CN105675883A - 一种检测人类白细胞抗原hla-g的方法 - Google Patents

一种检测人类白细胞抗原hla-g的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，采用HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列的蛋白片段作为抗原制备抗体3C4，采用HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋白片段偶联KLH后作为抗原制备抗体3H1，然后将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G，所述HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。本发明的方法具有检测灵敏度高、特异性好，具有很好的可重复性和准确性，从而为检测HLA-G提供了一种新的方法。

Description

一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及一种检测血清可溶性人类白细胞抗原G的方法。
背景技术
先兆子痫(preeclampsia，PE)是指在妊娠24周左右，在高血压、蛋白尿基础上，出现头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状，又称妊娠高血压综合征。是妊娠期特有疾病，产科四大重症之一。其发病率约为5-10％。严重危及母婴安全。对先兆子痫的早期筛查有助减少对母婴危害。
先兆子痫发病机理至今仍不是完全清楚。但是，现今医学界公认胎盘不正常植入和不正常发育是先兆子痫的主要病因。因为分娩后，胎盘排除，先兆子痫的症状即可消失。
胎盘不正常植入和不正常发育则与母亲的免疫功能相关。因为胎儿基因的一半来自母亲，一半来自父亲。对母体免疫系统来讲，胎儿是一个同种、半异体。但在成功的妊娠，母亲免疫系统并没有将其排斥清除。这种现象称之为母体对胎儿的免疫耐受。如果这种免疫耐受机制失调，即可引起母亲的免疫排斥反应增强而导致胎盘着床浅，胎盘的滋养叶细胞功能受损，胎盘缺血和胎盘代谢障碍。同时，胎盘源性血浆细胞毒性因子增加，从而使血管内皮细胞损伤，全身小动脉痉挛，最终导致妊娠高血压综合征(Goldman-WohlD,etal.Mol.Hum.Reprod.2000；6:88-95)。
人类白细胞G(HLA-G)是一种非经典的人类白细胞I类抗原(GeraghtyDEetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1987；84:9145-149)。HLA-G的基因同经典I类白细胞抗原的基因(HLA-A，-B和-C)均位于第6对染色体的短臂上；基因和表达的产物与经典I类白细胞抗原有86％雷同。但是，HLA-G与经典I类白细胞抗原相比，在正常生理情况下，HLA-G仅在胎盘的绒毛膜滋养细胞有较高的表达(Kovatsetal.,Science1990；248:220)。而HLA-A,-B和-C在所有的有核细胞均有表达，但在胎盘的绒毛膜细胞经典I类白细胞抗原表达则是缺失的。组织和细胞缺乏或降低经典I类白细胞抗原的表达，可以降低抗原提呈功能和免受细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击，但极容易受到自然杀伤细胞(NK)的攻击。HLA-G则具有抑制自然杀伤细胞，细胞毒性T淋巴细胞和抗原提呈细胞(APC)的功能(LeMaoultJetal.,TissueAntigens.2003；62:273)。因此，胎盘绒毛膜细胞经典I类白细胞抗原的表达的缺失和HLA-G的高表达构成了母体对胎儿免疫耐受关键的环节。
已有大量的研究证明先兆子痫患者的胎盘HLA-GmRNA和蛋白、以及血清中可溶性HLA-G蛋白表达明显降低(YieSMetal.,Am.J.Obster.Gynecol.191:525-529,2004)。O'Brin等人研究结果显示：先兆子痫患者HLA-G在胎盘绒毛外细胞滋养细胞簇上呈孤岛样缺失(O'BrienMetal.，Hum.Immunol.61:1126-1131，2000)。由于滋养细胞表达的HLA-G分子在细胞侵入母胎蜕膜中起到保护作用，HLA-G表达的缺陷，使绒毛滋养细胞易受母体免疫系统的攻击，让其侵蚀能力低下，侵入底蜕膜中的滋养细胞数量明显不足，侵蚀仅达子宫螺旋动脉蜕膜段，不能有效地完成血管重建(HuntJS,eta1.，Hum.Reprod.9:729-735，2003)。与正常妊娠相比，先兆子痫患者的胎盘种植较浅，血管内皮细胞受损和功能发生异常。
