CN111454363A - 结合cd40的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与人CD40特异结合的分离的单克隆抗体。还提供编码该抗体的核酸分子，以及用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供包含该抗体的免疫交联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本发明抗体的治疗方法。

Description

结合CD40的抗体及其用途
本申请是2019年3月4日提交的题为“结合CD40的抗体及其用途”的中国专利申请CN201910160181.7的分案。
技术领域
本发明涉及一种与人CD40特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在治疗与CD40相关的人类疾病中的用途，例如癌症、炎性疾病、感染性疾病、动脉粥样硬化血栓、和呼吸系统疾病。
背景技术
CD40，又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5或TNFR5，是一种跨膜共刺激蛋白，在抗原提呈细胞例如B细胞、巨噬细胞和树突细胞上表达。该蛋白与CD40L(CD154)，一种主要由激活的T淋巴细胞和血小板表达的主要配体，的结合，激活抗原提呈细胞，激发多个下游信号通路，包括免疫细胞激活和增殖、以及细胞因子和趋化因子的生产，增强细胞功能和免疫功能(Ara A et al，.(2018)Immunotargets Ther 7：55-61)。
另一方面，CD40也存在于非免疫细胞和肿瘤上(Costello et al.，(1999)ImmunolToday 20(11)：488-493；Tong et al.，(2003)Cancer Gene Ther 10(1)：1-13；Lee etal.，(2014)Curr Cancer Drug Targets 14(7)：610-620；Ara A et al，.(2018)同上)，并报道其与多种免疫疾病(包括自免疫疾病)、动脉粥样硬化血栓、癌症和呼吸系统疾病有关联。例如，CD40/CD40L表达在动脉粥样化相关细胞中上调。CD40在几乎所有的B细胞恶性肿瘤以及高达70％的实体瘤中表达，且某些B细胞恶性肿瘤中的CD40配体结合会促成多种保护肿瘤细胞免受细胞凋亡的因子的表达增加(Lee et al.，(1999)Proc Natl Acad SciUSA 96：9136-9141)。
尽管CD40在肿瘤发生中的作用非常复杂，已经开发出一些CD40抗体用于潜在的肿瘤治疗。CP-870,893，开发的完全人源的IgG2激动型CD40抗体，可以激活树突细胞，并已在多种背景的晚期癌症病患中显示出了临床效用(Vonderheide et al.，(2007)J ClinOncol 25(7)：876-883；Gladue et al.，(2011)Cancer Immunol Immunother 60(7)：1009-1017；Beatty et al.，(2013)Expert Rev Anticancer Ther 17(2)：175-186；Vonderheideet al.，(2013)Oncoimmunology 2(1)：e23033；Nowak et al.，Ann Oncol 26(12)：2483-2490；2015U.S.patent no.7,338,660)。Dacetuzumab，也称作SGN-40，是Seattle Genetics开发的人源化IgG1激动型CD40抗体，每周静脉施用下显示出抗肿瘤活性，特别是在患有弥漫性大B细胞性淋巴瘤的患者中。临床前数据也示出Dacetuzumab与其他药物例如CD20单抗利妥昔单抗的协同效应(Lapalombella et al.，(2009)Br J Haematol 144(6)：848-855；Hussein et al.，(2010)Haematologica 95(5)：845-848；de Vos et al.，(2014)J He-matol Oncol 7：44)。Chi Lob 7/4，英国癌症研究中心(Cancer Research UK)开发的嵌合IgG1激动型抗人CD40抗体，正在进行初始的临床测试。21名患者中的11名病情稳定，而没有部分或完全缓解(Chowdhury et al.，(2014)Cancer Immunol Res 2(3)：229-240)。此外，拮抗型CD40抗体也在人多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病中显示出抗肿瘤作用(Bensinger W et al.，(2012)Br J Haematol.159(1)：58-66；Mohammad Luqman et al.，(2008)Blood 112：711-720)。
需要更多具有更好药理特性的CD40抗体。
发明内容
本发明提供一种分离的单克隆抗体，例如，与CD40(例如，人CD40和猴CD40)结合的鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体。其可以是激活CD40信号通路的激动型CD40抗体。
本发明的抗体可以用于多种应用，包括检测CD40蛋白，治疗或预防CD40相关疾病，例如癌症、炎性疾病、感染性疾病、动脉粥样硬化血栓、和呼吸系统疾病。
因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、8和15；(2)SEQ ID NOs：1、9和15；(3)SEQID NOs：2、9和15；(4)SEQ ID NOs：3、10和16；(5)SEQ ID NOs：4、11和17；(6)SEQ ID NOs：5、12和18；(7)SEQ ID NOs：6、13和19；或(8)SEQ ID NOs：7、14和20的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其包含SEQ ID NOs：37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的氨基酸序列，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQID NOs：21、27和31；或(2)SEQ ID NOs：22、28和32；(3)SEQ ID NOs：23、29和33；(4)SEQ IDNOs：24、27和34；(5)SEQ ID NOs：25、27和35；或(6)SEQ ID NOs：26、30和36的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其包含SEQ ID NOs：51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，各包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、8、15、21、27和31；(2)SEQ IDNOs：1、9、15、21、27和31；(3)SEQ ID NOs：2、9、15、21、27和31；(4)SEQ ID NOs：3、10、16、22、28和32；(5)SEQ ID NOs：4、11、17、23、29和33；(6)SEQ ID NOs：5、12、18、24、27和34；(7)SEQID NOs：6、13、19、25、27和35；或(8)SEQ ID NOs：7、14、20、26、30和36的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：37和51；(2)SEQ IDNOs：38和52；(3)SEQ ID NOs：39和53；(4)SEQ ID NOs：40和54；(5)SEQ ID NOs：41和55；(6)SEQ ID NOs：44和58；(7)SEQ ID NOs：45和59；(8)SEQ ID NOs：46和60；(9)SEQ ID NOs：46和61；(10)SEQ ID NOs：47和60；(11)SEQ ID NOs：47和61；(12)SEQ ID NOs：48和59；(13)SEQ ID NOs：49和60；(14)SEQ ID NOs：49和61；(15)SEQ ID NOs：50和60；或(16)SEQ IDNOs：50和61的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，重链恒定区包含SEQ ID NOs：62、63或64的氨基酸序列，轻链恒定区包含SEQ ID NOs：65或66的氨基酸序列，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
本发明的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab‘2片段。
本发明的抗体或其抗原结合部分与人或猴CD40特异结合，阻断或促进CD40-CD40L相互作用。本发明的抗体是激动型CD40抗体，激活CD40信号通路，促进免疫细胞例如树突细胞的成熟。本发明的抗体或其抗原结合部分具有与现有技术CD40抗体相当或更好的体内抗肿瘤效果，且毒性相当或更低。肿瘤在抗体停止施用后不再生长，甚至完全消失。
本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的免疫交联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素相连接。本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本发明抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本发明的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。本发明的抗体或其抗原结合部分可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒携带使用。
本发明还提供组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、或免疫交联物或双特异性分子或CAR，以及药学上可接受的载体。
本发明还包括编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本发明还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备CD40抗体的方法，包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。
另一方面，本发明提供一种增强受试者免疫应答的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中炎性疾病、感染性疾病、动脉粥样硬化血栓或呼吸系统疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。在一些实施方式中，可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用其他药物，例如抗炎剂和抗微生物剂。在一些实施方式中，炎性疾病包括自免疫疾病。
在另一个方面，本发明提供在受试者中预防、治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。癌症可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于，B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肠腺癌、胰腺癌、肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、肺癌和鼻咽癌。在一些实施方式中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码或承载抗体的溶瘤病毒。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用，例如VISTA抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂，例如表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本发明的抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
附图描述
图1示出108个杂交瘤克隆的CD40信号通路激动活性排名。
图2示出CD40抗体对CD40-CD40L相互作用的促进或抑制性作用，其中抗体16A6、7B4和13A2促进CD40-CD40L相互作用(A)而抗体92F6抑制CD40-CD40L相互作用(B)。
图3示出CD40抗体的CD40信号通路激动活性。
图4示出经CD86(A)、CD80(B)和CD83(C)的染色而测量的CD40抗体对树突细胞成熟的促进作用。
图5示出CD40嵌合抗体对HEK293A/人CD40细胞(A)或HEK293A/猴CD40细胞(B)的结合力。
图6示出CD40嵌合抗体的CD40信号通路激动活性。
图7示出经CD86染色而测量的CD40抗体对树突细胞成熟的促进作用。
图8示出嵌合和人源化CD40抗体对人或猴CD40的结合力，其中嵌合和人源化13A2抗体(A)以及人源化7B4抗体(B)与人CD40结合，且嵌合和人源化13A2抗体(C)以及人源化7B4抗体(D)与猴CD40结合。
图9示出嵌合和人源化7B4抗体(A)以及嵌合和人源化13A2抗体(B)的CD40信号通路激动活性。
图10示出经CD86(A)、CD80(B)和CD83(C)的染色而测量的CD40抗体对供体1体内树突细胞成熟的促进作用。
图11示出经CD86(A)和CD80(B)染色而测量的CD40抗体对供体2体内树突细胞成熟的促进作用。
图12示出经CD86(A)、CD80(B)和IL-12(C)的染色而测量的供体3体内CD40抗体对树突细胞成熟的促进作用。
图13示出由SPR测量的嵌合或人源化CD40抗体7B4(A)、7B4-VHOVL0(B)、7B4-VH2VL2(C)、7B4-VH2VL3(D)、7B4-VH3VL2(E)、7B4-VH3VL3(F)、13A2(G)、13A2-VH0VL0(H)、13A2-VH2VL2(I)、13A2-VH2VL3(J)、13A2-VH3VL2(K)和13A2-VH3VL3(L)、以及参照抗体RO7009789(M)和ADC1013(N)对人CD40的结合亲和力。
图14示出嵌合或人源化CD40抗体对全长CD40 ECD或其截短体(A)以及对全长CD40ECD或其突变体(B)的结合亲和力。
图15示出人源化CD40抗体7B4-VH2VL2(A)和13A2-VH3VL3(B)对人CD40的结合特异性。
图16示出经CD86(A)、CD80(B)和CD83(C)的染色而测量的基因改造CD40抗体对树突细胞成熟的作用。
图17示出施用人源化CD40抗体或对照药物的各组的平均肿瘤体积(A)，以及溶剂组(B)、7B4VH2VL2组(C)、13A2VH3VL3组(D)、RO7009789组(E)和APX005(F)组的个体肿瘤体积。
图18示出施用人源化CD40抗体或对照药物的各组的平均动物体重。
图19示出人源化CD40抗体对肿瘤浸润CD4+T细胞(A)和CD8+T细胞(B)增殖的效果。
图20示出经CD80、CD83和CD86的染色而测量人源化CD40抗体对肿瘤浸润树突细胞(CD45+CD11c+细胞)成熟的促进作用。
具体实施方式
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“CD40”是指肿瘤坏死因子超家族成员五。该术语包括变体、异体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人CD40特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的CD40蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人CD40蛋白特异的抗体可以完全地对人CD40蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的CD40蛋白交叉反应。
