JP2024518245A - Ｔｒｏｐ２結合抗体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【要約】ヒトTROP2又はその抗原結合部位と特異的に結合する単離モノクローナル抗体。 また、当該抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び当該抗体又はその抗原結合部分を発現させるための方法も提供される。 本開示は、さらに、二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物、並びに本開示の抗TROP2抗体又はその抗原結合部分を用いた治療法を提供する。

Description

関連出願及び参照による援用
本出願は、2021年4月23日に出願された米国仮特許出願シリアル番号63/178，741の優先権を主張するものである。
前述の出願及びそのすべての引用文書（「ａｐｐｌｎ ｃｉｔｅｄ ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ」）、本明細書のすべての引用・参照文書（本明細書で引用されるすべての文献文書、特許、公開された特許出願を含むがこれらに限定されない）（「ｈｅｒｅｉｎ ｃｉｔｅｄ ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ」）は、本明細書のすべての引用参照文書及び製品製造業者の説明書、説明、製品仕様書、製品シート、または参照により、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に使用することができる。 より具体的には、参照されたすべての文書は、個々の文書が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照により組み込まれる。 本開示で言及されたあらゆるGenbank配列は、本開示の最も早い有効出願日のGenbank配列とすることにより、参照により組み込まれる。
発明の分野
本開示は、概して、高い親和性と機能性でヒトTRＯP2に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にマウス、キメラもしくはヒト化モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。 また、当該抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び当該抗体又はその抗原結合部分を発現させるための方法に関する。 本開示はさらに、二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体またはその抗原結合部分を含み得る医薬組成物、ならびにそれらを使用する治療方法に関する。
発明の背景
TROP2は膜貫通型糖タンパク質として知られ、上皮糖タンパク質-1（EGP-1）、膜成分表面マーカー1（M1S1）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー2（TACSTD2）、胃腸抗原733-1（GA733-1）とも呼ばれている。 TROP2分子は、疎水性前駆体ペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部で構成されている。 細胞質尾部には、高度保存のホスファチジルイノシトール 4,5-二リン酸 (PIP2) 結合配列と 303 位のセリンリン酸化部位が含まれている(Zaman S et al., (2019) Onco Targets Ther.12:1781-1790）。 TROP2の結合パートナーには、IFG-1, Claudin-1, Claudin-7, cyclin D1 とPKCが含まれる(Shvartsur A et al., (2015) Genes Cancer.6(3-4):84-105)。
TROP2 は、正常組織では低レベルで発現し、例えば胚器官の発達や胎児の成長に役割を果たしているが、正常組織ではベースラインのTROP2 レベルとは無関係に、すべてのがん種で TROP2 発現の上方制御が見られている (Mustata RC et al., (2013) Cell Reports.5(2):421-432; Guerra E et al., (2012) PLoS ONE.7(11): e49302; Trerotola M et al., (2013) Oncogene.32(2): 222-233)。 TROP2の発現が依存するいくつかの転写因子は、TP63/TP53Lやウィルムス腫瘍1（WT1）など、がんの発生と相関していることが研究で示されており、TROP2は腫瘍形成に関連する多くの細胞シグナル伝達経路に関与していることが実証されている。 例えば、TROP2シグナル伝達は、β－カテニンシグナル伝達を介して細胞の自己再生及び増殖を調節し、したがって癌細胞の幹細胞様特性を促進する (Stoyanova T et al., (2012) Genes Dev.26(20):2271-2285)。 TROP2の過剰発現は、子宮頸がん、卵巣がん、結腸がん、及び甲状腺がんにおける腫瘍浸潤を促進し、TROP2のノックダウンはがん細胞浸潤を減少させる(Guan H et al., (2017) BMC Cancer. 17(1):486; Liu T et al., (2013) PLoS One. 8(9):e75864; Wu B et al., (2017) Exp Ther Med. 14(3):1947-1952; Zhao P et al., (2018) Oncol Lett. 15(3):3820-3827)。 近年、TROP2シグナル伝達はさらに、細胞移動のためのシグナルを調節することが分かってきた。 例えば、TROP2がβ1インテグリン機能を調節して前立腺癌の転移を促進することが報告された(Trerotola M et al., (2013) Cancer Res.73(10):3155-3167)。
TROP2の高発現は、肝門部胆管がん、子宮頸がん、胃がんなどにおいて、臨床的に予後不良と相関していることが分かっている。2,569人の患者を含むメタ分析では、TROP2発現の増加は、いくつかの固形腫瘍における全体的な無病生存転帰の不良と統計的に関連していた(Fong D et al., (2008) Br J Cancer. 99(8):1290-1295; Ning S et al., (2013) J Gastrointest Surg. 17(2):360-368; Liu T et al., (2013) PLoS One. 8(9):e75864; Zhao W et al., (2016) Oncotarget. 7(5):6136-6145; Zeng P et al., (2016) Sci Rep. 6:33658). 腫瘍マーカーとしての TROP2 の役割は、特定の臨床試験で試験されている。
TROP2 は、その構造的特徴とがんとの相関関係により、魅力的な治療標的となっている。 いくつかの抗TRＯP2抗体が調製され、そのいくつかは乳癌の進行を阻害し、異種移植マウスモデルにおいてアポトーシスを誘導することが判明した(Lin H et al., (2014) Int J Cancer.134(5):1239-1249)。 しかし、2015年にIKEDAらによってより高い結合親和性とより低い内部移行活性を持つPr1E11が同定されるまで、おそらくそれらの高い内部移行率のため、裸抗体としての治療的価値を示すものはなかった (Ikeda M et al., (2015) Biochem Biophys Res Commun.458(4):877-82)。 PR1E11は、後の研究で、インビボで強力な抗体依存性細胞傷害性を誘導することが判明し、これは高い細胞表面保持に関連していると推定された(Ikeda M et al., (2016) Anticancer Res.36(11):5937-5944)。 現在、前臨床試験及び臨床試験中のTROP2標的治療薬のほとんどは、DS-1062a、IMMU-132、PF-06664178などの抗体薬物複合体（ADC）であり、限定された毒性で固体がん治療において、現在まで得られたいくつかの有望な結果がある(Zaman S et al., (2019) supra). 強力な DNA トポイソメラーゼ I 阻害剤 (DXd) を含む、新規の TROP2 指向性抗体薬物複合体 (ADC) であるダトポタマブ デルクステカン (Dato-DXd、DS-1062a) が開発され、前臨床モデルにおけるその抗腫瘍活性と安全性プロファイルが評価された(Daisuke Okajima et al., Mol Cancer Ther, 2021 Dec; 20(12): 2329-2340).
裸抗体として使用するための低い内在化活性を有する、又はADC調製のための高い内在化活性を有する、抗TROP2抗体に対する追加の必要性が存在する。
本出願におけるいかなる文書の引用又は特定も、かかる文書が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
本開示は、TRＯP2（例えば、ヒトTRＯP2）に結合し、ヒト及び/またはそれより高くはないにしても同等の結合親和性/結合能を有する、単離されたモノクローナル抗体、例えば、マウス、キメラもしくはヒト化モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。 サシツズマブ（ＩMMＵ－132の抗体部分などの先行技術の抗TRＯP2抗体と比較して、サルTRＯP2と比較して、より高いまたはより低い内部移行活性を有する。
本開示の抗体または抗原結合部分は、インビトロでのTRＯP2タンパク質の検出、及び癌などのTRＯP2関連疾患の治療を含む様々な用途に使用できる。
したがって、一方では、 本開示は、TRＯP2に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。包含内容：（ｉ）VH CDR1領域、VH CDR2領域、及びVH CDR3領域を含み得る重鎖可変領域を含むここで、VH CDR1領域、VH CDR2領域及びVH CDR3領域は、以下に対して少なくとも85％, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：(1) 配列番号：1、2及び3のそれぞれ；(2)配列番号：7、8及び3のそれぞれ；(3) 配列番号：12、13及び14のそれぞれ；(4) 配列番号：18、19及び20のそれぞれ；(5) 配列番号：24、25及び26のそれぞれ；(6) 配列番号：30、31及び32のそれぞれ；（7）配列番号：35、36及び37のそれぞれ。で及び/または（ｉｉ）VL CDR1領域、VL CDR2領域及びVL CDR3領域を含む軽鎖可変領域。ここで、VL CDR1領域、VL CDR2領域及びVL CDR3領域は、以下に対して少なくとも 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：(1) 配列番号4、5及び6のそれぞれ；(2) 配列番号:9、10及び11のそれぞれ；(3)配列番号:15、16及び17のそれぞれ；(4)配列番号:21、22及び23のそれぞれ；（5）配列番号：27，28，29のそれぞれ；(6.)配列番号:33、34及び29のそれぞれ；(7)配列番号:38、39及び40のそれぞれ；
本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、VH CDR 1領域、VH CDR 2領域及びVH CDR 3領域を有する重鎖可変領域、ならびにVL CDR 1領域、VL CDR 2領域及びVL CDR 3領域を有する軽鎖可変領域を含み得るが、ここで、VH CDR 1、VH CDR 2、VH CDR 3、VL CDR 1、VL CDR 2及びVL CDR 3は、以下に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：（１）配列番号：1、2、3、4、5及び6のそれぞれ； （２）配列番号：7、8、3、9、10及び11のそれぞれ； （3）配列番号：12、13、14、15、16及び17のそれぞれ； （4）配列番号：18、19、20、21、22及び23のそれぞれ；； （4）配列番号：24、25、26、27、28及び29のそれぞれ；； （6）配列番号：30、31、32、33、34及び29のそれぞれ； （7）配列番号：35、36、37、38、39及び40のそれぞれ。；
本開示の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分は、配列番号：44, 45, 46 (X1=S, X2=A; X1=T, X2=A; X1=S, X2=V), 47 (X1=R, X2=R; X1=A, X2=T), 51, 53, 55, 57, 59または61に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域を含むことができる。 配列番号：44及び47（X1＝A、X2＝T）のアミノ酸配列は、それぞれ 配列番号：41及び42、それぞれのヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
本開示の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：48, 49 (X1=D, X2=L, X3=V; X1=E, X2=V, X3=L), 50 (X1=Q, X2=S, X3=K; X1=G, X2=A, X3=K; X1=G, X2=S, X3=Y), 52, 54, 56, 58, 60または62に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域を含むことができる。. 配列番号：48及び50（X1＝G、X2＝A、X3＝Ｋ）のアミノ酸配列は、それぞれ 配列番号：43及び63、それぞれのヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、以下に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。 （1) 配列番号：44 及び48のそれぞれ；(2) 配列番号：45及び 49 (X1=D, X2=L, X3=V) のそれぞれ；(3) 配列番号：46 (X1=S、X2=A) 及び 49 (X1=E、X2=V、X3=L) のそれぞれ； (4) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(5) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び 49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(6) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び 49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(7) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び 49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(8) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び 50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(9) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び 50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(10) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び 50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(11) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び 50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(12) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び 50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ； (13) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ； (14) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ； (15) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ； (16) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ； (17) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ； (18) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び 50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ； (19) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び 50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(20) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び 50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(21) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び 50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(22) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び 50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(23) 配列番号：51 及び 52のそれぞれ；(23) 配列番号：53 及び 54のそれぞれ；(23) 配列番号：55 及び 56のそれぞれ；(23) 配列番号：57 及び 58のそれぞれ；(27) 配列番号：59 及び 60のそれぞれ；または (28) 配列番号：61及び62のそれぞれ；
