NO167758B - Fremgangsmaate ved fremstilling av humane monoklonale antistoffer mot serotypiske lipopolysakkarid-determinanter. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av humane monoklonale antistoffer som spesifikt reagerer med den serotypiske determinant på det tilgjengelige lipopolysakkarid-molekylet til Pseudomonas Aeruginosa bakterier av en Fisher immunotype 1 til 7.

Gram-negative bakteriesykdommer og deres mest alvorlige komplikasjoner, f.eks. bakteriemi og endotoxemi er årsaken til betydelig morbiditet og dødelighet hos menneskepasienter.

En undersøkelse av mange av tilfellene som er dokumentert

i litteraturen viser at noen av infeksjonsmanifestasjonene ved gram-negative bakterier, spesielt dødelige manifestasjoner har forbindelse med bestemte predisposisjonsfaktorer. Det er en øket hyppighet av slike infeksjoner hos eldre pasienter og hos pasienter som har alvorlig underliggende medisinske tilstander såsom brannsår, kirurgisk trauma, langsomt-helende sår, narkotika-avhengighet eller kreftformer. Disse infeksjoner kan være av nosocomial (d.v.s. hospital-tilegnet) opprinnelse hos pasienter som har ligget lenge på hospital, og spesielt hos pasienter som har gjennomgått kirurgiske inngrep, intravaskulær instrumentering eller manipulerende prosesser såsom uretral kateterisering, cystoskopi, tracheostomi, lumbar punktur og intravenøs infusjon av medikamenter og væsker, eller som har vært plassert på langtids-terapi med immunitets-undertrykkende midler, corticosteroider, antimetabolitter og/eller antibiotika. Strålingsterapi predisponerer også et pattedyr for infeksjon

av gram-negative bakterier.

Blant de hyppigst forekommende gram-negative organismer som forårsaker sykdommer er Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Serratia

marcescens og forskjellige arter av Proteus, Bacteroides, Providencia og Citrobacter (Sonnenwirth, "The Enteric Bacilli

and Similar Gram-Negative Bacteria", s. 753-790, Microbiology,

2. utg., Davies, B.D., Dulbecco, R., Eisen, H.N., Ginsberg, H.S., Wood, W.B. og McCarty, M., utg. Harper og Row (1973); McCabe,

W.R., "Gram-Negative Bacteremia", Adv. Intern. Med. (1974) 19:135-158; og Kreger et al., "Gram-Negative Bacteremia III.

Reassessment of Etiology, Epidemiology and Ecology in 612 Patients", Am. J. Med. (1980) 68:332-343). Også andre arter av Pseudomonas og Klebsiella samt medlemmer av slektene Aeromonas, Salmonella, Flavobacterium, Erwinia, Edwardsiella, Pectobacterium, Acinetobacter, Alcaligenes og Shigella bidrar til en betydelig del av gram-negative sykdommer hos mennesker (Sonnenwirth, ovenf.; McCabe, ovenf.; Kreger et al., ovenf.).

I de senere tiår har antibiotika vært den brukte terapi for å kontrollere gram-negative bakteriesykdommer. Den stadig forekomst og høye morbiditet og dødelighet i forbindelse med gram-negative bakteriesykdommer tyder imidlertid på at antibiotika-terapi har begrensninger ved forebyggelse og behandling av sykdommer forårsaket av disse organismer. Se f.eks. Andriole, V.T., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94:196-199.

Dette har forårsaket leting etter alternativ forebyggelses-

og behandlingsmetoder.

Aktiv immunisering av menneske eller eksperimentelle dyr med vaksiner av hele bakterieceller eller rensede bakterielle endotoksiner fører til utvikling av spesifikke antistoffer hovedsakelig rettet mot de kjemisk diverse gjentatte oligosakkarid-determinanter som foreligger på lipopolysakkarid (LPS)-molekyler (Luderitz et al., "Immunochemistry of O and R Antigens of Salmonella and Related Enterobacteriaceae", Bacteriol. Rev. (1966) 30:192-255; og Luderitz et al., "Isolation and Chemical and Immunological Characterization of Bacterial Lipopolysaccharides", Microbial Toxins, vol. 4,

s. 145-233, Weinbaum, G., Kadis, S., og Ajl, S.J., utg., Academic Press (1977), se fig. 1). I denne henseende er det viktig å merke seg at LPS-molekyler er en av hovedbestanddelene i den ytre cellemembran til de fleste, om ikke alle, gram-negative bakterier (Nikaido, H., "Biosynthesis and Assembly of Lipopolysaccharide", Bacterial Membranes and Walls, Leive, L., utg. Marcel Decker, (1973); se fig. 2). I fig. 1 er det illustrert en modell av den gram-negative cellevegg som viser stillingen av lipopolysakkarid-molekyler i forhold til bakteriens ytre membran. Denne modell mangler strukturer såsom kapsler, mantler og slimsjikt.

Lipopolysakkarider er også integrale bestanddeler i bakterielle endotoksiner, idet lipid A-resten til LPS-molekyler er ansvarlig for de fremherskende patofysiologiske virkninger (f.eks. feber, for høyt blodtrykk, disseminert intravaskulær koagulering, sjokk og potensielt død) i forbindelse med endotoksin-frigjøring under gram-negativ bakteriell septicemi eller indusert eksperimentelt med injeksjoner av endotoksin (Westphal et al., "Chemistry and Immunochemistry of Bacterial Lipopolysaccharides as Cell Well Antigens and Endotoxins",

Prog. Allergy (1983) 33:9-39). Fig. 2 illustrerer de tre områdene av gram-negative l.lpopolysakkarider. Det O-spesifikke kjedeområde er et langkjedet polysakkarid oppbygget av gjentatte oligosakkaridenheter. Hos forskjellige bakterie-arter kan disse oligosakkaridenheter inneholde fra 1 til så mange som 6 eller 7 monosakkaridenheter. Serotypiske determinanter av LPS (se tekst) er vist på dette molekylområde. Kjerneområdet inneholder flere monosakkarider i anordninger

som er relativt lite variert fra én stamme av gram-negative bakterier til en annen. Lipid A-området er i det vesentlige det samme hos alle gram-negative bakterier og er generelt knyttet til kjerneområdet gjennom keto-deoksyoktansyre-resten og tjener som tilknytningspunkt for lipopolysakkaridmolekylet til den ytre membran.

Induksjon og immunoterapeutisk bruk av type-spesifikke anti-LPS antistoffer har vært utstrakt studert i behandling av sykdom som skyldes Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)

på grunn av dens høye antibiotika-resistensgrad. Slike antistoffer, enten de er fremkommet aktivt eller passivt overført, har vist å være beskyttende i en rekke dyreinfeksjons-

modeller. Som oversikt se Pollack, M., "Antibody-Mediated Immunity in Pseudomonas Disease and Its Clinical Application", Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B.M. and Finlayson, J.S., eds. s.73-79, U.S. Department of Health and Human Services, (1979).

Kanskje enda viktigere er høye akutte serumkonsentrasjoner av antistoffer overfor type-spesifikke deler av LPS-molekylene til infiserende stammer observert å ha forbindelse med pasienters overlevelse ved P. aeruginosa bakteriemi (Pollack, M. og Young, L.S., "Protective Activity of Antibodies to Exotoxin A and Lippolysaccharide at the onset of Pseudomonas aeruginosa Septicemia in Man", J. Clin. Invest. (1979) 63:276-286).

Denne observasjon er faktisk funnet å strekke seg til hoved-mengden bakteriemier som skyldes forskjellige gram-negative organismer (Zinner, S.H. og McCabe, W.R., "Effects of IgM and IgG Antibody in Patients with Bacteremia Due to Gram-Negative Bacilli", J. Infect. Dis. (1976) 133:37-45; og Clumeck et al., "Humoral Immunity and Circulating Immune Complexes in Gram-Negative Bacteremia and Septic Shock", Bacterial Endotoxins and Host Response, s. 79-94, Agarwal, M.K., utg., Elsevier, (1980)).

Selv om den nøyaktige måte anti-LPS antistoffer utøver

sin beskyttelse på ikke er fullstendig klarlagt (spesielt med hensyn til de forskjellige slekter av gram-negative bakterier), antas generelt at de virker slik ved å lette klaring av LPS-molekyler fra blodstrømmen ved det reticuloendotheliale system eller ved å gjøre LPS-holdige bakterier sensitive overfor komplement-bevirket lysing og/eller phagocytose (Morrison, D.C. og Ryan, J.L., "Bacterial Endotoxins and Host Immune Responses", Adv. Immunol. (1979) 28:293-450). Følgelig kan hver og en eller en kombinasjon av de ovenfor nevnte beskyttelsesformer virke i alvorlige gram-negative bakteriesykdommer.

I 1975 beskrev Kohler og Milstein den oppdagelse at visse muse-cellelinjer kunne fusjoneres med muse-miltceller og gi hybridomer som kunne utskille rene "monoklonale" antistoffer (Kohler, G., og Milstein, C., "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature

(1975) 256:495-497).

