JP2725041B2 - ヒトモノクローナル抗体とそれを有効成分とする感染症の予防、治療剤 - Google Patents
ヒトモノクローナル抗体とそれを有効成分とする感染症の予防、治療剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、単一なモノクロナール抗体であるにもかか
わらず複数の血清型の緑膿菌（シュードモナス・エルギ
ノーサ、Pseudomonas aeruginosa）のＯ抗原に対して親
和性を示す抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体産生細胞と
その抗体、それを有効成分とする緑膿菌感染症の予防、
治療剤およびその製剤に関するものである。 従来の技術 緑膿菌は自然界に広く存在し、下水等の他ヒト、動物
の口腔、腸内から高率にみいだされる。この菌が病原性
を発揮するのはこの菌自体の菌力による一般感染症患者
におけるよりもむしろ感染抵抗力の低下した患者、即ち
癌患者、免疫抑制療法下の患者、移植患者、熱傷患者お
よび新生児などである。 現在、緑膿菌感染症は最も治療の困難な感染症と考え
られている。すなわち、緑膿菌はこれまで常用されてき
た抗生物質のほとんどすべてに対して耐性を示すばかり
でなく、近年開発された抗生物質に対しても容易に耐性
が誘導される傾向が強い。そのため、抗生物質療法の限
界に立って、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした
予防、治療法の研究がなされている。その１つにワクチ
ンの開発の研究があるが、既に感染を受けた患者に対す
る速効を望むことは困難である。他方、近年、緑膿菌感
染症の治療に健常人の血清あるいは血漿から精製したヒ
ト免疫グロブリンあるいはその化学的修飾物を有効成分
とする製剤を用いることが多い。しかし、これらの製剤
に含まれる抗体のうち緑膿菌に対し親和性を有し、か
つ、治療に有効な抗体の量は一定せず、また、その量が
少ないため、これらの製剤の予防、治療効果を疑問視す
る向きも多い。そのため、低用量で有効なヒトモノクロ
ーナル抗体の開発が急がれている。 一方、緑膿菌の表面抗原としては、外膜由来の蛋白抗
原（outer membrane protein,OMP）、ベン毛あるいはス
ライム由来の多糖体抗原、およびリポ多糖体（lipopoly
saccharide、以下LPSと略す）抗原の存在が知られてい
る。このうちLPSは血清型特異抗原部位であるＯ−多糖
側鎖（以下「Ｏ抗原」ということがある）とグラム陰性
菌に共通の基本構造であるリピドＡおよびコア部分より
形成される。Ｏ−多糖側鎖はオリゴ糖の反復から成って
おり、このＯ−多糖側鎖部分の免疫的性質により緑膿菌
の血清型別分類がなされている。しかし、緑膿菌の血清
型別分類に関しては現在でも多くの議論があり、日本で
はＡ型からＭ型までの13種類に分類する緑膿菌研究会分
類〔Homma,Japan J.Exp.Med.,46,329-336（1976）〕が
広く用いられており、緑膿菌研究会分類と他の分類を対
比すると下記の通りである。 なお、近年、Ｏ−多糖側鎖の一次構造も順次明らかに
なりつつあり〔例えば、Kropinski他、Antibiot.Chemot
her.,36,58-73（1985）〕、将来において新しい分類が
採択される可能性もある。緑膿菌のLPSのＯ−多糖側鎖
に対する抗体、すなわち緑膿菌Ｏ抗原に対する抗体は、
補体系を介して強い溶菌作用やオプソニン作用を持つこ
とが知られている。そこで、本発明者等は緑膿菌感染症
の予防、治療に有効なヒトモノクローナル抗体の取得を
目的として鋭意研究を重ね、緑膿菌の血清型抗原に対す
るヒトモノクローナル抗体、すなわち緑膿菌に対し血清
型特異的に反応するヒトモノクローナル抗体が、同型の
血清型の緑膿菌感染に対し非常に高い防御活性を有する
事を初めて見い出し、特開昭60-248626公報記載の発明
を完成するに至った。しかし、その後の緑膿菌のLPSの
Ｏ−多糖側鎖に対するヒトモノクローナル抗体の感染防
御に関する公報〔特開昭61-152280、特開昭61-155398〕
の記述にあるように、緑膿菌に対して血清型特異的に反
応するヒトモノクローナル抗体は単一の血清型の緑膿菌
にのみ特異的に反応し、同型の血清型の緑膿菌感染に対
しては防御活性を有するが、異なる血清型の緑膿菌感染
に対する防御活性はない。 一方、緑膿菌の外膜由来の蛋白抗原に対するモノクロ
ーナル抗体〔Sawada他,J.Infect.Dis.,150,570-576（19
85）、中村善明他、日本細菌学会雑誌,39,337（198
4）〕や、緑膿菌の共通多糖体に対するヒトモノクロー
ナル抗体〔Sawada他,J.Infect.Dis.,150,1290-1299（19
85）〕は何れも、緑膿菌感染に対する防御活性が低い。 発明が解決しようとする問題点 上述の様に緑膿菌のＯ抗原に対するヒトモノクローナ
ル抗体は、感染防御抗体として他の緑膿菌の抗原に対す
るヒトモノクローナル抗体と比較し非常に高い活性を有
するが、対応する血清型の緑膿菌感染に対してのみ有効
である。緑膿菌研究会分類ではＯ抗原は13種に分類さ
れ、頻度の差は有るが臨床的に分離される緑膿菌の血清
型もこれら全ての血清型菌に及んでいる。そのため、緑
膿菌感染症の予防、治療薬としてＯ抗原に対するヒトモ
ノクローナル抗体を一般に用いるには、数種から十数種
類の抗体を組み合わせた製剤を作製する必要がある。し
かし、組み合わせるモノクローナル抗体の数が多くなれ
ばなるほど、製品の品質管理等の煩雑さが増す。この様
な煩雑さを減少させるためには、複数の異なる血清型の
緑膿菌に交差反応性を示し、かつ、複数の異なる血清型
の緑膿菌感染に対し強い感染防御能を有するＯ抗原に対
するヒトモノクローナル抗体の取得が望ましいが、未だ
成功例の報告はない。さらには、ヒトに安全な投与が可
能な上記ヒトモノクローナル抗体を大量かつ安定に産生
する細胞株の創出も重要な課題となっている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、高い感染防御活性を有し、さらに複数
の血清型の緑膿菌を共通に認識するような単一のヒトモ
ノクローナル抗体を分泌する細胞株の取得を目的として
鋭意研究を重ね、本発明を完成するに至った。 本発明は、緑膿菌の複数の異なる種類のＯ抗原に対し
て共通に反応するヒトモノクローナル抗体、すなわち、
緑膿菌のＯ抗原に対して複数に反応するヒトモノクロー
ナル抗体を持続産生する自己複製細胞株を得、この細胞
株の産生するヒトモノクローナル抗体を、単品、又はそ
れらを組合わせることにより緑膿菌感染症の予防、治療
剤に使用して、ヒトおよび動物における緑膿菌感染症の
予防、治療を達成しようとするものである。ヒトの抗体
産生細胞（Ｂ細胞）にエプスタイン・バー・ウイルス
（Epstein-Barr virus、以下EBウイルスと略す）を感染
させ形質転換（以下EBウイルス形質転換と略す）を行う
か、あるいはヒトの抗体産生細胞をヒトあるいは動物由
来の無限増殖能を有する細胞、例えば腫瘍細胞と細胞融
合することにより無限増殖能を有する細胞集団を得、こ
のなかから血清型の異なる複数の緑膿菌に反応性を有す
る単一なヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を酵
素抗体法を使用したスクリーニングとクローニングによ
り選別した。次に、この細胞を培養し、培養液より血清
型の異なる緑膿菌に反応性を有する単一なヒトモノクロ
ーナル抗体を任意の一般的な方法、たとえばカラムクロ
マトグラフィー、電気泳動、沈澱および抽出等により精
製した。精製したヒトモノクローナル抗体は、単独、あ
るいは任意の添加物を加え、液状製剤あるいは凍結乾燥
製剤として緑膿菌感染症の予防、治療に供することがで
きる。 図面の簡単な説明 第１図から第７図はヒトモノクローナル抗体の緑膿菌
Ｏ抗原に対する交差反応性を、モノクローナル抗体とLP
Sの結合反応に対する各種血清型緑膿菌LPSによる阻害試
験により調べた結果を示す図で、第１図はHPs1のＤ型と
Ｉ型の各緑膿菌LPSによる結合阻害を示す図で、第２図
はHPs2のＥ型およびＦ型の各緑膿菌LPSによる結合阻害
を示す図で、第３図はHPs4のＡ型およびＬ型の各緑膿菌
LPSによる結合阻害を示す図で、第４図はHPs5のＧ型お
よびＨ型の各緑膿菌LPSによる結合阻害を示す図で、第
５図はHPs6のＥ型およびＦ型の各緑膿菌LPSの結合阻害
を示す図で、第６図はHPs7のＡ型およびＦ型の各緑膿菌
LPSによる結合阻害を示す図で、第７図はHPs8のＥ型お
よびＦ型の各緑膿菌LPSの結合阻害を示す図である。 （具体的説明） 1.使用緑膿菌 本発明では便宜上使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主
催の血清型別検討委員会の決定による血清型別分類に従
うものとし、第１表に示すＡ型からＭ型に属する菌株を
使用している。 Ａ型からＭ型に属する菌株の多くは、アメリカン・タ
イプカルチャーコレクション（ATCC）および東京大学医
科学研究所から入手できる。 2.ヒトモノクローナル抗体の製造 本発明による、緑膿菌のＯ抗原に対して複数に反応す
るヒトモノクローナル抗体、すなわち、緑膿菌のLPSの
Ｏ−多糖側鎖に対するヒトモノクローナル抗体は、EBウ
イルス形質転換法や細胞融合法等の方法により作製され
る。 EBウイルス形質転換法による本発明のヒトモノクロー
ナル抗体の作製は、ヒト抗体産生細胞（ヒトＢ細胞）
を調製し、ヒト抗体産生細胞にEBウイルスを感染させ
て形質転換を行い、血清の異なる複数の緑膿菌に反応
性を有する抗体の分泌を検出し、該形質転換細胞集団
より単一の細胞株を選別（この操作を以下クローニング
ということがある）し、該細胞株を培養後、培養物
よりヒトモノクローナル抗体を精製することにより行え
る。 次に各工程につき詳細な説明を加える。 抗体産生細胞の調製 本発明の方法に用いるヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）
は、緑膿菌に対する抗体産生がみられる健常人あるいは
緑膿菌感染症既往歴のある患者の末梢血、リンパ節、扁
桃腺、脾臓や分娩時の臍帯血などから公知の方法により
得ることが出来る。例えば、血液や上記組織などからの
ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の分離および濃縮は、フィ
コール・コンレイ液等の細胞分画液を用いた比重遠心
法、Ｅロゼット形成法、パニング法などを組み合わせて
効率的に行うことが出来る。 形質転換 EBウイルスによるヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の形質
転換法は公知の方法〔例えばNature,269,420-422（197
7）〕に準じて実施することが出来る。 B95−８細胞（感染性のEBウイルスを産生するマーモ
セット白血球由来細胞（を20％ウシ胎児血清（以下FCS
と略す）を含むRPMI 1640培地（以下培養液と略すこと
がある）で培養し、静止期に近い７日目の培養上清を遠
心分離してウイルス液を得る〔第４回日本免疫学会総会
記録、399-401（1974）〕。つぎに、の方法で得たヒ
ト抗体産生細胞（Ｂ細胞）を遠心分離し、吸引にて上清
を除去して得られるペレットにウイルス液を加えて分散
後、37℃、５％炭酸ガス存在下で１時間培養する。培養
後、遠心分離し、吸引にて上清を除去した後、ペレット
に細胞密度が１×105から５×105個/mlとなる様に培養
液を加え、細胞を分散させる。細胞分散液を24ウエル培
養プレートまたは96ウエル培養プレートの各ウエルに分
注し、37℃、５％炭酸ガス存在下で２週間から４週間培
養する。この間、３日から４日ごとに培養液の半量を新
しい培養液に交換することが望ましい。 抗体の検出 本発明の血清型の異なる複数の緑膿菌に反応性を有す
る抗体の検出は、一般のラジオイムノアッセイ法や、酵
素抗体法などの方法〔成書「単クローン抗体」p144,講
談社刊（1983）等〕により行うことが出来る。本発明で
は酵素抗体法を用いている。すなわち、あらかじめ血清
型の異なる複数の緑膿菌の0.3％ホルマリン処理菌体あ
るいはLPSを個々にメンブランフィルターに固定し、容
器中で細胞の培養上清を一定時間反応させた後、酵素標
識したウサギ抗ヒト抗体を反応させ、酵素反応による基
質の呈色割合により目的抗体の産生の有無および産生量
を測定するドット・イムノバインディングアッセイ法
〔以下DIBA法と略す、Anal.Biochem.,119,142-147（198
2）〕を簡易アッセイ法として用いている。なお必要に
より、酵素標識した抗ヒト抗体にヒト免疫グロブリンの
型に特異的な抗体を用いることにより免疫グロブリンの
型の決定が出来る。 クローニング の方法によって細胞の増殖コロニーが認められた各
ウエルの培養上清について上記酵素抗体法（以下ELISA
法と略す）などの方法により、目的抗体が存在するウエ
ルを選別した後、このウエル中の細胞を軟寒天法〔成書
「組織培養応用研究法」p289、ソフトサイエンス社刊
（1985）等〕あるいは限界希釈法〔成書「単クローン抗
体」p73、講談社刊（1983）等〕によりクローニングを
行う。さらに、クローニングにより細胞の増殖が認めら
れた後、再度上記酵素抗体法によるアッセイを行う。１
回から数回のクローニングにより、目的の抗体のみを分
泌する単一細胞株を得ることが出来る。 樹立細胞株の培養 の方法で樹立された細胞株の培養は、通常の培地を
用いて行える。例えば、前記培養液や一般の低血清ある
いは無血清培地が適宜使用出来る。 ヒトモノクローナル抗体の精製 培養液からの本発明のヒトモノクローナル抗体の精製
は、硫酸アンモニウム塩析法、ゲルろ過法、イオン交換
樹脂クロマト法などの非特異的精製法や、抗原あるいは
ヒトモノクローナル抗体に親和性を有する物質（例えば
プロテインＡや抗ヒト免疫グロブリン抗体等）を固定化
した担体を用いるアフィニティクロマト法などの公知の
方法の組み合わせにより行うことが出来る。 細胞融合法による本発明のヒトモノクローナル抗体の
作製は、公知の方法〔成書「MONOCLONAL ANTIBODIES」p
363,Plenum Press刊他〕に準じ行える。すなわち、ヒ
ト抗体産生細胞（ヒトＢ細胞等）を調製し、ヒト抗体
産生細胞と無限増殖能を有する細胞を細胞融合させ、
血清型の異なる複数の緑膿菌の反応性を有する抗体の分
泌を検出し、該ハイブリドーマ集団より単一の細胞株
を選別し、該細胞株を培養後、培養物よりヒトモノ
クローナル抗体を精製することにより行える。 抗体産生細胞の調製 細胞融合に用いる抗体産生細胞には、前記EBウイルス
形質転換法で述べたと同様な抗体産生細胞を用いること
が出来るが、さらには、前記EBウイルス形質転換法によ
り得られる、目的抗体を分泌するクローニング前のEBウ
イルス形質転換細胞集団、あるいはクローニングにより
得られる単一EBウイルス形質転換細胞株を用いることも
出来る。また、ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）をポークウ
ィードマイントージェン（PWM）を添加した培養液中で
数日間培養し、抗体産生細胞を増殖させた後に細胞融合
に供することも出来る。 細胞融合 ヒトＢ細胞ハイブリドーマの作製では、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養液
（HAT培地）、あるいはヒポキサンチンおよびアザセリ
ンを含有する培養液（HA培地）に感受性の無限増殖能を
有するヒト由来のミエローマ細胞、ミエローマ様細胞、
リンパ芽球細胞やリンパ芽球様細胞を細胞融合のパート
