FI89278B - Metod foer framstaellning av monoklonal human antikropp mot serotypiska lipopolysackariddeterminanter pao gramnegativa bakterier - Google Patents

Description

0 89278

MENETELMÄ MONOKLONAALISEN HUMAANIVASTA-AINEEN VALMISTAMISEKSI GRAM-NEGATIIVISTEN BAKTEEREIDEN SEROTYYPPISIÄ LIPOPOLYSAKKARIDI-DETERMINANTTEJA KOHTAAN

KEKSINNÖN TAUSTA Keksinnön piiri

Gram-negatilvisen bakteerin aiheuttama sairaus ja sen vakavimmat komplikaatiot ovat syynä ihmispotilaiden huomattavaan morbiditeettiin ja kuolleisuuteen.

Kirjallisuudessa esitettyjen monien tapausten tutkiminen osoittaa, että jotkin gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttaman infektion oireet, erityisesti kuolettavat oireet liittyvät tiettyihin alttiiksi tekeviin tekijöihin. Sellaisten infektioiden esiintymistiheys on lisääntynyt vanhemmissa potilaissa sekä potilaissa, joilla on vakavia, perimmäisiä, lääketieteellisiä tiloja, kuten esimerkiksi palohaavoja, leikkaushaavoja, hitaasti paranevia haavoja, huumausainead-diktiota tai pahanlaatuisia tiloja. Nämä infektiot saattavat olla sairaalaperäisiä (esim. sairaalassa hankittuja) potilailla, jotka on sijoitettu sairaalaan pitkäksi aikaa, ja erityisesti potilailla, joille on suoritettu leikkaus, käytetty instrumentteja suonensisäisesti, tai, joille on suoritettu käsittelyjä, kuten esimerkiksi virtsaputken katetroin- '·’ ti, rakon tähystys, henkitorven avaus, lannepunktio ja lääke aineiden ja liuosten suonensisäinen infuusio tai joita on hoidettu pitkän aikaa immunosupressiivisillä aineilla, korti-kosteroideilla, antimetaboliitellla ja/tai antibiooteilla. Säteilyhoito tekee myös nisäkäsisännän alttiiksi gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttamalle infektiolle.

-- Gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttamissa sairauksissa useimmin tavattavien organismien joukkoon kuuluvat Escherichia coll, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa. Serratia marcescens ja erilaiset Proteus-, Bacteroldes-, Providencla- ja Cltrobacter-lajit 2 89278 (Sonnenwirth, "The Enteric Bacilli and Similar Gram-negative Bacteria," ss.753-790, "Microbiology", toinen painos, Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H.N., Ginsberg, H.S., Wood, W.B., ja McCarty, M., julkaisijat Harper Ja Row (1973); McCabe, W.R., "Gram-Negative Bacteremia," Adv. Intern. Med. (1974) 1^9:315-158; Ja Kreger et al., "Gram-Negative Bacteremia III. Reassesment of Etiology, Epidemiology and Ecology in 612 Patients," Am. J. Med. (1980) 68:332-343).

Myös muut Pseudomonas-. Ja Klebslella-lajlt sekä Aeromonas-, Salmonella-, Flavobacterlum-. Erwinla-, Edwardslella-. Pecto-bacterlum-, Aclnetobacter-. Alcallgenes- ja Shlgella-sukuJen lajit ovat lisäsyynä merkittävään osaan ihmisillä esiintyviä, gram-negatiivisten bakteerelden aiheuttamia sairauksia (Sonnenwirth, supra; McCabe, supra; Kreger et al., supra).

Muutamien viimeisten vuosikymmenien aikana antibiootit ovat valittu hoitomuoto gram-negatiivisten bakteerelden aiheuttamia tauteja vastustettaessa. Jatkuva levinneisyys Ja korkea sairastuvuus sekä kuolleisuus, Jotka liittyvät gram-negatii-visen bakteerin aiheuttamaan sairauteen, kuitenkin tuntuvat vilttaavan antibioottihoidon rajoituksiin näiden organismien aiheuttaman sairauden hoidossa Ja sitä estettäessä. Katso esim., Andriole, V.T., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", J.Lab. Clin. Med. (1978) 94: 196-199· Tämä on antanut aihetta tutkia vaihtoehtoisia estoja hoitomenetelmiä.

Alempaa tutkimusta koskeva kuvaus

Ihmisen tai koe-eläinten aktiivinen immunisointi kokonaisia bakteerisoluja käsittävillä rokotteilla tai puhdistetuilla bakteerien endotoksiineilla Johtaa spesifisten vasta-aineiden kehittymiseen, jotka vasta-aineet kohdistuvat pääasiallisesti kemiallisesti erilaisia, toistuvia oligosakkaridi-determinantteja kohtaan, Jotka sijaitsevat lipopolysakkari-dimolekyylien pinnalla (LSP) (Luderitz et al., "Immunoche-mistry of 0 and R Antigens of Salmonella and Related l! 3 89278

Enterobacterlaceae, "Bacterlol. Rev. (1966) ^0: 192-255; ja Luderitz et al., "Isolation and Chemical and Immunological Characterization of Bacterial Lipopolysaccharides, "Microbial Toxins, osa 4, ss. 1^5-233, Weinbaum, G., Kadis, S., ja Ajl, S.J., julk. Academic Press (1977), katso kuva 1). Tässä suhteessa on tärkeä huomata, että LSP-molekyylit ovat useimpien, joskaan eivät kaikkien gram-negatiivisten bakteereiden ulomman solumenbraanin päärakenneosia (Nikaido, H., Biosynthesis and Assembly of Lipopolysaccharide." Bacterial Membranes and Walls, Leive, L., julk., Marcel Decker, (1973); katso kuva 2). Kuvassa 1 esittää gram-negatiivisen bakteerin soluseinämän mallia, josta käy ilmi lipopolysakkaridlmolekyy-llen asema bakteerin ulomman membraanin suhteen. Tästä mallista puuttuvat sellaiset rakenteet kuten esimerkiksi kapselit, kuori- ja Ilmakerrokset.

Lipopolysakkaridit ovat myös bakteereiden endotoksiinien olennaisia rakenneosia, siten että LPS-molekyylien lipidi-A-osa vastaa syvällisistä patofysiologislsta ominaisuuksista (esim. kuumeesta, alentuneesta verenpaineesta, hajapesäk-kelsestä suonensisäisestä hyytymästä, sokista ja mahdollisesta kuolemasta), Jotka kytkeytyvät endotoksilnin vapautumiseen gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttaman verenmyrkytyksen aikana tai jotka on kokeellisesti indusoitu endotok-siini-injektioiden avulla (Westphal et ai., "Chemistry and Immunochemistry of Bacterial Lipopolysaccharides as Cell Wall Antigens and Endotoxins, "Prog.Allergy (1983) 33: 9-39). Kuva 2 kuvaa gram-negatiivisten lipopolysakkaridien kolmea aluetta: O-spesifinen ketjualue on pitkäketJulnen polysakkaridi, Joka koostuu toistuvista lipopolysakkari-di-yksiköistä. Eri bakteerilajeilla nämä oligosakkaridiyk-siköt saattavat sisältää yhdestä aina kuuteen tai seitsemään monosakkaridi-yksikköön saakka. Serotyyppiset LPS:n determinantit (katso teksti) on tuotu esiin molekyylin tällä alueella. Core-alue sisältää useita monosakkarideja järjestäytyneinä siten, että ne ovat suhteellisen muuttumattomia gram-negatiivisen bakteerin kannasta toiseen. Lipidi-A-alue „ 89278 on oleellisesti sama kaikissa gram-negatlivisissa bakteereissa, se on tavallisesti kiinnittynyt core-osaan keto-deoksioktoonihappo-osan välityksellä Ja toimii lipopolysakka-ridi-molekyylin kiinnittymiskohtana ulkomembraaniin.

Tyyppispesifisten anti-LSP-vasta-aineiden induktiota ja immu-noterapeuttista käyttöä on perusteellisimmin tutkittu hoidettaessa sairautta, jonka Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) aiheuttaa, tämän bakteerin korkea-asteisen antibioottiresistenssin vuoksi. Sellaisten vasta-aineiden, Joko ne ovat aktiivisesti syntyneitä tai ne ovat passiivisesti siirrettyjä, on osoitettu olevan suojaavia eläinten erilaisissa infek-tiomalleissa. Selontekoa haluttaessa, katso Pollack, M., "Antibody-Mediated Immunity in Pseudomonas Disease and Its Clinical Application," Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations), Alving, B.M. Ja Finlayson, J.S., julkaisijat, ss. 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, (1979).

Ehkä on vielä tärkeämpää, että infektoivien kantojen LPS-molekyylien tyyppi-spesifisten osien vasta-aineiden korkeiden tiittereiden akuuteissa seerumeissa on havaittu kytkeytyvän eloonjäämiseen potilaissa, joilla on P. aeruglnosan aiheuttama bakteremia (Pollack, M. Ja Young, L. S., "Protective Activity of Antibodies to Exdotoxln A and Llpopolysaccharide at the onset of Pseudomonas aeruginosa Septicemia in Man," J. Clin. Invest. (1979) 63:276-286).

Tämän havainnon on tosiasiassa todettu ulottuvan pääosaan erilaisten gram-negatiivisten organismien aiehuttamia bakteremioita (Zlnner, S.H. Ja McCabe, W.R:, "Effects of IgM and IgG Antibody in Patients with Bacteremia Due to Gram-Negative Bacilli," J.Infect. Pis. (1976) 133:37-^5; ja Clumeck e£ al., "Humoral Immunity and Circulating Immune Complexes in Gram-Negative Bacteremia and Septic Shock," Bacterial Endotoxins and Host Response, ss. 79-91*, Agarwal, M. K., julkaisija Elsevier, (1980).

Ii 5 89278

Vaikka tarkkoja tapoja, joilla anti-LPS-vasta-aineet panevat toimeen sellaisen suojauksen, ei ole vielä kokonaan kuvattu (erityisesti gram-negatiivisten bakteereiden erilaisten sukujen suhteen), ajatellaan yleensä, että ne toimivat helpottamalla LPS-molekyylien poistumista verivirrasta retikuloendo-teliaali-järjestelmän avulla tai tehden LPS:a sisältävät bakteerit herkiksi komplementin välittämälle solujen hajoamiselle ja/tai fagosytoosille (Morrison, D.C: ja Ryan, J.L., "Bacterial Endotoxins and Host Immune Responses", Adv. Immunol, (1979) 28:293-450). Mahdollisesti Jokin yllä esitetyistä suojausmallelsta tai niiden yhdistelmä saattaa toimia vakavissa gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttamissa taudeissa.

Vuonna 1975 Kohler ja Milstein tiedottivat keksinnöstään, Jonka mukaisesti tietyt hiiren solulinjat voivat sulautua hiiren pernasolujen kanssa hybridoma-solujen muodostamiseksi, Jotka voivat erittää puhtaita "monoklonaalisia" vasta-aineita (Kohler, G., Ja Milstein, C., "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity, " Nature (1975) 256:495-497).

Vuoden 1982 yhteenvedossa (=253), Jonka J. Sadoff et ai. ovat Julkaisseet Abstracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy:n sivulla 110, tiedotettiin P^_ aeruglnosan tietyn kannan (serotyypin) LPS-molekyylien oligosakkaridi-determinantteja vastaan kohdistuvista hiiren IgM-luokan monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamisesta hybridoma-tekniikan avulla Ja että nämä hiiren monoklonaaliset vasta-aineet antoivat suojan P^_ aeruginosa-bakteerin saman kannan (esim. homologisen kannan) kuoleman aiheuttavaa ärsykettä vastaan.

Keksinnön yhteenveto

Kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön uusia transformoituja humaani lymfosyyttisolulinjoja sekä humaani monoklonaalisia 6 89278 vasta-aineita, jolloin solulinjat ja vasta-aineet sitoutuvat spesifisesti tiettyihin serotyyppisiin determinantteihin, jotka sijaitsevat gram-negatiivisten bakteereiden ulkomembraani(e)n lipopolysakkaridimolekyylien pinnalla. Monoklonaalisia vasta-aineita saatetaan käyttää nisäkkäillä suojaamaan ärsykettä vastaan ja tekisi mahdolliseksi gram-negatiivisten bakteereiden ihmisissä aiheuttaman taudin patofysiologisten vaikutusten terapeuttisen ja/tai patofysiologisen käsittelyn. Vasta-aineen valmistusmenetelmä on tarkemmin selitetty patenttivaatimuksissa.