I et 1982 sammendrag ($253) publisert på s. 110 i Abstracts of the 19 82 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, rapporterte J. Sadoff et al., produksjon via hybridom-teknikker av mus (murin) monoklonale antistoffer av IgM-klassen rettet mot oligosakkarid-determinantene til LPS-molekylene til en spesiell stamme (serotype) av P. aeruginosa, og at disse murine monoklonale antistoffer ga beskyttelse til mus mot et dødelig angrep av P. aeruginosa bakterier av den samme stamme (d.v.s. den homologe stamme.).

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles de humane monoklonale antistoffer ved at humane B-celler oppnådd fra en pasient utsatt for Pseudomonas Aeruginosa bakterieantigener udødeliggjøres (gjøres kontinuerlige) ved virustransformasjon eller cellefusjon; cellelinjer som utskiller monoklonale antistoffer av IgG- eller av IgM-isotype som er reaktive med det bakterielle lipopolysakkarid-molekyl isoleres fra de kontinuerlige B-celler ved kloning; monoklonale antistoffer fra cellelinjene for nøytraliserende aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa bakterier måles; og en cellelinje som er istand til å produsere det monoklonale antistoff i et næringsmedium dyrkes og de monoklonale antistoffer som er utskilt av denne cellelinjen utvinnes fra dyrkningssupernatanten.

Nye transformerte lymfocytt-humancellelinjer og monoklonale human-antistoffer tilveiebringes hvor cellelinjer og antistoffer spesifikt bindes til bestemte serotypiske determinanter på lipopylosakkarid (LPS)-molekylene av den ytre cellemembran eller membraner av P. aeruginosa bakterier. Det monoklonale antistoffet kan brukes for beskyttelse i pattedyr mot et dødelig angrep av homologe gram-negative bakterier og skulle tillate terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av de patofysiologiske virkninger av gram-negativ bakteriell sykdom hos mennesker.

Fig. 1 er et illustrerende diagram av membranene og den invendige vegg til en gram-negativ bakterie; og

fig. 2 er en skjematisk fremstilling av et lipopolysakkarid-molekyl.

Transformerte human-lymfocyttceller tilveiebringes som gir spesifikk beskyttende monoklonal human-antistoffer overfor tilgjengelige lipopolysakkarid-molekyler. Med "tilgjengelige" menes at LPS-molekylene er fysikalsk tilgjengelig i miljøet for bruk til direkte samvirke med de monoklonale antistoffer. Ved denne definisjonen vil PLS-molekyler som er utskilt fra gram-negative bakterier i det omgivende miljø være frie til å samvirke direkte med spesifikke monoklonale antistoffer og klares gjennom det reticuloendotheliale system. I denne forbindelse vil de monoklonale antistoffer ventes å være fordelaktige i behandling av alvorlige sykdommer som skyldes Pseudomonas aeruginosa.

Det er velkjent at innenfor en spesiell art gram-negative bakterier kan det være flere immunologisk forskjellige stammer eller typer. I mange tilfeller kan forskjellene mellom eller blant stammer eller typer tilskrives variasjoner i antigen-strukturen til LPS-molekylene og spesielt strukturell variasjon innefor de 0-spesifikke sidekjeder av LPS-molekyler (se fig. 1). Således gir strukturelt forskjellige 0-spesifikke sidekjeder forskjellige antigenstrukturer. Immunologisk gjenkjennelse av slik antigen-variasjon fører til dannelse av antistoffer som er spesifikke for en gitt antigen-variant. Når slike antistoffer brukes til å serologisk (d.v.s. ved agglutinering, ELISA etc.) differensiere mellom en antigen-variant og en annen, kalles de således gjenkjente antigen-varianter serotyper og sies å vise serotypiske determinanter. Således gir de 0-spesifikke sidekjeder av LPS-molekyler serotypiske antigen-determinanter. For en fagmann vil det være klart at da foreliggende oppfinnelse tilveiebringer monoklonale human-antistof f er overfor serotypiske determinanter på LPS-molekyler, kan den tilveiebringe antistoffer som er type-spesifikke, hvilket betyr at de er spesifikke overfor LPS-molekyler til en spesiell type innenfor en art.

Ved diskusjon av de forskjellige serotyper kan type-skjemaer med hell anvendes. Illustrerende for slike type-skjemaer er sådanne for P. aeruginosa. Fisher-typesystemet for P. aeruginosa er velkjent og er beskrevet i Fisher et al., "New Immunotype Scheme for Pseudomonas aeruginosa Based on Protective Antigens", J. Bacteriol. (1969) 98:835-836.

Dette system klassifiserer hoveddelen av kjente P. aeruginosa

i 7 typer: Fisher immunotype 1; Fisher immunotype 2; Fisher immunotype 3; Fisher immunotype 4; Fisher immunotype 5; Fisher immunotype 6; og Fisher immunotype 7. På lignende måte gir det internasjonale antigentypeskjerna (IATS) systemet for P. aeruginosa (se Brokopp, CD. og Farmer, J.J. , III, "Typing Methods for Pseudomonas aeruginosa", Pseudomonas aeruginosa: Clinical Manifestations of Infection and Current Pherapy,

s. 89-133, Doggett, R.G. > utg., Academic Press, 1979) ca. 17 forskjellige serotyper kalt IATS type 1, IATS type 2 etc.

For både Fisher (Hanessian, S., et al., "Isolation and Characterization of Antigenic Components of a New Heptavalent Pseudomonas Vaccine", Nature (1971) 229:209-210) og IATS typesystemet (Brokopp og Farmer, supra), er antigen-determinanten i forhold til begge serotypiske skjemaer vist å sitte på LPS-molekylet. En sammenligning og korrelering av begge type-systemer er angitt i tabell 1.

Monoklonale antistoffer produseres av celle-drevet Epstein-Barr virus (EBV) transformasjon av B lymfocyttceller erholdt fra mennesker som er eller har vært utsatt for de respektive gram-negative bakterier. Antistoff-sekresjons-cellelinjene man derved får er karakterisert som kontinuerlig voksende lymfoblastoid-celler som har en diploid karyotype,

er Eostein-Barr kjerneantigen (EBNA) positive, og utskiller monoklonalt antistoff av enten IgG, IgM, IgA eller IgD isotype, innbefattet undertyper IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4. Den celle-drevne transformasjonsprosess er en oppfinnelse av M.E. Lostrom og er beskrevet i detalj i US-patent nr. 4.464.465. De monoklonale antistoffer kan brukes intakt eller som fragmenter såsom Fab eller F(ab')2/ normalt intakt. I noen tilfeller kan det være ønskelig å konjugere antistoffene til andre forbindelser for å oppnå spesielle resultater. For eksempel kan antistoffene konjugeres til cytotoksiske midler såsom radionukleider, antibiotika etc.

Denne prosessanvendelsen for å fremstille de foreliggende monoklonale antistoffer er vist med de følgende eksempler.

Disse eksempler skal bare illustrere representative utførelses-former av oppfinnelsen og skal ikke betraktes som begrensende for oppfinnelsens omfang.

Eksempel I

Eksempel I viser fremgangsmåter for fremstilling av et monokJonalt menneske-antistoff mot P. aeruginosa Fisher immunotype 2 (IATS type 11) LPS-molekyler og viser videre den beskyttende aktivitet til antistoff in vivo mot et letalt angrep av den homologe stamme.

A. Oppnåelse av egnede humanceller

Egnede human-B-celler (lymfocytter) ble tatt fra milten til et dødt individ man visste hadde hatt sykdommen cystisk fibrose og tidligere hadde hatt infeksjoner med P. aeruginosa. Milten erholdt ved autopsi ble skåret i skiver ca. 15 mm tykke. Celler ble frigjort fra kapselen og tilhørende matrise i en stor petri-skål ved forsiktig perfusering av hver skive med kalsium/magnesium-fri fosfat-pufferet saltvann (CMF-PBS)

avgitt gjennom en 18-gauge nål festet til en sprøyte. Enkjernede celler ble skilt fra miltcellepreparatet ved standard sentrifugeringsteknikker på Ficoll-Pague (Boyum, A.,

"Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood", Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968) 21:suppl.97, 77-89) og vasket to ganger i CMF-PBS.

