HA蛋白的抗体是否具有中和病毒的能力，通过病毒微中和实验检测血清的中和滴度，结果表明该志愿者血清中确实存在可以中和H3N2及H1N1的抗体(图1，B)。
2，单细胞技术筛选抗原特异性的记忆B细胞,nested-PCR技术获得抗体基因并在CHO细胞上成功表达纯化抗体
接下来发明人通过单细胞RT-PCR技术获得特异性识别流感病毒HA蛋白的抗体的基因，并在体外进行表达纯化，具体方法如下(图2)：抽取该接种过季节性三价流感疫苗的志愿者的外周血20ml,分离出PBMC，通过流式细胞术分离出特异性结合流感病毒HA的记忆性B细胞；单细胞反转录PCR获得cDNA，然后通过两轮nested-PCR获得单个细胞抗体基因的重轻链可变区基因；将配对的抗体基因的重轻链测序获得以上抗体可变区基因的碱基序列，并构建到带有抗体恒定区的抗体表达载体上；瞬时转染CHO细胞表达抗体；收集CHO细胞上清，用Protein G通过亲和层析纯化抗体以获得纯度较高的抗体；对获得的抗体进行功能性评价以筛选出有效的抗体。
最后，通过该技术，成功获得一株广谱性中和Group1及Group2流感病毒的全人单克隆抗体，命名为12mAb。
3，抗体序列及胚系来源分析总结
首先分析了12mAb的氨基酸序列及其胚系基因等信息。发现12mAb重链V区来源于一个新的胚系IGHV3-48*02，未曾报道有流感病毒抗体来源此胚系。轻链V区来源于IGKV1-12*01。重轻链基因相对于胚系基因各有8、9个体细胞突变。另一个比较特殊的地方是12mAb重链CDR3(即VH-CDR3或HCDR3)长达23个氨基酸(图3，A、B)，这在所有抗体中是十分罕见的，这提示HCDR3可能在12mAb识别抗原HA的过程中发挥着重要的作用。
4,体细胞回复突变实验发现抗体上发挥作用的重要氨基酸
在不断的选择压力下，抗体会发生多种体细胞突变。前期对12mAb胚系基因的分析表明，其重轻链分别有8/9个体细胞突变。然而这些体细胞突变对抗体的亲和力及广谱性的影响并不可知。为了探究这个问题，发明人将以上17个体细胞突变氨基酸回复突变到胚系基因，分别表达纯化出以上17个突变抗体，并通过ELISA检测以上17个突变抗体对H3N2(Group2)及H1N1(Group1)HA的结合活性。结果显示，当重链106/114及轻链32/53/92位氨基酸回复突变后，其对H3N2 HA的结合活性下降，表明以上氨基酸在抗体识别抗原过程中发挥重要作用。重链114及轻链32/53/92位氨基酸回复突变后，其对H1N1 HA的结合活性下降，表明以上氨基酸在抗体识别抗原过程中发挥重要作用(图4)。综合以上信息表明，12mAb在识别抗原时重轻链均发挥重要作用，这与已报导的F10/CR6261等只依靠重链发挥作用的抗体不一样。重链106/114氨基酸是位于重链的HCDR3上的，表明较长的HCDR3确实发挥了重要作用。另一方面确认了5个对抗原识别重要的抗体上的氨基酸，这为改造优化抗体建立坚定的基础。
5,体外亲和力及中和活性检测发现12mAb可以广谱性的结合并中和Group1及Group2的流感病毒。
为了研究12mAb结合流感病毒HA的能力及广谱性，使用OCTET RED 96仪器检测12mAb对不同HA的亲和力。结果显示，12mAb可以广谱性的结合Group2的所有亚型的流感病毒HA，包括H3、H4、H7、H10、H14、H15，同时也对Group1的H1、H5具有较好的亲和力，对多数H3、H4、H7、H14、H1、H5的亲和力达到nM级别(图5，A)。为了研究12mAb中和流感病毒的能力及广谱性，依托于实验室现有的病毒，将12mAb与不同的病毒孵育，通过微中和实验来检测12mAb中和病毒的能力(图5，B)。结果显示，12mAb可以中和H3、H4、H7、H1亚型的流感病毒。
6,小鼠水平评价12mAb对不同流感病毒的保护作用，发现12mAb对H3N2,H1N1及H7N9病毒起到很好的保护作用。
体外实验证明12mAb可以结合并中和多种亚型的Group1及Group2的流感病毒，接下来为了证明12mAb在体内也可以起到很好的保护作用，分别进行了小鼠水平的H3N2，H7N9及H1N1的病毒攻击实验。实验中所选取的毒株分别为：A/HongKong/01/1968(H3N2)、A/Shanghai/02/2013(H7N9)、A/Sichua n/01/2009(H1N1),其中H3N2及H7N9是以PR8作为骨架，分别重组A/Hong Kong/01/1968(H3N2)、A/Shanghai/02/2013(H7N9)的HA及NA基因构建的重组毒株。BalB/c小鼠共分为5组，每组5只，对照组接种PBS，实验组分别接种1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的12mAb,24h后攻击致死剂量的流感病毒。连续称取体重14天，并绘制体重变化曲线及存活曲线图。实验结果表明，12mAb对H3N2，H7N9及H1N1病毒均有不同程度的保护作用。对于H3N2病毒，3mg/kg的12mAb即可以使小鼠完全存活，10mg/kg时体重完全不下降(图6，A、B)。对于H7N9,12mAb对小鼠的保护作用稍差一点，但10mg/kg的12mAb可以起到保护作用(图6，C、D)。而对于H1N1，1mg/kg的12mAb便可以使小鼠完全存活(图6，E、F)。综合以上实验证实12mAb可以保护小鼠抗击流感病毒。