本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ジスルフィド結合によって連結された重鎖及び軽鎖を含んでよく、重鎖は重鎖可変領域及び重鎖定数領域を含んでよく、軽鎖は軽鎖可変領域及び軽鎖定数領域を含んでよく、本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖定数領域を含んでよい。ここで、重鎖可変領域のC末端は重鎖定数領域のN末端に連結され、軽鎖可変領域のC末端は軽鎖定数領域のN末端に連結されており、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記のアミノ酸配列を含んでいてもよく、抗体又はその抗原結合部分はTROP2と結合する。 重鎖定常領域は、例えば配列番号：64 (X1=R, X2=E, X3=M; X1= K, X2=D, X3=L)に記載のアミノ酸配列を有するヒトIgG1定常領域又はその機能的断片などの、強化されたFCR結合能力を有する重鎖定常領域であってもよい。軽鎖定数領域は、例えば配列番号：65に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトκ定常領域、又はその機能的断片。 重鎖定常領域はまた、強化されたFcR結合親和性を有するように操作されたヒトIgG2もしくはIgG4定常領域、またはその機能的断片であってもよい。 配列番号６４および６５のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７４および７５の核酸配列によってコードされ得る。
特定の実施形態における本開示の抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含むか、またはそれらからなってもよく、各重鎖は、上述の重鎖定常領域、重鎖可変領域またはCDR配列を含み得、各軽鎖は、 上記の軽鎖定常領域、軽鎖可変領域またはCDR配列において、抗体はTROP2に結合する。 本開示の抗体は、例えば、IgG1、IgG2又はIgG4アイソタイプの全長抗体であり得る。 他の実施形態における本開示の抗体またはその抗原結合部分は、単鎖可変フラグメント（SCFV）抗体、またはFab もしくはF（ab'）2フラグメントなどの抗体フラグメントであり得る。
本開示はまた、前記抗体、又はその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能性部分（例えば、第2の抗体）に連結された、本開示の抗体、又はその抗原結合部分を含み得る、二重特異性分子を提供する。 本開示はまた、細胞毒素、例えばSN-38などの治療薬に連結された、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含み得る、抗体薬物複合体などの免疫複合体を提供する。 別の態様では、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（CAR）の一部とすることができる。 また、T細胞やNK細胞など、抗原キメラ受容体を構成し得る免疫細胞も提供される。 さらに、本開示の抗体またはその抗原結合部分を備えた腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
抗体もしくはその抗原結合部分、免疫複合体、または二重特異性分子は放射性標識され、例えば転移性TRＯP2＋腫瘍/がんの分布を含むTRＯP2＋腫瘍/がんの分布を追跡/検出するための臨床画像化に使用され得る。 放射性標識には、3Hが含まれるが、これらに限定されない。
本開示は、本開示の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子、免疫複合体またはCARをコードする核酸分子、ならびにそのような核酸分子及び宿主細胞を含み得る発現ベクターも提供する。 それはそのような発現ベクターを含み得る。 宿主細胞を使用して本開示の抗TRＯP2抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子、免疫複合体またはCARを調製する方法も提供され、この方法は、ステップ(i)宿主細胞内で対象分子を発現させること、及びステップ(ii)宿主細胞またはその細胞培養物から対象分子を単離することを含む得る。
また、抗体またはその抗原結合部分、免疫複合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、CARまたはCAR-T細胞、核酸分子を含み得る医薬組成物、本開示の発現ベクターまたは宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を提供する。 特定の実施形態では、医薬組成物は、抗がん剤など、特定の疾患を治療するための治療剤をさらに含んでもよい。
さらに別の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるTRＯP2に関連する疾患（例えば、過剰なTRＯP2発現/シグナル伝達）を治療するための方法を提供する。これは、治療有効量の本開示の医薬組成物を対象に投与することを含み得る。 疾患は、腫瘍又はがんであってもよい。 腫瘍は、固形腫瘍または非固形腫瘍である場合があり、これには、乳がん、大腸がん、胃腺がん、食道がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣上皮がん、前立腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、膀胱腫瘍、子宮頸がん、子宮内膜がん、濾胞性甲状腺がん、及び多形性膠芽腫が含まれるが、これらに限定されない。 特定の実施形態では、抗VISTA抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM 3抗体、抗STAT3抗体、及び/又は抗ROR1抗体など、少なくとも1つの追加の抗がん抗体をさらに投与することができる。 特定の実施形態では、被験者はヒトである。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における癌イメージング方法であって、対象に本開示の放射性標識抗TRＯP2抗体もしくはその抗原結合部分、免疫複合体、または二重特異性分子を投与することを含む方法を提供する。 この方法は、食道扁平上皮がん、大腸がん、膵臓がん、結腸がん、甲状腺乳頭がん、乳がん、膀胱がんなどを含むが、これらに限定されない、TROP2の発現が高い腫瘍またはがんの分布を追跡/検出するために使用される。 特定の実施形態では、被験者はヒトである。
即席の開示の他の特徴及び利点は、限定的に解釈されるべきではない以下の詳細な説明及び例から明らかになるであろう。 本出願を通じて引用された全ての文献、Genbankエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
従って、本発明の目的は、いかなる従来公知の製品、製品の製造方法、又は製品の使用方法も本発明に包含しないことであり、出願人は、いかなる従来公知の製品、プロセス、又は方法についても免責する権利を留保し、ここに開示するものである。 さらに、本発明は、USPTO（米国特許法第１１２条、第１段落）又はEPO（EPC第83条）の書面記載要件及び実施可能要件に合致しない製品、プロセス、又は製品の製造方法又は製品の使用方法を本発明の範囲に包含する意図はないことに留意し、出願人は、以前に記載した製品、製品の製造方法又は製品の使用方法の免責事項を開示し、ここに権利を留保するものである。ＥＰＣ53条(c)並びにＥＰＣ規則28(b)及び(c)に準拠することが発明の実施において有利である。 本出願の系統、他の系統、又は第三者の先行出願における出願人の付与特許の被験者である実施形態を明示的に否認するすべての権利は、明示的に留保される。 本書のいかなる内容も、確約として解釈されるものではない。
本開示、特に請求項及び/又は段落において、「含む（comprises）」、「含まれる（composed）」、「含む（comprising）」等の用語は、米国特許法において帰属する意味を有することができることに留意されたい。例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に言及されていない要素を許容するが、先行技術に見出される要素又は本発明の基本特性又は新規特性に影響を与える要素を除外する。
以下の詳細な説明は、例として与えられるが、本発明を記載された特定の実施形態にのみ限定することを意図するものではなく、添付の図面と共に最もよく理解され得る。
捕捉ELＩSAにおけるヒトTRＯP2に対するマウス抗体A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7、A1H3C5H8E12の結合能力を示す。 捕捉ELＩSAにおけるヒトTRＯP2に対するマウス抗体B1G1F5A3及びC1B3B12D2の結合能力を示す。
間接ELＩSAにおけるカニクイザルTRＯP2に対するマウス抗体A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7、A1H3C5H8E12の結合能力を示す。 間接ELＩSAにおけるカニクイザルTRＯP2に対するマウス抗体B1G1F5A3及びC1B3B12D2の結合能力を示す。
細胞ベースの結合FACSアッセイにおける、ヒトTRＯP2を発現する293F-TRＯP2細胞に対する、マウス抗体A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7、A1H3C5H8E12の結合能力を示す。 細胞ベースの結合FACSアッセイにおける、ヒトTRＯP2を発現する293F-TRＯP2細胞に対する、マウス抗体B1G1F5A3及びC1B3B12D2の結合能力を示す。
マウス抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1、A1H3C5H8E12が競合ELＩSA試験においてベンチマーク-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。 マウス抗体A1F1G12A7及びA1B12D2B4E7B3が競合ELＩSA試験においてベンチマーク-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。 マウス抗体B1G1F5A3及びC1B3B12D2が競合ELＩSA試験においてベンチマーク-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。
競合ELＩSA試験においてA1E4F7D4、A1E11A12D1及びA1H3C5H8E12がマウス抗体A1E4F7D4-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。
競合ELＩSA試験においてマウス抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1及びA1H3C5H8E12がマウス抗体A1E11A12D1-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。
競合ELＩSA試験においてマウス抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1及びA1H3C5H8E12がマウス抗体A1H3C5H8E12-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。
293F-TRＯP2細胞に対するマウス抗体-DTTP1170コンジュゲートの内在化媒介細胞毒性を示す。
捕捉ELＩSAにおけるヒトTRＯP2に対するキメラ抗体A1E4F7D4及びC1B3B12D2（A）、及びA1F1G12A7（B）の結合能力を示す。 捕捉ELＩSAにおけるヒトTRＯP2に対するキメラ抗体A1E4F7D4及びC1B3B12D2（A）、及びA1F1G12A7の結合能力を示す。
間接ELＩSAにおけるキメラ抗体A1E4F7D4、C1B3B12D2のカニクイザルTRＯP2に対する結合能力を示す。 間接ELＩSAにおけるキメラ抗体A1F1G12A7のカニクイザルTRＯP2に対する結合能力を示す。
細胞ベースの結合FACSアッセイにおける、ヒトTRＯP2を発現する293F-TRＯP2細胞に対するキメラ抗体A1E4F7D4及びC1B3B12D2の結合能力を示す。 細胞ベースの結合FACSアッセイにおける、ヒトTRＯP2を発現する293F-TRＯP2細胞に対するキメラ抗体A1F1G12A7の結合能力を示す。
293F-TRＯP2細胞に対するキメラ抗体-DT3Cコンジュゲートの内在化媒介細胞毒性を示す。
捕捉ELISAにおけるヒトTROP2に対するhuA1E4F7D4-V16の結合能力を示す。
間接ELＩSAにおける、カニクイザルTRＯP2に対するHｕA1E4F7D4-V16の結合能力を示す。
細胞ベースの結合FACSアッセイにおける、ヒトTRＯP2を発現する293F-TRＯP2細胞に対するHｕA1E4F7D4-V16の結合能力を示す。
競合ELＩSA試験において抗体HｕA1E4F7D4-V16がベンチマーク-ヒトTRＯP2結合をブロックする能力を示す。
293F-TRＯP2細胞に対するHｕA1E4F7D4-V16-DT3Cコンジュゲートの内在化媒介細胞毒性を示す。
huA1E4F7D4-V16のタンパク質サーマルシフトアッセイ結果を示す。
細胞ベースの結合FACSアッセイにおける、ヒトTRＯP2を発現する293F-TRＯP2細胞に対するHｕA1E4F7D4-V16の結合能力を示す。
293F-TRＯP2細胞に対するHｕA1E4F7D4-V16-DT3Cコンジュゲートの内在化媒介細胞毒性を示す。
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。 追加の定義は、詳細な説明を通じて記載される。
「TROP2」という用語は、上皮糖タンパク質-1、胃腸抗原733-1、及び膜成分表面マーカー-1としても知られる腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー2を指す。 「TROP2」という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含んでいてもよい。 例えば、ヒトTROP2タンパク質に特異的な抗体は、特定の場合、サルなどのヒト以外の種からのTROP2タンパク質と交差反応することがある。 他の実施形態では、ヒトTROP2タンパク質に特異的な抗体は、ヒトTROP2タンパク質に完全に特異的であり、他の種又は他のタイプのものに対して交差反応を示さないか、又は特定の他の種からのTROP2と交差反応するが他の全ての種とは交差反応しない場合がある。
「ヒトTROP2」という用語は、配列番号71に記載されるヒトTROP2のアミノ酸配列のような、ヒト由来のアミノ酸配列を有するTROP2タンパク質を指す。 「サルTRＯP2」または「カニクイザルTRＯP2」という用語は、カニクイザルまたはアカカニクイザル由来のアミノ酸配列、例えば、NCBIアクセッション番号XP＿001114599．1またはXP＿011762693．1を有するアミノ酸配列を有するTRＯP2タンパク質を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、場合によっては、標的を認識し、少なくとも1つの抗原結合部位を介して特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、抗原結合部位は通常、免疫グロブリン分子の可変領域内にある。 本明細書で使用される場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、単鎖Fv(scFv)抗体、重鎖抗体(HCAb)、軽鎖抗体(LCAb)、多重特異性抗体、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、 抗体が所望の生物学的活性を示す限り、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、及び抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子（例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン分子）を指す。 また、抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を含むが、これらに限定されない。 抗体は、以下の5つの主要なクラスの免疫グロブリンのいずれであってもよい。IgA、IgD、IgE、IgG、及び IgM、またはそのサブクラス (アイソタイプ) (例: IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及び IgA2)。アルファ、デルタと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づく 、イプシロン、ガンマ、ミュー。 免疫グロブリンの異なるクラスは、異なるよく知られたサブユニット構造と三次元構成を有している。 抗体は、裸であったり、毒素や放射性同位元素など他の分子と結合していたりすることもある。 明示的に別段の指示がない限り、本明細書で使用する「抗体」という用語は、インタクトな抗体の「抗原結合部分」を含む。 IgGは、2本の重鎖（H）と2本の軽鎖（L）がジスルフィド結合によって相互に連結されてなる糖タンパク質である。 各重鎖は、重鎖可変領域（以下、VHと略記する）と重鎖定常領域から構成されている場合がある。 重鎖定常領域は、CH1、CH2、CH3の3つのドメインから構成されてもよい。 各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記する）と軽鎖定常領域とから構成されてもよい。 軽鎖定数領域は、1つのドメインCLで構成されてもよい。 VH及びVL領域は、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる保存性の高い領域にさらに細分化されることができる。 VHとV Lはそれぞれ3つのCDRと4つのFRからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4の順に配列している。FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。 重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが存在する。 抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第1成分（C1q）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。 重鎖定常領域の「機能的断片」とは、免疫細胞及び/または補体系タンパク質への抗体の結合を媒介する能力など、全長定常領域の機能を保持する定常領域の一部を指す。 軽鎖定常領域の「機能的断片」とは、全長定常領域の機能を保持する定常領域の一部を指す。