De mononukleære celler ble befridd for T-celler ved bruk av en modifisert E-rosett-metode. Kort sagt ble cellene først

# 7

resuspendert til en konsentrasjon pa 1x10 celler/ml i PBS inneholdende 20% fetalt kalveserum (FCS) ved 4°C. 1 ml av denne suspensjonen ble så plassert i et 17x100 mm polystyren rundbunnet rør tilsatt 1x10 g 2-amino-etyl-isotiouroniumbromid (AET)-behandlede røde saueblodceller fra en 10% løsning av RPMI 1640 medium (Madsen, M. og Johnson, H.E., "A Methodological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells", J. Immun. Methods (1979) 27:61-74). Suspensjonen ble meget forsiktig blandet i 5-10 minutter ved 4°C og E-rosett-cellene så fjernet ved sentrifugering på Ficoll-Pague i 8 min. ved 2500xg ved 4°C. E-rosett-negative enkjernede miltceller (E Spl) som ga bånd ved grenseflaten ble vasket én gang i RPMI 16 40 medium og resuspendert i det samme inneholdende 15% y/v FCS, L-glutamin (2 mmol/1), natriumpyruvat (1 mmol/1), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 yg/ml), hypoxantin (lxl0~<4>M), aminopterin (4xlO~<7>M) og thymidin (l,6xl0~<5>M).

Dette medium kalles heretter HAT-medium.

B. Celle- drevet transformasjon av celler

Celle-drevet transformasjon av E Spl-cellene ble utført ved å dyrke E Spl-cellene sammen med en transformerende cellelinje. Den transformerende cellelinje var en Epstein-Barr kjerneantigen (EBNA) positiv lymfoblastoid human-cellelinje avledet ved etylmetansulfonat (EMS) mutagenese av GM 1500 lymfoblastoid-cellelinjen etterfulgt av seleksjon i nærvær av 30 yg/ml 6-tioguanin for å gjøre cellene hypoxantin-guanin fosforibosyl transferase (HGPRT) fattige og således HAT-sensitive. Denne cellelinje betegnes 1A2 cellelinje og ble deponert hos A.T.C.C. 29. mars 1982 under A.T.C.C. nr.

CRL 8119. lA2-celler i logaritmisk vekstfase ble oppslemmet

i HAT-medium og så kombinert med E Spl-celler i et forhold,

30 lA2-celler pr. E~Spl-celle. Celleblandingen ble plettert i 10 flatbunnede 96 brønners mikrotiter-plater i en konsentrasjon på 155.000 celler/brønn i et volum på 200 yl pr. brønn,

og kulturen inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære inneholdende 6% C02• Kulturene ble foret hver 3 til 4 dag ved å erstatte halvparten av supernatanten med nytt HAT-medium. Brønnene ble observert hver annen dag på et snudd mikroskop etter tegn på celleformering. 2 uker etter plettering av cellene og etter at lA2-celiene var døde på grunn av HAT-seleksjon, ble foringen av brønnene foretatt med en ny mediaformulering identisk med HAT-medier bortsett fra at den manglet aminopterin-komponenten. 18 dager etter plettering observerte man at ca. 70% av brønnene inneholdt formerende celler og at i de fleste av brønnene hadde cellene tilstrekkelig densitet til fjerning og prøving av supernatanter for anti-P. aeruginosa antistoff.

C. Påvisning av spesifikke antistoff- utskillende celler

Supernatanter ble undersøkt med hensyn til nærvær av anti-P. aeruginosa antistoffer ved bruk av en enzym-bundet immunosorbent måle (ELISA)-teknikk (Engvall, E., "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology", Med. Biol.

(1977) 55:193-200). Antigenplatene besto av flatbunnede 96 brønners mikrotiterplater hvis brønner inneholdt forskjellige hele bakterier som var blitt etancl-fiksert til bunnen av brønnen. Platene ble fremstilt ved tilsetning av 50 yl vasket bakteriesuspensjon (ODggQ=0,2) i PBS i brønnene, sentrifugering av platene i 20 minutter ved 500xg, utluftning av PBS, tilsetning av 75 yl etanol i 10 miniutter, fjerning av etanol etterfulgt av lufttørking. Forskjellig antigenplater brukt i undersøkelsen inneholdt: (1) blanding av P. aeruginosa Fisher immunotyper 1 til og med 3 (A.T.C.C. nr. 27312, 27313, 27314); (2) blanding av P. aeruginosa Fisher immunotyper 4 t.o.m. 7 (A.T.C.C. nr. 27315, 27316, 27317, 27318); (3) et klinisk isolat av Escherichia coli; (4) Klebsiella pneumoniae (A.T.C.C. nr. 8047); og (5) en mikrotiterplate uten bakterier. For ELISA-metoden ble brønnene i antigenplatene først blokkert med 75 yl 5% BSA i 1 time for å forhindre ikke-spesifikk binding av protein. Etter å ha tatt ut ikke-absorbert BSA ble supernatanter fra brønnen i kulturplaten igjen plettert i de tilsvarende brønner av antigenplatene (50 yl/brønn) og platene inkubert ved 37°C i et fuktig kammer i 30 minutter. Supernatantene ble så fjernet, brønnene vasket tre ganger med 1% BSA-PBS og 50 yl biotinylert geite-anti-human immunoglobulin (lg) (tago #2593 fortynnet 1:1000 i 1% BSA-PBS) tilsatt hver brønn. Etter 30 minutters inkubering ved 37°C i et fuktet kammer ble biotinylert anti-human lg fjernet, brønnene vasket tre ganger med 1% BSA-PBS, og 50 yl av et forut dannet avidin:biotinylert pepperotperoksydase-kompleks (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) satt til hver brønn. Etter 30 minutters inkubering ved romtemperatur ble overskuddet Vectastain ABC-reagens fjernet, brønnene igjen vasket tre ganger med 1% BSA-PBS, og 100 yl substrat (0,8 mg/ml orto-fenylendiamin-dihydroklorid i 100 mM citratpuffer, pH 5,0, pluss 0,03% n2°2 i ionefritt 1^0, blandet i like volumer rett før plettering) tilsatt hver brønn. Etter en 30 minutters inkubering i mørket, ble 50 yl 3N H2S04 satt til hver brønn for å avslutte reaksjoner. Kultursupernatanter inneholdende antistoffer tilsvarende platens antigen ble påvist ved positiv farveutvikling i tilsvarende brønner og styrken av reaksjonen kvantifisert ved måling av absorbensen ved 490nm på en Dynatech MR 580

mikro ELISA leser.

Analyse av kultursupernatantene ved ovennevnte metode førte til identifisering av tre brønner (6F11, 4G9 og 10B2)

som inneholdt anti-P. aeruginosa spesifisert på de første Fisher-immunotyper 1 til og med 3 plater, men ikke Fisher-immunotypene 4 til og med 7 plater eller noen av kontroll-platene. For å identifisere de funne spesifikke Fisher-immunotyper, ble antigenplater inneholdende etanol-fikserte bakterier av bare én Fisher-immunotype fremstilt som beskrevet ovenfor for hver immunotype. Resultatet av ELISA-målingen som er angitt ovenfor med kultursupernatanter fra brønner 6F11,

4G9 og 10B2 på de enkelte immunotype-plater viste at disse tre brønner inneholdt antistoff spesifikk for Fisher 2 immunotypen.

D. Kloning av spesifikke antistoff- produserende celler

Cellene i brønnene 6F11, 4G9 og 10B2 ble klonet i flere runder (to eller tre) inntil alle klonale supernatanter målt ved ovennevnte ELISA-metode på Fisher 2 immunotype antigenplater ga en positiv reaksjon. Celler ble klonet ved å begrense fortynning på et halvt-flytende sjikt av menneske-forhud fibroblaster i flatbunnede 96 brønners plater. Medier besto av RPMI 1640 inneholdende 15% FCS, L-glutamin (2 mmol/1), natriumpyruvat (1 mmol/1), penicillin (100 IU/ml) og streptomycin (100 yg/ml). Kulturene ble foret hver tredje dag ved erstatning av halvparten av supernatanten med friskt medium. Generelt hadde brønnene tilstrekkelig lymfoblastoid celledensitet mellom 2 og 3 uker etter plettering for analyse av anti-Fisher 2 immunotypespes i fitet.

Således oppnåddes i dette eksperiment tre klonede transformerte human-cellelin^er som er kontinuerlig (udødelig) og som hver utskiller monoklonale human-antistoffer overfor serotypiske determinanter på LPS-molekylene av Fisher immunotype 2 P. aeruginosa. I dette og etterfølgende eksempler har cellelinje og antistoff den produserer samme betegnelse.

Før innsendelse av foreliggende søknad ble den kontinuerlige transformerte human-cellelinje her angitt som 6F11 deponert hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, som A.T.C.C. nr. CRL 8562.

E. Karakterisering av monoklonale antistoffer

Det faktum at de monoklonale antistoffer fra hver av klonene bare reagerte med en eneste (i dette tilfelle Fisher 2) immunotype tydet på at antistoffet var rettet mot et lipopolysakkarid antigen da LPS-seroty<p>en er i samsvar med Fisher-immunotypesysternet (Hanessian, Nature (New Biology) (1971) 229:209-210). For å undersøke dette videre ble en utvidet ELISA-prøve utført med 6F11, 4G9 og 10B2-supernatantene på hele fikserte bakterieplater som inneholdt 17 IATS-serotype stammer av P. aeruginosa, P. aureofaciens, J5 mutanten av E. coli 0111:B4 og et klinisk isolat av Providencia stuartii. 1 fullstendig overensstemmelse med en sammenligning av Fisher-immunotypene og deres tilsvarende LPS-baserte serotyper i IATS-skjemaet (se tabell 1) var hver av anti-Fisher immunoty<p>e 2 klonale supernatanter reaktive med bare IATS-stamme 11. Ingen reaksjoner ble observert på noen av ikke-P. aeruginosa-bakteriene.

