KR20230175298A - Trop2에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Trop2에 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

인간 TROP2에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현시키기 위한 방법도 제공된다. 본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자, 면역접합체, 키메라 항원 수용체, 종양용해 바이러스, 및 약학적 조성물, 뿐만 아니라 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 사용한 치료 방법을 추가로 제공한다.

Description

TROP2에 결합하는 항체 및 이의 용도
본 출원은 2021년 4월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제 63/178,741에 대한 우선권을 주장한다.
상기 출원, 이에 인용된 모든 문헌("출원에 인용된 문헌") 및 본원에 인용되거나 참조된 모든 문헌(본원에 인용된 모든 문헌 문서, 특허, 공개 특허 출원을 비제한적으로 포함함)("본원에 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은 본원에 언급된 임의의 생산물을 위한 또는 본원에 참조로 포함되는 임의의 문헌 내의 임의의 제조업체의 지침, 설명, 생산물 사양 및 생산물 시트와 함께 이에 의해 참조로 본원에 포함되고 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본 개시에서 언급된 임의의 젠뱅크(Genbank) 서열은 본 개시의 가장 빠른 유효한 출원일의 젠뱅크 서열을 참조로 포함한다.
발명의 분야
본 개시는 일반적으로 높은 친화성 및 작용성으로 인간 TROP2에 결합하는 단리된 단클론성 항체, 특히 마우스, 키메라 또는 인간화 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현시키기 위한 방법도 제공된다. 본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 이중특이적 분자, 면역접합체, 키메라 항원 수용체, 종양용해 바이러스, 및 약학적 조성물, 뿐만 아니라 이를 사용한 치료 방법을 추가로 제공한다.
TROP2는 상피 당단백질-1(EGP-1), 막 성분 표면 표지자-1(M1S1), 종양 관련 칼슘 신호 변환기-2(TACSTD2) 및 위장 항원 733-1(GA733-1)로도 알려진 막관통 당단백질이다. 각 TROP2 분자는 소수성 전구체 펩티드, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리로 구성된다. 세포질 꼬리는 고도로 보존된 포스파티딜이노시톨 4, 5-이인산(PIP2) 결합 서열 및 303 위치의 세린 인산화 부위를 포함한다(Zaman S et al., (2019) Onco Targets Ther. 12:1781-1790). TROP2의 결합 파트너는 IFG-1, Claudin-1, Claudin-7, cyclin D1 및 PKC을 포함한다(Shvartsur A et al., (2015) Genes Cancer. 6(3-4):84-105).
TROP2는 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현되며, 예를 들어, 배아 기관 발달 및 태아 성장에 역할을 하는 반면, 정상 대조군의 기준 TROP2 발현 수준과 무관하게 모든 암 유형에서 발현이 증가하는 것으로 밝혀졌다(Mustata RC et al., (2013) Cell Reports. 5(2):421-432; Guerra E et al., (2012) PLoS ONE. 7(11): e49302; Trerotola M et al., (2013) Oncogene. 32(2): 222-233). 연구에 따르면, TROP2 발현을 결정하는 여러 전사 인자는 TP63/TP53L 및 빌름스 종양1(WT1)과 같은 암의 발생과 관련이 있으며, TROP2는 종양 발생과 관련된 많은 세포 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, TROP2 신호 전달은 β-카테닌 신호 전달을 통해 세포의 자기재생 및 증식을 조절하여 암 세포의 줄기 세포와 유사한 특성을 촉진시킨다(Stoyanova T et al., (2012) Genes Dev. 26(20):2271-2285). TROP2 과발현은 자궁경부암, 난소암, 대장암, 갑상선암의 종양 침입을 촉진시키고, TROP2 녹다운은 암 세포의 침입을 감소시킨다(Guan H et al., (2017) BMC Cancer. 17(1):486; Liu T et al., (2013) PLoS One. 8(9):e75864; Wu B et al., (2017) Exp Ther Med. 14(3):1947-1952; Zhao P et al., (2018) Oncol Lett. 15(3):3820-3827). 최근에 TROP2 신호 전달은 세포 이동을 위한 신호 전달을 조절하는 것으로 추가로 밝혀졌다. 예를 들어, TROP2는 β1 인테그린 기능을 조절하여 전립선암의 전이를 촉진하는 것으로 보고되었다(Trerotola M et al., (2013) Cancer Res. 73(10):3155-3167).
