JPS6169796A - ヒトモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 （発明の分野） グラム陰性細菌疾患及びその最も深刻な併合症、例えば
画面症及び内毒症はヒトの患者において大きな病気及び
死亡の原因である。

文献に報告されている多くのケースの検討により、グラ
ム陰性細菌による感染の症状、特に致命的症状がある種
の素因と関連していることが示される。老人患者及び深
刻な基底的医学的状態、例えば火傷、外科的外傷、遅治
性創傷、麻薬中毒、又は癌を有する患者において前記の
ような感染の頻度が増加している。これらの感染は、長
期入院している患者、そして％に外科的介入、血管内装
入、又は操作的手法例えばカテーテル排尿、肪胱鏡検査
、気管吻合、腰椎穿刺、及び医薬及び液体の静脈内注入
を受けた患者、あるいは免疫抑制剤、コルチコステロイ
ド、抗代謝剤、及び／又は抗生物質によシ長期治療を受
けた患者において、病院原因性（すなわち病院獲得性）
である。放射能療法もまた、哺乳動物をグラム陰性細菌
によシ感染にかかりやすくする。

グラム陰性細菌性疾患においてしばしば遭遇する微生物
として、エセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ凹
）、クレプシーラ・ニエーモニア（Ｋｌｅｂｓｌｓｌｌ
ａｐｎ＠ｕｍａｎｉｓ・）、エンテロパクター−アエロ
グネスプロテウス（Ｐｒｏｔｏｕｓ）、バクテロイデス
（Ｂａｅｔｅｒｏｌｄｅｓ）及びシトロバクタ−（Ｃ１
ｔｒｏｂａｃｔｅｒ）の色々な種を挙げることができる
〔ソンネンウィルス、”腸内パシルス及び類縁グラム陰
性細菌“。

７５３−７９０頁、マイクロバイオロジー（Ｍｉ　ｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇ７）＋第２版、デービス、　Ｂ、Ｄ　、
ド９ルペコ、Ｒ１、アイゼン、　Ｈ，Ｎ、　、ジンスペ
ルグ、　ｆ（、Ｓ、　、ラード、Ｗ、Ｂ、、及びマツカ
ーシー、Ｍ、、ハーノ々−及びロウ編集（１９７３）：
マツカベ、　Ｗ、Ｒ，“グラム陰性菌血症”。

アドパ・インターナ、メゾ４　、　（Ａｄｖ、　Ｉｎｔ
４ｒｎ、Ｍｅｄ、）（１９７４）１９：１３５−１５８
：及びクレガー等。

”グラム陰性菌血症Ｉ［１，６１２患者における病因、
疫学及び生態学１．アメリカン・ジャーナル・オプ・メ
ディシン（Ａｍ、　Ｊ、　Ｍ＠ｄ、）　（１９８０）す
；３３２−３４３）。さらに、シェードモナス及びクレ
ゾシラの他の種、並びに７エロモナス（Ａｓ　ｒｃｍ＠
ｎＪｕ＋）属、サルモネラ（Ｓｍ１ｍｏｎ＠ｌ１ｍ）属
、７うメパクテリ５ウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ＠ｒｉａ
ｍ）属、エルウィニア（Ｅｒｖｌｎｌａ）属、エドワー
ドシーラＱ士！慕１と１鴫）属、ペクト（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｇ）属、及びシｒう（Ｓｈ１ｇ＠ｌ１ｍ）属の
構１０成員がヒトにおけるグラム陰性細菌疾患のかなシ
の部分を担う（ソンネンウイルス、前掲：マッヵペ、前
掲；クレガー等、前掲）。

過去数１０年にわたり、抗生物質がグラム陰性細菌性疾
患の抑制医療において選択されてきた。

１５シかしながら、グラム陰性細菌性疾患に関連する連
続する流行、並びに高い発病及び死亡率は、これらの生
物による疾患の予防及び治療における抗生物質療法の限
界を示唆した。例えば、アンドリオレ、　ｖ、’ｌ’１
＠シェードモナス菌血症：抗生物質２（療法は生存を改
善するか７″、ジャーナル・オブ・ラゲラトリー・アン
ド・クリニカル・メディシン（Ｊ、　Ｌａｂ、　ＣｌＩ
ｎ、　Ｍｅｂ、）（１９７８）９４　：１９６−１９９
を参照のこと。これは代替予防及び治療法を試みた。

（従来の技術） 全細菌細胞（ｖｈｏｌｅ　ｂａｅｔｅｒｉａｌ　ｅｓ＋
１１　）又はｎａされた細菌エンドトキシンによるヒト
又は実験動物の能動免疫は、リポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）上に存在する化学的に多様な反復するオリゴ９サ
ツカライドに対して主として向けられた特異的抗体の発
生を導く〔ルダーリッッ等、′″サルモネラ及び関連エ
ンドバクテリアッセー００及びＲの免疫化学１．バクテ
リオロジカル・レピエー（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

と）（１９６６）とト１９２−２５５：及びルダーリッ
ツ等、“細菌リポポリサッカライドの単離並びに化学的
及び免疫学的特徴付け”、ミクロビアル・トキシンズ（
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｏｘｉｎｓ）　ＶＯ２４＋　１
４５−２３３頁、ワインパウム、Ｇ、カディｘ、ｓ、及
びアシル、　Ｓ、Ｊ、　ｉ集、アカデミツクプレス（１
９７７）、第１図参照のこと〕。これに関し【。

ＬＰＳ分子はすべてではないにしてもほとんどのグラム
陰性細菌の外細胞膜（ｏｕｔ＠ｒ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ）の主要な構成身分の１つであることに注目す
ることが重要である〔ニカイドー、Ｈ０＠リポポリサッ
カライドの生合成及び集成″、バクチリアル・メンプラ
ンス・アンド・ウオールス（Ｂａｃｔ＠ｒｉ凰１Ｍｅｍ
ｂｒａｎ＠ｓ　ａｎｄ　Ｗａｌｌｓ）　＋ライブ、Ｌ６
編集、マーセルデツカ−、（１９７３）：第２図参照の
仁と〕。

第１図中に、細菌の外膜に対するリポポリサッカライド
の位置を示すグラム隘性細胞壁のモデルが説明されてい
る。このモデルは莢膜（ｃａｐｓｕｌ＠）、エンペロー
ブ（ｅｎｖｅｌｏｐｓ）及び粘質層（ｓｌｉｍｅｌａｙ
ｅｒ）のごとき構造が省略されている。

リポポリサッカライドはまた、細菌エンドトキシンの一
体的構成々分であシ、ＬＰＳ分子のリピド人成分はグラ
ム陰性細菌性敗血症における又はエンドトキシンの注射
により実験的に誘発されるエンドトキシン放出に関連す
る深刻な病理生理学的効果（例えば発熱、低血圧、伝染
住血管内凝固、ショック、及び死の可能性）に寄与する
〔ウエストファル等、“細胞壁抗原及びエンドトキシン
としての細菌性リポポリサッカライドの化学及び免疫化
学”、プログ・アレルギー（Ｐｒｏｇ、　Ａｌ　ｌｅｒ
ｓｗ）（１９８３）ユニ：９−３９）。第２図は、グラ
ム陰性リポポリサッカライドの３領域を示す。〇−特特
異的領領域反復するオリゴサツカライドユニットから構
成された長鎖ポリサッカライドである。

異る細菌種におい−〔、これらのオリゴサツカライドユ
ニットは１個から６又は７個という多くのモノサッカラ
イドユニットを含有する。ＬＪＰｓの血清型（Ｓｅｒｏ
ｔｙｐｅ）決定基は分子のこの領域に配置されている。

コア（ｅｏｒｅ）領域はグラム陰性細菌相互間で比較的
変化のない配置で幾つかのモノサッカライドを含有する
。リピドＡ領域はすべてのグラム陰性細菌において実質
上同一であシ、一般にケト−デオキシオフトン酸を介し
しコア領域に結合しておシ、そしてリポポリサッカライ
ドと外膜との接合点として機能する。

タイプ特異的抗−ＬＰＳ抗体の銹導及び免疫療法的使用
は、シェードモナス・アエルギノサ〔Ｐ、アエルギノサ
（Ｐ、　ａｅｒｕｇｌｎｏｍａ）　）　Ｋ起因する疾患
の治療において最も広範に研究されている。この微生物
は抗生物質に対して高度な耐性を有するからである。抗
体は、能動的に生成するにしろ受動的に移行するにしろ
、種々の動物感染モデルにおいて保護的であることが示
されている。概観するため、ボラックＩ　ＭＨｚ　　＠
シェードモナス疾患におゆる抗体介在免疫及びその臨床
的適用“イムノグロプリンス：キャラクチリスティクス
・アンド・ユーシズ・オプ・イントラビーナス・プレパ
ラーグ、　Ｂ、Ｂ、及びフィンレインン、　Ｊ、Ｓ、編
集。

７３−７９頁、　Ｕ、Ｓ、　デノ臂−トメント・オツ・
ヘルス・アンド・ヒユーマン・サーピシス（１９７９）
を参照のこと。

おそらく一層重要なことには、感染菌株のＬＰＳ分子の
タイプ特異的部分に対する高い急性の血清抗体価がＰ、
アエルギノサ細菌を有する患者の生存に関連することが
観察されている〔ボラック、Ｍ。

及びヤング、　Ｌ、Ｓ、　、　−ヒトにおけるシ為−ド
モナス・アエルギノサの攻撃におけるエキソトキシンＡ
及びリポポリサッカライドに対する抗体の保護活性”、
“ジャーナル・オツ・クリニカル・インベスティｒ−シ
曹ン（Ｊ、ＣｌＩｎ、Ｉｎｖｓａｔ、）（１９７９）６
３：２７６−２８６］。事実、この観察が種々のグラム
陰性生物によシ惹起される大部分の画面症に拡張される
ことが見出されている〔テンナー。

Ｓ、Ｈ，及ヒマツカへ、　Ｗ、Ｒ，＃　＠グラム陰性パ
シルスによる画面症を有する患者におけるＩｇＭ及びＩ
ｇＧ抗体の効果１．ジャーナル・オプ・イン７エクシヤ
ス・ディシーズ（Ｊ、Ｉｎｆ＠ｅｔ、　Ｄｉｇ、）（１
９７６）　１３３：３７−４５：及びクラメク等、“グ
ラム陰性菌血症及び敗血症シ目ツクにおける体液性免疫
及び循環免疫複合体”、バクチリアル・エキソトキシン
ズ・アンド・ホスト・リスポンス（Ｂａｅｔｅｒｉａｌ
Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈｏ５ｔ　Ｒｅ５ｐｏ
ｎｓ・）、７９−９４頁。

アガーワル、　Ｍ、に、編集、エルセビール（１９８０
））。

抗−ＬＰＳ抗体がこのような保護をもたらす正確方法は
十分には記述されていないが、これらの抗体は細網内皮
組織系によシ、あるいはＬＪ”Ｓ含有細菌を補体介在細
胞溶解及び／又は食作用に対して感受性にすることによ
り保護をもたらすものと考えられている〔モリソン、　
Ｄ、Ｃ，及びリアン、　Ｊ、Ｌ、。

“細菌エンドトキシン及び宿主免疫応答”アドパ。

イムノロ、　（Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）（１９７
９）　２８　：２９３−４５０）。おそらく、上記の保
護機構の１つ又は組合わせが深刻なグラム陰性細菌性疾
患において機能するであろう。

１９７５年に、コーラ−及びミリスタインは、ある種の
マウスセルラインがマウス牌細胞と融合し【純粋な“モ
ノクローナル”抗体を分泌するハイツリドーマを形成す
るという彼らの発見を報告し九〔コーラ−２Ｇ、及びミ
リスタイン、Ｃ０゛所定の特異性の抗体を分泌する融合
細胞の連続培養”。