En av de tre anti-Fisher immunotype 2 monoklonale human-antistof fer ble karakterisert videre. Basert på sterkere reaktivitet av antistoffet i ELISAer og bedre vekstegenskaper av den respektive cellelinje valgtes 6F11 monoklonet.

Biokjemisk karakterisering av de biologiske arter som gjenkjennes av 6F11 antistoffet ble utført ved immunoplott— analyse. Kort sagt, 20 ug rått LPS (fremstilt ved varm fenol/vann-metoden (Westphal, 0., et al., "Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser", Z. Naturforsch (1952) 79:14 8-155) fra hver av de syv Fisher-immunotyper, 20 yg av kromatografert renset LPS fra E. coli 0111:B4 og Klebsiella pneumoniae (begge fra List Laboratories, Campbell, CA) og 50 yg av et ytre membranpreparat (Tam, M.R., et al., "Serological Classification of Neisseria gonorrhoeae With Monoclonal Antibodies", Infect. Immun. (1982) 36:1042-1053) av Fisher-immunotype 2 bakterier ble alle underkastet natriumdodecyl-sulfat (SDS)-polyakrylamidgel-elektroforese (Hancock, R.E.W.

og Carey, A.M., "Outer Membrane of Pseudomonas aeruginosa: Heat and 2-Mercaptoethanol-Modifiable Proteins", J. Bacteriol.

(1977) 140:901-910). Adskilte molekyltyper ble overført fra gelen til en nitrocellulosemembran (NCM) som beskrevet annet-steds (Towbin, H., et al., "Electrophoretic Transfer of

Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications", Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1979) 76:4350-4354) og NCM-plotten blokkert i 1 time i PBS-Tween (Batteiger, B., et al., "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins Transferred to Nitrocellulose Membranes", J. Immunol. Meth.

(1982) 55:297-307). Plotten ble så inkubert 1 time ved romtemperatur i 30 ml PBS-Tween inneholdende 3 ml ferdig kultur-supernatant fra 6Fll-linjen. Etter fire 5-minutters rensinger i PBS-Tween ble plotten inkubert i en 1:5000 fortynning (i PBS-Tween) kanin anti-menneske lg i 1 time ved romtemperatur. Plotten ble renset fire ganger i PBS-Tween og så plassert i 30 ml av en løsning inneholdende 1:2000 fortynning (i PBS-Tween) av protein A-pepperotperoksydase (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA). Etter 1 times inkubering ved romtemperatur ble plotten renset fire ganger i PBS-Tween og så dykket i 60 ml substrat fremstilt som følger: 120 mg pepperotperoksydase-farveutviklingsreagens (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) ble oppløst i 40 ml kold metanol, 120 yl 30% H202 ble satt til 200 ml tris-pufferet saltvann (TBS - 20 mM tris pH 7,4, 0,5M NaCl); de to løsninger ble blandet rett før tilsetning til plotter. Etter riktig farveutvikling (normalt 15-45 min. etter tilsetning av substrat) ble reaksjonen avbrutt ved rensning av plotten flere ganger i ionefritt vann.

Resultatene var som følger. Positive reaksjoner ble bare funnet i sporene som inneholdt Fisher-immunotype 2 rått LPS

og det ytre membranpreparat av Fisher-immunotype 2 bakterier.

I begge disse spor viste 6Fll-antistoffet seg å gjenkjenne en rekke regelmessig adskilte molekylære enheter som gir opphav til et stige-lignende mønster på immunoplotten. Denne profil var helt i overensstemmelse med det man ser i polyakrylamidgel-elektroforetisk analyse av LPS i nærvær av SDS hvor det ikke har vært påvist at den heterogene størrelsesprofil som vises av båndene skyldes en populasjon av LPS-molekyler med forskjellige vektbidrag tilsvarende antallet 0-antigen-oligosakkarid-sidekjedeenheter til stede pr. molekyl. (Pavla, E.T. og Makela, P.H., "Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Natrium Dodecyl Sulfate/Polyakrylamide Gel Electrophoresis", Eur. J. Biochem., (1980) 107:137-143;

og Goldman, R.D. og Leive, L., "Heterogeneity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Eschérichita. coli 0111 og Salmonella typhimurium LT2" Eur. J. Biochém. (1;980) 107:145-153). Disse data viser kollektivt at den serologiske spesifiteten til monoklonalt antistoff 6F11 er rettet mot LPS-molekylet på Fisher-immunotype 2-bakteriene. Da -serolbgisk spesifitet av LPS-molekyler er basert på strukturen til/gjentatte oligosakkaridenheter og/eller deres glykosidiske-s bindinger (Westphal et al., Prog. Allergy (1983) ; 33 :9-394 ,

viser dataene videre at monoklonalt antistoff 6F11 er spesifikt for en del av oligosakkaridenheten eller bindingen mellom slike enheter istedenfor serologisk bevarte strukturer av LPS.. representert ved kjerneområdet og lipid A.

Isotypen av det 6F11 monoklonale antistoff ble bestemt

i en ELISA-måling i likhet med spesif itetsprøvene,. beskrevet tidligere bortsett fra at biotinylert geite anti-human igG (gamma-kjede - spesifikk, Tago) eller biotinylert geite anti-human IgM (mu-kjede-spesifikk, Tago) ble brukt som reagens i andre trinn istedenfor det bredere reaktive biotinylerte geite anti-human lg. Begge reagenser ble brukt i en 1:500:fortynning, og antigenplaten inneholdt etanol-fiksert Fisher-immunotype 2-bakterier. Positiv reaksjon av 6F11 antistoffet med Fisher-immunotype 2-bakterier ble bare observert med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM-isotype for det mono klonale antistoff.

En fagman vil se at hvis fremgangsmåten i dette.eksempel ble gjentatt flere aanger, og de derved erholdte isotyper av LPS-spesifikke monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne noen IgM og noen IgG isotyper.

F. In vitro aktivitet

In vitro-funksjonell aktivitet av det 6F11 monoklonale antistoff ble eksaminert i en opsonophagocytisk måling som sammenlignet opptaket av radioaktivt merkede bakterier med humane neutrophiler i nærvær av komplement når det 6F11 monoklonale antistoff var til stede og ikke til stede.

Radioaktivt merkede bakterier ble fremstilt.ved å inokulere 5 ml Pseudomonos minimal medium (A.uerard og Snell, kapitel 7, "Biochemical Factors in Growth", Manual of Methods for.General Bacteriology, Gerhardt, P. et al., utg. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1981, s. 79-111) med 10.0 yl

(1 yCi) 3H-leucin (146,5 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) og 30 yl av en natten over trypticase soyamedium-kultur av Fisher-immunotype 2 P. aeruginosa. Røret ble inkubert ved 37°C på en ryster i 4-6 timer etter at overskudd *^H-leucin var fjernet ved fire vaskinger i Hank's balansert saltvannsløsning inneholdende 0,1% gelatin og 5 mmol HEPES, (HBSS/gel), pH 7,2. Bakteriene ble sentrifugert ved 950xg i 10 minutter for hver vask og resuspendert i HBSS/gel til en sluttkonsentrasjon på 6,67 x 10 /ml. Human neutrophiler ble isolert ifølge van Furth og Van Zwet ("In vitro Determination of Phagocytosis and Intracellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear Phagocytes", in Handbook of Experimental Immunology (1973)

vol. 2, D.M. Weir, 2 utg., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 36,1-36,24) med flere modifikasjoner. Brungul hinne

fra 10 ml heparinisert blod ble undersjiktet med Ficoll-Paque og sentrifugert. Den røde blodcelleklump (RBC) ble vasket én gang i RPMI 1640 medium og resuspendert i samme volum PBS på 37°C. 3 ml av denne suspensjon ble så satt til 6 ml 2% dekstran (i 37°C PBS) og innholdene forsiktig, men grundig blandet ende over ende. Etter 20 min. inkubering ved 37°C slik at RBCene fikk sedimentere, ble supernatanten (inneholdende neutrophilene) fjernet og vasket to ganger i 4°C PBS. Cellene ble vasket en gang mer i 4°C HBSS-HEPES (pH 7,2) og resuspendert i samme til 5 x 10 neutrophiler/ml. Lyophilisert kaninserum rekonstituert i 0,0IM EDTA (pH 7,2) og to ganger absorbert med levende bakterier (Bjornson, A.B. og Michael, J.G., "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa. I. Interaction of Opsonins With the Bacterium", J. Inf. Dis. (1974) 130:Suppl.S119-S125) som representerer de syv Fisher-immunotyper, tjente som en kilde til komplement.