术语“人CD40”是指具有人氨基酸序列的CD40蛋白，人氨基酸序列为例如Genbank登录号为NP_001241.1的氨基酸序列(SEQ ID NO.：68)。术语“猴CD40”和“鼠CD40”分别指具有猴和小鼠序列的CD40蛋白，例如分别具有Genbank登录号为NP_001252791.1(SEQ IDNO.：70)和Genbank登录号为NP_035741.2(SEQ ID NO.：72)的序列。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，CD40蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与CD40蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合CD40蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人CD40蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的CD40蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“小鼠源抗体”是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠框架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
在本文中，“特异结合人CD40”的抗体是指与人CD40(还可能是其他非人物种的CD40)结合但是基本不与非CD40蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人CD40蛋白，即KD值为5.0x10-8M以下，优选1.0x10-8M以下，更优选为5.0x 10-9M以下。
术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0x 10-6M以上，更优选1.0x 10-5M以上，更优选1.0x 10-4M以上、1.0x 10-3M以上，更优选1.0x 10-2M以上。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x 10-6M以下，优选5.0x 10-8M以下，更优选1.0x 10-8M以下、5.0x 10-9M以下，更优选1.0x 10-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
本文中所用的术语“激动型CD40抗体”是指能够与CD40结合并激活或引发CD40信号通路从而促进免疫细胞激活和增殖以及细胞因子和趋化因子的生成的CD40抗体。而术语“拮抗型CD40抗体”是指阻断或抑制可以由CD40L结合引发的CD40信号通路。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病严重程度的本发明抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
本发明的多个方面在以下更加具体地加以描述。
CD40抗体具有对人CD40的结合特异性以及其他有益的功能特征
本发明的抗体以高亲和力特异性地结合人CD40，例如，KD值为1x 10-8M以下。抗体还具有与猴CD40的交叉反应性，不与小鼠CD40结合。
本发明的抗体是激活或引发CD40信号通路并参与免疫细胞激活和增殖以及细胞因子和趋化因子的生成的激动型CD40抗体。
本发明的抗体，与现有技术CD40抗体相比，具有与现有CD40抗体相比相当或更好的体内抗肿瘤效应，毒性相当或更低。在停止施用抗体后，肿瘤停止生长，甚至完全消除。
优选的本发明抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。
CD40单克隆抗体
优选的本发明抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。CD40抗体的VH氨基酸序列为SEQ ID NOs：37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。CD40抗体的VL氨基酸序列为SEQ ID NOs：51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、或61。抗体的重链/轻链可变区序列列于以下表1中，一些抗体具有相同的VH或VL。优选的抗体重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NOs：62、63或64，轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NOs：65或66。
Figure BDA0002454184300000091
与人CD40结合的其他CD40抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本发明抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。相似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。
因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及
(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一CD40抗体的VL，其中该抗体特异结合人CD40。
在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一CD40抗体的CDR，其中该抗体特异结合人CD40。
在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括CD40抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人CD40的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一CD40抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer etal.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashiet al.，J.Biochem (Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.90：4374-8(1993)；Polymenis andStoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献均通过引用的方式全部并入本文。
在另一实施方式中，本发明的抗体包含CD40抗体的重链可变区的CDR2以及至少CD40抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一CD40抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人CD40。优选这些抗体(a)竞争结合CD40；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本发明CD40抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含CD40抗体的轻链可变区CDR2，或者另一CD40抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人CD40。在另一实施方式中，本发明的抗体可以包括CD40抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一CD40抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人CD40。
保守修饰
在另一实施方式中，本发明的抗体包含与本发明CD40抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；deWildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelleyand O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(b)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
(e)该抗体特异结合人CD40。
本发明的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人CD40的高亲和力，以及引发对CD40表达细胞的ADCC或CDC的能力。
在多个实施方式中，抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本发明抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、B-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
基因修饰的抗体
本发明的抗体可以以具备本发明CD40抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，框架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的框架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmannet al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queenet al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本发明单克隆抗体的VH和VL CDR序列，它们可以含有不同的框架序列。
这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。
通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschμl et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
用于本发明抗体的优选框架序列是结构上与本发明抗体所用的框架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该框架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的框架区中。例如，在一些情况下，将框架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类的可变区修饰是将VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
此外，在另一实施方式中，本发明提供分离的CD40单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的基因改造抗体包括在VH和/或VL的框架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些框架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的框架残基。这些残基可以通过将抗体框架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
另一类的框架修饰包括对框架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
此外，作为框架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本发明的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方式中，Cm的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。
本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本发明的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
抗体的物理特性
本发明的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选CD40抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选CD40抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
编码本发明抗体的核酸分子
在另一方面，本发明提供编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本发明的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
优选的本发明核酸分子包括编码CD40单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。
本发明单克隆抗体的制备
本发明的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
制备本发明单克隆抗体的转染瘤的生成
本发明的抗体还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而VH与载体中的CH可操作地连接，VL与载体中的CL可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
免疫交联物
本发明的抗体可以与治疗剂交联，形成免疫交联物，例如抗体-药物交联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Git、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。
双特异性分子
另一方面，本发明涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本发明抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
在实施方式中，除Fc结合特异性和CD40结合特异性外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以是针对增强因子(EF)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合并从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，增强因子抗体可以与细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)或其他免疫细胞结合，引起增强的针对靶细胞的免疫应答。
双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。
编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒
溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本发明的抗体与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本发明抗体的溶瘤病毒可以引入人体中。
药物组合物
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗体或药物，例如VISTA抗体。本发明的药学组合物可以在与例如另一抗癌剂、另一抗炎剂或抗微生物剂的联合疗法中进行施用。
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本发明的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。
给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案涉及每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。本发明CD40的优选给药方案包括静脉内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以以下给药时间表中的一个进行给药：(i)每四周给药六次，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后1mg/kg体重每三周一次。在一些方法中，剂量调整成实现约1-1000μg/ml的血药浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