Piirroksia koskeva lyhyt kuvaus

Kuva 1 on gram-negatiivisen bakteerin sisäseinää ja membraa-neja valaiseva diagrammi; ja

Kuva 2 on lipopolysakkaridimolekyylin kaaviomalnen kuva.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön transformoituja humaani lymfosyyttisoluja, jotka valmistavat spesifisiä, suojaa-via monoklonaalisia humaani vasta-aineita vastaanottavaisille lipopolysakkaridi-molekyyleille. "Vastaanottavaisilla'’ tarkoitetaan, että LPS-molekyylit ovat ulkoisesti käytettävissä käyttöympäristössä monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa tapahtuvaa suoraa vuorovaikutusta varten. Tämän määritelmän mukaisesti, LPS-molekyylit, jotka ovat irronneet gram-negatiivisista bakteereista ympäröivään ympäristöön, olisivat vapaita suoraan vuorovaikutukseen spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja poistuisivat retiku-loendoteliaali-järjestelmän kautta. Tässä yhteydessä monoklonaalisten vasta-aineiden odotettaisiin olevan hyödyksi erilaisten gram-negatiivisten bakteereiden aiheuttamaa vakavaa sairautta hoidettaessa. Lisäksi, gram-negatiivisten bakteereiden ulkopinnalla sijaitsevat LPS-molekyylit olisivat saatavissa spesifisten monoklonaalisten molekyylien kanssa I! 7 89278 tapahtuvaa suoraa kosketusta varten saaden täten aikaan komplementti-välitteisen bakteerin hajoamisen ja/tai fagosy-toosin. Bakteerit, joita kyseessä oleva keksintö koskee, voidaan edelleen määritellä fagosytoivien solujen avulla hajoaviksi bakteereiksi (mikäli ne opsonoltuvat antikodllla Ja tagosytoivat solut "sulattavat" ne) tai että ne hajoavat suoran vuorovaikutuksen avulla homologisen vasta-aineen tai seerumin komponenttien, kuten esimerkiksi komplementin kanssa, missä suhteessa näiden mekanismien tiedetään olevan ratkaisevan tärkeitä sellaisten organismien poistamisessa. Bakteerin rakenneosien, kuten esimerkiksi kapseleiden, kuorien tai Ilmakerrosten, Jotka saattavat rajoittaa tai estää suoraa lähestyttävyyttä LPS-molekyyleille, ennakoitaisiin vähentävän kyseessä olevan keksinnön käyttökelpoisuutta. Esimerkkeihin bakteereista, jotka sisältävät sellaisia rakenteita, kuuluvat kapseloidut Klebslella-lajlt Ja kuoren ympäröimä Escherichia coll.

Tarkoittamatta rajoittaa kyseessä olevan keksinnön piiriä, voidaan identifioida gram-negatiivisten bakteereiden useita sukuja Ja lajeja, Joilla saattaa olla erityistä mielenkiintoa etiologisen kytkeytymisensä vuoksi ihmisten vakaviin sairauksiin. Ne kuuluvat laajalti gram-negatiivisten organismien kolmeen suureen heimoon, nimittäin Enterobacterlaceae-, Bacteroldaceae- Ja Pseudomonadaceae-helmolhln. Enterobacte-roaceaen tyypillisiin edustajiin kuuluvat esimerkiksi Escherichia coll; Klebsiella lajeja kuten esimerkiksi Κ_^ pneumoniae, K. ozaenae sekä K_;_ rhlnoscleromatls; Enterobacter-laje-ja, kuten esimerkiksi E^ aerogenes, E. cloacea, E. hafnlae ja E^ agglomarans; Serratla marcescens; Proteus-lajeja, kuten esimerkiksi P^ vulgaris, P. mlrabllls, P. rettgerl ja P. morganll; Provldencla stuartll; seka Cltrobacter-lajeja (Son-nenwirth, supra; McCabe, supra; Ja Kreger et al., supra, liitetty viitteenä). Bacteroldaceaen tyypillisiin edustajiin kuuluu Bacteroldes-lajeja, kuten esimerkiksi B^ fragllis; Ja Fusobacterlum-lajeja (Sonnenwirth, supra, liitetty viitteenä). Pseudomonadaceaen tyypillisiin edustajiin kuuluvat 8 89278 P. aeruginosa, P. pseudomallel, P« mallei, P. fluorescens, P. putlda, P. cepacia, P. strutzerl, P. maltophllla (katso Gilardi, G.L., "Pseudomonas Species In Clinical Microbiology," Mt. Sinai J. Med. (1976) ^3:710-726, liitetty viitteenä). Kyseessä olevan keksinnön avulla voidaan saavuttaa suoja myös muita vastaavia organismeja kohtaan.

Edellä luetellut Pseudomonas-lajlt edustavat kyseessä olevan keksinnön edullista sovellutusta, siten että P_;_ aeruglnosan suhteen sovellutus on edullisempi.

On tunnettua, että gram-negatilvisten bakteereiden tiettyjen lajien Joukossa voi olla monia immunologisesti erotettavia kantoja tai tyyppejä. Monissa tapauksissa kantojen tai tyyppien väliset erot voivat Johtua muunnoksista LPS-molekyylien antigeenirakenteessa ja erityisesti rakenteellisesta vaihtelusta LPS-molekyylien O-spesifisissä sivuketjuissa (katso kuva 1). Täten rakenteellisesti erilaiset O-spesifiset sivu-ketjut esittävät erilaisia antigeeni-rakenteita. Sellaisen antigeenisen muunnoksen immunologisen tunnistamisen tuloksena on annetulle antigeeni-muunnokselle spesifisten vasta-aineiden syntyminen. Kun sellaisia vasta-aineita on käytetty erottamaan serologisesti (esim. agglutinaation, ELISAN, jne. avulla) yhtä antigeeni-muunnosta toisesta, näin tunnistetut antigeeni-muunnokset on nimitetty serotyypeiksi ja niiden sanotaan esittävän serotyyppisiä determinantteja. Täten LPS-molekyylien O-spesifiset sivuketjut esittävät serotyyppisiä antigeeni-determinantteja. Aiheeseen perehtyneet arvostavat sitä, että koska kysessä oleva keksintö antaa käyttöön monoklonaalisla humaanivasta-alneita LPS-molekyylien serotyypplsille determinanteille, voidaan antaa käyttöön vasta-aineita, jotka ovat tyyppispesifisiä, mikä tarkoittaa, että ne ovat spesifisiä lajien joukossa tietyn tyypin LPS-molekyyleille.

Erilaisia serotyyppejä käsiteltäessä voidaan hyödyllisesti

II

9 89278 käyttää erilaisia määrittelykaaviolta. Esimerkkinä sellaisista määrittelykaavoista ovat aeruglnosalle laaditut mää-rlttelykaaviot. Fisherin määrittelykaavio P^_ aeruglnosalle on hyvin tunnettu, Ja sitä kuvataan yksityiskohtaisesti Fish-erin et ai.:n julkaisussa "New Immunötype Scheme for Pseudomonas aeruginosa Based on Protective Antigens", J.Bacterlol. (1969) 98^:835-836, Joka on sisällytetty tähän yhteyteen viitteenä. Tämän Järjestelmän mukaisesti pääosa tunnetusta P^_ ae-ruglnosasta luokitellaan seitsemään tyyppiin: Fisherln lmmu-notyyppi 1; Flsherin immunotyyppi 2; Fisherin immunotyyppl 3; Fisherin Immunotyyppi Fisherin immunotyyppi 5; Fisherin immunotyyppi 6; sekä Fisherin immunotyyppi 7. Samalla tavalla, the International Antigenic Typing Scheme (IATS) -järjestelmä aeruglnosalle (katso, Brokopp, C.D. Ja Farmer, J.J., III, "Typing Methods for Pseudomonas aeruginosa, " Pseudomonas aeruginosa: Clinical Manifestations of Infection and Current Therapy, ss. 89-133, Doggett, R.G., julkaisija, Academic Press, 1979) antaa käyttöön noin 17 erillistä serotyyppiä, joita nimitetään IATS-tyypiksi 1, IATS-tyypiksl 2, Jne. Sekä Fisherin (Hanesslan, S., et ai., "Isolation and Characterization of Antigenic Components of a New Heptavalen Pseudomonas Vaccine," Nature (1971) 229: 209-210) että IATS-määrittelyjärjestelmän suhteen (Brokopp ja Farmer, supra), molempia serotyyppikaavioita koskevan antigeenideterminantin on osoitettu sijaitsevan LPS-molekyy-lissä. Molempien määrittelyjärjestelmien vertailu Ja korrelaatio esitetään taulukossa 1.

10 89278

Taulukko 1 P. aeruglnosan kahden määrittelyjärjestelmän vertailu IATS (serotyyppi) Flsher (imraunotyyppi) 1 l» 2 3,7 3 4 5 3,7 6 1 7 6 8 6 9 10 5 11 2 12 13 14 15 16 3,7 17

Monoklonaalisia vasta-aineita valmistaa humaani donoreilta saatujen B-lymfosyyttisolujen Epstein-Barr virus (EVB)-trans-formaatio, jota solu pitää yllä, Ja mainitut humaanidonorit ovat tai ne ovat olleet alttiita vastaaville gram-negatiivi-sille bakteereille. Näin muodostuneille, vasta-ainetta erittäville solulinjoille on ominaista, että ne ovat Jatkuvasti kasvavia lymfoblasti-soluja, Joilla on diploidinen tumatyyp-pi, ne ovat Epstein-Barr tuma-antigeenin (EBNA) suhteen positiivisia ja erittävät Joko IgG-, IgM-, IgA- tai IgD-isotyy-pin monoklonaalista vasta-ainetta, alatyypit IgGl, IgG2,

II

n 89278

IgG3 Ja IgG4 mukaanluettuina. Solun ylläpitämä transformaa-tiotapahtuma sinänsä on M.E. Lostromin keksintö, ja sitä kuvataan yksityiskohtaisesti Yhdysvaltain patentissa no 4,464,465, joka on liitetty viiteenä tähän yhteyteen. Mono-klonaalisla vasta-aineita voidaan käyttää joko koskemattomina tai palasina, kuten esimerkiksi Fäb tai F(ab')2, tavallisesti koskemattomina. Joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa yhdistää vasta-aineet muihin yhdisteisiin tiettyjen tulosten saavuttamiseksi. Esimerkiksi vasta-aineita voidaan konjugoida sytotoksisiin aineisiin, kuten esimerkiksi radionuklideihin, antibiootteihin, jne.

Tätä menetelmää koskevaa hakemusta, kyseessä olevien monoklo-naalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, havainnollistetaan seuraavin esimerkein. Näiden esimerkkien tarkoituksena on ainoastaan valaista kyseessä olevan keksinnön tyypillisiä patentin suoritusmuotoja eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksinnön piiriä.

KOKEELLINEN OSA

Esimerkki 1

Esimerkki 1 havainnollistaa menetelmiä humaani monoklonaali-sen vasta-aineen valmistamiseksi aeruglnosan Fischer-im-munotyyppi 2:n (IATS-tyyppi 11) LPS-molekyylejä vastaan, Ja esimerkki havainnollistaa edelleen mainitun vasta-aineen suojaavaa aktiivisuutta in vivo homologisen kannan kuolettavaa ärsykettä kohtaan.

A. Sopivien humaanlsolujen saanti

Sopivat humaani B-solut (lymfosyytit) olivat peräisin kuolleen henkilön pernasta, jonka henkilön tiedettiin kuolleen "cystic fibrosis” -sairauteen ja Jolla tiedettiin olleen aiempia P^ aeruglnosan aiheuttamia infektioita.

Perna, Joka saatiin ruumiinavauksessa, leikattiin noin 15 12 69278 mm:n paksuisiksi viipaleiksi. Solut vapautettiin kapselista Ja yhdistävästä matriisista suureen petrimaljaan perfusoimalla varovaisesti kutakin viipaletta fosfaatilla puskuroidulla keittosuolaliuoksella, jossa ei ollut kalsiumia/magneslumia (CMF-PBS) ja joka annosteltiin ruiskuun kiinnitetyn, 18-gaugen neulan kautta. Yksitumaiset solut erotettiin pernasoluvalmisteesta standardisentri-fugointitekniikoln Ficoll-Paquella (Boyum, A., "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood," Scand.