抗体に関連して使用される「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、抗原（例えば、SARS-CoV-2スパイク タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を指す。 抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。 抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。(i) Fab フラグメント、VL、VH、CL、及び CH1 ドメインからなる一価フラグメント; （ｉｉ）F（ab'）2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFAB フラグメントを含む二価フラグメント；(iii) VH ドメインと CH1 ドメインからなる Fd フラグメント。 (iv) 抗体の単一アームの VL ドメイン及び VH ドメインからなる Fv フラグメント、（V）VHドメインからなるdAb フラグメント（Ward et al.,（1989）Nature 341：544－546）。（vi）単離された相補性決定領域（CDR）；(viii) ナノボディ、単一の可変ドメインと 2 つの定常ドメインを含む重鎖可変領域。 さらに、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を用いて、VL及びVH領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作ることができる合成リンカーによって結合することができる（単一鎖Fv（scFv）として知られている；例えば Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc.Natl．Acad．Sci.USA 85:5879-5883)。 このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれることを意図している。 これらの抗体断片は、当業者に知られた従来の技術を用いて得られ、その断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される「単離された」抗体またはその抗原結合部分は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（例えば、特異的に結合する単離抗体）を実質的に含まない抗体またはその抗原結合部分を指すことを意図する。 TROP2タンパク質は、TROP2タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。 しかしながら、ヒトTRＯP2タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分は、他の種からのTRＯP2タンパク質などの他の抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。 さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質及び/又は化学物質を実質的に含まないことができる。
本明細書で使用する「マウス抗体」という用語は、フレームワーク領域及びCDR領域の両方がマウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。 さらに、抗体が定数領域を含む場合、定数領域もまた、マウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。 本開示のマウス抗体は、マウス生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。 しかしながら、本明細書で使用する「マウス抗体」という用語は、他の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がマウスフレームワーク配列にグラフト化された抗体を含むことを意図していない。
「キメラ抗体」という用語は、非ヒト由来の遺伝物質とヒト由来の遺伝物質を組み合わせて作られた抗体を意味する。 又は、より一般的には、キメラ抗体とは、ある種からの遺伝物質と他の種からの遺伝物質とを有する抗体である。
本明細書で使用する「ヒト化抗体」という用語は、ヒトで天然に産生される抗体変異体との類似性を高めるためにタンパク質配列が改変された非ヒト種由来の抗体を意味する。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、天然に起こり得る変異及び/又は微量に存在し得る翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は、同一である。 モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して指向性を持つ、非常に特異性の高い抗体である。 ポリクローナル抗体製剤は通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むのに対し、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向性を持つ。 モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンに汚染されていないハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有利である。 修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の性格を示し、特定の方法による抗体の製造を要求するものと解釈されるものではない。 例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法を含む様々な技術によって製造することができる。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、IgM又はIgG1）を意味する。
本明細書において、「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語は、「抗原に特異的に結合する抗体」という語と互換的に使用される。
本明細書で使用する「ヒトTROP2に特異的に結合する」抗体は、ヒトTROP2タンパク質（及び場合によっては1つ以上の非ヒト種からのTROP2タンパク質）に結合するが、非TROP2タンパク質には実質的に結合しない抗体を指すことを意図している。 好ましくは、抗体は、「高親和性」で、すなわち、5.0 x10-8 M以下、より好ましくは1.0 x10-8 M以下、さらに好ましくは2.0 x 10-9 M以下のKDでヒトTROP2タンパク質に結合する。
本明細書で使用される、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質または細胞に結合しないか、または高親和性で結合しない、すなわち、1.0×10-6 M以上、より好ましくは1.0×10-5 M以上のKDでタンパク質または細胞に結合することを意味し、 より好ましくは1．0×10 -4 M以上、より好ましくは1．0×10 -3 M以上、さらにより好ましくは1．0×10 -2 M以上を指す。
IgG抗体の「高親和性」 という用語は、標的抗原に対して1.0×10-6M以下、より好ましくは5.0×10-8M以下、さらにより好ましくは1.0×10-8M以下、さらにより好ましくは1.0×10-9M以下、さらにより好ましくは1.0×10-10M以下のKDを有する抗体を意味する。 しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて変化し得る。 例えば、IgMアイソタイプに対する「高親和性」結合は、10-6M以下、より好ましくは10-7M以下、さらにより好ましくは10-8M以下のKDを有する抗体を指す。
本明細書で使用する用語「Kassoc」又は「Ka」は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しており、一方、本明細書で使用する用語「Kdis」又は「Kd」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。 本明細書で使用する「KD」という用語は、KdとKaの比（すなわち、Kd/Ka）から得られる解離定数を意味し、モル濃度（M）として表されることを意図している。 抗体のKD値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。 抗体のKDを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる方法であり、好ましくはBiacore（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いる方法である。
「EC50」という用語は、最大有効濃度の半分としても知られ、指定された曝露時間後にベースラインと最大値の間の中間で応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
「IC50」という用語は、最大阻害濃度の半分としても知られ、抗体または抗原結合が存在しない場合と比較して、特定の生物学的または生化学的機能を50%阻害する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
「被験体」 という用語には、ヒト又はヒト以外の動物が含まれる。 「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、牛、馬、鶏、両生類、及び爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が含まれるが、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、牛、馬などの哺乳類が好ましい。
「治療有効量」という用語は、疾患または状態（腫瘍など）に関連する症状を予防または改善し、及び/または疾患の重症度を軽減するのに十分な、本開示の抗体または抗原結合部分の量や状態を指す。 治療上有効な量は、実際の有効量が当業者によって容易に識別される、治療される状態との関連で理解される。
本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ヒト及び/またはサルのTRＯP2に対して、より高くはないにしても同等の結合親和性/結合能でヒトTRＯP2に特異的に結合し、サシツズマブ（IMMU-132の抗体部分）などの抗TROP2抗体など従来のものと比較して、より高いまたはより低い内部移行活性を有する。
本開示の抗体またはその抗原結合部分は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を指す。
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、下記及び以下の実施例に記載されるように構造的及び化学的に特徴付けられたモノクローナル抗体である。 本開示の重鎖/軽鎖可変領域及びCDRのアミノ酸配列ＩD番号を以下の表1に要約するが、いくつかの抗体は同じVHまたはVL を共有する。 抗体の重鎖定常領域は、例えば配列番号64（X1＝R、X2＝E、X3＝M；X1＝Ｋ、X2＝D、X3＝L ）に記載のアミノ酸配列を有するヒトIgG1重鎖定常領域であり得る、またはその機能的断片であり、抗体の軽鎖定常領域は、例えば配列番号65に記載のアミノ酸配列。 本開示の抗体はまた、ヒトIgG2またはIgG4重鎖定常領域を含み得る。 本開示の抗体はまた、ヒトκ軽鎖定常領域を含み得る。
表1の重鎖可変領域CDR及び軽鎖可変領域CDRは、Kabat番号付けシステムによって定義されている。 しかしながら、当技術分野で周知のように、CDR領域は、重鎖/軽鎖可変領域配列に基づいて、Chothia、及びIMGT、AbM、又はContact番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定することもできる。
表1. Ig抗体の重鎖・軽鎖可変領域のアミノ酸配列ID番号とCDR
ヒトTRＯP2に結合する他の本開示の抗TRＯP2抗体のVH及び/またはVL 配列（またはCDR配列）は、ヒトTRＯP2抗体のVH及び/またはVＬL 配列（またはCDR配列）と「混合して適合」させることができる。 好ましくは、免疫グロブリン様抗体を用いるいくつかの実施形態では、VH鎖及びVL 鎖（またはそのような鎖内のCDR）が混合され、適合される場合、特定のVH／/VL 対からのVH配列は、構造的に類似したVH配列で置き換えられる。 同様に、好ましくは、特定のVH/VLペアリングからのVL配列は、構造的に類似したVL配列と置換される。
したがって、一実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、以下を含み得る：
(a) 表1に列挙したアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域; 及び/または
（b）上記の表1に列挙したアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、または別の抗TRＯP2抗体のVL であって、抗体はヒトTRＯP2に特異的に結合する。
別の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、以下を含み得る：
(a) 表 1 に列挙した重鎖可変領域の CDR1、CDR2、及び CDR3 領域。 及び/または
（b）上記の表1に列挙した軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3領域、または別の抗TRＯP2抗体のCDRであり、抗体はヒトTRＯP2に特異的に結合する。
さらに別の実施形態では、抗体、又はその抗原結合部分は、抗TROP2抗体の重鎖可変CDR2領域を、ヒトTROP2と結合する他の抗体のCDR、例えば、重鎖可変領域からのCDR1及び/又はCDR3、及び/又は異なる抗TROP2抗体の軽鎖可変領域からのCDR1、CDR2、及び/又はCDR3、と組み合わせたものを含んでいる。
さらに、CDR3ドメインは、CDR1及び/又はCDR2ドメインとは独立して、単独で同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定できること、及び共通のCDR3配列に基づいて同一の結合特異性を有する複数の抗体を予測可能に生成できることは当技術分野でよく知られている。
したがって、別の実施形態では、本開示の抗体は、抗TROP2抗体の重鎖可変領域のCDR2と、抗TROP2抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変領域の少なくともCDR3、又は別の抗TROP2抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変領域のCDR3を含んでいてもよく、ここで抗体はヒトTROP2と特異的に結合することが可能である。 これらの抗体は、好ましくは、（a）TROP2との結合を競合し；（b）機能的特性を保持し；（c）同じエピトープに結合し；及び/又は（d）本開示の抗TROP2抗体と同様の結合親和性を有する。 さらに別の実施形態では、抗TROP2抗体の軽鎖可変領域のCDR2、又は別の抗TROP2抗体の軽鎖可変領域のCDR2をさらに含んでよく、ここで抗体は、ヒトTROP2に特異的に結合することが可能である。 別の実施形態では、本開示の抗体は、抗TROP2抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変領域のCDR1、又は別の抗TROP2抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変領域のCDR1を含んでよく、ここで抗体は、ヒトTROP2に特異的に結合することが可能である。
別の実施形態では、一つ以上の保守変更を経た本開示の抗体またはその抗原結合部分は、以下の点で本開示の抗TRＯP2抗体のものとは異なるCDR1、CDR2、及びCDR3配列の重鎖及び/または軽鎖可変領域配列を含み得る。 抗原結合を除去しない特定の保存的配列修飾がなされ得ることは、当業者に理解されている。
したがって、一実施形態では、抗体は、CDR1、CDR2、及びCDR3配列を含んでいてもよい重鎖可変領域、及び/又はCDR1、CDR2、及びCDR3配列を含んでいてもよい軽鎖可変領域を含んでいてもよく、ここで、
(a）重鎖可変領域CDR1配列は、上記表1に記載の配列、及び/又はその保存的修飾を含んでいてもよい；及び/又は
(b）重鎖可変領域CDR2配列は、上記表1に記載の配列、及び/又はその保存的修飾を含んでいてもよい；及び/又は
(c）重鎖可変領域CDR3配列は、上記表1に記載の配列、及び/又はその保存的修飾を含んでいてもよい；及び/又は
(d）軽鎖可変領域CDR1、及び/又はCDR2、及び/又はCDR3配列は、上記表1に記載の配列、及び/又はその保存的修飾を含んでいてもよい；及び/又は
(e) 抗体は、ヒトTROP2と特異的に結合する。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、例えば、マウス、キメラ、またはヒト化されたものであり得る。
本明細書で使用する場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響又は変化を与えないアミノ酸改変を指すことを意図している。 そのような保存的な改変には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。 改変は、部位特異的変異誘発及びPCR媒介変異誘発などの当技術分野で知られる標準的な技術によって、本開示の抗体に導入することができる。 保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである。 類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）である。 したがって、本開示の抗体のCDR領域内の1つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、改変された抗体は、本明細書に記載の機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記に規定する機能）に関して試験することができる。
本開示の抗TROP2抗体のVH/VL配列の1つ以上を有する抗体を出発材料として用いて、本開示の抗体を調製し、改変された抗体を工学的に作製することができる。 抗体は、1つ又は両方の可変領域（すなわち、VH及び/又はVL）内、例えば、1つ又は複数のCDR領域内及び/又は1つ又は複数のフレームワーク領域内の1つ又は複数の残基を修飾することによって工学的に作製することができる。 さらに、又は代替的に、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を改変することによって設計することができる。
特定の実施形態では、CDRグラフトは、抗体の可変領域を設計するために使用することができる。 抗体は、6つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（CDRｓ）に位置するアミノ酸残基を介して、主に標的抗原と相互作用する。 このため、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列に比べ、個々の抗体で多様性がある。 CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用を担っているので、特性の異なる別の抗体からのフレームワーク配列にグラフトした特定の自然発生抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann et al.,（1998）Nature 332:323-327; Jones et al.,（1986）Nature 321:522-525; Queen et al.,（1989）Proc.Natl．Acad．米国86:10029-10033; 米国特許番号第5,225,539; 第5,530,101; 第5,585,089; 第5,693,762及び第6,180,370).
フレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開 DNA データベースまたは公開された参考文献から取得できる。
抗体タンパク質配列は、当業者によく知られているギャップドBLAST（Altschul et al.,（1997）、上）と呼ばれる配列類似性検索法の1つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較される。 本開示の抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似しているものである。
可変領域修飾の別のタイプは、VH及び/又はVL CDR1、CDR2及び/又はCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって目的の抗体の一つ又は複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。 変異を導入するために部位特異的変異誘発又はPCR媒介変異誘発を行うことができ、抗体結合又は関心のある他の機能特性への影響は、当該技術分野で知られているようにin vitro又はin vivoアッセイで評価することができる。 好ましくは、保存的修飾（当技術分野で既知のもの）が導入される。 変異は、アミノ酸の置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。 さらに、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4又は5個より多い残基は変更されない。
本開示の操作された抗体には、例えば抗体の特性を改善するために、VH及び/またはVL 内のフレームワーク残基に修飾が加えられた抗体が含まれる。 典型的には、そのようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。 例えば、1つのアプローチは、1つ又は複数のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列に「突然変異」することである。 より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含むことができる。 このような残基は、抗体のフレームワーク配列を、その抗体が由来する生殖細胞系列の配列と比較することによって同定することができる。
別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、または1つ以上のCDR領域内の1つ以上の残基を変異させてT細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。 このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公開第20030153043号にさらに詳細に記載されている。
加えて、又はフレームワーク領域もしくはCDR領域内で行われる改変の代替として、本開示の抗体は、典型的には、血清半減期、補体固定、Fc受容体結合、及び/又は抗原依存性細胞細胞傷害などの抗体の1以上の機能特性を変えるために、Fc領域内に改変を含むように操作することが可能である。 さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾することができ（例えば、1つ又は複数の化学部分を抗体に付着させることができる）、又はそのグリコシル化を変更するために修飾され、再び抗体の1つ又は複数の機能的特性を変更するために修飾される。
別の実施形態では、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異される。 より具体的には、1つ以上のアミノ酸変異が、抗体がネイティブなFcヒンジドメインSpA結合と比較して損なわれたスタフィロコッカルプロテインA（SpA）結合を有するように、Fcヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン界面領域に導入される。 この方法は、米国特許第6,165,745号でさらに詳しく説明されている。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。 例えば、グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠いている）。 グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。 このような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内の1つ又は複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。 例えば、1つ以上のアミノ酸置換は、それによってその部位でのグリコシル化をなくすために、1つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去をもたらすように行うことができる。 このようなアグリコシル化により、抗体の抗原に対する親和性を高めることができる。 例えば、米国特許第5,714,350及び6,350,861号を参照してください。
さらに、フコシル残基の量を減らした低フコシル化抗体や、二重鎖のGlcNac構造を増やした抗体など、グリコシル化のタイプを変えた抗体も作製することができる。 このような糖鎖修飾は、抗体のADCC活性を増加又は減少させることが証明されている。 このような糖鎖修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞で抗体を発現させることにより達成することができる。 グリコシル化機構が変化した細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現させ、それによってグリコシル化が変化した抗体を産生するための宿主細胞として使用することが可能である。
本開示によって企図される本明細書の抗体の別の改変は、ペギル化である。 抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにペギル化され得る。 抗体をペグ化するために、抗体又はその断片は、典型的には、1つ以上のPEG基が抗体又は抗体断片に付着する条件下で、PEGの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（PEG）と反応される。 好ましくは、ペギル化は、反応性PEG分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。 本明細書で使用する場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（C1-C10）アルコキシ-もしくはアリールオキシ-ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール-マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたPEGの形態のいずれかを含むことを意図している。 特定の実施形態では、PEG化される抗体は、アグリコシル化抗体である。 タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で知られており、本開示の抗体に適用することができる。EP 0 154 316 及び EP 0 401 384を参照してください。
本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び/又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けることができる。
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに1つ又は複数のグリコシル化部位を含むことができる。 そのようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増加、又は抗原結合の変化による抗体のpKの変化をもたらす場合がある（Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. , (2000) Mol Immunol 37:697-706)が挙げられる。 グリコシル化は、N-X-S/T配列を含むモチーフで起こることが知られている。
好ましい実施形態では、抗体は、アスパラギン異性化部位を含まない。 アスパラギンの脱アミド化はN-G又はD-G配列上で起こり、ポリペプチド鎖にリンクを導入し、その安定性を低下させるイソアスパラギン酸残基の生成につながる（イソアスパラギン酸効果）。
各抗体は固有の等電点（pI）を持ち、一般にpH6から9.5の範囲にある。 IgG1抗体のpIは一般的にpH7-9.5、IgG4抗体のpIは一般的にpH6-8の範囲に収まります。 通常の範囲外のpIを有する抗体は、生体内条件下で何らかのアンフォールディングや不安定性を有する可能性があると推測されている。 したがって、正常範囲に入るpI値を含む抗TROP2抗体であることが好ましい。 これは、正常範囲内のpIを有する抗体を選択することによって、又は帯電した表面残基を変異させることによって達成され得る。
別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変領域、又はCDRをコードする核酸分子を提供する。 核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、又は部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。 核酸は、標準的な技術によって他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から離れて精製される場合、「単離され」又は「実質的に純粋にされる」。 本開示の核酸は、例えば、DNA又はRNAであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。 好ましい実施形態では、核酸は、cDNA分子である。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。 ハイブリドーマ（例えば、以下でさらに説明するようにヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）により発現される抗体については、ハイブリドーマにより作られる抗体の軽鎖及び重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅又はcDNAクローニング技術によって得ることができる。 免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体（例えば、ファージディスプレイディープLsを使用する）については、そのような抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。
本開示の好ましい核酸分子には、TRＯP2モノクローナル抗体またはCDRのVH配列及び/またはVL 配列をコードする核酸分子が含まれる。 本開示の好ましい核酸分子には、TRＯP2モノクローナル抗体またはCDRのVH配列及び/またはVL 配列をコードする核酸分子が含まれる。VH 及び/または VL セグメントをコードする DNA フラグメントが得られたら、これらの DNA フラグメントを標準的な組換え DNA 技術によってさらに操作して、たとえば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Fab フラグメント遺伝子、または scFv 遺伝子に変換することができる。 これらの操作において、VL－又はVH-をコードするDNA断片は、抗体定数領域やフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のDNA断片と操作的に連結される。 この文脈で使用される「操作的に連結された」という用語は、2つのDNA断片がコードするアミノ酸配列がインフレームで保たれるように結合されることを意味する。
VH領域をコードする単離されたDNAは、VHをコードするDNAを重鎖定数領域（CH1、CH2、CH3）をコードする別のDNA分子に操作的に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。 ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。 重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域であり得るが、最も好ましくはIgG1又はIgG4定常領域である。 Fab断片重鎖遺伝子の場合、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定数領域のみをコードする別のDNA分子に作動的に連結することができる。
VLー領域をコードする単離DNAは、VLをコードするDNAを軽鎖定数領域CLをコードする別のDNA分子に作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（Fab軽鎖遺伝子と同様）に変換することができる。 ヒト軽鎖定数領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。 好ましい実施形態では、軽鎖定数領域は、kappa又はラムダ定数領域であり得る。
scFv遺伝子を作成するために、VH及びVLをコードするDNA断片は、VH及びVL配列が、VL及びVH領域がフレキシブルリンカーによって接合された、連続した単鎖タンパク質として発現し得るように、例えば、アミノ酸配列（Gly4-Ser）3をコードする別の断片に作動上連結する (例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc.Natl．Acad．Sci.USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,, (1990) Nature 348:552-554).
本開示のモノクローナル抗体（mAbs）は、Kohler及びMilstein（1975）Nature 256：495の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を使用して製造することができる。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態には、Bリンパ球のウイルス性又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ深層Lsが含まれる。 キメラ抗体又はヒト化抗体もまた、当該技術分野において周知である。
本開示の抗体はまた、例えば、当技術分野でよく知られているような組換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞のトランスフェクションマにおいて生産することができる（例えば、Morrison，S. (1985) Science 229：1202）。 一実施形態では、標準的な分子生物学技術によって得られた部分長又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするDNAは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動的に連結されるように、1つ又は複数の発現ベクターに挿入される。 この文脈において、「操作的に連結された」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味する。
「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。 このような調節配列は、例えば、Goeddel（Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)）に記載されている。 哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えばサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）及びポリマウイルスエンハンサーから得られるプロモーター及び/又はエンハンサーが含まれる。 または、ユビキチンプロモーターやβ-グロビンプロモーターのような、非ウイルス性の制御配列も使用できる。 さらに、異なる供給源からの配列からなる調節要素、例えば、SV40初期プロモーターとヒトT細胞白血病ウイルス1型の長末端リピートからの配列を含むSRαプロモーター系（Takebe et al.,（1988）Mol.Cell.Biol.8：466-472）などが挙げられる。細胞。Biol.8:466-472も参照されたい)。 発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。
抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子は、同じ発現ベクター又は別々の発現ベクターに挿入することができる。 好ましい実施形態では、可変領域は、VHセグメントがベクター内のCHセグメント（複数可）に、VLセグメントがベクター内のCLセグメントに作動的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定数領域及び軽鎖定数領域を既にコードする発現ベクターに挿入して、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作成するために使用される。 さらに、又は代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。 抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。 シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであっても、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であってもよい。
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子などの追加の配列を運ぶことができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第4，399，216号；4，634，665及び5，179，017を参照されたい）。 選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許第4,399,216; 4,634,665 及び 5,179,017号を参照してください。)。 例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与するものである。 好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子（メトトレキサート選択/増幅を伴うdhfr-宿主細胞における使用のため）及びneo遺伝子（G418選択のため）が挙げられる。
重鎖及び/または軽鎖を発現させるには、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。 「トランスフェクション」 という用語のさまざまな形式は、原核生物又は真核生物の宿主細胞への外因性DNAの導入に一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストランのトランスフェクションなどを含むことを意図している。 本開示の抗体を原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれかで発現させることは理論的には可能であるが、真核生物細胞、特に哺乳類宿主細胞における抗体の発現が最も好ましいのは、かかる真核細胞、特に哺乳類細胞が、原核細胞よりも、適切に折り畳まれて免疫的に活性な抗体を組み立てて分泌させる可能性が高いからである。