“治疗有效量”的本发明CD40抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加、或对感病性引起的损伤或无能的预防能力。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。
药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、透皮贴剂、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
在某些实施方式中，本发明的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本发明的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawaet al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoeet al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体(组合物、双特异性分子和免疫交联物)具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症、炎性疾病或感染疾病的治疗和/或预防。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。
考虑到本发明CD40抗体的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本发明提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本发明的抗体，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本发明抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肠腺癌、胰腺癌、肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、肺癌和鼻咽癌，不管是原发癌还是转移癌。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本发明的抗体抑制。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中炎性疾病、感染性疾病、动脉粥样硬化血栓、和呼吸系统疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用抗炎剂、抗微生物剂或其他治疗剂。
总体而言，本发明的抗体可以用来增强受试者的免疫应答。
本发明的这些和其他方法在以下进一步讨论。
联合疗法
本发明提供本发明CD40抗体或其抗原结合部分与一种或多种能有效抑制受试者中肿瘤生长的其他抗体一起施用的联合疗法。在一个实施方式中，本发明提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用CD40抗体以及一种或多种其他抗体，例如VISTA抗体、LAG-3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和/或CTLA-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。
CD40信号通路激活可另外与标准癌症治疗结合。例如，CD40信号通路激活可以与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断、以及化疗相结合。例如，化疗剂可以与CD40抗体一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。例如，表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-FU可以施用给接受CD40抗体疗法的患者。
任选地，CD40与一种或多种其他抗体(例如，CTLA-4抗体和/或LAG-3抗体和/或PD-1抗体)的组合还可以与免疫原性剂结合，免疫原型剂为例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、和转染有表达免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He et al.，(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原肽，例如gp100肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1、和/或酪氨酸酶、或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。
其他可以与CD40抗体联合的疗法包括但不限于白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
本发明还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。
实施例
实施例1稳定表达人、猴或小鼠CD40的HEK293A细胞株的构建
合成编码人、猴或小鼠CD40的cDNA序列(SEQ ID NOs：67、69和71，分别编码氨基酸序列SEQ ID NOs：68、70和72)，并经酶切克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)中。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-CD40与psPAX和pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人、猴或小鼠CD40的HEK293A细胞(分别为HEK293A/hCD40、HEK293A/rhCD40、HEK293A/muCD40)。转染的HEK293A细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤霉素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。人和猴CD40的表达通过流式分析仪经FACS分析，使用市售可得的人CD40抗体(PE-抗人CD40抗体，Cat#313006，Biolegend，美国)。相似地，小鼠CD40的表达通过市售可得的小鼠CD40抗体(PE-小鼠CD40抗体，Cat#124609，Biolegend，美国)经FACS确证。
实施例2制备分泌人CD40抗体的杂交瘤细胞系
小鼠抗人CD40单克隆抗体通过常规杂交瘤融合技术获得，方案略做改动。
接种
13只BALB/C小鼠(维通利华，中国)通过交叉注射重组人CD40(ECD)-his蛋白(义翘神州，中国，Cat：10774-H08H)和猴CD40(ECD)-hFc蛋白(义翘神州，中国，Cat：90097-C02H)进行免疫，具体免疫流程如表2所示。人CD40(ECD)-his蛋白和猴CD40(ECD)-hFc蛋白用等体积的完全Freund佐剂(Cat#：F5881-10*10ML，Sigma，美国)、不完全Freund佐剂(Cat#：F5506-6*10ML，Sigma，美国)或PBS超声乳化。
表2.免疫进程
Figure BDA0002454184300000221
每次加强免疫后1周，从每只小鼠体内取50μl血清，经ELISA检测滴度，具体使用重组人CD40-hFc(Cat#：10774-H02H，义翘神州，中国)和猴CD40(ECD)-hFc(Cat#：90097-C02H，义翘神州，中国)进行结合测试。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、小鼠CD40的HEK293A细胞经FACS进行滴度测试。
基于最后一次加强之后的ELISA检测和FACS检测结果，血清滴度较高的7只小鼠被选出用于下一步的杂交瘤细胞系制备。
杂交瘤细胞系的制备
通过常规的杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞系，方案略做修改。
最后一次加强的四天后，将小鼠处死后取出脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基(Cat#：SH30243.01B，Hyclone，美国)清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(CRL-1581，ATCC，美国)与上述分离的小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG(Cat#：P7181，Sigma，美国)融合的方式进行。融合后的细胞用DMEM清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640+10％FBS+1X HAT)。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×104细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO2的潮湿细胞培养箱培养7天。在第7天时，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1X HAT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，经ELISA和FACS筛选杂交瘤。
通过ELISA筛选杂交瘤细胞系
首先通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人CD40结合的杂交瘤克隆。与人CD40结合的杂交瘤克隆进一步测试与猴或小鼠CD40结合的能力。
对于ELISA检测，用人CD40(ECD)-his(0.5μg/ml，Cat#：10774-H08H，义翘神州，中国)、猴CD40(ECD)-hFc(0.5μg/ml，Cat#：90097-C02H，义翘神州，中国)或小鼠CD40-his(0.5μg/ml，Cat#：50324-M03H，义翘神州，中国)对96孔ELISA板铺板，100μl每孔，室温过夜。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)溶液清洗3遍，用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时，用PBST溶液清洗3遍。杂交瘤细胞培养基上清用稀释液(PBS+1％BSA、+1％山羊血清+0.01％吐温20)稀释10倍后，吸取100μl加入样品检测孔。室温孵育1小时后，板用PBST清洗3遍。每孔加入100μl山羊抗鼠Fc-HRP(1：5000，Cat#：A9309-1ml，Sigma，美国)，室温孵育1小时，PBST清洗3遍，加入80μl TMB显色。5-10分钟后加入80μl的0.16M硫酸终止显色，用酶标仪(SpectraMaxR i3X，Molecμlar Devies，美国)检测OD450的读值
经上述ELISA，筛选出234个与人和猴CD40有特异结合力的杂交瘤细胞系。
通过FACS检测筛选杂交瘤细胞系
对筛选出的234个杂交瘤细胞系进一步测试其与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠CD40的结合能力。首先将105个实施例1中的制备HEK293A/人CD40细胞、HEK293A/猴CD40细胞、或者HEK293A/鼠CD40细胞加入96孔板的各检测孔中。杂交瘤培养物上清用稀释液(PBS，含1％BSA、1％山羊血清、0.01％吐温20)稀释10倍加入到样品检测孔，100μl每孔。4℃孵育1个小时后，用FACS洗液(PBS+1％BSA+0.01％吐温20)清洗3遍。之后，细胞用FACS洗液重悬，加入500倍稀释的APC山羊抗小鼠IgG二抗(Cat#：405308，BioLegen，美国)4度孵育1小时，板用PBS清洗3遍后上FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。
基于上述FACS筛选，得到162个对HEK293A/人CD40细胞以及HEK293A/猴CD40细胞有高结合力而不与HEK-293A/小鼠CD40细胞结合的杂交瘤克隆。
产生CD40抗体的杂交瘤细胞的亚克隆
对上述162个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA和FACS检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到108个对人和猴CD40呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。
通过HEK-Blue活性检测筛选杂交瘤细胞系
将上述筛选出来的108个亚克隆在96孔板中铺板，并培养5天。收集上清进行HEK-Blue活性检测，以识别对人CD40信号通路有激动活性的CD40抗体。
通过用表达人CD40(SEQ ID NO.：68)的慢病毒(如实施例1般制备)侵染HEK-Bluenull 1_v细胞(InvivoGen，美国)来构建表达该融合蛋白的HEK-Blue报告细胞系(HEK-Blue/CD40)，再用10μg/ml的嘌呤霉素进行加压筛选。
对于HEK-Blue/CD40报告系统检测，将4×104个HEK-Blue/CD40细胞重悬在200μl细胞培养基(DMEM培养基(Hyclone，USA，Cat#：SH30243.01)+10％FBS(Excell，China，Cat#：FND500)+10μg/ml嘌呤霉素(GIBCO，USA，Cat#：A11138-03)+100μg/ml NormocinTM(Invivogen，USA，Cat#：ant-nr-2)+100μg/ml博来霉素(Invivogen，USA，Cat#：ant-Zn-5)中，于96孔板铺板，并于37℃培养过夜。第二天，各孔加入200μl DMEM培养基，替换原培养基。培养7小时后，用HEK-Blue检测缓冲液(Invivogen，US，Cat#：hb-det3)替换DMEM培养基，100μL每孔，并每孔加入100μL杂交瘤上清液。得到的混合物在37℃、5％CO2下孵育，直至显出蓝色。用SpectraMax酶标仪(Molecμlar Devices，美国)测定OD630处的读值。其中阴性对照为HEL抗体(LifeTein，LLC，US，Cat.#：LT12031)。RO7009789(一种根据US7338660B2公开的氨基酸序列制备且具有人IgG2/κ恒定区的激动型抗体)和CD40L(Cat#：10239-H08E，义翘神州，中国，CD40的天然配体和激活因子)用作阳性对照。
如图1所示，38个克隆显示出不同程度的CD40激动活性。
实施例3小鼠CD40单克隆抗体的纯化
基于上述的HEK-Blue检测，共挑取20个具有高HEK-Blue活性的克隆(详见以下表3)，进行进一步的研究。首先将20个所选克隆的单克隆小鼠抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基(Gibco，美国，Cat#：12045-076)和1％HT补充液(Gibco，Cat#：11067-030)。细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。
通过使用κ和λ-小鼠快速分型试剂盒(Thermal，美国，Cat#：26179)和小鼠单克隆抗体分型试剂(Sigma，美国，Cat#：IS02-1KT)来确定纯化抗体的亚型，检测步骤与试剂盒说明书中的一致。所选20个克隆抗体的亚型和表达滴度总结在表3中。
表3.CD40抗体的亚型和表达滴度
抗体 亚型 表达滴度(mg/l) 抗体 亚型 表达滴度(mg/l)
13A2 小鼠IgG1/κ 24.744 77D9 小鼠IgG1/K 12.22
16A6 小鼠IgG1/κ 31.111 79D7 小鼠IgG1/κ 20.39
29A10 小鼠IgG1/κ 33.889 142F7 小鼠IgG1/κ 17.22
7B4 小鼠IgG1/κ 18.667 89D11 小鼠IgG1/K 95.73
9A7 小鼠IgG1/K 7.778 91E4 小鼠IgG2a/K 4.47
19H4 小鼠IgG1/K 10.000 101C12 小鼠IgG1/K 18.94
37G10 小鼠IgG1/K 65.333 92F6 小鼠IgG1/K 39.97