J. Clin. Lab. Invest. (1968) 21_: täydennysosa 97, 77-89) sekä pestiin kaksi kertaa CMF-PBS:llä.

Mononukleaarlsista soluista poistettiin T-solut muunnetulla, E-rosetteja muodostavalla menetelmällä. Lyhyesti sanottuna, solut lietettiin ensin 1x107 solua/ml:n konsentraationa PBSrään, joka sisälsi 20 % vasikan sikiön seerumia (FCS), 4° C:ssa. Yksi ml tätä suspensiota pantiin sitten 17x100 mm:n suuruiseen, pyöreäpohjäiseen polystyreeniputkeen, Johon lisättiin 1χ1θ9 2-amino-etyyli-isotiouroniumbromidilla (AET) käsiteltyjä lampaan punasoluja 10 öisestä (tilav./tilav.) liuoksesta, joka oli RPMI 1640 elatusaineessa (Madsen, M. ja Johnson, H.E.; "A Methodological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells," J_;_ Immun. Methods (1979) 27.:61-74). Suspensiota sekoitettiin varovaisesti 5-10 minuutin ajan 4°C:ssa, Ja E-rosetteja muodostaneet solut poistettiin sentrifugoimalla Ficoll-Paquella 8 minuutin ajan 2500xg, 4°C:ssa. E-rosettien muodostamisen suhteen negatiiviset pernan mononukleaariset solut (E“Spl), jotka kerrostuivat rajapintaan, pestiin kerran RPMI 1640 elatusaineessa ja ne lietettiin uudelleen samaan elatusaineeseen, joka sisälsi 15 % (tilavuus/tilavuus) FCS:a, L-glutamllnia (2mmooli/litra), natriumpyruvaattia (lmmooli/1), penisilliiniä (100 kansainvälistä ykslkköä/ml), streptomysiiniä (100j4g/ml), hypoksantiinla (lxlO-^M), amlnopteriiniä (4xl0_iiM) sekä tymidiiniä (1,6x10~5m) . Tätä elatusainetta nimitetään myöhemmin tässä yhteydessä HAT-elatusaineeksi.

li .

13 89278 B. Solun liikkeelle panema solujen transformaatio

Solun liikkeelle panema E“Spl-solujen transformaatio suoritettiin viljelemällä E“Spl-solujen yhdessä transformoivan so-lulinjan kanssa. Transformoiva solulinja oli Epstein-Barr tuma-antigeeni-positiivinen (EBNA) humaanilymfoblastisolulin-Ja, joka oli peräisin GM 1500 lymfoblastisolulinjän etyyli-metaanisulfonaatti-(EMS)-mutaatiosta, jonka jälkeen oli suoritettu valinta 6-tioguaniinin (30 ^ig/ml) läsnäollessa, jotta soluista tulisi sellaisia, että niistä puuttuu hypoksantiini-guaniini-fosforibosyylitransferaasi (HGPRT) ja että ne täten olisivat HAT:lie herkkiä. Solulinjaa nimitetään 1A2-solulinjaksi, ja se Jätettiin säilytettäväksi A.T.C:C.:een maaliskuun 29. päivänä, 1982, merkittynä A.T.C.C. no CRL 8ll9:ksi. lA2-solut, jotka olivat logaritmisessa kasvuvaiheessa, suspendoltiin HAT-elatusainee-seen, Ja ne yhdistettiin sen jälkeen suhteessa 30 lA2-solua yhtä E~Spl-solua kohti. Soluseos siveltiin 10 tasapohjaiselle 96 kammiota käsittävälle mikrotiitteri-levylle konsen-traationa 155 000 solua/kammlo, 200jjl:n tilavuutena kammiota kohti, ja viljelmää inkuboitiin 37°C:ssa, kostutetussa ilmakehässä, Joka sisälsi 6 % CC>2:a. Viljelmiä ravittiin Joka kolmas, neljäs päivä korvaamalla puolet supernatantista tuoreella HAT-elatusaineella. Kammioita tarkasteltiin Joka toinen päivä käänteismlkroskoopilla solun Jakautumisen merkkien havaitsemiseksi. Kaksi viikkoa sen Jälkeen kun solut oli siirrostettu levyille Ja lA2-solut olivat kuolleet HAT-valin-nan Johdosta, kammioiden ravitseminen uudella elatusainefor-mulaatiolla suoritettiin yhtäläisesti HAT-elatusaineen kanssa, paitsi että aminopteriinikomponentti puuttui. Kahdensan-toista päivän kulutttua siirrostuksesta havaittiin, että noin 70 % kammioista sisälsi jakaantuvia soluja Ja että useimmissa kammioissa solutiheys oli riittävä supernatant-tien poistamiseksi ja tutkimiseksi antl-P. aeruginosa-vas-ta-aineen suhteen.

1U 89278 C. Spesifistä vasta-ainetta erittävien solujen löytäminen

Supernatantlt seulottiin antl-P. aeruginosa vasta-aineiden suhteen käyttämällä entsyymiin kytkettyä immunosorbenssi-mää-ritys-(ELISA) tekniikka (Engvall, E., "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology,1’ Med. Biol. (1977) 55: 193-200). Antigeenilevyt koostuivat tasapohjaisista, 96-kammioislsta mikrotiltterilevyistä, joiden kammiot sisälsivät erilaisia, kokonaisia bakteereita, jotka oli etanolin avulla kiinnitetty kammion pohjaan. Levyt valmistettiin lisäämällä kammioihin 50 jjl pestyä bakteerisuspensiota (ΟΕ>66θ=0,2), Joka oli PBS:ssä, levyjä sentrifugoitiin 20 minuutin ajan nopeudella 500xg, PBS imettiin pois, lisättiin 75 1 etanolia 10 minuutin ajaksi, etanoli poistettiin, min kä Jälkeen kuivattiin ilmalla. Tutkimuksessa käytettyihin erilaisiin antigeenilevyihln kuuluivat: (1) P. aeruglnosan Pisher-immunotyyppien 1-3 seos (A.T.C.C. numerot 27312, 27313, 27314); (2) P. aeruglnosan Fisher-immunotyyppien 4-7 seos (A.T.C.C. numerot 27315, 27316, 27317, 27318); kliinisesti eristetty Escherichia coll; (4) Klebsiella pneumoniae (A.T.C.C. no 8047); sekä (5) mikrotiitterilevy ilman bakteereita.

ELISA-menetelmää varten antigeeni-levyjen kammioihin lisättiin ensin 75 pl 5 irista BSA:a 1 tunnin ajaksi epäspesifisen proteiinin sitoutumisen estämiseksi. Adsorboitumattoman BSA:n poistamisen Jälkeen, supernatantlt viljelylevyjen kammioista siirrostettiin kopioina antigeenilevyjen vastaaviin kammioihin (50 JX 1/kammio), Ja levyjä inkuboitiin 37°C:ssa, kosteutetuissa kammioissa, 30 minuutin ajan. Sitten superna-tantit poistettiin, kammioita pestiin kolme kertaa 1 öisellä BSA-PBS:llä, ja kuhunkin kammioon lisättiin 50 μ 1 bioti-nyyliä sisältävää vuohen anti-humaani-immunoglobuliinia (Ig) (Tago =2593» laimennettu 1:1000 1 JJ:lsessa BSA-PBS:ssä). Kostutetussa kammiossa, 37°C:ssa suoritetun, 30 minuutin pituisen inkuboinnin jälkeen poistettiin blotinyyliä sisältävä anti-humaani Ig, kammioita pestiin kolme kertaa 1 i:lsella li 15 89278 BSA-PBS: llä, ja kuhunkin kammioon lisättiin 50 ^jl ennalta muodostettua avidiinia: biotinyyliä sisältävä piparjuuri-peroksidaasikompleksia (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Huoneenlämpötilassa suoritetun 30 minuutin pituisen lnkuboinnin jälkeen poistettiin ylimäärä Vectastain ABC-reagenssia, kammiot pestiin Jälleen kolme kertaa 1 irisella BSA-PBS:llä, Ja kuhunkin kammioon lisättiin 100 fjl substratttia (0,8 mg/ml ortho-fenyleenl-diamiinin dihydrokloridia 100 mmolaarisessa sitraattipusku-rissa, pH 5,0 sekä 0,03 i:ista H2C>2:a ionittomassa H20:ssa, yhtä suurina tilavuuksina sekoitettuina Juuri ennen siirros-tusta). Pimeässä suoritetun, 30 minuutin pituisen inkuboin-nin Jälkeen kuhunkin kammioon lisättiin 50 jaI 3N H2S0/j:a reaktioiden lopettamiseksi. Levyillä sijaitsevia antigeenejä vastaavia vasta-aineita sisältävät vilJelmä-supernatantit havaittiin positiivisen värinkehittymisen perusteella vastaavissa kammioissa, ja reaktion voimakkuus kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 490 nm:ssä, Dynatech MR 580 mlkro-ELISA -lukijalla.

Viljelmä-supernatanttien analyysi yllä mainitun menetelmän avulla johti kolmen kammion (6F11, 4G9 Ja 10B2) identifiointiin, jotka sisälsivät antl-P. aeruglnosa-speslfIsyyttä Fish-er-immunotyyppeJä 1-3 koskevalla levyllä, mutta ei Fisher-im-munotyyppejä 4-7 koskevalla levyllä eikä kontrollilevyillä. Tunnistetun, spesifisen Fisher-lmmunotyypin identifioimiseksi valmistettiin, yllä kullekin immunotyypille kuvatulla tavalla, antigeeni-levyjä, jotka sisälsivät etanolilla kiinnitettyjä bakteereita, jotka olivat ainoastaan yhtä Fisher-immunotyyppiä. ELISA-määrityksen suorittaminen, kuten yllä on esitetty, käyttämällä kammioista 6F11, 4G9 ja 10B2 saatuja viljelmäsupernatantteja yksittäisillä immunotyyppi-levyillä, ilmaisi, että nämä kolme kammiota sisälsivät vasta-ainetta, Joka oli spesifinen Fisher-immunotyypille 2.

16 89278 D. Spesifistä vasta-ainetta valmistavien solujen kloonaus

Kammioissa 6F11, MG9 ja 10B2 sijaitsevat solut kloonattiin useita kertoja (kaksi tai kolme), kunnes kaikki kloonaus-supernatantit yllä esitetyllä ELISA-menetelmällä, Fisher-im-munotyyppi 2:n antigeenilevyillä antoivat positiivisen reaktion. Solut kloonattiin rajalaimennusta käyttäen, ihmisen esinahan fibroblastien puoliksi yhtyvällä kerroksella, tasapohjaisissa 96-kammioisissa levyissä. Elatusalne koostui RPMI l640:sta, joka sisälsi 15 % (tilav./tilav.) FCS:a, L-glutamiinia (2 mmoolia/1), natriumpyruvaattia (1 mmoo-li/1), penisilliiniä (100 kansainvälistä yksikköä/ml) sekä streptomysiiniä (100)Ug/ml). Viljelmiä ravittiin Joka kolmas päivä korvaamalla puolet supernatantista tuoreella elatusai-neella. Tavallisesti, kammioissa oli siirrostuksen Jälkeen, toisen ja kolmannen viikon välillä, riittävä lymfoblastisolu-tiheys anti-Fisher 2 immunotyyppispesifisyyden analyysiä varten.

Täten tässä kokeessa saatiin kolme kloonattua, transformoitua humaanisolulinjaa, jotka ovat jatkuvasti viljeltävissä ja jotka kukin erittävät monoklonaalisia humaanivasta-ainei-ta Fisher-immunotyypin 2 P^ aeruglnosan LPS-molekyyleillä sijaitsevia serotyyppisiä determinantteja kohtaan. Tässä ja seuraavissa esimerkeissä solulinjalla ja vasta-aineella, jota se tuottaa, on sama nimitys.

Ennen tämän patenttihakemuksen Jättämistä, jatkuva, transformoitu humaanisolulinja, jota tässä yhteydessä nimitetään 6Fll:ksi, jätettiin säilytettäväksi the American Type Culture Collectioniin, Rockville, MD, A.T.C.C. no CRL 8562:na.

E. Monoklonaallsten vasta-aineiden luonnehtiminen

Se seikka, että kustakin kloonista peräisin olevat vasta-aineet reagoivat yksinomaan yhden ainoan (tässä tapauksessa

Il ; it 89278

Fisher 2) immunotyypin kanssa, tuntui osoittavan, että vasta-aine oli suunnattu lipopolysakkaridi-antigeeniä kohtaan, koska LPS-serotyyppi korreloi Fisherin-immunotyypeiksi luo-kittelevan järjestelmän kanssa (Hanessian, Nature (New Biology) (1971) 229:209-210). Tämän seikan tutkimiseksi edelleen suoritettiin laajennettu ELISA-koe 6F11-, MG9- ja 10B2-super-natanteilla, kokonaisia, kiinnitettyjä bakteereita käsittävillä levyillä, jotka sisälsivät P^ aeruginosan seitsemäntoista IATS-serotyyppikantaa, P^_ aerofaclensln, E. coll 011:B4:n J5-mutantin sekä Provldencla Stuartiin, joka oli kliinisesti eristetty. Sopien täydellisesti yhteen Fisher-im-munotyyppien Ja niiden vastaavien, IATS-kaavioon sisältyvien (ks. taulukko 1), LPS:ään perustuvien serotyyppien vertailun kanssa, kukin anti-Fisher-immunotyyppi 2:n kloonaussuperna-tanteista reagoi ainoastaan IATS-kannan 11 kanssa. Mitään reaktioita el havaittu millään noista el-P. aeruginosa-bakteereista.