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈ ａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているよ うな、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓ ｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－ ４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ 細胞及びＳＰ２細胞を含む。特にNSOミエローマ細胞で使用する場合、別の好ましい発現系は、WO87/04462、WO89/01036及び及びEP338,841に開示されているGS遺伝子発現系である。 抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは宿主細胞が増殖している培養液への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、抗体を産生することができる。 抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養液から回収することができる。
別の態様では、本開示は、少なくとも2つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも1つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体のリガンド）に連結した本開示の1つ以上の抗体を含み得る二重特異性分子を特徴としている。 したがって、本明細書で使用する場合、「二重特異性分子」は、3つ以上の特異性を有する分子を含む。 一実施形態では、二重特異性分子は、Fc結合特異性及び抗TROP2結合特異性に加えて、第3の特異性を有する。 本開示の二重特異性分子は、特定の実施形態において、FCR結合親和性が低下するように操作され得る。
二重特異性分子は、多くの異なる形式及びサイズである可能性がある。 粒径スペクトルの一方の端では、二重特異性分子は伝統的な抗体の形式を保持するが、同じ特異性の2つの結合アームを持つ代わりに、それぞれが異なる特異性を持つ2つの結合アームを持つ点が異なる。 もう一方の極端な例としては、2つの単鎖抗体断片（scFv）がペプチド鎖で結合した二重特異性分子、いわゆるBs（scFv）2コンストラクトが挙げられる。 中間のサイズの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーで連結された2種類のF(ab)断片が含まれる。 これら及び他の形式の二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製することができる。
本開示の抗体またはその抗原結合部分は、治療薬と結合して、抗体薬物結合体（ADC）などの免疫結合体を形成することができる。 好適な治療薬には、抗炎症剤及び抗癌剤が含まれる。 ADCにおいて、抗体及び治療薬は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーのような切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。 より好ましくは、リンカーは、Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser又はGluなどのペプチド性リンカーである。 ADCは、米国特許明細書に記載されているように調製することができる。第7，087，600号；第6，989，452号；及び第7，129，261号；PCT公開WO 02/096910；WO 07/038，658；WO 07/051，081；WO 07/059，404；WO 08/083，312； 及びWO 08/103，693；米国特許公開20060024317；20060004081；及び20060247295；これらの開示は引用により本明細書に組み込まれるものとする。
腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染し、がん細胞を死滅させる。 本開示の抗体は、腫瘍性ウイルスと組み合わせて使用することができる。 または、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、人体に導入することができる。
また、抗TRＯP2 ScFvまたはＶＨＨフラグメントを含むキメラ抗原受容体（CAR）も本明細書で提供され、抗TRＯP2 ScFvまたはVHHは、本明細書に記載のCDR及び重鎖/軽鎖可変領域を含み得る。
抗TRＯP2 CARは、（a）抗TRＯP2 ScFvまたはVHHを含み得る細胞外抗原結合ドメイン；及び (b) 膜貫通ドメイン； (c) 細胞内シグナル伝達ドメイン。 CARは、細胞外抗原結合ドメインのN末端に、新生受容体を小胞体に誘導するシグナルペプチド、及び細胞外抗原結合ドメインのN末端に、受容体の結合をより可能にするヒンジペプチドを含んでもよい。 CA Rは、好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、一次細胞内シグナル伝達ドメインと1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインから構成される。 主に使用され、最も効果的な細胞内一次シグナル伝達ドメインは、ITAMを含むCD3-zeta細胞質ドメインであり、そのリン酸化によりT細胞の活性化がもたらされる。 共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、CD137及びOX40などの共刺激タンパク質に由来してもよい。 CARは、サイトカイン、及び共刺激リガンドなどの、T細胞の拡大、持続、及び抗腫瘍活性を増強する因子をさらに追加してもよい。
また、本明細書で提供されるCARを含んでいてもよい、操作された免疫エフェクター細胞も提供される。 特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、T細胞、NK細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。 特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、T細胞である。
別の態様では、本開示は、抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子、CAR－T細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体、あるいは核酸分子、発現ベクターを含み得る医薬組成物を提供する。 または、本開示の宿主細胞は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される。 抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子、CAR-T細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体、核酸分子、発現ベクターまたは宿主細胞は、組成物が2種類以上を含む場合、別々に投与することができる。 組成物は、必要に応じて、抗腫瘍薬などの1つまたは複数の追加の薬学的活性成分を含有してもよい。
医薬組成物は、任意の数の賦形剤から構成されてもよい。 使用できる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散又は懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、保存剤、等張剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。 適切な賦形剤の選択と使用は、Gennaro 編、Remington で教示されている： The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. （Lippincott Williams & Wilkins 2003）、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮の投与（例えば、注射又は注入による）に適している。 投与経路によっては、活性成分を酸及びそれを不活性化し得る他の自然条件の作用から保護するための材料でコーティングすることができる。 本明細書で使用する「非経口投与」という語は、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、関節内、被殻、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び骨膜内注射及び注入を含むが、これらに限定されない。 または、本開示の抗体は、非経口経路、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下又は局所的に投与することができる。
医薬組成物は、無菌水溶液又は分散液の形態とすることができる。 また、マイクロエマルジョンやリポソームなど、高薬物濃度に適した秩序ある構造で製剤化することができる。
単一の剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される被験者及び特定の投与様式によって異なり、一般に、治療効果をもたらす組成物の量となるであろう。 一般に、100％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の約0．01％から約99％の範囲である。
投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。 例えば、単一のボーラスを投与することができ、数回に分けて経時的に投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示されるように、投与量を比例的に減少又は増加させることができる。 投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。 本明細書で使用する投与単位形態とは、治療される対象への単位投与量として適した物理的に離散した単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性成分を含む。 または、抗体は徐放性製剤として投与することができ、この場合、より少ない頻度で投与することが必要となる。
組成物の投与について、投与量は、約0.0001～100mg/kgの範囲であってもよい。 例示的な治療体制は、1ヶ月に1回の投与を伴う。
抗TRＯP2抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子、CAR－T細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫複合体、核酸分子、発現ベクター、または宿主の「治療有効量」 本開示の細胞は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度及び期間の増加、または疾患罹患による機能障害もしくは障害の予防をもたらす。 例えば、担癌被験者の治療のために、「治療上有効量」は、好ましくは、未治療被験者に対して少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらに好ましくは少なくとも約60％、さらに好ましくは少なくとも約80％炎症を除去する。
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。 生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。 例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
治療用組成物は医療機器経由で投与可能です。例えば、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、および第４，５９６，５５６号）。(2) 微量注入ポンプ（米国特許米国特許第4,487,603号）; (3) 経皮デバイス（米国特許第4,486,194号）; （４）輸液装置（米国特許第4,447,233号及び第4,447,224号）。 (5) 浸透圧装置（米国特許第4,439,196号及び第4,475,196号）のような医療機器を介して投与することができる。これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示のモノクローナル抗体は、in vivoでの適切な分配を確実にするために製剤化することができる。 例えば、本開示の治療用抗体又はその抗原結合部分が血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を強化するために標的化部分を追加的に含み得るリポソーム中に製剤化することが可能である。 例えば、米国特許第米国特許第4，522，811号；5,374,548; 5,416,016; そして5,399,331。V. V. Ranade(1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob.Agents Chemother.39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol.1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol.Chem.269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273を参照されたい。
本開示の医薬組成物は、例えば、過剰なTRＯP2シグナル伝達による腫瘍の治療を含む、多くのインビトロ及びインビボでの有用性を有する。
TRＯP2が腫瘍細胞増殖に関連していることを考慮すると、本開示は、それを必要とする対象においてTRＯP2関連腫瘍または癌を治療するための方法を提供し、この方法は、対象に本開示の医薬組成物を投与することを含み得る。 腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍である場合があり、これには、乳がん、大腸がん、胃腺がん、食道がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣上皮がん、前立腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、膀胱腫瘍、子宮頸がん、子宮内膜がん、濾胞性甲状腺がん、及び多形性膠芽腫が含まれるが、これらに限定されない。 特定の実施形態では、少なくとも1つの追加の抗癌抗体をさらに投与することができる。 特定の実施形態では、被験者はヒトである。
別の態様では、本開示は、本開示の医薬組成物が、被験者における腫瘍の成長を阻害するのに有効な1つ又は複数の追加の抗体と共投与される、併用療法の方法を提供する。 一実施形態では、本開示は、本開示の医薬組成物と、抗OX40抗体、抗TIM-3抗体、抗CD137抗体、抗GITR抗体、抗LAG-3抗体、抗PD-L1抗体、及び抗PD-1抗体などの1以上の追加の抗体を対象に投与することを含むことができる、被検者における腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。 特定の実施形態では、被験者はヒトである。 また、TROP2経路遮断は、さらに標準的ながん治療と組み合わせ得る。
さらに別の態様では、本開示は、診断方法、組成物及びキットを提供する。 一実施形態では、本開示の抗体または抗原結合部分は、組織におけるTRＯP2の存在及び発現を決定するために使用される。 一実施形態では、診断は、予後を示し、及び/又は、治療及び/又は経過観察を指示する。 たとえば、TROP2 シグナル伝達は腫瘍の治療の標的にすることができる。 一実施形態では、本開示の抗体または抗原結合部分は、TRＯP2関連腫瘍または癌の予後及び適切な治療及び追跡を決定するための診断キットまたは方法に使用される。
本明細書で議論される治療薬の組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時投与することができ、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤を有する別々の組成物として同時投与することができる。 別の実施形態では、治療薬の組み合わせは、順次投与することができる。
さらに、併用療法の複数の用量を順次投与する場合、順次投与の順序は、投与の各時点で回復させることも、同じ順序に保つこともでき、順次投与は同時投与と組み合わせることもでき、又はそれらの任意の組み合わせも可能である。
本開示はさらに、それを必要とする対象におけるTROP2陽性組織、例えば、がん組織の画像化のための方法であって、放射性標識された抗TROP2抗体又はその抗原結合部分、免疫複合体、又は本開示の二重特異性分子を、対象に投与することを含む方法を提供する。 この方法は、食道扁平上皮がん、大腸がん、膵臓がん、結腸がん、甲状腺乳頭がん、乳がん、膀胱がんなどを含むが、これらに限定されない、TROP2の発現が高い腫瘍またはがんの分布を追跡/検出するために使用される。 特定の実施形態では、被験者はヒトである。
本発明及びその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書において様々な変更、置換及び改変を行うことができることが理解されるべきである。
本開示は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはさらに限定的に解釈されるべきではない。 すべての図の内容、及び本出願を通じて引用されたすべての文献、Genbank配列、特許及び公開特許出願は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例
実施例1 マウス抗TRＯP2モノクローナル抗体の作製
予防接種
E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998に記載されている方法に従ってマウスを免疫化しました。免疫原として、C末端にヒトIgG1 Fcを有する自社製組換えヒトTROP2タンパク質（配列番号：66に記載のアミノ酸配列）を免疫原として使用し、ヒトTRＯP2-hisタンパク質（配列番号67に記載のアミノ酸配列）を自社で作製した。は、抗血清力価の決定及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングに使用された。
免疫用量には、一次免疫及び追加免疫の両方において、マウス1匹当たり、注射当たり20μgのヒトTROP2-Fcタンパク質が含まれた。 免疫応答を高めるために、完全フロイトアジュバント及び不完全フロイトアジュバント（Sigma, St. Louis, Mo., USA）をそれぞれ初回免疫及び追加免疫に使用した。 簡単に言うと、アジュバントと抗原の混合物を以下のように調製した。 まず、アジュバントをバイアル内でボルテックスを使用して穏やかに混合し、所望の量のアジュバントをオートクレーブした 1.5 mL 微量遠心管に移した。 抗原を PBS または生理食塩水中で 0.2 ～ 0.27 mg/ml の範囲の濃度で調製し、計算された量の抗原をアジュバントとともに微量遠心分離管に加えた。 得られた混合物を2分間穏やかにボルテックスすることによって混合し、油中水型エマルションを生成した。 次いで、アジュバント抗原エマルジョンを、動物注射用の適切な注射器に引き込んだ。 合計 20 μg の抗原を 150 ～ 200 μl の量で注入した。 各動物を免疫化し、その後、抗血清力価に応じて 4 ～ 5 回追加免疫した。 良好な力価を有する動物には、融合前に腹腔内注射により最後の追加免疫を与えた。