35C9 小鼠IgG1/K 11.667 82D3 小鼠IgG2a/K 16.27
16F4 小鼠IgG2b/κ 14.000 23B8 小鼠IgG2a/κ 32.33
50F6 小鼠IgG1/κ 12.778 51F7 小鼠IgG1/κ 1.44
实施例4纯化的小鼠CD40单克隆抗体与人和猴CD40结合
纯化的小鼠CD40单克隆抗体首先通过ELISA检测来确定其与重组人、猴或小鼠CD40蛋白的结合亲和力。
ELISA检测板用500ng/m1人CD40(ECD)-his(义翘神州，中国，Cat：10774-H08H)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温下封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的CD40抗体(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Simga，美国，Cat#：A9309-1ml)，室温孵育1小时。板用新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#no.：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMaxRi3X(Molecular Devies，美国)在450nm读值。
20个CD40单克隆抗体对猴或小鼠CD40的物种交叉反应性进一步通过直接ELISA进行测试。具体地，将500ng/ml猴CD40(ECD)-hFc蛋白(义翘神州，中国，Cat：90097-C02H)或小鼠CD40-hFc(义翘神州，中国，Cat：50324-M03H)包被在96孔ELISA板中，并与100μl梯度稀释的CD40抗体(最高浓度40μg/ml)共同孵育。之后使用HRP-山羊抗小鼠IgG(Sigma，美国，Cat#：A9309-1ml)。CD4抗体RO7009789和ADC1013(根据US2016/0311916A1公开的氨基酸序列制备，且具有人IgG1/κ恒定区)用作参照。
上述结合测试的EC50值总结在表4中。可以看到，20种抗体中，除51F7外，均与猴CD40交叉反应而不与小鼠CD40交叉反应。
表4. 20种小鼠CD40单抗对人、猴、或小鼠CD40的结合力
Figure BDA0002454184300000251
实施例5小鼠CD40单克隆抗体与HEK293A细胞表达的人和猴CD40结合
为进一步确定CD40抗体是否与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠CD40结合，分别使用稳定过表达人、猴或小鼠CD40的HEK293A细胞(见实施例1)进行FACS细胞结合检测。简单而言，将105个HEK293A细胞在96孔板上铺板，并加入梯度稀释的CD40抗体(最高浓度40μg/ml)。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(BioLegen，美国，Cat#：405308)。4℃孵育1小时后，细胞用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)监测细胞荧光。
如表5所示，所有20个小鼠CD40单克隆抗体示出与人和猴CD40的高结合力，但是不结合小鼠CD40(数据未显示)。
表5.CD40抗体与人和猴CD40的结合亲和力
Figure BDA0002454184300000261
实施例6小鼠CD40抗体抑制或促进人CD40-CD40L之间的相互作用
对纯化的CD40抗体进一步测试其阻碍或促进人CD40L与人CD40结合的能力。简单而言，96孔ELISA板用500ng/ml的人CD40L(Cat#：10239-H08E，义翘神州，中国)4℃包被过夜。之后，板用200μl封闭液(PBS+2％BSA)室温封闭2小时。梯度稀释的CD40抗体(最高浓度为40μg/ml)与2μg/ml人CD40-hFc(Cat#：10774-H02H，义翘神州)混合，并于37℃孵育1小时，得到的混合物随后加入检测孔，室温孵育1小时。板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍，加入5000倍稀释的抗人IgG FC-HRP(Simga，美国，Cat#：A0170-1ML)，室温孵育1小时。板用PBST洗液洗3遍，各孔加入80μl TMB显色。5-10分钟后，加入80μl 0.16M硫酸来终止反应，之后用SpectraMaxR i3X(Molecμlar Devies，美国)进行OD450读值。
有意思的是，数据表明，6种小鼠抗体(13A2、16A6、7B4、50F6、142F7和101C12)促进人CD40-CD40L相互作用，而有3种抗体(23B8、92F6、82D3)阻碍CD40-CD40L相互作用，剩下的几种抗体对CD40-CD40L结合没有明显的作用。4个代表性的克隆的结果显示在图2中。
实施例7小鼠CD40抗体激活CD40信号通路活性
为确定所选的小鼠CD40抗体是否具有CD40信号通路激动活性，进行HEK-Blue活性检测。简单而言，将实施例2制备的HEK-Blue/CD40细胞孵育在DMEM培养基(Hyclone，美国，Cat#：SH30243.01)中，培养基还含有10％FBS(Excell，China，Cat#：FND500)、10μg/ml嘌呤霉素(GIBCO，美国，Cat#：A11138-03)、100μg/ml NormocinTM(Invivogen，美国，Cat#：ant-nr-2)、100μg/ml博来霉素(Invivogen，美国，Cat#：ant-Zn-5)。将4×104个HEK-Blue/CD40细胞均分到96孔板的200μl细胞培养基中，37℃培养过夜(约12小时)。用200μl新鲜DMEM培养基替换原培养基，继续培养7小时。之后，将各孔的DMEM培养基替换成100μl HEK Blue检测缓冲液(Invivogen，美国Cat#：hb-det3；)，其中含有各种浓度的CD40抗体(浓度范围从100μg/ml到0.01ng/ml)。细胞继续在37℃培养，直至显出蓝色。使用SpectraMaxR i3X酶标仪(Molecμlar Devices，美国)检测OD630读值。
EC5o值总结在表6中，代表性单抗的曲线显示在图3中。可以看出，这20种抗体在功能性HEK-Blue检测中显示出不同程度的激动活性，表明能够刺激CD40下游信号通路。
表6.CD40抗体的激动活性
抗体 HEK Blue EC<sub>50</sub>(ng/mL) 抗体 HEK Blue EC<sub>50</sub>(ng/mL)
RO7009789 23.26 142F7 64.77
ADC1013 1034 89D11 91.06
13A2 12.61 91E4 152.7
16A6 11.37 82D3 285.4
7B4 26.14 23B8 3373
50F6 42.16 51F7 6173
101C12 175.2 92F6 263.7
77D9 22.26 19H4 92.79
35C9 86.08 16F4 252.1
37G3 146.1 29A10 139.8
79D7 55.29 9A7 61.96
实施例8抗原表位竞争
通过竞争ELISA的方法检测抗体之间的抗原结合表位竞争。简单而言，96孔ELISA检测板用5μg/ml的R07009789或ADC1013包被，4℃过夜。这些孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时。0.5μg/ml人CD40(ECD)-his蛋白(Cat#：10774-H08H，义翘神州，中国)加入检测板中，室温继续孵育1小时。板用PBST清洗3遍，加入1μg/ml纯化的抗体，室温孵育1小时。ELISA板用PBST洗3遍后加入20000倍稀释的抗小鼠Fc-HRP(Cat#：A9309-1MC，Simga，美国)，室温孵育1小时。继续用PBST洗液洗3遍后，用新鲜配制的Ultra-TMB(Huzhou Yingchuang，中国，Cat#：TMB-S-003)室温显色5分钟，并用SpectraMax酶标仪(Molecular Devices；US；SpectraMaxR i3X)在450nm进行读值。
结果总结在表7中。7种小鼠抗体(101C12、142F7、89D11、13A2、16A6、7B4和50F6)与两种参照抗体存在表位竞争，而抗体9A7、92F6、19H4、16F4和51F7不与任一参照抗体存在表位竞争。剩下的几种抗体与两个参照抗体中的一种存在表位竞争。
表7.竞争ELISA测试的表位竞争
Figure BDA0002454184300000281
+：存在竞争；-：不存在竞争
实施例9激动型CD40抗体促进树突细胞成熟
进行树突细胞成熟实验，来进一步确认小鼠CD40抗体的激动活性。简单而言，来自一健康人供体血样中的PBMC通过梯度密度离心的方式进行收集，并重悬于RPMI1640培养基中，37℃培养2小时，收集贴壁细胞，即单个核细胞。上述细胞培养于含有100ng/ml重组人GM-CSF(R&D；美国；Cat：7954-GM)、100ng/ml重组人IL-4(R&D；美国；Cat#：6507-IL)和10％FBS的RPMI1640培养基中。3天后将培养基进行半换液，细胞培养5天后，不同浓度的CD40抗体(10ug/ml或者1ug/m1)和对照抗体加入到细胞培养中并继续培养48小时。用小鼠抗人CD83(BD；USA；Cat#：556910)、PE小鼠抗人CD86(BD；USA；Cat#：555658)和BV650小鼠抗人CD80(BD；USA；Cat#：564158)对树突细胞活化标志物进行染色，并通过流式细胞仪检测。
代表性抗体的结果显示在图4中。与Hel对照相比，小鼠CD40抗体16A6、29A10、7B4和13A2增加了CD86(成熟树突细胞的生物标志物)的表达，而抗体16A6、29A10、7B4和13A2显著上调了CD80和CD83(两者均为共刺激分子)的表达。
实施例10嵌合CD40抗体的表达和纯化
选取8个抗体((13A2、16A6、7B4、29A10、92F6、77D9、50F6和142F7)进行进一步的研究。首先通过RT-PCR方法对这8个抗体的杂交瘤细胞进行可变区序列的克隆，使用文献中提及的引物(Juste，Muzard，&Billiald，(2006)，Anal Biochem.，1；349(1)：159-61)。通过将编码可变区和各自的人IgG2/κ恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：63和65)的序列插入到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI来构建表达载体。可变区的氨基酸SEQ ID编码总结在表1中。
将上述获得的表达载体转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)。具体而言，HEK-293F细胞在Free StyleTM293表达培养基(Gibco，Cat#：12338-018)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将各表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO2的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化单克隆抗体。
实施例11 CD40嵌合单克隆抗体与HEK293A细胞表达的人或猴CD40结合
根据实施例5的方法步骤，对嵌合抗体检测它们与实施例1制备的HEK293A/人CD40细胞、HEK293A/猴CD40细胞、以及HEK293A/小鼠CD40细胞的结合力。RO7009789和ADC1013抗体作为阳性对照
如图5所示，嵌合抗体与人和猴CD40均有高亲和力，而不与小鼠CD40结合(数据未示出)。
实施例12 CD40嵌合抗体具有CD40信号通路激动性且促进树突细胞成熟
根据实施例7和实施例9的方法步骤，通过HEK-Blue检测和树突成熟检测，对嵌合抗体进一步检测其对CD40信号通路的激活效果。RO7009789、APX005和/或ADC1013用作阳性对照抗体，其中APX005具有人IgG1/κ恒定区，按照WO2014/070934A1中的氨基酸序列制备。
如图6所示，8个嵌合抗体表现出与其母单抗相似的功能活性。图7示出，所有测试的嵌合抗体均能上调树突细胞上CD86蛋白(成熟树突细胞的生物标志物)的表达，表明其对树突细胞成熟的促进。
实施例13 CD40抗体的人源化改造
基于上述相关的功能试验，挑选两个抗体，7B4和13A2，进行人源化改造和进一步研究。小鼠源抗体的人源化改造通过互补决定区(CDR)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。
为选出鼠源抗体7B4和13A2的人源化受体框架，将7B4和13A2的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与7B4和13A2同源度最高的人种系IGVH和IGVK作为人源化改造的框架。所选择的轻链种系受体序列是人IGKV2-30*02，所选择的重链种系受体序列是人IGHV4-28*06，具体见表8。
对7B4和13A2的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。简单来说，所选结构模板分别与7B4和13A2具有相同类型的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、和H-CDR3环状结构。利用所选择的结构模板，通过用人种系重链和轻链框架序列代替小鼠框架而构建人源化7B4和13A2的结构模型。随后进行三维结构建模，以鉴定出可能对维持CDR环状结构或重链和轻链连接起重要作用的关键框架氨基酸残基。当鼠源抗体框架与人种系受体框架在某一位点上拥有相同的氨基酸残基时，保留人种系氨基酸残基。另一方面，当鼠源框架与人种系受体框架在某一位点上拥有不同的氨基酸残基时，通过结构模拟来评价该残基的重要性。如果发现人种系受体框架内的某一氨基酸残基与CDR区残基相互作用并对CDR残基产生影响，那么该残基就会回复突变为鼠源残基。
表8.用于抗体结构模拟的结构模板
抗体链 模板结构的PDB编码 序列同一性 序列相似性
13A2重链 5E2T 71％ 83％
13A2轻链 1DLF 84％ 92％
7B4重链 5E2T 87％ 90％
7B4轻链 1DLF 87％ 95％
在上述结构建模的基础上，13A2重链鉴定出5个潜在的回复突变(I49M、V68I、M70I、K44N、G45K)，轻链鉴定出5个潜在的回复突变(M4L、R51L、F76L、Y92F、Q105S)。7B4重链鉴定出5个潜在的回复突变(I49M、V68I、M70I、K44N、G45K)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(M4L、R51L、Y92F、Q105S)。
如表1所示，针对13A2，共设计出三个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，共得到5个人源化抗体。相似地，对于7B4，共设计出三个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，共得到5个人源化抗体。
合成编码人源化重链可变区加上人IgG2恒定区的序列、以及编码人源化轻链可变区加上人κ恒定区的序列，重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：63和65，并利用BamH I和Xho I限制性酶切位点克隆到pCDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen，美国)中。所有表达构建均经测序证实。用重链表达载体和轻链表达载体转染HEK293F表达系统(Invitrogen，美国)，并瞬时表达10个人源化CD40抗体(7B4抗体5个，13A2抗体5个)，方法步骤如实施例10所述。人源化抗体按照实施例3所述进行纯化。
实施例14嵌合和人源化CD40抗体的特征测试
根据实施例5中的方法步骤，对嵌合和人源化CD40抗体进一步测试其与HEK193A/人CD40以及HEK293A/猴CD40的结合力。参照实施例7，通过HEK-Blue对嵌合和人源化CD40抗体进一步检测其对CD40信号通路的激活力。根据实施例9中的方法步骤，对人源化抗体进一步测试其促进树突细胞成熟的作用，树突细胞来源于3个不同的健康人供体的血样。树突细胞中IL-12(p40)的分泌情况，用IL-12(p40)检测试剂盒(BD，US，Cat#：551116)检测，具体实验步骤跟说明书完全一致。