TROP2의 고발현은 임상적으로 간문부 담관암, 자궁경부암, 위암 등의 불량한 예후와 상관관계가 있다. 2,569명의 환자를 포함한 메타 분석에서 TROP2 발현 증가는 여러 고형 종양에서 양호하지 않은 전체 생존 및 무병 생존 결과와 통계적으로 관련이 있었다(Fong D et al., (2008) Br J Cancer. 99(8):1290-1295; Ning S et al., (2013) J Gastrointest Surg. 17(2):360-368; Liu T et al., (2013) PLoS One. 8(9):e75864; Zhao W et al., (2016) Oncotarget. 7(5):6136-6145; Zeng P et al., (2016) Sci Rep. 6:33658). 종양 표지자로서 TROP2의 역할은 특정 임상시험에서 시험되고 있다.
그 구조적 특성과 암과의 상관관계 때문에 TROP2는 매력적인 치료 표적이 되었다. 여러 항-TROP2 항체가 제조되었으며, 그중 일부는 유방암의 진행을 억제하고 이종 이식 마우스 모델에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다(Lin H et al., (2014) Int J Cancer. 134(5):1239-1249). 그러나, 2015년 IKEDA 등에 의해 Pr1E11의 높은 결합 친화성 및 낮은 내부화 활성이 확인되기 전까지, 기존 항체(naked antibody)는 높은 내부화율로 인해 치료적 가치를 나타내지 못한 것으로 보인다(Ikeda M et al., (2015) Biochem Biophys Res Commun. 458(4):877-82). 후속 연구에서 Pr1E11은 높은 세포 표면 유지와 관련이 있는 것으로 추정되는 강력한 항체 의존적 세포 독성을 생체내에서 유도하는 것으로 밝혀졌다(Ikeda M et al., (2016) Anticancer Res. 36(11):5937-5944). 현재 임상 전 및 임상 시험 중인 대부분의 TROP2 표적 치료제는 DS-1062a, IMMU-132, PF-06664178 등의 항체-약물 접합체(ADC)이며, 현재까지 제한된 독성을 사용한 고형암 치료에서 고무적인 결과를 얻었다(Zaman S et al., (2019) supra). 강력한 DNA 토포이소머라제 I 억제제(DXD)를 가진 새로운 TROP2-유도 항체-약물 접합체(ADC)인 다토포타맙 데룩스테칸(Dato-DXd, DS-1062a), 이 개발되었으며 전임상 모델에서 항종양 활성 및 안전성 프로파일이 평가되었다(Daisuke Okajima et al., Mol Cancer Ther, 2021 Dec; 20(12): 2329-2340).
기존 항체로 사용할 내부화 활성이 낮은 추가적인 항-TROP2 항체 또는 ADC 제조를 위한 내부화 활성이 높은 추가적인 항-TROP2 항체가 필요가 있다.
본 출원에서 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 문헌이 본 발명에대한 종래 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것이 아니다.