ネイチェアー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７５）２５６：４
９５−４９７〕。

アブストラクト・オプ・ザ１９８２インターサイエンス
・コンフェレンス・オン・アンチミクロビアル・エーゼ
ンッ・アンド・ケモセラヒ−Ｃｈ＠ｍｏｔｈ＠ｒａｐｙ
）の１１０頁に報告された１９８２年のアブストラクト
（÷２５３）において、Ｊ、サド７等は、Ｐ、アエルギ
ノサの特定の株（血清型）のｔ、ｐｓ分子のオリゴサツ
カライド決定基に対して向けられた１ｇＭクラスのマウ
ス（ネズミ）モノクローナル抗体のハイツリドーマ技法
による生産、及びこのネズミモノクローナル抗体がＰ、
アエルギノサ細菌の同じ株〔すなわち相同（ｈｏｍｏｌ
ｏｇｏｕｓ）株〕の致死的チャレンジに対してマウスに
保護を与えることを報告した。

発明の概要 新規な形質転換されたリンパ球セルライン及びヒトモノ
クローナル抗体が提供され、このセルライン及び抗体は
グラム陰性細菌の外細胞膜のリポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）分子上の幾つかの血清型決定基に特異的に結合す
る。このモノクローナル抗体は、相同グラム陰性細菌の
致死的チャレンジに対する哺乳動物の保護のために使用
され、そしてヒトにおけるグラム陰性細菌の病原生理学
的効果の治療的及び／又は予防的装置を可能にする。

具体的な記載 接近可能なリポポリサッカライド分子に対して特異的な
保護的ヒトモノクローナル抗体を産生ずる形質転換され
たリンノ４球細亀が提供される。

１接近可能（ａｃｃｅｓ１ｂｌ＠）　’なる語は、ｔ、
ｐｓ分子が使用の環境においてモノクローナル抗体との
直接的相互作用のために物理的に利用可能であることを
意味する。この定義によシ、グラム陰性細菌から周囲環
境に与えられるＬＰＳ分子が特異的モノクローナル抗体
と直接的に相互作用することができ、そし【細網内皮組
織系を介して排除されるであろう。これに関し【、モノ
クローナル抗体は、種々のグラム陰性細菌に因る深刻な
疾患の処置において役立つと予想される。さらに、グラ
ム陰性細菌の外表面に存在するＬＰＳ分子は特異的七ノ
クローナル分子と直接的に接触することができ、そして
細菌の補体介在溶解（ｅｏｍｐｌｅｍｓｎｔ−ｍｅｄｉ
ａｔｅｄｌｙｓｌｍ）及び／又は食作用（ｐｈａｇｏｅ
ｙｔｏｓｉｍ）の用意をするであろう。

この発明に関する細菌はさらに１食作用細胞によシ（抗
体によシオプノニン作用を受けそしてそのような細胞に
よシ摂取される場合）又は相同性抗体（ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓ　ａｎｔｌｂｏｄｙ）及び補体のごとき血清成分
との直接的相互作用によシ（これらの機構はこれらの生
物の除去において臨床的に重要であることが知られてい
る）破壊されるものとして定義することができる。ＬＰ
Ｓ分子への直接的［接近性（ａｃｅｓ＋５ａｉｂｉｌｉ
ｔｙ）　Ｊを制限し又は阻害する細菌性構造、例えば莢
膜、エンベロープ又は粘質膜はこの発明の有用性を減少
するように関与するかもしれない。このような構造を含
有する細菌の例には莢膜を有するクレブシラ（Ｋｌｓｂ
ｓｌａｌｌａ・）の種及びエンベロープを有するニジエ
リシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅｏｌｉ　）
が含まれる。

この発明の範囲を限定することを意図しないが、深刻な
ヒトの疾患における病因関与の観点から特に興味ある幾
つかの属及び種を特定することができる。これらは広く
、グラム陰性生物の３つの科。

スナわち二ンテロバクテリアセー ロバクテリアセーには、例えばエセリヒア・コリ；クレ
ブシラｓｐ、　、例えばに、ニエーモニア（【。

ンテロバクターｓｐ２例えばＥ、アエログネス（１ｍａ
ｒｃｅｓｃａｎｓ）　ニブロチウス＠ｐ、例えばｐ、ブ
ルガリス（ｐ、ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ｐ、ミラビリス（
Ｐ−ｍ１ｒａｂｌｌｌｓ）、Ｐ、レチｒす（Ｐ、ｒｅｔ
ｔｉｇ＠ｒｔ）　、及び２１モルガニ−（Ｐ、ｍｏｒｇ
ａｎｉｉ）　：プロビンデンシア・スツアルテイー−（
ＣＩｔｒｏｂａｅｔ＠ｒ）　ｓｐ、　（ソンネンウイル
ス、前掲：マッカベ、前掲；及びクレーガー等、前掲）
が含まれる。代表的なシェードモナダセーには、Ｐ、ア
エルーノサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ、シｚ
　　Ｇ”’ｆレイ（Ｐ、ｐ＠ｅｕｄａｍａｌｌｅｉ）、
Ｐ、ｆｆレイ（Ｐ、ｍａｌｌｅｌ）、Ｐ、　　フルオレ
センス（Ｐ、　ｆ　ｌｕｏｒｓｎｅｎｇ）、Ｐ、プチダ
（Ｐ、　ｐｕｔｌｄａ）、Ｐ、セノ臂シア（Ｐ、ｃｅｐ
ａｃｉｍ）、Ｐ、ストルツェリ（ｐ。

５ｔｒｕｔ＠ｒｌ）、Ｐ、マルトフィリア（Ｐ、ｍａｌ
ｔｏｐｈｉｌｉｍ）が含まれる〔ジラージ、　Ｇ、Ｌ、
　、“臨床微生物におけるシェードモナス種”、出、シ
ナイＪ、メト（黒。

５ｌｎａｌ　Ｊ、　Ｍａｄ、）（１９７６）４３　：　
７１０−７２６）。

他の同等な生物に対する保護も、この発明によシ同様に
達成することができる。

上記のシェードモナスの種はこの発明の好ましい適用を
代表し、Ｐ、アエルギノサに最も好ましく適用される。

グラム陰性細菌の特定の種の中に多数の免疫学的に区別
し得る株又はタイプが存在することが知られている。多
くの場合１株又はタイプ間又は内の相違はｔ、ｐｓ分子
の抗ｉ構造の差異、そして特にＬＰＳ分子の〇−特異的
側鎖（第１図参照のこと）内の構造的差異と関連付ける
ことができる。すなわち、構造的に異る〇−特異的側鎖
は異る抗原構造を提供する。このような抗原的差異の免
疫的認識は、与えられた抗原的変種（ａｎｔ１ｇ＠ｎｉ
ｅマａｒｌ＠ＬＬｏｎ）に特異的な抗体の生成をもたら
す。このような抗体を用いて１つの抗原的変種と他の抗
原的変種とを血清学的に識別する（すなわち、凝集、Ｉ
：ＬＩＳＡ等によって）場合、このようにして認識され
る抗原的変種を血清型（セロタイプ。

ｇｓｒｏｔｙｆｌりと称し、そしてこれは血清型決定基
を表示するものと言われる。従って、ＬＰ８分子の０−
％異的側鎖は血清梨抗鳳決定基を提供する。

この発明はＬＳＰ分子上の血清型決定基に対するヒトモ
ノクローナル抗体を提供するから、この発明はタイプ特
異的、すなわち種内で特定のタイプのＬＰＳ分子に特異
的な抗体を提供することができることが当業者によシ認
められよう。

種々の血清型の検討において、タイプ分はスキームを用
いるのが有用である。このようなタイプ分はスキームの
例としてＰ、アエルギノサのそれを挙げることができる
。Ｐ、アエルギノサについてのフィッシャーのタイプ分
は系はよく知られておシ、そしてフィッシャー等、“保
護抗原を基礎にするシェードモナス・アエルギノサにつ
いての新イムノタイグスキーム１．ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　（
１９６９）　９８　：　８３５−８３６に詳細に記載さ
れている。この系は、既知のＰ、アエルギノサ大部分を
７タイプに分類する。

すなわちフィッシャー・イムノタイプ１、フィッシャー
・イムノタイプ２、フィッシャー・イムノタイプ３．フ
ィッシャー・イムノタイプ４、フィッシャーイムノタイ
プ５、フィッシャー・イムノタイｆ６、及びフィッシャ
ー・イムノタイプ７である。同様に、Ｐ、アエルギノサ
についてのインターナシ目ナル・アンチダニツク・タイ
ピング・スキーム（ＩＡＴＳ）系〔プロコツブ、　Ｃ，
Ｄ、及びファー・マー、Ｊ、Ｊ、、ＩＩ、＠シェードモ
ナス・アエルギノサのタイプ分は方法′、シ鳥−ドモナ
ス・アエＡ’ｄｆノサ：クリ二カル・マニフェステーシ
コンズ・オブ・イン７エクシ冨ン・アンドーカレントー
セラフイＴｈｅｒａｐｙ）、　８９−１３３頁、ドｌ”
ット、Ｒ，Ｇ、＠集。

アカデミツク・プレス、１９７９を参照のこと〕は、Ｉ
ＡＴＳタイプ１、ＩＡＴＳタイプ２等と称する１７の血
清型を与える。フィッシャー〔ハネシアン、Ｓ。

等、“新規な７価のシェードモナスワクチンの抗原成分
の単離及び特徴付け′、ネイチーアー（１９７１）２ヱ
旦：２０９−２１０）及びＩＡＴＳタイプ分は系（プロ
コツブ及びファーマー、線温）のいずれについても、両
血清屋スキームに関する抗ス決定基はＬＰＳ分子上に存
在することが示されている。両タイプ分は系の比較及び
相互開基を第１第　　　　１　　　　表 Ｐ、アエルギノサについての２攬類のタイプ分は系の比
較 ２３．７ ５３．７ １６　　　　　　　３　、７ マー モノクローナル抗体は、対応するグラム陰性細菌に暴露
されているか又は暴露、されたことのあるヒト供与体か
ら得られ九Ｂ　ＩＪンパ球細胞の細胞ドライブン（ｃｅ
ｌｌ−ｄｒｉｖｅｎ）エプスタイン−パール−ウィルス
（ＷＨＶ）形質転換により生産される。このようにして
得られた抗体分泌セルラインは、２倍体核型（ｄｉｐｌ
ｏｉｄ　ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）を有する連続的に増殖す
るリンポプラストイド細胞として特徴付けられ、エグス
タインーバールス核抗ｉ　（ｇＥＮＡ贋性でわシ、そし
てＩｇＧ　、　　ＩｇＭ　、　Ｉｇｋ　、又はＩｇＤア
イソタイグ（サブタイプＩｇＧ１　、　ＩｇＧ２　、１
ｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）のモノクローナル抗体を分
泌する。細胞ドライブン形質転換法それ自体はＭ、Ｌロ
ストロムの発明であり、そして米国特許第４．４６４，
４６５号に詳細に記載されている。モノクローナル抗体
はそのままで、又は断片、例えばＦａｂもしく　ＦｉＦ
　（ａ　ｂ　’　）２として使用することができ、通常
はそのまま使用する。ある場合には、特定の結果を達成
するために抗体を他の化合物と組み合わせるのが望まし
い。例えば、抗体を細胞変性剤、例えば放射性核種、抗
生物質等と組み合わせることができる。

この発明のモノクローナル抗体を製造するためのこの方
法の適用を次の例により説明する。これらの例は、この
発明の代表的な態様を説明するためのものであシ、この
発明の範囲を限定するものではない。