那么，检测血清HLA-G在预测先兆子痫的发生有无临床应用价值呢？Hackmon等人比较先兆子痫患者与正常妊娠晚期孕妇的血清sHLA-G，发现前者血清sHLA-G的水平显著低于后者(HackmonR,etal.Am.J.Obster.Gynecol.197:255:e1-e5,2007)。Rizzo等人检测了580例白人妊娠妇女，也发现在妊娠中期和晚期先兆子痫的病人血清sHLA-G显著低于正常妊娠妇女(RizzoRetal.,Am.J.Reprod.Immunol.62:320-338,2009)。Yie等人研究发现妊娠高血压疾病的患者在早孕及中孕期其母血中的HLA-G表达即下降，与正常对照组差异显著，可以通过在早孕期检测其母血中的HLA-G水平，预测其妊娠高血压疾病的发生(YieSMetal.,Am.J.Obstet.Gynecol.193:204-208,2005)。他们的研究进一步得到了Steinborn等人研究的证实。Steinborn等人检测40位正常妇女，291位正常妊娠妇女和236位先兆子痫的患者，发现血清sHLA-G水平在正常早孕时增高，然后随孕期而下降。但在先兆子痫的患者在早孕及中孕期其母血中的HLA-G明显低于正常妊娠妇女。统计分析显示早孕期检测其母血中的HLA-G水平能够预测其妊娠高血压疾病的发生(Steinborneta.,Am.J.Reprod.Immunol.57:277-86,2007)。国内也有研究发现先兆组与正常妊娠组血清中的sHLA-G的水平差异有统计学意义(侯彩英等:现代生物医学进展.8:1905-1906，2008)。
但是，上述的研究也均显示，血清中HLA-G的浓度个体差异较大。这些研究且仅仅测定第一孕期(1-3个月)，第二孕期(4-6各月)和第三孕期(6-9个月)。实验设计比较粗糙，比较难以确定其临床判断值。
此外，大量的研究证明：母亲血液中的促血管生长因子如胎盘生长因(placentalgrowthfactor，PlGF),可溶性血管内皮细胞生长因子受体(solublevascularendothelialgrowthfactorreceptor，sVEGFR)和可溶性血管内皮生长因子受体1，sFlt-1)，可溶性内皮糖蛋白(solubleendoglin)，抗血管紧张II受体(angiotensinIItypeIreceptor)在先兆子痫发生前一至两个星期出现变化。均有可能作为先兆子痫早期筛查的指标(BaumannMU,etal.,Mol.AspectsMed2007；28:227–244；SavajSandVaziriN.IranJKidneyDis.2012；6:334-338)。不过这些指标与先兆子痫病理过程中由于胎盘不正常植入引起的后期血管变化相关，在第一孕期正常妊娠和先兆子痫患者并无区别；而只能在第二孕期(24周)之后，在接近先兆子痫发病的时间，才能看到正常妊娠和病人之间的区别；不能较早地预测疾病的发生。
申请号为200710075443.7的中国专利公开了一种含抗HLA-G的单克隆抗体的癌症诊断试剂盒及其应用，其采用的两个抗HLA-G重链区域不同抗原表位的单抗(HGY和HGY-2)，用夹心式酶联免疫方法，根据纯化的HLA-G蛋白标准，定量地确定血清或其他体液中HLA-G的含量。但其灵敏度和准确性都不够理想。
发明内容
本发明目的是提供一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，提高检测HLA-G的灵敏度和准确性。
本发明的技术方案为：
一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，采用HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列的蛋白片段作为抗原制备单克隆抗体3C4，采用HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋白片段偶联KLH后作为抗原制备单克隆抗体3H1，然后将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G，所述HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
进一步地，制备抗体3C4的方法如下：
(1)采用重组蛋白的方法获得HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列的蛋白片段；