본 개시는 TROP2(예를 들어, 인간 TROP2)에 결합하고 사시투주맙(IMMU-132의 항체 부분)과 같은 종래 기술의 항-TROP2 항체와 비교하여 더 높지는 않더라도 비슷한 인간 및/또는 원숭이 TROP2에 대한 결합 친화성/결합능, 더 높거나 더 낮은 내부화 활성을 갖는 단리된 단클론성 항체(예들 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화 단클론성 항체) 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 방사성으로 표지된 TROP2 단백질의 시험관내 검출 및 암과 같은 TROP2 관련 질환의 치료를 포함하여 다양한 적용을 위해 사용할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시는 VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역(여기서, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역, 및 VH CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3; (2) 각각 SEQ ID NO: 7, 8 및 3; (3) 각각 SEQ ID NO: 12, 13 및 14; (4) 각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; (5) 각각 SEQ ID NO: 24, 25 및 26; (6) 각각 SEQ ID NO: 30, 31 및 32; 또는 (7) 각각 SEQ ID NO: 35, 36 및 37과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음); 및/또는 (ii) VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역(여기서, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역, 및 VL CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 6; (2) 각각 SEQ ID NO: 9, 10 및 11; (3) 각각 SEQ ID NO: 15, 16 및 17; (4) 각각 SEQ ID NO: 21, 22 및 23; (5) 각각 SEQ ID NO: 27, 28 및 29; (6) 각각 SEQ ID NO: 33, 34 및 29; 또는 (7) 각각 SEQ ID NO: 38, 39 및 40과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 갖는, TROP2에 결합하는 단리된 단클론성 항체(예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화 항체), 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역, 및 VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6; (2) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 3, 9, 10 및 11; (3) 각각 SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 및 17; (4) 각각 SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22 및 23; (5) 각각 SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28 및 29; (6) 각각 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34 및 29; 또는 (7) 각각 SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 및 40과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 44, 45, 46 (X1=S, X2=A; X1=T, X2=A; X1=S, X2=V), 47 (X1=R, X2=R; X1=A, X2=T), 51, 53, 55, 57, 59 또는 61과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 44 및 47(X1=A, X2=T)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 41 및 42의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 48, 49(X1=D, X2=L, X3=V; X1=E, X2=V, X3=L), 50(X1=Q, X2=S, X3=K; X1=G, X2=A, X3=K; X1=G, X2=S, X3=Y), 52, 54, 56, 58, 60 또는 62와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 48 및 50(X1=G, X2=A, X3=K)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 43 및 63의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 (1)각각 SEQ ID NO: 44 및 48; (2) 각각 SEQ ID NO: 45 및 49(X1=D, X2=L, X3=V); (3) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (4) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (5) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (6) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (7) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (8) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (9) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (10) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (11) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (12) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (13) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (14) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (15) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (16) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (17) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (18) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (19) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (20) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (21) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (22) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (23) 각각 SEQ ID NO: 51 및 52; (24) 각각 SEQ ID NO: 53 및 54; (25) 각각 SEQ ID NO: 55 및 56; (26) 각각 SEQ ID NO: 57 및 58; (27) 각각 SEQ ID NO: 59 및 60; 또는 (28) 각각 SEQ ID NO: 61 및 62과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 이황화 결합에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는데, 여기서 중쇄 가변 영역의 C 말단은 중쇄 불변 영역의 N 말단에 연결되고, 경쇄 가변 영역의 C 말단은 경쇄 불변 영역의 N 말단에 연결되는데, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 상술된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 TROP2에 결합한다. 중쇄 영역은 SEQ ID NO: 64(X1=R, X2=E, X3=M; X1= K, X2=D, X3=L)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 불변 영역과 같이, 향상된 FcR 결합능을 갖는 중쇄 불변 영역이거나 이의 기능적 단편일 수 있다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 65에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 카파 불변 영역 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 향상된 FcR 결합 친화성을 갖도록 조작된 인간 IgG2 또는 IgG4 불변 영역이거나 이의 기능적 단편일 수도 있다. SEQ ID NO: 64 및 65의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 74 및 75의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시의 항체는 특정 구현예에서 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 여기서 각각의 중쇄는 상기 언급된 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함할 수 있고, 각각의 경쇄는 상기 언급된 경쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함할 수 있고, 항체는 TROP2에 결합한다. 본 개시의 항체는 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형의 전장 항체일 수 있다. 다른 구현예에서 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 또는 항체 단편, 예컨대, Fab 또는 F(ab’)2 단편일 수 있다.　