実験 例１゜ 例１は、Ｐ、アエルギノサ・フィッシャー・イムノタイ
プ２　（ＩＡＴＳタイプ１１）のＪＳ分子に対するヒト
モノクローナル抗体の製造方法を示し、そしてさらに相
同法（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　５ｔｒａｉｎ）の致死的
チャレンジに対する級抗体の保護活性を示す。

Ａ、適切なヒト細胞の取得 適切なヒトＢ−細胞（リンパ球）を、のう色性線維症を
有したことがらシ、セしてＰ、アエルギノサによる感染
を受けたことがおることが知られている病気の個体の膵
臓から得た。剖検によりて得られ九膵臓を約１５ｍの厚
さの断片に切断した。

注射器に取り付けた１８−ｒ−ジ針を通して各断片にカ
ルシウム／マグネシウム不吉リン酸緩衝化塩溶液（ＣＭ
Ｆ−ＰＢＳ）を潅流することによシ細抱を被膜及び結合
組織から大形のベトリ皿に遊離せしめた。単核細胞を膵
臓細胞調製物から、フィコルーバク（Ｆｉ　ｃｏ　１１
−Ｐａｑｕｅ　）上での標準的遠心分離技法により分離
し〔がエム１人、、”ヒト血液からの単核細胞及び顆粒
球の単離”、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・ク
リニカル・アンド・うゲラトリー８９〕、そし？　ＣＭ
Ｆ−ＰＢＳ中で２回洗浄した。

改変Ｅ−ロゼツト法により単核細胞からＦｉ胞を涸渇さ
せた。要約すれば、細胞をまず４℃において２０％のウ
シ胎児血清（Ｆｅ２）を含有するＰＢＳ中にＩ　Ｘ　１
０’細胞／−の濃度に再懸濁した。次に、この懸濁液１
ｄを１ＯＸＩ００諷のポリスチレン丸底チェープに入れ
、これに２−アミノーエチルーイソチオウロニウムプロ
ミド（Ａｇ′ｒ）で処理された羊赤血球細胞１×１０９
個（ＲＰＭＩ　１６４０培地中１０ｖｌｖチ溶液から）
を加えた〔マドセン、Ｍ、及びジ四／ソン＋）（１ｇ−
＋”ＡＥＴ処理された羊赤血球細胞を用いるＥ−ロゼツ
ト形成の方法論的研究″、レジャール・オプ・イムノロ
ジカル・メンズ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）（１９７９）２７　：６
ｌ−７４）。この懸濁液を４℃にて５〜１０分間非常に
おだやかに混合し、そして次にフィコルーバク上で２５
００′４．４℃にて８分間遠心分離することによりｇ−
ロゼツト形成した細胞を除去した。界面にバンドを形成
するＥ−ロゼツト形成陰性の牌単核細胞（Ｅ−８ｐｌ）
をＲＰＭ１１６４０培地中で１回洗浄し、セして１５ｖ
／ｖ　％のＦｅ２　、　Ｌ−グルタミン（２ｍ　ｍｏｌ
／ｌ　）　。

ピルビン酸ナトリウム（１ｍ　ｍｏｌＡ　）　、ペニシ
リン（１００Ｉ眸）、ストレプトマイシン（１００μル
薊）、ヒポキサンチン（ＩＸＩＯ”−’Ｍ）、アミノグ
チリン（４Ｘ　１０−’Ｍ）及びチミジン（１，６Ｘ１
０−５Ｍ）を含有する同培地に再懸濁した。この培地を
今後ＨＡＴ培地と称する。

以Ｔ奈白 Ｂ、細胞の細胞−ドライプン形質転換 ｇ−８ｐｌ細亀の細胞−ドライプン形質転換は、ｇ−ｓ
ｐｔ細胞と形質転換セルラインとを同時培養（ｃｏｅｕ
ｌｔｉマａｔｉｏｎ）することにより実施した。形質転
換セルラインはニススタイン−１４−ル核抗原（ＥＥＮ
Ａ）陽性ヒドリンポプラストイドセルラインであシ、こ
のセルラインは、ＧＭ　１５００リンポプラストイドセ
ルラインをエチルメタンスルホネート（謳）で変異処理
し、そして次に３０μｇ〜の６−チオグアニンの存在下
で選択して、細胞をヒＩキサンチンーグアニンホスホリ
？ジルトランスフェラーゼ（Ｉ（ＧＲＲＴ）欠損、そし
てそれ故にＨＡＴ感受性にすることによって誘導したも
のである。このセルラインはｌＡ２セルラインと命名さ
れ、そし【１９８２年３月２９日に、ＡＴＣＣＡ　ＣＲ
Ｌ　８１１９としてＡＴＣＣに寄託された。対数増殖期
にあるＩＡ２細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、そして次に１
人２細胞とＥ−８ｐｌ細胞との比較を３０としてε−５
ｐｔと一緒にした。この細胞混合物を、平底９６ウ工ル
ミクロタイタープレート１０枚に、ウェル当り２００μ
ｌの容積中１５５，０００細胞／ウエルの濃度でプレー
トし、そしてこの培養物を６嘩のＣＯ２を含有する加湿
環境中で３７℃にてインキエペートした。３〜４日ごと
に、培養物の上清液の半分を新鮮なＨＡＴ培地と取シ代
えた。ウェルを倒立顕微鏡上で隔日に細胞増殖の徴候に
りいて観察した。細胞をグレートして２週間後及びＩＡ
２細胞がＨＡＴ選択のために死滅した後、アミノプテリ
ン成分を欠くほかＨＡＴ培地と同一の組成の新しい培地
を細胞に与えた。グレートしてから１８日後に、約７０
％のウェルが増殖中の細胞を含むこと、及びほとんどの
ウェル中で細胞が上清液を取シ出しそして抗−Ｐ、アエ
ルキノサ抗体について試験するために十分な濃度にある
ことが観察された。

Ｃ０特異抗体分泌細胞の検出 上？！Ｎｉｌ、エンデイムリンクドイムノソルベントア
ッセイ（ＩＬＩ　８人）技法〔エングバル、ε、、＠微
生物学における定量的エンデイムイムノアッセイ（ＥＬ
ｊＳＡ）　’　、メディカル・パイオロ・（Ｍｓｄ、Ｂ
ｉｏｌ、）（１９７７）５５：１９３−２００　）を用
いて抗−Ｐ。

アエルギノサ抗体の存在についてスクリーニングした。

抗原プレートは平底９６ウエルミクロタイタープレート
から成シ、そのウェルは該エウルの底にエタノール固定
した種々の全縮Ｊ＠　（ｖｒｈｏ　ｌｅｂｍｅｔｅｒｌ
ｍ）を収容する。このプレートは次のようにして調製し
た。すなわち、ＰＢＳ中洗浄細菌懸濁液（００６６ｏ＝
０．２　）　５０μ！をウェルに加え、プレートを５０
０Ｘ、ｐにて２０分間遠心し、　ＰＢＳを吸引し、７５
μノのエタノールを加えて１０分間処理し、エタノール
を除去し、そして空気乾燥した。スクリーニングに次の
ような種々の抗原グレートを使用シタ。（１）Ｐ、アエ
ルギノサ、フィッシャーイムノタイプ１〜３　（ＡＴＣ
ＣＡ　２７３１２　、Ａ　２７３１３　、墓２７３１４
　）の混合物：（２）Ｐ、アエルゼノサ、フィッシャー
イムノタイプ４〜７　（ＡＴＣＣＡ　２７３１５　、＆
２７３１６゜Ａ　２７３１７、ム２７３１ｇ　）　：　
（３）エシェリヒア・コブの臨床分離株；（４）クレブ
シラ・ニエーモニ７（ＡＴＣＣム８０４７　）　：及び
（５）細菌を伴わないミクロタイターグレート。

１ｉ：Ｉ、ＩＳＡ法のため、抗原プレートのウェルをま
ず７５μ！０５　％　ＢＳＡＫよ９１時間ブロックして
蛋白質の非特異的結合を防止した。未吸着ＢＳＡを除去
した後、カルテ為アープレートのウェルからの上清液を
抗原プレートの対応するウェルにレプリカプレートしく
５０μｌ／ウエル）、そしてプレートを加湿チャンバー
中３７℃に″′Ｃ３０分間インキーベートした。次に上
清を除去し、ウェルを１　％　ＢＳＡ−ＰＢ８で３回洗
浄し、そして５０μノのピオチン化やぎ抗−ヒト免疫グ
ロブリン（Ｉｇ）（１％ＢＳＡ−Ｐｕｓ中に稀釈された
りが（Ｔａｇｏ）す２５９３）を各ウェルに加えた。加
湿チャンバー中３７℃にて３０分間インキエペーシヨコ
ンた後、ビオチン化抗−ヒトＩｇを除去し、ウェルをＩ
Ｉ％ＢＳ人−ＰＢＳで３回洗浄し、そして５０μノのあ
らかじめ調製したアビジン：ピオチン化ホースラディッ
シェ／４’−オキシダーゼ複合体（ベクタスタインＡＥ
Ｃキット、ベクトルラデラトリーズ社、パーリンガム、
カリホルニア）を各ウェルに加えた。室温にて３０分間
インキユペートシた後、過剰のベクタスタインＡＢＣ試
薬を除去し、ウェルを再度１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗
浄し、そして１００μｌの基質（１００ｒｒ＋Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ５，０）中０．８１−のオ／Ｌ／）−フ
ェニレンジアミンニ塩酸塩、及び脱イオン水中０．０３
％Ｈ２Ｏ２をプレート直前に等量ずつ混合する〕を各ウ
ェルに加えた。暗中で３０分間インキエベートした後、
３　Ｎ　ＯＨ２Ｓｏ４溶液５０μ！を各ウェルに加えて
反応を停止させた。プレートの抗原に対応する抗体を含
有する培養上清液を対応するウェル中での陽性発色によ
り検出し、そして反応の強度をダイナチクＭＲ５８０ミ
クロＥＬＩＳＡリーダー上で４９０　ｎｍにおける吸収
を測定することにより定量した。

上記の方法による培養上清液の分析が、フィッシャーイ
ムノタイプ１〜３に対する抗−Ｐ、アエルキノサ特異性
を有するがフィンシャーイムノタイプ４〜７又は対照プ
レートに対して特異性を有しない３個のウェル（６Ｆ１
１．４Ｇ９、及び１０Ｂ２）Ｄ同定を導いた。認識され
る特異的フィンシャーイムノタイプを同定するために、
１種類のみのフィッシャーイムノタイプのエタノール固
定細菌を収容する抗原プレートを、各イムノタイプにつ
いて上記のようにして調製した。ウェル６Ｆ１１　、　
４Ｇ９及び１０Ｂ２からの培養上清液を用いて、個々の
イムノタイププレート上で上記のＥＬＩ　ＳＡ測測定行
ったところ、これら３つのウェルがフィッシャー２イム
ノタイプに特異的な抗体を含むことが示された。

ウェル６Ｆ１１．４Ｇ９、及び１０Ｂ２中の細胞を、フ
ィッシャー２イムノタイプ抗原プレート上で上記のＥＬ
　Ｉ　ＳＡ法によシ測定されたすべてのクローン化上清
液が陽性反応をもたらすまで、複数ラウンド（２又は３
）のクローニングにかけた。平底９６ウエルプレート中
ヒト包皮線維芽細胞の半一フルアンド層上での限界稀釈
法により細胞をクローン化した。１５　ｖ／ｖ％Ｆｃｓ
　、　Ｌ−グルタミン（２ｍ　ｍｎｌ／ｌ＞　、ピルビ
ン醸ナトリウム（１ｍ　ｍｏ４／Ｊ）。