7，12mAb通过抑制HA0酶切为HA1和HA2，以及低pH诱导的HA的构象变化来抑制宿主胞膜与病毒包膜的融合，从而阻断病毒入侵细胞，清除感染的病毒。
HA位于流感病毒的表面，主要介导病毒与宿主细胞的唾液酸受体的结合过程及病毒包膜与宿主胞膜的膜融合过程。12mAb中和流感病毒的机制有可能是通过以上两种机制的一种。首先，为了探究12mAb是否抑制病毒与宿主细胞的唾液酸受体的结合过程，将病毒与不同浓度的12mAb孵育1h后并加到1％的鸡红细胞中，检测鸡红细胞是否凝集。结果显示，12mAb不能抑制H3N2,H1N1及H7N9导致的血凝，而对照抗体均有较高的HAI活性(图7，A)。这说明12mAb不能抑制流感病毒HA与宿主细胞表面唾液酸受体的结合。那12mAb是否可以抑制HA介导的病毒包膜与宿主胞膜的膜融合过程，为了探究这个问题，发明人在Hela细胞表面分别表达H1N1及H3N2 HA蛋白，在加与不加12mAb的情况下，通过TPCK将HA0酶切为HA1和HA2,再用pH＝5的柠檬酸刺激诱导膜融合。实验结果表明，12mAb可以明显的抑制H3N2 HA介导的Hela细胞膜融合，而不加抗体及使用非相关的对照抗体却不能抑制H3N2介导的Hela细胞膜融合。对于H1N1 HA，其正常情况下产生膜融合的程度要弱于H3N2 HA，但是依然可以看出12mAb可以抑制H1N1 HA介导的Hela细胞膜融合，而不加抗体及使用非相关的对照抗体却不能抑制H1N1介导的Hela细胞膜融合(图7，B)。
病毒与宿主细胞结合后经历了一系列的变化最终完成病毒包膜与宿主胞膜的融合，首先是HA被呼吸道上皮细胞产生的类似trypsin的蛋白酶酶切为HA1和HA2，在体内酸性环境诱导下，HA发生构象变化，暴露融合肽，并使融合肽更加接近于宿主胞膜，从而诱导膜融合产生。以上的实验已经证实12mAb可以抑制膜融合，但具体是抑制了酶切过程还是HA构象变化并不清楚。为了探究12mAb能否抑制HA0酶切为HA1和HA2，将H3N2及H1N1的HA0分别在加12mAb及对照抗体的情况下，酶切不同的时间，并通过Western Blot检测HA0存在情况。结果显示，对H3N2及H1N1 HA,在2h时12mAb依然可以抑制HA0的酶切，而不加抗体及对照抗体却被酶切完全(图7，C)。为了探究12mAb能否抑制低pH诱导的HA构象变化，将HA蛋白先用TPCK处理使其酶切为HA1和HA2，再将其与不同抗体孵育，并用酸诱导，由于发生构象变化后的HA通常对TPCK很不稳定，容易降解，所以最后用TPCK处理细胞，WB检测HA是否被降解掉。如图(图7，D)所示，12mAb可以抑制低pH诱导的HA构象变化，而不加抗体及加对照抗体组的HA在低pH诱导下已被降解完全。
8,12mAb比MEDI8852及FI6v3表现出更好的结合及中和H3N2流感病毒的能力。
前期的数据已经证实12mAb可以广谱性的结合及中和Group1及Group2的流感病毒，但是其与已经报道的较好的广谱性抗体的结合及中和能力并未进行比较过。MEDI8852及FI6v3是目前已经报道的最好的广谱性流感抗体，为此，发明人全基因合成并表达出以上两种抗体，并通过ELISA实验及病毒微中和实验来比较12mAb和MEDI8852及FI6v3结合及中和病毒的能力。发现在所检测的6株不同年代的H3N2 HA蛋白中，12mAb对H3N 2HA蛋白的结合活性要明显优于MEDI8852及FI6v3抗体，表现出较高的结合活性(图8，A-F)。根据实验室现有的6株H3N2流感病毒中和实验显示，12mAb中和病毒的能力总体上要优于MEDI8852及FI6v3抗体。对于1968HongKongH3,2006DongHuH3及2013SwitherlandH3,12mAb和MEDI8852及FI6v3的中和能力没有明显差异，但对于2009CanineH3,2007BrisbaneH3及2009VictorialH3,12mAb的IC50值明显低于MEDI8852及FI6v3抗体，且FI6v3并不能中和2007BrisbaneH3及2009VictorialH3(图8，G)。
9,12mAb识别了H3N2 HA的一段线性表位。