For målingen ble 300 yl Fisher-immunotype 2 bakteriesuspensjon satt til 100 yl 6F11 kultur-supernatant (fortynnet 1:1 med varme-inaktivert FCS) i et 1,5 ml Eppendorfrør og inkubert på en rotator ved 37°C i 30 min. Dette ble etterfulgt av sekvensiell tilsetning av 50 yl kompliment og deretter 50 yl neutrophil suspensjon med 30 og 45 minutters inkuberings-perioder på en rotator ved 37°C etter hver av de respektive tilsetninger. Neutrophilene ble så vasket to ganger ved å

fylle røret med kold PBS, sentrifugering i 5 min. ved 100xg og

fjerne supernatanten. 250 yl 0,1N NaOH ble tilsatt for å lyse neutrophilene, røret inkubert i 15 min., hurtigblandet, inkubert ytterligere 15 min., ved hvilken tid 250 yl av rørets innhold ble solubilisert i 3 ml scintillasjonsvæske (Dimilume 30, United Technologies, Packard) og tellet ved bruk av en Beckman LS 7000 væske-scintillasjonsteller. Resultatene ble uttrykt som prosent opptak av innført radioaktivt merkede bakterier. Cpm i forbindelse med innførte radioaktivt merkede bakterier ble målt ved å telle 250 yl av innholdene fra et kontrollrør som hadde gjennomgått ovennevnte forløp, bortsett fra tilsetningen av varme-inaktivert (56°C, 30 min.) normalt kaninserum for monoklonalt antistoff og ingen vaskinger for å fjerne ikke-inntatte bakterier.

Som vist i tabell 2 ble Fisher-immunotype 2-bakterier bare phagocytosert i nærvær av mono onalt antistoff 6F11, og en aktiv kilde til komplement. Når dette eksperiment ble gjentatt ved bruk av Fisher-immunotype 1-bakterier istedenfor Fisher-immunotype 2-bakterier observertes ikke noe bakterielt opptak, hvilket viser spesifiteten av 6F11 antistoffers kapasitet til å opsonisere bakterier og bevirke phagocytose.

Da den kombinerte virkning av opsoniner (spesifikke antistoffer) og polymorfonukleære leukocytter (neutrophiler) synes å være den primære immunitetsmekanisme overfor P. aeruginosa (Pollack, ovenfor), tyder disse data på at antistoff 6F11 under riktig administrering ville gi beskyttelse mot et dødelig angrep av Fisher-immunotype 2-bakterier.

G. In vivo aktivitet

For å prøve ovennevnte hypotese ble dyrebeskyttelses-studier utført med 6F11 antistoffet og flere Fisher-immunotyper av P. aeruginosa. 6F11 antistoff ble først konsentrert fra brukt kultursupernatant ved felling med mettet ammoniumsulfat (50% slutt-konsentrasjon) (Good, A.H., et al., "Purification of Immunoglobulins and Their Fragments", Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. og Shiigi, S.M., utg. W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)). Utfelt materiale ble rekonstituert i sterilt vann, grundig dialysert mot PBS og sterilt filtrert. Nytt kulturmedium som hadde gjennomgått samme fremgangsmåte tjente som negativ kontroll. Hunn BALB/c mus som veide mellom 20 og 22 g ble oppdelt i to grupper på 10 mus hver. Én gruppe ble intraperitonealt inokulert (ip) med 0,5 ml konsentrert 6F11 antistoff (inneholdende ca.

50 yg antistoff bestemt ved radioimmunologisk måling) mens den

andre gruppe fikk ip 0,5 ml konsentrert kulturmedium. 6 timer senere ble alle dyr infisert ip med 0,3 ml av en levende bakteriesuspensjon inneholdende 51D^q Fisher-immunotype 2 P. aeruginosa. Bakteriesuspensjonen var fremstilt fra et kulturmedium i logaritmisk vekstfase, fra hvilket bakteriene ble sentrifugert, vasket to ganger i PBS og resuspendert til den riktige tetthet i PBS. Bakterieinfeksjonen utgjorde 1,2 x 10<8 >levende organismer. Dyr ble observert over et tidsrom på 5 dager. 18 timer etter infeksjon var alle dyr som hadde fått konsentrerte kulturmedier døde. Derimot var de dyr som hadde fått 6F11 mono onalt antistoff alle levende. Sistnevnte gruppe syntes temmelig friske på dette tidspunkt med bare små symptomer på bakterieinfeksjon (d.v.s. en svak uregelmessighet i pelsen). Disse symptomer forsvant 48 timer etter infeksjonen uten noen ytterligere tegn på bakteriesykdom under resten av observasjonsperioden. Lignende eksperimenter utført ved bruk av en infeksjon av 5LD^Q av andre Fisher-immunotyper av P. aeruginosa førte ikke til noen beskyttelse med 6F11 antistoffet. Disse data viser tydelig at passivt overført 6F11 antistoff gir fullstendig og spesifikk beskyttelse mot en dødelig infeksjonsdose av P. aeruginosa.

Eksempel II

Eksempel II viser en fremgangsmåte for fremstilling av

et monoklonalt human-antistoff mot P. aeruginosa Fisher-immunotype 4.

Perifere blod-lymfocytter (PBL) fra e t menn eske som tidligere var utsatt for P. aeruginosa ble anvendt. Ti plater ble sådd med 2000 E~ PBL/brønn pluss 40.000 1A2 celler/brønn i Iscove's modifiserte Dulbecco's medium tilført 15% (v/v) FCS, L-glutamin (2 mmol/1), penicillin (100IU/ml), streptomycin

(100 yg/ml) og Hat som beskrevet i eksempel I. Denne medium-formulering kalles heretter Iscove's medium. Målemetoden som er beskrevet i eksempel I ble anvendt, bortsett fra at E. coli og K. pneumoniae måleplater ble sløyfet. En supernatant i én av brønnene, kalt 9D10, var positiv bare på Fisher-immunotyper 4-7 platen og ble deretter vist å være Fisher 4 spesifikk ved måling av individuelle immunotype-antigenplater. Kloning av celler fra brønn 9D10 ble utført ved å bestråle human PBL

(2,5 x 10<5>/brønn) som tilførselsceller i 0,5-området 96-brønns flatbunnede plater, og Iscove's medium uten HAT-supplement, men fremgangsmåten er ellers som forut beskrevet. Før innsendelse av foreliggende søknad var cellelinje 9D10 som her er beskrevet deponert hos American Type Culture Collection og gitt betegnelsen CRL 8752.

Antistoffet 9D10 var karakterisert som IgM i en isotypebestemmelse som forut beskrevet og ble vist bare å reagere med IATS-stamme 1 i en spesifitetsprøve på IATS serotyper. Ved å anvende tidligere beskrevne fremgangsmåter for immunoplot-analyse, reagerte foreliggende antistoff bare med Fisher-immunotype 4 LPS og et ytre membranpreparat fra Fisher-immunotype 4-bakterier, hvilket viste en stige-lignende profil i likhet med den som er beskrevet for 6Fll-antistoffet.

Ved å anvende de tidligere fremgangsmåter for in vitro-og in vivo-aktivitet fikk man følgende resultater.

For in vivo data se tabell på side 21 vedrørende 9D10 antistoff.

Eksempel III

Eksempel III viser en fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale human-antistoffer mot P. aeruginosa Fisher-

immunotyper 1 og 4.

Den anvendte lymfocytt-kilde var fra en cystisk fibrose-pasient hvis serum inneholdt over normale konsentrasjoner for LPS av flere Fisher-immunotyper. I dette tilfelle ble fem

plater inokulert med 15.000 PBL/brønn pluss 140.000 1A2 celler/brønn. Den samme Iscove's mediaformulering ble anvendt som beskrevet i eksempel II, men var tilsatt 0,5 yg/ml cyklo-

sporin A for funksjonelt å inaktivere T-cellene. Det var ingen T-celle-deplettering under rosettdannelse med AET-SRBC brukt i

dette eksperiment. Nærvær av cyklosporin A ble opprettholdt i mediene inntil målingen av masterbrønnene.

Undersøkelse av kultursupernatantene ble utført som

beskrevet i eksempel II. En supernatant fra brønnen kalt C5D5

var positiv bare på Fisher-immunotyper 4-7-platen og ble bekreftet som Fisher-immunotype 4 spesifikk på individuelle immunotype-antigenplater som forut beskrevet. En annen supernatant fra brønnen kalt C5B7 reagerte bare på Fisher-immunotype 1-3-platen og ble vist spesifikk for Fisher-immunotype 1 på individuelle immunotype-antigenplater som forut beskrevet.

Før innsendelse av foreliggende patentsøknad ble cellelinjene

C5B7 og C5D5 deponert hos American Type Culture Collection og

gitt betegnelsen CRL 8753 og henholdsvis CRL 8754. Både C5D5

og C5B7 ble vist å være IgM målt ved isotopanalyse som forut beskrevet. C5D5 reagerte bare med IATS-stamme 1, mens C5B7 reagerte bare med IATS-stamme 6 som ventet fra sammenhengen mellom Fisher-immunotyper og IATS-serotyper.