ペニシリン（１００ＩＵ／Ｍ）、及びストレプトマイシ
ン（１００μ１１１１）を含有するＲＰＭＩ　１６４０
から成る培地を使用した。培養物の上清の半分ずつを３
日ごとに新鮮な培地で置換した。一般Ｋ、ウェルは、抗
−フィッシャー２イムノタイグ特異性の分析のためにプ
レートして２〜３週間後十分なリンポプラストイド細胞
湿度となった。

従って、この実験において、連続性（不滅性）で１）そ
してそれぞれがフィッシャーイムノタイプ２Ｐ、アエル
ギノサのＬＰＳ分子上の血清型決定基に対するヒトモノ
クローナル抗体を分泌する３種類の形質転換され九クロ
ーン化ヒトセルラインが確立された。この例、及びこの
後の例においてセルライン及び該セルラインが産生ずる
抗体に同じ名称を付す。

６Ｆ１１と称する形質転換された連続性ヒトセルライン
は、こと特許出願の出願前に、アメリカン・タイプ・カ
ルチエア・コレクシ璽ン、ロックビレ。

順にＡＴＣＣＡＣＲＬ　８５６２として寄託された。

各クローンからのモノクローナル抗体が単一の（この場
合、フィッシャー２）イムノタイプと排他的に反応した
事実は、抗体がリポポリサッカライド抗原に対して向け
られていることを示唆した。

ＬＰＳ血清型はフィッシャーイムノタイプ系と関連する
からである〔）・ネジアン、ネイチェアー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（二＄−バイオロジー）（１９７１）２２９：　２
０９−２１０）。これをさらに試験するため、Ｐ、アエ
ルギノサ、Ｐ、アラレオファシェンス（Ｌａｕｒｅｏｆ
ａｅｌｅｎｓ）、Ｅ、コリ０１１１：Ｂ４のＪｆｉ異株
、及びグロピデ／シア・スツアルテイー（Ｐｒ　ｏマ１
ｄｅｎｅｉａｓｔｕａｒｔｉｉ）の臨床分離株の１７の
ＩＡＴＳ血清凰血清古株全固定細胞プレート上で、６Ｆ
１１．４Ｇ９、及び１０Ｂ２上清液を用いて拡張された
ＥＬＩＳＡ試験を行った。フィッシャーイムノタイプと
ＩＡＴＳスキームにおけるそれらの対応するＬＰＳを基
礎にした血清型（第１表を参照のこと）との比較の完全
な一致において、抗−フィッシャーイムノタイプ２クロ
ーン上清液のそれぞれはＩＡＴＳ　１１株とのみ反応性
でＩｐツた。非−Ｐ、アエルギノサ細菌のいずれとも反
応が観察されなかった。

３種類のヒト抗−フイツシャーイムノタイプ２モノクロ
ーナル抗体の内の１つをさらに特徴付けた。対応するセ
ルラインのＥＬＩＳｋにおける抗体との強い反応性及び
良好な増殖特性に基いて、６Ｆ１１を選択した。

６Ｆ１１抗体によフ認識される分子種の生化学的特徴付
けをイムノプロット分析によシ行った。要約すれば、７
種類のフィッシャーイムノタイプのそれぞれからの粗Ｌ
ＰＳ　（熱フェノールー水法；ウエストファル、Ｏｌ等
、′″フエノール／水よる細菌の抽出”、ツアイトシエ
リフト・フェール・ナトウ−Ａ／　７　＃　ルシ＄ンク
（Ｚ、ＮａＬｕｒｆｏｒｓｅｈ、）（１９５２）７９：
１４８−１５５にヨり調製されたも（Ｄ　）　２０　ｔ
ｔ９、Ｅ−＝ｒ　ｖ　０１１１：Ｂ４及Ｑ；クレプシラ
・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｓｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉｍ）からのクロマトグラフ精製されたＬＰＳ　（い
ずれも、リストラゲラトリーズ。

キャンベル、カリホルニアより）２０μｇ、並びにフィ
ッシャーイムノタイプ２細菌の外膜調製物〔タム、　Ｍ
、Ｒ，等、１モノクロ一ナル抗体を用いるナイゼリア・
ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
ａｅ）の血清学的分類”、インフエクシコン・アンド・
イムニテ４　　（Ｉｎｆａｅ、　Ｉｍｎｕｎ、）（１９
８２）ユ６：１０４２−１０５３）５０μｇをそれぞれ
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）−ポリアクリルアミ
ドグル電気泳動にかけた〔）・ン−ｘ　り、　Ｒ，Ｅ、
Ｗ。

及びカレイ、　Ａ、Ｍ、、　”　−／　＄−トモナス−
７エルギノサの外膜：熱及び２−メルカプトエタノール
−変性蛋白質″、レジャール・オプ・バクテリオロジー
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）（１９７７）　１４０　
：９０１−９１０〕。分離された分子量をグルからニト
ロセルロース膜（ＮＣＭ）に移し〔この方法は、トウビ
ン。

Ｈ６等、′ポリアクリルアミドグルからニトロセルロー
スシートへの蛋白質の電気泳動的移行″、プロシーディ
ンゲス・オブ・ザ・ナシ冒ナル・アカデミ−・オプ・サ
イエンシス・オプ・デ・ユナイテッド・スティソ・オブ
・アメリカ（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。

に記載されている〕、そし？ＮＣＭプロットをＰＢＳ−
トゥイーン中で１時間ブロックした〔パッチイガ−１Ｂ
１等、“ニトロセルロース膜に移された蛋白質の免疫的
検出におけるブロッキング剤としてのトゥイーン２０の
使用”、ジャーナル・オプ・イムノロシカＡ／・メンズ
（Ｊ、　Ｉｍｎｕｎ、Ｍｅｔｈ）　（１９８２）５５：
２９７−３０７〕。次にプロットを、６Ｆ１１セルライ
ンからのスペント培養上清液３−を含有する３０−のＰ
ＢＳ　−）ウィーン中で、室温にて１時間インキエベー
トした。ＴＢＳ−）ウィーン中で５分間ずつ４回すすい
だ後、プロットを、ラビット抗−ヒトｒｇの１：５００
０稀釈物（ＰＢＳ　−）ウィーン中）中で室温にて１時
間インキエペートシタ。

プロットをＰＢＳ　−）ウィーン中で４回洗浄し、そし
て次にプロティンＡ−ホースラディツシュパーオキシダ
ーゼ（チミドラ？ラドリーズ社、サン７ランシスコ、Ｃ
Ａ）の１：２０００稀釈物（ＰＢＳ−トゥイーン中）を
含有する溶液３０−に入れた。室温にて１時間インキエ
ペートした後、プロットをＰＢＳ　−）ウィーン中で４
回すすぎ、そして次に、下記のようにして調製した基質
６０−に浸漬した。

ｆｆｘわち、１２０ダのホースラディソシエバーオキシ
ダーゼ発色試薬（ビオ−ラドラボラトリーズ。

リッチモンド、カリホルニア）を４０ｄの冷メタノール
に溶解し、他方１２０μｌの３０％Ｈ２ｏ２を２００ｄ
のＴｒ１ｇ緩衝化塩溶液（ＴＢＳ−２０ｍＭ　Ｔｒｉｍ
。

ｐＨ７，４、０，５ＭＮａＣ６）に加え、そしてこれら
２穏類の溶液をプロットに添加する直前に混合した。

適当な発色の後（通常、基質を添加した後１５〜４５分
間）、プロットを脱イオン水で数回洗浄すること罠より
反応を停止した。

結果は下記の通シであった。陽性反応は、フィッシャー
イムノタイプ２粗ＬＰＳ及びフィッシャーイムノタイプ
２細菌の外膜調製物を含むトラックにおいてのみ見られ
た。これらのトラックのいずれにおいても、６Ｆ１１抗
体は規則的に配置された一連の分子種を認識し、イムノ
プロット上にはしご状のノ々ターンを示した。このプロ
フィールはＳＤＳの存在下でのＬＰＳのポリアクリルア
ミドグル電気泳動分析で見られるパターンと完全に一致
した。

この電気泳動においては、バンドによって示される不均
一なサイズのプロフィールが分子当ｐ存在する〇−抗原
オリゴサッカライド側鎖ユニットの数に相当する分子量
の段階的増加により異るＬＰＳ分子の集団に基〈ことが
証明されている。〔バブラ、　Ｅ、Ｔ、及びマケラ、　
Ｐ、Ｈ，、”ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルア
ミドグル電気泳動によシ分析されたサルモネラ・チビム
リウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙ　ｐｈ　Ｉｍｕ　ｒ
　ｉ　ｕｍ）中のリポポリサッカライドの不拘−性＃、
ヨロピアン・ジャーナル・オグ・バイオケミストリー（
Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　（１９８０）　１
０７　：１３７−１４３：並びにゴールドマン、　Ｒ，
Ｄ、及びライペ１Ｌｓ１＠エシェリヒア・コリ０１１１
及ヒサルモネラ・チビムリウムＬＴ２からのリポポリサ
ッカライド中の抗原性側鎖長の不均一性”、ヨーロピア
ン・ジ゛ヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ
。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｓｍ、（１９８０）１０７：１４５−１
５３）。

要約すれば、これらのデータは、モノクローナル抗体６
Ｆ１１の血清学的特異性がフィッシャーイムノタイプ２
細菌のＬＰＳ分子に対して向けられていることを示す。

さらに、ＬＰ８分子の血清学的特異性は反復するオリゴ
サンカライドユニット及び／又はそのグリコシド結合の
構造に基く〔ウニストンアル等、プログ・アレルギー（
Ｐｒｏｇ、Ａ１１ｏｒｇｙ）（１９８２）３３：９−３
９）から、上記のデータは、モノクローナル抗体６Ｆ１
１が、コア領域及びリピドＡによって代表されるＬＰＳ
の血清学的に保存された構造に対してではなく、むしろ
オリゴサツカライドユニットのある部分又は該ユニット
間の結合に対して特異的であることを示す。

６Ｆ１１モノクロ一ナル抗体のアイソタイプを前記の特
異性試験に類似するＥＬ　Ｉ　ＳＡ測測定おいて決定し
た。但し、第２段階の試薬として一層広い反応性を有す
るビオチン化やぎ抗−ヒト■ｇの代りにビオチン化やぎ
抗−ヒ）ＩｇＧ（ｆｆンマー鎖特異的。

タボ）又はビオチン化やぎ抗−ヒ）ＩｇＭ（ミーー鎖特
異的、タゴ）を使用した。両試薬を１　：５００の稀釈
において使用し、そして抗原グレートにはエタノール固
定したフィッシャーイムノタイプ２細菌を含有せしめた
。６Ｆ１１抗体とフィッシャーイムノタイプ２細菌との
陽性反応が抗−１ｇＭ試薬を用いた場合にのみ観察され
、モノクローナル抗体がＩｇＭアイソタイプであること
が示された。この例の方法を数回反復した。こうして得
られたＬＰＳ−特異的モノクローナル抗体のアイソタイ
プを決定したところ、幾つかはＩｇＭアイソタイプであ
り、そして幾つかはＩｇＧアイソタイプであった。

Ｆ・　イン−ビトロ活性 ６Ｆ１１モノクロ一ナル抗体のイン−ビトロ機能活性を
オプソニン食細胞測定（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｅｙｔ
ｆｃａａａａ７）により測定した。この方法においては
、　６Ｆ１１モノクロ一ナル抗体が存在する場合又は存
在しない場合における補体の存在下でのヒト好中球によ
る放射能ラベルされた細菌の取り込みを比較した。