为了研究12mAb结合抗原的表位，首先研究了12mAb是结合抗原的线性表位还是构像表位。通过加入DTT及SDS并100度煮沸的方法将HA蛋白变性，使其线性化，并包板至ELISA板，与未变性HA做对照，ELISA检测12mAb对变性H3/H7/H1 HA及未变性H3/H7/H1 HA的结合活性。已报到的其他抗体作为实验对照。结果显示，12mAb都可以结合变性及不变性的H3N2HA，而MEDI8852,FI6v3及CR8020只可以结合未变性的H3N2 HA,非相关的对照抗体均不能结合变性及不变性的H3N2 HA；对于H1N1及H7N7的HA，12mAb，MEDI8852,FI6v3，CR8020，F10,3E1只能结合未变性的HA，不能结合变性后的HA(图9，A-C)。以上数据表明，12mAb识别了H3N2 HA的线性表位，而对于H1N1及H7N7的HA,12mAb识别的是构象表位。为了近一步验证12mAb是否可以识别所有变性后的H3N2 HA而不仅限于1968HongKong H3N2,发明人又选取了另外三株H3N2 HA蛋白进行实验，结果发现对这三株H3N2 HA蛋白，12mAb均可以结合变性后的HA，而且其结合能力同未变性的HA的结合能力基本一致，甚至有一点提升，这说明，12mAb可以结合所有H3N2病毒HA蛋白的线性表位(图9，D-F)。
为了找到这段线性表位在HA上的位置，首先构建了不同长短的1968HongKongH3N2 HA的截短表达载体，然后在293T细胞上表达以上截短表达载体，最后通过WesternBlot来检测12mAb对以上截短的蛋白的结合情况。(图9，G)是较大范围的截短实验，12mAb并不能结合1-390氨基酸长度的HA蛋白，表示1-390氨基酸上并没有12mAb的表位，而1-412氨基酸时，12mAb有少量的结合，1-489氨基酸时，相对于全长HA，12mAb有完全的结合活性。这说明12mAb结合H3N2 HA的表位大约在390-489氨基酸之间(该H3N2 HA购买自义翘神州，其N端加入His标签，氨基酸顺序按照该购买的序列顺序标记，Cat:VG40116-NH)，即HA2 31-130氨基酸之间。为了进一步明确这段线性表位的位置，进行了第二次截短实验。(图9，H)是较小范围的截短实验，实验结果表明12mAb结合H3N2 HA的表位大约在417-435氨基酸之间，即HA258-75氨基酸之间。该段序列是位于HA2helix A与长helix CD之间的loop段。
讨论
治疗性抗体
治疗性抗体用于流感的等病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1禽流感病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有广谱中和活性的抗流感病毒的治疗性抗体具有以下潜在优势，一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合，另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。1986年，第一株治疗器官移植出现的排斥反应的鼠单抗——莫罗单抗-CD3(murmonabCD3,hoclone OKT3)获得美国FDA批准上市，但由于其在人体内会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了应用。随着免疫学和分子生物学的发展，基因工程抗体迅速发展，嵌合抗体，人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展，将HAMA反应降至最低乃至消除,尤其以全人抗体成为抗体药物未来的发展方向。
目前Crucell、Genetech、Medimmune等公司已相继研发出流感病毒广谱性中和抗体，尤其以Medimmune研发的MEDI8852效果最好，MEDI8852可以中和几乎所有的Group1及Group2的流感病毒，并在小鼠及雪貂上展现了较好的保护作用。美国FDA授予该抗体快车道地位，目前正在临床II期阶段。大部分广谱流感病毒抗体主要靶定在流感病毒血凝素的茎秆部区，主要包括融合亚结构域、融合肽和外缘β折叠等，该部分区域是血凝素相对保守的位置，不太容易发生突变。以往报道的抗体的表位也大都是构象表位，然而线性表位的发现对于流感广谱疫苗的设计也十分重要。
本发明抗体12mAb
(1)本发明从一个接种过季节性流感疫苗的志愿者外周血中，通过单细胞RT-PCR技术筛选到一株全人广谱性中和抗体，12mAb。该抗体重链V区来源于IGHV3-48*02胚系，目前还未曾有报道该胚系基因来源的流感病毒抗体。12mAb重轻链序列上各有8-9个体细胞突变，重链CDR3长达23个氨基酸，该长度的HCDR3在已报道的抗体中十分罕见，预示着HCDR3在结合抗原方面发挥着重要的作用。通过回复体细胞突变到胚系基因实验确实找到了位于HCDR3上的氨基酸发挥重要的结合抗原的作用。同时发现12mAb的重、轻链均在结合抗原方面发挥重要作用。