(2)将步骤(1)获得的蛋白片段作为抗原免疫小鼠，然后经细胞融合、筛选杂交瘤细胞得到抗体3C4。
进一步地，制备抗体3H1的方法如下：
(1)合成HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋白片段并偶联KLH；
(2)将步骤(a)偶联KLH后的蛋白片段作为抗原免疫小鼠，然后经细胞融合、筛选杂交瘤细胞得到抗体3H1。
进一步地，将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G的方法如下：
(1)将抗体3C4包被在酶标板上，
(2)加入含有HLA-G的待测血浆或血清或细胞培养液，并设置阳性和阴性对照，振荡后洗涤，
(3)加入生物素标记的抗体3H1，振荡后洗涤，
(4)加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物，振荡后洗涤，
(5)加入显色液显色，
(6)加入终止液终止显色反应，
(7)检测光密度并与标准曲线对比。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用HLA-G的重链的特定蛋白片段作为抗原制备抗体3C4，采用HLA-G的轻链的特定蛋白片段偶联KLH后作为抗原制备抗体3H1，然后将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G，具有检测灵敏度高、特异性好，具有很好的可重复性和准确性，灵敏度达到3ng/ml，准确性达到95.8％，从而为检测HLA-G提供了一种新的方法。
附图说明
图1、原核表达HLA-G重组蛋白(101aa)的SDS-PAGE电泳图谱。1:亲和层析前；2:亲和层析后。
图2中A为由HLA-G重组蛋白免疫小鼠制备的抗HLA-G单抗(3C4)的抗体稀释曲线，以证明抗体的敏感性；图2中B为将人胎盘组织匀浆行SDS-PAGE电泳分离，转移至偏二氟乙烯(PVDF)膜。再用抗HLA-G单抗(3C4)进行免疫印迹实验，以证明抗体的特异性。并与其它抗HLA-G单抗进行比较。1:抗HLA-G单抗(3C4)；2:抗HLA-G单抗(HGY)；3：抗HLA-G单抗(4H84)。
图3中A为由KLH偶联合成的β2-微球蛋白多肽(50aa)免疫小鼠制备的抗β2-微球蛋白单抗(3H1)的抗体稀释曲线，以证明抗体的敏感性；图3中B为将人胎盘组织匀浆行SDS-PAGE电泳分离，转移至偏二氟乙烯(PVDF)膜。再用抗抗β2-微球蛋白单抗(3H1)进行免疫印迹实验，以证明抗体的特异性。并与其它抗β2-微球蛋白单抗进行比较。1:抗β2-微球蛋白单抗(3H1)；2:抗β2-微球蛋白单抗(Abcom)。
图4中A为10批HLA-G酶联免疫试剂盒的标准曲线。HLA-G蛋白标准是采用本发明的抗HLA-G单抗(3H4)制备的抗体亲和柱从人胎盘匀浆分离纯化获得。HLA-G蛋白标准与包被在酶标扳抗HLA-G单抗(3H4)结合后，再用生物素标记的抗β2-微球蛋白单抗(3H1)识别。生物素标记则采用Streptoavidin-HRP识别，并催化HRP底物TMB发生颜色反应。在酶标仪读取450/630观密度。最后采用直线回归方法分析得出曲线的切距、斜率的直线回归方程；图4中B为HLA-G标准曲线和待测血清样品稀释曲线的平行试验。这两条曲线的斜率无显著差异。
图5为正常妊娠第一周期血清HLA-G实际浓度(U/ml)与先兆子痫病人第一周期血清HLA-G实际浓度(U/ml)的比较，P＝0.001。灰色区域表示血清HLA-G实际浓度在正常妊娠和先兆子痫病人重叠范围。
图6为正常妊娠孕娠第一周期血清HLA-G对数浓度(LOGU/ml)与先兆子痫病人第一周期血清HLA-G实际浓度(LOGU/ml)的比较，P＝0.001。灰色区域表示血清HLA-G实际浓度在正常妊娠和先兆子痫病人重叠范围。
图7为正常妊娠从怀孕第4周到怀孕第11周血清HLA-G实际浓度(U/ml)变化与先兆子痫病人同期血清HLA-G实际浓度(U/ml)变化的比较。*表明正常妊娠与先兆子痫相比，P<0.05。
图8为正常妊娠从怀孕第4周到怀孕第11周血清HLA-G对数浓度(LOGU/ml)变化与先兆子痫病人同期血清HLA-G实际浓度(LOGU/ml)变化的比较。*表明正常妊娠与先兆子痫相比，P<0.05。
图9为检测血清HLA-G对预测先兆子痫的ROC曲线分析。当采用4-11孕周HLA-G实际浓度(U/ml)，AUC＝0.701，P＝0.001。当采用4-11孕周HLA-G对数浓度(LOGU/ml)，AUC＝0.762，P＝0.001。当采用8-11孕周HLA-G对数浓度(LOGU/ml)，AUC＝0.847，P＝0.0001。