본 개시는 또한 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 부분과는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능적 모이어티(예를 들어, 제2 항체)에 연결된 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 이중특이적 분자를 제공한다.　 본 개시는 또한 치료제, 예컨대, SN-38과 같은 세포독소에 연결된, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 면역접합체, 예컨대, 항체-약물 접합체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부로 구성될 수 있다. 또한 T 세포 및 NK 세포와 같은 항원 키메라 수용체를 포함할 수 있는 면역 세포가 제공된다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로 강화된 종양용해 바이러스가 추가로 제공된다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 방사성으로 표지되고 예를 들어, 전이성 TROP2+ 종양/암의 분포를 포함하여 TROP2+ 종양/암의 분포를 추적/검출하는 임상 영상에 사용될 수 있다. 방사성 표지는 3H를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시는 또한 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 CAR, 이러한 핵산 분자를 포함할 수 있는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포를 사용하여 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 CAR을 제조하기 위한 방법으로서, (i) 숙주 세포에서 대상 분자를 발현하는 단계 및 (ii) 숙주 세포 또는 이의 세포 배양물로부터 대상 분자를 단리하는 단계를 포함할 수 있는, 방법도 제공된다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체, 이중특이적 분자, 종양용해 바이러스, CAR 또는 CAR-T 세포, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 항암제와 같은 특정 질환을 치료하기 위한 치료제를 추가로 함유할 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 TROP2 (예를 들어, 과도한 TROP2 발현/신호 전달) 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 치료적 유효량의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 질환은 종양 또는 암일 수 있다. 종양은 유방암, 대장암, 위선암, 식도암, 간세포암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 난소상피암, 전립선암, 췌장관선암, 두경부암, 편평상피세포암, 신장세포암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 여포성 갑상선암, 다형성 교모세포종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고형 종양 또는 비고형 종양일 수 있다. 특정 구현에에서, 적어도 하나의 추가적인 항암 항체, 예컨대, 항-VISTA 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-STAT3 항체 및/또는 항-ROR1 항체가 추가로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 암 영상화를 위한 방법으로서, 방사성으로 표지된 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 이 방법은 식도 편평상피세포암, 대장암, 췌장암, 결장암, 유두상 갑상선암, 유방암 및 방광암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 TROP2 고발현 종양 또는 암의 분포를 추적/검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 개시의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이고, 이들은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 젠뱅크 항목, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 참조로 본원에 포함된다.
따라서, 본 발명의 목적은 출원인이 권리를 유보하도록 임의의 이전에 공지된 생산물, 생산물을 제조하는 공정, 또는 생산물을 사용하는 방법을 본 발명 내에 포함시키지 않으며, 이에 의해 임의의 이전에 공지된 생산물, 공정, 또는 방법의 포기를 개시한다. 본 발명은 출원인이 권리를 유보하도록 USPTO(35 U.S.C. §112, 첫 단락) 또는 EPO(EPC의 83항)의 서면 기재 요건 및 실시 가능 요건을 충족하지 않는 임의의 생산물, 공정, 또는 생산물의 제조 또는 생산물의 사용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 하는 것이 아니고, 이에 의해 임의의 이전에 기재된 생산물, 생산물의 제조 공정, 또는 생산물의 사용 방법의 포기를 개시한다는 것이 추가로 주목된다. 본 발명의 실시에 있어서 Art. 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC를 준수하는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제3자의 종래 출원된 출원에서 출원인의 임의의 등록된 특허(들)의 요지인 임의의 구현예를 명백히 포기하는 모든 권리는 명백히 유보된다. 본 명세서에서 어떤 것도 약속으로 해석되어서는 안된다.
본 개시 내용 및 구체적으로 청구항 및/또는 단락에서, "포함한다(comprises)", "포함된(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 귀속된 의미를 가질 수 있다는 것이 주목되며; 예를 들어, 이들은 "포함한다(includes)", "포함된(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 및 "필수적으로 이루어진다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 명시적으로 열거되지 않은 요소를 허용하지만, 종래 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 제외한다.
본 발명을 기술된 특정 구현예로만 제한하고자 하는 것이 아닌, 예로서 주어진 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 포획 ELISA에서 인간 TROP2에 대한 마우스 항체 A1E4F7D4, A1B12D2B4E7B3, A1E11A12D1, A1F1G12A7 및 A1H3C5H8E12(a), B1G1F5A3 and C1B3B12D2(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 2a 및 도 2b는 간접 ELISA에서 시노몰구스 TROP2에 대한 마우스 항체 A1E4F7D4, A1B12D2B4E7B3, A1E11A12D1, A1F1G12A7 및 A1H3C5H8E12(a), B1G1F5A3 및 C1B3B12D2(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 3a 및 도 3b는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 TROP2를 발현하는 293F-TROP2 세포에 대한 마우스 항체 A1E4F7D4, A1B12D2B4E7B3, A1E11A12D1, A1F1G12A7 및 A1H3C5H8E12(a), B1G1F5A3 및 C1B3B12D2(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 경쟁 ELISA에서 벤치마크-인간 TROP2 결합을 차단하는 마우스 항체 A1E4F7D4, A1E11A12D1 및 A1H3C5H8E12(a), A1F1G12A7 및 A1B12D2B4E7B3(b), B1G1F5A3 및 C1B3B12D2(c)의 능력을 보여주는 것이다.