(2)体外结合实验表明12mAb可以结合所有亚型的Group2的流感病毒HA及Group1的部分毒株HA，包括H3、H4、H7、H10、H14、H15、H1、H5。限于实验室现有的流感病毒毒株，病毒中和实验表明12mAb可以中和H1、H3及H7亚型的流感病毒。小鼠水平的检测表明，12mAb可以保护小鼠不被H1、H3及H7亚型的流感病毒感染。这预示该抗体潜在的抗流感病毒感染的临床应用价值，为临床上提供新型抗流感病毒感染的候选药物。
(3)同时，还比较了12mAb和其他已发表的广谱性及中和活性都最好的两株流感病毒抗体，MEDI8852及FI6v3。发现12mAb对H3N2亚型的流感病毒的结合及中和活性都优于MEDI8852及FI6v3。这为解决近几年频频爆发流行的H3N2病毒提供新的更优的防控策略。
(4)在12mAb识别抗原的表位情况的研究中，发现12mAb识别了H3N2HA的线性表位，及H7N7及H1N1的构象表位。而对于MEDI8852/FI6v3/CR8020/F10/3E1等抗体，均是识别HA的构象表位。这揭示出12mAb的与众不同。同时，通过截短表达实验，找到了12mAb结合的线性表位的最短序列，即HA2 58-75位氨基酸。该段序列是位于HA茎秆部区的Helix A与HelixCD之间的loop环，目前还没有报道过流感抗体的表位位于此位置。综上，12mAb的识别表位十分特殊，新的表位的发掘为流感疫苗的设计提供新的靶点与思路。
(5)机制探索进一步佐证了本发明的观点，发现12mAb并没有血凝抑制活性，说明12mAb不能靶向HA的受体结合区。膜融合抑制实验发现，12mAb可以抑制膜融合，进一步机制研究表明12mAb可以抑制HA0的酶切以及低pH值诱导的HA的构象变化。以上实验进一步佐证了12mAb作用靶标是HA的茎秆部区。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明序列信息
SEQ ID NO.1
GFTFSTYN
SEQ ID NO.2
ISTSSNTI
SEQ ID NO.3
ARDRGCSSTNCYVVGYYFYGMDV
SEQ ID NO.4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYNMNWVRQAPGKGLEWLSYISTSSNTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRDEDTAVYYCARDRGCSSTNCYVVGYYFYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.5
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTACAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCGCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATACATTAGTACTAGTAGTAATACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAAAACTCACTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGTTGTAGTAGCACCAACTGCTATGTGGTTGGCTACTACTTCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.6
QGISSY
SEQ ID NO.7
GAT
SEQ ID NO.8
QQADSFPLT
SEQ ID NO.9
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQLKPGRAPKLLIYGATRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYHC QQADSFPLTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO.10
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCTGAAACCAGGGAGAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAACCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCGGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACCATTGTCAACAGGCTGACAGTTTCCCTCTCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 广谱性中和流感病毒的全人抗体