ハイブリドーマの融合とスクリーニング
マウス骨髄腫細胞株（SP2/0-Ag14、ATCC#CRL-1581）の細胞を、融合直前に対数期段階に達するように培養した。 免疫マウスからの脾臓細胞を無菌的に調製し、Kohler G and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497 (1975)に記載されている方法に従って骨髄腫細胞と融合させた。融合した「ハイブリッド細胞」は、その後、DMEM/20% FCS/HAT培地中の96ウェルプレートに分注された。 融合後7日から10日目に生存しているハイブリドーマコロニーを顕微鏡で観察した。 2週間後、各ウェルからの上清を、ヒトTRＯP2－hisタンパク質（配列番号67を用いて社内で調製）を使用するキャプチャELＩSAに提供した。 ヒトTROP2タンパク質に結合する抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、24ウェルプレートに移した。 これらのハイブリドーマクローンを、カニクイザルのTROP2結合活性についてさらに試験した。 高い特異的なヒト TROP2 結合活性とカニクイザル Trop2 結合活性を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを限界希釈法でサブクローニングして細胞株のクローン性を確認し、モノクローナル抗体を精製した。 簡単に説明すると、プロテイン A セファロースカラム (bestchrom (Shanghai) Biosciences 製、Ｃａｔ＃AA0273) を、5 ～ 10 カラム容量の PBS 緩衝液を使用して洗浄した。 ハイブリドーマモノクローンの細胞上清をカラムに通し、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまでPBS緩衝液を使用してカラムを洗浄した。 カラムを溶出緩衝液（0.1M Glycine-HCl, pH 2.7）で溶出し、直ちに中和緩衝液（1M Tris-HCl, pH 9.0）で1.5mlチューブに採取した。 免疫グロブリンを含む画分をプールし、PBS中で4℃、一晩透析した。
実施例2：BIACORE表面プラズモン共鳴を使用したマウス抗TROP2モノクローナル抗体の結合親和性の決定
実施例1で生成した精製抗TRＯP2マウスモノクローナル抗体（mAb）を、BiacoreT200システム（GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA）によって結合親和性及び結合速度論について特性評価した。
簡単に説明すると、ヤギ抗マウス IgG 抗体(GE healthcare, Ｃａｔ＃BR100838、マウス抗体キャプチャ キット)は、Biacore が提供する標準アミンカップリングキット(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)、またはベンチマーク(社内で調製されたサシツズマブ、 本明細書ではBMまたはBM1とも呼ばれ、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号68及び69に示される）。の親和性測定用プロテイン G チップ(GE healthcare,Cat#29-1793-15)を使用して、一級アミンを介して CM5 チップ(GE healthcare, Cat#BR100530 のカルボキシ メチル デキストラン コーティングされたチップ)に共有結合した。 チップ（バイオセンサー）表面の未反応部位は、エタノールアミンでブロッグした。実施例1及びベンチマークで生成した抗TRＯP2抗体を2μg/ml の濃度でそれぞれ10μL/minの流速でチップ上に流した。 次に、段階希釈したヒト TROP2-his タンパク質 (配列番号 67 で社内で調製)、またはカニクイザル TROP2-his タンパク質 (配列番号 70 で社内で調製) を HBS-EP+ バッファーで 2 倍希釈する (Biacore 提供) を160 nM から開始し、流速 30 μL/min でチップ上に流した。 抗原抗体結合動態は2分間、解離動態は10分間追跡した。 会合及び解離曲線は、BIAcore評価ソフトウェアを用いて、1:1のLangmuir結合モデルに適合させた。 ＫD、ＫA及びＫD値を決定し、以下の表2にまとめた。
表2.マウス抗TROP2抗体の結合親和性
本開示のすべてのマウス抗体は、ベンチマークと比較して同等以上の結合親和性でヒトTRＯP2及びカニクイザルTRＯP2に特異的に結合した。 マウス抗体 A1E4F7D4、A1E11A12D1 及び C1B3B12D2 は、ヒト TROP2 及びカニクイザル TROP2 に対して最も高い結合親和性を示した。
実施例3 マウス抗TRＯP2モノクローナル抗体の結合活性
本開示のマウス抗TRＯP2抗体のTRＯP2に対する結合活性は、捕捉ELＩSA、間接ELＩSA及びフローサイトメトリー（FACS）によって決定された。
Capture ELISA
簡単に説明すると、96ウェルプレートを、PBS中の2μg/ml AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG、Fcγフラグメント特異的(Jackson Immuno Research、Cat#115-005-071) 100μlで4℃で一晩コーティングした。 プレートを洗浄緩衝液（PBS+0.05%v/vTween-20、PBST）で1回洗浄し、その後200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（PBST中の5%w/v無脂肪乳）で37℃で2時間ブロックした。 プレートを4回洗浄し、それぞれ、100μLの段階希釈した本開示の抗TRＯP2抗体、ベンチマーク、または陰性対照としてのHＩGG（静脈内注射用ヒト免疫グロブリン（PH4）、Hualan Biological Engineering Inc.）(2.5% w/v の無脂肪乳を含む PBST で 5 倍希釈、66.7 nM から開始)とともにインキュベートし、その後再度 4 回洗浄した。 捕獲した抗TROP 2抗体を含むプレートをビオチン標識ヒトTROP 2-hisタンパク質 (自社製、配列番号：67、PBST中の2.5%w/v非脂肪乳中56.7ng/mL、100μl/ウェル) と37℃で40分間インキュベートした。67、PBST 中の 2.5% w/v 無脂肪乳中 56.7 ng/mL、100 μl/ウェル) を 37℃ で 40 分間、4 回洗浄し、ストレプトアビジン結合 HRP(PBST で 1:10000 希釈、Jackson Immuno Research、Cat#016-030-084、100 μl/ウェル)と37℃で40分間インキュベートした。 最終洗浄後、プレートを100μl/ウェルのELISA基質TMB (Innoreagents, Cat#TMB-S-002) と共に室温でインキュベートした。 50μl/ウェルの1M H2SO4を用いて室温で3～10分で反応を停止し、TMBについては450nm、参照波長として630nmの二重波長モードを使用して各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。 OD (450-630) 値を抗体濃度に対してプロットした。 データは Graphpad Prism ソフトウェアを使用して解析し、EC50値を報告した。 結果を図1Aおよび図1Bに示した。
Indirect ELISA
本開示の抗TRＯP2抗体を、カニクイザルのTRＯP2タンパク質との交差反応について試験した。 簡単に説明すると、96ウェルマイクロプレートを、炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（PH9．6）中の100μL の2μG/ML カニクイザルTRＯP2-HｉSタンパク質（配列番号70で社内調製）で4℃で一晩コーティングした。 ELISAプレートを洗浄緩衝液(PBS+0.05% v/v Tween-20、PBST)で1回洗浄し、その後200μl/ウェルのブロッキング緩衝液(PBST中5% w/v無脂肪乳)で37℃で2時間ブロックした。 プレートを4回洗浄し、100μL /ウェルの段階希釈した本開示または対照の抗TRＯP2抗体（66．7nMで開始、PB ST中の2．5％W/V無脂肪乳で5倍段階希釈）とともに37℃で40分間インキュベートした。 ELISA プレートを再度 4 回洗浄し、ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗マウス IgG、Fcγ フラグメント特異的 (PBST 緩衝液で 1:5000 希釈、Jackson Immunoresearch、Cat#115-035-071、100 μl/ウェル) とともに37℃で40 分間インキュベートした。 最終洗浄後、プレートを 100 μl/ウェルの TMB (Innoreagents) とともに室温でインキュベートした。 3～10分後、室温で50μl/ウェルの1M H2SO4を用いて反応を停止し、TMBについては450nm、参照波長として630nmの二重波長モードを使用して各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。 OD (450-630) 値を抗体濃度に対してプロットした。 データは Graphpad Prism ソフトウェアを使用して解析し、EC50値を報告した。 結果を図2Aおよび図2Bに示した。
細胞ベースの結合FACS
細胞表面 TROP2 タンパク質に対するマウス抗 TROP2 抗体の結合活性は、細胞膜上に完全長ヒト TROP2 (uniprot#P09758、配列番号:71)を安定して発現する Biosion 社内で調製された 293F-TROP2 細胞 (クローン ID#3A8) を使用して、フローサイトメトリー (FACS) によってテストされた。 293F-TROP2 細胞は、リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬 (Thermo Fisher) の指示に従って、EcoRI 部位と XbaI 部位の間にヒト TROP2 コード配列が挿入された pCMV-T-P プラスミドを 293F 細胞 (Thermofisher Inc.、カタログ番号 11625019) にトランスフェクトすることによって調製した。
293F-TROP2細胞を細胞培養フラスコから採取し、2回洗浄し、2％v/vウシ胎児血清（FACS緩衝液）を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）に再懸濁した。 次に、ウェルあたり 2 x 105 個の 293F-TROP2 細胞を、さまざまな濃度 (66.7 nM から開始、FACS バッファーで 4 倍段階希釈) の抗 TROP2 抗体またはコントロール 100 μl とともに 96 ウェルプレートでアイスで 40 分間インキュベートした。 細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、100μL/ウェルのR-フィコエリトリン AffiniPure F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG (H+L)(FACS バッファーで 1:1000 希釈、Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.、Cat#115-116-146)を添加した。 暗所4℃で40分インキュベートした後、細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁させた。 Becton Dickinson FACS Canto II-HTS装置を使用して蛍光を測定し、MFI（平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。 データは Graphpad Prism ソフトウェアを使用して解析し、EC50値を報告した。 結果を図3Aおよび図3Bに示した。
図1Aおよび図1B から、本開示のすべてのマウス抗TRＯP2抗体がヒトTRＯP2に特異的に結合することがわかる。 抗体 A1E4F7D4、A1E11A12D1、B1G1F5A3 及び C1B3B12D2 はベンチマークよりも低い EC50 を示し、ヒト TROP2 タンパク質により効率的に結合することを示唆し、抗体 A1B12D2B4E7B3 はベンチマークよりも高い Bmax を示した。 図3Aおよび図3B は、マウス抗TRＯP2抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1、A1H3C5H8E12は、FACS試験におけるベンチマークよりも有意に高い結合能力を示した。
図2Aおよび図2B によれば、本開示のすべての抗体はサルTRＯP2に特異的に結合し、B 1G1Ｆ5A3及びC1B3B12D2は、ベンチマークよりも高い結合活性でサルTRＯP2タンパク質に結合した。
実施例4 エピトープビニング
マウス抗 TROP2 抗体は、競合 ELISA アッセイでエピトープ結合についてテストされた。 簡単に説明すると、PBS 中の 1 μg/mL のベンチマーク、2 μg/mL のマウス抗体 A1E4F7D4、2 μg/mL のマウス抗体 A1E11A12D1、及び 2 μg/mL のマウス抗体 A1H3C5H8E12 100 μl を、それぞれ 96 ウェルマイクロプレートに37℃で2時間ほどコーティングした。 ELISAプレートを洗浄緩衝液(PBS+0.05% v/vＴｗｅｅｎ-20、PBST)で一度洗浄した後、200μlのブロッキング緩衝液 (PBST中の5% w/vの無脂肪乳) で37℃で2時間ブロッグした。 ブロッキング中に、抗TRＯP2抗体または対照をビオチン標識ヒトTRＯP2-HｉSタンパク質（配列番号67、PB ST中の2．5％w/v無脂肪乳中34ng/ml）で希釈した。80nMから開始して、 5倍段階希釈し、室温で40分間インキュベートした。 プレートを4回洗浄した後、抗体/TRＯP2－hisタンパク質混合物を、抗体でコーティングされたプレートに、ウェル当たり100μL 加えた。 37℃で40分間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液を使用して再度4回洗浄した。 次にプレートを加え、100μlのPeroxidase Streptavidin（PBST緩衝液で1：10000希釈、Jackson Immunoresearch、Cat#016-030-084）と37℃で40分間インキュベートした。 プレートを洗浄緩衝液で再度洗浄した。 最後にTMBを添加し、1M H2SO4で反応を停止させた。 各ウェルの吸光度を、TMBは450 nm、参照波長として630 nmの2波長モードを使用してマイクロプレートリーダーで読み取り、OD（450-630）値を抗体濃度に対してプロットした。 データは Graphpad Prism ソフトウェアを使用して解析し、IC50値を報告した。 ベンチマーク－TRＯP2結合をブロックする抗体の能力を図4A、図４Ｂおよび図4Cに示し、A1E4Ｆ7D4、A1E11A12D1及びA1H3C5H8E12とのTRＯP2結合をブロックする抗体の能力をそれぞれ図5、図６および図7に示した。
図4A、図４Ｂおよび図4Cから、抗TRＯP2抗体A1Ｆ1G12A7、A1B 12D2B 4E7B 3及びB 1G1Ｆ5A3がB M-ヒトTRＯP2結合をブロックできたことがわかり、それらが結合するエピトープとベンチマークによって結合されるエピトープが重複する可能性があることが示唆される。 A1E4F7D4、A1E11A12D1、A1H3C5H8E12、C1B3B12D2を含む残りのマウス抗TROP2抗体は、ヒトTROP2へのベンチマーク結合をブロックしなかったことから、ベンチマークと比較して異なるエピトープに結合する可能性があることが示唆された。
図5、図６および図7に示すように、A1E4Ｆ7D4、A1E11A12D1、及びA1H3C5H8E12が結合するエピトープは重複し、A1E4Ｆ7D4及びA1E11A12D1が結合するエピトープは、A1H3C5H8E12が結合するエピトープよりも多くのアミノ酸残基にわたっていた。
実施例5：抗TRＯP2抗体の細胞ベースの内在化アッセイ
細胞ベースの内在化アッセイでは、Biosion 社内で調製した 293F-TROP2 細胞 (クローン ID#3A8) を使用して、抗 TROP2 抗体の内在化率を正確に評価した。 まず、配列番号72に示されるアミノ酸配列を使用して、DTTP－1170と呼ばれる組換えタンパク質を合成した。 次に、10% v/v FBS (Gibco、Cat#10099-141) を補充した 100 μL FreeStyle293 培地 (Gibco、Cat#12338-018) 中の 5 x 103 個の 293F-TROP2 細胞を 96 ウェル平底プレート(Thermo Fisher Scientific Inc., Cat#167008)に播いた。 細胞播種の翌日、本発明のマウス抗TRＯP2抗体または対照（10％ v/v ＦB Sを含むＦreeStyle293培地中1．6μg/ml ）を、ＦB Sを含むＦreeStyle293培地中1．6μg/ml のDTTP1170タンパク質と混合した。 10% v/v FBS、1:1 体積比、室温で 30 分間インキュベートした。それは、次いで細胞培養培地中で段階希釈し、0．8μg/ml から開始して3倍段階希釈した。 次に、連続希釈した抗体/DTTP1170混合液100μlを細胞プレートに添加し、37℃のCO2インキュベーター内で72時間インキュベートした。 プレートにCell Titer Glo試薬（Vazyme Biotech Co., Ltd, Cat#DD1101-02）を加え、室温で3～5分インキュベートした。 その後、細胞培養プレートをTecan infinite 200Pro plate-readerで分析した。 データはGraphpad prismソフトウェアを用いて解析し、IC50値は、細胞生存率に対する最大阻害の50％を達成した抗体濃度として報告された。
mAb-DTTP複合体が標的細胞に内在化した場合、標的細胞の生存率は著しく低下した。 結合体が内在化しない場合、培地中の遊離DTTP1170は殺細胞活性を持たないか、ほとんど持たない。 その結果を図8に示された通りです。それは、A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7、A1H3C5H8E12、B1G1F5A3、及びC1B3B12D2を含む、本開示のすべてのマウス抗体のDTTP1170コンジュゲートが比較的高い速度で内部移行されることを示した。
実施例6 キメラ抗体の生成及び特性評価
抗TROP2マウスmAbの配列を決定し、重鎖及び軽鎖可変領域の配列ID番号を表1にまとめた。
抗TRＯP2マウスMab A1E4Ｆ7D4、A1Ｆ1G12A7及びC1B3B12D2の重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトＩgG1重鎖（配列番号64、X1＝Ｋ、X2＝D、X3＝L ）にインフレームでクローニングした、及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号65）であり、可変領域のC末端はそれぞれの定常領域のN末端に連結されていた。