ナー細胞として用いるのが好適であるが、HAT培地に感
受性のマウスミエローマ細胞等をパートナー細胞として
用いることも出来る。 例えば、パートナー細胞としてマウスミエローマ細
胞、p3-NS1/1-Ag4.1（略称NS−１）と、EBウイルスによ
り形質転換後、目的抗体の産生が認められたウエルの細
胞や、末梢血等から分離される抗体産生細胞を1:1から
1:10程度の比率で混合し、さらに細胞融合用培地（50％
ポリエチレングリコールと10％ジメチルスルホキサイド
を含むRPMI 1640培地等）を加えて、公知の方法により
細胞を融合させる。つぎに、融合したハイブリドーマの
みの増殖に適したHAT−ウアバイン培養液（前記HAT培地
にさらにウアバインを含有する培養液、HAT−０培地）
に、細胞密度が１×105から５×105個/mlとなる様に細
胞を分散させる。細胞分散液を24ウエルまたは96ウエル
の培養プレートに分注し、37℃、５％炭酸ガス存在下で
約２週間から４週間培養する。この間、３日から５日ご
とにHAT−０培地の半量を新しいHAT−０培地と交換する
ことが望ましい。この際、フィーダー細胞としてマウス
の腹腔浸出細胞等に共存させるハイブリドーマの増殖を
早めることが出来る。 また、パートナー細胞としてヒトリンパ芽球様細胞、
MHP-315と、EBウイルス形質転換細胞株や、末梢血等か
ら分離される抗体産生細胞を1:1から1:10程度の比率で
混合し、前記同様に細胞融合後、HA−ウアバイン培養液
（前記HA培地にさらにウアバインを含有する培養液、HA
−０培地）に細胞を分散し、培養することによってハイ
ブリドーマを作製することが出来る。 なお、パートナー細胞として、マウス由来のX63、P3U
1、X63.653、SP2/0などを、ヒト由来のSK0-007、GM1500
などを用いることが出来る。 抗体の検出 かくしてハイブリドーマの明瞭な増殖が認められたウ
エルについて、前記EBウイルス形質転換法で述べたと同
様に酵素抗体法により異なる血清型の複数の緑膿菌に反
応性を示す抗体を検出する。 クローニング 前記EBウイルス形質転換法で述べたと同様に、クロー
ニングを繰り返し単一細胞株を得ることが出来る。 樹立株の培養 前記EBウイルス形質転換法で述べたと同様に、単一細
胞株を適当な培養液で培養することが出来る。 抗体の精製 前記EBウイルス形質転換法で述べたと同様に、培養液
より本発明のヒトモノクローナル抗体を精製することが
出来る。 3.ヒトモノクローナル抗体製剤の製造 本発明による、緑膿菌のＯ抗原に対し、複数に反応す
るヒトモノクローナル抗体は、単独、あるいは通常用い
られる添加剤、賦形剤を加えて液剤あるいは凍結乾燥製
剤として用いることが出来る。実際の緑膿菌感染症の予
防、治療にあたっては本発明のヒトモノクローナル抗体
を単独または２種以上混合するか、あるいは緑膿菌に対
する他のヒトモノクローナル抗体やヒトグロブリン製剤
と混合して用いてもよい。特に、混合製剤を製造する場
合は、本抗体を用いることにより、抗体の感染防御スペ
クトルが拡大することから、混合するヒトモノクローナ
ル抗体の種類の数を減少することが出来る。 なお、本発明のヒトモノクローナル抗体の用量、投与
経路は適宜選択されるが、用量は体重kgあたり0.01ない
し10mgが好ましく、投与経路は皮内、皮下、筋肉内、静
脈内投与等が可能である。 5.実施例 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 実施例1.EBウイルス形質転換法によるヒトモノクローナ
ル抗体の作製１ 抗体の作製１ （１） 抗原の調製 緑膿菌研究会型別検討委員会の血清型別分類（Ａ型か
らＭ型）に従い、次の第１表に示す株菌より抗体アッセ
イに用いる菌体およびLPSを調製した。 各緑膿菌菌株を普通寒天培地（日水製薬）で、37℃、
一夜培養し、増殖したコロニーを集め、生理食塩液に懸
濁し菌液を調製した。0.5mlの菌液を、一本当たり150ml
の本間らの合成培地〔Tanamoto他,J.Biochem.,83,711-7
18（1978）〕を含む坂口フラスコに接種し、37℃で16時
間振盪培養した。培養後、最終濃度が0.3％になる様に
ホルマリンをフラスコに加え、室温に１時間放置した。
最後に、菌体を遠心分離（12,000×ｇ、30分間）により
集め、生理食塩液と蒸留水で順次洗浄した後、凍結乾燥
してホルマリン処理乾燥菌体を得た。各血清型緑膿菌LP
Sは、凍結乾燥前のホルマリン処理湿菌体20gを出発材料
として、熱フェノール抽出法〔成書「免疫実験操作
法」、p2037、免疫学会編（1978）〕に従い精製した。
各血清型緑膿菌のホルマリン処理菌体よりのLPSの収量
（乾物重量）は、25mgから75mgであった。 （２） EBウイルス液の調製 EBウイルスを産生放出しているB95−８細胞を、３×1
05個/mlの密度となるように20％FCSを含むRPMI 1640培
地（以下、培養液と称することがある）に浮遊させ、５
％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。静止期に近い
７日目の培養上清を遠心分離（800×ｇ、10分間）によ
り集め、ポアサイズ0.45ミクロンのメンブランフィルタ
ー（ミリポア社）でろ過後、形質転換実験のEBウイルス
液として用いた。 （３） ヒト抗体産生細胞（リンパ球）の調製 健常人から採血したヘパリン加末梢血50mlに等量のRP
MI1640培地を加えて２倍に希釈後、半量のフィコール・
パック（ファルマシア社）上に界面が乱れない様に重層
し、室温で遠心分離（400×ｇ、30分間）した。遠心分
離後、界面層をパスツールピペットを用いて取り出し、
等量の20％FCSを含むRPMI1640培地を加えて、室温で遠
心分離（250×ｇ、10分間）した。沈澱した細胞を、20
％FCSを含むRPMI 1640培地に懸濁し、さらに１回、遠心
分離の操作を繰り返し、ヒト抗体産生細胞（リンパ球）
のペレット（細胞数;5×107個）を得た。 （４） EBウイルスによる形質転換 ヒト抗体産生細胞５×107個に対して（２）で調製し
たウイルス液50mlを加えて、37℃で１時間インキュベー
ションした。インキュベーション後、遠心分離（250×
ｇ、10分間）により細胞を集めた。細胞を20％FCSを含
むRPMI 1640培地に分散し、５×105個/mlの密度に調整
後、0.1mlずつ、96ウエル平底培養プレートに加え、５
％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。４日後に0.1m
lの20％FCSを含むRPMI 1640培地を加え、その後、４日
から５日ごとに半量の培養液を新しい培養液で交換し
た。（５）に示す抗体検出法により緑膿菌菌体との反応
が認められたウエルの細胞を、24ウエル培養プレートへ
拡大培養した。 （５） 抗体の検出 細胞増殖の認められたウエルについて、培養上清中の
抗緑膿菌ヒト抗体の有無を酵素免疫測定法であるDIBA法
で測定した。96ウエル平底培養プレートの培養上清の場
合は、各ウエルの培養上清0.1mlを、１ドット当たり0.4
μｇの13種の血清型の緑膿菌のホルマリン処理乾燥菌体
の混合物を固定したグリッド入りニトロセルロース・メ
ンブレンフィルター（3.1mm角）と、96ウエルＵ型マル
チプレート中で反応させた。24ウエル培養プレートの培
養上清の場合は、各ウエルの培養上清0.2mlを、Ａ型か
らＦ型までの６種とＧ型からＭ型までの７種の緑膿菌の
ホルマリン処理乾燥菌体を別々の場所に固定したグリッ
ド入りニトロセルロース・メンブレンフィルター（6.2m
m×9.3mm角）と、48ウエル培養プレート中で反応させ
た。室温で２時間反応させ、ついでパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・イムノグロブリン抗体（ダコ社）と２
時間反応後、４−クロロ−１−ナフトールを基質として
発色させ、抗原を固定したニトロセルロース・メンブレ
ンフィルター上に肉眼観察で発色が認められたものを抗
体産生が陽性と判定した。 （６） クローニング 抗体検出法により複数の血清型の緑膿菌との反応性が
認められたウエルの細胞を、6cmシャーレに移した。6cm
シャーレ中で増殖した細胞は軟寒天法によりクローニン
グをおこなった。先ず、血球計算盤を用いて正確に細胞
数を測定した後、１×105個/mlの密度の細胞浮遊液と
し、この細胞浮遊液0.1mlを0.3％アガロース（シープラ
ークアガロース、エフ・エム・シー社）を含む培養液30
mlに加え混合した。つぎに、あらかじめ0.5％アガロー
スを含む培養液4mlを分注して固めた6cmシャーレに、細
胞および0.3％アガロースを含む培養液3mlを分注して固
めた（各細胞あたり10枚）。細胞を分注した6cmシャー
レは５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。３週間
から５週間後、軟寒天中に細胞が増殖しコロニーが肉眼
的に認められるようになったら、各コロニーをパスツー
ルピペットを用いて、あらかじめウエル当たり0.1mlの
培養液を分注した96ウエル平底培養プレートの各ウエル
に移し培養した。２日後に培養液0.1mlを加え、さらに
２日後、細胞増殖の認められたウエルについて培養上清
中の抗緑膿菌モノクローナル抗体の有無をDIBA法で測定
した。抗体産生が陽性と判断されたウエルの細胞を24ウ
エル培養プレートへ拡大培養した。３日後、24ウエル培
養プレートのウエルについて、培養上清中の抗緑膿菌抗
体の有無をDIBA法で測定した。複数の血清型緑膿菌と反
応する抗体を産生していると判断されたウエルの細胞を
上記のごとく再度同様な操作を繰り返しクローニングを
行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＩ型とＤ型に交差反
応性を有するヒトモノクローナル抗体、HPs1（IgM）を
産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5035、およびＥ
型とＦ型に交差反応性を有するヒトモノクローナル抗
体、HPs2（IgM）を産生するEBウイルス形質転換細胞
株、MP5038を得た。MP5035と5038は、微工研に微工研条
寄第1598号、微工研条寄第1596号として寄託されてい
る。 （７） 細胞株の培養と抗体の精製 ヒトモノクローナル抗体、HPs1及びHPs2を産生する２
株のEBウイルス形質転換細胞を、フラスコ（底面積175c
m2）を用いて0.5％ウシ血清アルブミン（以下BSAと略
す）を含むRITC55−９培地〔Exp.Cell Res.,138,127-13
4（1982）〕でそれぞれ培養し、培養物より遠心分離（4
00×ｇ、30分間）により上清を得、50％硫酸アンモニウ
ム塩析法とセファクリル（Sephacryl）S-300（ファルマ
シア社）カラムを用いた分画法により抗体を精製した。
HPs1を産生するEBウイルス形質転換細胞株を培養した25
0mlの培養液からは、IgM画分を2.5mg、またHPs2を産生
するEBウイルス形質転換細胞株を培養した2Lの培養液か
らは、IgM画分を76mg得た。 実施例2.EBウイルス形質転換法によるヒトモノクローナ
ル抗体の作製２ 緑膿菌感染症患者の末梢血を用いる以外は、実施例１
と同様にしてEBウイルスによる形質転換を行った。ヘパ
リン加末梢血25mlからヒト抗体産生細胞のペレット（細
胞数;1.4×107個）を得た。２回の軟寒天クローニング
を行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＡ型とＬ型に交差
反応するヒトモノクローナル抗体、HPs4（IgM）を産生
するEBウイルス形質転換細胞株、MP4091およびＧ型とＨ
型に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HPs5（Ig
M）を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5050を得
た。MP5050は、微工研に微工研条寄第1600号として寄託
されている。実施例１の（７）と同様に細胞を培養し、
HPs4を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP4091を培
養した250mlの培養液からは、IgM画分を2.5mg、またHPs
5を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5050を培養
した450mlの培養液からは、IgM画分を8.6mg得た。 実施例3.EBウイルス形質転換法によるヒトモノクローナ
ル抗体の作製３ 実施例１と異なる健常人の末梢血を用いる以外は、実
施例１と同様にしてEBウイルスによる形質転換を行っ
た。ヘパリン加末梢血25mlからヒト抗体産生細胞のペレ
ット（細胞数;2.8×107個）を得た。２回の軟寒天クロ
ーニングを行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＡ型とＦ
型に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HPs7（Ig
M）を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5046を得
た。MP5046は、微工研に微工研条寄第1599号として寄託
されている。実施例１の（７）と同様に細胞を培養し、
HPs7と産生するEBウイルス形質転換細胞株、HP5046を培
養した300mlの培養液からは、IgM画分を4.1mg得た。 実施例4.ハイブリドマー法によるヒトモノクローナル抗
体の作製１ （１） ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の調製 健常人から採血したヘパリン加末梢血50mlから実施例
１の（３）と同様にしてヒト抗体産生細胞のペレット
（細胞数;4.6×107個）を得た。これに実施例１の
（２）で調製したウイルス液46mlを加えて、37℃で１時
間インキュベーションした。インキュベーション後、遠
心分離（250×ｇ、10分間）により集めた細胞に培養液
を加え、１×105個/mlの密度となるように浮遊させ、フ
ラスコ（底面積175cm2）２本に分注し、５％炭酸ガス存
在下、37℃で静置培養した。５日後に各々50mlの培養液
を加え、さらに５日後に遠心により細胞を集めた。 （２） 細胞融合 EBウイルス形質転換細胞のマウスミエローマ細胞株、
NS−１を各々RPMI1640培地で洗浄した。EBウイルス形質
転換細胞1.3×108個とマウスミエローマ細胞1.3×109個
を50ml容量のプラスチック製遠心管中で混合する。混合
した細胞を遠心分離（175×ｇ、10分間）し、上清を捨
て、細胞を充分にほぐす。この細胞を含む遠心管に、50
％ポリエチレングリコール（M.W.1500、和光純薬）、10
％ジメチルスルホキサイドを含むRPMI1640培地0.5mlを
静かに加え遠心管をゆっくり回転させて、細胞融合させ
る。２分後、RPMI1640培地10mlを加え静かに攪拌後、遠
心分離（175×ｇ、10分間）する。遠心後、上清を捨
て、２×10-4Ｍヒポキサンチン、0.176μg/mlアミノプ
テリン、13μg/mlチミジン、５μＭウアバインおよび20
％FCSを含むRPMI1640培地（以下HAT−０培養液と略す）
を加えて１×106個/mlの密度の細胞浮遊液とし、ウエル
当たり0.1mlずつ、96ウエル平底培養プレートに加え、
５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。４日後に0.