도 5는 경쟁 ELISA에서 마우스 항체 A1E4F7D4-인간 TROP2 결합을 차단하는 마우스 항체 A1E4F7D4, A1E11A12D1 및 A1H3C5H8E12의 능력을 보여주는 것이다.
도 6은 경쟁 ELISA에서 마우스 항체 A1E4F7D4-인간 TROP2 결합을 차단하는 마우스 항체 A1E11A12D1, A1E11A12D1 및 A1H3C5H8E12의 능력을 보여주는 것이다.
도 7는 경쟁 ELISA에서 마우스 항체 A1E4F7D4-인간 TROP2 결합을 차단하는 마우스 항체 A1E11A12D1, A1H3C5H8E12 및 A1H3C5H8E12의 능력을 보여주는 것이다.
도 8은 293F-TROP2 세포에서 마우스 항체-DTTP1170 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 9a 및 도 9b는 포획 ELISA에서 인간 TROP2에 대한 키메라 항체 A1E4F7D4 및 C1B3B12D2(a), 및 A1F1G12A7(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 10a 및 도 10b는 간접 ELISA에서 시노몰구스 TROP2에 대한 키메라 항체 A1E4F7D4 및 C1B3B12D2(a), 및 A1F1G12A7(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 11a 및 도 11b는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 TROP2를 발현하는 293F-TROP2 세포에 대한 키메라 항체 A1E4F7D4 및 C1B3B12D2(a), 및 A1F1G12A7(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 12는 293F-TROP2 세포에서 키메라 항체-DT3C 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 13은 포획 ELISA에서 인간 TROP2에 대한 huA1E4F7D4-V16의 결합능을 보여주는 것이다.
도 14는 간접 ELISA에서 시노몰구스 TROP2에 대한 huA1E4F7D4-V16의 결합능을 보여주는 것이다.
도 15는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 TROP2을 발현하는 293F-TROP2 세포에 대한 huA1E4F7D4-V16의 결합능을 보여주는 것이다.
도 16은 경쟁 ELISA에서 벤치마크-인간 TROP2 결합을 차단하는 항체 huA1E4F7D4-V16의 능력을 보여주는 것이다.
도 17은 293F-TROP2 세포에서 huA1E4F7D4-V16-DT3C 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 18은 huA1E4F7D4-V16의 단백질 열 이동 검정 결과를 보여주는 것이다.
도 19는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 TROP2을 발현하는 293F-TROP2 세포에 대한 huA1E4F7D4-V16의 결합능을 보여주는 것이다.
도 20은 293F-TROP2 세포에서 huA1E4F7D4-V16-DT3C 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
본 개시를 보다 용이하게 이해할 수 있도록 보장하기 위해, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의가 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.
용어 "TROP2"는 상피 당단백질-1, 위장 항원 733--1 및 막 성분 표면 마커-1로도 알려진 종양 관련 칼슘 신호 변환기-2를 지칭한다. 용어 "TROP2"는 변이체, 동형, 동족체, 동원체 및 이원체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 TROP2 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우에, 원숭이와 같은 인간 이외의 종으로부터의 TROP2 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 TROP2 단백질에 특이적인 항체는 인간 TROP2 단백질에 완전 특이적일 수 있고, 다른 종에 대한 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않거나, 다른 모든 종이 아니라 다른 특정 종으로부터의 TROP2과 교차 반응할 수 있다.