放射能ラベルされた細菌は、５ｗ１ｌのシェードモナス
最少培地〔アララード及びスネル、第７章゛増殖におゆ
る生化学的因子１．マニーアル・オプ・メンズ・フォア
・ゼネラル・バクテリオロジガーハート、Ｐ０等編集、
アメリカン・ソシェティー・フォア・マイクロバイオロ
ノー、ワシントンＤＣ，１９８１，７９−１１１Ｘ）に
、１００Ａｌ（１μＣＩ）ノ３Ｈ−ロイシン（１４６，
５Ｃ１／ｍｍｏＡｆ、　　＝　＄−イングランドニ為り
レア、メストン、ＭＡ）及びフィッシャーイムノタイプ
２Ｐ、アエルギノサのトリブチカーゼソイプロスでの一
夜培養物３０μｌを接種することにより行った。テエー
プを３７℃にてシェーカー上で４〜６時間時間インキ−
ベートこの後、０．１％ゼラチン及び５　ｍＭ　ＨＥＰ
ＥＳを含有するノ１ンクの平衡塩溶′ｏ、（ＨＢＳＳ／
Ｇｅｔ）　（ｐＨ７，２）中で４回洗浄することによシ
過剰の５Ｈ−ロイシンを除去した。各洗浄ごとに細菌を
９５０Ｘ、９にて１０分間遠心し、そして最終濃度が６
．６７　Ｘ　ｌ　ｏ６，４となるようにｆ（ＢＳＳ／Ｇ
ｅ　１中に再懸濁した。ヒト好中球を、ファン・ファー
ス及びファン・ツエットの方法〔１多形核食細胞及び単
核食細胞による食細胞作用及び細胞内殺作用のイン−ビ
トロ決定”、）・ンドブノク・オプ・エクスペリメンタ
ル・イムノロソー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｆｉ：ｘ
ｐｅｒｉｍｅｎＬａｌ　ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９
７３）　Ｖｏ１２．、Ｄ、Ｍ、　クー１−４フ編、第２
版、ブラックウエルサイエンティフィックノ９プリケう
ションズ、オノクスフォード、３６．１−３６．２４３
に幾らかの改変を加えた方法により単離した。１０ｄの
へ・マリン処理血液からのバフィーコートの下にフィコ
ルーバクを重層し、そして遠心分離した。

赤血球縄胞（ＲＢＣ）ベレットをＲＰＭＩ　１６４０培
地中で１回洗浄し、そして３７℃の同容量のＰＢＳに再
懸濁した。次に、この懸濁液３祉を６−の２チデキスト
　ラン（３７℃のＰＢＳ中）に加え、内容物をおだやか
Ｋしかし十分に混合した。３７℃にて２０分間インキ−
ベートしてＲＢＣを沈降せしめた後、上清（好中球を含
有する）を取り出し、そして４℃のＰＢＳ中で３回洗浄
した。細胞をもう一度４℃のＨＢＳＳ−ＨＥＰＩＩＣ３
（声７．２）中で洗浄し、そして同液中に５Ｘ１０個／
ｄの好中球となるように再懸濁した。凍結乾燥したラビ
ット血清を０．０１　Ｍ　ＩＴＡ（ｐＨ７，２）中に再
調製し、そして７種類のフィッシャーイムノタイプを代
表する生存細菌に２度吸着させ〔プシコンソン、　Ａ、
Ｂ、及びミハエルス、Ｊ、Ｃ，。

１シエードモナス・アエルギノサの食細胞作用を促進す
るヒト血清中因子、■、オプンニンと細菌トの相互作用
′、レジャール・オブ・インフェクシャス・ディシーズ
（Ｊ、ｉｍｆ、Ｄｔｓ　）　（１９７４）　１３０：５
ｕｐｐ１．５１１９−８１２５）、補体源として使用し
た。

測定のため、３００μｌのフィッシャーイムノタイプ２
細菌懸濁液を１．５ｄのエッペンドルフチューブ中で１
００μノの６Ｆ１１培養上清液（加熱失活させたＦｅ２
によシ１：１稀釈したもの）に加え、そして回転機上で
３７℃にて３０分間インキユペートシた。次に、５０μ
ｌの補体、そして次に５０μｌの好中球懸濁液を添加し
、それぞれの添加後３０分間及び４５分間、回転機上３
７℃にてインキシベートした。次に、チ為−ブに冷ＰＢ
Ｓを満たし、１００Ｘ＃にて５分間遠心分離し、そして
上清を除去することによシ好中球を２回洗浄した。

２５０μｌの０．１　Ｎ　ＮａＯＨを加えて好中球を溶
解し、チューブを５分間インキ為ベートし、渦動し、そ
してさらに１５分間インキ−ベートし、この時点で２５
０μｌのチ＾−プの内容物を３１１１のシンチレーショ
ン液（ディミリム３０゜ユナイテッドテクノロジース、
バクカー）’）Ｋ溶解り、　ヘックマンＬＳ７０００　
Ｕ体シンチレーシ田ンカウンターによシカラントした。

放射性ラベル細菌のインプットに対する取り込みのチと
して結果を示した。放射性ラベルされた細菌のインデッ
）Ｋ関連するＣｐｍは、モノクローナル抗体の代シに熱
失活した（５６℃。

３０分間）正常ラビット血清を添加し、そして摂取され
なかった細菌を洗浄除去しなかった点を除き上記と同様
に処理した対照チェープの内容物２５０μｌをカウント
することによシ測定した。

第２表に示すように、フィッシャーイムノタイプ２細菌
はモノクローナル抗体６Ｆ１１及び補体の活性源の存在
下でのみ摂食された。フィッシャーイムノタイプ２細菌
の代りにフィッシャーイムノタイプ１細菌を用いてこの
実験をＩＡシ返した場合、細菌の取り込みは観察されず
、従りて細菌をオプソナイズしそし【食細胞作用を促進
する６Ｆ１１抗体の特異性が示された。オプソニン（特
異的抗体）と多形核白血球（好中球）との組合わされた
作用がＰ、アエルギノサ（／ラック、前掲）の−次的機
構のようであるから、これらのデータは抗体６Ｆ１１は
適切な投与のもとてフィッシャーイムノタイプ２細菌の
致死的チャレンジに対して保護をもたらすことを示唆し
ている。

以下余白 第　　　２　　　表 −−３，８ ＋６．６ −　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　
２．４＋　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　
６１．７（ａ）（→は培地。

（ｂ）（→は熱失活補体。

Ｇ、インービポ活性 上記の仮定を試験するため、幾つかのフィッシイムノタ
イプのＰ、アエルギノサ及び６Ｆ１１抗体を用いて動物
保獲研究を行った。まず６Ｆ１１抗体をスペント培養上
清液から飽和硫酸アンモニウム（最終濃度５０％）を用
いる沈澱によシ濃縮した〔ゲート、　Ａ、Ｈ，等、゛免
疫グロブリン及びその断片の精製”、セレクテッド・メ
ンズ・イン・セルラー・イムノロジー（Ｓａｌｅｃｔａ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｎｕ
ｎｏｌｏｇ７）　Ｉ　ミツセル、　Ｂ、Ｂ、及びシイギ
、　Ｓ、Ｍ。

１ｉ集、　Ｗ、Ｈ，フリーマン＆　Ｃｏ　−＋サンフラ
ンシスコ。

カリホルニア、２７９−２８６（１９８０））。沈澱し
た物質を無菌水中に再調製し、ＰＢＳに対して十分に透
析し、そして無菌濾過した。新鮮な培地を同じ方法にか
け負対照とした。体重２０〜２３ｇの雌性ＢＡＩ４／ｃ
　マウス１０匹ずつを２群に分けた。

１方の群には０．５　ｍの濃縮された６Ｆ１１抗体（ラ
ジオイムノアッセイで測定した場合約５０μｇの抗体を
含む）を腹腔内（ｉｐ）投与し、他方の群には０．５−
の濃縮された培地を投与した。６時間後、すべての動物
上しＤ５ｏの５倍量のフィッシャーイムノタイプ２Ｐ、
アエルキノザを含有する生細菌懸濁液０、３　ｎｌｆ　
ｉｐチャレンゾした。細菌懸濁液は対数増殖期の液体培
養物から調製した。すなわち培養液から細菌を遠心分離
し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＰＢＳ中適当な濃度
に再懸濁した。細菌チャレンジは１．２Ｘ１０８個の生
細菌で行った。動物を５日間観察した。チャレンジから
１８時間後、濃縮した培地を投与されたすべての動物が
死んだ。これに対して、６Ｆ１１モノクロ一ナル抗体を
投与された動物はすべて生存した。後者の群は、この時
点で細菌感染のごくわずかな症状（すなわちわずかな毛
立ち）を伴って非常に健康のように見えた。

これらの症状はチャレンジ後４８時間までに消滅し、そ
の後の観期間を通じて細菌感染のその他の証拠はなかっ
た。他のフィッシャーイムノタイプのＰ、アエルキノサ
のＬＤ５ｏの５倍量のチャレンジを用いて行った同様の
実験は６Ｆ１１投体による保ｍをもたらさなかった。こ
れらのデータは、受動的に移行した６Ｆ１１抗体がＰ、
アエルーノサの致死的チャレンジ量に対して完全且つ特
異的保護をもたらすことを明瞭に示している。

例２゜ 例２は、Ｐ、アエルギノサ・フィッシャーイムノタイプ
４に対するヒトモノクローナル抗体の製造方法を示す。

Ｐ、アエルギノサに事前に暴露されたヒトからの末梢血
リンパ球（ＰＢＬ）を用いた。１０枚のプレートに１例
Ｉにおいて記載したように１５マ／Ｖ％のＦｅ２　、　
Ｌ−グルタミン（２ｍ　ｍａｔ／ｌ　）　、ペニシリン
（１００１Ｕ、４）　、ストレプトマイシン（１００μ
シ耐）及びａＴを補充したイスコペ（Ｉｓｃｏｖｓ）の
改変ドルベニ１　（Ｄｕｌｂｅａｃｏ）培地中２０００
のｇ−ｐＢｔ、／ウェル、及び４０，０００個のＩＡ２
細胞／ウェルを接覆しえ。この培地を今後イスコベ培地
と称する。

例ＩＫ記載した測定方法を使用した。但し、Ｅ、コリ及
びに、ニエモニア測定プレートは用いなかった。

９Ｄ１０と称する１つのウェル中の上清がフィッシャー
イムノタイプ４〜７グレート上でのみ陽性であり、そし
て個々のイムノタイプ抗原プレート上で測定した時フィ
ッシャー４特異的であると決定さレタ。ウェル９Ｄ１０
からの細胞のクローニン／ｌ−１照射されたヒトＰＢＬ
　（２，５Ｘ　１０５／ウエル）をフィーダー細胞とし
て用いて、０．５−エレア９６−ウェル平底プレート中
で、ＨＡＴを補充しないイスコペ培地を用いて行い、方
法は前記の通シとした。

この特許出願の出願前に、セルライン９Ｄ１０はアメリ
カン・タイプ・カルチエア・コレクションに寄託され、
そしてＣＲＬ８７５２の番号が与えられた。

抗体９Ｄ１０は前記のアイソタイプの決定によりＩｇＭ
として特徴付けられ、そしてｔＡＴｓ血清型についての
特異性試験においてＩＡＴＳＡｌ２Ｏ２反応することが
示された。イムノプロット分析のための前記の方法を用
いる場合、この抗体はフィッシャーイムノタイプ４ＬＰ
Ｓ及びフィッシャーイムノタイプ４細菌由来の外膜調製
物とのみ反応し、６Ｆ１１抗体について記載したのと同
様のはしご状プロフィールが示された。