具体实施方式
实施1.重组HLA-G蛋白片段
材料和方法
1.目的基因的克隆及质粒构建
●从基因库中调取HLA-G基因序列，选取与HLA-A、-B和-C同源性低的区域，用Primer5.0软件设计引物。上游引物为5’-gaagaggagacacggaacac-3’(255---274bp)下游引物为5’-ctccaggtaggctctccttt-3’(538---557bp)。并将设计的引物交生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
●因人胎盘组织有较高的HLA-G表达，取胎盘组织匀浆处理后，采用TRNzol方法提取总RNA。
●采用两步法进行RT-PCR将要克隆的目的基因扩增。反转录(RT)反应体系和反应条件如表1；聚合酶链式反应(PCR)反应体系和反应条件如表2。
表1
表2
●采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的目的基因。
●将扩增出的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳切胶方法，用天根公司的TIANgelMidiPurificationKit按照操作说明书纯化。
●按照qiagen公司PQE30UA载体试剂盒操作手册将纯化的PCR产物与载体直接连接。
●将连接质粒转化到M15感受态细胞中，均匀涂布于相应抗生素/LB平板上，37℃倒置过夜培养，观察菌落生长情况。
●采用RT-PCR方法鉴定表达阳性的菌株。用LB培养液37℃250rpm增殖阳性菌株。
2.重组蛋白HLA-G表达及纯化
●将鉴定的阳性重组菌接种于抗生素/LB液体培养基中培养，加IPT进行诱导表达。
●将诱导表达的菌体重悬于含变性剂、还原剂、表面活性剂及蛋白酶抑制剂和DNase的细胞裂解缓冲液中，冰浴条件下超声波破碎细胞。4℃12000r/min离心15min，收集上清液。
●采用亲和层析方法将上清液进行纯化。收集洗脱液。将洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析。
●用方法测定洗脱液中蛋白质浓度，分装后于-70℃冻存备用。
结果
(1)SDS-PAGE电泳分析和用商业化抗HLA-G单克隆抗体(4H84)进行的免疫印迹结果见附图1。表明本次实施克隆纯化出HLA-G的一个蛋白片段。分子量为10kd。
(2)根据HLA-G基因序列，克隆出HLA-G重组蛋白片段的氨基酸序列为：HLA-G蛋白序列中的第85aa至第185aa：
EEETRNTKAHAQTDRANLATLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLE
本次实施研制的HLA-G重组蛋白片段氨基酸序列(85aa-185aa)位于HLA-G蛋白分子重链区域α1(25aa-148aa)和α2(146aa-203aa)之间。HLA-G氨基酸序列与经典的白细胞抗原HLA-A、-B和-C的平均有86％的类同(KovatsSetal.,Science.1990；248(4952):220-223)。但该克隆重组的蛋白片段的氨基酸序列则与HLA-A、-B和-C相应的氨基酸序列分别仅有78％，75％和76％的类同。这样采用该重组蛋白免疫动物制备的抗体与HLA-A、-B和-C发生交叉反应的可能性更小，特异性将显著提高。实施2结果证明由该蛋白片段免疫小鼠制备的抗HLA-G单抗(3C4)与我们以前发明的抗HLA-G单抗(HGY和HGY-2)和商业化抗HLA-G单抗只识别35KdHLA-G蛋白重链。
实施2.抗HLA-G单克隆抗体制备
材料和方法
1.抗原制备
用实施1中制备的HLA-G85aa-185aa片段作为抗原。
2.小鼠免疫
●将50μgHLA-G85aa-185aa片段加等体积弗氏完全佐剂乳化到滴水不化后，对6-8周龄雌性Balb/c小鼠行腹腔注射，注射体积200μl/只小鼠，2周后进行第二次免疫。
●将HLA-G85aa-185aa片段加等体积弗氏不完全佐剂乳化到滴水不化后，做小鼠腹腔注射，注射体积200μl/只小鼠，2周后进行第三次免疫。
●将HLA-G85aa-185aa片段加等体积弗氏不完全佐剂乳化到滴水不化后，做小鼠腹腔注射，注射体积200μl/只小鼠，2周后采小鼠尾静脉血，离心，取血清用酶联免疫法检测血清效价。
●对小鼠血清效价达到1:10000以上的小鼠，在融合前三天做加强免疫；小鼠血清效价在1：10000以下的小鼠做四次免疫，四次免疫后检测血清效价，达到1:10000以上，在融合前三天做加强免疫。