I immunoblotanalyse ble foreliggende antistoff C5D5 vist å reagere bare med Fisher-immunotype 4 LPS og et utvendig membranpreparat fra Fisher-immunotype 4-bakterier viste en stige-lignende profil i likhet med den som er beskrevet for 6F11 antistoffet.

I en lignende immunoblotanalyse reagerte antistoffet C5B7 bare med Fisher-immunotype 1 LPS og et utvendig membranpreparat av en Fisher-immunotype 1-stamme som viste en stige-lignende profil.

In vitro- og in vivo-målinger som forut beskrevet gir de følgende resultater.

Opsonofagocytisk måling:

In vivo beskyttelsesstudier:

Ingen videre forandringer etter 3 dager.

Infeksjonsdose: SLD^ levende Fisher-immunotype 4-bakterier.

Ingen videre forandringer etter 3 dager.

Infeksjonsdose: 5LD^q levende Fisher-immunotype 1-bakterier.

Eksempel IV

Eksempel IV viser en fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale human-antistof fer mot P. aeruginosa Fisher-immunotyper 5 og 6 og viser videre den beskyttende aktivitet til antistoffene in vivo mot et dødelig angrep av den homologe stamme.

En perifer blodprøve erholdtes fra en cystisk fibrose-pasient som hadde hatt kronisk infeksjon med P. aeruginosa. Enkjernede celler ble skilt fra blodet som beskrevet i eksempel I. Celle-drevet transformasjon av mottagelige B-celler ble utført som beskrevet i eksempel III, unntatt at 23 plater ble inokulert med 20.000 mononukleære celler pluss 80.000 1A2 celler/brønn i rundbunnede 96-brønners plater (Costar 3799) .

Undersøkelse av kultursupernatantene etter spesifikke antistoffer ble utført ved bruk av en modifikasjon av ELISA-målingen beskrevet i eksempel I. Antigenplater besto av flatbunnede 96-brønners mikrotiterplater (Immulon II, Dynatech), hvis brønner inneholdt forskjellige levende bakterier adsorbert på brønnens bunn. For å lette adsorpsjon av bakteriene på plasten ble 50 pl/brønn poly-L-lysin (PLL) (1 ug/ml i PBS,

pH 7,2) inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Det ikke-adsorberte PLL ble så fjernet, platene vasket én gang med PBS, 50 yl vasket bakteriesuspensjon (ODg60=0,2) i PBS satt til hver brønn, og platene inkubert i 1 time ved 37°C. Ikke-adsorberte bakterier ble fjernet ved å vaske platene tre ganger med saltvann-Tween [0,9% NaCl, 0,05% (v/v) Tween-20]. Bakterie-sammensetningen på platene var som beskrevet i eksempel I, bortsett fra at ingen E. coli eller K. pneumoniae plater ble anvendt. ELISA ble påbegynt ved først å blokkere platene med

200 yl/brønn blokkeringspuffer [PBS, pH 7,2, inneholdende 5%

(vekt/volum) fettfri tørrmelk, 0,01% antiskum A (Sigma) og 0,01% (vekt/volum) thimerosal] i 60 min. ved romtemperatur. Etter blokkering ble platene vasket tre ganger med saltvann-Tween. 50 pl PBS, pH 7,2, inneholdende 0,1% Tween-20 og 0,2%

(vekt/volum) BSA ble så plassert i alle brønner. Supernatanter fra brønner i kulturplatene ble igjen plettert i de tilsvarende brønner av antigenplatene (50 yl/brønn), og platene ble inkubert 30 min. ved romtemperatur. Supernatanter ble så fjernet, brønnene vasket tre ganger med saltvann-Tween, og 50 yl riktig fortynnet pepperotperoksydase (HRP) konjugert geite anti-menneske IgG + IgM (American Qualex International #A1114 + #A1124) ble satt til brønnene. I dette eksempel ble HRP-geit anti-IgG og HRP-geit anti-IgM brukt i en sluttfortynning på 1:5000 og 1:3000, resp., i PBS, pH 7,2, inneholdende 0,05% Tween-20 og 0,1% BSA. Etter 30 minutteres inkubering ved romtemperatur ble overskudd enzym konjugerte geit-antistoffer fjernet, og brønnene ble vasket tre ganger med saltvann-Tween. Resten av den ELISA-involverte tilsetning av substrat og etterfølgende farveutvikling ble utført som beskrevet i eksempel I.

Analyse av kultursupernatantene ved ovennevnte metode førte til identifisering av to brønner (13C1 og 5G2) som bare var positive på Fisher-immunotyper 4-7-plater. Det ble deretter målt med ELISA på individuelle immunotype-antigenplater at antistoff i brønn 13C1 var Fisher-immunotype 5-spesifikt, mens antistoff i brønn 5G2 var Fisher-immunotype 6-spesifikt. Isotypebestemmelse som beskrevet i eksempel I, men ved bruk av ELISA-format og HRP-anti-human IgG og HRP-anti-human IgM-reagenser beskrevet i dette eksempel viste en IgM-isotype for hver av de ovennevnte Fisher-immunotype-spesifikke antistoffer.

Kloning av spesifikke antistoff-produserende celler fra brønnene 13C1 og 5G2 ble utført ved uavhengig å la cellene fra hver brønn gå gjennom flere runder begrensende fortynnings-kloning inntil alle kloningsupernatanter målt etter ovenfor nevnte ELISA-forskrift førte til en positiv reaksjon på den riktige Fisher-immunotype. Kloning ble utført i 96-brønners rundbunnede plater med 1 x IO<5> bestrålte (2400 Rads) human PBLer pr. brønn som tilførte celler. 7 dager senere ble ytterligere 1 x IO5 bestrålte PBLer satt til hver brønn. Den resulterende klonale cellelinje som produserer anti-Fisher immunotype 5 monoklonale human-antistoffer kalles 13C1, mens den klonale cellelinje som produserer anti-Fisher immunotype 6 monoklonale antistoffer kalles 5G2. Det monoklonale antistoff som produseres av hver av de klonale linjer har samme betegnelse som den respektive linje som produserer det.

Før innsendelse av foreliggende patentsøknad ble de her beskrevne cellelinjer 13C1 og "5G2 deponert hos American Type Culture Collection og fikk betegnelsene CRL 8796 og henholdsvis CRL 8797.

Immunoplottanalyse ble utført på utvendig membranpreparater (OMP) fra hver av de syv Fisher-immunotyper med monoklonale antistoffer 13C1 og 5G2 som beskrevet i eksempel I med de følgende modifikasjoner. Etter inkubering med monoklonalt antistoff og etterfølgende vaskeserier i PBS-Tween, ble hver av NCM-plottene inkubert 1 time ved 25°C i en 1:1000 fortynning (i PBS-Tween) alkalisk fosfatase-konjugert geite anti-human IgG + IgA + IgM (Zymed). Plottene ble så vasket 5 ganger 5 min. i PBS-Tween, ved hvilken tid antigen-antistoff-reaksjoner ble synliggjort ved å inkubere plottene i 20-30 min. ved 2 5°C i 30 ml nitroblåtetrazolium/5- brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (NBT-BCIP)-substrat som beskrevet av Leary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1983) 80:4045-4049. Farvefremkalling ble stoppet ved å rense plotten flere ganger i ionefritt vann. Monoklonale antistoffer 13C1 og 5G2 viste en positiv reaksjon bare i de tilfeller man hadde homologe antistoffa bakterielle utvendige membrankombinasjoner. Det vil si monoklonalt antistoff 13C1 reagerte bare med OMP fra Fisher-immunotype 5 og monoklonalt antistoff 5G2 reagerte bare med OMP fra Fisher-immunotype 6. I begge tilfeller førte reaksjonen til en stige-lignende profil med jevnt adskilte bånd som tyder på LPS som det gjenkjente molekylære mål. Til understøttelse for LPS som mål-antigen, fant man videre at de stige-lignende profiler var uforandret i hvert tilfelle når OMPene ble varmebehandlet (100°C, 1 time) og deretter inkubert ved 60°C i 2 timer i nærvær av proteinase K (10-20 yg/50 yg protein i prøven) før elektro-forese. De sistnevnte forbehandlinger er kjent for å ødelegge protein-antigener.