Yhtä kolmesta anti-Fisher-immunotyyppi 2 monoklonaalisista vasta-aineista luonnehdittiin edelleen. Vasta-aineen voimakkaan reaktiivisuuden perusteella ELISA-määrityksissä ja vastaavan solulinjan parempien kasvuominalsuuksien vuoksi valittiin 6F11 monoklonaaliseksi.

Molekyylilaatujen biokemiallinen karakterisointi, jossa tunnistamiseen käytettiin 6Fll-vasta-ainetta, suoritettiin immu-no-täplä-analyysin avulla. Lyhyesti sanottuna, natriumdode-syyllsulfaatti (SDS)-polyakryyliamidi-geelielektroforeesi (Hancock, R.E.W. ja Carey, A.M., ’’Outer Membrane of Pseudomonas aeruginosa: Heat and 2-Mercaptoethanol-Modifiable Proteins,” J. Bacterlol. (1977) 1*40:901-910) suoritettiin 20 jug:lle raakaa LPS:a (valmistettu kuumalla fenoli-vesi-me- • · netelmällä (Westphal, 0., et ai., "Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser," Z. Naturforsch (1952) 79:1^8-155), Jotka olivat peräisin kustakin seitsemästä Fisher-immunotyypistä, 20^g:lle kromatografisesti puhdistettua LPS:a, Joka oli saatu E^_ coli 0111:B4:stä sekä ie 89278

Klebsiella pneumonlaelta (molemmat List Laboratoriesilta, Cambell, CA) sekä 50 yug:lle Fisher-immunotyyppi 2 bakteerelden ulkomembraanivalmisteelle (Tam, M.R., et al., "Serological Classification of Neisseria gonorrhoeae With Monoclonal Antibodies," Infect. Immun. (1982) 36:1042-1053). Erotetut molekyylilajlt siirrettiin geeliltä nitroselluloosamembraanille (NCM), kuten muualla on kuvattu (Towbin, H., et al., "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications," Proc. Natl. Acad.Scl. USA (1979) 7.9:4350-4354) ja NCM-täplää käsiteltiin yhden tunnin ajan PBS-Tweenissä (Batteiger, B., et al^., "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins Transferred to Nitrocellulose Membranes, " J. Immunol. Meth. (1982) 55.:297-307). Täplää inkuboitiin sitten yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT), 30 ml:ssa PBS-Tweeniä, joka sisälsi 3 ml käytettyä viljel-mäsupernatanttia, Joka oli peräisin 6Fll-solulinjasta. Sen jälkeen kun oli suoritettu neljä viiden minuutin mittaista huuhtelua PBS-Tweenissä, täplää inkuboitiin 1:5000 laimennuksessa (PBS-Tweenissä) kaniinin antihumaani Ig:ä, yhden tunnin ajan, huoneenlämpötilassa. Täplää huuhdottiin neljä kertaa PBS-Tweenissä, ja sitten se pantiin 30 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1:2000 laimennuksen (PBS-Tween) proteiini A-pi-parjuuriperoksidaasia (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA). Huoneenlämpötilassa suoritetun, tunnin pituisen inkuboinnin Jälkeen täplää huuhdottiin neljä kertaa PBS-Tweenissä, ja sitten se upotettiin 60 ml:aan substraattia, joka oli valmistettu seuraavasti: 120 mg plparjuuripe-roksidaasi-värinkehltysreagenssia (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) liuotettiin 40 ml:aan kylmää metanolia; 120 μ\ 30 %:ista H202:a lisättiin 200 ml:aan Trisillä puskuroitua keittosuolaliuosta (TBS-20mM Tris pH 7,4, 0,5M NaCl); kaksi liuosta sekoitettiin Juuri ennen täplien päälle suoritettavaa lisäämistä. Sopivan värin kehittymisen Jälkeen (tavallisesti 15-45 min substraatin lisäyksen Jälkeen) reaktio

II

19 89278 tukahdutettiin huuhtomalla täplää useita kertoja ionittomalla vedellä.

Tulokset olivat seuraavat. Positiiviset reaktiot havaittiin ainoastaan vyöhykkeissä, jotka sisälsivät Flsher-lmmunotyyp-pi 2:n raakaa LPS:a sekä bakteereiden ulkomembraanivalmistet-ta, joka oli Fisher-immunotyyppiä 2. Näissä molemmissä vyöhykkeissä 6F11-vasta-aine näytti tunnistavan sarjan säännöllisesti sijoittuneita, itsenäisiä molekyylikokonalsuuksla, jotka muodostivat tikkaiden kaltaisen kuvion immunotäplälle. Tämä kuva oli täysin yhtäpitävä sen kuvan kanssa, joka nähtiin LPS:n polyakryyliamidi-geelielektroforeei-analyysissä, SDS:n läsnäollessa, mikä oli havainnollistettu, että kaistaleiden osoittama heterogeeninen sivuproflili johtuu LPS-mole-kyyllen populaatiosta, jonka molekyylit eroavat painonlisäys-ten verran, Jotka vastaavat kuhunkin molekyyliin sisältyvien O-antigeenisten oligosakkaridi-slvuketjuyksiköiden lukumäärää (Pavla, E.T. ja Mäkelä, P.H., "Lipopolysaccharide Hetero-genity in Salmlnella typhlmurlum Analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis," Eur. J.

Biochem., (1980) 107: 137-143; sekä Goldman, R.D. Ja Leive, L., "Heterogenity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coll Olli and Salmonella typhlmurlum LT2, Eur. J. Biochem. (1980) 107:145-153). Yhteisesti nämä tiedot ilmaisevat, että monoklonaalisen vasta-aineen 6F11 serologinen spesifisyys kohdistuu LPS-molekyyliin, Joka sijaitsee Fisher-immunotyyppl 2:een kuuluvien bakteereiden pinnalla. Edelleen, koska LPS-molekyylin immunologinen spesifisyys perustuu toistuvien oligosakkaridi-yksiköiden rakenteeseen Ja/tai niiden glykosidisiln sidoksiin (Westphal et ai., Prog. Allergy (1983) 33· 9-39), tulokset ilmaisevat, että monoklonaalinen vasta-aine 6F11 on spesifinen oligosakkaridi-yksikön Jollekin osalle tai sellaisten yksiköiden välillä sijaitsevalle sidokselle pikemmin kuin serologisesti muuttumattomina pysyville LPS:n rakenneosille, joita core-alue ja lipidi A edustavat.

20 89278 6F1l-monoklonaalisen vasta-aineen isotyyppi määritettiin ELISA-määrityksen avulla samalla tavalla kuin aiemmin kuvatut spesifisyys-testit, paitsi että biotlnyyliä sisältävä vuohen anti-humaani IgG (gamma-ketjulle spesifinen, Tago) tai biotinyyliä sisältävä vuohen antl-humaanilgM (mu-ket-julle spesifinen, Tago) käytettiin kakkosvaiheen reagensslna laajemmalti reagoivan, biotlnyyliä sisältävän, vuohen anti-humaani Ig:n sijasta. Molempia regensseja käytettiin 1:500 laimennuksena, sekä käytettiin antigeeni-levyä, joka sisälsi etanolilla kiinnitettyjä Fisher-immunotyyppi 2:n bakteereita. 6F11-vasta-aineen positiivinen reaktio Fisher-immunotyyppi 2:n bakteereiden kanssa havaittiin ainoastaan anti-IgM-reagenssln avulla, mikä havainnollisti IgM-iso-tyypln monoklonaaliselle vasta-aineelle. Kyseessä olevaan aiheeseen perehtyneet ymmärtävät täysin, että jos kyseessä olevan esimerkin mukainen menetelmä toistettaisiin useita kertoja ja määritettäisiin näin saadut LPS-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden isotyypit, saatettaisiin löytää Joitakin IgM- Ja Joitakin IgG-isotyyppeJä.

F. Aktiivisuus in vitro 6F11 monoklonaalisen vasta-aineen toiminnallinen aktiivisuus in vitro tutkittiin opsoniinifagosyyttisen menetelmän avulla, Jossa verrattiin radiomerkattujen bakteereiden vastaanottoa humaanineutrofilleillä komplementin läsnäollessa, kun 6F11 monoklonaalinen vasta-aine oli läsnä tai se puuttui.

Radiomerkatut bakteerit valmistettiin siirrostamalla 5 ml Pseudomonas-mlnlmaall-elatusainetta (Ayerard ja Snell, kappale 7, "Biochemical Factors in Growth," Manual of Methods for General Bacteriology, Gerhardt, P. et aJ., Julk., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1981, ss. 79-111) 100jul:llä (1 Ci) 3H-leusiinia (1^6,5 Cl/mmooli, New England Nuclear, Boston, MA) sekä 30 z*1 :llä Fisher-immunotyyppi 2:een kuuluvan P^ aeruglnosan tryptikaasi-soiJa-lihaliemessä l! 2i 89278 yön yli kasvatettua viljelmää. Putkea inkuboltiin 37°C:ssa, ravistelijassa, 4-6 tunnin ajan, jonka jälkeen 3H-leusiinin ylimäärä poistettiin pesemällä neljä kertaa Hankin tasapainotetussa keittosuolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1 % gelatiinia sekä 5mM HEPES:a, (HBSS/Gel), pH 7,2. Bakteerit sentri-fugoitiin nopeudella 950xg, 10 minuutin ajan, kussakin pe-suvaiheessa sekä lietettiin uudelleen HBSS/Gel:iin lopulliseksi konsentraatioksi 6,67xl0^/ml. Humaanineutrofill it eristettiin van Furthin ja Van Zwetin menetelmän mukaisesti ("In vitro Determination of Phagosytosis and Intracellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear Phagocytes," teoksessa Handbook of Experimental Immunology (1973) osa 12, julk. D.M. Weir, toinen painos, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 36.1-36.24) monia muunnoksia käyttäen. Ruskeankeltainen kuori 10 ml:sta heparinisoitua verta kerrostettiin Ficoll-Paguen kanssa sekä sentrifugoitiin. Punaisten verisolujen (RBC) saostuma pestiin kerran RPMI 1640-elatusaineessa ja lietettiin uudelleen yhtä suureen tilavuuteen PBS:a, 37°C:ssa. Kolme millilitraa tätä suspensiota lisättiin sitten 6 ml:aan 2 %:ista dekstraania (PBS:ssa, 37°C:ssa), ja sisältöä sekoitettiin ainoastaan kumoamalla putki varovaisesti. 37°C:ssa suoritetun, 20 minuutin pituisen inkuboinnin Jälkeen, mikä suoritettiin punasolujen sedimentoimiseksi, supernatantti (Joka sisälsi neutrofiilit) poistettiin ja niitä pestiin kaksi kertaa 4°C:ssa PBS:ssä. Solut pestiin kerran vielä 4°C:ssa HBSS-HEPES:ssä (pH 7,2), ja ne lietettiin uudelleen samaan väliaineeseen konsentraatioksi 5x107 neutrofiiliä/ml. Lyofilisoitu kaniinin seerumi, Joka liuotettiin 0,01 M EDTA:aan (pH 7,2) sekä absorboitiin kahdesti elävien bakteerelden kanssa (BJornson, A.B. ja Michel, J.G., "Factors in Human Serum Promoting Phagosytosis of Pseudomlnos aeruginosa. I. Interaction of Opsonins With the Bacterium," J. Inf. Pis. (1974) 130: täydennysosa, sivut 119-125), Jotka edustivat seitsemää Fisher-lmmunotyyppiä, toimi komplementin lähteenä.