1mlのHAT−０培養液を加え、その後、４日から５日毎に
半量の培養液を新しいHAT−０培養液で交換した。 （３） 抗体の検出 細胞増殖の認められたウエルについて、培養上清中の
抗緑膿菌モノクローナル抗体の有無を実施例１の（５）
と同様にしてDIBA法で測定した。96ウエル平底培養プレ
ートの培養上清0.1mlを、RPMI1640培地で２倍に希釈
し、Ａ型からＦ型までの６種とＧ型からＭ型までの７種
の緑膿菌のホルマリン処理乾燥菌体を別々の場所に固定
した２枚のグリッド入りニトロセルロース・メンブレン
フィルター（6.2mm×9.3mm角）と、48ウエル培養プレー
ト中で反応させた。 （４） クローニング あらかじめ、３％グリコーゲン（東京化成工業）を含
むリン酸緩衝液（以下、PBSと略す）をマウス（Balb/
c）腹腔に投与して４日後に腹腔内浸出細胞を集め、１
×105個/mlの密度の細胞浮遊液とし、ウエル当たり0.1m
lずつ分注した96ウエル平底培養プレートを準備する。
つぎに、抗体検出法により複数の血清型緑膿菌との反応
が認められたウエルの細胞をそれぞれ集め、血球計算盤
を用いて正確に細胞数を調べ、HAT−０培養液に分散
し、20個/mlと200個/mlの細胞浮遊液とし、上記マウス
腹腔内浸出細胞を分注した96ウエル平底培養プレートの
各ウエルの上清を除去した後に、各0.1mlずつ加え、５
％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。４日後に0.1m
lのHAT−０培養液を加え、３日から４日ごとに半量の培
養液を新しいHAT−０培養液で交換をして、７日から14
日後に細胞増殖の認められたウエルについて培養上清の
抗緑膿菌ヒト抗体の有無をDIBA法で測定した。複数の血
清型の緑膿菌と反応する抗体を産生していると判断され
たウエルの細胞を上記のごとく再度同様な操作を繰り返
しクローニングを行い、緑膿菌研究会分類の血清型のそ
れぞれＥ型とＦ型に交差反応するヒトモノクローナル抗
体、HPs6（IgG）を産生するハイブリドーマ細胞株、MP4
092を得た。 （５） 細胞の培養および抗体の精製 96ウエル平底培養プレートで十分増殖させたハイブリ
ドーマ細胞は、徐々に拡大培養し、1Lのスターリングシ
ステムで500mlの20％FCSを含むRPMI1640培養液を用いて
培養した。培養物より遠心分離（400×ｇ、30分間）に
より上清を得、50％硫酸アンモニウム塩析法とプロテイ
ン（Protein）Ａ−セファロース（Sepharose）4B（ファ
ルマシア社）カラムを用いた分画法により精製して、Ig
Gを5mg得た。 実施例5.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
２ （１） ２−アミノエチルイソチオウロニウム・ヒドロ
ブロマイド（以下、AETと略す）処理ヒツジ赤血球の調
製 5mlのヒツジ赤血球（以下SRBCと略す）浮遊液（日本
バイオテスト研究所）を50ml容量のプラスチック製遠心
管に取り、20mlのゼラチン・ベロナール・バッファ（以
下、GVBと略す）を加え、よく攪拌した後、遠心分離
（1,600×ｇ、10分間）した。上清を吸引除去し、沈澱
したSRBCを20mlのGVDに懸濁し、さらに３回遠心分離の
操作を繰り返した。得られた約1mlのSRBCのペレットに4
mlの0.143M AET水溶液を加えて懸濁し、時々攪拌しなが
ら、37℃で15分間反応させた。反応終了後、直ちに20ml
の氷冷したGVBを加え、よく攪拌した後に遠心分離（1,6
00×ｇ、10分間）した。上清を吸引除去し、沈澱を20ml
のGVBに懸濁し、さらに２回、遠心分離の操作を繰り返
した。AET処理SRBCは、２×108個/mlの密度になるよう
にGVBに分散し、使用まで、氷冷下に保存した。 （２） ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の調製 交通事故により入院し、外傷治癒後約３ケ月を経過し
た。緑膿菌に対する抗体価の高い健常人から採血したヘ
パリン加末梢血25mlを、等量のモノポリ・リゾルビング
・メディウム（フロウ社）上に界面が乱れないように重
層し、室温で遠心分離（350×ｇ、30分間）した。遠心
分離後、界面層部分の細胞を含む液をパスツールピペッ
トを用いて取り出し、等量の20％FCSを含むRPMI1640培
地を加え、室温で遠心分離（350×ｇ、10分間）沈澱し
た細胞を、20％FCSを含むRPMI1640培地に再懸濁し、さ
らに１回、遠心分離の操作を繰り返して、ヒトリンパ球
画分のペレット（細胞数;5×107個）を得た。 次に得られたヒトリンパ球画分を、4mlの20％FCSを含
むRPMI1640培地に懸濁し、５×106個/mlの密度となるよ
うに調製した。各0.5mlの懸濁液を８本の50ml容量のプ
ラスチック製遠心管に分注し、各遠心管に（１）で調製
したAET処理SRBC分散液、1mlを加えた。よく混和した
後、遠心分離（20×ｇ、２分間）した。遠心分離後、４
℃に、２時間静置してロゼット形成反応を行った。反応
終了後、1.5mlの20％FCSを含むRPMI1640培地を加え、パ
スツールピペットを用いて静かにペレットを破壊した。
ロゼット形成細胞浮遊液を集め、50mlのプラスチック製
遠心管に入れた20mlのモノポリ・リゾルビング・メディ
ウム上に界面が乱れないように重層し、遠心分離（350
×ｇ、30分間）した。遠心分離後、界面層をパスツール
ピペットを用いて集め、界面層部分の細胞を含む液をパ
スツールピペットを用いて取り出し、等量の20％FCSを
含むRPMI1640培地を加え、室温で遠心分離（250×ｇ、1
0分間）した。沈澱した細胞を、20％FCSを含むRPMI1640
培地に再懸濁し、さらに２回、遠心分離の操作を繰り返
して、ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）のペレット（細胞
数;1.0×107個）を得た。 ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）のペレットを20mlの20％
FCSを含むRPMI1640培地に懸濁し、５×105個/mlの密度
に調整し、1/200容量のポークウイードマイトジェン（P
WM）（ギブコ社）を加え、フラスコ（底面積75cm2）に
入れ、５％炭酸ガス存在下、37℃で６日間静置培養し
た。 （３） 細胞融合 あらかじめ、マウス（Balb/c）一匹当たり0.5mlの2.5
％グリコーゲンを含むPBSを腹腔内に注入し、４日後に
腹腔内に浸出した細胞を集め、別に調製したマウス脾臓
細胞と共に20％FCSを含むRPMI1640培地に分散し、それ
ぞれ５×105個/ml、１×106個/mlの密度の細胞浮遊液と
し、ウエル当たり0.1mlづつ分注した96ウエル平底プレ
ート（以下、フィーダープレートと称する）を準備し
た。 PWMで処理したヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）とヒト由
来リンパ芽球様細胞、MHP-315を各々RPMI1640培地で洗
浄した。５×107個のヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）と同
細胞数のリンパ芽球様細胞を、50ml容量のプラスチック
製遠心管中で混合した。混合した細胞を遠心分離（175
×ｇ、10分間）した。上清を捨て、沈澱した細胞はFCS
を含まないRPMI1640培地に懸濁し、さらに２回、遠心分
離の操作を繰り返した。遠心分離後、パスツールピペッ
トを用いて上清を出来る限り取り除き、細胞ペレットと
した。このペレットに緩やかな振動を与え、少し細胞を
ほぐした後、0.3mlの融合試薬（50％ポリエチレングリ
コール4,000、10％ジメチルスルホキサイドを含むPBS溶
液）を加え、室温で、90秒間緩やかに遠心管を回転させ
た。90秒後、20mlの20％FCSを含むRPMI1640培地をゆっ
くり加え、さらに２分後に、20mlの同培地を加えて静か
に細胞を分散させた。細胞融合後の細胞を遠心分離（17
5×ｇ、10分間）によりペレットとし、このペレットを2
0％FCSを含むRPMI1640培地に分散し、１×106個/mlの密
度に調製した。細胞分散液を、フィーダープレートの各
ウエルの上清を除去した後に、各ウエル当たり0.1mlず
つ加え、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。 24時間後に、４×10-4Ｍヒポキサンチン、２μg/mlア
ザセリン、10μＭウアバイン、および20％FCSを含むRPM
I1640培地を、ウエルあたり0.1mlずつ加えた。その後
は、３日から４日ごとに、半量の培養液を２×10-4Ｍヒ
ポキサンチン、１μg/mlアザセリン、５μＭウアバイ
ン、および20％FCSを含むRPMI1640培地（以下HA−０培
養液と略す）で交換した。 （４） 抗体の検出 約４週間から５週間後、細胞増殖の認められたウエル
について、培養上清中の抗緑膿菌ヒト抗体の有無を、実
施例１の（５）と同様にしてDIBA法で測定した。 （５） クローニング 抗体検出法により複数の血清型緑膿菌との反応が認め
られたウエルの細胞をそれぞれ集め、血球計算盤を用い
て正確に細胞数を調べ、HA−０倍養液に分散し、20個/m
lと200個/mlの細胞浮遊液とし、上記フィーダープレー
トの各ウエルの上清を除去した後に、各ウエル当たり0.
1mlずつ加え、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養し
た。４日後に0.1mlのHA−０倍養液を加え、その後は３
日から４日ごとに半量の培養液を交換した。２週間から
４週間後、増殖の認められたウエルについて培養上清の
抗緑膿菌ヒト抗体の有無をDIBA法で測定した。複数の血
清型の緑膿菌と反応する抗体を産生していると判断され
た細胞を上記のごとく再度同様な操作を繰り返しクロー
ニングを行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＥ型とＦ型
に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HPs8（IgM）
を産生するハイブリドーマ細胞株、MP4095を得た。MP40
95は微工研に微工研菌寄第9750号として寄託されてい
る。 （６） 細胞の培養および抗体の精製 96ウエル平底培養プレートで十分に増殖させたハイブ
リドーマ細胞株MP4095は徐々に拡大培養し、４枚のフラ
スコ（底面積175cm2）で200mlのNYSF404無血清培地〔矢
部、組織培養、11、458（1985）〕を用いて培養した。
培養物より遠心分離（400×ｇ、20分間）により190mlの
上清を得、ポアサイズ0.22ミクロンのメンブランフィル
ターで濾過した。濾液は、あらかじめ0.025Mリン酸緩衝
液（pH6.8）で緩衝化したモノＱカラム（ファルマシア
社）に2ml/分の流速で吸着させた。吸着後、同緩衝液と
等量の0.3Mリン酸緩衝液（pH6.5）の混合液でカラムを
洗浄した。洗浄後、0.3Mリン酸緩衝液（pH6.5）でIgM画
分を溶出した。190mlの培養上清より1mgのIgM抗体が得
られた。 実施例6.ハイブリドーマ法によるヒトモノクローナル抗
体の作製３ （１） ヒト抗体産生細胞の調製 ヒト抗体産生細胞には、実施例１で得た、緑膿菌研究
会分類のＩ型とＤ型に交差反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体、HPs1（IgM）を産生するEBウイルス形質転
換細胞株、MP5035を用いた。MP5035は、20％FCSを含むR
PMI1640培地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培
養し、対数増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリ
ドーマの作製に用いた。 （２） 細胞融合 形質転換細胞、MP5035とヒト由来リンパ芽球様細胞、
MHP-315を、各々FCSを含まないRPMI1640培地で洗浄し
た。1.3×108個の形質転換細胞と同細胞数のヒトリンパ
芽球様細胞を、50ml容量のプラスチック製遠心管中で混
合した。混合した細胞を遠心分離（175×ｇ、10分間）
した。上清を捨て、沈澱した細胞はFCSを含まないRPMI1
640培地に懸濁し、さらに２回、遠心分離の操作を繰り
返した。遠心分離後、パスツールピペットを用いて上清
を出来る限り取り除き、細胞ペレットとした。このペレ
ットに緩やかな振動を与え、少し細胞をほぐした後、0.
3mlの融合試薬（50％ポリエチレングリコール4,000、10
％ジメチルスルホキサイドを含むPBS溶液）を加え、室
温で、90秒間緩やかに遠心管を回転させた。90秒後、20
mlの20％FCSを含むRPMI1640培地をゆっくり加え、さら
に２分後に、20mlの同培地を加えて静かに細胞を分散さ
せた。細胞融合後の細胞を遠心分離（175×ｇ、10分
間）によりペレットとし、このペレットを20％FCSを含
むRPMI1640培地に分散し、１×106個/mlの密度に調製し
た。細胞分散液を、フィーダープレートの各ウエルの上
清を除去した後、各ウエル当たり0.1mlずつ加え、５％
炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。 24時間後に、４×10-4Ｍヒポキサンチン、２μg/mlア
ザセリン、10μＭウアバイン、および20％FCSを含むRPM
I1640培地を、ウエルあたり0.1mlずつ加えた。その後
は、３日から４日ごとに、半量の培養液を２×10-4Ｍヒ
ポキサンチン、１μg/mlアザセリン、５μＭウアバイ
ン、および20％FCSを含むRPMI1640培地（HA−０培養
液）で交換した。 （３） 抗体の検出 約４週間から５週間後、細胞増殖の認められたウエル
について、培養上清中の抗緑膿菌ヒト抗体の有無を、実
施例１の（５）と同様にしてDIBA法で測定した。 （４） クローニング 抗体検出法により、Ｄ型とＩ型の血清型緑膿菌と反応
する抗体の存在が認められたウエルの細胞をそれぞれ集
め、血球計算盤を用いて正確に細胞数を計測した。細胞
をHA−０培養液に分散し、20個/mlと200個/mlの細胞密
度の細胞浮遊液とした。フィーダープレート（各１枚）
の各ウエルの上清を除去した後に、各ウエル当たり0.1m
lずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養し
た。４日後に0.1mlのHA−０倍溶液を加え、その後は３
日から４日ごとに半量の培養液を新しいHA−０培養液と
交換した。２週間から４週間後、増殖の認められたウエ
ルについて培養上清中の抗緑膿菌ヒト抗体の有無をDIBA
法で測定した。Ｄ型とＩ型の血清型緑膿菌と反応する抗
体を産生していると判断された細胞を上記のごとく再度
同様な操作を繰り返しクローニングを行った。２回のク
ローニングにより緑膿菌研究会分類の血清型のそれぞれ
Ｅ型とＦ型に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HP
s9（IgM）を産生するハイブリドーマ細胞株、MP5082を
得た。96ウエル平底培養プレートで十分に増殖させた細
胞を徐々に拡大培養した。MP5082は、微工研に微工研菌
寄第9745号として寄託されている。 （５） 細胞の培養および抗体の精製 ハイブリドーマ細胞株、MP5082を、３×105個/mlとな
るように200mlのNYSF404無血清培地に分散し、４枚のフ
ラスコ（底面積175cm2）にて分注して、５％炭酸ガス存
在下、37℃で静置培養した。培養開始４日後に、培養液
より遠心分離（400×ｇ、20分間）により190mlの上清を
得、培養上清より実施例５の（６）と同様にしてモノＱ
カラムで抗体を精製した。190mlの培養上清より1.7mgの
IgM抗体が得られた。 実施例7.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
４ ヒト抗体産生細胞には、実施例１で樹立した、緑膿菌
研究会分類のＥ型とＦ型に交差反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体、HPs2（IgM）を産生するEBウイルス形