3.细胞融合
●准备饲养细胞：在细胞融合和单克隆的选择过程中，由于单个的或数量很少的细胞不易生存，须加入饲养细胞。一般选择腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，巨噬细胞可吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。
●分离免疫小鼠的脾细胞：无菌操作打开小鼠腹腔，剪下脾脏组织，去除结缔组织，用细胞筛将脾脏制备成细胞悬液，转到50ml离心管内，1000rpm/min离心5min，用不完全1640培养基重悬，细胞计数。
●收集SP2/0细胞到50ml离心管内，1000rpm/min离心5min，用不完全1640培养基重悬，台盼蓝染色计数活细胞。按照脾细胞：SP2/0细胞＝5:1比例混合两种细胞，1000rpm/min离心5min，移去上清液。
●轻弹细胞底部，37℃水浴1min，使其达融合温度。将加预热至37℃的50％PEG-15000.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续1min，37℃水浴静置90秒。再在37℃水浴中缓慢滴加1ml不完全1640培养基，1min内加完，重复1次；1ml培养基，0.5min内加完，重复1次；再加16ml培养基，2min内加完，37℃静置10min，1000rpm/min离心5min，移去上清液。
●移去上清，轻弹细胞底部，加20ml含有HAT的完全1640培养基。取出培养好饲养细胞的96孔板，每孔滴加融合的细胞液100μl。轻轻摇匀后，放入37℃温箱中培养。第7日换入含HT的完全1640培养液。
4.筛选分泌HLA-G抗体的杂交瘤细胞
●包被HLA-G85aa-185aa片段，1μg/孔，封闭。在无菌条件下，将有克隆团的对应96孔各取100ul培养基，进行捕获酶联免疫测定。
●根据捕获酶联免疫测定实验结果，选择免疫阳性扩大培养，并进行进一步筛选。
结果
(1)经多次筛选后得到一株抗HLA-G85aa-185aa片段的单克隆抗体，命名为3C4
(2)小鼠分型试剂盒(Amersh)测定，该细胞株产生的单抗亚型为IgG2b
(3)用捕获酶联免疫测定测定的3H1单抗的抗体滴度实验证明本发明该抗体对HLA-G85aa-185aa片段具有较高的敏感性(附图2中A)
(4)用免疫印迹方法实验证明抗体对HLA-G蛋白具有较高的特异性(附图2中B)。
实验结果表明本发明由采用HLA-G85aa-185aa片段免疫小鼠制备的抗HLA-G重链区域的单抗(3C4)具有很高的特异性和敏感性。可以用于HLA-G蛋白表达的免疫测定。
实施3.抗Beta-微球蛋白单克隆抗体制备
材料和方法
1.抗原制备
查阅资料，根据β2微球蛋白设计多肽序列：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGF(β2微球蛋白氨基酸序列：1aa-50aa)。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成多肽，并偶联KLH。
2.小鼠免疫
●将50μgKLH偶联β2微球蛋白多肽加等体积弗氏完全佐剂乳化到滴水不化后，对6-8周龄雌性Balb/c小鼠行腹腔注射，注射体积200μl/只小鼠，2周后进行第二次免疫。
●将50μgKLH偶联β2微球蛋白多肽加等体积弗氏不完全佐剂乳化到滴水不化后，做小鼠腹腔注射，注射体积200μl/只小鼠，2周后进行第三次免疫。
●将50μgβ2微球蛋白加等体积弗氏不完全佐剂乳化到滴水不化后，做小鼠腹腔注射，注射体积200μl/只小鼠，2周后采小鼠尾静脉血，离心，取血清用酶联免疫法检测血清效价。
●对小鼠血清效价达到1:10000以上的小鼠，在融合前三天做加强免疫；小鼠血清效价在1:10000以下的小鼠做四次免疫，四次免疫后检测血清效价，达到1:10000以上，在融合前三天做加强免疫。
3.细胞融合
●准备饲养细胞：在细胞融合和单克隆的选择过程中，由于单个的或数量很少的细胞不易生存，须加入饲养细胞。一般选择腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，巨噬细胞可吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。
●分离免疫小鼠的脾细胞：无菌操作打开小鼠腹腔，剪下脾脏组织，去除结缔组织，用细胞筛将脾脏制备成细胞悬液，转到50ml离心管内，1000rpm/min离心5min，用不完全1640培养基重悬，细胞计数。