용어 "인간 TROP2"는 SEQ ID NO: 71에 기재된 인간 TROP2의 아미노산 서열과 같은, 인간으로부터의 아미노산 서열을 갖는 TROP2 단백질을 지칭한다. 용어 "원숭이 TROP2" 또는 "시노몰구스 TROP2"는 NCBI 수탁 번호 XP_001114599.1 또는 XP_011762693.1을 갖는 아미노산 서열과 같은, 돼지꼬리 원숭이(macaca nemestrina) 또는 붉은털 원숭이(macaca mulatta)로부터의 아미노산 서열 갖는 TROP2 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어"항체"는 일부 경우에 항원-결합 부위가 일반적으로 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 있는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 통해 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어는 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 단쇄 Fv(scFv) 항체, 중쇄 항체(HCAb), 경쇄 항체(LCAb), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자(예를 들어, 이중 가변 도메인 면역글로불린 분자)를 포괄한다. 항체는 또한 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위부류(이소형)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)인 임의의 5 개 주요 부류의 면역글로불린일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고 잘 알려진 하위단위 구조 및 3-차원 배열을 갖는다. 항체는 독소 및 방사성 동위원소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다른 분자에 네이키드되거나 접합될 수 있다. 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 항체의 "항원-결합 부분"을 포함한다. IgG는 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함할 수 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인( CH1, CH2 및 CH3)으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 강쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성될 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 V L은 아미노-말단부터 카복시-말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다. 중쇄 불변 영역의 "기능적 단편"은 면역 세포 및/또는 보체계 단백질에 대한 항체의 결합을 매개하는 능력과 같은 기능을 보유하는 불변 영역의 일부를 지칭한다. 경쇄 불변 영역의 "기능적 단편"은 전장 불변 영역의 기능을 보유하는 불변 영역의 일부를 지칭한다.
항체와 함께 사용되는 용어 "항원-결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"은 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 C H1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544--546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있으며, 이 합성 링커는 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있게 한다(단쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. J. Mol. Biol. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 하고자 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는 "단리된" 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭하는 것으로 하고자 한다(예를 들어, TROP2 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 TROP2 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음) 그러나, 인간 TROP2 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다른 종으로부터의 TROP2 단백질과 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "마우스 항체"는 프레임워크와 CDR 영역 둘 모두가 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 하고자 한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시의 마우스 항체는 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-지정 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "마우스 항체"는 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 마우스 프레임워크 서열 상에 접목된 항체를 포함하는 것으로 하고자 하지 않는다.
용어 "키메라 항체"는 비인간 공급원으로부터의 유전 물질을 인간으로부터의 유전 물질과 조합함으로써 제조된 항체를 지칭한다. 또는 보다 일반적으로, 키메라 항체는 특정 종으로부터의 유전 물질과 함께 또 다른 종으로부터의 유전 물질을 갖는 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키도록 변형된 단백질 서열을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 개체군에서 얻은 항체를 지칭한다. 즉, 개체군을 구성하는 개별 항체들은 자연적으로 발생할 수 있는 소량의 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적으로 지시된다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와 달리, 각각의 단클론성 항체는 항원의 단일 결정기에 대해 지시된다. 단클론성 항체는 이러한 특이성 외에도, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 항체의 특성이 실질적으로 동종 항체의 개체군으로부터 얻어지는 것임을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 이를테면, 하이브리도마법을 포함하는 다양한 기법으로 제조될 수 있다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에특이적으로 결합하는 항체"와 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "인간 TROP2에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 TROP2 단백질(및 가능하게는 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 TROP2 단백질)에 결합하지만 비-TROP2 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 바람직하게는, 항체는 "고친화성", 즉 5.0 x10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1.0 x10-8 M 이하, 및 더욱 바람직하게는 2.0 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 TROP2 단백질을 결합한다.
본원에서 사용되는 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는"이라는 용어는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 고친화성으로 결합하지 않는,즉, 1.0 x 10-6 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-5 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-4 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-3 M 이상, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-2 M 이상의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 "고친화성"이라는 용어는 표적 항원에 대한 1.0 x 10-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 5.0 x 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하 및 더욱더 바람직하게는 5.0 x 10-10 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 대해서는 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화성" 결합은 10-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-7 M 이하, 더욱더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의결합 속도를 지칭하는 것으로 하고자 하지만, 본원에서 사용되는 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 본원에서 사용되는 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에서 잘 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 BiacoreTM 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것에 의해 이루어진다.
최대 유효 농도의 절반으로도 알려진 용어 "EC50"은 특정 노출 시간 후 기준선과 최대 값 사이의 중간의 반응을 유도하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 농도를 지칭한다.
최대 억제 농도의 절반으로도 알려진 용어 "IC50"은 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 부재에 비해 50%만큼 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 농도를 지칭한다.
용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하지만, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유동물이 바람직하다.
용어 "치료적 유효량"은 질환 또는 질병(예컨대, 종양)과 관련된 증상을 예방하거나 개선하고/하거나 질환 또는 질병의 중증도를 감소시키기에 충분한 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 치료되는 질병에 대한 맥락과 관련하여 이해되며, 여기서 실제 유효량은 당업자가 용이하게 알 수 있다.