22 8 9 278 Määritystä varten lisättiin 300 μΐ Fisher-immunotyyppi 2:n bakteerisuspenslota 100 jul:aan 6Fll-viljelmän supernatanttia (laimennettu 1:1 lämmöllä inaktivoidulla FCSrl.lä) 1,5 ml:n vetoisessa Eppendorf-putkessa ja inkuboitiin pyörijässä, 37°C:ssa, 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen lisättiin peräkkäin 50 μ1 komplementtia ja sitten 50 jul neutrofiilisuspen-siota 30 minuutin ja *45 minuutin pituisia jaksoja pyörijässä, 37°C:ssa, kunkin vastaavan lisäyksen jälkeen. Sitten neutrofiilit pestiin kahdesti täyttämällä putki kylmällä PBS:llä, sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 100xg:13ä sekä poistamalla supernatantti. Lisättiin 250 μΐ o,IN Na0H:a neutrofiilien liuottamiseksi, putkea inkuboitiin 15 ajan, sekoitettiin,ja inkuboitiin vielä 15 ajan, Jonka jälkeen 250 |il putken sisältöä liuotettiin 3 ml:aan tuikenestettä (Dimilume 30, United Technologies, Packard) ja iskut mitattiin käyttämällä Beckman LS 7000 nestetuikelaskljaa. Tulokset ilmaistiin syötettyjen, radiomerkattujen bakteerelden prosentuaalisena käyttönä. Iskut minuutissa, jotka kytkeytyivät käytettyihin, radiomerkattuihin bakteereihin, mitattiin laskemalla 250 kontrolliputkien sisältöä, Joka oli käsitelty yllä esitetyn menetelmän mukaisesti, paitsi että lisättiin lämmön avulla inaktivoitua (56°C, 30 min) normaalia kaniinin seerumia monoklonaalisen vasta-aineen asemasta eikä suoritettu mitään pesuja käyttämättömien bakteerelden poistamiseksi.

Kuten on esitetty taulukossa 2, Fisher-immunotyyppi 2:een kuuluvat bakteerit joutuivat fagosytoosin kohteeksi ainoastaan monoklonaalisen vasta-aineen 6F11 sekä komplementin aktiivisen lähteen läsnäollessa. Kun tämä koe toistettiin käyttämällä Fisher-immunotyyppi l:n bakteereita Fisher-immunotyyppi 2:n bakteerelden sijasta, mitään bakteerelden käyttöä ei havaittu, mikä täten havainnollisti 6Fll-vasta-aineen suorituskyvyn spesifisyyttä opsonlsoituja bakteereita vastaan sekä fagosytoosin edistymistä. Koska opsonilnien (spesifisten vasta-aineiden) Ja polymorfonukleaaristen leukosyyttien li 23 89278 (neutrofiilIen) yhteistoiminta näyttää olevan primaarinen mekanismi immuniteetille aeruginosaa vastaan (Pollack, supra), nämä tulokset antavat ymmärtää, että vasta-aine 6F11, sopivasti annosteltuna, antaisi suojan Fisher-lmmuno-tyyppi 2:n bakteerelden kuolettavaa ärsykettä kohtaan.

Taulukko 2

Syötettyjen, 3H-Fisher-immuno-tyyppi 2:a vastaavien bakteereiden prosentuaalinen 6 F11-vasta-aine^. Komplementti^ käyttö_ 3.8 + - 6.6 + 2.1« + + 6l.7 a(-) = elatusaine b(-) = lämmöllä Inaktivoitu komplementti G. Aktiivisuus in vivo

Yllä esitetyn olettamuksen tutkimiseksi suoritettiin eläimen suojauskokeita 6Fll-vasta-aineen sekä P^ aeruglnosan useiden Fisher-immunotyyppien avulla. Ensin 6F11-vasta-aine ensin vä-kevöitlin saostamalla se käytetystä vlljelmä-supernatantista kyllästetyn ammoniumsulfaatin avulla (50 Ji:inen lopullinen konsentraatio) (Good, A.H., et ai., "Purification of Immunoglobulins and Their Fragments," Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. ja Shiigi, S.M., Julk. W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980)). Saostettu materiaali liuotettiin uudelleen tislattuun veteen, dialysoltlin perusteellisesti PBS:a vastaan ja suodatettiin 2ί\ S 9 2 78 steriillsti. Samalla tavalla käsitelty tuore elatusaine toimi negatiivisenä kontrollina. Naaraspuoliset BALB/c-hiiret, joiden paino oli 20-22 g, jaettiin kahteen kymmenen hiiren ryhmään. Yksi ryhmä silrrostettiin vatsaontelonsisäisesti (ip) 0,5 ml :11a väkivöityä 6Fll-vasta-ainetta (joka sisälsi noin 50 vasta-ainetta radioimmunologisella menetelmällä määritettynä), kun taas toinen ryhmä sai vatsaontelonsisäisesti 0,5 ml, väkevöityä elatusai-netta. Kuusi tuntia myöhemmin kaikille eläimille annettiin ärsykkeenä ip 0,3 ml elävää bakteerisuspensiota, joka sisälsi 5 LD50 Fisher-immunotyyppi 2:a edustavaa aeruglnosaa. Bakteerisuspensio oli valmistettu elatusalneesta, joka oli logaritmisessa kasvuvaiheessa ja Josta bakteerit sentrifu-goitiin, pestiin kaksi kertaa PBS.ssä ja lietettiin uudelleen PBS:ään sopivaksi solutiheydeksi. Bakteeriärsyke vastasi 1,2x10^ elävää organismia. Eläimiä tarkasteltiin viiden päivän ajan. Kahdeksantoista tunnun kuluttua ärsykkeen antamisesta kaikki eläimet, Jotka olivat saaneet konsentroitua elatusainetta, olivat kuolleet. Sitä vastoin ne eläimet, jotka olivat saaneet 6F11 monoklonaalista vasta-ainetta, olivat kaikki elossa. Viimeksi mainittu ryhmä näytti jokseenkin terveeltä tässä vaiheessa, ainoastaan vähäisin bakteeri-infektion oirein (se on, vähäistä turkin pörhistymistä). Nämä oireet hävisivät 48 tunnissa ärsykkeen antamisen Jälkeen ilman bakteerisairautta koskevia lisätodisteita havaintojakson jäljelle jääneenä aikana. Samanlaisia kokeita suoritettiin käyttämällä ärsykkeenä P^ aeruglnosan muiden Fisher-immuno-tyyppien 5LD5o:a, Joiden tuloksena ei saatu mitään suojaa 6Fll-vasta-aineen avulla. Nämä tulokset havainnollistavat selvästi, että passiivisesti siirretty 6F11-vasta-aine antaa täydellisen ja spesifisen suojan P^_ aeruglnosan kuolettavaa ärsykeannosta vastaan.

Il 25 39278

Esimerkki 2

Esimerkki 2 havainnollistaa menetelmää monoklonaalisen humaa-nivasta-aineen muodostamiseksi P^_ aeruglnosan Fisher-immuno-tyyppiä 4 vastaan.

Käytettilin perifeerisen veren lymfosyyttejä (PBL), jotka oli saatu henkilöstä, Joka oli ollut alttiina P^_ aerugino-salle. Kymmenen levyä siirrostetilin 2000 E- PBL:llä/kammio Ja 40 000 lA2-solulla/kammio Iscove'in muuntamalla Dulbeccon elatusailneella, Jota täydennettiin 15 %:iin (tilav./tllav.) FCS:n suhteen, L-glutamlinilla (2mmoolia/l), penisilliinillä (100 kansainvälistä yksikkö/ml), streptomysiinillä (100 jlig/ml) sekä HAT:llä, esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Tätä elatusaineformulaatiota tässä yhteydessä myöhemmin nimitetään Iscove'in elatusaineeksi. Käytettiin esimerkissä 1 kuvattua määritysmenetelmää, paitsi että E. coli- Ja K. pneu-monlae-määrltyslevyt poistettiin. Erääseen kammioon sisältyvä supernatantti, Jota nimitettiin 9D10:ksi, oli positiivinen ainoastaan Fisher-immunotyyppi 4-7 levyillä, ja tämän jälkeen sen määritettiin olevan spesifisen Fisher 4:Ile, kun se määritettiin yksittäisillä immunotyyppi-antigeeni-1evy11-lä. Kammiosta 9D10 saatujen solujen kloonaus suoritettiin käyttämällä säteilytettyä humaani PBL:a (2,5xl05/kammio) syöjäsoluina pinta-alaltaan 0,5, 96-kammioisilla, tasapohjaisilla levyillä, sekä Iscove'in elatusainetta ilman HAT-l.i-säystä, mutta menetelmä on muutoin edellä kuvatun kaltainen. Ennen kyseessä olevan patenttihakemuksen jättämistä, tässä yhteydessä kuvattu solulinja 9D10 jätettiin tallennettavaksi the American Type Culture Collectioniin CRL 8752:ksi merkittynä.

Vasta-aine 9D10 karakterisoitiin IgMrksi aiemmin kuvatussa lsotyyppimäärityksessä ja sen osoitettiin reagoivan ainoastaan IATS-kannan 1 kanssa IATS-serotyypeillä suoritetussa 26 39278 spesifisyyskokeessa. Käytettäessä aiemmin kuvattuja menetelmiä immunotäplä-analyyslin, kohteena ollut vasta-aine reagoi ainoastaan Fisher-immunotyyppi 4:n LPS:n sekä ulkomembraani-valmisteen kanssa, joka oli Pisher-immunotyyppi 4:a edustavilta bakteereilta peräisin, antaen tikkaiden kaltaisen kuvan samalla tavalla kuin kuvattiin 6Pll-vasta-aineen suhteen.

Käyttämällä aiempia menetelmiä aktiivisuuden määrittämiseksi in vitro ja In vivo, saatiin seuraavat tulokset.

Taulukko 3

Opsonofagosyytti-määrltys:

Syötettyjen, 3H-Flsher-immuno-tyyppi 2:a vastaavien bakteereiden prosentuaalinen 9D10-vas ta-alnea Komplementti** käyttö_ 8.1» + - 4.9 + 9.5 + + 65.3 a(-) = elatusaine 6(-) = lämmön avulla inaktivoitu komplementti In vlvo-tuloksla varten katso sivulta 27 taulukkoa, Joka koskee 9D10-vasta-ainetta.

Esimerkki 3

Esimerkki 3 havainnollistaa menetelmää monoklonaalisten humaanivasta-ainelden valmistamiseksi P^_ aeruglnosan Flsh-er-lmmunotyyppejä 1 Ja M vastaan.

27 89278 Käytetty lymfosyytti-lähde oli peräisin "cystic fibrosis"-po-tilaalta, jonka seerumi sisälsi normaalia suuremmat tiitte-rit useiden Pisher-lmmunotyyppien LPSrlle. Kyseessä olevassa esimerkissä viisi levyä siirrostettiin 15 000 PBL:llä/kammio sekä 140 000 1A2 solulla/kammio. Käytettiin samaa, esimerkissä 2 kuvattua Iscove'in elatusaineformulaatiota, mutta sitä täydennettiin 0,5 j*g:lla/ml syklosporiini A:a, jolloin tarkoituksena oli inaktivoida T-solut toiminnallisesti. T-solut eivät poistuneet kyseessä olevassa kokeessa käytetyn, AET-SRBC:n kanssa tapahtuvan rosettien muodotumisen kautta. Cycloporiinin läsnäoloa pidettiin yllä pääkammioiden määrittämiseen saakka.

Vlljelmäsupernatanttien tutkiminen suoritettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. C5D5:ksi merkitystä kammiosta saatu su-pernatantti oli positiivinen ainoastaan Flsher-immunotyyppe-Jä 4-7 vastaavilla levyillä, Ja se varmistettiin spesifiseksi Fisher-immunotyyppi 4:lie yksityisillä immunotyyppi-anti-geeni-levyillä, aiemmin kuvatulla tavalla. Eräs toinen super-natantti, joka oli peräisin C5B7:ksi merkitystä kammiosta, reagoi ainoastaan Fisher-lmmunotyyppeJä 1-3 vastaavilla levyillä, Ja se varmistettiin spesifiseksi Fisher-immunotyyppi l:n suhteen yksityisillä immunotyyppi-antigeeni-levyillä, aiemmin kuvatulla tavalla. Ennen tämän patenttihakemuksen Jättämistä, solulinjat C5B7 ja C5D5 jätettiin talletettaviksi the American Type Culture Collectioniin Ja ne merkittiin vastaavasti CRL 8753:ksl Ja CRL 8754:ksi. Sekä C5D5:n että C5B7:n osoitettiin olevan IgM:a aiemmin kuvatulla isotyyppi-analyysillä määritettynä. C5D5 reagoi ainoastaan lATS-kannan 1 kanssa, kun taas C5B7 reagoi ainoastaan IATS-kannan 6 kanssa, kuten odotettiin Fisher-immunotyyppien Ja IATS-serotyyp-pien välisen suhteen perusteella.

Limmunotäplä-analyysissä osoitettiin kohteena olevan vasta-aineen C5D5 reagoivan ainoastaan Fisher-immunotyyppi 4:a 28 89278 edustavan LPS:n sekä Fisher-immunotyyppi 4:a edustavista bakteereista saadun ulkomembraanipreparaatin kanssa, mikä ilmeni tikkaiden kaltaisena kuvana, saman kaltaisena kuin on kuvattu 6F11-vasta-aineen suhteen.