●收集SP2/0细胞到50ml离心管内，1000rpm/min离心5min，用不完全1640培养基重悬，台盼蓝染色计数活细胞。按照脾细胞：SP2/0细胞＝5:1比例混合两种细胞，1000rpm/min离心5min，移去上清液。
●轻弹细胞底部，37℃水浴1min，使其达融合温度。将加预热至37℃的50％PEG-15000.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续1min，37℃水浴静置90秒。再在37℃水浴中缓慢滴加1ml不完全1640培养基，1min内加完，重复1次；1ml培养基，0.5min内加完，重复1次；再加16ml培养基，2min内加完，37℃静置10min，1000rpm/min离心5min，移去上清液。
●移去上清，轻弹细胞底部，加20ml含有HAT的完全1640培养基。取出培养好饲养细胞的96孔板，每孔滴加融合的细胞液100μl。轻轻摇匀后，放入37℃温箱中培养。第7日换入含HT的完全1640培养液。
4.筛选分泌β2-MG抗体的杂交瘤细胞
●包被β2微球蛋白多肽，1μg/孔，封闭。在无菌条件下，将有克隆团的对应96孔各取100ul培养基，进行捕获酶联免疫测定。
●根据捕获酶联免疫测定实验结果，选择免疫阳性扩大培养，并进行进一步筛选。
结果
(1)经多次筛选后得到一株抗β2微球蛋白的单克隆抗体，命名为3H1。
(2)小鼠分型试剂盒(Amersh)测定，该细胞株产生的单抗亚型为IgG1
(3)用捕获酶联免疫测定测定的3H单抗的抗体滴度实验证明本发明该抗体对β2微球蛋白多肽具有较高的敏感性(附图3中A)。
(4)用免疫印迹方法实验证明抗体对β2微球蛋白具有较高的特异性(附图3中B)。
实验结果表明本发明由采用β2微球蛋白多肽(1aa-50aa)免疫小鼠制备的抗HLA-G轻链(β2微球蛋白)的单抗(3H1)具有很高的特异性和敏感性。可以用于夹心式HLA-G酶联免疫测定。
实施4.人类白细胞抗原-G酶联免疫试剂盒的研制
材料和方法
1.单抗：
该试剂盒采用一种抗HLA-G单抗(3C4)和抗β2-微球蛋白单抗(3H1)。这两种抗体分别结合HLA-G蛋白分子重链α1-α2之间的抗原表位和HLA-G蛋白分子轻链β2-微球蛋白的抗原表位。抗体均储存在-80℃。
2HLA-G蛋白标准的制备
采用本发明的抗HLA-G单抗(3H4)制备成抗HLA-G抗体亲和柱。将人工流产的胎盘组织的提取液经亲和层析分离纯化获得，其纯度>95％.
3.ELISA试剂盒的制备
●该试剂盒是应用抗HLA-G单克隆抗体(10μg/mL)用标准方法包被在96孔酶标板或12X8或8X12酶标条上。血浆或血清或细胞培养液中的可溶性HLA-G蛋白和3C4抗体结合；再采用生物素标记的抗β2-微球蛋白单抗(3H1)对被3C4抗体结合的HLA-G蛋白进行夹心式结合。然后用Streptoavidin-HRP复合物结合生物素标记的抗β2-微球蛋白单抗。辣根过氧化酶催化色原底物(TMB)显色。根据标准曲线确定检测样品中HLA-G的浓度。
4.测定步骤
●每孔加50～100ul样品和HLA-G标准于HLA-GELISA酶标板(条)，并设阳性和阴性对照，室温震摇1h。
●用1x洗液洗板4次。
●每孔加入50ulAnti-β2MG-biotin抗体工作液，室温震摇1h。
●用1x洗液洗板4次。
●每孔加入50ulStreptavidin-HRP抗体工作液(建议将Streptavidin-HRP抗体作1：1000稀释于1xSamplebuffer)，室温震摇1h。
●用1x洗液洗板4次。
●每孔滴加TMB-A液和TMB-B液各一滴(每滴约50ul)，在室温下显色10～15min。
●每孔加入50ulStopsolution终止显色反应。
●在酶标仪上读取样品的450/630nm波长处的光密度(A450/630)。
结果
●HLA-GELISA的标准曲线见图4中A。
●用该试剂检测的连续稀释的血浆样品所得到的值与标准曲线完全平行，表明从血浆检测到是与标准HLA-G蛋白同质(图5中B)。
●根据试剂盒的标准曲线，检测的敏感性为3ng/mL的可溶性HLA-G。
●回收实验证明该试剂盒的准确率为95.8％(表3)。
表3.回收实验结果
●该检测的批内和批间误差分别为3.28％and7.70％(表4)。
表4.批内稳定性实验结果
实验批数 1 2 3 4 5 6 7 8 平均
批内误差 4.81％ 4.26％ 4.16％ 1.05％ 2.31％ 1.61％ 3.03％ 5.01％ 3.28％
批间误差 8.20％ 2.50％ 4.76％ 2.01％ 10.3％ 14.5％ 7.04％ 12.3％ 7.70％