ヒトIgG1重鎖定常領域に結合した重鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクターと、ヒトκ軽鎖定常領域に結合した軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクターを1 mg/mL PEI を含む 1.1:1 の軽鎖構築物と重鎖構築物の比率での 293F 浮遊細胞培養50mlに一過的にトランスフェクトした。
振盪フラスコ中で6日後に細胞上清を回収し、遠心して細胞ペレットにし、次いで上記のように細胞上清からキメラ抗体を精製した。 精製した抗体を、前述の実施例のプロトコールに従って、軽微な変更を加えたまたは含まず、ならびに記載されたプロトコールに従い、捕捉ELISA、間接ELISA、細胞ベースの結合FACS、BIAcore親和性試験、エピトープビニング、及び細胞ベースの内在化アッセイで試験した。
BIAcore では、ヤギ抗ヒト IgG (GE heathcare、Cat#BR100839、ヒト抗体捕捉キット) をヤギ抗マウス IgG の代わりに CM5 チップに共有結合させ、タンパク質 Gチップの代わりに CM5 チップをベンチマークに使用しました。 その結果を表 3 に示した。
捕捉 ELISA では、AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG、Fcγ フラグメント特異的、100 μl/ウェルの代わりに、AffiniPure Goat Anti-Human IgG、Fcγ フラグメント特異的 (Jackson Immuno Research、Cat#109-005-098) を使用した。 結果を図9Aおよび図9Bに示した。
間接 ELISA では、ペルオキシダーゼ AffiniPure F(ab')2 フラグメント ヤギ抗ヒト IgG、Fcγ フラグメント特異的 (Jackson Immunoresearch、Cat#109-036-098) を、ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗マウス IgG、Fcγ フラグメント特異的100μl/ウェルの代わりに使用しました。結果を図10Aおよび図10Bに示した。
細胞ベースの結合 FACS では、R-フィコエリトリン アフィニピュア F(ab') 2 フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H+L)の代わりに、R-フィコエリトリン アフィニピュア ヤギ抗ヒト IgG、Fcγ フラグメント特異的、Jackson Immunoresearch、Cat#109-115-098）を使用した（100 μl/ウェル）。結果を図11Aおよび図11Bに示した
細胞ベースの内部移行アッセイでは、受容体結合ドメインを欠くジフテリア毒素（DT）と、連鎖球菌プロテインG（3C）のC1、C2、及びC3ドメインからなる、配列番号73のアミノ酸配列を有するDT3Cと呼ばれる組換えタンパク質を使用して、DTTP1170 の代わりに抗体を結合させる。 また、自社製の抗 CD22 抗体をネガティブコントロールとして使用した。 細胞播種の翌日には、10％ v/v ＦB Sを含むＦreeStyle293培地中40μg/ml の本開示のキメラ抗TRＯP2抗体または対照を、10％ v/v ＦB Sを含むＦreeStyle293培地中40μg/ml のDT3Cタンパク質と1℃で混合した。 1:1体積比、室温で30分間インキュベートした。次いで、これらを細胞培養培地中で連続希釈し、20μg/ml から開始して3倍段階希釈した。 次に、連続希釈した抗体/DT3C混合液100μlを細胞プレートに添加し、37℃のCO2インキュベーター内で72時間インキュベートした。 その結果を図12に示した。
表3.ヒト TROP2 及びカニクイザル TROP2 に対するキメラ抗 TROP2 抗体の結合親和性
図9Aおよび図9B 及び図11Aおよび図11B から、キメラA1E4Ｆ7D4及びC1B3B12D2抗体は、捕捉ELＩSA及び/または細胞ベースの結合ＦACS試験においてベンチマークよりも高い結合能力を示したが、キメラA1Ｆ1G12A7抗体は捕捉ELISA及び細胞ベースの結合FACSテストのベンチマークよりもわずかに低い結合能力を有していたことが分かる。 。
図10Aおよび図10B に示すように、キメラA1E4Ｆ7D4、A1Ｆ1G12A7及びC1B3B12D2抗体は、ベンチマークと同等の結合活性でサルTRＯP2タンパク質に特異的に結合した。
図12は、キメラA1E4Ｆ7D4抗体及びキメラC1B3B12D2抗体のDT3Cコンジュゲートが、現在臨床で使用されているベンチマークDT3Cコンジュゲートと比較して同等またはより高い速度で内部移行されたことを示した。特に、キメラA1E4F7D4-DT3Cコンジュゲートは標的細胞により効率的に取り込まれ、より効果的な方法で標的細胞死を引き起こします。 一方、キメラ A1F1G12A7-DT3C コンジュゲートの内在化率は、ベンチマーク DT3C コンジュゲートよりもはるかに低かった。
表3にまとめたように、BIAcore テストでテストしたキメラ抗体 A1E4F7D4 及び C1B3B12D2 の結合親和性は、ベンチマークの結合親和性よりも高かった。
実施例7 抗TRＯP2抗体A1E4Ｆ7D4のヒト化
マウス抗 TROP2 抗体 A1E4F7D4 をヒト化してさらに特徴付けました。 抗体のヒト化は、以下で詳細に説明するように、十分に確立されたCDR移植法を使用して実施した。
簡単に言うと、マウスまたはキメラ抗体 A1E4F7D4 の軽鎖及び重鎖の可変領域配列をヒト免疫グロブリン遺伝子データベースと照合した。 最も高い相同性を有するヒト生殖系列が選択され、これらの生殖系列からのフレームワークを使用して、抗体 A1E4F7D4 のフレームワークが置き換えられた。 特に、A1E4F7D4 の CDR を選択したフレームワークに挿入し、フレームワーク内の残基をさらに復帰突然変異させて、より多くの候補重鎖/軽鎖可変領域を取得した。 合計21個の例示的なヒト化A1E4Ｆ7D4抗体、すなわちHｕA1E4Ｆ7D4-V1～HｕA1E4Ｆ7D4-V21が得られ、その重鎖/軽鎖可変領域の配列ＩD番号は表1に示されている。
ヒトＩgG1重鎖定常領域に連結されたHｕA1E4Ｆ7D4－V1～HｕA1E4Ｆ7D4－V21のいずれかの重鎖可変領域をコードするヌクレオチドを含むベクター（配列番号64、X1＝Ｋ、X2＝D、X3＝L）、及びヒトカッパ軽鎖定常領域に連結されたヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド（配列番号65）をそれぞれ含むベクターを、1 mg/mL PEI を含む重鎖構築物に50ml の293Ｆ懸濁細胞培養物を1．1：1の軽鎖から重鎖まで一時的にトランスフェクトした。
実施例8：例示的なヒト化抗体の特徴付け
ヒト化抗体 huA1E4F7D4-V1 ～ huA1E4F7D4-V21 を含む細胞上清を振盪フラスコ中で 6 日後に回収し、前述の軽微な変更の実施例のプロトコールに従って Biacore T200 システム (GE heathcare、Pittsburgh、PA、USA) によってヒト TROP2 への結合親和性について試験した。
ヤギ抗マウス IgG (GE heathcare、Cat#BR100839、ヒト抗体捕捉キット) をヤギ抗マウス IgG の代わりに CM5 チップに共有結合させた。ヒト化抗体 huA1E4F7D4-V1 ～ huA1E4F7D4-V21 を含む細胞上清を、精製抗体の代わりに使用した。 段階希釈したヒトTROP2-hisタンパク質の代わりに、濃度40nMのヒトTROP2-hisタンパク質を使用した。 Ka、Kd、及び KD 値を決定し、表 4 にまとめた。
データは、試験したヒト化抗体が高いヒトTROP2結合親和性を有することを示した。
前述の実施例のプロトコルに若干の変更を加えたもの、及び以下に記載するプロトコルに従って、ヒト化抗体 huA1E4F7D4-V16 を上記のように精製し、Biacore、Capture ELISA、間接 ELISA、細胞ベース結合 FACS、競合 ELISA、細胞ベース機能アッセイ、及びタンパク質サーマルシフトアッセイで試験した。
BIAcore では、ヤギ抗ヒト IgG (GE heathcare、Cat#BR100839、ヒト抗体捕捉キット) をヤギ抗マウス IgG の代わりに CM5 チップに共有結合させ、タンパク質 Gチップの代わりに CM5 チップをベンチマークに使用しました。 その結果を表 6 に示した。
Capture ELISA では、AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG、Fcγ フラグメント特異的、100 μl/ウェルの代わりに、AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG、Fcγ フラグメント特異的 (Jackson Immunoresearch、Cat#109-006-008) を使用した。 その結果を図13に示した。
間接 ELISA では、ペルオキシダーゼ AffiniPure F(ab') 2 フラグメント ヤギ抗ヒト IgG、Fcγ フラグメント特異的 (Jackson Immunoresearch、Cat#109-036-098) を、ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗マウス IgG、Fcγ フラグメント特異的100μl/ウェルの代わりに使用した。 その結果を図14に示した。
表4.ヒト化 A1E4F7D4 mAb の結合親和性
細胞ベースの結合 FACS では、R-フィコエリトリン アフィニピュア F(ab') 2 フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H+L)の代わりに、R-フィコエリトリン アフィニピュア ヤギ抗ヒト IgG、Fcγ フラグメント特異的、Jackson Immunoresearch、Cat#109-115-098）を使用した（100 μl/ウェル）。 その結果を図15に示した。
細胞ベースの内在化アッセイでは、配列番号73のアミノ酸配列を有するDT3Cタンパク質を使用して抗体を結合させた。 細胞播種の翌日、本発明の抗TRＯP2抗体または対照（10％ v/v ＦB Sを含むＦreeStyle293培地中4．44μg/ml ）を、10％ v/v ＦB Sを含むＦreeStyle293培地中4．44μg/ml のDT3Cタンパク質と混合した。10 ％v/v FBSを1：1の体積比で添加し、室温で30分間インキュベートし、次いでこれを細胞培養培地中で段階希釈し、2.22μg/mLから開始して3倍段階希釈した。 次に、連続希釈した抗体/DT3C混合液100μlを細胞プレートに添加し、37℃のCO2インキュベーター内で72時間インキュベートした。 その結果を図17に示した。
サーマルシフトアッセイでは、GloMeltTM （登録商標）サーマルシフトタンパク質安定性キット (Biotium、カタログ番号 33022-T) を使用して、タンパク質サーマルシフトアッセイを使用して Tm (融解温度) を決定した。 簡単に説明すると、GloMeltTM 染料を解凍し、室温に戻した。 色素の入ったバイアルをボルテックスし、遠心分離した。 次に、95μL PBSに200倍希釈した染料を5μL加え、10倍希釈した染料を調製した。 10倍希釈した2μL と10μgヒト化抗体を加え、PBSを加えて総反応量を20 μLにした。 色素と抗体の入ったチューブを軽く回転させ、表5のパラメータでメルトカーブプログラムを設定したリアルタイムPCRサーモサイクラー（Roche, LightCycler 480 II）にセットした。 その結果を図18に示した。
表5. メルトカーブプログラムのパラメータ
ベンチマーク－ヒトTRＯP2結合に対するhｕA1E4Ｆ7D4－V16の遮断活性の結果を図16のように示した。
表6.ヒト化 mAb の結合親和性
表6によれば、抗体hｕA1E4Ｆ7D4－V16は、キメラA1E4Ｆ7D4抗体と比較して、ヒト及びサルのTRＯP2タンパク質に対して同等の結合親和性を示し、ベンチマークのものよりも高かった。
図13及び15から、ヒト化抗体hｕA1E4Ｆ7D4-V16は、ベンチマークよりも低いEC50でヒトTRＯP2に特異的に結合し、ヒトTRＯP2タンパク質により効率的に結合することが示唆された。 図14に示すように、hｕA1E4Ｆ7D4-V16は、ベンチマークと比較して匹敵する活性でサルTRＯP2に結合した。
図16に示されるように、ヒト化抗体hｕA1E4Ｆ7D4-V16は、ヒトTRＯP2へのベンチマーク（TRＯP2 BM1）の結合をブロックしなかった。このことは、この抗体がベンチマーク（TRＯP2 BM1）と比較して異なるエピトープに結合する可能性があることを示唆している。
図17は、hｕA1E4Ｆ7D4-V16-DT3Cコンジュゲートがベンチマーク-DT3Cコンジュゲートよりも高い速度で内部移行されることを示した。これは、hｕA1E4Ｆ7D4-V16-DT3Cコンジュゲートが標的細胞によってより効率的に内部移行され、より効果的な方法で標的細胞死を引き起こすことを意味する。
さらに、図18に示すように、hｕA1E4Ｆ7D4-V16の融解温度は71．5℃と87．5℃であった。
実施例9：ヒト化抗体huA1E4F7D4-V16の特性評価
軽微な変更を加えてまたは加えずに、前述の実施例のプロトコル、及び以下に説明するプロトコルに従い、ダトポタマブの類似体（第一三共の抗trop2 mAb、Dato-DXd、DS-1062a）と比較して、それぞれ配列番号76及び77の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を用いて社内で作製されたBM2とも呼ばれる ヒト化抗体 huA1E4F7D4-V16 は、Biacore、細胞ベースの結合 FACS、細胞ベースの内部移行アッセイ、及びエピトープ グループ化 ELISA でテストされた。
BIAcore の結果を表 7に示します。
細胞ベースの結合FACSについては、結果を図19に示した。
細胞ベースの内在化アッセイでは、配列番号73のアミノ酸配列を有するDT3Cタンパク質を使用して抗体を結合させた。 細胞播種の翌日には、huA1E4F7D4-V16 またはコントロール、10% v/v FBS を含む FreeStyle293 培地中 4.44 μg/mL を、10% v/v FBS を含む FreeStyle293 培地中 4.44 μg/mL の DT3C タンパク質と 1:1 の体積比で混合し、室温で30分間インキュベートした。次いで、これらを細胞培養培地中で連続希釈し、2．22μg/ml から開始して3倍連続希釈した。 次に、連続希釈した抗体/DT3C混合液100μlを細胞プレートに添加し、37℃のCO2インキュベーター内で72時間インキュベートした。 その結果を図20に示した。
表7.huA1E4F7D4-V16の結合親和性
結果は、huA1E4F7D4-V16がヒトTROP2に対して100倍以上高い親和性を有し、BM2よりも優れた細胞結合能力を有し、BM2と同等の内在化速度を有することを示した。
エピトープビニング
エピトープビニングELISAを実施して、huA1E4F7D4-V16が結合するエピトープとBM1またはBM2が結合するエピトープがある程度重複するかどうかを判定した。
まず、エピトープビニングテストに適したビオチン標識ヒト Trop2 タンパク質の濃度を決定するために、キャプチャ ELISA を実行した。 簡単に説明すると、96 ウェル プレートを、PBS 中の 2 μg/ml huA1E4F7D4-V16、BM1 または BM2 でそれぞれ 100 μl/ウェルでコーティングし、4℃ で一晩コーティングし、PBST 中の 5% 無脂肪乳で37℃で2 時間ブロックした。 プレートを4回洗浄し、2．5％無脂肪乳（1．3μg/ml から開始して5μg/ml ）を含むPBST中で段階希釈したビオチンヒトTRｏP2－hｉsタンパク質（配列番号67）100μL /ウェルを添加した。 数倍段階希釈）を行い、37℃で40分間インキュベートした。 次いで、プレートを4回洗浄し、100μL /ウェルのHRP－ストレプトアビジン（Jacｋsｏn Ｉmmｕnｏ Research、カタログ番号016－030－084）を添加した。 プレートを37℃でさらに40分間インキュベートした。 次いで、プレートを再度洗浄し、100μl/ウェルのTMBを加えてRTで15分間発色させ、続いて50μlの1M H2SO4でクエンチした。 450nmでのOD値を読み取った。 抗体が約 2.0 の OD450 値を与える濃度が、エピトープビニングテスト用に選択された。
上記で決定した適切な濃度を使用して、エピトープ グループ化 ELISA を実行した。 簡単に説明すると、PBS 中の 2 μg/mL の BM1、2 μg/mL の BM2、及び 2 μg/mL の huA1E4F7D4-V16 100 μl を、それぞれ 96 ウェルマイクロプレート上に 37℃で 2 時間コーティングした。 ELISAプレートを洗浄緩衝液(PBS+0.05% v/vトゥイーン-20、PBST)で一度洗浄した後、200μlのブロッキング緩衝液 (PBST中の5%w/vの無脂肪乳) で37℃で2時間ブロッグした。 ブロッキング中に、huA1E4F7D4-V16、BM1及びBM2をそれぞれヒトビオチン-ヒトTrop2タンパク質と混合し、混合物中のhuA1E4F7D4-V16、BM1及びBM2の最終濃度は15μg/mlであり、ヒトビオチン-ヒトTrop2タンパク質は タンパク質は上記で決定された最終濃度である。 混合物を室温で40分間インキュベートした。 プレートを4回洗浄した後、抗体/ビオチン-TROP2-hisタンパク質混合物を抗体コートプレートにウェル当たり100μl加え、37℃でさらに40分間インキュベートした。 次いで、100μl/ウェルのHRP-ストレプトアビジンを添加し、40分間インキュベートした。 次に、OD450 値を決定し、交差競合能力を計算しました (抗体 X の交差競合能力 (%) = (抗体 X の OD450 - ブランクの OD450) / (mAb なしの OD450 - ブランクの OD450) * 100%) 。
抗体の交差競合能力が 80% より高い場合、抗体は同じエピトープに結合するとみなされた。
結果を以下の表8に示す。 huA1E4F7D4-V16はヒトTROP2へのベンチマーク結合をブロックしなかったことがわかり、BM1及びBM2と比較して異なるエピトープに結合する可能性があることを示唆している。
表8.エピトープビニング結果
本開示は、1つ以上の実施形態に関連して上述されてきたが、本開示は、それらの実施形態に限定されるものではなく、本説明は、添付の請求項の精神及び範囲内に含まれ得る全ての代替物、修正物、及び同等物を網羅することを意図していることが理解されるべきである。 本明細書で引用された全ての参照文献は、さらにその全体が参照により組み込まれる。
本願における配列は、以下に要約される。
このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、その多くの明白な変形が可能であるので、上記の段落によって定義された発明は、上記の説明で示された特定の詳細に限定されるものではないことが理解されるものと思われる。
［項目１］
TROP2に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
（i）VH CDR1領域、VH CDR2領域及びVH CDR3領域を含む重鎖可変領域を含み、VH CDR1領域、VH CDR2領域及びVH CDR3領域が、以下に対して少なくとも85％,86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% または100% の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖のみの抗体又はその抗原結合部分：：(1) 配列番号:1、2及び3のそれぞれ；(2) 配列番号:7、8及び3のそれぞれ；(3) 配列番号:12、13及び14のそれぞれ；(4) 配列番号:18、19及び20のそれぞれ；(5) 配列番号:24、25及び26のそれぞれ；(6) 配列番号:30、31及び32のそれぞれ；（7）配列番号：35、36、37のそれぞれ； 及び/または