Samanlaisessa immunotäplä-analyysissä vasta-aine C5B7 reagoi ainoastaan Fisher-immunotyyppi l:a edustavan LPS:n ja Fish-er-immunotyyppiä 1 edustavan kannan ulkomembraani-preparaat-tia kohtaan, mikä ilmeni tikkaiden kaltaisena kuvana.

Aiemmin kuvatulla tavalla suoritetut _ln vitro- ja in vivo-määritykset antoivat seuraavat tulokset.

Opsonofagosyyttinen määritys: Syötettyjen, 3H-Fisher-lmmuno-tyyppi 4:a vastaavien bakteereiden prosentuaalinen C5D5-vasta-alnea Komplementti^ käyttö_ 8.4 + - 6.3 + 9.5 + + 56.1

Syötettyjen, 3H-Fisher-immuno-tyyppi l:a vastaavien bakteereiden prosentuaalinen C5B7-vasta-alnea Komplementti^ käyttö_ 6.3 + - 6.9 + 17.7 + + 56.3 a(-) = elatusaine k(-) = lämmön avulla inaktivoitu komplementti

II

29 89278

In vivo suoritetut suojaustutkimukset: C5D5 & 9D10 f eläviä/kokonaismäärä 3 päivää ärsykkeen antamisen jälkeen_

Elatusaine 0/10 C5D5 (Anti-Fisher A) 10/10 C5B7 (Anti-Fisher 1) 1/10 9D10 (Anti-Fisher 4) 8/10

Ei muita muutoksia 3 päivän kuluttua.

Ärsykeannos: 5LD50 elävää Fisher-immunotyyppiä 4 edustavaa bakteeria.

C5B7 eläviä/kokonaismäärä 3 päivää ärsykkeen antamisen .jälkeen_

Elatusaine 0/10 C5D5 (Anti-Fisher 4) 2/10 9D10 (Anti-Fisher 4) 0/10 C5B7 (Anti-Fisher 1) 8/10

Ei muita muutoksia 3 päivän kuluttua.

Ärsykeannos: 5LD50 elävää Fisher-immunotyyppiä 1 edustavaa bakteeria.

Esimerkki 4

Esimerkki 4 havainnollistaa menetelmää monoklonaalisten humaani vasta-aineiden valmistamiseksi aeruglnosan Fisher-immunotyyppejä 5 ja 6 vastaan, Ja se edelleen havainnollistaa mainitujen vasta-aineiden suojaavaa vaikutusta ^n vivo homologisen kannan kuolettavaa ärsykettä vastaan.

30 89278 Näyte perifeerisestä verestä saatiin "cystic flbrosis"-poti-laalta, jonka tiedettiin poteneen aeruglnosan aiheuttamaa infektiota. Mononukleaariset solut erotettiin verestä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Herkkien B-solujen solun ylläpitämä transformaatio suoritettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, paitsi että 23 levyä silrrostettiin. 20 000 mononuk-leaarisella solulla sekä 80 000 lA2-solulla kammiota kohti pyöreäpohjäisi!la, 96-kammloisilla levyillä (Costar 3799).

Viljelmäsupernatanttien seulonta spesifisien vasta-aineiden suhteen suoritettiin käyttämällä esimerkissä 1 kuvatun ELI-SA-määrityksen muunnosta. Antigeeni-levyt koostuivat tasapohjaisista, 96-kammioislsta mikrotiitterilevyistä (Immulon II, Dynatech), joiden kammiot sisälsivät erilaisia eläviä bakteereita kammion pohjaan adsorboituneina. Bakteereiden adsorption helpottamiseksi muovin pinnalle. Poly-L-lysiiniä (PLL) (1 ^g/ml PBS:ssä-, pH 7,2), 50 μΐ/kammio, inkuboitlin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Adsorboitumaton PLL pyyhittiin pois, levyt pestiin kerran PBS:llä, kuhunkin kammioon lisättiin 50 pi pestyä bakteerisuspensiota (OD66o=0>2), joka oli PBSrssä, Ja levyjä inkubjoitiin yhden tunnin ajan 37°C:ssa. Adsorboitumattomat bakteerit poistettiin pesemällä levyt kolme kertaa kelttosuola-Tween-seoksella (0,9 %

NaCl:a, 0,05 % (tilav./tilav.) Tween-20). Levyjen bakteeri-koostumus oli esimerkissä I kuvtun kaltainen, paitsi että ei käytetty E. coli- tai K. pneumoniae-levyjä. ELISA aloitettiin käsittelemällä levyt ensin estopuskurilla (blocking-pus-kuri) (200 ul/kammio) (PBS, pH 7,2, Joka sisälsi 5 % (palno/-tilavuus) rasvatonta kuivamaitoa; 0,01 % (tilav./tilav.) An-tifoam A:a (Sigma) sekä 0,01 % (paino/tilav.)timerosaalia) 60 minuutin ajan, huoneenlämpötilassa. Esto- (blocking) vaiheen jälkeen, levyt pestiin kolme kertaa keittosuola-Tween-seoksella. Kalkkiin kammioihin pantiin sitten 50 μΐ PBS:a, pH 7,2, Joka sisälsi 0,1 % Tween-20:a sekä 0,2 % (paino/tila-vuus) BSA:a.

Il 31 89278

Viljelmälevyjen kammioista saadut supernatantit siirrostet-tiin kopioina antigeeni-levyjen vastaaviin kammioihin (50 ρΊ/kammio), ja levyjä inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten supernatantit poistettiin, kammioita pestiin kolme kertaa keittosuola-Tween-seoksella, ja kammioihin lisättiin 50 μΐ sopivasti laimennettua, piparjuuri peroksidaaslin (HPR) konjugoitua vuohen anti-humaani IgG + IgM:a (American Qualex International ^111^ + f AI12^- Tässä esimerkissä käytettiin HRPJ-vuohi anti-IgG:a sekä HRP-vuohi anti-IgM:a vastaavasti lopullisina laimennuksina 1:5000 sekä 1:3000, jotka valmistettiin PBSriin, pH 7,2, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:a Ja 0,1 % BSA:a. Huoneenlämpötilassa suoritetun, 30 minuutin pituisen inkuboinnin Jälkeen ylimäärä entsyymiin konjugoituneita vuohen vasta-aineita poistettiin ja kammiot pestiin kolme kertaa keittosuola-Tween-seoksella. ELISA-menetelmän Jäljelle Jäävä osa, johon kuuluvaat substraatin lisäys sekä sitä seuraava värin kehittyminen, suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Yllä esitetyllä menetelmällä suoritettu viljelmä-supernatant-tien analyysi Johti kahden kammion (13C1 Ja 5G2) identifioitiin, Jotka olivat positiivisia ainoastaan Fisher-lmmuno-tyyppien 4-7 levyillä. Tämän Jälkeen määritettiin ELISA:11a, yksittäisillä immunotyyppi-antigeeni-levyillä, että vasta-aine kammiossa 13C1 oli Fisher-immunotyypille 5 spesifinen, kun taas vasta-aine kammiossa 5G2 oli spesifinen Fisher-immunotyypil- le 6. Isotyyppi-määritykset, Jotka suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, mutta käyttämällä ELISA-formaattia sekä HRP-anti-humaani IgG- Ja HRP-anti-humaani IgM-reagensseJa, joita on kuvattu kyseessä olevassa esimerkissä, havainnollistivat IgM-isotyypin kullekin yllä esitetyille, Fisher-immuno-tyypin suhteen spesifisille vasta-aineille.

Spesifistä vasta-ainetta tuottavien solujen kloonaus kammioista 13C1 sekä 5G2 suoritettiin itsenäisesti suorittamalla 32 89278 kustakin kammiosta saaduille soluille rajalalmennus-kloonauk-sen useampia kierroksia, kunnes kaikki kloonaussupernatantit jotka määritettiin yllä esitetyn ELISA-menetelmän mukaisesti, antoivat positiivisen reaktion sopivalla Fisher-im-munotyyplllä. Kloonaus suoritettiin 96-kammioisllla, pyöreä-pohjaisilla levyillä käyttämällä syöjäsoluina 1x105 säteily-tettyä (2400 radia) humaani PBL:a kammiota kohti. Seitsemän päivää myöhemmin kuhunkin kammioon lisättiin vielä 1x105 sä-teilytettyä PBL:a. Syntyvä, kloonattu solulinja, joka valmistaa anti-Fisher-lmmunotyyppi 5 monoklonaallsta humaani vasta-ainetta, on merkitty 13Cl:ksi, kun taas kloonattu solulinja, joka valmistaa anti-Fischer-immunotyyppi 6 monoklonaallsta humaani vasta-ainetta, on merkitty 5G2:ksi. Kunkin kloonauksen avulla saadun linjan valmistamaa monoklonaallsta vasta-ainetta nimitettiin vastaavan, valmistavan linjan mukaisesti.

Ennen kyseessä olevan hakemuksen jättämistä, tässä yhteydessä kuvatut solulinjat 13C1 Ja 5G2 jätettiin säilytettäviksi the American Type Culture Collectlonlin ja niille annettiin vastaavasti merkinnät CRL 8796 ja CRL 8797·

Immunotäpläanalyysl suoritettiin kustakin seitsemästä Fisher-immunotyypistä saaduilla ulkomembraanipreparaateilla (OMP) monoklonaalisten vasta-aineiden 13JCl Ja 5G2 kanssa, esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, seuraavia muunnoksia käyttäen. Sen jälkeen kun oli lnkuboitu monoklonaalisen vasta-aineen kanssa Ja tämän jälkeen oli suoritettu pesusarja PBS-Tweenissä, kutakin NCM-täplää inkuboitiln yhden tunnin ajan 25oC:ssa, alkaliseen fosfataasiin konjugoidun vuohen anti-humaani IgG + IgA + IgM:n (Zymed) laimennoksessa 1:1000 (PBS-Tweenlssä). Sitten täpliä pestiin viisi kertaa viiden minuutin ajan PBS:Twee- nissä, Jonka jälkeen antigeeni-vasta-aine-vuorovalkutukset tehtiin näkyviksi inkuboimalla täpliä 20-30 minuutin ajan 25oC:ssa, 30 ml:ssa nitro-sininen-tetratsollum/5-bromi- li 33 8 9278 4-kloori-3-indolyylifosfaatti (NBT-BCIP) substraattia,

Learyn et ai., kuvaamalla tavalla, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA (1983) §0_: 4045-4049. Värin kehittyminen pysäytettiin huuhtomalla täplää useita kertoja ionittomalla vedellä.

Monoklonaaliset vasta-aineet 13C1 Ja 5G2 antoivat positiivisen reaktion ainoastaan niissä tapauksissa, Joissa oli kysymys homologinen vasta-aine: bakteerlien ulkomembraaniyhdis-telmistä. Se merkitsee, että monoklonaalinen vasta-aine reagoi ainoastaan Fisher-immunotyyppi 5:Itä peräisin olevan 0MP:n kanssa ja monoklonaalinen vasta-aine reagoi ainoastaan Fisher-immunotyyppi 6:lta saadun 0MP:n kanssa. Molemmissa tapauksissa reaktio antoi säännöllisesti sijoittuneiden vyöhykkeiden muodostaman tikkaiden kaltaisen kuvan, mikä ilmaisi LPS:n olleen tunnistettuna molekyylikohteena. Vahvistukseksi sille, että LPS toimi kohde-antigeenina, pantiin merkille, että tikkaiden kaltaiset kuvat olivat muuttumattomat kussakin tapauksessa, kun OMP:ltä käsiteltiin lämmöllä (lOOoC, 1 tunti) ja inkuboitiin sitten 60oC:ssa 2 tunnin ajan prote-inaasi K:n läsnäollessa (10-20 ^ig/50 jAg proteiinia näyttes-sä) ennen elektroforeesin suorittamista. Jälkimmäisten esikäsittelyjen tiedetään vaurioittavan proteiiniantigeeneJä.

Monoklonaalisten humaani vasta-aineiden 13C1 Ja 5G2 toiminnallista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosyytti-sellä, bakteereja tappavalla määrityksellä. Bakteerit koottiin logaritmisessa kasvuvaiheessa viljelmästä, joka oli tryptikaasi-soija-lihaliemessä, lietettiin uudelleen Hankin tasapainotettuun keittosuolaliuokseen, Joka sisälsi 0,1 mM HEPESiä (HBSS/GEL/HEPES), optiseksi tiheydeksi OD660 = 0,100, sitten suoritettiin laimennus suhteessa 1:1000 samassa puskurissa. Humaanineutrofiilit eristettiin normaalien luovuttajien verestä esimerkissä I kuvatulla tavalla Ja lietettiin uudelleen tiheydeksi 5x107 neutrofiiliä/ml/ HBSS/GEL/HEPES:iin. Seerumi, joka oli peräisin normaalien luovuttajien verestä, toimi humaani komplementin lähteenä.