上述实验结果证明本发明的HLA-G酶联免疫试剂盒具有较高的灵敏性、特异性、可重复性和准确性。该试剂盒不同于我们以前获得专利中的HLA-G酶联免疫试剂盒(200710075443.7)。200710075443.7专利中采用的两个抗HLA-G重链区域不同抗原表位的单抗(HGY和HGY-2)。本发明采用一种抗HLA-G重链区域(α1和α2重链之间)的单抗和一种抗HLA-G轻链(β2微球蛋白1aa-50aa之间)的单抗。它们结合的HLA-G抗原表位于200710075443.7专利中的试剂盒相差较远，而且结合的抗原表位较为明确；其检测血清HLA-G蛋白的可靠性一致。
实施5.检测孕娠早期血清HLA-G含量在早期筛查先兆子痫的应用
虽然已有文献报道检测先兆子痫病人妊娠第一、二和三期血清中可溶性HLA-G浓度均较正常孕妇显著降低，但因为可溶性HLA-G浓度随孕期变化而变化；而且个体差异较大，正常妊娠和先兆子痫病人之间的数据有较大的交叉；难以找到一个明确的判断值。文献报道的研究均为回顾性实验。实验结果也不能明确得到在妊娠早期发现的血清可溶性HLA-G浓度降低是否表明该孕妇在妊娠后期可能出现先兆子痫的危险。本实施的目的是用本发明研发的HLA-G酶联免疫检测试剂盒前瞻性地，在妊娠第一周期(4-11周)按孕周测定孕妇血清可溶性HLA-G浓度；然后追踪至妊娠第三周期，验证是否妊娠早期检测可溶性HLA-G浓度可以用于先兆子痫的筛查。
1.材料和方法
从妊娠第4周开始到第11周，收集了118例孕妇血清样品。这些孕妇均未经特殊治疗；在4-11周期间超声检查和血清内分泌激素人绒毛膜激素，孕酮和雌二醇均在正常范围内(见表1)。样品收集后即送实验室进行分批检测。
*P<0.05
这些样品中可溶性HLA-G浓度均为复管测定。每次测定均含一标准曲线，3个不同剂量的质控样品。每批均包括正常标准，待测样品和质控样品在室温保温1小时，洗板4次，然后加入1：500的生物素标记的抗HLA-G单克隆抗体复合物，每孔50μl。室温保温1小时，再加入1：1000的Streptoaviding-HRP复合物，每孔50μl。以TMB为底物显色，1MHCl终止显色反应。酶标仪读450/630nm波长的光密度。最后用直线回归方法进行分析，得出标准曲线的切距，斜率和直线回归方程，血清中HLA-G浓度则从标准曲线确定。
用SSPC统计软件对测定的结果进行统计学分析。用T检验比较第一孕期正常孕妇和先兆子痫病人。用方差分析比较正常孕妇和先兆子痫HLA-G随孕周的变化。各孕周正常孕妇和先兆子痫病人差异则采用T检验。用ROC曲线分析方法确定检测血清HLA-G对妊娠筛查先兆子痫的特异性，敏感性和临界值。
2.结果：
根据AmericanCollegeofObstetriciansandGynecologists和InternationalSocietyEarlyriskassessmentforpreeclampsia的先兆子痫的诊断标准：主要是在妊娠20周后出现高血压(>140/90mmHg)and蛋白尿(>0.3gper24hours)和其他症状，118例检测的孕妇有14例发生了先兆子痫，发病率为11％。正常孕妇和先兆子痫病人的临床特征见表1。
在第一妊娠周期先兆子痫病人血清HLA-G无论实测浓度(U/ml)或是转换成对数浓度(LOGUU/ml)都显著低于正常孕妇(图5和图6；P均＝0.001)。
在正常孕妇血清HLA-G的实测浓度从妊娠第4周到第11周逐渐增高(P＝0.0001)，而先兆子痫病人则无显著变化(P＝0.992)(图7)。但是从第4周到第9周正常孕妇和先兆子痫病人差异无统计学意义。第10和11周则差异显著(P分别＝0.037和0.003)。
如将HLA-G的实测浓度转换成对数，在正常孕妇血清HLA-G浓度从妊娠第4周到第11周也显示逐渐增高(P＝0.0001)。同样，而先兆子痫病人则无显著变化(P＝0.984)(图8)。以这种表达方式正常孕妇和先兆子痫病人在第7、8、10和11周的差异显著(P分别＝0.034,0.018,0.007和0.001)。
ROC曲线分析结果表明(图9)：如采用整个第一孕期HLA-G实测浓度比较正常孕妇和先兆子痫，AUC为0.701，95％CI＝0.602-0.801，P＝0.0001。如采用第7-11周HLA-G实测浓度比较正常孕妇和先兆子痫，AUC为0.762，95％CI＝0.617-0.906，P＝0.0001。而采用第7-11周HLA-G对数浓度比较正常孕妇和先兆子痫，AUC为0.847，95％CI＝0.716-0.978，P＝0.0001。
表2总结三种方法对先兆子痫临床预测效率。
3.讨论