如图8、9、10(供体1)、11(供体2)以及12(供体3)所示，所有的人源化抗体均与人和猴OX40蛋白结合，不与小鼠OX40结合，均能激活CD40信号通路、促进树突细胞成熟，且13A2-VH3VL2、13A2-VH3VL3和7B4VH2VL2显示出最高的结合、激动和功能活性。
实施例15.嵌合和人源化CD-40抗体与人CD40的亲和力
通过BIAcoreTM 8K(GE Life Sciences，美国)来定量测定嵌合或人源化CD40抗体对人CD40的结合亲和力。
具体地，将100-200RU(反应单位)的人CD40(ECD)-his蛋白(义翘神州，中国，Cat：10774-H08H)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片未反应基团。梯度稀释(浓度从0.3μM到10μM)的抗体注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。结合速率(ka)和解离速率(kd)使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数KD通过kd/ka计算得到。SPR确定的抗体结合解离曲线如图13所示，表9示出嵌合抗体和人源化抗体的结合亲和力数据。RO7009789和ADC1013抗体作为阳性对照。
表9.CD40抗体对人CD40的结合亲和力
抗体 k<sub>a</sub> k<sub>d</sub> K<sub>D</sub>
RO700789 1.07E+5 1.83E-4 1.71 E-9
ADC1013 1.2E+6 3.48E-2 2.9E-08
13A2 4.84E+05 1.73E-03 3.58E-09
13A2-VH0VL0 3.96E+05 1.14E-02 2.88E-08
13A2-VH2VL2 8.23E+05 1.71 E-03 2.08E-09
13A2-VH2VL3 7.35E+05 2.61 E-03 3.55E-09
13A2-VH3VL2 8.25E+5 2.42E-3 2.93E-09
13A2-VH3VL3 5.98E+5 4.59E-3 7.68E-09
7B4 1.00E+06 3.6E-03 3.6E-09
7B4-VH0VL0 2.75E+06 6.8E-03 2.47E-09
7B4-VH2VL2 2E+06 5.81E-03 2.91E-09
7B4-VH2VL3 1.78E+06 6.39E-03 3.6E-09
7B4-VH3VL2 1.46E+06 6.15E-03 4.2E-09
7B4-VH3VL3 2.13E+06 4.88E-03 2.99E-09
实施例16嵌合和人源化CD40抗体的抗原结合表位鉴定
通过ELISA测试嵌合和人源化CD40抗体的抗原结合表位。
CD40的胞外区(ECD)包含4个半胱氨酸富集结构域(CRD)，分别命名为CRD1、CRD2、CRD3和CRD4。基于CD40 ECD的结构，构建一个全长CD40 ECD、五个CD40ECD截短体和四个CD40 ECD突变体，这些重组蛋白的信息在以下表10中示出。这几个蛋白均在N端连有信号肽(SEQ ID NO.：83)，用以蛋白表达分泌，在C端连有mFc标签(SEQ ID NO.：84)，用于ELISA检测。合成编码这些重组蛋白的DNA序列并克隆到pcDNA3.1载体中。重组蛋白表达和纯化根据实施例10中的方法步骤进行。按照实施例2所述的方法步骤进行ELISA检测，来评估单抗对重组CD40蛋白的结合力。
如图14的A所示，所有的抗体均与全长CD40 ECD结合，且都不与截短体结合，表明CRD1结构域参与在抗体结合中，且对抗体结合较为重要。图14的B示出，13A2嵌合抗体、三种人源化抗体和ADC1013不与CD40突变体2-4结合，表明这五种抗体有相同或相似的结合表位。RO7009789不与突变体1、2或4结合，APX005不与突变体2或4结合。
表10.CD40 ECD截短体和突变体
Figure BDA0002454184300000321
注：CRDΔ1表示截短的CRD1结构域
实施例17人源化CD40抗体与人CD40特异结合
为检测抗体对CD40的结合特异性，根据实施例2所述的方法步骤，通过ELISA法检测人源化抗体与人CD40以及序列同源性较高的TNFRSF家族其他成员的结合力。
具体而言，检测了人源化抗体与人CD40(ECD)-his(TNFRSF4，Cat#：10774-H08H，义翘神州，中国)、人OX40-his(TNFRSF5，Cat#：10481-H08H，义翘神州，中国)、人HVEM-mFc(TNFRSF14，Cat#：HVM-H5255，ACRO，中国)、人4-1BB(TNFRSF9，Cat#：41B-H522a，ACRO，中国)、人NGFR(TNFRSF16，Cat#：13184-H08H，义翘神州，中国)、人DR6(TNFRSF21，Cat#：10175-H08H，义翘神州，中国)、和人RANK(TNFRSF11，Cat#：RAL-H5240，ACRO，义翘神州，中国)的结合亲和力。
如图15所示，13A2VH3VL3和7B4VH2VL2均不与人OX40(TNFRSF4)、HVEM(TNFRSF14)、4-1BB(TNFRSF9)、NGFR(TNFRSF16)、DR6(TNFRSF21)或RANK(TNFRSF11)结合，表明13A2VH3VL3和7B4VH2VL2抗体与人CD40的结合特异性。
实施例18基因修饰的CD40抗体具有更好的激动活性
研究表明，激动型CD40抗体的最佳生物和抗肿瘤效果需要Fc受体(FcR)的共同作用(Richman and Vonderheide，(2014)Cancer Immunol Res 2(1)：19-26)。因此，将CD40抗体制备成具有13A2VH3VL3或7B4VH2VL2的重/轻链可变区以及人IgG1/κ恒定区，且人IgG1恒定区带有S267E和L328F突变(突变IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.：64)。得到的抗体分别命名为13A2-VH3VL3-IgG1(SE/LF)和7B4-VH2VL2-IgG1(SE/LF)，并按照实施例9中的方法步骤，进一步测试其促进树突细胞成熟的活性。RO7009789、ADC1013和APX005用作阳性对照，Hel用作阴性对照。
如图16所示，比起亲本抗体，13A2-VH3VL3-IgG1(SE/LF)和7B4-VH2VL2-IgG1(SE/LF)在促进树突细胞成熟方面均显示出更高的激动活性，且13A2-VH3VL3-IgG1(SE/LF)在所有测试抗体中具有最高活性。
实施例19人源化抗体具有体内抗肿瘤效果
对具有13A2VH3VL3或7B4VH2VL2的重/轻链可变区以及小鼠IgG1/κ恒定区(小鼠IgG1/κ恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NOs：62和66所示)的CD40抗体的体内抗肿瘤活性进行研究，所使用的动物模型通过对CD40靶点人源化的转基因小鼠(GemPharmatech Co.Ltd，中国)植入MC38小鼠肠腺癌而建立。抗体使用小鼠IgG1/κ恒定区来加强抗体在小鼠模型中的Fc功能。
各小鼠在第0天在一侧腹部皮下注射1×106MC38细胞。待肿瘤长到80mm3时，随机分成五组，每组8只。小鼠在第4、7、11、14、18和21天腹腔注射13A2-VH3VL3、7B4-VH2VL2、对照抗体(RO7009789或APX005)、或PBS，10mg/kg/天，其中RO7009789和APX005均改造成具有如SEQ ID NOs：62和66所示的小鼠IgG1/κ恒定区。
随时间追踪小鼠体重变化和肿瘤大小。用游标卡尺隔天测量肿瘤的长边(D)和短边(d)，并通过公式TV＝0.5xD x d2计算肿瘤体积。在抗体组肿瘤达到3.5em3前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。
在第25天，各组取4只肿瘤较大的小鼠用于T细胞分析，其他小鼠继续进行肿瘤大小测量。用于T细胞分析的小鼠在处死后，立即取肿瘤放置在有胶原酶的Hanks缓冲液中。用剪刀将肿瘤组织剪成小块，并将剪碎的肿瘤组织继续孵育在含胶原酶的Hanks缓冲液中，37℃轻缓震摇30分钟。之后，向各样品加入10ml RPMI 1640+10％FBS，终止胶原酶活性，保持免疫细胞活力。将样品通过70μm细胞滤膜(Corning，Cat#：352350)，进行过滤，并放置在新离心管中。样品离心后重悬到PBSF缓冲液中(PBS+2％FBS)，细胞密度为1×107细胞/ml。样品用PBSF清洗2遍，然后分成两份，向其中一份加入荧光标记的CD45抗体(BrilliantViolet785TM小鼠CD45抗体，Biolegend，US，Cat#：103149)、CD8抗体(APC小鼠CD8a抗体，Biolegend，US，Cat#：100712)、CD3抗体(FITC小鼠CD3抗体，Biolegend，US，Cat#：100203)和CD4抗体(PerCP小鼠CD4抗体，Biolegend，US，Cat#：100432)混合物，向另外一份加入荧光标记的CD11c抗体(APC小鼠CD8a抗体，Biolegend，US，Cat#：100712)、CD80抗体(APC小鼠CD11c抗体，Biolegend，US，Cat#：117310)、CD83抗体(E/Cy7小鼠CD83抗体，Biolegend，US，Cat#：121518)和CD86抗体(FITC小鼠CD86抗体，Biolegend，US，Cat#：105005)混合物。所得的混合物4℃孵育半个小时。细胞用PBSF清洗2遍，然后经FACS仪器(BD)进行分析。
如图17所示，与阴性对照组相比，CD40抗体的治疗显著地减慢或抑制肿瘤生长，尽管个体反应不同。在7B4VH2VL2和APX005组，在所有小鼠中均观察到肿瘤生长抑制，在13A2VH3VL3和RO7009789组，大部分小鼠均表现为肿瘤生长抑制。在第28天，在7B4VH2VL2施用组中，4只剩余小鼠体内的肿瘤完全消失，在APX005组中，4只中的2只小鼠体内的肿瘤完全消失。
CD40抗体治疗可能因为抗体毒性问题造成小鼠体重下降。如图18和表11所示，扣除肿瘤重量(25日肿瘤约为1000mm3，1.2g)后，13A2VH3VL3处理组小鼠在第25天的体重与初始体重略有增加，没有例如RO7009789处理带来的大幅度体重下降的问题，且相比7B4VH2VL2和APX005，对于体重影响更小，表明13A2VH3VL3抗体的毒性较低。
表11.各组小鼠的体重(均值±SE(g)，每组8只小鼠)
组别/天数 4 6 8 11 14 18 21 25
13A2-VH3VL3 22.9±0.5 20.6±0.5 22.5±0.5 24.1±0.5 24.7±0.5 25.2±0.5 24.7±0.5 25.4±0.8
7B4-VH2VL2 23.0±0.3 21.2±0.2 23.4±0.2 23.8±0.2 22.7±0.5 24.4±0.2 22.2±0.5 22.9±0.5
RO7009789 23.9±0.3 21.5±0.4 22.9±0.4 22.6±0.3 22.2±0.4 22.1±0.5 21.8±0.4 19.6±0.5
APX005 22.6±0.3 20.8±0.3 22.9±0.3 23.1±0.4 23.4±0.6 24.1±0.4 21.5±0.6 22.0±0.7
PBS 23.3±0.4 23.2±0.3 24.2±0.4 23.7±0.3 25.1±0.4 26.5±0.4 27.8±0.5 30.7±0.6
图19示出，抗体7B4VH2VL2显著提升了CD45+细胞中CD45+CD3+CD8+细胞以及CD45+CD3+CD4+细胞的百分比。CD45+CD3+CD8+细胞的百分比在13A2VH3VL3处理组中也上升。此外，图20表明7B4VH2VL2处理显著增加了肿瘤浸润树突细胞(CD45+CD11c+细胞)中的CD80和CD83表达，表明其在促进树突细胞成熟中的较强激动活性。
本申请的CD40抗体50F6的序列总结如下。
Figure BDA0002454184300000341
Figure BDA0002454184300000351
尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。
序列表
<110> 北京天广实生物技术股份有限公司
北京华放天实生物制药有限责任公司
<120> 结合CD40的抗体及其用途
<130> 55566 00006
<160> 84
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2/7B4-HV-CDR1
<400> 1
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<220>
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<220>
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<220>
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Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
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<213> 人工序列
<220>
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Thr Ile Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
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Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
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Gly
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<212> PRT
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Glu Val Ser Gly Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly Arg Phe
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Arg Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Glu Met Phe Lys
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Gly
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<213> 人工序列
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<223> 77D9-HV-CDR3
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Arg Ala Tyr
1
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<220>
<223> 50F6-HV-CDR3
<400> 19
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1
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<212> PRT
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<220>
<223> 142F7-HV-CDR3
<400> 20
Gly Gly Ser Gly Phe Ala Tyr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
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<223> 13A2/7B4/16A6-LV-CDR1
<400> 21
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 22
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<212> PRT