質転換細胞株、MP5038を用いる以外は、実施例６と同様
にしてヒト由来リンパ芽球様細胞株、MHP-315と細胞融
合を行った。まず、MP5038を20％FCSを含むRPMI1640培
地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培養し、対数
増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリドーマの作
製に用いた。1.0×108個のEBウイルス形質転換細胞と同
細胞数のヒトリンパ芽球様細胞を細胞融合し、実施例６
と同様にしてクローニングを行い、緑膿菌研究会分類の
血清型のＥ型とＦ型に交差反応性を示すヒトモノクロー
ナル抗体、HPs10（IgM）を産生するハイブリドーマ細胞
株、MP5064を得た。MP5064は、微工研に微工研菌寄第97
51号として寄託されている。ハイブリドーマ細胞株、MP
5064を、３×105/mlとなるように350mlのNYSF404無血清
培地に分散し、７枚のフラスコ（底面積175cm2）に分注
して、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。培養
開始４日後に、培養液より遠心分離（400×ｇ、20分
間）により330mlの上清を得、培養上清より実施例５の
（６）と同様にしてモノＱカラムで抗体を精製した。30
0mlの培養上清より7.7mgのIgM抗体が得られた。 実施例8.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
５ ヒト抗体産生細胞には、実施例２で樹立した、緑膿菌
研究会分類のＧ型とＨ型に交差反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体、HPs5（IgM）を産生するEBウイルス形
質転換細胞株、MP5050を用いる以外は、実施例６と同様
にしてヒト由来リンパ芽球様細胞株、MHP-315と細胞融
合を行った。まず、MP5050を20％FCSを含むRPMI1640培
地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培養し、対数
増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリドーマの作
製に用いた。1.3×108個のEBウイルス形質転換細胞と同
細胞数のヒトリンパ芽球様細胞を細胞融合し、実施例６
と同様にして緑膿菌研究会分類の血清型のＧ型とＨ型に
交差反応性を示すヒトモノクローナル抗体、HPs11（Ig
M）を産生するハイブリドーマ細胞株、MP5104を得た。M
P5104は微工研に微工研菌寄第9753号として寄託されて
いる。ハイブリドーマ細胞株、MP5104を、３×105個/ml
となるように500mlのNYSF404無血清培地に分散し、10枚
のフラスコ（底面積175cm2）に分注して、５％炭酸ガス
存在下、37℃で静置培養した。培養開始４日後に、培養
液より遠心分離（400×ｇ、20分間）により470mlの上清
を得、培養上清より実施例５の（６）と同様にしてモノ
Ｑカラムで抗体を精製した。450mlの培養上清より9.8mg
のIgM抗体が得られた。 実施例9.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
６ ヒト抗体産生細胞には、実施例３で樹立した、緑膿菌
研究会分類のＡ型とＦ型に交差反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体、HPs7（IgM）を産生するEBウイルス形
質転換細胞株、MP5046を用いる以外は、実施例６と同様
にしてヒト由来リンパ芽球様細胞株、MHP-315と細胞融
合を行った。まず、MP5046を20％FCSを含むRPMI1640培
地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培養し、対数
増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリドーマの作
製に用いた。1.3×108個の形質転換細胞と同細胞数のヒ
トリンパ芽球様細胞を細胞融合して実施例６と同様にし
て緑膿菌研究会分類の血清型のＡ型とＦ型に交差反応性
を示すヒトモノクローナル抗体、HPs12（IgM）を産生す
るハイブリドーマ細胞株、MP5075を得た。MP5075は、微
工研に微工研菌寄第9752号として寄託されている。ハイ
ブリドーマ細胞株、MP5075を、３×105個/mlとなるよう
に550mlのNYSF404無血清培地に分散し、11枚のフラスコ
（底面積175cm2）に分注して、５％炭酸ガス存在下、37
℃で静置培養した。培養開始４日後に、培養より遠心分
離（400×ｇ、20分間）により530mlの上清を得、培養上
清より実施例５の（６）と同様にしてモノＱカラムで抗
体を精製した。530mlの培養上清より13.4mgのIgM抗体が
得られた。 実施例10.ヒトモノクローナル抗体のLPSおよびRa、リピ
ドＡとの反応性 実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例
５、実施例６、実施例７、実施例８および実施例９で得
られたヒトモノクローナル抗体と各血清型緑膿菌のLPS
およびLPSの共通構造部分のみを有するRa株由来のLPSお
よびリピドＡとの反応性を実施例１で述べたDIBA法で検
討した。各血清型緑膿菌LPSは、実施例１で調製したも
のを用いた。Ra（サルモネラ・ミネソタ、Salmonella m
innesota R60）株由来のLPSおよびリピドＡは市販品
（リスト・バイオロジカル・ラボラトリー社）を用い
た。結果を第２表に示した。各ヒトモノクローナル抗体
はLPSの共通構造部分であるRaあるいはリピドＡとは反
応せず、各血清型緑膿菌LPSと特異的に反応することか
ら、LPSのＯ−多糖側鎖部分を認識するヒトモノクロー
ナル抗体であることが明らかとなった。 実施例11.LPSに対するヒトモノクローナル抗体の交差反
応性１ 実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs1、
HPs2の緑膿菌のＯ−多糖側鎖、すなわちＯ抗原に対する
交差反応性を、LPSをコートしたプレートを用いた酵素
免疫測定法（ELISA法）で検討した。実施例１で調製し
た緑膿菌LPSを炭酸緩衝液（pH9.6）に溶解し、２μg/ml
の濃度とした。50μｌのLPS溶液をELISA用96ウエルプレ
ート（グライナー社）の各ウエルに分注し、37℃に２時
間放置して固定後、溶液を捨て、２％BSAを含む炭酸緩
衝液でブロックした。0.05％ツイーン（Tween）20を含
むPBSに溶解した各抗体液（25ng/ml）と、等量の各緑膿
菌LPS溶液（50μg/ml）の２倍希釈系列希釈液を混合
し、室温で１時間反応させた。50μｌの反応液を前記LP
Sを固定したELISA用96ウエルプレートの各ウエルに分注
し、室温で1.5時間反応させた。ウエルを0.05％ツイー
ン20を含むPBSで洗浄後、50μｌのパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・免疫グロブリン（500倍希釈）と室温
で、1.5時間反応させた。0.05％ツイーン20を含むPBSで
洗浄後、50μｌの10mg/ml2,2′−アジノビス（３−エチ
ルベンズチアゾリンスルホン酸）（ABTS）、0.003％過
酸化水素水を含むクエン酸緩衝液と室温で、30分間反応
させた。波長414nmの吸光度を測定し、吸光度より各緑
膿菌LPSにより各抗体とプレートに固定したLPSとの結合
に対する阻害率を求めた。 第１図に示すように、Ｉ型緑膿菌LPSをコートプレー
トへのHPs1の結合は、Ｉ型およびＤ型の各緑膿菌LPSに
より阻害されたが、Ａ型緑膿菌LPSにより阻害されない
ことから、HPs1はＩ型とＤ型の２種のＯ抗原を共通に認
識するモノクローナル抗体であることが確認された。第
２図に示す様に、Ｆ型緑膿菌LPSをコートプレートへのH
Ps2の結合は、Ｅ型およびＦ型の各緑膿菌LPSにより阻害
されたが、Ｄ型緑膿菌LPSにより阻害されないことか
ら、HPs2はＥ型とＦ型の２種のＯ抗原を共通に認識する
モノクローナル抗体であることが確認された。 実施例12.LPSに対するヒトモノクローナル抗体の交差反
応性２ 実施例２、実施例３、実施例４および実施例５で得ら
れたヒトモノクローナル抗体、HPs4、HPs5、HPs6、HPs
7、HPs8の緑膿菌Ｏ抗原に対する交差反応性を、実施例1
1と同様にLPSをコートしたプレートを用いたELISA法で
検討した。第３図に示す様に、Ａ型緑膿菌LPSをコート
したプレートへのHPs4の結合は、Ａ型およびＬ型の各緑
膿菌LPSにより阻害され、第４図に示すように、Ｈ型緑
膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs5の結合は、Ｇ型
およびＨ型の各緑膿菌LPSにより阻害され、第５図に示
す様に、Ｅ型緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs6
の結合は、Ｅ型およびＦ型の各緑膿菌LPSにより阻害さ
れ、第６図に示す様に、Ａ型緑膿菌LPSをコートプレー
トへのHPs7の結合は、Ａ型およびＦ型の各緑膿菌LPSに
より阻害を受け、第７図に示す様に、Ｅ型緑膿菌LPSを
コートしたプレートへのHPs8の結合は、Ｅ型およびＦ型
の各緑膿菌LPSにより阻害を受けた。これらの結果か
ら、ヒトモノクローナル抗体、HPs4、HPs5、HPs6、HPs
7、HPs8はそれぞれＡ型とＬ型、Ｇ型とＨ型、Ｅ型およ
びＦ型、Ａ型およびＦ型、Ｅ型およびＦ型の各２種のＯ
抗原を共通に認識するモノクローナル抗体であることが
確認された。 実施例13.LPSに対するヒトモノクローナル抗体の交差反
応性３ 実施例６、実施例７、実施例８および実施例９で得ら
れたヒトモノクローナル抗体、HPs9、HPs10、HPs11、HP
s12の緑膿菌Ｏ抗原に対する交差反応性を、実施例11と
同様にLPSをコートしたプレートを用いたELISA法で検討
した。Ｉ型緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs9の
結合は、ＤおよびＩ型の各緑膿菌LPSにより阻害され
た。Ｅ型緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs10の結
合は、Ｅ型およびＦ型の各緑膿菌LPSに阻害され、Ｈ型
緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs11の結合は、Ｇ
型およびＨ型の各緑膿菌LPSにより阻害され、Ａ型緑膿
菌LPSをコートしたプレートへのHPs12の結合は、Ａ型お
よびＦ型の各緑膿菌LPSにより阻害を受けた。これらの
結果から、ヒトモノクローナル抗体、HPs9、HPs10、HPs
11、HPs12はそれぞれＤ型とＩ型、Ｅ型およびＦ型、Ｇ
型およびＨ型、Ｅ型およびＦ型の各２種のＯ抗原を共通
に認識するモノクローナル抗体であることが確認され
た。 実施例14.ヒトモノクローナル抗体の好中球による緑膿
菌殺菌に対する促進活性試験 実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs2の
マウス好中球による緑膿菌殺菌促進活性について検討し
た。生後８周から12週のマウス（Balb/c、雌）に、１匹
当たり2mlの2.5％（w/v）グリコーゲンを含むPBSを腹腔
内に投与し、５時間後に、好中球を含む腹腔内浸出細胞
（14匹分）を採取した。好中球を含む腹腔内浸出細胞
は、氷冷下、ハンクス（Hanks）液にて２回洗浄し、１
×107個/mlの密度となるように10mMのヘペス（HEPES）
を含むハンクス液（以下HBSSと略す）に分散し、使用時
まで氷冷下に保存した。Ｅ型緑膿菌、PA103およびＦ型
緑膿菌、IID1006をそれぞれ普通寒天平板培地に播種
し、37℃で20時間培養した。増殖した菌体コロニーをか
きとり、生理食塩液に懸濁し、同液で２回洗浄した後、
波長540nmにおける吸光度が0.12となるようにHBSSに懸
濁した。調製した菌液は、使用時まで氷冷下に保存し
た。補体は、モルモット正常血清（乾燥補体、日本バイ
オテスト研究所）をHBSSにて５倍に希釈して用いた。 氷冷下に、プラスチック製試験管（ファルコン社）に
菌液を10μｌずつ分注し、これにあらかじめHBSSで25μ
g/ml、2.5μg/ml、0.025μg/mlの濃度に調整したHPs2の
40μｌと補体液の10μｌを加えて、よく混和した。次
に、好中球を含む腹腔内浸出細胞液40μｌを加えて、よ
く混和した後、37℃で２時間、回転振盪培養（200rpm）
した。培養終了時に各試験管に氷冷水900μｌを加え、
好中球を浸透圧破壊した。各試験管より100μｌをと
り、HBSSにて10倍、100倍、1000倍に希釈し、それぞれ
の希釈液を100μｌずつ普通寒天平板培地（３枚）に播
種し、37℃で18時間培養した。寒天平板培地上に生じた
コロニー数を計測し、残存菌数を求めた。対照群は各添
加液の代わりにHBSSを添加した。結果は第３表、第４表
に示されるように、HPs2は、補体存在下で好中球による
Ｅ型とＦ型の異なる２種の血清型の緑膿菌の殺菌を促進
した。 実施例15.ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対す
る防御活性試験１ 実施例１、実施例２、実施例３、実施例４および実施
例５で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs1、HPs2、
HPs4、HPs5、HPs6、HPs7、HPs8の緑膿菌感染に対する感
染防御活性について検討した。生後、８週から12週令の
マウス（Balb/c、雌）一群５匹から10匹に、マウス１匹
当たりヒトモノクローナル抗体を50ng、500ng、５μ
ｇ、50μｇを含む溶液0.2mlを腹腔内へ投与し、２時間
後に各菌株（IID1009（Ａ型）、IID1004（Ｄ型）、PA10
3（Ｅ型）、F7（Ｆ型）、P28（Ｇ型）、IID1009（Ｈ
型）、IID1010（Ｉ型）、IID1014（Ｌ型））の菌液を腹
腔内へチャレンジした。対照群にはヒトモノクローナル
抗体の代わりに生理食塩液のみを投与した。各血清型の
緑膿菌は、ハートインフュージョン寒天平板培地に播種
して、37℃で一夜培養した。増殖した菌体コロニーをか
きとり、生理食塩液にて希釈後、５％ムチンを加え、マ
ウス一匹当たり50％致死量（LD50値）の３倍から15倍の
チャレンジ菌量となるように調整し、菌液とした。緑膿
菌をチャレンジ後、７日目の各投与群のマウスの生存率
から50％有効投与量（ED50値）を求めた。結果は第５表
に示される様に、各ヒトモノクローナル抗体はそれぞれ
が反応特異性を示す２種の異なる血清型の緑膿菌の感染
に対し高い防御活性を有していた。 実施例16.ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対す
る防御活性試験２ 実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs2の
緑膿菌感染に対する感染防御活性を抗体の投与時期を変
えて検討した。生後、８週令のマウス（Balb/c、雌）一
群10匹に、マウス１匹当たりのヒトモノクローナル抗
体、HPs2を0.2μｇを含む溶液0.2mlを腹腔内へ投与し、
抗体投与の24時間前、同時、１時間後、４時間後にPA10
3（Ｅ型）に菌液を腹腔内へチャレンジした。対照群に
はヒトモノクローナル抗体の代わりに生理食塩液のみを
投与した。菌液は実施例15と同様に、生理食塩液にて希
釈後、５％ムチンを加え、マウス一匹当たりLD50量の８
倍となるように調整した。緑膿菌をチャレンジ後、３日
目の各投与群のマウスの生存率を観察した。結果は第６
表に示される様に、HPs2は、反応特異性を示すＥ血清型
の緑膿菌の感染に対し、菌液チャレンジの４時間後の投
与を除いて防御活性を有していた。このことより、HPs2
は緑膿菌の感染に対し予防の効果のみならず治療の効果
も有することが明らかとなった。 実施例17.凍結乾燥製剤の調製 実施例１で得られたHPs2を1mg/ml濃度となるように0.