イン−ビトロ及びインーピ？活性についての前記の方法
を用いて次の結果が得られた。

第　　　３　　　表 オプンニン食細胞測定 −＋　　　　　　９．５ 例３゜ 例３は、Ｐ、アエルギノサ・フィッシャータイプ１及び
４に対するヒトモノクローナル抗体の製造方法について
示す。

９７７１球の分離源として、幾つかのフィンシャーイム
ノタイプのＬＰＳに対して正常より高い力価を含有する
のう飽性線維症患者の血清を用いた。

この場合、５枚のプレートに１５，０００　ｐＢｔ、’
ウェル及び１４０，０００個のＩＡ２細胞／ウェルを接
種した。例２に記載したのと同様のイスコペ培地を用い
たが、Ｔ−細胞を機能的に不活性化する目的で０．５μ
籠のサイクロスポリンＡを補充した。この実験に使用し
たＡＦ、Ｔ−８ＲＢＣによるロゼツト形成を通じてＴ−
細胞の涸渇はなかった。サイクロスポリンＡはマスター
ウェルの測定まで培地中に保持した。

例２に記載したのと同様にして培養上清のスクリーニン
グを行った。Ｃ３Ｄ５と称するウェルがらの上清がフィ
ッシャーイムノタイプ４−７プレート上でのみ陽性であ
）、そして前記の個々のイムノタイプ抗原プレート上で
フィッシャーイムノタイプ４特異的であることが確認さ
れた。Ｃ３Ｂ７と称するウェルからの他の上滑はフィッ
シャーイムノタイプ１−３プレート上でのみ反応し、そ
して前記の個々のイムノタイグプレート上でフィッシャ
ーイムノタイプ１に特異的であることが確認された。こ
の特許出願の出願前に、セルラインＣ３Ｂ７及びＣ３Ｄ
５はそれぞれＣＲＬ　８７５３及びＣＲＬ　８７５４と
してＡＴＣＣに寄託された。Ｃ３Ｄ５及びＣ３Ｂ７の両
者は、前記のアイソタイプ分析によｐｌｇＭであること
が決定された。Ｃ３Ｄ５はＩＡＴＳＡｌ２Ｏ２反応し、
そして０５Ｂ７はＩＡＴＳ株６とのみ反応し、フィッシ
ャーイムノタイプとｆＡＴｓ血清瓜の相互関係から予想
される通りであった。

イムノプロット分析において、この発明の抗体Ｃ３Ｄ５
はフィッシャーイムノタイプ４のＬＰＳ及びフィッシャ
ーイムノタイプ４細菌からの外膜調製物とのみ反応し、
６Ｆ１１抗体について記載したのと同様のハシゴ状プロ
フィールもたらすことが示された。

同様のイムノプロット分析において、抗体０５Ｂ７はフ
ィッシャーイムノタイプ１のＬＰＳ及びフィッシャーイ
ムノタイプ１株の外膜調製物とのも反応し、ハシゴ状プ
ロフィールを示した。

前記のイン−ビトロ、及びインーピぎ測定は次の結果を
もたらした。

オグンニン食細胞測定 −−８，４ ＋６．３ −　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　９．
５＋　　　　　　＋　　　　　５６．１ 第　　　５　　　表 −−６，３ ＋６．９ −　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　１７．７
＋　　＋　　５６．３ 第４表及び第５表中、 （ａ）（→は培地であり （ｂ）（→は熱失活補正である。

以下余白 第　　　６　　　表 （７−ビｙｆ保護（Ｃ５Ｄ５及び９Ｄ１０）チャレンジ
後の３日の 生存／合計比 培　　地　　　　　　　　　　０／１０Ｃ５Ｄ５（抗−
フイｙ’／ヤ　４）　　　　　　１０／１０Ｃ５Ｂ７（
抗−７４ｙシャ　１　）　　　　　　　１／１０９０１
０（抗−７４ｙシャ　４　）　　　　　　　８／１０３
日後は変化せず。

チャレンジｉｔ　：　ＬＤ５ｏの５倍量の生存フィッシ
ャーイムノタイプ４細菌。

以下余白 第　　７　　　表 インービゲ保＠　（Ｃ５Ｂ７） チャシンク後３日の 生存／合計比 培　　地　　　　　　　　　　　　　０／１０Ｃ５Ｄ５
（抗−フィッシャー４）　　　　　　　　　　２／ｉ。

９０１０（抗−フィッシャー４）　　　　　　　　　Ｏ
／１０Ｃ５Ｂ７（抗−フィッシャー１）　　　　　　　
　　８／１０３日後は変化せず。

チャレンジ−１：　ＬＤ５ｏの５倍量の生存フィッシャ
ーイムノタイプ１細菌。

以下余白 例４゜ 例４Ｈ１Ｐ、アエルギノサ・フィッシャーイムノタイプ
５及び６に対するヒトモノクローナル抗体の製造方法を
示し、そしてさらに相同株の致死的チャレンジに対する
該抗体のイン−ビデ保護活性を示す。

Ｐ、アエルギノサの慢性感染を有していたことが知られ
ているのう飽性線維症患者から末梢血サンプルを得た。

例１に記載した方法により血液から単核細胞を分離した
。例３に記載したのと同様にして感受性Ｂ細胞の細胞ド
ライプン形質転換を行った。但し、２３枚の丸底９６ウ
エルプレート（コスタ−３７９９）にウェル当９２０，
０００個の単核細胞及びｇ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ個のｌＡ２
細胞を接種した。

特異抗体についての培養上溝液のスクリーニングを例１
に記載したｇＬＩｓＡ測定の変法を用いて行った。抗原
プレートは平底９６ウエルミクロタイタープレート（イ
ムノン■、ダイナチック）から成シ、このウェルはウェ
ル底に吸着された種々の生存細菌を含む。プラスチック
への細菌の吸着を促進するために、５０μＶウエルのポ
リ−シーリジン（ＰＬＬ）（ＰＢＳ、ｐＨ７゜２．中１
μに値）を室温にて３０分間インキ−ベートする。次に
未吸着ＰＬＬを除去し、プレートをＰＢＳで１回洗浄し
、ＰＢＳ中洗浄細菌懸濁液（０Ｄ６６ｏ＝　０．２　）
　５０μｇを各ウェルに加え、そしてプレートを３７℃
にて１時間インキエペートした。塩−トウィーン溶液（
０，９％ＮａＣｔ、０．０５％トウイーン２０　、　ｖ
／ｖ％）によりプレートを３回洗浄することにより未吸
着細菌を除去した。プレートの細菌組成は例１に記載し
た通りとしたが、Ｅ、コリプレート又はに、ニーモニア
プレートは使用しなかった。まず、２００μｌ／ウエル
のブロッキング緩衝液（５ｖ７’マチ脱脂ドライミルク
、　０．０１　ｖ／ｖ　チアンチアオームＡ（シグマ）
。

及び０．０１ｖ／マチチメロサルを含有するＰＢＳ（Ｐ
）（７，２））によシブレートを室温にて６０分間ブロ
ックすることによＪＥＬＩＳＡを開始した。ブロッキン
グの後、プレートを塩−ウィイーン溶液で３回洗浄した
。次に、０．１％トゥイーン２０及び０．２％　ＢＳＡ
　（Ｗ／りを含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，２＞　５０μ
ｌをすべてのウェルに入れた。培養プレートのウェルか
らの上清を抗原プレートの対応するウェルにレプリカプ
レートし、そしてプレートを３０分間室温にてインキ−
ベートした。次に上清を除去し、ウェルを塩−トウィー
ン溶液で３回洗浄し、そし℃やぎ抗−ヒトＩｇＧ　＋　
ＩｇＭに接合したホースラディッシエバーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）　（アメリカンクアレックスインターナショ
ナルナＡ１１１４＋すＡ　１１２４）の適切な稀釈物５
０μｌをウェルに加えた。この例において、０．０５％
トゥイーン２０及び０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（
ＰＨ７，２）中に、ＨＲＰ−やぎ抗−ＩｇＧ及びＨＲＰ
−やぎ抗−ＩｇＭをそれぞれ１　：５０００及び１：３
０００に稀釈して使用した。室温にて３０分間インキ−
ベートした後、過剰の酵素接合抗体を除去し、そしてウ
ェルを塩−トクイーン溶液で３回洗浄した。基質の添加
及びそれに続く発色を含むＥＬＩＳｋの残シの段階は例
１に記載したのと同様にして行った。

上記の方法による培養上清の分析は、フィッシャーイム
ノタイプ４−フプレート上でのみ陽欽する２つのウェル
（１３Ｃ１及び５Ｇ２）の同定を導いた。

次に、個々のイムノタイグ抗原プレート上でのｇＬｘｓ
ＡＫより、ウェル１３Ｃ１中の抗体はフィッシャーイム
ノタイプ５％異的であり、ウェル５Ｇ２中の抗体はフイ
ックヤーイムノタイプ６特異的であることが決定された
。この例に記載したＦ：、ＬＩＳＡフォーマット並びに
１（ＲＰ抗−ヒ）ＩｇＧ及び）ＩＲＰ抗−と）ｉｇＭ試
薬を用いて例１に記載したのと同様にして行りたアイソ
タイプの決定によシ、上記のフィッシャーイムノタイム
特異的抗体のそれぞれがＩｇＭアイソタイプであること
が示された。

ウェル１３Ｃ１及び５Ｇ２からの特異的抗体産生細胞の
クロー二／グ金次のようにして行りた。すなわち、各ウ
ェルからの細胞をそれぞれ別々に、上記のＥＬＩＳＡ法
により測定されたすべてのクローナル上清が適切なフィ
ッシャーイムノタイプ上で陽性反応をもたらすまで、複
数ラウンドの限界稀釈クローニングにかけた。クローン
化は、フィーダー細胞としてウェル尚シ１×１０個の照
射された（２４００ラド）ヒトＰＢＬを用いて９６ウエ
ル丸底プレート中で行った。７日後、各ウェルにさらに
１×１０５個の照射されたＦＢＩ、を加えた。抗−フィ
ッシャ−イムノタイプ５ヒトモノクローナル抗体を産生
する得られたクローン化セルラインを１３０１と称し、
他方抗−フイツシャーイムノタイム６ヒトモノクローナ
ル抗体を産生ずるクローン化セルラインを５０２と称す
る。これらのクローン化セルラインのそれぞれＫよシ産
生されるモノクローナル抗体Ｋ、それらを産生ずる対応
するセルラインと同じ名称を与える。

この特許出願の出願前に、セルライン１３Ｃ１及び５Ｇ
２はＡＴＣＣにそれぞれＣＲＬ　８７９６及びＣＲＬ８
７９７として寄託された。モノクローナル抗体１３Ｃ１
及び５０２を用いて、７種類のフィッシャーイムノタイ
プのそれぞれからの外膜調製物（ＯＭＰ）についてイム
ノプロット分析を行った。この方法は例１に記載した方
法と同様であるが次のように改変した。

モノクローナル抗体とのインキエペーシ讐ン及びその後
のＰＢＳ−）ウィーン中での一連の洗浄の後、ＮＣＭプ
ロットのそれぞれを、やぎ抗−ヒ）ＩｇＧ＋ｆｇＡ＋　
ＩｇＭに接合したアルカリ性ホスファターゼ（チメド）
の１；１０００稀釈物（ＰＢＳ−）クイーン中）中で２
５℃にて１時間インキエペートした。