In vitro funksjonell aktivitet av monoklonale human-antistoffer 13C1 og 5G2 ble undersøkt i en opsonophagocytisk baktericid måling. Bakteriene ble høstet i log fase vekst fra kultur i trypticase soyamedium, resuspendert til en OD660 = O'^-00 1 Hank's balanserte saltvannsløsning inneholdende 0,1% gelatin og 5 mil HEPES (HBSS/GEL/HEPES), og deretter fortynnet 1:1000 i den samme puffer. Human-neutrophiler ble isolert fra blodet til normale frivillige personer som beskrevet i eksempel I og resuspendert til 5 x 10 neutrophiler/ml i HBSS/GEL/HEPES. Serum fra koagulert blod fra normale frivillige personer tjente som kilde til human komplement. Før bruk ble 9 deler serum slått sammen med 1 del 0,1M EDTA, pH 7,2, og så absorbert med syv Fisher-immunotyper av P. aeruginosa som beskrevet i eksempel I. For å forhindre aktivering av alterna-tive banekomplement-komponenter, ble det absorberte serum behandlet videre med Zymosan (Sigma) for å fjerne properdin som beskrevet i Bjornson og Michael, J.Inf. Dis. (1974) 130 suppl.: S119-S125.

-Reaksjonene ble påbegynt i 1,5 ml koniske polypropylen-rør ved å slå sammen 100 yl bakteriesuspensjon og 50 yl monoklonal antistoffholdig supernatant. Etter 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur ble 50 yl kompliment, 50 yl neutrophil suspensjon og 250 yl HBSS/GEL/HEPES satt til hvert rør. Rørene ble inkubert i ytterligere 1 time ved 37°C på en rotator, hvoretter 10 yl fra hvert rør ble blandet med 3 ml flytende trypticase soya-agar (45°C) og innholdene slått på trypticase soya-agar-plater. Etter at agaren hadde fått tilstrekkelig tid til å stivne, ble platene oversjiktet med ytterligere 3 ml flytende trypticase soya-agar. Platene ble inkubert natten over ved 37°C og resulterende bakteriekolonier opptellet neste dag på en Quebec koloniteller. Nødvendige kontroller for å undersøke antistoff-spesifitet og om bakterieaktivitet eller ikke var resultatet av opsonophagocytose ble foretatt ved (1) tilsetning av feilaktig monoklonalt antistoff istedenfor riktig antistoff, og (2) erstatning av neutrophiler med HBSS/GEL/HEPES resp. Som vist i tabellene nedenunder, var monoklonale anti-stoffer 13C1 og 5G2 baktericide i forhold til deres homologe stammer. I hvert tilfelle viser resultatene at phagocytisk opptak av opsoniserte bakterier med human-neutrophiler var

primært ansvarlig to^ ^duksjon av bakterietellingene. Gjentagelse av disse eksperimenter ved bruk av ikke-homologe antistoff-bakteriekombinasjoner førte ikke til noe bakterie-opptak, hvilket viser den funksjonelle spesifiteten til hver av de ovennevnte antistoffer som opsoniske antistoffer.

Opsonophagocytisk baktericid måling:

Ved å anvende fremgangsmåten som er detaljert beskrevet

i eksempel I for måling av in vivo aktivitet til de monoclonale antistoffer fikk man de følgende resultater som viser klart at antistoffene 13C1 og 5G2 gir beskyttelse mot en dødelig angrepsdose av den homologe stamme.

In vivo beskyttelsesundersøkelser:

Ingen ytterligere forandringer etter 3 dager

Infeksjonsdose: 5 LD^Q levende Fisher-immunotype 5 bakterier

Ingen ytterligere forandringer etter 3 dager

. Infeksjonsdose: 5 LD^q levende Fisher-immunotype 6 bakterier Eksempel V

Eksempel V viser en fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt human-antistoff mot P. aeruginosa Fisher-immunotype 7 og viser videre den beskyttende virkning av dette antistoff in vivo mot en dødelig infeksjon av den homologe stamme.

En perifer blodprøve ble tatt fra en pasient med cystisk fibrose kjent for å ha en kronisk infeksjon med P. aeruginosa. Enkjernede celler ble skilt fra blodet som beskrevet i eks. I. Celle-drevet transformasjon av mottagelige B-celler ble utført som beskrevet i eksempel II, unntatt at 8 plater ble inokulert med 8000 E~PBLer pluss 60.000 lA2-celler pr. brønn i rundbunnede 96-brønners plater.

Undersøkelse av kultursupernatantene med hensyn til spesifikke antistoffer ble utført som beskrevet i eksempel IV. En supernatant i én av brønnene betegnet 8E7 var positiv bare på Fisher-immunotype 4-7-platen og ble deretter målt å være Fisher 7 spesifikk ved måling på individuelle immunotype-antigenplater. IsotypebestemmeIse som beskrevet i eksempel IV viste en IgM-isotype for Fisher-immunotype 7 spesifikt antistoff.

Kloning av spesifikke antistoff-produserende celler fra brønn 8E7 ble utført etter forskriften som er beskrevet i eksempel IV. Den resulterende klonede cellelinje som produserer anti-Fisher-immunotype monofelonalt 7 antistoff er kalt 8E7.

Det monoklonale antistoff som produseres med denne linje har samme betegnelse. Før innsendelse av foreliggende patentsøknad ble den her beskrevne cellelinje 8E7 deponert hos American Type Culture Collection og gitt betegnelsen CRL 8795.

Immunoplottanalyse utført som beskrevet i eksempel IV på utvendig membranpreparater (OMP) fra hver av de 7 Fisher-immunotyper med monoclonalt antistoff 8E7 viste en positiv reaksjon bare på OMPet fra Fisher-immunotype 7. Reaksjonen førte til en stige-lignende profil av regelmessig adskilte bånd som tyder på LPS som gjenkjent molekylært mål. Immunoplott-profilen var uendret når Fisher-immunotype 7 OPM ble oppvarmet og proteinase K behandlet (se eks. IV) før elektrofores hvilket videre underbygger LPS som målantigenet.

Ved å anvende fremgangsmåter som detaljert er beskrevet

i eksempel I for å bestemme in vivo aktiviteten til monoklonalt antistoff 8E7, fikk man følgende resultater og det vises tydelig at antistoff 8E7 gir beskyttelse mot en dødelig angrepsdose av Fisher-immunotype 7 bakterier.

In vivo beskyttelsesstudier:

Ingen ytterligere forandringer etter 3 dager

Infeksjonsdose: 5 LD^q levende Fisher-immunotype 7 bakterier Eksempel VI

Eksempel VI viser fremgangsmåter for fremstilling av monoklonale human-antistoffer mot serotypiske determinanter

på LPS-molekylene til arter av andre Pseudomonas enn P. aeruginosa. Det viser videre fremgangsmåter for valg fra således fremstilte monoklonale human-antistoffer av slike som er beskyttende hos pattedyr mot en dødelig angrepsdose av de homologe bakterier.

Fremgangsmåtene fra eksempel I-IV kan gjentas ved å bruke høstede lymfocytter fra menneskedonatorer som utgangsmaterialer hvilke er utsatt for andre typer Pseudomonas, f.eks. P. mallei, P. pseudomallei, P. fluorescens, P. putida, P. cepacia, P. stutzeri og P. maltophilia. Potensielle donatorer kan under-søkes som beskrevet i eksempel IV for å bestemme personer som er utsatt for de forskjellige Pseudomonas-arter og undertyper innenfor slike arter. Å utføre fremgangsmåten fra eksempel I-IV ville gi opphav til udødelige human-cellelinjer som utskiller type-spesifikke monoklonale human-antistoffer mot LPS-molekylene til forskjellige typer av disse arter Pseudomonas. Videre analyse av disse monoklonale antistoffer ifølge eksempler I-IV, ville vise de antistoffer som er beskyttende mot de

dødelige følger av infeksjon som skyldes den homologe stamme.

Eksempel VII

Eksempel VII viser fremgangsmåter for fremstilling av monoklonale human-antistof f er mot serotypiske determinanter på LPS-molekylene til stammer av gram-negative bakterier som ikke er av slekten Pseudomonas. Det viser videre fremgangsmåter for å utvelge fra således fremstilte monoklonale human-antistoffer de som er beskyttende i pattedyr mot en dødelig infeksjonsdose av de homologe bakterier.

Fremgangsmåtene fra eksempler I-IV kan gjentas ved som utgangsmaterialer å bruke lymfocytter som er høstet fra human-donatorer utsatt for andre stammer av gram-negative bakterier såsom E. coli, K. pneumoniae, P. vulgaris og S. marcescens. Potensielle donatorer kan undersøkes for å finne personer som tidligere har vært utsatt for forskjellig slike bakteriestammer. Utførelse av fremgangsmåter som tidligere er beskrevet ville føre til udødelige human-cellelinjer som utskiller monoklonale antistoffer mot serotypiske determinanter på LPS-molekylene til E. coli, K. pneumoniae, P. vulgaris og S. marcescens resp. Analyse av disse monoklonale human-antistoffer som tidligere beskrevet ville angi hvilke antistoffer som er beskyttende mot de dødelige følger av infeksjon som skyldes den homologe stamme forutsatt at LPS-molekylene i den homologe stamme er "tilgjengelig" (se omtale av "tilgjengelighet" av LPS-molekyler forut).