2％（w/v）ヒト血清アルブミン（カルビオ社）を含むPB
Sに溶解し、ポアサイズ0.22ミクロンのメンブランフィ
ルターを用いて除菌濾過した。バイアル当たり1mlを無
菌分注し、凍結乾燥して本発明の凍結乾燥製剤を調製し
た。蒸留水で再溶解し、緑膿菌に対する抗体価を測定し
たところ、活性は保持されていた。 発明の効果 本発明によるヒトモノクローナル抗体の単品、又は２
種以上の組み合わせ、あるいは他のヒト抗体と組み合わ
せることにより、緑膿菌感染症に対し優れた予防、治療
効果が達成される。 本発明で注目すべきことは、本発明による異なる血清
型の緑膿菌間で交差反応性を有するヒトモノクローナル
抗体が認識する抗原が血清型特異抗原部位であるＯ−多
糖側鎖上に存在し、さらに、このヒトモノクローナル抗
体が緑膿菌感染に対して極めて低濃度・低用量で予防お
よび治療効果を発揮することを本発明者らがはじめて見
い出したことである。さらには、単独使用での感染防御
スペクトルの拡大により、緑膿菌のＯ抗原に対するヒト
モノクローナル抗体を含む製剤の製造において、混合す
るヒトモノクローナル抗体の種類を減らすことをこのヒ
トモノクローナル抗体を使うことにより可能にすること
を本発明者らが初めて見い出したことである。 なお、特開昭61-155398公報には、本間の分類の２、
７および13型の血清型菌に対して反応性を示すヒトモノ
クローナル抗体について述べられているが、その認識す
る血清型菌はいずれも緑膿菌研究会分類、およびLanyi
の分類で同一血清型に分類され、単に同一血清型におけ
る亜系を認識する抗体と考えられ、本発明でいう複数の
異なる血清型の緑膿菌を共通に認識する単一のヒトモノ
クローナル抗体とは性質を異にするものである。 本発明で言う緑膿菌の血清型間の交差反応性を示すと
は、ヒトモノクローナル抗体が反応性を示す複数の緑膿
菌が、現在までに知られているいずれの血清型の分類方
法上においてもただ一つの血清型内に分類されない場合
を指し、ヒトモノクローナル抗体が反応性を示す複数の
緑膿菌が、特定の分類方法上においてのみ複数の血清型
に分類されるものは、本発明で言う緑膿菌の血清型間で
交差反応性を示すことにはならなず、ただ単に、同一血
清型内の亜系としての反応性を示すにすぎない。 また、本発明におけるヒトモノクローナル抗体は、免
疫グロブリンの型がＭ型またはＧ型であるが、Ａ型であ
ってもかまわないことは容易に指摘される。 規則第13規則の２の寄託された微生物への言及 寄託機関：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号 受託番号及び寄託した日付： 1.微工研菌寄第9745号 昭和62年12月７日 2.微工研菌寄第9750号 昭和62年12月９日 3.微工研菌寄第9751号 昭和62年12月９日 4.微工研菌寄第9752号 昭和62年12月９日 5.微工研菌寄第9753号 昭和62年12月９日 6.微工研条寄第1596号 昭和62年12月７日 7.微工研条寄第1598号 昭和62年12月９日 8.微工研条寄第1599号 昭和62年12月９日 9.微工研条寄第1600号 昭和62年12月９日
わらず複数の血清型の緑膿菌（シュードモナス・エルギ
ノーサ、Pseudomonas aeruginosa）のＯ抗原に対して親
和性を示す抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体産生細胞と
その抗体、それを有効成分とする緑膿菌感染症の予防、
治療剤およびその製剤に関するものである。 従来の技術 緑膿菌は自然界に広く存在し、下水等の他ヒト、動物
の口腔、腸内から高率にみいだされる。この菌が病原性
を発揮するのはこの菌自体の菌力による一般感染症患者
におけるよりもむしろ感染抵抗力の低下した患者、即ち
癌患者、免疫抑制療法下の患者、移植患者、熱傷患者お
よび新生児などである。 現在、緑膿菌感染症は最も治療の困難な感染症と考え
られている。すなわち、緑膿菌はこれまで常用されてき
た抗生物質のほとんどすべてに対して耐性を示すばかり
でなく、近年開発された抗生物質に対しても容易に耐性
が誘導される傾向が強い。そのため、抗生物質療法の限
界に立って、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした
予防、治療法の研究がなされている。その１つにワクチ
ンの開発の研究があるが、既に感染を受けた患者に対す
る速効を望むことは困難である。他方、近年、緑膿菌感
染症の治療に健常人の血清あるいは血漿から精製したヒ
ト免疫グロブリンあるいはその化学的修飾物を有効成分
とする製剤を用いることが多い。しかし、これらの製剤
に含まれる抗体のうち緑膿菌に対し親和性を有し、か
つ、治療に有効な抗体の量は一定せず、また、その量が
少ないため、これらの製剤の予防、治療効果を疑問視す
る向きも多い。そのため、低用量で有効なヒトモノクロ
ーナル抗体の開発が急がれている。 一方、緑膿菌の表面抗原としては、外膜由来の蛋白抗
原（outer membrane protein,OMP）、ベン毛あるいはス
ライム由来の多糖体抗原、およびリポ多糖体（lipopoly
saccharide、以下LPSと略す）抗原の存在が知られてい
る。このうちLPSは血清型特異抗原部位であるＯ−多糖
側鎖（以下「Ｏ抗原」ということがある）とグラム陰性
菌に共通の基本構造であるリピドＡおよびコア部分より
形成される。Ｏ−多糖側鎖はオリゴ糖の反復から成って
おり、このＯ−多糖側鎖部分の免疫的性質により緑膿菌
の血清型別分類がなされている。しかし、緑膿菌の血清
型別分類に関しては現在でも多くの議論があり、日本で
はＡ型からＭ型までの13種類に分類する緑膿菌研究会分
類〔Homma,Japan J.Exp.Med.,46,329-336（1976）〕が
広く用いられており、緑膿菌研究会分類と他の分類を対
比すると下記の通りである。 なお、近年、Ｏ−多糖側鎖の一次構造も順次明らかに
なりつつあり〔例えば、Kropinski他、Antibiot.Chemot
her.,36,58-73（1985）〕、将来において新しい分類が
採択される可能性もある。緑膿菌のLPSのＯ−多糖側鎖
に対する抗体、すなわち緑膿菌Ｏ抗原に対する抗体は、
補体系を介して強い溶菌作用やオプソニン作用を持つこ
とが知られている。そこで、本発明者等は緑膿菌感染症
の予防、治療に有効なヒトモノクローナル抗体の取得を
目的として鋭意研究を重ね、緑膿菌の血清型抗原に対す
るヒトモノクローナル抗体、すなわち緑膿菌に対し血清
型特異的に反応するヒトモノクローナル抗体が、同型の
血清型の緑膿菌感染に対し非常に高い防御活性を有する
事を初めて見い出し、特開昭60-248626公報記載の発明
を完成するに至った。しかし、その後の緑膿菌のLPSの
Ｏ−多糖側鎖に対するヒトモノクローナル抗体の感染防
御に関する公報〔特開昭61-152280、特開昭61-155398〕
の記述にあるように、緑膿菌に対して血清型特異的に反
応するヒトモノクローナル抗体は単一の血清型の緑膿菌
にのみ特異的に反応し、同型の血清型の緑膿菌感染に対
しては防御活性を有するが、異なる血清型の緑膿菌感染
に対する防御活性はない。 一方、緑膿菌の外膜由来の蛋白抗原に対するモノクロ
ーナル抗体〔Sawada他,J.Infect.Dis.,150,570-576（19
85）、中村善明他、日本細菌学会雑誌,39,337（198
4）〕や、緑膿菌の共通多糖体に対するヒトモノクロー
ナル抗体〔Sawada他,J.Infect.Dis.,150,1290-1299（19
85）〕は何れも、緑膿菌感染に対する防御活性が低い。 発明が解決しようとする問題点 上述の様に緑膿菌のＯ抗原に対するヒトモノクローナ
ル抗体は、感染防御抗体として他の緑膿菌の抗原に対す
るヒトモノクローナル抗体と比較し非常に高い活性を有
するが、対応する血清型の緑膿菌感染に対してのみ有効
である。緑膿菌研究会分類ではＯ抗原は13種に分類さ
れ、頻度の差は有るが臨床的に分離される緑膿菌の血清
型もこれら全ての血清型菌に及んでいる。そのため、緑
膿菌感染症の予防、治療薬としてＯ抗原に対するヒトモ
ノクローナル抗体を一般に用いるには、数種から十数種
類の抗体を組み合わせた製剤を作製する必要がある。し
かし、組み合わせるモノクローナル抗体の数が多くなれ
ばなるほど、製品の品質管理等の煩雑さが増す。この様
な煩雑さを減少させるためには、複数の異なる血清型の
緑膿菌に交差反応性を示し、かつ、複数の異なる血清型
の緑膿菌感染に対し強い感染防御能を有するＯ抗原に対
するヒトモノクローナル抗体の取得が望ましいが、未だ
成功例の報告はない。さらには、ヒトに安全な投与が可
能な上記ヒトモノクローナル抗体を大量かつ安定に産生
する細胞株の創出も重要な課題となっている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、高い感染防御活性を有し、さらに複数
の血清型の緑膿菌を共通に認識するような単一のヒトモ
ノクローナル抗体を分泌する細胞株の取得を目的として
鋭意研究を重ね、本発明を完成するに至った。 本発明は、緑膿菌の複数の異なる種類のＯ抗原に対し
て共通に反応するヒトモノクローナル抗体、すなわち、
緑膿菌のＯ抗原に対して複数に反応するヒトモノクロー
ナル抗体を持続産生する自己複製細胞株を得、この細胞
株の産生するヒトモノクローナル抗体を、単品、又はそ
れらを組合わせることにより緑膿菌感染症の予防、治療
剤に使用して、ヒトおよび動物における緑膿菌感染症の
予防、治療を達成しようとするものである。ヒトの抗体
産生細胞（Ｂ細胞）にエプスタイン・バー・ウイルス
（Epstein-Barr virus、以下EBウイルスと略す）を感染
させ形質転換（以下EBウイルス形質転換と略す）を行う
か、あるいはヒトの抗体産生細胞をヒトあるいは動物由
来の無限増殖能を有する細胞、例えば腫瘍細胞と細胞融
合することにより無限増殖能を有する細胞集団を得、こ
のなかから血清型の異なる複数の緑膿菌に反応性を有す
る単一なヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を酵
素抗体法を使用したスクリーニングとクローニングによ
り選別した。次に、この細胞を培養し、培養液より血清
型の異なる緑膿菌に反応性を有する単一なヒトモノクロ
ーナル抗体を任意の一般的な方法、たとえばカラムクロ
マトグラフィー、電気泳動、沈澱および抽出等により精
製した。精製したヒトモノクローナル抗体は、単独、あ
るいは任意の添加物を加え、液状製剤あるいは凍結乾燥
製剤として緑膿菌感染症の予防、治療に供することがで
きる。 図面の簡単な説明 第１図から第７図はヒトモノクローナル抗体の緑膿菌
Ｏ抗原に対する交差反応性を、モノクローナル抗体とLP
Sの結合反応に対する各種血清型緑膿菌LPSによる阻害試
験により調べた結果を示す図で、第１図はHPs1のＤ型と
Ｉ型の各緑膿菌LPSによる結合阻害を示す図で、第２図
はHPs2のＥ型およびＦ型の各緑膿菌LPSによる結合阻害
を示す図で、第３図はHPs4のＡ型およびＬ型の各緑膿菌
LPSによる結合阻害を示す図で、第４図はHPs5のＧ型お
よびＨ型の各緑膿菌LPSによる結合阻害を示す図で、第
５図はHPs6のＥ型およびＦ型の各緑膿菌LPSの結合阻害
を示す図で、第６図はHPs7のＡ型およびＦ型の各緑膿菌
LPSによる結合阻害を示す図で、第７図はHPs8のＥ型お
よびＦ型の各緑膿菌LPSの結合阻害を示す図である。 （具体的説明） 1.使用緑膿菌 本発明では便宜上使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主
催の血清型別検討委員会の決定による血清型別分類に従
うものとし、第１表に示すＡ型からＭ型に属する菌株を
使用している。 Ａ型からＭ型に属する菌株の多くは、アメリカン・タ
イプカルチャーコレクション（ATCC）および東京大学医
科学研究所から入手できる。 2.ヒトモノクローナル抗体の製造 本発明による、緑膿菌のＯ抗原に対して複数に反応す
るヒトモノクローナル抗体、すなわち、緑膿菌のLPSの
Ｏ−多糖側鎖に対するヒトモノクローナル抗体は、EBウ
イルス形質転換法や細胞融合法等の方法により作製され
る。 EBウイルス形質転換法による本発明のヒトモノクロー
ナル抗体の作製は、ヒト抗体産生細胞（ヒトＢ細胞）
を調製し、ヒト抗体産生細胞にEBウイルスを感染させ
て形質転換を行い、血清の異なる複数の緑膿菌に反応
性を有する抗体の分泌を検出し、該形質転換細胞集団
より単一の細胞株を選別（この操作を以下クローニング
ということがある）し、該細胞株を培養後、培養物
よりヒトモノクローナル抗体を精製することにより行え
る。 次に各工程につき詳細な説明を加える。 抗体産生細胞の調製 本発明の方法に用いるヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）
は、緑膿菌に対する抗体産生がみられる健常人あるいは
緑膿菌感染症既往歴のある患者の末梢血、リンパ節、扁
桃腺、脾臓や分娩時の臍帯血などから公知の方法により
得ることが出来る。例えば、血液や上記組織などからの
ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の分離および濃縮は、フィ
コール・コンレイ液等の細胞分画液を用いた比重遠心
法、Ｅロゼット形成法、パニング法などを組み合わせて
効率的に行うことが出来る。 形質転換 EBウイルスによるヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の形質
転換法は公知の方法〔例えばNature,269,420-422（197
7）〕に準じて実施することが出来る。 B95−８細胞（感染性のEBウイルスを産生するマーモ
セット白血球由来細胞（を20％ウシ胎児血清（以下FCS
と略す）を含むRPMI 1640培地（以下培養液と略すこと
がある）で培養し、静止期に近い７日目の培養上清を遠
心分離してウイルス液を得る〔第４回日本免疫学会総会
記録、399-401（1974）〕。つぎに、の方法で得たヒ
ト抗体産生細胞（Ｂ細胞）を遠心分離し、吸引にて上清
を除去して得られるペレットにウイルス液を加えて分散
後、37℃、５％炭酸ガス存在下で１時間培養する。培養
後、遠心分離し、吸引にて上清を除去した後、ペレット
に細胞密度が１×105から５×105個/mlとなる様に培養
液を加え、細胞を分散させる。細胞分散液を24ウエル培
養プレートまたは96ウエル培養プレートの各ウエルに分
注し、37℃、５％炭酸ガス存在下で２週間から４週間培
養する。この間、３日から４日ごとに培養液の半量を新
しい培養液に交換することが望ましい。 抗体の検出 本発明の血清型の異なる複数の緑膿菌に反応性を有す
る抗体の検出は、一般のラジオイムノアッセイ法や、酵
素抗体法などの方法〔成書「単クローン抗体」p144,講
談社刊（1983）等〕により行うことが出来る。本発明で
は酵素抗体法を用いている。すなわち、あらかじめ血清
型の異なる複数の緑膿菌の0.3％ホルマリン処理菌体あ
るいはLPSを個々にメンブランフィルターに固定し、容
器中で細胞の培養上清を一定時間反応させた後、酵素標
識したウサギ抗ヒト抗体を反応させ、酵素反応による基
質の呈色割合により目的抗体の産生の有無および産生量
を測定するドット・イムノバインディングアッセイ法
〔以下DIBA法と略す、Anal.Biochem.,119,142-147（198
2）〕を簡易アッセイ法として用いている。なお必要に
より、酵素標識した抗ヒト抗体にヒト免疫グロブリンの
型に特異的な抗体を用いることにより免疫グロブリンの
型の決定が出来る。 クローニング の方法によって細胞の増殖コロニーが認められた各
ウエルの培養上清について上記酵素抗体法（以下ELISA
法と略す）などの方法により、目的抗体が存在するウエ
ルを選別した後、このウエル中の細胞を軟寒天法〔成書
「組織培養応用研究法」p289、ソフトサイエンス社刊
（1985）等〕あるいは限界希釈法〔成書「単クローン抗
体」p73、講談社刊（1983）等〕によりクローニングを
行う。さらに、クローニングにより細胞の増殖が認めら
れた後、再度上記酵素抗体法によるアッセイを行う。１
回から数回のクローニングにより、目的の抗体のみを分
泌する単一細胞株を得ることが出来る。 樹立細胞株の培養 の方法で樹立された細胞株の培養は、通常の培地を
用いて行える。例えば、前記培養液や一般の低血清ある
いは無血清培地が適宜使用出来る。 ヒトモノクローナル抗体の精製 培養液からの本発明のヒトモノクローナル抗体の精製
は、硫酸アンモニウム塩析法、ゲルろ過法、イオン交換
樹脂クロマト法などの非特異的精製法や、抗原あるいは
ヒトモノクローナル抗体に親和性を有する物質（例えば
プロテインＡや抗ヒト免疫グロブリン抗体等）を固定化
した担体を用いるアフィニティクロマト法などの公知の
方法の組み合わせにより行うことが出来る。 細胞融合法による本発明のヒトモノクローナル抗体の
作製は、公知の方法〔成書「MONOCLONAL ANTIBODIES」p
363,Plenum Press刊他〕に準じ行える。すなわち、ヒ