34 89278

Ennen käyttöä, yhdeksän osaa seerumia yhdistettiin 1 osan kanssa 0,1M EDTAra, pH 7,2, ja sitten se absorboitiin P♦ aeruglnosan seitsemän Fisher-immunotyypin kanssa esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Komplementtikomponenttlen vaihtoehtoisen tien aktivoitumisen estämiseksi absorboitunutta seerumia käsiteltiin edelleen Zymosanilla (Sigma), Bjornsonin ja Michaelin kuvaamalla tavalla, J. Inf. Dls. (1974) 130 täyden- nysosa: ss. 119-125, properdiinin poistamiseksi.

Reaktiot aloitettiin 1,5 ml:n vetoisissa, kellamaisissa poly-propyleeniputkissa yhdistämällä 100 H1 bakteerisuspensiota sekä 50 μΐ monoklonaalista vasta-ainetta sisältävää super-natanttia. Huoneenlämpötilassa suoritetun 30 minuutin pituisen inkuboinnin jälkeen kuhunkin putkeen lisättiin 50 j^l komplementtia, 50 μ 1 neutrofilllsuspensiota sekä 250 μΐ HBSS/GEL/HEPES:a. Putkia inkuboitlin toisen tunnin ajan 37°C:ssa, pyörijässä, jonka jälkeen 10 μ\:η erä kustakin putkesta sekoitettiin 3 ml:n kanssa nestemäistä tryptikaasl-soi-ja-agaria (45°C), ja sisällöt kaadettiin tryptikaasi-soiJa-agar-levyille. Sen jälkeen kun agarin oli annettu riittävän aikaa jähmettyä, levyt päällystettin toisella 3 ml:n suuruisella erällä nestemäistä tryptikaasi-soija-agaria. Levyjä inkuboitlin yön yli 37°C:ssa, ja muodostuvat bakteerlpesäk-keet laskettiin seuraavan päivänä Quebec-pesäkelaskiJassa. Sopivat kontrollit, vasta-ainespesifisyyden ja sen seikan tutkimiseksi, oliko bakteereja tappava aktiivisuus opsono-fagosytoosin tulos, määritettiin (1) lisäämällä sopimatonta monoklonaalista vasta-ainetta sopivan vasta-aineen sijasta ja (2) korvaamalla neutrofillit vastaavasti HBSS/GEL/-HEPES:llä. Kuten alempana sijaitsevissa taulukoissa on esitetty, monoklonaaliset vasta-aineet 13C1 ja 5G2 olivat bakteereja tappavia homologisten kantojensa suhteen. Kussakin tapauksessa tulokset ilmaisevat, että opsonisoitujen bak-teereiden fagosytointi humaanineutrofilleillä oli ensisijaisesti syynä bakteereiden lukumäärien laskuun. Näiden li 35 89278 kokeiden toistaminen käyttämällä ei-homologisia vasta-ai-ne-bakteeri-yhdistelmiä tuotti tulokseksi sen, ettei ilmennyt bakteereiden vähenemistä, havainnollistaen täten kunkin yllä esitetyn vasta-aineen toiminnalista spesifisyyttä opso-niini-vasta-aineena.

Opsonofagosyyttisen bakteereja tappavan vaikutuksen määrittäminen:

Bakteeripesäkkeiden 13Cl-vasta-alnea Neutroflllltb lukumäärä0_ 844 + - 721 + 756 + + 11 a(-) = anti-Fisher-immunotyyppi 2 monoklonaalinen humaani vasta-aine 6F11

b(-) = ainoastaan HBSS/GEL/HEPES

c = Koe suoritettiin Fisher-immunotyyppiä 5 edustavilla bakteereilla

Bakteeripesäkkeiden 502 vasta-ainea Neutroflllitb lukumääräc_ 451 + - 422 + 570 + + 166 a(~) = anti-Fisher-immunotyyppi 2 monoklonaalinen humaani vasta-aine 6F11

b(-) = ainoastaan HBSS/GEL/HEPES

c(-) = koe suoritettiin Fisher-lmmunotyypplä 6 edustavilla bakteereilla 36 8 9 2 7 8 Käyttämällä esimerkissä 1 yksityiskohtaisesti esitettyjä menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden aktiivisuuden arvioimiseksi in vivo, saatiin seuraavat tulokset, ja ne havainnollistavat selvästi, että vasta-aineet 13C1 ja 5G2 antavat suojan homologisen kannan kuolettavaa ärsykettä vastaan.

Suojaa koskevat tutkimukset in vivo: 13C1 f eläviä/kuolleita 3 päivän kuluttua ärsykkeen antamisesta 13C1 (anti-Fisher 5) 10/10 C5B7 (anti-Fisher 1) 0/10

Ei muita muutoksia 3 päivän kuluttua Ärsykeannos: 5 LD50 eläviä, Fisher-immunotyyppiä 5 edustavia bakteereita 5G2 f eläviä/kuolleita 3 päivän kuluttua ärsykkeen antamisesta 5G2 (anti-Fisher 6) 10/10 C5B7 (anti-Fisher 1) 0/10

Ei muita muutoksia 3 päivän kuluttua Ärsykeannos: 5LD^q eläviä Fisher-immunotyyppiä 6 edustavia bakteereita li 3? 89278

Esimerkki 5

Esimerkki 5 havainnollistaa menetelmää monoklonaalisen humaani vasta-aineen valmistamiseksi aeruglnosan Flsher-immunotyyppiä 7 vastaan, ja edelleen se havainnollistaa mainitun vasta-aineen suojaavaa aktiivisuutta Iti vivo homologisen kannan kuolettavaa ärsykettä kohtaan.

Näyte perifeerisestä verestä saatiin "cystic fibrosis"-po-tilaalta, jonka tiedettiin poteneen P_j_ aeruglnosan aiheuttamaa kroonista infektiota. Mononukleaariset solut erotettiin verestä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Solun ylläpitämä transformaatio herkillä B-soluilla suoritettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, paitsi että kahdeksan levyä siirrostet-tiln 8000 E -BL:llä sekä 60 000 lA2-solulla kammiota kohti pyöreäpohjäisillä, 96-kammioisilla levyillä.

Viljelmäsupernatanttien seulonta spesifisten vasta-aineiden suhteen suoritettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Erääseen kammioista sisältyvä supernatantti, Joka merkittiin 8E7:ksi, oli positiivinen ainoastaan Fisher-immunotyyppejä 4-7 käsittävillä levyillä, Ja myöhemmin sen määritettiin olevan Fisher 7:ää kohtaan spesifinen, kun se määritettiin immu-notyyppi-antigeeni-levyillä. Esimerkissä 4 kuvatulla tavalla suoritetut isotyyppimääritykset havainnollistivat IgM-lsotyy-pin Fisher-immunotyyppi 7:ää kohtaan spesifiselle vasta-aineelle.

Kammioon 8E7 sisältyvien, spesifistä vasta-ainetta valmistavien solujen kloonaus suoritettiin noudattamalla esimerkissä 4 kuvattua menettelyä. Syntyvä kloonattu solulinja, joka valmistaa anti-Fisher-immunotyyppi 7 monoklonaalista humaani vasta-ainetta, merkitjään 8E7:ksi. Tämän linjan valmistamalla monoklonaalisella vasta-aineella on sama nimitys.

33 «9278

Ennen tämän patenttianomuksen jättämistä, tässä yhteydessä kuvattu solulinja 8E7 jätettiin säilytettävksl the American Type Culture Col.lectioniin ja se nimitettiin CRL 8795:ksi.

Immunotäpläanalyysi, joka suoritettiin.esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, kultakin seitsemältä immunotyypiltä saaduilla ulkomembraanipreparaatellla (OMP), monoklonaallsen vasta-aineen 8E7 kanssa, antoi positiivisen reaktion ainoastaan Pisher-immunotyypiltä 7 saadulla 0MP:llä. Reaktion tuloksena oli säännöllisesti sijoittuneiden vyöhykkeiden muodostama, tikkaiden kaltainen kuva, Joka ilmaisi LPStn tunnistetuksi molekyylikohteeksl. Immunotäpläanalyysin antama kuva oli muuttumaton, kun Fisher-immunotyyppi 7:n OMP:a kuumennettiin ja sitä käsiteltiin proteinaasi K:11a (katso esimerkki 4) ennen elektroforeesia, mikä edelleen puhui sen puolesta, että LPS oli kohde-antigeeni.

Käyttämällä esimerkissä 1 yksityiskohtaisesti kuvattuja menetelmiä monoklonaallsen vasta-aineen aktiivisuuden määrittämiseksi in vivo, saatiin seuraavat tulokset ja havainnollistettiin helposti, että vasta-aine 8E7 antaa suojan kuolettavaa ärsykeannosta vastaan Fisher-immunotyyppiä 7 edustavia bakteereita.

Suojaustutklmukset in vivo: 8E7 f eläviä/kuolleita 3 päivän kuluttua ärsykkeen antamisesta 8E7 (anti-Fisher 7) 10/10 C5B7 (anti-Fisher 1) 1/10

El multa muutoksia 1 päivän kuluttua Ärsykeannos: bED50 elävää, Fisher-immunotyyppiä 7 edustavaa bakteeria ti 39 8 9278

Esimerkki 6

Esimerkki 6 havainnollistaa menetelmiä monoklonaalisten humaani vasta-aineiden valmistamiseksi Pseudomonas-lajien, muiden kuin P. aeruginosan, LPS-molekyyleillä sijaitsevia serotyyppisiä determinantteja vastaan. Kyseessä oleva esimerkki havainnollistaa edelleen monoklonaalisten humaani vasta-aineiden valintamenetelmiä, Jotka vasta-aineet on siten valmistettu, että ne suojaavat nisäkkäitä kuolettavaa ärsykeannosta vastaan homologisia bakteereita.

Esimerkkien 1-4 mukaiset menetelmät voidaan toistaa käyttämällä lähtöaineena lymfosyyttejä, Jotka on kerätty humaani-luovuttajilta, Jota ovat olleet alttiina Pseudomonaksen muille lajeille, kuten esimerkiksi P^_ malleille. P. pseudo-mallellle. P. fluorescensllle. P. putldalle. P. cepacialle, P. stutzerllle sekä P. maltophilialle. Mahdollisia luovuttajia voidaan seuloa esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, henkilöiden määrittelemiseksi, Jotka ovat olleet alttiina erilaisille Pseudomonas-lajellle sekä näiden lajien alatyypeille. Esimerkkien 1-4 mukaisia menetelmiä käyttäen saatettaisiin päätyä jatkuvasti viljeltäviin solulinjoihin, jotka erittävät tyyppispe-sifisiä, monoklonaalisia humaani vasta-aineita Pseudomonaksen näiden lajien yksityisten tyyppien LPS-molekyylejä kohtaan. Näiden monoklonaalisten vasta-aineiden lisäanalyysi, esimerkkien 1-4 mukaisesti suoritettuna, identifioisi ne vasta-aineet, jotka suojaavat homologisen kannan infektiosta johtuvia, kuolettavia seurauksia vastaan.

Esimerkki 7

Esimerkki 7 havainnollistaa menetelmää monoklonaalisten humaani vasta-aineiden valmistamiseksi, gram-negatiivisten bakteereiden kantojen, muiden kuin Pseudomonas-suvun. LPS-molekyyleillä sijaitsevia serotyyppisiä determianantteja kohtaan. Kyseessä oleva esimerkki havainnollistaa edelleen HO 89278 monoklonaalisten humaani vasta-aineiden valintamenetelmiä, kun vasta-aineet ovat siten valmistetut, että ne suojaavat nisäkkäitä homologisten bakteereiden kuolettavaa ärsykean-nosta vastaan.

Esimerkkien 1-4 mukaiset menetelmät voidaan toistaa käyttämällä lähtömateriaalina lymfosyyttejä, Jotka on koottu humaa-niluovuttajilta, Jotka olivat alttiina gram-negatiivisten bakteereiden muille kannoille, kuten esimerkiksi E^_ colille, K. pneumonialle, P. vulgarlkselle sekä S^_ marcescensllle. Mahdolliset luovuttajat voidaan seuloa henkilöiden tunnistamiseksi, jotka aiemmin olivat alttiina sellaisten bakteereiden erilaisille kannoille. Aiemmin kuvattujen menetelmien käyttäminen antaisi tuloksena jatkuvasti viljeltäviä solulinjoja, jotka erittävät monoklonaalisia humaani vasta-aineita colin.

K. pneumonlaen, P. vulgarlksen sekä S^_ marcescensln LPS-mole-kyyleillä sijaitsevia serotyyppisiä determinantteja kohtaan.