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<220>
<223> 29A10-LV-CDR1
<400> 22
Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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<223> 92F6-LV-CDR1
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Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 77D9-LV-CDR1
<400> 24
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Leu Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
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<212> PRT
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<220>
<223> 50F6-LV-CDR1
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
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<212> PRT
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
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<211> 7
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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
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<220>
<223> 92F6-LV-CDR2
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<211> 7
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<220>
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Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2/7B4/16A6-LV-CDR3
<400> 31
Leu Gln Val Thr His Val Pro Phe Thr
1 5
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<211> 9
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<220>
<223> 29A10-LV-CDR3
<400> 32
Gln Gln Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Thr
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<220>
<223> 92F6-LV-CDR3
<400> 33
Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Phe Thr
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<211> 9
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<220>
<223> 50F6-LV-CDR3
<400> 35
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 142F7-LV-CDR3
<400> 36
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro
1 5
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-HV
<400> 37
Glu Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B4-HV
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16A6-HV
<400> 39
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr His Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 40
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 29A10-HV
<400> 40
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Tyr Arg Gly Asp Gly Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 92F6-HV
<400> 41
Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 77D9-HV
<400> 42
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Glu Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Val Ser Gly Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Arg Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 50F6-HV
<400> 43
Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 44
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 142F7-HV
<400> 44
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Gly Ile Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-VH0VL0-HV
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 46
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-VH2VL2/VH2VL3-HV
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-VH3VL2/VH3VL3-HV
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B4-VH0VL0-HV
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B4-VH2VL2/VH2VL3-HV
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 50
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B4-VH3VL2/7B4-VH3VL3-HV
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asn
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-LV
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Leu
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7B4-LV
<400> 52
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Leu
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16A6-LV
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Leu
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Leu Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 29A10-LV
<400> 54
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 92F6-LV
<400> 55
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 77D9-LV
<400> 56
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Leu
20 25 30
Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
85 90 95
Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 50F6-LV
<400> 57
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 142F7-LV
<400> 58
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-VH0VL0/7B4-VH0VL0-LV
<400> 59
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-VH2VL2/VH3VL2/7B4-VH2VL2/VH3VL2-LV
<400> 60
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13A2-VH2VL3/VH3VL3/7B4-VH2VL3/VH3VL3-LV
<400> 61
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IgG1重链恒定区
<400> 62
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 63
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG2重链恒定区
<400> 63
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区，含S267E和L328F突变
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Κ轻链恒定区
<400> 65
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Κ轻链恒定区
<400> 66
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 67
<211> 834
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 240
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
accatctgca cctgtgaaga aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc 360
ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 420
accatctgcg agccctgccc agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 480
tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagag ccctggtggt gatccccatc 600
atcttcggga tcctgtttgc catcctcttg gtgctggtct ttatcaaaaa ggtggccaag 660
aagccaacca ataaggcccc ccaccccaag caggaacccc aggagatcaa ttttcccgac 720
gatcttcctg gctccaacac tgctgctcca gtgcaggaga ctttacatgg atgccaaccg 780
gtcacccagg aggatggcaa agagagtcgc atctcagtgc aggagagaca gtga 834
<210> 68
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 69
<211> 837
<212> PRT
<213> 猕猴（Macaca mulatta）
<400> 69
Ala Thr Gly Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys
35 40 45
Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys
50 55 60
Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly
65 70 75 80
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly
130 135 140
Ala Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr
145 150 155 160
Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Thr Gly
165 170 175
Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala
180 185 190
Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Thr Ala Gly Ala Cys Ala
195 200 205
Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Cys
210 215 220
Ala Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys
225 230 235 240
Ala Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala
245 250 255
Ala Cys Cys Thr Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys
275 280 285
Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala
290 295 300
Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala
305 310 315 320
Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly
325 330 335
Ala Gly Thr Gly Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala
340 345 350
Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly
355 360 365
Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys
370 375 380
Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala
385 390 395 400
Thr Thr Gly Cys Thr Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Cys
405 410 415
Thr Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Gly
420 425 430
Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Cys Gly Gly Cys Thr
435 440 445
Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys
450 455 460
Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly
465 470 475 480
Thr Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala
485 490 495
Gly Cys Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala
500 505 510
Cys Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly
515 520 525
Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala
530 535 540
Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly Gly
545 550 555 560
Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Gly
565 570 575
Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala
580 585 590
Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly
595 600 605
Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Thr Cys
610 615 620
Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly
625 630 635 640
Thr Cys Thr Thr Thr Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr
645 650 655
Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Cys
660 665 670
Gly Ala Thr Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys
675 680 685
Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala
690 695 700
Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly
705 710 715 720
Gly Ala Cys Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr
725 730 735
Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys
740 745 750
Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala
755 760 765
Cys Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly
770 775 780
Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Gly
785 790 795 800
Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys Ala Thr Cys
805 810 815
Thr Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Cys
820 825 830
Ala Gly Thr Gly Ala
835
<210> 70
<211> 278
<212> PRT
<213> 猕猴
<400> 70
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Tyr Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Ser Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Leu His Cys Met
100 105 110
Ser Glu Ser Cys Glu Ser Cys Val Pro His Arg Ser Cys Leu Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Arg Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Gln
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Cys Leu Gly Ile Leu Phe Val Ile
195 200 205
Leu Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Asn
210 215 220
Asp Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Leu
225 230 235 240
Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Pro Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 71
<211> 869
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 71
atggtgtctt tgcctcggct gtgcgcgcta tggggctgct tgttgacagc ggtccatcta 60
gggcagtgtg ttacgtgcag tgacaaacag tacctccacg atggccagtg ctgtgatttg 120
tgccagccag gaagccgact gacaagccac tgcacagctc ttgagaagac ccaatgccac 180
ccatgtgact caggcgaatt ctcagcccag tggaacaggg agattcgctg tcaccagcac 240
agacactgtg aacccaatca agggcttcgg gttaagaagg agggcaccgc agaatcagac 300
actgtctgta cctgtaagga aggacaacac tgcaccagca aggattggag gcatgtgctc 360
agcacacgcc ctgtatccct ggctttggag ttatggagat ggccactgag accactgata 420
ccgtctgtca tccctgccca gtcggcttct tctccaatca gtcatcactt ttcgaaaagt 480
gttatccctg gacaagctgt gaggataaga acttggaggt cctacagaaa ggaacgagtc 540
agactaatgt catctgtggt ttaaagtccc ggatgcgagc cctgctggtc attcctgtcg 600
tgatgggcat cctcatcacc attttcgggg tgtttctcta tatcaaaaag gtggtcaaga 660
aaccaaagga taatgagatc ttaccccctg cggctcgacg gcaagatccc caggagatgg 720
aagattatcc cggtcataac accgctgctc cagtgcagga gacgctgcac gggtgtcagc 780
ctgtcacaca ggaggatggt aaagagagtc gcatctcagt gcaggagcgg caggtgacag 840
acagcatagc cttgaggccc ctggtctga 869
<210> 72
<211> 289
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 72
Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Leu Gly Gln Cys Val Thr Cys Ser Asp Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
His Asp Gly Gln Cys Cys Asp Leu Cys Gln Pro Gly Ser Arg Leu Thr
35 40 45
Ser His Cys Thr Ala Leu Glu Lys Thr Gln Cys His Pro Cys Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Phe Ser Ala Gln Trp Asn Arg Glu Ile Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Arg His Cys Glu Pro Asn Gln Gly Leu Arg Val Lys Lys Glu Gly Thr
85 90 95
Ala Glu Ser Asp Thr Val Cys Thr Cys Lys Glu Gly Gln His Cys Thr
100 105 110
Ser Lys Asp Cys Glu Ala Cys Ala Gln His Thr Pro Cys Ile Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Met Glu Met Ala Thr Glu Thr Thr Asp Thr Val Cys His
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Gln Ser Ser Leu Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Tyr Pro Trp Thr Ser Cys Glu Asp Lys Asn Leu Glu Val Leu Gln
165 170 175
Lys Gly Thr Ser Gln Thr Asn Val Ile Cys Gly Leu Lys Ser Arg Met
180 185 190
Arg Ala Leu Leu Val Ile Pro Val Val Met Gly Ile Leu Ile Thr Ile
195 200 205
Phe Gly Val Phe Leu Tyr Ile Lys Lys Val Val Lys Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Asn Glu Ile Leu Pro Pro Ala Ala Arg Arg Gln Asp Pro Gln Glu Met
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Pro Gly His Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln Val Thr Asp Ser Ile Ala Leu Arg Pro Leu
275 280 285
Val
<210> 73
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长OD40 ECD
<400> 73
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
165 170
<210> 74
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短体1
<400> 74
Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His
1 5 10 15
Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln
20 25 30
Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly
35 40 45
Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser
50 55 60
Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser
85 90 95
Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu
100 105 110
Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro
115 120 125
Gln Asp Arg Leu Arg
130
<210> 75
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短体2
<400> 75
Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala
20 25 30
Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe
35 40 45
Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr Ser Cys
50 55 60
Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp
65 70 75 80
Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
85 90
<210> 76
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短体3
<400> 76
Glu Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu
1 5 10 15
Lys Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln
20 25 30
Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg
35 40 45
Leu Arg
50
<210> 77
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短体4
<400> 77
Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu
1 5 10 15
Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp
20 25 30
Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp Pro
35 40 45
Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr
50 55 60
Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu
65 70 75 80
Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys Gln
85 90 95
Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val Gly