ト抗体産生細胞（ヒトＢ細胞等）を調製し、ヒト抗体
産生細胞と無限増殖能を有する細胞を細胞融合させ、
血清型の異なる複数の緑膿菌の反応性を有する抗体の分
泌を検出し、該ハイブリドーマ集団より単一の細胞株
を選別し、該細胞株を培養後、培養物よりヒトモノ
クローナル抗体を精製することにより行える。 抗体産生細胞の調製 細胞融合に用いる抗体産生細胞には、前記EBウイルス
形質転換法で述べたと同様な抗体産生細胞を用いること
が出来るが、さらには、前記EBウイルス形質転換法によ
り得られる、目的抗体を分泌するクローニング前のEBウ
イルス形質転換細胞集団、あるいはクローニングにより
得られる単一EBウイルス形質転換細胞株を用いることも
出来る。また、ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）をポークウ
ィードマイントージェン（PWM）を添加した培養液中で
数日間培養し、抗体産生細胞を増殖させた後に細胞融合
に供することも出来る。 細胞融合 ヒトＢ細胞ハイブリドーマの作製では、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養液
（HAT培地）、あるいはヒポキサンチンおよびアザセリ
ンを含有する培養液（HA培地）に感受性の無限増殖能を
有するヒト由来のミエローマ細胞、ミエローマ様細胞、
リンパ芽球細胞やリンパ芽球様細胞を細胞融合のパート
ナー細胞として用いるのが好適であるが、HAT培地に感
受性のマウスミエローマ細胞等をパートナー細胞として
用いることも出来る。 例えば、パートナー細胞としてマウスミエローマ細
胞、p3-NS1/1-Ag4.1（略称NS−１）と、EBウイルスによ
り形質転換後、目的抗体の産生が認められたウエルの細
胞や、末梢血等から分離される抗体産生細胞を1:1から
1:10程度の比率で混合し、さらに細胞融合用培地（50％
ポリエチレングリコールと10％ジメチルスルホキサイド
を含むRPMI 1640培地等）を加えて、公知の方法により
細胞を融合させる。つぎに、融合したハイブリドーマの
みの増殖に適したHAT−ウアバイン培養液（前記HAT培地
にさらにウアバインを含有する培養液、HAT−０培地）
に、細胞密度が１×105から５×105個/mlとなる様に細
胞を分散させる。細胞分散液を24ウエルまたは96ウエル
の培養プレートに分注し、37℃、５％炭酸ガス存在下で
約２週間から４週間培養する。この間、３日から５日ご
とにHAT−０培地の半量を新しいHAT−０培地と交換する
ことが望ましい。この際、フィーダー細胞としてマウス
の腹腔浸出細胞等に共存させるハイブリドーマの増殖を
早めることが出来る。 また、パートナー細胞としてヒトリンパ芽球様細胞、
MHP-315と、EBウイルス形質転換細胞株や、末梢血等か
ら分離される抗体産生細胞を1:1から1:10程度の比率で
混合し、前記同様に細胞融合後、HA−ウアバイン培養液
（前記HA培地にさらにウアバインを含有する培養液、HA
−０培地）に細胞を分散し、培養することによってハイ
ブリドーマを作製することが出来る。 なお、パートナー細胞として、マウス由来のX63、P3U
1、X63.653、SP2/0などを、ヒト由来のSK0-007、GM1500
などを用いることが出来る。 抗体の検出 かくしてハイブリドーマの明瞭な増殖が認められたウ
エルについて、前記EBウイルス形質転換法で述べたと同
様に酵素抗体法により異なる血清型の複数の緑膿菌に反
応性を示す抗体を検出する。 クローニング 前記EBウイルス形質転換法で述べたと同様に、クロー
ニングを繰り返し単一細胞株を得ることが出来る。 樹立株の培養 前記EBウイルス形質転換法で述べたと同様に、単一細
胞株を適当な培養液で培養することが出来る。 抗体の精製 前記EBウイルス形質転換法で述べたと同様に、培養液
より本発明のヒトモノクローナル抗体を精製することが
出来る。 3.ヒトモノクローナル抗体製剤の製造 本発明による、緑膿菌のＯ抗原に対し、複数に反応す
るヒトモノクローナル抗体は、単独、あるいは通常用い
られる添加剤、賦形剤を加えて液剤あるいは凍結乾燥製
剤として用いることが出来る。実際の緑膿菌感染症の予
防、治療にあたっては本発明のヒトモノクローナル抗体
を単独または２種以上混合するか、あるいは緑膿菌に対
する他のヒトモノクローナル抗体やヒトグロブリン製剤
と混合して用いてもよい。特に、混合製剤を製造する場
合は、本抗体を用いることにより、抗体の感染防御スペ
クトルが拡大することから、混合するヒトモノクローナ
ル抗体の種類の数を減少することが出来る。 なお、本発明のヒトモノクローナル抗体の用量、投与
経路は適宜選択されるが、用量は体重kgあたり0.01ない
し10mgが好ましく、投与経路は皮内、皮下、筋肉内、静
脈内投与等が可能である。 5.実施例 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 実施例1.EBウイルス形質転換法によるヒトモノクローナ
ル抗体の作製１ 抗体の作製１ （１） 抗原の調製 緑膿菌研究会型別検討委員会の血清型別分類（Ａ型か
らＭ型）に従い、次の第１表に示す株菌より抗体アッセ
イに用いる菌体およびLPSを調製した。 各緑膿菌菌株を普通寒天培地（日水製薬）で、37℃、
一夜培養し、増殖したコロニーを集め、生理食塩液に懸
濁し菌液を調製した。0.5mlの菌液を、一本当たり150ml
の本間らの合成培地〔Tanamoto他,J.Biochem.,83,711-7
18（1978）〕を含む坂口フラスコに接種し、37℃で16時
間振盪培養した。培養後、最終濃度が0.3％になる様に
ホルマリンをフラスコに加え、室温に１時間放置した。
最後に、菌体を遠心分離（12,000×ｇ、30分間）により
集め、生理食塩液と蒸留水で順次洗浄した後、凍結乾燥
してホルマリン処理乾燥菌体を得た。各血清型緑膿菌LP
Sは、凍結乾燥前のホルマリン処理湿菌体20gを出発材料
として、熱フェノール抽出法〔成書「免疫実験操作
法」、p2037、免疫学会編（1978）〕に従い精製した。
各血清型緑膿菌のホルマリン処理菌体よりのLPSの収量
（乾物重量）は、25mgから75mgであった。 （２） EBウイルス液の調製 EBウイルスを産生放出しているB95−８細胞を、３×1
05個/mlの密度となるように20％FCSを含むRPMI 1640培
地（以下、培養液と称することがある）に浮遊させ、５
％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。静止期に近い
７日目の培養上清を遠心分離（800×ｇ、10分間）によ
り集め、ポアサイズ0.45ミクロンのメンブランフィルタ
ー（ミリポア社）でろ過後、形質転換実験のEBウイルス
液として用いた。 （３） ヒト抗体産生細胞（リンパ球）の調製 健常人から採血したヘパリン加末梢血50mlに等量のRP
MI1640培地を加えて２倍に希釈後、半量のフィコール・
パック（ファルマシア社）上に界面が乱れない様に重層
し、室温で遠心分離（400×ｇ、30分間）した。遠心分
離後、界面層をパスツールピペットを用いて取り出し、
等量の20％FCSを含むRPMI1640培地を加えて、室温で遠
心分離（250×ｇ、10分間）した。沈澱した細胞を、20
％FCSを含むRPMI 1640培地に懸濁し、さらに１回、遠心
分離の操作を繰り返し、ヒト抗体産生細胞（リンパ球）
のペレット（細胞数;5×107個）を得た。 （４） EBウイルスによる形質転換 ヒト抗体産生細胞５×107個に対して（２）で調製し
たウイルス液50mlを加えて、37℃で１時間インキュベー
ションした。インキュベーション後、遠心分離（250×
ｇ、10分間）により細胞を集めた。細胞を20％FCSを含
むRPMI 1640培地に分散し、５×105個/mlの密度に調整
後、0.1mlずつ、96ウエル平底培養プレートに加え、５
％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。４日後に0.1m
lの20％FCSを含むRPMI 1640培地を加え、その後、４日
から５日ごとに半量の培養液を新しい培養液で交換し
た。（５）に示す抗体検出法により緑膿菌菌体との反応
が認められたウエルの細胞を、24ウエル培養プレートへ
拡大培養した。 （５） 抗体の検出 細胞増殖の認められたウエルについて、培養上清中の
抗緑膿菌ヒト抗体の有無を酵素免疫測定法であるDIBA法
で測定した。96ウエル平底培養プレートの培養上清の場
合は、各ウエルの培養上清0.1mlを、１ドット当たり0.4
μｇの13種の血清型の緑膿菌のホルマリン処理乾燥菌体
の混合物を固定したグリッド入りニトロセルロース・メ
ンブレンフィルター（3.1mm角）と、96ウエルＵ型マル
チプレート中で反応させた。24ウエル培養プレートの培
養上清の場合は、各ウエルの培養上清0.2mlを、Ａ型か
らＦ型までの６種とＧ型からＭ型までの７種の緑膿菌の
ホルマリン処理乾燥菌体を別々の場所に固定したグリッ
ド入りニトロセルロース・メンブレンフィルター（6.2m
m×9.3mm角）と、48ウエル培養プレート中で反応させ
た。室温で２時間反応させ、ついでパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・イムノグロブリン抗体（ダコ社）と２
時間反応後、４−クロロ−１−ナフトールを基質として
発色させ、抗原を固定したニトロセルロース・メンブレ
ンフィルター上に肉眼観察で発色が認められたものを抗
体産生が陽性と判定した。 （６） クローニング 抗体検出法により複数の血清型の緑膿菌との反応性が
認められたウエルの細胞を、6cmシャーレに移した。6cm
シャーレ中で増殖した細胞は軟寒天法によりクローニン
グをおこなった。先ず、血球計算盤を用いて正確に細胞
数を測定した後、１×105個/mlの密度の細胞浮遊液と
し、この細胞浮遊液0.1mlを0.3％アガロース（シープラ
ークアガロース、エフ・エム・シー社）を含む培養液30
mlに加え混合した。つぎに、あらかじめ0.5％アガロー
スを含む培養液4mlを分注して固めた6cmシャーレに、細
胞および0.3％アガロースを含む培養液3mlを分注して固
めた（各細胞あたり10枚）。細胞を分注した6cmシャー
レは５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。３週間
から５週間後、軟寒天中に細胞が増殖しコロニーが肉眼
的に認められるようになったら、各コロニーをパスツー
ルピペットを用いて、あらかじめウエル当たり0.1mlの
培養液を分注した96ウエル平底培養プレートの各ウエル
に移し培養した。２日後に培養液0.1mlを加え、さらに
２日後、細胞増殖の認められたウエルについて培養上清
中の抗緑膿菌モノクローナル抗体の有無をDIBA法で測定
した。抗体産生が陽性と判断されたウエルの細胞を24ウ
エル培養プレートへ拡大培養した。３日後、24ウエル培
養プレートのウエルについて、培養上清中の抗緑膿菌抗
体の有無をDIBA法で測定した。複数の血清型緑膿菌と反
応する抗体を産生していると判断されたウエルの細胞を
上記のごとく再度同様な操作を繰り返しクローニングを
行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＩ型とＤ型に交差反
応性を有するヒトモノクローナル抗体、HPs1（IgM）を
産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5035、およびＥ
型とＦ型に交差反応性を有するヒトモノクローナル抗
体、HPs2（IgM）を産生するEBウイルス形質転換細胞
株、MP5038を得た。MP5035と5038は、微工研に微工研条
寄第1598号、微工研条寄第1596号として寄託されてい
る。 （７） 細胞株の培養と抗体の精製 ヒトモノクローナル抗体、HPs1及びHPs2を産生する２
株のEBウイルス形質転換細胞を、フラスコ（底面積175c
m2）を用いて0.5％ウシ血清アルブミン（以下BSAと略
す）を含むRITC55−９培地〔Exp.Cell Res.,138,127-13
4（1982）〕でそれぞれ培養し、培養物より遠心分離（4
00×ｇ、30分間）により上清を得、50％硫酸アンモニウ
ム塩析法とセファクリル（Sephacryl）S-300（ファルマ
シア社）カラムを用いた分画法により抗体を精製した。
HPs1を産生するEBウイルス形質転換細胞株を培養した25
0mlの培養液からは、IgM画分を2.5mg、またHPs2を産生
するEBウイルス形質転換細胞株を培養した2Lの培養液か
らは、IgM画分を76mg得た。 実施例2.EBウイルス形質転換法によるヒトモノクローナ
ル抗体の作製２ 緑膿菌感染症患者の末梢血を用いる以外は、実施例１
と同様にしてEBウイルスによる形質転換を行った。ヘパ
リン加末梢血25mlからヒト抗体産生細胞のペレット（細
胞数;1.4×107個）を得た。２回の軟寒天クローニング
を行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＡ型とＬ型に交差
反応するヒトモノクローナル抗体、HPs4（IgM）を産生
するEBウイルス形質転換細胞株、MP4091およびＧ型とＨ
型に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HPs5（Ig
M）を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5050を得
た。MP5050は、微工研に微工研条寄第1600号として寄託
されている。実施例１の（７）と同様に細胞を培養し、
HPs4を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP4091を培
養した250mlの培養液からは、IgM画分を2.5mg、またHPs
5を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5050を培養
した450mlの培養液からは、IgM画分を8.6mg得た。 実施例3.EBウイルス形質転換法によるヒトモノクローナ
ル抗体の作製３ 実施例１と異なる健常人の末梢血を用いる以外は、実
施例１と同様にしてEBウイルスによる形質転換を行っ
た。ヘパリン加末梢血25mlからヒト抗体産生細胞のペレ
ット（細胞数;2.8×107個）を得た。２回の軟寒天クロ
ーニングを行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＡ型とＦ
型に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HPs7（Ig
M）を産生するEBウイルス形質転換細胞株、MP5046を得
た。MP5046は、微工研に微工研条寄第1599号として寄託
されている。実施例１の（７）と同様に細胞を培養し、
HPs7と産生するEBウイルス形質転換細胞株、HP5046を培
養した300mlの培養液からは、IgM画分を4.1mg得た。 実施例4.ハイブリドマー法によるヒトモノクローナル抗
体の作製１ （１） ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の調製 健常人から採血したヘパリン加末梢血50mlから実施例
１の（３）と同様にしてヒト抗体産生細胞のペレット
（細胞数;4.6×107個）を得た。これに実施例１の
（２）で調製したウイルス液46mlを加えて、37℃で１時
間インキュベーションした。インキュベーション後、遠
心分離（250×ｇ、10分間）により集めた細胞に培養液
を加え、１×105個/mlの密度となるように浮遊させ、フ
ラスコ（底面積175cm2）２本に分注し、５％炭酸ガス存
在下、37℃で静置培養した。５日後に各々50mlの培養液
を加え、さらに５日後に遠心により細胞を集めた。 （２） 細胞融合 EBウイルス形質転換細胞のマウスミエローマ細胞株、
NS−１を各々RPMI1640培地で洗浄した。EBウイルス形質
転換細胞1.3×108個とマウスミエローマ細胞1.3×109個
を50ml容量のプラスチック製遠心管中で混合する。混合
した細胞を遠心分離（175×ｇ、10分間）し、上清を捨
て、細胞を充分にほぐす。この細胞を含む遠心管に、50
％ポリエチレングリコール（M.W.1500、和光純薬）、10
％ジメチルスルホキサイドを含むRPMI1640培地0.5mlを
静かに加え遠心管をゆっくり回転させて、細胞融合させ
る。２分後、RPMI1640培地10mlを加え静かに攪拌後、遠
心分離（175×ｇ、10分間）する。遠心後、上清を捨
て、２×10-4Ｍヒポキサンチン、0.176μg/mlアミノプ
テリン、13μg/mlチミジン、５μＭウアバインおよび20
％FCSを含むRPMI1640培地（以下HAT−０培養液と略す）
を加えて１×106個/mlの密度の細胞浮遊液とし、ウエル
当たり0.1mlずつ、96ウエル平底培養プレートに加え、
５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。４日後に0.