Näiden monoklonaalisten humaani vasta-aineiden analyysi aiemmin kuvatulla tavalla ilmaisisi, mitkä vasta-aineet suojaavat homologisten kantojen aiheuttamista infektiosta johtuvilta, kuolemaan johtavilta seurauksilta, edellyttäen, että homologisen kannan LPS-kohdemolekyylit ovat "alttiita” (katso LPS-molekyylin "alttiutta" koskevaa pohdintaa yllä).

Farmaseuttiset formulaatlot ja käyttö

Kyseessä olevan keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita saatetaan sisällyttää komponentteina farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät terapeuttisen tai ehkäisevän määrän ainakin yhtä kyseessä olevan keksinnön mukaista mono-klonaalista vasta-ainetta farmaseuttisesti tehokkaan kantaja-aineen kanssa. Farmaseuttisen kantaja-aineen tulisi olla mikä tahansa yhteen sopiva, myrkytön aine, joka soveltuu monoklonaalisten vasta-aineiden luovuttajaksi potilaalle.

li .

4i 8 9 278

Steriiliä vettä, alkoholia, rasvoja, vahoja sekä lnerttejä kiinteitä aineita saatetaan käyttää kantaja-aineena. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita (puskuroivia aineita, dispergoivia aineita) saatetaan sisällyttää farmaseuttiseen koostumukseen. Sellaiset koostumukset voivat sisältää yksinkertaisen, monoklonaalisen vasta-aineen ollakseen spesifisiä bakteerin yhtä kantaa tai tyyppiä kohtaan. Tämä tarjoaa sen edun, että materiaali on erinomaisen spesifistä eikä sisällä mitään asiaankuulumattomia vasta-aineita. Sellaisen tuotteen haittana saattaa myös olla, että se on niin spesifinen, ettei se sovellu laajalti käytettävksi. Vaihtoehtoisesti, farmaseuttinen koostumus voi sisältää kaksi tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotta muodostuu "coctall". Esimerkiksi P.aeruglnosan ollessa kysymyksessä, "coctallin", joka sisältää monoklonaalisia humaani vasta-aineita kutakin immu-notyyppiä tai serotyypppiä kohtaan, tulisi olla yleistuote,l jolla on aktiivisuutta tuon tietyn bakteerin tavallisten tyyppien pääosaa kohtaan. Muiden lajien tai kantojen ollessa kysymyksessä voidaan käyttää myös yksinkertaista vasta-ainetta tai vasta-aineiden seosta.

Erityistä mielenkiintoa on terapeuttisilla koostumuksilla, joissa on vähintään kaksi monoklonaalista humaani vasta-ainetta, tavallisesti vähintään kolme, tavallisemmin vähintään neljä, usein vähintään seitsemän, ja saattaa olla kymmenen tai useampia vasta-aineita. Erityistä mielenkiintoa on ainakin kahden monoklonaalisen humaani vasta-aineen yhdistelmillä, Jotka spesifisesti reagoivat ainakin kahden Fisher-im-munotyypln kanssa, erikoisesti ainakin kahden kanssa Fisher-immunotyypeistä 1, 2, 3, 5, 6, ja 7 sekä mieluum min ainakin neljän kanssa. Edulliset koostumukset reagoivat ainakin neljän Flsher-immunotyypin kanssa. Edulliset koostumukset reagoivat ainakin neljän Fisher-immunotyypin kanssa, edullisemmin 5-6 tyypin kanssa Ja edullisimmin kaikkien seitsemän kanssa.

42 89278

Erilaisten komponenttien moollsuhde ei tavallisesti vaihtele enemmän kuin kertoimen 10 verran, tavallisesti ei enempää kuin kertoimen 5 verran, ja tavallisesti moolisuhde tulee olemaan noin 1:1-2 jokaiselle muulle komponentille.

Monoklonaaliset humaani vasta-aineet sekä niiden farmaseuttiset koostumukset, jotka ovat tämän keksinnön mukaisia, ovat erityisen käyttökelpoisia suun kautta tai parenteraa-1isesti suoritettavaan annosteluun. Mieluummin saatetaan farmaseuttisia koostumuksia annostella parenteraalisesti, esim. ihonalaisesti, lihaksen- tai laskimonsisäisesti.

Täten tämä keksintö antaa käyttöön parenteraalista annostelua varten koostumuksia, jotka käsittävät monoklonaalisen humaani vasta-aineen liuoksen tai niiden seoksen hyväksyttävän kantaja-aineen liuoksen tai niiden seoksen hyväksyttävään kantaja-aineeseen, mieluummin vettä sisältävään kantaja-aineeseen liuotettuna. Voidaan käyttää erilaisia vettä sisältäviä kantaja-aineita, esim. vettä, puskuroitua vettä, 0,^ Arista keittosuolaliuosta, 0,3 i:ista glysiiniä yms. Nämä liuoksetm ovat steriilejä ja yleensä ne eivät sisällä kiinteää ainetta. Nämä koostumukset saatetaan steriloida tavanomaisilla, hyvin tunnetuilla sterilointimentelmillä. Koostumukset saattavat sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä apu-aineita, joita tarvitaan, jotta olosuhteet muistuttavat fysiologisia olosuhteita, kuten esimerkiksi pH:n säätö- ja puskurointlaineita, (osmoottista) painetta säätäviä aineita yms·, esimerkiksi natriumasetaattla, natriumkloridia, kaliumkloridia, natriumlaktaattia Jne. Vasta-aineen konsentraatio näissä formulaatioissa voi vaihdella laajalti, esim. alle 0,5 %:ista, tavallisesti 1 $:sta aina 15 tai 20 %:iin (painoa), ja se valitaan ensisijaisesti nestetllavuuksien, viskositeettien jne. perusteella, mieluummin valittua, erityistä annostelutapaa varten.

li 43 89278 Täten, tyypillinen, farmaseuttinen koostumus lihaksensisäistä annostelua varten voitaisiin valmistaa sisältämään 1 ml steriiliä, puskuroitua vettä sekä 50 mg monoklonaalis ta vasta-ainetta. Tyypillinen koostumus 1a6kimonsisäistä ruisketta varten voitaisiin valmistaa sisältämään 250 ml steriiliä Ringerin liuosta ja 150 mg monoklonaalista vasta-ainetta. Varsinaiset menetelmät parenteraalisesti annosteltavien koostumusten valmistamiseksi ovat tunnettuja tai aiheeseen perehtyneille selviä, ja niitä kuvataan yksityiskohtaisemmin esim. Remington's Pharmaceutical Seiencessä, 15. painos,

Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1975), joka on viitteenä liitetty tähän yhteyteen.

Kyseessä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan lyo-fisoida varastointia varten ja muodostaa uudelleen sopivaan kantaja-aineeseen käyttöä varten. Tämän tekniikan voidaan osoittaa olevan tehokas tavanomaisten immunoglobuliinlen ollessa kysymyksessä, Ja voidaan käyttää tunnettuja lyofoli-sointi- ja uudelleenmuodostamismenetelmlä. Aiheeseen perehtyneet ymmärtävät täysin, että lyofilisointi ja uudelleen liuottaminen voivat johtaa valhtelevassa määrin vasta-aineen aktiivisuuden häviämiseen esimerkiksi tavanomaisilla immuno-globullineilla, IgM-vasta-aineilla on suuremmassa määrin taipumus menettää aktiivisuutta kuin IgG-vasta-aineil.la) ja että tämä voidaan kompensoida käyttötasoja säätämällä.

Koostumuksia, jotka sisältävät kyseessä olevaa monoklonaa-lista vasta-ainetta tai niiden seosta, voidaan antaa ennalta ehkäisemään gram-negatiivisen bakteerin aiheuttamaa sairautta tai sen hoitamiseen. Terapeuttisessa käytössö koostumuksia annetaan potilaalle, Joka Jo potee gram-negatiivisen bakteerin aiheuttamaa Infektiota, riittävässä määrin parantamaan tai ainakin osittain pysäyttämään infektio ja sen komplikaatiot. Määrä, Joka on riittävä tämän toteuttamiseksi, määritellään "terapeuttisesti tehokkaana annoksena".

ini b 9 2 7 8 Tässä käytössä tehokkaat määrät riippuvat infektion vakavuudesta sekä potilaan immuunijärjestelmän yleistilasta, mutta yleensä ne ovat noin yhdestä noin 200 mg:aan vasta-ainetta kilogrammaa kohti kehon painoa siten, että yleisemmin käytetään annoksia, jota ovat 5-25 mg kilogrammaa kohti. Täytyy muistaa, että keksinnön mukaisia materiaaleja voidaan yleisesti käyttää vakavissa tautitilanteissa, se merkitsee, henkeä uhkaavissa tai mahdollisesti henkeä uhkaavissa tilanteissa, erityisesti bakteremiassa ja endotokse-miassa. Sellaisissa tapauksissa, ottaen huomioon vieraiden aineiden sekä "vieraan aineen" hylkimisen poissaolon, jotka saavutetaan kyseessä olevan keksinnön mukaisilla monoklo-naalisillä humaani vasta-aineilla, on mahdollista, ja hoitavasta lääkäristä saattaa tuntua toivottavalta, annostella näitä vasta-aineita oleellisia ylimääriä.

Annosteltaessa ehkäisevässä mielessä, koostumuksia, Jotka sisältävät kyseessä olevaa vasta-ainetta tai vasta-aineiden seoksia, annetaan potilaalle, joka ei ole vielä gram-negatii-visten bakteerelden infektoima, jpotilaan vastustuskyvyn lisäämiseksi sellaista mahdollista infektiota kohtaan. Sellainen määrä määritellään "ennalta ehkäisevästi tehokkaaksi annokseksi". Tässä käytössä tarkka määrä riippuu jälleen potilaan terveydentilasta ja immuniteetin yleisestä tasosta, mutta yleensä annoksen taso on 0,1-25 mg kilogrammaa kohti, erityisesti 0,5-2,5 mg kilogrammaa kohti.

Koostumusten yksinkertaiset Ja moninkertaiset annostelut voidaan suorittaa hoitavan lääkärin valitsemin annostasoin ja -tavoin. Joka tapauksessa, farmaseuttisten formulaatiolden tulisi antaa käyttöön riittävä määrä kyseessä olevan keksinnön mukaista (mukaisia) vasta-ainetta (vasta-aineita) potilaan tehokkaaksi hoitamiseksi.

li

Claims (11)

45 39278 Vaikka kyseessä olevaa keksintöä on kuvattu jossain määrin yksityiskohtaisesti, valaisemalla sitä esimerkein, jotta keksintö olisi paremmin ymmärretty, on selvää, että saatetaan suorittaa tiettyjä muunnoksia ja muutoksia liitteenä seuraavien patenttivaatimusten puitteissa.

1. Menetelmä monoklonaalisen humaanivasta-aineen valmistamiseksi, joka reagoi spesifisesti jonkun suvuista Enterobacteriaceae, Bacteroidaceae tai Pseudomonadaceae peräisin olevan gram-nega-tiivisen bakteerin luoksepäästävien lipopolysakkaridimolekyylien pinnalla sijaitsevien serotyyppisten determinanttien kanssa, tunnettu siitä, että tehdään jatkuvasti viljeltäviksi gram-negatiivisille bakteeriantigeeneille altistuneelta potilaalta saadut humaani-B-solut; eristetään näistä jatkuvasti viljeltäviksi tehdyistä B-soluista ne solulinjat, jotka erittävät monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat bakteerin lipopo-lysakkaridimolekyylin kanssa; tutkitaan mainituista solulinjois-ta peräisin olevien monoklonaalisten vasta-aineiden aktiivisuus gram-negatiivista bakteeria vastaan; ja viljellään solulinja, joka pystyy tuottamaan tätä monoklonaalista vasta-ainetta ja otetaan talteen solulinjan erittämät monoklonaaliset vasta-aineet .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-solut tehdään jatkuvasti viljeltäviksi Epstein-Barr-virustransformaatiolla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solulinja on hybridisolulinja.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solulinja on transformoitu imusolu.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luoksepäästäville lipopolysakkaridimolekyyleille spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet ovat IgG- tai IgM-iso-tyyppiä. 46 89278

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solulinja on ATCC-talletusnumeroltaan joku seuraa-vista: CRL 8562, CRL 8752, CRL 8753, CRL 8754, CRL 8795, CRL 8796 tai CRL 8797.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine pystyy reagoimaan Pseudomonas aeruginosan lipopolysakkaridin kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Pseudomonas aeruginosa on Fisher-immunotyyppiä 1-7.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine neutraloi kyseisen bakteerin infektiivisyyden.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine neutraloi jonkun suvuista Enterobacteriaceae, Bacteroidaceae tai Pseudomonadaceae peräisin olevan gram-negatiivisen bakteerin.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerilaji on Pseudomonas aeruginosa.