<130> P2018-1724
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Asn
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Ile Ser Thr Ser Ser Asn Thr Ile
1 5
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Ala Arg Asp Arg Gly Cys Ser Ser Thr Asn Cys Tyr Val Val Gly Tyr
1 5 10 15
Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Thr Ser Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Cys Ser Ser Thr Asn Cys Tyr Val Val Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 5
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctacaaca tgaactgggt ccgccaggcg 120
ccagggaagg ggctggagtg gctttcatac attagtacta gtagtaatac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaaaaa ctcactgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300
ggttgtagta gcaccaactg ctatgtggtt ggctactact tctacggtat ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Gly Ala Thr
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctacttag cctggtatca gctgaaacca 120
gggagagccc ctaagctcct gatctatggt gcaacccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcgg cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacca ttgtcaacag gctgacagtt tccctctcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321

Claims (14)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.7所示的VL-CDR2，
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR3，
优选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区的序列、如权利要求2所述的重链的序列、如权利要求3所述的轻链可变区的序列、如权利要求4所述的轻链的序列、或如权利要求5所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
11.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
12.如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、如权利要求5所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
13.一种检测样品中流感病毒血凝素HA蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与权利要求5所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在流感病毒血凝素HA蛋白。
14.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求5所述的抗体或权利要求6所述的重组蛋白。
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