1mlのHAT−０培養液を加え、その後、４日から５日毎に
半量の培養液を新しいHAT−０培養液で交換した。 （３） 抗体の検出 細胞増殖の認められたウエルについて、培養上清中の
抗緑膿菌モノクローナル抗体の有無を実施例１の（５）
と同様にしてDIBA法で測定した。96ウエル平底培養プレ
ートの培養上清0.1mlを、RPMI1640培地で２倍に希釈
し、Ａ型からＦ型までの６種とＧ型からＭ型までの７種
の緑膿菌のホルマリン処理乾燥菌体を別々の場所に固定
した２枚のグリッド入りニトロセルロース・メンブレン
フィルター（6.2mm×9.3mm角）と、48ウエル培養プレー
ト中で反応させた。 （４） クローニング あらかじめ、３％グリコーゲン（東京化成工業）を含
むリン酸緩衝液（以下、PBSと略す）をマウス（Balb/
c）腹腔に投与して４日後に腹腔内浸出細胞を集め、１
×105個/mlの密度の細胞浮遊液とし、ウエル当たり0.1m
lずつ分注した96ウエル平底培養プレートを準備する。
つぎに、抗体検出法により複数の血清型緑膿菌との反応
が認められたウエルの細胞をそれぞれ集め、血球計算盤
を用いて正確に細胞数を調べ、HAT−０培養液に分散
し、20個/mlと200個/mlの細胞浮遊液とし、上記マウス
腹腔内浸出細胞を分注した96ウエル平底培養プレートの
各ウエルの上清を除去した後に、各0.1mlずつ加え、５
％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。４日後に0.1m
lのHAT−０培養液を加え、３日から４日ごとに半量の培
養液を新しいHAT−０培養液で交換をして、７日から14
日後に細胞増殖の認められたウエルについて培養上清の
抗緑膿菌ヒト抗体の有無をDIBA法で測定した。複数の血
清型の緑膿菌と反応する抗体を産生していると判断され
たウエルの細胞を上記のごとく再度同様な操作を繰り返
しクローニングを行い、緑膿菌研究会分類の血清型のそ
れぞれＥ型とＦ型に交差反応するヒトモノクローナル抗
体、HPs6（IgG）を産生するハイブリドーマ細胞株、MP4
092を得た。 （５） 細胞の培養および抗体の精製 96ウエル平底培養プレートで十分増殖させたハイブリ
ドーマ細胞は、徐々に拡大培養し、1Lのスターリングシ
ステムで500mlの20％FCSを含むRPMI1640培養液を用いて
培養した。培養物より遠心分離（400×ｇ、30分間）に
より上清を得、50％硫酸アンモニウム塩析法とプロテイ
ン（Protein）Ａ−セファロース（Sepharose）4B（ファ
ルマシア社）カラムを用いた分画法により精製して、Ig
Gを5mg得た。 実施例5.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
２ （１） ２−アミノエチルイソチオウロニウム・ヒドロ
ブロマイド（以下、AETと略す）処理ヒツジ赤血球の調
製 5mlのヒツジ赤血球（以下SRBCと略す）浮遊液（日本
バイオテスト研究所）を50ml容量のプラスチック製遠心
管に取り、20mlのゼラチン・ベロナール・バッファ（以
下、GVBと略す）を加え、よく攪拌した後、遠心分離
（1,600×ｇ、10分間）した。上清を吸引除去し、沈澱
したSRBCを20mlのGVDに懸濁し、さらに３回遠心分離の
操作を繰り返した。得られた約1mlのSRBCのペレットに4
mlの0.143M AET水溶液を加えて懸濁し、時々攪拌しなが
ら、37℃で15分間反応させた。反応終了後、直ちに20ml
の氷冷したGVBを加え、よく攪拌した後に遠心分離（1,6
00×ｇ、10分間）した。上清を吸引除去し、沈澱を20ml
のGVBに懸濁し、さらに２回、遠心分離の操作を繰り返
した。AET処理SRBCは、２×108個/mlの密度になるよう
にGVBに分散し、使用まで、氷冷下に保存した。 （２） ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）の調製 交通事故により入院し、外傷治癒後約３ケ月を経過し
た。緑膿菌に対する抗体価の高い健常人から採血したヘ
パリン加末梢血25mlを、等量のモノポリ・リゾルビング
・メディウム（フロウ社）上に界面が乱れないように重
層し、室温で遠心分離（350×ｇ、30分間）した。遠心
分離後、界面層部分の細胞を含む液をパスツールピペッ
トを用いて取り出し、等量の20％FCSを含むRPMI1640培
地を加え、室温で遠心分離（350×ｇ、10分間）沈澱し
た細胞を、20％FCSを含むRPMI1640培地に再懸濁し、さ
らに１回、遠心分離の操作を繰り返して、ヒトリンパ球
画分のペレット（細胞数;5×107個）を得た。 次に得られたヒトリンパ球画分を、4mlの20％FCSを含
むRPMI1640培地に懸濁し、５×106個/mlの密度となるよ
うに調製した。各0.5mlの懸濁液を８本の50ml容量のプ
ラスチック製遠心管に分注し、各遠心管に（１）で調製
したAET処理SRBC分散液、1mlを加えた。よく混和した
後、遠心分離（20×ｇ、２分間）した。遠心分離後、４
℃に、２時間静置してロゼット形成反応を行った。反応
終了後、1.5mlの20％FCSを含むRPMI1640培地を加え、パ
スツールピペットを用いて静かにペレットを破壊した。
ロゼット形成細胞浮遊液を集め、50mlのプラスチック製
遠心管に入れた20mlのモノポリ・リゾルビング・メディ
ウム上に界面が乱れないように重層し、遠心分離（350
×ｇ、30分間）した。遠心分離後、界面層をパスツール
ピペットを用いて集め、界面層部分の細胞を含む液をパ
スツールピペットを用いて取り出し、等量の20％FCSを
含むRPMI1640培地を加え、室温で遠心分離（250×ｇ、1
0分間）した。沈澱した細胞を、20％FCSを含むRPMI1640
培地に再懸濁し、さらに２回、遠心分離の操作を繰り返
して、ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）のペレット（細胞
数;1.0×107個）を得た。 ヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）のペレットを20mlの20％
FCSを含むRPMI1640培地に懸濁し、５×105個/mlの密度
に調整し、1/200容量のポークウイードマイトジェン（P
WM）（ギブコ社）を加え、フラスコ（底面積75cm2）に
入れ、５％炭酸ガス存在下、37℃で６日間静置培養し
た。 （３） 細胞融合 あらかじめ、マウス（Balb/c）一匹当たり0.5mlの2.5
％グリコーゲンを含むPBSを腹腔内に注入し、４日後に
腹腔内に浸出した細胞を集め、別に調製したマウス脾臓
細胞と共に20％FCSを含むRPMI1640培地に分散し、それ
ぞれ５×105個/ml、１×106個/mlの密度の細胞浮遊液と
し、ウエル当たり0.1mlづつ分注した96ウエル平底プレ
ート（以下、フィーダープレートと称する）を準備し
た。 PWMで処理したヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）とヒト由
来リンパ芽球様細胞、MHP-315を各々RPMI1640培地で洗
浄した。５×107個のヒト抗体産生細胞（Ｂ細胞）と同
細胞数のリンパ芽球様細胞を、50ml容量のプラスチック
製遠心管中で混合した。混合した細胞を遠心分離（175
×ｇ、10分間）した。上清を捨て、沈澱した細胞はFCS
を含まないRPMI1640培地に懸濁し、さらに２回、遠心分
離の操作を繰り返した。遠心分離後、パスツールピペッ
トを用いて上清を出来る限り取り除き、細胞ペレットと
した。このペレットに緩やかな振動を与え、少し細胞を
ほぐした後、0.3mlの融合試薬（50％ポリエチレングリ
コール4,000、10％ジメチルスルホキサイドを含むPBS溶
液）を加え、室温で、90秒間緩やかに遠心管を回転させ
た。90秒後、20mlの20％FCSを含むRPMI1640培地をゆっ
くり加え、さらに２分後に、20mlの同培地を加えて静か
に細胞を分散させた。細胞融合後の細胞を遠心分離（17
5×ｇ、10分間）によりペレットとし、このペレットを2
0％FCSを含むRPMI1640培地に分散し、１×106個/mlの密
度に調製した。細胞分散液を、フィーダープレートの各
ウエルの上清を除去した後に、各ウエル当たり0.1mlず
つ加え、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。 24時間後に、４×10-4Ｍヒポキサンチン、２μg/mlア
ザセリン、10μＭウアバイン、および20％FCSを含むRPM
I1640培地を、ウエルあたり0.1mlずつ加えた。その後
は、３日から４日ごとに、半量の培養液を２×10-4Ｍヒ
ポキサンチン、１μg/mlアザセリン、５μＭウアバイ
ン、および20％FCSを含むRPMI1640培地（以下HA−０培
養液と略す）で交換した。 （４） 抗体の検出 約４週間から５週間後、細胞増殖の認められたウエル
について、培養上清中の抗緑膿菌ヒト抗体の有無を、実
施例１の（５）と同様にしてDIBA法で測定した。 （５） クローニング 抗体検出法により複数の血清型緑膿菌との反応が認め
られたウエルの細胞をそれぞれ集め、血球計算盤を用い
て正確に細胞数を調べ、HA−０倍養液に分散し、20個/m
lと200個/mlの細胞浮遊液とし、上記フィーダープレー
トの各ウエルの上清を除去した後に、各ウエル当たり0.
1mlずつ加え、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養し
た。４日後に0.1mlのHA−０倍養液を加え、その後は３
日から４日ごとに半量の培養液を交換した。２週間から
４週間後、増殖の認められたウエルについて培養上清の
抗緑膿菌ヒト抗体の有無をDIBA法で測定した。複数の血
清型の緑膿菌と反応する抗体を産生していると判断され
た細胞を上記のごとく再度同様な操作を繰り返しクロー
ニングを行い、緑膿菌研究会分類の血清型のＥ型とＦ型
に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HPs8（IgM）
を産生するハイブリドーマ細胞株、MP4095を得た。MP40
95は微工研に微工研菌寄第9750号として寄託されてい
る。 （６） 細胞の培養および抗体の精製 96ウエル平底培養プレートで十分に増殖させたハイブ
リドーマ細胞株MP4095は徐々に拡大培養し、４枚のフラ
スコ（底面積175cm2）で200mlのNYSF404無血清培地〔矢
部、組織培養、11、458（1985）〕を用いて培養した。
培養物より遠心分離（400×ｇ、20分間）により190mlの
上清を得、ポアサイズ0.22ミクロンのメンブランフィル
ターで濾過した。濾液は、あらかじめ0.025Mリン酸緩衝
液（pH6.8）で緩衝化したモノＱカラム（ファルマシア
社）に2ml/分の流速で吸着させた。吸着後、同緩衝液と
等量の0.3Mリン酸緩衝液（pH6.5）の混合液でカラムを
洗浄した。洗浄後、0.3Mリン酸緩衝液（pH6.5）でIgM画
分を溶出した。190mlの培養上清より1mgのIgM抗体が得
られた。 実施例6.ハイブリドーマ法によるヒトモノクローナル抗
体の作製３ （１） ヒト抗体産生細胞の調製 ヒト抗体産生細胞には、実施例１で得た、緑膿菌研究
会分類のＩ型とＤ型に交差反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体、HPs1（IgM）を産生するEBウイルス形質転
換細胞株、MP5035を用いた。MP5035は、20％FCSを含むR
PMI1640培地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培
養し、対数増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリ
ドーマの作製に用いた。 （２） 細胞融合 形質転換細胞、MP5035とヒト由来リンパ芽球様細胞、
MHP-315を、各々FCSを含まないRPMI1640培地で洗浄し
た。1.3×108個の形質転換細胞と同細胞数のヒトリンパ
芽球様細胞を、50ml容量のプラスチック製遠心管中で混
合した。混合した細胞を遠心分離（175×ｇ、10分間）
した。上清を捨て、沈澱した細胞はFCSを含まないRPMI1
640培地に懸濁し、さらに２回、遠心分離の操作を繰り
返した。遠心分離後、パスツールピペットを用いて上清
を出来る限り取り除き、細胞ペレットとした。このペレ
ットに緩やかな振動を与え、少し細胞をほぐした後、0.
3mlの融合試薬（50％ポリエチレングリコール4,000、10
％ジメチルスルホキサイドを含むPBS溶液）を加え、室
温で、90秒間緩やかに遠心管を回転させた。90秒後、20
mlの20％FCSを含むRPMI1640培地をゆっくり加え、さら
に２分後に、20mlの同培地を加えて静かに細胞を分散さ
せた。細胞融合後の細胞を遠心分離（175×ｇ、10分
間）によりペレットとし、このペレットを20％FCSを含
むRPMI1640培地に分散し、１×106個/mlの密度に調製し
た。細胞分散液を、フィーダープレートの各ウエルの上
清を除去した後、各ウエル当たり0.1mlずつ加え、５％
炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。 24時間後に、４×10-4Ｍヒポキサンチン、２μg/mlア
ザセリン、10μＭウアバイン、および20％FCSを含むRPM
I1640培地を、ウエルあたり0.1mlずつ加えた。その後
は、３日から４日ごとに、半量の培養液を２×10-4Ｍヒ
ポキサンチン、１μg/mlアザセリン、５μＭウアバイ
ン、および20％FCSを含むRPMI1640培地（HA−０培養
液）で交換した。 （３） 抗体の検出 約４週間から５週間後、細胞増殖の認められたウエル
について、培養上清中の抗緑膿菌ヒト抗体の有無を、実
施例１の（５）と同様にしてDIBA法で測定した。 （４） クローニング 抗体検出法により、Ｄ型とＩ型の血清型緑膿菌と反応
する抗体の存在が認められたウエルの細胞をそれぞれ集
め、血球計算盤を用いて正確に細胞数を計測した。細胞
をHA−０培養液に分散し、20個/mlと200個/mlの細胞密
度の細胞浮遊液とした。フィーダープレート（各１枚）
の各ウエルの上清を除去した後に、各ウエル当たり0.1m
lずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養し
た。４日後に0.1mlのHA−０倍溶液を加え、その後は３
日から４日ごとに半量の培養液を新しいHA−０培養液と
交換した。２週間から４週間後、増殖の認められたウエ
ルについて培養上清中の抗緑膿菌ヒト抗体の有無をDIBA
法で測定した。Ｄ型とＩ型の血清型緑膿菌と反応する抗
体を産生していると判断された細胞を上記のごとく再度
同様な操作を繰り返しクローニングを行った。２回のク
ローニングにより緑膿菌研究会分類の血清型のそれぞれ
Ｅ型とＦ型に交差反応するヒトモノクローナル抗体、HP
s9（IgM）を産生するハイブリドーマ細胞株、MP5082を
得た。96ウエル平底培養プレートで十分に増殖させた細
胞を徐々に拡大培養した。MP5082は、微工研に微工研菌
寄第9745号として寄託されている。 （５） 細胞の培養および抗体の精製 ハイブリドーマ細胞株、MP5082を、３×105個/mlとな
るように200mlのNYSF404無血清培地に分散し、４枚のフ
ラスコ（底面積175cm2）にて分注して、５％炭酸ガス存
在下、37℃で静置培養した。培養開始４日後に、培養液
より遠心分離（400×ｇ、20分間）により190mlの上清を
得、培養上清より実施例５の（６）と同様にしてモノＱ
カラムで抗体を精製した。190mlの培養上清より1.7mgの
IgM抗体が得られた。 実施例7.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
４ ヒト抗体産生細胞には、実施例１で樹立した、緑膿菌
研究会分類のＥ型とＦ型に交差反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体、HPs2（IgM）を産生するEBウイルス形
質転換細胞株、MP5038を用いる以外は、実施例６と同様
にしてヒト由来リンパ芽球様細胞株、MHP-315と細胞融
合を行った。まず、MP5038を20％FCSを含むRPMI1640培
地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培養し、対数
増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリドーマの作
製に用いた。1.0×108個のEBウイルス形質転換細胞と同
細胞数のヒトリンパ芽球様細胞を細胞融合し、実施例６
と同様にしてクローニングを行い、緑膿菌研究会分類の
血清型のＥ型とＦ型に交差反応性を示すヒトモノクロー
ナル抗体、HPs10（IgM）を産生するハイブリドーマ細胞
株、MP5064を得た。MP5064は、微工研に微工研菌寄第97
51号として寄託されている。ハイブリドーマ細胞株、MP
5064を、３×105/mlとなるように350mlのNYSF404無血清
培地に分散し、７枚のフラスコ（底面積175cm2）に分注
して、５％炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。培養
開始４日後に、培養液より遠心分離（400×ｇ、20分
間）により330mlの上清を得、培養上清より実施例５の
（６）と同様にしてモノＱカラムで抗体を精製した。30
0mlの培養上清より7.7mgのIgM抗体が得られた。 実施例8.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
５ ヒト抗体産生細胞には、実施例２で樹立した、緑膿菌
研究会分類のＧ型とＨ型に交差反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体、HPs5（IgM）を産生するEBウイルス形
質転換細胞株、MP5050を用いる以外は、実施例６と同様
にしてヒト由来リンパ芽球様細胞株、MHP-315と細胞融
合を行った。まず、MP5050を20％FCSを含むRPMI1640培
地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培養し、対数
増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリドーマの作
製に用いた。1.3×108個のEBウイルス形質転換細胞と同
細胞数のヒトリンパ芽球様細胞を細胞融合し、実施例６
と同様にして緑膿菌研究会分類の血清型のＧ型とＨ型に
交差反応性を示すヒトモノクローナル抗体、HPs11（Ig
M）を産生するハイブリドーマ細胞株、MP5104を得た。M
P5104は微工研に微工研菌寄第9753号として寄託されて
いる。ハイブリドーマ細胞株、MP5104を、３×105個/ml
となるように500mlのNYSF404無血清培地に分散し、10枚
のフラスコ（底面積175cm2）に分注して、５％炭酸ガス
存在下、37℃で静置培養した。培養開始４日後に、培養
液より遠心分離（400×ｇ、20分間）により470mlの上清
を得、培養上清より実施例５の（６）と同様にしてモノ
Ｑカラムで抗体を精製した。450mlの培養上清より9.8mg
のIgM抗体が得られた。 実施例9.細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の作製
６ ヒト抗体産生細胞には、実施例３で樹立した、緑膿菌