（ｉｉ）VL CDR1領域、VL CDR2領域及びVL CDR3領域を含む軽鎖可変領域を含み、VL CDR1領域、VL CDR2領域及びVL CDR3領域が、以下に対して少なくとも85％、86％,87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖のみの抗体又はその抗原結合部分： (1) 配列番号:4、5及び6のそれぞれ；(2) 配列番号:9、10及び11のそれぞれ；(3) 配列番号:15、16及び17のそれぞれ；(4) 配列番号:21、22及び23のそれぞれ；(5) 配列番号:27、28及び29のそれぞれ；(6) 配列番号:33、34及び29のそれぞれ；又は (7) 配列番号:38、39及び40のそれぞれ、
を備える、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
［項目２］
前記重鎖可変領域が、配列番号：44, 45, 46 (X1=S, X2=A; X1=T, X2=A; X1=S, X2=V), 47 (X1=R, X2=R; X1=A, X2=T), 51, 53, 55, 57, 59, または 61に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目３］
前記軽鎖可変領域が、配列番号：48, 49 (X1=D, X2=L, X3=V; X1=E, X2=V, X3=L), 50 (X1=Q, X2=S, X3=K; X1=G, X2=A, X3=K; X1=G, X2=S, X3=Y), 52, 54, 56, 58, 60または62に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目４］
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）配列番号44及び48のそれぞれ；（２）配列番号45及び 49 (X1=D, X2=L, X3=V) のそれぞれ；(3) 配列番号：46 (X1=S、X2=A) 及び 49 (X1=E、X2=V、X3=L) のそれぞれ； (4) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(5) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(6) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(7) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(8) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(9) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(10) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(11) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(12) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(13) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(14) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(15) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(16) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(17) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(18) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(19) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(20) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(21) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(22) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(23) 配列番号：51及び52のそれぞれ；(24) 配列番号：53及び54のそれぞれ；(24) 配列番号：55及び56のそれぞれ；(24) 配列番号：57及び58のそれぞれ；(27) 配列番号：59及び60のそれぞれ；または(28) 配列番号：61及び62のそれぞれ、
に対して少なくとも85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% または100%の同一性を含むアミノ酸配列を含む、項目３に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
［項目５］
前記重鎖可変領域に連結された、配列番号64（X1＝R、X2＝E、X3＝M；またはX1＝Ｋ、X2＝D、X3＝L）の前記アミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された配列番号65の前記アミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
［項目６］
IgG1、IgG2又はIgG4アイソタイプである、項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目７］
（a）ヒトTRＯP2に結合する；(b) サルの TROP2 に結合する；及び/または (c) TROP2+ 細胞によって内部移行される、項目１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
［項目８］
マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、項目１に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
［項目９］
治療薬に連結された、項目１～８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
［項目１０］
前記治療薬が細胞毒素である、項目９に記載の免疫複合体。
［項目１１］
前記治療薬が、配列番号72のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号73のアミノ酸配列を含むタンパク質である、項目９に記載の免疫複合体。
［項目１２］
項目１～８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子。
［項目１３］
項目１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
［項目１４］
項目１３に記載の発現ベクターを含む、またはそのゲノムに組み込まれた項目１２に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
［項目１５］
項目１から８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、項目９から１１のいずれか一項に記載の免疫複合体、項目１２に記載の核酸分子、項目１３に記載の発現ベクター、または項目１４に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［項目１６］
抗腫瘍剤をさらに含む、項目１５に記載の医薬組成物。
［項目１７］
過剰なTRＯP2シグナル伝達に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、項目１５に記載の医薬組成物の使用方法。
［項目１８］
疾患が癌である、項目１７に記載の医薬組成物の使用方法。
［項目１９］
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、胃腺癌、食道癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣上皮癌、前立腺癌、膵管腺癌、 頭頸部がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、膀胱新生物、子宮頸がん、子宮内膜がん、甲状腺濾胞がん、または多形神経膠芽腫からなる群から選択されるがんである、項目１８に記載の医薬組成物の使用方法。
［項目２０］
項目１から８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌画像化のための方法であって、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の一部は放射性標識されている、癌画像化のための方法。

Claims (20)

  1. TROP2に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
    （i）VH CDR1領域、VH CDR2領域及びVH CDR3領域を含む重鎖可変領域を含み、VH CDR1領域、VH CDR2領域及びVH CDR3領域が、以下に対して少なくとも85％,86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% または100% の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖のみの抗体又はその抗原結合部分：：(1) 配列番号:1、2及び3のそれぞれ；(2) 配列番号:7、8及び3のそれぞれ；(3) 配列番号:12、13及び14のそれぞれ；(4) 配列番号:18、19及び20のそれぞれ；(5) 配列番号:24、25及び26のそれぞれ；(6) 配列番号:30、31及び32のそれぞれ；（7）配列番号：35、36、37のそれぞれ； 及び/または
    （ｉｉ）VL CDR1領域、VL CDR2領域及びVL CDR3領域を含む軽鎖可変領域を含み、VL CDR1領域、VL CDR2領域及びVL CDR3領域が、以下に対して少なくとも85％、86％,87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖のみの抗体又はその抗原結合部分： (1) 配列番号:4、5及び6のそれぞれ；(2) 配列番号:9、10及び11のそれぞれ；(3) 配列番号:15、16及び17のそれぞれ；(4) 配列番号:21、22及び23のそれぞれ；(5) 配列番号:27、28及び29のそれぞれ；(6) 配列番号:33、34及び29のそれぞれ；又は (7) 配列番号:38、39及び40のそれぞれ、
    を備える、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  2. 前記重鎖可変領域が、配列番号：44, 45, 46 (X1=S, X2=A; X1=T, X2=A; X1=S, X2=V), 47 (X1=R, X2=R; X1=A, X2=T), 51, 53, 55, 57, 59, または 61に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
  3. 前記軽鎖可変領域が、配列番号：48, 49 (X1=D, X2=L, X3=V; X1=E, X2=V, X3=L), 50 (X1=Q, X2=S, X3=K; X1=G, X2=A, X3=K; X1=G, X2=S, X3=Y), 52, 54, 56, 58, 60または62に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
  4. 前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）配列番号44及び48のそれぞれ；（２）配列番号45及び 49 (X1=D, X2=L, X3=V) のそれぞれ；(3) 配列番号：46 (X1=S、X2=A) 及び 49 (X1=E、X2=V、X3=L) のそれぞれ； (4) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(5) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(6) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(7) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び49 (X1=E, X2=V, X3=L) のそれぞれ；(8) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(9) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(10) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(11) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(12) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び50 (X1=Q, X2=S, X3=K) のそれぞれ；(13) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(14) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(15) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(16) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(17) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び 50 (X1=G, X2=A, X3=K) のそれぞれ；(18) 配列番号：46 (X1=S, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(19) 配列番号：46 (X1=T, X2=A) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(20) 配列番号：46 (X1=S, X2=V) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(21) 配列番号：47 (X1=R, X2=R) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(22) 配列番号：47 (X1=A, X2=T) 及び50 (X1=G, X2=S, X3=Y) のそれぞれ；(23) 配列番号：51及び52のそれぞれ；(24) 配列番号：53及び54のそれぞれ；(24) 配列番号：55及び56のそれぞれ；(24) 配列番号：57及び58のそれぞれ；(27) 配列番号：59及び60のそれぞれ；または(28) 配列番号：61及び62のそれぞれ、
    に対して少なくとも85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% または100%の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  5. 前記重鎖可変領域に連結された、配列番号64（X1＝R、X2＝E、X3＝M；またはX1＝Ｋ、X2＝D、X3＝L）の前記アミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された配列番号65の前記アミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  6. IgG1、IgG2又はIgG4アイソタイプである、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
  7. （a）ヒトTRＯP2に結合する；(b) サルの TROP2 に結合する；及び/または (c) TROP2+ 細胞によって内部移行される、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  8. マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  9. 治療薬に連結された、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
  10. 前記治療薬が細胞毒素である、請求項９に記載の免疫複合体。
  11. 前記治療薬が、配列番号72のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号73のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項９に記載の免疫複合体。
  12. 請求項１～８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  14. 請求項１３に記載の発現ベクターを含む、またはそのゲノムに組み込まれた請求項１２に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  15. 請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、請求項９から１１のいずれか一項に記載の免疫複合体、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３に記載の発現ベクター、または請求項１４に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  16. 抗腫瘍剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 過剰なTRＯP2シグナル伝達に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項１５に記載の医薬組成物の使用方法。
  18. 疾患が癌である、請求項１７に記載の医薬組成物の使用方法。
  19. 前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、胃腺癌、食道癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣上皮癌、前立腺癌、膵管腺癌、 頭頸部がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、膀胱新生物、子宮頸がん、子宮内膜がん、甲状腺濾胞がん、または多形神経膠芽腫からなる群から選択されるがんである、請求項１８に記載の医薬組成物の使用方法。
  20. 請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌画像化のための方法であって、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の一部は放射性標識されている、癌画像化のための方法。
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