同以前的报道一样，在妊娠第一早期(1-3月)先兆子痫病人血清HLA-G相较正常孕妇显著降低。亦如以前的报道一样，血清HLA-G个体差异相当大(正常孕妇为72.5±30.3U/ml，mean±SD；先兆子痫为51.6±23.8U/ml，mean±SD)。从ROC曲线，如果确定特异性为80％，其敏感度仅为35.3％。如果确定敏感度为80％，特异性仅为44.1％。显然不能满足临床应用的要求。在统计学上将实测数据进行对数转换可以减少数据的变异性。本研究将HLA-G实测值转换成对数值后，正常孕妇为1.81±0.21(mean±SD)，先兆子痫为1.65±0.24(mean±SD)；大大减少数据的变异性。从ROC曲线，如果确定特异性为80％，其敏感度增加为56.7％。如果确定敏感度为80％，特异性增加为47.1％。也不能满足临床应用的要求
根据以前的报道，正常孕妇血清HLA-G浓度从妊娠第一周期到第二周期(4-6月)逐渐增加，在第三周期开始下降(Steinborneta.,Am.J.Reprod.Immunol.57:277-86,2007)。但没有第一周期每周浓度变化的报道。本研究则证明正常孕妇血清HLA-G浓度从妊娠第4周到11周逐渐增加，但先兆子痫则无明显差异。而且，在转换成对数值后，第4周到6周和第9周无明显差异。因此，在确定临床判断值时，可以从第7周开始。这样，从ROC曲线，采用实测值，如果确定特异性为80％，其敏感度增加为70.1％。如果确定敏感度为80％，特异性增加为56.2％。ROC曲线下的面积(AUC)也从0.701增加到0.762。采用对数值，如果确定特异性为80％，其敏感度增加为85.2％。如果确定敏感度为80％，特异性增加为80％。ROC曲线下的面积(AUC)也从0.762增加到0.847。完全能够满足临床应用的要求。
对于采用血清HLA-G早期预测孕妇有无患先兆子痫的危险性，前瞻性研究明显优于回顾性，因为可以更准确地判断HLA-G与先兆子痫的因果关系，这是以往的报道所没有的。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (4)

1.一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，其特征在于，采用HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列的蛋白片段作为抗原制备单克隆抗体3C4，采用HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋白片段偶联KLH后作为抗原制备单克隆抗体3H1，然后将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G，所述HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，其特征在于，制备抗体3C4的方法如下：
(1)采用重组蛋白的方法获得HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列的蛋白片段；
(2)将步骤(1)获得的蛋白片段作为抗原免疫小鼠，然后经细胞融合、筛选杂交瘤细胞得到抗体3C4。
3.根据权利要求1所述的一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，其特征在于，制备抗体3H1的方法如下：
(1)合成HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋白片段并偶联KLH；
(2)将步骤(a)偶联KLH后的蛋白片段作为抗原免疫小鼠，然后经细胞融合、筛选杂交瘤细胞得到抗体3H1。
4.根据权利要求1所述的一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，其特征在于，将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G的方法如下：
(1)将抗体3C4包被在酶标板上，
(2)加入含有HLA-G的待测血浆或血清或细胞培养液，并设置阳性和阴性对照，振荡后洗涤，
(3)加入生物素标记的抗体3H1，振荡后洗涤，
(4)加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物，振荡后洗涤，
(5)加入显色液显色，
(6)加入终止液终止显色反应，
(7)检测光密度并与标准曲线对比。
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