研究会分類のＡ型とＦ型に交差反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体、HPs7（IgM）を産生するEBウイルス形
質転換細胞株、MP5046を用いる以外は、実施例６と同様
にしてヒト由来リンパ芽球様細胞株、MHP-315と細胞融
合を行った。まず、MP5046を20％FCSを含むRPMI1640培
地を用いてフラスコ（底面積175cm2）中で培養し、対数
増殖期の細胞を遠心分離により集めハイブリドーマの作
製に用いた。1.3×108個の形質転換細胞と同細胞数のヒ
トリンパ芽球様細胞を細胞融合して実施例６と同様にし
て緑膿菌研究会分類の血清型のＡ型とＦ型に交差反応性
を示すヒトモノクローナル抗体、HPs12（IgM）を産生す
るハイブリドーマ細胞株、MP5075を得た。MP5075は、微
工研に微工研菌寄第9752号として寄託されている。ハイ
ブリドーマ細胞株、MP5075を、３×105個/mlとなるよう
に550mlのNYSF404無血清培地に分散し、11枚のフラスコ
（底面積175cm2）に分注して、５％炭酸ガス存在下、37
℃で静置培養した。培養開始４日後に、培養より遠心分
離（400×ｇ、20分間）により530mlの上清を得、培養上
清より実施例５の（６）と同様にしてモノＱカラムで抗
体を精製した。530mlの培養上清より13.4mgのIgM抗体が
得られた。 実施例10.ヒトモノクローナル抗体のLPSおよびRa、リピ
ドＡとの反応性 実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例
５、実施例６、実施例７、実施例８および実施例９で得
られたヒトモノクローナル抗体と各血清型緑膿菌のLPS
およびLPSの共通構造部分のみを有するRa株由来のLPSお
よびリピドＡとの反応性を実施例１で述べたDIBA法で検
討した。各血清型緑膿菌LPSは、実施例１で調製したも
のを用いた。Ra（サルモネラ・ミネソタ、Salmonella m
innesota R60）株由来のLPSおよびリピドＡは市販品
（リスト・バイオロジカル・ラボラトリー社）を用い
た。結果を第２表に示した。各ヒトモノクローナル抗体
はLPSの共通構造部分であるRaあるいはリピドＡとは反
応せず、各血清型緑膿菌LPSと特異的に反応することか
ら、LPSのＯ−多糖側鎖部分を認識するヒトモノクロー
ナル抗体であることが明らかとなった。 実施例11.LPSに対するヒトモノクローナル抗体の交差反
応性１ 実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs1、
HPs2の緑膿菌のＯ−多糖側鎖、すなわちＯ抗原に対する
交差反応性を、LPSをコートしたプレートを用いた酵素
免疫測定法（ELISA法）で検討した。実施例１で調製し
た緑膿菌LPSを炭酸緩衝液（pH9.6）に溶解し、２μg/ml
の濃度とした。50μｌのLPS溶液をELISA用96ウエルプレ
ート（グライナー社）の各ウエルに分注し、37℃に２時
間放置して固定後、溶液を捨て、２％BSAを含む炭酸緩
衝液でブロックした。0.05％ツイーン（Tween）20を含
むPBSに溶解した各抗体液（25ng/ml）と、等量の各緑膿
菌LPS溶液（50μg/ml）の２倍希釈系列希釈液を混合
し、室温で１時間反応させた。50μｌの反応液を前記LP
Sを固定したELISA用96ウエルプレートの各ウエルに分注
し、室温で1.5時間反応させた。ウエルを0.05％ツイー
ン20を含むPBSで洗浄後、50μｌのパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・免疫グロブリン（500倍希釈）と室温
で、1.5時間反応させた。0.05％ツイーン20を含むPBSで
洗浄後、50μｌの10mg/ml2,2′−アジノビス（３−エチ
ルベンズチアゾリンスルホン酸）（ABTS）、0.003％過
酸化水素水を含むクエン酸緩衝液と室温で、30分間反応
させた。波長414nmの吸光度を測定し、吸光度より各緑
膿菌LPSにより各抗体とプレートに固定したLPSとの結合
に対する阻害率を求めた。 第１図に示すように、Ｉ型緑膿菌LPSをコートプレー
トへのHPs1の結合は、Ｉ型およびＤ型の各緑膿菌LPSに
より阻害されたが、Ａ型緑膿菌LPSにより阻害されない
ことから、HPs1はＩ型とＤ型の２種のＯ抗原を共通に認
識するモノクローナル抗体であることが確認された。第
２図に示す様に、Ｆ型緑膿菌LPSをコートプレートへのH
Ps2の結合は、Ｅ型およびＦ型の各緑膿菌LPSにより阻害
されたが、Ｄ型緑膿菌LPSにより阻害されないことか
ら、HPs2はＥ型とＦ型の２種のＯ抗原を共通に認識する
モノクローナル抗体であることが確認された。 実施例12.LPSに対するヒトモノクローナル抗体の交差反
応性２ 実施例２、実施例３、実施例４および実施例５で得ら
れたヒトモノクローナル抗体、HPs4、HPs5、HPs6、HPs
7、HPs8の緑膿菌Ｏ抗原に対する交差反応性を、実施例1
1と同様にLPSをコートしたプレートを用いたELISA法で
検討した。第３図に示す様に、Ａ型緑膿菌LPSをコート
したプレートへのHPs4の結合は、Ａ型およびＬ型の各緑
膿菌LPSにより阻害され、第４図に示すように、Ｈ型緑
膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs5の結合は、Ｇ型
およびＨ型の各緑膿菌LPSにより阻害され、第５図に示
す様に、Ｅ型緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs6
の結合は、Ｅ型およびＦ型の各緑膿菌LPSにより阻害さ
れ、第６図に示す様に、Ａ型緑膿菌LPSをコートプレー
トへのHPs7の結合は、Ａ型およびＦ型の各緑膿菌LPSに
より阻害を受け、第７図に示す様に、Ｅ型緑膿菌LPSを
コートしたプレートへのHPs8の結合は、Ｅ型およびＦ型
の各緑膿菌LPSにより阻害を受けた。これらの結果か
ら、ヒトモノクローナル抗体、HPs4、HPs5、HPs6、HPs
7、HPs8はそれぞれＡ型とＬ型、Ｇ型とＨ型、Ｅ型およ
びＦ型、Ａ型およびＦ型、Ｅ型およびＦ型の各２種のＯ
抗原を共通に認識するモノクローナル抗体であることが
確認された。 実施例13.LPSに対するヒトモノクローナル抗体の交差反
応性３ 実施例６、実施例７、実施例８および実施例９で得ら
れたヒトモノクローナル抗体、HPs9、HPs10、HPs11、HP
s12の緑膿菌Ｏ抗原に対する交差反応性を、実施例11と
同様にLPSをコートしたプレートを用いたELISA法で検討
した。Ｉ型緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs9の
結合は、ＤおよびＩ型の各緑膿菌LPSにより阻害され
た。Ｅ型緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs10の結
合は、Ｅ型およびＦ型の各緑膿菌LPSに阻害され、Ｈ型
緑膿菌LPSをコートしたプレートへのHPs11の結合は、Ｇ
型およびＨ型の各緑膿菌LPSにより阻害され、Ａ型緑膿
菌LPSをコートしたプレートへのHPs12の結合は、Ａ型お
よびＦ型の各緑膿菌LPSにより阻害を受けた。これらの
結果から、ヒトモノクローナル抗体、HPs9、HPs10、HPs
11、HPs12はそれぞれＤ型とＩ型、Ｅ型およびＦ型、Ｇ
型およびＨ型、Ｅ型およびＦ型の各２種のＯ抗原を共通
に認識するモノクローナル抗体であることが確認され
た。 実施例14.ヒトモノクローナル抗体の好中球による緑膿
菌殺菌に対する促進活性試験 実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs2の
マウス好中球による緑膿菌殺菌促進活性について検討し
た。生後８周から12週のマウス（Balb/c、雌）に、１匹
当たり2mlの2.5％（w/v）グリコーゲンを含むPBSを腹腔
内に投与し、５時間後に、好中球を含む腹腔内浸出細胞
（14匹分）を採取した。好中球を含む腹腔内浸出細胞
は、氷冷下、ハンクス（Hanks）液にて２回洗浄し、１
×107個/mlの密度となるように10mMのヘペス（HEPES）
を含むハンクス液（以下HBSSと略す）に分散し、使用時
まで氷冷下に保存した。Ｅ型緑膿菌、PA103およびＦ型
緑膿菌、IID1006をそれぞれ普通寒天平板培地に播種
し、37℃で20時間培養した。増殖した菌体コロニーをか
きとり、生理食塩液に懸濁し、同液で２回洗浄した後、
波長540nmにおける吸光度が0.12となるようにHBSSに懸
濁した。調製した菌液は、使用時まで氷冷下に保存し
た。補体は、モルモット正常血清（乾燥補体、日本バイ
オテスト研究所）をHBSSにて５倍に希釈して用いた。 氷冷下に、プラスチック製試験管（ファルコン社）に
菌液を10μｌずつ分注し、これにあらかじめHBSSで25μ
g/ml、2.5μg/ml、0.025μg/mlの濃度に調整したHPs2の
40μｌと補体液の10μｌを加えて、よく混和した。次
に、好中球を含む腹腔内浸出細胞液40μｌを加えて、よ
く混和した後、37℃で２時間、回転振盪培養（200rpm）
した。培養終了時に各試験管に氷冷水900μｌを加え、
好中球を浸透圧破壊した。各試験管より100μｌをと
り、HBSSにて10倍、100倍、1000倍に希釈し、それぞれ
の希釈液を100μｌずつ普通寒天平板培地（３枚）に播
種し、37℃で18時間培養した。寒天平板培地上に生じた
コロニー数を計測し、残存菌数を求めた。対照群は各添
加液の代わりにHBSSを添加した。結果は第３表、第４表
に示されるように、HPs2は、補体存在下で好中球による
Ｅ型とＦ型の異なる２種の血清型の緑膿菌の殺菌を促進
した。 実施例15.ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対す
る防御活性試験１ 実施例１、実施例２、実施例３、実施例４および実施
例５で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs1、HPs2、
HPs4、HPs5、HPs6、HPs7、HPs8の緑膿菌感染に対する感
染防御活性について検討した。生後、８週から12週令の
マウス（Balb/c、雌）一群５匹から10匹に、マウス１匹
当たりヒトモノクローナル抗体を50ng、500ng、５μ
ｇ、50μｇを含む溶液0.2mlを腹腔内へ投与し、２時間
後に各菌株（IID1009（Ａ型）、IID1004（Ｄ型）、PA10
3（Ｅ型）、F7（Ｆ型）、P28（Ｇ型）、IID1009（Ｈ
型）、IID1010（Ｉ型）、IID1014（Ｌ型））の菌液を腹
腔内へチャレンジした。対照群にはヒトモノクローナル
抗体の代わりに生理食塩液のみを投与した。各血清型の
緑膿菌は、ハートインフュージョン寒天平板培地に播種
して、37℃で一夜培養した。増殖した菌体コロニーをか
きとり、生理食塩液にて希釈後、５％ムチンを加え、マ
ウス一匹当たり50％致死量（LD50値）の３倍から15倍の
チャレンジ菌量となるように調整し、菌液とした。緑膿
菌をチャレンジ後、７日目の各投与群のマウスの生存率
から50％有効投与量（ED50値）を求めた。結果は第５表
に示される様に、各ヒトモノクローナル抗体はそれぞれ
が反応特異性を示す２種の異なる血清型の緑膿菌の感染
に対し高い防御活性を有していた。 実施例16.ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対す
る防御活性試験２ 実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、HPs2の
緑膿菌感染に対する感染防御活性を抗体の投与時期を変
えて検討した。生後、８週令のマウス（Balb/c、雌）一
群10匹に、マウス１匹当たりのヒトモノクローナル抗
体、HPs2を0.2μｇを含む溶液0.2mlを腹腔内へ投与し、
抗体投与の24時間前、同時、１時間後、４時間後にPA10
3（Ｅ型）に菌液を腹腔内へチャレンジした。対照群に
はヒトモノクローナル抗体の代わりに生理食塩液のみを
投与した。菌液は実施例15と同様に、生理食塩液にて希
釈後、５％ムチンを加え、マウス一匹当たりLD50量の８
倍となるように調整した。緑膿菌をチャレンジ後、３日
目の各投与群のマウスの生存率を観察した。結果は第６
表に示される様に、HPs2は、反応特異性を示すＥ血清型
の緑膿菌の感染に対し、菌液チャレンジの４時間後の投
与を除いて防御活性を有していた。このことより、HPs2
は緑膿菌の感染に対し予防の効果のみならず治療の効果
も有することが明らかとなった。 実施例17.凍結乾燥製剤の調製 実施例１で得られたHPs2を1mg/ml濃度となるように0.
2％（w/v）ヒト血清アルブミン（カルビオ社）を含むPB
Sに溶解し、ポアサイズ0.22ミクロンのメンブランフィ
ルターを用いて除菌濾過した。バイアル当たり1mlを無
菌分注し、凍結乾燥して本発明の凍結乾燥製剤を調製し
た。蒸留水で再溶解し、緑膿菌に対する抗体価を測定し
たところ、活性は保持されていた。 発明の効果 本発明によるヒトモノクローナル抗体の単品、又は２
種以上の組み合わせ、あるいは他のヒト抗体と組み合わ
せることにより、緑膿菌感染症に対し優れた予防、治療
効果が達成される。 本発明で注目すべきことは、本発明による異なる血清
型の緑膿菌間で交差反応性を有するヒトモノクローナル
抗体が認識する抗原が血清型特異抗原部位であるＯ−多
糖側鎖上に存在し、さらに、このヒトモノクローナル抗
体が緑膿菌感染に対して極めて低濃度・低用量で予防お
よび治療効果を発揮することを本発明者らがはじめて見
い出したことである。さらには、単独使用での感染防御
スペクトルの拡大により、緑膿菌のＯ抗原に対するヒト
モノクローナル抗体を含む製剤の製造において、混合す
るヒトモノクローナル抗体の種類を減らすことをこのヒ
トモノクローナル抗体を使うことにより可能にすること
を本発明者らが初めて見い出したことである。 なお、特開昭61-155398公報には、本間の分類の２、
７および13型の血清型菌に対して反応性を示すヒトモノ
クローナル抗体について述べられているが、その認識す
る血清型菌はいずれも緑膿菌研究会分類、およびLanyi
の分類で同一血清型に分類され、単に同一血清型におけ
る亜系を認識する抗体と考えられ、本発明でいう複数の
異なる血清型の緑膿菌を共通に認識する単一のヒトモノ
クローナル抗体とは性質を異にするものである。 本発明で言う緑膿菌の血清型間の交差反応性を示すと
は、ヒトモノクローナル抗体が反応性を示す複数の緑膿
菌が、現在までに知られているいずれの血清型の分類方
法上においてもただ一つの血清型内に分類されない場合
を指し、ヒトモノクローナル抗体が反応性を示す複数の
緑膿菌が、特定の分類方法上においてのみ複数の血清型
に分類されるものは、本発明で言う緑膿菌の血清型間で
交差反応性を示すことにはならなず、ただ単に、同一血
清型内の亜系としての反応性を示すにすぎない。 また、本発明におけるヒトモノクローナル抗体は、免
疫グロブリンの型がＭ型またはＧ型であるが、Ａ型であ
ってもかまわないことは容易に指摘される。 規則第13規則の２の寄託された微生物への言及 寄託機関：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号 受託番号及び寄託した日付： 1.微工研菌寄第9745号 昭和62年12月７日 2.微工研菌寄第9750号 昭和62年12月９日 3.微工研菌寄第9751号 昭和62年12月９日 4.微工研菌寄第9752号 昭和62年12月９日 5.微工研菌寄第9753号 昭和62年12月９日 6.微工研条寄第1596号 昭和62年12月７日 7.微工研条寄第1598号 昭和62年12月９日 8.微工研条寄第1599号 昭和62年12月９日 9.微工研条寄第1600号 昭和62年12月９日
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/569 9282−4Ｂ 15/00 Ａ
33/577 9282−4Ｂ Ｃ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９７５３
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９７５２
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．異なる２つの血清型の緑膿菌の０−抗原を認識し、
反応することが出来るヒトモノクローナル抗体であっ
て、異なる２つの血清型がＡ型およびＦ型、Ｄ型および
Ｉ型、Ｅ型およびＦ型、又は、Ｇ型およびＨ型であるこ
とを特徴とするヒトモノクローナル抗体。 ２．微工研条寄第1598号、微工研条寄第1596号、微工研
条寄第1600号、微工研条寄第1599号、微工研菌寄第9750
号、微工研菌寄第9745号、微工研菌寄第9751号、微工研
菌寄第9753号、微工研菌寄第9752号の各細胞が産生する
特許請求の範囲第１項記載のヒトモノクローナル抗体。 ３．異なる２つの血清型の緑膿菌の０−抗原を認識し、
反応することが出来るヒトモノクローナル抗体であっ
て、異なる２つの血清型がＡ型およびＦ型、Ｄ型および
Ｉ型、Ｅ型およびＦ型、又は、Ｇ型およびＨ型であるヒ
トモノクローナル抗体を産生する自己複製細胞とそれに
由来する細胞株。 ４．自己複製細胞がエプスタイン・バー・ウイルス形質
転換細胞である特許請求の範囲第３項記載の自己複製細
胞とそれに由来する細胞株。 ５．自己複製細胞がハイブリドーマである特許請求の範
囲第３項記載の自己複製細胞とそれに由来する細胞株。 ６．ハイブリドーマが無限増殖能を有する細胞とヒト由
来の抗体産生細胞のハイブリドーマであることを特徴と
する特許請求の範囲第５項記載の自己複製細胞とそれに
由来する細胞株。 ７．無限増殖能を有する細胞がヒト由来の細胞であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の自己複製細
胞とそれに由来する細胞株。 ８．無限増殖能を有する細胞が動物由来の細胞であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の自己複製細
胞とそれに由来する細胞株。 ９．抗体産生細胞が正常リンパ細胞であることを特徴と
する特許請求の範囲第６項から第８項記載の自己複製細
胞とそれに由来する細胞株。 １０．抗体産生細胞がウイルス形質転換細胞であること
を特徴とする特許請求の範囲第６項から第８項記載の自
己複製細胞とそれに由来する細胞株。 １１．微工研条寄第1598号、微工研条寄第1596号、微工
研条寄第1600号、微工研条寄第1599号、微工研菌寄第97
50号、微工研菌寄第9745号、微工研菌寄第9751号、微工
研菌寄第9753号、微工研菌寄第9752号の各細胞である特
許請求の範囲第３項記載の自己複製細胞とそれに由来す
る細胞株。 １２．異なる２つの血清型の緑膿菌の０−抗原を認識
し、反応することが出来るヒトモノクローナル抗体であ
って、異なる２つの血清型がＡ型およびＦ型、Ｄ型およ
びＩ型、Ｅ型およびＦ型、又は、Ｇ型およびＨ型である
ヒトモノクローナル抗体を少なくとも１種含有する緑膿
菌感染症の予防、治療剤。 １３．緑膿菌感染症の予防、治療剤が液状製剤であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第12項記載の予防、治療
剤。 １４．緑膿菌感染症の予防、治療剤が凍結乾燥製剤であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第12項記載の予防、
治療剤。
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