次にプロットをＰＢＳ　−トウイーン中で５分間ずつ５
回洗浄し、この時点で、レーリイー等、！ロシーディン
グス・オブ・デ・ナシ鵞ナル・アカデミ−・オプ・サイ
エンシス・オブ・ザ・エナイテツているようにして、３
Ｑｄのニトロブルエテトラゾリウム１５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルホスフェート（ＮＢＴ−ＢＣＩ
Ｐ　）基質中で２５℃にて２０〜３０分間プロットをイ
ンキユベートすることにより抗原−抗体反応を可視化し
た。プロットを脱イオン水中で回数すすぐことによシ発
色を停止した。モノクローナル抗体１３Ｃ１及び５Ｇ２
は均一抗体：細菌外膜の組合わせの場合にのみ陽性反応
を示した。すなわち、モノクローナル抗体１３Ｃ１はフ
ィッシャーイムノタイｆ５からのＯＭＰとのみ反応し、
そして七ツクローナル抗体５Ｇ２はフィッシャーイムノ
タイプ６からのＯＭＰとのみ反応した。両ケースにおい
【、反応は、認識される分子ターゲットとして、ＬＰＳ
を示す規則的に配置されたバンドのはしご状プロフィー
ルをもたらした。

ＬＰＳがターダット抗原であることを支持するものとし
て、電気泳動に先立ってＣＭＰを熱処理（１００℃、１
時間）しそして次にプロテイナーゼＫ（１０〜２０μｖ
５０μｇサンプル中蛋白質）の存在下で６０℃にて２時
間インキ−ベートした場合に各ケースにおいてはしご状
プロフィールが変化しないことがさらに注目された。後
者の前処理が蛋白質抗原に対して破壊的であることが知
られている。

ヒトモノクローナル抗体１３ｃ１及び５Ｇ２のイン−ビ
トロ機能活性をオプノニン食細胞性殺菌測定（ｏｐｓｏ
ｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｂａｃｔａｒｌｃｉｄ轟１
　ａｓｓａｙ）におい【試験した。細菌をトリブチカー
ゼソイプロス中培養物から対数増殖期において収得し、
０．１　％ゼラチン及び５　ｍＭ　ＨＥＰＦＳを含有す
るへンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ／ＧＥＬ４／ＨＦ、Ｐ
ＥＳ　）中に０Ｄ６６ｏ＝０．１００に再懸濁し、そし
て次に同じ緩衝液中Ｋ　１　：、１０００に稀釈した。

ヒト好中球を正常な志願者から例１に記載したようにし
て単離し、そしてＨＩ３５８／ＧＥＬＡ化ｐＦ、ｓ中に
５Ｘ１０’好中球／１ＬＩＫ再懸濁した。

正常な志願者の凝固血液からの血清をヒト補体として用
いた。使用に先立って９部の血清を１部の０．１　ＭＥ
ＤＴＡ　　（ＰＨ７，２）と混合し、そして次に例１に
詳細に記載したようにしてＰ、アエルギノサの７種類の
フィッシャーイムノタイプに吸させた。

他の経路の補体成分の活性化を防止するため、吸着され
た血清をさらにチモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）　（シグマ
）で処理してグロノ４−ジン（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）を
除去した〔プジ冒ンソン及びミハエルス、ジャーナル・
オプ・インフェクシャス・ディシーズ（Ｊ、Ｉｎｆ。

Ｄｉｇ、）　（１９７４）　１３０　、５ｕｐｐ１．：
　ａｌ１９−ｓ１２５：］。

１、５１ｎｌのポリプロピレンコニカルチエーブ中で１
００μｌの細菌懸濁液及び５０μｌのモノクローナル抗
体含有上清を混合することによシ反応を開始した。温度
にて３０分間インキエペートした後、５０μｅの補正、
５０μｌの好中球懸濁液、及び２５０１ｉｔ　０ＥＢＳ
Ｓ／ＧＥＶＨＥＰＩＳを各テ、−ブに加えた。

チェープを回転機上で３７℃にてさらに１時間インキエ
ベートし、次に各チェーブからの１０μｌを３−の液体
トリデチカーゼソイアガ−（４５℃）と混合した。寒天
が固化するのに十分な時装置いた後、プレートを他の３
−の液体トリブチカーゼソイアガーで重層した。プレー
トを３７℃にて一夜インキエベートし、そして生成した
細菌コロニーを次の日にクエペクコロニーカウンター上
で計数した。抗体特異性及び殺菌活性がオプソニン食細
胞作用の結果であるか否かを試験するための適切な対照
を、それぞれ（１）適切な抗体の代シに適切でない抗体
の添加、及び（２）好中球をＨＢＦＱｙ’ＧＥＩ、／Ｈ
ＥＰＪ：Ｓによシ置き換えることによシ試験した。下記
の第７表及び第８表に示すように、モノクローナル抗体
１３Ｃ１及び５Ｇ２はそれらの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓ　ａｔｒａｌｎ）に対して殺菌的でｈった。

各ケースにおいて、これらの結果は、ヒト好中球による
オプソニン化細菌の食細胞的取り込みが細菌数の減少を
一次的に担当することを示した。非相同（ｎｏｎ−ｈｏ
ｍｅｌｏｇｏｕｓ）抗体−細菌組み合わせを用いるこれ
らの試験の反復は細菌の取り込みをもたらさず、従って
上記抗体のオデソニン抗体としての機能的特異性が示さ
れた。

オプンニン食細胞性殺菌測定 ＋７２１ −　　　　　　　　＋　　　　　　　７５６＋＋１１ （ａ）（→はヒト抗−フィッシャーイムノタイデ２モノ
クローナル抗体６Ｆ１１　。

（ｂ）（→はＨＢＳＳ／ＧＥ１．／ＨｇＰＥ５　Ｏみ。

（ｃ）　　フィッシャーイムノタイプ５細菌について実
施された実験。

以下余白 第　　　８　　　表 ＋４２２ −　　　＋　　５７０ ＋　　　＋　　１６６ （ａ）（−）はヒト抗−フィッシャーイムノタイプ２モ
ノクローナル抗体６Ｆ１１゜ （ｂ）（→はＨＢＳＳ／ＧＥＩＪＨＥＰＥＳ　（１）み
。

（Ｃ）フィッシャーイムノタイプ６細菌について実施さ
れた実験。

モノクローナル抗体のインーピが活性の評価のために例
１に詳細に記載した方法を用いて次の結果が得られた。

この結果は、抗体１３Ｃ１及び５０２が相同体の致死量
のチャレンジに対して保腹をもたらすことを明瞭に示し
ている。

第　　　９　　　表 インーピ？保護試験（１３Ｃ１） チャレンジ後３日の １３Ｃ１（抗−フィッシャー５）　　　　１α／１０Ｃ
５Ｂ７（抗−フィッシャー１）　　　　　　　０／１０
３日後は変化せず。

チャレンジ量：ＬＤ５ｏの５倍量の化フィッシャーイム
ノタイプ５細菌。

以下余白 第　　１０　　表 （５Ｇ２） チャレンジ３日後の Ｃ３Ｂ７（抗−フィッシャー１）　　　　　　α／１０
３日後は変化せず。

チャレン４：ＬＤ５ｏの５倍量の化フィッシャーイムノ
タイプ６細菌。

例５゜ 例５は、Ｐ、アエルイノサ・フィッシャーイムノタイプ
７に対するヒトモノクローナル抗体の製造方法を示し、
そし℃さらに相同株の致死的チャレンジに対するこの抗
体のイン−ビデ保護活性を示す。

Ｐ、アエルギノサの慢性感染を有していたことが知られ
ているのう電性線維症患者から末梢血サンプルを得た。

例１に記載したようにして、血液から単核細胞を分離し
た。感受性Ｂ細胞の細胞−ドライブン形質転換を例２に
記載した方法により行った。但し、８枚の丸底９６ウエ
ルグレー）Ｋウェル当り８０００個のＢ−ＰＢｔ、及び
６０，０００個のＩＡ２細胞を接種した。

例４に記載したのと同様にして特異抗原についての培養
上清のスクリーニングを用った。８Ｅ７と称する１つの
ウェルの上清がフィッシャーイムノタイプ４−フグレー
ト上でのみ陽性であシ、そして次に個々のイムノタイプ
抗原プレート上で測定した場合フィッシャー７特異的で
あると決定された。例４に記載したアイソタイプの決定
によシ、このフィッシャ−イムノタイプ７特異的抗体が
ＩｇＭアイソタイプであることが決定された。

ウェル８Ｅ７の特異抗体産生細胞のクローニングを例４
に記載した方法に従って行った。抗−フィッシャ−イム
ノタイプ７ヒトモノクローナル抗体を産生ずる得られた
クローナルセルラインヲ８Ｅ７と称する。このセルライ
ンによシ産生されたモノクローナル抗体も同じ名称を有
する。この特許出願の出願前に、セルライン８Ｅ７はＡ
ＴＣＣにＣＲＬ８７９５として寄託された。

７種類のフィッシャーイムノタイプのそれぞれからの外
膜調製物（ＯＭＰ　）に対してモノクローナル抗体８ｇ
７を用いて例４に記載した方法により行われたイムノプ
ロット分析は、フィッシャーイムノタイグアからの葺上
でのみ陽性反応を示した。

この反応は、認識される分子ターグツトとしてのＬＰＳ
を示す規則的に配置されたバンドのはしご状プロフィー
ルをもたらした。電気泳動前にフィッシャーイムノタイ
プ７の哩を加熱しそしてプロフィ−ルに処理（例４を参
照のこと）した場合、イムノプロットのプロフィールは
変化せず、ＬＰＳがターダット抗原であることがさらに
支持された。

モノクローナル抗体８Ｅ７のイン−ビトロ活性を評価す
るために例１に詳細に記載した方法を用いて次の結果が
得られた。この結果は、抗体８Ｆ、７がフィッシャーイ
ムノタイグア細菌の致死量のチャレンジに対して保Ｗｇ
ｔをもたらすことを示している。

以下余白 第　　１１　　表 インーピメ保護試験（８Ｅ７） チャレンジ後３日の 生存／合計比 ８Ｅ７（抗−フィッシャー７）　　　　　　　　１０／
１００５Ｂ７（抗−フィッシャー１）　　　　　　　　
　１／１０３日後は変化せず。

チャレンジ量：ＬＤ５ｏの５倍量の化フィッシャーイム
ノタイグア細菌。

例６゜ 例６は、Ｐ、アエルギノサ以外のシェードモナスの種の
ＬＰＳ分子上の血清型決定基に対するヒト−モノクロー
ナル抗体の製造方法を示す。この例はさらに、このよう
にして生産されたヒトモノクローナル抗体から、相同細
菌の致死量のチェレンジに対して哺乳動物において保護
効果を有する抗体をスクリーニングする方法を示す。

シェードモナスの種、例えばＰ、マレイ（Ｐ、ｍａｌｌ
ｅｉ）、Ｐ、シェードマレイ（Ｐ、ｐｓｅｕｄｏｍａｌ
ｌｅｌ）　、Ｐ、　フルオレセンス（Ｐ、ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ）、Ｐ、グチダ（Ｐ、ｐｕｔｉｄａ）、に暴
露されたヒト供与体から採取した９７７４球を出発材料
として用いて例１〜４の方法を反復した。

例４に記載したのと同様にして潜在的供与者をスクリー
ニングして、色々なシェードモナスの種及びこれらの種
内のサブタイプに暴露された個人を決定することができ
る。例１〜４の方法を実施することによシ、シェードモ
ナスのこれらの種の個個のタイプのＬＰ８分子に対する
タイプ特異的ヒトモノクローナル抗体を分泌する不滅ヒ
トセルラインを生じさせることができる。さらに、例１
〜４に従りてこれらのモノクローナル抗体を分析するこ
とによシ、相同様の致死的感染に対して保護活性を有す
る抗体を同定することができる。