100 105 110
Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr
115 120 125
Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys
130 135 140
Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
145 150 155
<210> 78
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短体5
<400> 78
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr
20 25 30
His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val
35 40 45
Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu
50 55 60
Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg
65 70 75 80
Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser
100 105 110
Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp
115 120 125
Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly
130 135 140
Pro Gln Asp Arg Leu Arg
145 150
<210> 79
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体1
<400> 79
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Ala Ala Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
165 170
<210> 80
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体2
<400> 80
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Ala
20 25 30
Ala Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
165 170
<210> 81
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3
<400> 81
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Ala Ala Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
165 170
<210> 82
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体4
<400> 82
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Ala Ala Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg
165 170
<210> 83
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 83
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 84
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mFc-标签
<400> 84
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys

Claims (18)

1.一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，该轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链CDR1区、CDR2区和CDR3区，以及轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNOs：6、13、19、25、27和35所示，其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NOs：43和57所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2、或IgG4亚型。
6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区和轻链恒定区分别包含如(1)SEQ ID NOs：62和66；(2)SEQID NOs：63和65；或(3)SEQ ID NOs：64和65所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人CD40结合；(b)与猴CD40结合；(c)不与小鼠CD40结合；(d)促进CD40-CD40L结合；(e)激活CD40信号通路；(f)促进树突细胞成熟；和(g)促进CD8+和/或CD4+T细胞增殖。
8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为鼠源、嵌合或人源化抗体。
9.一种双特异性分子、免疫交联物、嵌合抗原受体、基因改造T细胞受体、或溶瘤病毒，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
10.一种组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的组合物，还包含第二抗体、和/或细胞因子。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述第二抗体选自VISTA抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、STAT3抗体和ROR1抗体。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述细胞因子为GM-CSF和/或IL-4。
14.一种核酸，编码权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
15.一种表达载体，包含权利要求14所述的核酸。
16.一种宿主细胞，包含权利要求15所述的表达载体。
17.权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分、或权利要求10-13中任一项所述的组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肠腺癌、胰腺癌、肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、肺癌和鼻咽癌。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112439060B (zh) * 2019-09-02 2024-03-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pd-l1免疫疗法的新用途
CN112924683B (zh) * 2019-12-05 2023-08-29 张曼 尿液外泌体cd40蛋白及其多肽片段在膀胱癌中的应用
CN117295764A (zh) * 2021-06-28 2023-12-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd40抗体、其抗原结合片段及医药用途
WO2023020475A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Utc Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Cd40-targetting antibodies and uses thereof
WO2023046131A1 (zh) * 2021-09-26 2023-03-30 正大天晴药业集团股份有限公司 抗cd40抗体的应用
CN114380911B (zh) * 2022-01-12 2022-12-27 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 靶向人cd40抗原的人源化单克隆抗体及其应用
WO2023138666A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Utc Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Circular rna and use thereof
WO2023155926A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. Tumor antigen-dependent cd40 agonist antibodies
TW202346366A (zh) * 2022-04-02 2023-12-01 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 標靶ｐｄ－ｌ１和ｃｄ４０的抗原結合蛋白及其製備和應用
WO2023232036A1 (zh) * 2022-05-31 2023-12-07 明济生物制药（北京）有限公司 抗cd40抗体和抗pd-l1×cd40双特异抗体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012170072A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Immungene, Inc. Engineered antibody-tnfsf member ligand fusion molecules
WO2015032906A2 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Bionovion Holding B.V. Cd70-binding peptides and method, process and use relating thereto
CN105849262A (zh) * 2013-09-30 2016-08-10 第三共株式会社 抗lps o11抗体
CN106928362A (zh) * 2011-04-29 2017-07-07 埃派斯进有限公司 抗‑cd40抗体及其使用方法
JP2018526989A (ja) * 2015-08-07 2018-09-20 ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー Ｌａｇ−３およびｐｄ−１に特異的な新規融合ポリペプチド
CN109071665A (zh) * 2016-04-18 2018-12-21 塞德斯医疗公司 结合人cd40的激动性抗体及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6051228A (en) * 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
WO2001056603A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-09 Tanox, Inc. Cd40-binding apc-activating molecules
CN104918957B (zh) * 2012-10-30 2018-11-16 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
US20170233485A1 (en) * 2014-08-18 2017-08-17 Biogen Ma Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
MA41460A (fr) * 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
SG11201807677YA (en) * 2016-03-04 2018-10-30 Univ Rockefeller Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
JP2019523221A (ja) * 2016-05-27 2019-08-22 アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド 抗ｃｄ４０抗体とその使用
EP3464367B1 (en) * 2016-05-27 2020-09-09 AbbVie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
CN109384845B (zh) * 2017-08-14 2022-06-21 中国科学院上海营养与健康研究所 一种cd40单克隆抗体、其制备方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106928362A (zh) * 2011-04-29 2017-07-07 埃派斯进有限公司 抗‑cd40抗体及其使用方法
WO2012170072A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Immungene, Inc. Engineered antibody-tnfsf member ligand fusion molecules
WO2015032906A2 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Bionovion Holding B.V. Cd70-binding peptides and method, process and use relating thereto
CN105849262A (zh) * 2013-09-30 2016-08-10 第三共株式会社 抗lps o11抗体
JP2018526989A (ja) * 2015-08-07 2018-09-20 ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー Ｌａｇ−３およびｐｄ−１に特異的な新規融合ポリペプチド
CN109071665A (zh) * 2016-04-18 2018-12-21 塞德斯医疗公司 结合人cd40的激动性抗体及其用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CIMANIS A.Y: "Ig light chain V region-mouse，Accession No:S38719", 《GENBANK》 *
GREGORY L.BEATTY ET AL.: "A phase I study of an agonist CD40 monoclonal antibody (CP-870,893) in combination with gemcitabine in patients with advanced pancreatic ductal adenocarcinoma", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
ROY B. ET AL.: "IgM heavy chain variable regin{ECO:0000313|EMBL:AFW17578.1}", 《EMBL-EBI》 *
TAKAHASHI Y ET AL.: "immunoglobulin heavy chain, partial [Mus musculus]，Accession No:BAN13969.1", 《GENBANK》 *
刘文增 等: "胰腺癌的肿瘤微环境及其免疫治疗研究进展", 《中国免疫学杂志》 *

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