본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 사시투주맙(IMMU-132의 항체 부분)과 같은 종래 기술의 항-TROP2 항체와 비교하여 더 높지는 않더라도 비슷한 인간 및/또는 원숭이 TROP2에 대한 결합 친화성/결합능, 더 높거나 더 낮은 내부화 활성을 갖는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 마우스, 키메라 및 인간화일 수 있다.
본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 하기에서 그리고 실시예에서 기술되는 바와 같이 구조적 및 화학적으로 특징화되는 단클론성 항체이다. 본 개시의 중쇄/경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 ID 번호는 하기 표 1에 요약되어 있으며, 일부 항체는 동일한 VH 또는 VL을 공유한다. 항체에 대한 중쇄 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 64(X1=R, X2=E, X3=M; X1=K, X2=D, X3=L)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이의 기능적 단편일 수 있고, 항체에 대한 경쇄 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 65에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 카파 불변 영역일 수 있다. 본 개시의 항체는 또한 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 함유할 수 있다. 본 개시의 항체는 또한 인간 카파 경쇄 불변 영역을 함유할 수 있다.
표 1의 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 카바트(Kabat) 넘버링 체계에 의해 정의되었다. 그러나, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, CDR 영역은 또한 중쇄/경쇄 가변 영역 서열에 기초하여 코티아(Chothia), 및 IMGT, AbM, 또는 콘택트(Contact) 넘버링 체계/방법과 같은 다른 체계에 의해 결정될 수 있다.
[표 1] Ig 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 ID 번호
인간 TROP2에 결합하는 다른 항-TROP2 항체의 VH 및/또는 VL 서열(또는 CDR 서열)은 본 개시의 VH 및/또는 VL 서열(또는 CDR 서열)과 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 바람직하게는, 면역글로불린 유사 항체의 일부 구현 예에서, VH 및 VL 사슬(또는 이러한 사슬 내의 CDR)이 혼합되고 매칭될 때, 특정 VH/VL 쌍형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게는 특정 VH/VL 쌍형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은
(a) 표 1에서 상기 열거된 아미노산 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역; 및/또는
(b) 표 1에서 상기 열거된 아미노산 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 또는 또 다른 항-TROP2 항체의 VL을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은
(a) 표 1에서 상기 열거된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역; 및/또는
(b) 표 1에서 상기 열거된 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 또는 또 다른 항-TROP2 항체의 CDR을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 인간 TROP2에 결합하는 다른 항체의 CDR과 조합된 항-TROP2 항체의 중쇄 가변 CDR2 영역, 예를 들어, 중쇄 가변 영역으로부터의 CDR1 및/또는 CDR3, 및/또는 상이한 항-TROP2 항체의 경쇄 가변 영역으로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함한다.
또한, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과 무관하게 CDR3 도메인 단독이 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 다수의 항체가 예측 가능하게 생성될 수 있음이 당업계에 널리 공지되어 있다.
따라서, 또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체는 항-TROP2 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2, 및 항-TROP2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 CDR3, 또는 또 다른 항-TROP2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR3을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 항체는 바람직하게는 (a) TROP2와 결합에 대해 경쟁하고/하거나; (b) 기능적 특징을 보유하고/하거나; (c) 동일한 에피토프에 결합하고/하거나; (d) 본 개시의 항-TROP2 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다. 추가의 또 다른 구현예에서, 항체는 항-TROP2 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2, 또는 또 다른 항-TROP2 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체는 항-TROP2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, 또는 또 다른 항-TROP2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하나 이상의 보존적 변형에 의해 본 개시의 항-TROP2 항체와는 상이한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 항원 결합을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있음이 당업계에서 이해된다.
따라서, 일 구현예에서, 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역 및/또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서
(a) 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및/또는 이의 보존적 변형을 포함하고/하거나;
(b) 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및/또는 이의 보존적 변형을 포함하고/하거나;
(c) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함하고/하거나;
(d) 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 상기 표1에 열거된 서열(들), 및/또는 이의 보존적 변형을 포함할 수 있고;
(e) 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화의 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 하고자 한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같이 당업계에 공지된 표준 기법에 의해 본 개시의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기가대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되었다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 분석을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험될 수 있다.