以下余白 例７゜ 例７は、シェードモナス属以外のグラム陰性細菌の株の
ＬＰＳ分子上の血清型決定基に対するヒトモノクローナ
ル抗体の製造方法を示す。この例はさらに、こうして生
産されたヒトモノクローナル抗体から、相同細菌の致死
的チャレンジ量に対する哺乳動物において保護活性を有
する抗体をスクリ−ニングする方法を示す。

グラム陰性細菌の他の菌株、例えばＥ、コリ、Ｋ。

二ｚ−モニア、Ｐ、ブルガリス（Ｐ、ｖｕｌｇａｒｌｍ
）及びＳ、マルセッセンス（Ｓ、ｍａｒｃｅｓＣｅｎｓ
）　　に暴露されたヒト供与体から採取したリンノサ球
を出発材料として使用して例１〜４の方法を実施するこ
とができる。潜在的供与体をスクリーニングしてこれら
の細菌の色々な株に対してすでに暴露された個人を同定
することができる。前記の方法を実施することによシ、
それぞれＥ、コリ、Ｋ、二エモニア、Ｐ、ブルガリス、
及びＳ、マルセッセンスのＬＰＳ分子上の血清型決定基
に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不滅化ヒト
セルラインを得ることができる。

これらのヒトモノクローナル抗体の前記のような分析に
よ）、相同様のターゲットＬＰＳ分子が“接近可能“で
おれば揃記のＬＰ８分子の“接近可能性“の検討を照照
のこと）、相同様による致死的感染に対して保護活性を
有する抗体がどれであるかが示される。

医薬製剤及び使用 この発明のモノクローナル抗体は、治療的又は予防的な
量の少なくとも１つのこの発明のモノクローナル抗体を
医薬として有効な担体と共に含んで成る医薬組成物の成
分として導入することができる。この医薬担体は、モノ
クローナル抗体を患者に投与するために適当な任意の適
合性の非毒性物質である。担体として無菌水、アルコー
ル、脂肪、ワックス、不活性固体を使用することができ
る。医薬として許容される助剤（緩衝剤、分散剤）もま
た医薬組成物に導入することができる。これらの組成物
は、細菌の１つの特定の株又はタイプに対して特異的で
あるように単一のモノクローナル抗体を含有せしめるこ
とができる。これは、他の抗体を含有しない極めて特異
的な物質であるという利点を有する。この製品はまた、
広い用途を有しない程特異的であるという欠点を有する
。他方、医薬組成物は２種類以上のモノクローナル抗体
を含有して１カクテル”を形成することができる。例え
ば、Ｐ、アエルギノサについて、イムノタイプ又は血清
皺のそれぞれに対するヒトモノクローナル抗体を含有す
るカクテルは、その特定の細菌の非常に多くの一般的タ
イブに対する活性を有する万能製品である。他の種及び
菌株について、単一の抗体抗体混合物を同様に使用する
ことができる。

２種類以上、通常は３種類以上、よシ一般的には４種類
以上、しばしば７種類以上、そして場合によりては１０
種類以上のヒトモノクローナル抗体を含有する医薬組成
物が特に興味深い。フィッシャーイムノタイプの２種類
以上、さらに詳しくはフィッシャーイムノタイプ１，２
．３．４．５゜６及び７の内の２種類以上、そして好ま
しくは４種類以上と特異的に反応する２種類以上の七ツ
クローナル抗体の組合わせが特に興味深い。好ましい組
成物はフィッシャーイムノタイプの４ｆｆｉ類以上、さ
らに好ましくは４〜６種類、そして最も好ましくは７種
類すべてと反応する。

種々の成分のモル比は、係数１０以上をもって異ること
は通常なく、さらに一般的には係数５以下であシ、そし
て一般に他の成分のそれぞれに対して約１＝１〜２の比
率である。

この発明のヒトモノクローナル抗体及び医薬組成物は経
口投与又は非経腸投与のために特に有用である。好まし
くは、この発明の医薬組成物は非経腸的に、すなわち皮
下に、肉筋肉又靜脈内に投与することができる。従って
この発明は、許容される担体、好ましくは水性担体中に
溶解したヒトモノクローナル抗体又はそのカクテルの溶
液から成る非経口投与用組成物を提供する。糧々の水性
担体、例えば水、緩衝化水、０．４チ塩溶液、０．３チ
グリシン等を使用することができる。この溶液は無菌的
であり、そして一般に粒状物を含有しない。これらの組
成物は常用のよく知られた殺菌法により殺菌することが
できる。この組成物は、生理的条件に接近するために必
要な場合には、医薬として許容される補助剤、例えば声
調整及び緩衝剤、浸透圧調製剤等、例えば酢酸ナトリウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、
乳酸ナトリウム等を含有することができる。これらの製
剤中の抗体濃度は広範囲に変えることができる。すなわ
ち、０．５チ以上、通常１％以上、１５％又は２０チま
で（いずれも重量％）であシ、そして主として流体容積
、粘度等に基いて、好ましくは選択される特定の投与方
法のために選択されるであろう。

すなわち、筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は１ｄの
無菌緩衝化水及び５０■のモノクローナル抗体を含むよ
うに作ることができる。静脈注入用の典凰的な組成物は
２５０１１７の無菌リンゲル液、及び１５０■のモノク
ローナル抗体を含むように作ることができる。非経腸的
投与組成物の実際の製造方法はそれ自体公知であり、又
は当業者にとって明らかであシ、そして例えばレミント
ンズ・ファーマシニーティカル・サイエンス（Ｒｅｍ　
ｌｎｇｔｏｎｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ
ｅｎｃｅ）　、１５版号マックパブリッシング社、イー
スタンペンシルバニア（１９７５）に詳細に記載されて
いる。

この発明のモノクローナル抗体は貯蔵のために凍結乾燥
することができ、そして使用前に適当な担体中に再調製
することができる。この技法は、常用の免疫グロブリン
について効果的であることが示されておシ、当業界にお
いて知られている冷却乾燥技法及び再調製技法を用いる
ことができる。

凍結乾燥及び再調製によシ種々の程度に抗体活性が喪失
することがある（例えば、常用の免疫グロブリンについ
て、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よシも大きく活性喪失する
）ことが知られておシ、使用レベルは補償するように調
整されなければならない。

この発明のヒトモノクローナル抗体又はそのカクテルを
含む組成物はグラム陰性細菌性疾患の予防的及び／又は
治療的処理のために投与することができる。医療的適用
において、この組成物は、グラム陰性細菌によシすでに
感染している患者に、感染及びその合併症を治ゆさせ、
又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量において
投与される。これを達成するのに適当な量は１医療的有
効量”として定義される。この使用のために有効な量は
感染の深刻さ及び患者自身の免疫系の一般的状態に依存
するが、体重１にｇ当シ抗体約１〜２０■でおり、に９
ａす５〜２５■の投与量がよシ一般的に使用される。こ
の発明の物質は一般に、深刻な疾患状態、すなわち生命
を脅やかす状態又は潜在的に生命を脅やかす状態、特に
画面症又はエンドトキシン症において使用式れることに
注目すべきである。これらの場合、外来物質の不存在、
及び外来物質拒絶の不存在がこの発明のヒトモノクロー
ナル抗体によシ達成されるため、治療医が実質的に過剰
量のこれらの抗体を投与することが可能であシ、そして
望ましいと考えられる。

予防的適用において、この発明の抗体又はそのカクテル
を含有する組成物はグラム陰性細菌にまだ感染していな
い患者に投与され、このような感染の可能性に対する患
者の耐性が強化される。このような量は”予防的有効量
′と定義される。この使用においては、正確な量はやは
シ患者の健康状態及び免疫の一般的レベルに依存するが
、一般に０．１〜２５１ｎｇ／Ｉ、％Ｖｃｏ、ｓ　〜２
．ｓｗ／ｋｙでおる。

治療医によシ選択された投与量レベル及び投与パターン
によシ組成物の単−又は複数投与を行うことができる。

いずれにしても、医薬組成物は、患者を効果的に処置す
るのに十分な量のこの発明の抗体を提供すべきである。

以上、この発明の理解に供するため、この発明を幾分詳
細に説明によシ又は例により記載したが、この発明の範
囲内において変法及び改変が行われることは明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はグラム陰性細菌の膜及び内壁の略図である。 第２図はリポポリサッカライド分子の概略を示す図であ
る。 以下余白 ＦＩＧ、１ ・○：８ノ引ライド　　　　　・：本スフシート　　−
：でタノ−７レアミン一二　し鋼重し上清：／）目−話
セ ＦＩＧ、　　２ 手続補正書（方式） 昭和６０年９　月に９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グラム陰性細菌の接近可能なリポポリサッカライド
   分子上の血清型決定基に特異的に反応するヒトモノクロ
   ーナル抗体。 ２、前記グラム陰性細菌がエンテロバクテリアセー（￥
   Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ￥）科、バクテ
   ロイダセー（￥Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ￥）科、
   又はシュードモナダセー（￥Ｐｓｏｕｄｏｍｏｎａｄａ
   ｃｅａｅ￥）科の１員である特許請求の範囲第１項記載
   のヒトモノクローナル抗体。 ３、それぞれが異るグラム陰性細菌のリポポリサッカラ
   イド分子上の血清型決定基と反応する２以上のヒトモノ
   クローナル抗体を含んで成る組成物。 ４、前記ヒトモノクローナル抗体がエンテロバクテリア
   セー（￥Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ￥）科
   、バクテロイダセー（￥Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ
   ￥）科、又はシュードモナダセー（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
   ｎａｄａｃｅａｅ￥）科の１員のセロタイプ決定基と反
   応する特許請求の範囲第３項記載の組成物。 ５、前記モノクローナル抗体が同じ細菌種の異る血清型
   と反応する特許請求の範囲第４項記載の組成物。 ６、前記細菌種がシュードモナス・アエルギノサ（￥Ｐ
   ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥　￥ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ￥）
   であり、そして前記複数の抗体がフィッシャー（Ｆｉｓ
   ｈｅｒ）イムノタイプ１〜７の少なくとも２種類のリポ
   ポリサッカライドと反応する特許請求の範囲第５項記載
   の組成物。 ７、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記
   載の組成物を医薬として許容される担体と共に含んで成
   る医薬組成物。 ８、グラム陰性細菌の接近可能なリポポリサッカライド
   分子上の血清型決定基と特異的に反応するヒトモノクロ
   ーナル抗体を分泌する形質転換された不滅化ヒトリンパ
   球セルライン。 ９、前記グラム陰性細菌がエンテロバクテリアセー（￥
   Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｒｉａｃｅａｅ￥）科、バクテ
   リオイダセー（￥Ｂａｃｔｒｉｏｉｄａｃｅａｅ￥）科
   、又はシュードモナダセー（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ
   ａｃｅａｅ￥）科の１員である特許請求の範囲第８項記
   載のセルライン。 １０、前記グラム陰性細菌がシュードモナス・アエルギ
   ノサ（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥　￥ａｅｒｕｇｉｎ
   ｏｓａ￥）のフィッシャーイムノタイプである特許請求
   の範囲第９項記載のセルライン。 １１、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ８５６２、ＣＲＬ８７５
   ２、ＣＲＬ８７５３、ＣＲＬ８７５４、ＣＲＬ８７９５
   、ＣＲＬ８７９６、又はＣＲＬ８７９７のいずれかであ
   る特許請求の範囲第１０項記載のセルライン。 １２、特許請求の範囲第１項〜第５項に記載の組成物の
   予防的又は治療的に有効な量を投与することを含んで成
   る細菌に感受性の哺乳動物宿主の処置方法。 １３、特許請求の範囲第６項に記載の組成物の予防的又
   は治療的に有効な量を投与することを含んで成る細菌に
   対して感受性の哺乳動物宿主の処置方法。