Farmasøytiske formuleringer og bruk

De monoklonale antistoffer fremstilt i foreliggende oppfinnelse kan inntas som bestanddeler i farmasøytiske blandinger som inneholder en terapeutisk eller profylaktisk mengde av minst ett av de monoklonale antistoffer fremstilt i foreliggende oppfinnelse med en farmasøytisk virksom bærer. En farmasøytisk bærer bør være en fordragelig, ikke-toksisk substans som er egnet til å avgi de monoklonale antistoffer til pasienten. Sterilt vann, alkohol, fett, vokser og inerte faste stoffer kan brukes som bærer. Farmasøytisk aksepterte hjelpestoffer (puffer-reagenser, dispergeringsmidler) kan også inntas i den farma-søytiske blanding. Slike blandinger kan inneholde et enkelt monoklonalt antistoff for å være spesifikt mot en spesiell stamme eller type bakterier. Dette gir fordelen ved å være et utsøkt spesifikt materiale som ikke inneholder noen fremmede antistoffer. Et slikt produkt kan ha en ulempe ved at det er så spesifikt at det ikke har noen bred anvendelse. Eventuelt kan en farmasøytisk blanding inneholde to eller flere monoklonale antistoffer og danne en "cocktail". Med f.eks.

P. aeruginosa vil en cocktail inneholdende monoklonale human-antistoffer mot hver av immunotypene eller serotypene være et universalt produkt med aktivitet mot mesteparten av de vanlige typer av den spesielle bakterie. Med andre arter og stammer kan et enkelt antistoff eller blandinger av antistoffer også brukes.

Av spesiell interesse er terapeutiske blandinger som har minst to monoklonale human-antistoffer, normalt minst tre,

særlig minst fire, ofte minst syv og kan ha ti eller flere.

Av særlig interesse er kombinasjoner av minst to monoklonale human-antistoffer som spesifikt reagerer med minst to av Fisher-immunotypene, spesielt minst to av Fisher-immunotypene 1, 2, 3,

4, 5, 6 og 7, og fortrinnsvis minst fire. Foretrukne blandinger reagerer med minst fire av Fisher-immunotypene, heller fem til seks og helst alle syv.

Molforholdet av de forskjellige bestanddeler vil normalt ikke adskille seg med mer enn en faktor på 10, heller ikke mer enn en faktor på 5, og vil normalt være i et molforhold ca. 1:1-2 til hver av de andre bestanddelene.

De morickllionale human-antistof fer og farmasøytiske blandinger derav i foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendelig for oral eller parenteral administrering. Fortrinnsvis kan de farmasøytiske blandinger gis parenteralt, d.v.s. subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Således gir foreliggende oppfinnelse blandinger for parenteral administrering som om-fatter en løsning av det monoklonale human-antistof f eller en cocktail derav oppløst i en akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. En rekke vandige bærere kan brukes, f.eks. vann, pufferet vann, 0,4% saltvann, 0,3% glycin og lignende. Disse løsninger er sterile og generelt fri for partikkelformig stoff. Disse blandinger kan steriliseres ved vanlige, velkjente steriliseringsteknikker. Blandingene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpesubstanser etter behov for å nærme seg fysiologiske tilstander slik som pH-justering og pufringsmidler, toniske justeringsmidler og lignende, f.eks. natriumacetat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriumlaktat osv. Konsentrasjonen av antistoff i disse formuleringene kan

variere meget, d.v.s. fra mindre enn 0,5%, normalt 1% til så meget som 15 eller 20 vekt% og vil velges primært basert på væskevolumer, viskositeter osv., fortrinnsvis for den valgte spesielle administreringsform.

Således kunne en typisk farmasøytisk blanding for intra-muskulær injeksjon lages inneholdende 1 ml sterilt pufret vann og 50 mg monoklonalt antistoff. En typisk blanding for intravenøs intusjon kunne lages inneholdende 250 ml steril Ringer's løsning og 150 mg monoklonalt antistoff. Aktuelle fremgangsmåter for fremstilling av parenteralt administrerbare blandinger vil være kjent eller åpenbar for en fagmann og er i nærmere detalj beskrevet f.eks. i Remington<1>s Pharmaceutical Science, 15 utg., Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania

(1975) .

De monoklonale antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan frysetørkes for lagring og rekonstitueres i en egnet bærer før bruk. Denne teknikk har vist seg å være effektiv med vanlige immun-globuliner og vanlig kjent fryse-tørking og rekonstitueringsteknikker kan anvendes. En fagmann vil kjenne til at frysetørking og rekonstituering kan føre til varierende grad av antistoffaktivitets-tap (f.eks. med vanlige immunglobuliner, IgM-antistoffer har tendens til å ha større aktivitetstap enn IgG-antistoffer), og at bruksnivåene kan måtte justeres for å kompensere.

Blandingene inneholdende det foreliggende monoklonale human-antistoff eller en cocktail derav kan gis for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling av gram-negative bakteriesykdommer. Ved terapeutisk anvendelse gis blandinger til en pasient som allerede er infisert med gram-negative bakterier i en tilstrekkelig mengde til å kurere eller i det minste delvis stoppe infeksjonen og dens komplikasjoner. En passende mengde for å oppnå dette er definert som en "terapeutisk virksom dose". Effektive mengder for denne bruk vil avhenge av infeksjonsgraden og den generelle tilstand til pasientens eget immunsystem, men varierer i alminnelighet fra ca. 1 til 200 mg antistoff pr. kg kroppsvekt, idet doser fra 5 til 25 mg pr. kg er mer vanlig brukt. Det må tasohensyr. til at materialer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse generelt kan anvendes i alvorlige sykdomstilstander, d.v.s. livstruende eller potensielt livstruende situasjoner, spesielt bakteriemi og endotoxemi. I slike tilfeller er det i lys av mangelen på fremmedsubstanser og mangel på "fremmedsubstans"-avvisninger, hvilket oppnås med foreliggende mono klonale human-antistoffer fremstilt i foreliggende oppfinnelse, mulig og kan føles ønskelig av den behandlende lege å gi betydelig overskudd av disse antistoffer.

Ved profylaktiske anvendelser gis blandinger inneholdende foreliggende antistoff eller en cocktail derav til en pasient som ikke allerede er infisert med en gram-negativ bakterie for å styrke pasientens motstand mot slik potensiell infeksjon. En slik mengde er definert som en "profylaktisk virksom dose". Ved denne bruk avhenger de nøyaktige mengder igjen av pasientens helsetilstand og generelle immunitetsgrad, men varierer generelt fra 0,1 til 25 mg pr. kg, spesielt 0,5 til 2,5 mg pr. kg.

Enkelte eller flere administreringer av blandingene kan utføres med doseringsmengder og mønstre som velges av den behandlende lege. I alle tilfeller bør de farmasøytiske formuleringer gi en mengde antistoff(er) fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som er tilstrekkelig til å behandle pasienten effektivt.

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet detaljert som illustrasjon og eksempel i den hensikt å gjøre forståelsen derav klarere, vil det være åpenbart at visse forandringer og modifikasjoner kan utføres innenfor rammen av de vedlagte krav.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av humane monoklonale antistoffer som spesifikt reagerer med den serotypiske determinant på det tilgjengelige lipopolylsakkarid-molekylet til Pseudomonas Aeruginosa bakterier av Fisher immunotype l til 7, karakterisert ved at humane B-celler oppnådd fra en pasient utsatt for Pseudomonas Aerunigosa bakterieantigener udødeliggjøres ved virustransformasjon eller cellefusjon; cellelinjer som utskiller monoklonale antistoffer av IgG-eller av IgM-isotype og som er reaktive med det bakterielle lipopolysakkarid-molekyl, isoleres fra de kontinuerlige B-celler og klones; monoklonale antistoffer som har nøytraliserende aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa bakterier testes; og en cellelinje som er istand til å produsere det nøytrali-serende monoklonale antistoff i et næringsmedium dyrkes, og de monoklonale antistoffer som er utskilt av denne cellelinjen utvinnes fra dyrkningssupernatanten.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at B-cellene er gjort kontinuerlige ved Epstein-Barr virus transformasjon.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles humant monoklonalt antistoff som er reaktivt med P.aeruginosa Fisher immunotype 1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles humant monoklonalt antistoff som er reaktivt med P.aeruginosa Fisher immunotype 2.

5. Fremgangsmåte ifølge ]:rav 1, karakterisert ved at det fremstilles humant monoklonalt antistoff som er reaktivt med P.aeruginosa Fisher immunotype 4.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles humant monoklonalt antistoff som er reaktivt med P.aeruginosa Fisher immunotype 5.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles humant monoklonalt antistoff som er reaktivt med P.aeruginosa Fisher immunotype 6.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles humant monoklonalt antistoff som er reaktivt-med P.aeruginosa Fisher immunotype 7.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellelinjen som anvendes er én av ATCC tilgjengelighetsnummerne CRL 8562, CRL 8752, CRL 8753, CRL 8754, CRL 8795, CRL 8796 eller CRL 8797.