본 개시의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본 개시의 항-TROP2 항체의 VH/VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 또는 둘 모두의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의 하나 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 항체의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 접목은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 사용될 수 있다. 항체는 주로 6 개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이런 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 간에 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 되기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 접목된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현할 수 있다(예를 들어, 문헌[Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. J. Acad] 참조; 또한 U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지된 Gapped BLAST(상기 문헌[Altschul et al., (1997)]로 불리는 서열 유사성 탐색 방법 중 하나를 사용하여 종합된 단백질 서열 데이터베이스와 비교된다. 본 개시의 항체에서 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 개시의 항체에 의해 사용된 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형An은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선하는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합, 또는 관심 있는 다른 기능적 특성에 대한 효과가 당업계에 공지된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 분석에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형(당업계에 공지된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기가 변경된다.
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어, 항체의 특성을 개선하기 위해, VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기가 변형된 항체들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화"로도 지칭되며, 미국 특허 공개 제20030153043호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도, 또는 그에 대한 대안으로, 본 개시의 항체는, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성,예컨대, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포 세포 독성을 변경하기 위해, Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 개시의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 이의 당화를 변경하도록, 또 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 네이티브 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 포도구균 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체의 당화는 변형된다. 예를 들어, 무당화된(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 당화를 결여함). 당화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 당화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 당화 부위를 제거하여 해당 부위에서 당화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 무당화는 항원의 항체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,714,350 및 도 6,350,861에 나타나 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 당화를 갖는 항체, 예컨대, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 바이섹팅(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 당화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 당화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술되어 있고, 본 개시의 재조합 항체를 발현하여 변경된 당화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
본 개시에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는, 예를 들어, 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 또는 이의 단편은 전형적으로 하나 이상의 PEG 그룹이 항체 또는 항체 단편에 부착하게 되는 조건 하에, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응된다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 임의의 형태, 예컨대, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 하고자 한다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 무당화된 항체이다. 단백질을 페길화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 개시의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제EP 0 154 316호 및 EP 0 401 384호를 참조한다.
본 개시의 항체는 이의 상이한 부류를 검출하고/하거나 구별하기 위한 이들의 다양한 물리적 특성을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에 하나 이상의 당화 부위를 함유할 수 있다. 이러한 당화 부위는 변경된 항원 결합으로 인해 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 초래할 수 있다(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). 당화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려졌다.
바람직한 구현예에서, 항체는 아스파라긴 이성(isomerism) 부위를 함유하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 발생할 수 있고, 이는 폴리펩티드 사슬 내에 링크를 도입하고 이의 안정성을 감소시키는 이소아스파트산 잔기의 생성을 초래할 수 있다(이소아스파트산 효과).
각각의 항체는 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 속하는 고유한 등전점(pI)을 가질 것이다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7 내지 9.5의 pH 범위에 속하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6 내지 8의 pH 범위에 속한다. 정상 범위 이외의 pI를 갖는 항체가 생체내 조건 하에 일부 언폴딩 및 불안정성을 가질 수 있다는 추측이 있다. 따라서, 정상 범위에 속하는 pI 값을 함유하는 항-TROP2 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써 또는 전하를 띤 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 CDR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기법에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". 본 개시의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시의 핵산은 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 수득될 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우(예를 들어, 파지 디스플레이 기법을 이용함), 이러한 항체를 인코딩하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 개시의 바람직한 핵산 분자는 TROP2 단클론성 항체의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 CDR을 인코딩하는 것들을 포함한다. VH 및/또는 VL 분절을 인코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환시키기 위해, 표준 재조합DNA 기법에 의해 더 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-인코딩 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 또 다른 단백질을 인코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 문맥에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2 개의 DNA 단편이 연결되어, 2 개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)을 유지하는 것을 의미하고자 한다.
VH 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VH-인코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-인코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VL-인코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 변환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 인코딩하는 또 다른 단편에 작동 가능하게 연결되고, 그에 따라 VH 및 VL 서열은 인접한 단쇄 단백질로서 발현될 수 있고, VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다(예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. J. Mol. Biol. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,, (1990) Nature 348:552-554] 참조).
본 개시의 단클론성 항체(mAb)는 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 잘 알려진 체세포 혼성화(하이브리도마) 기법을 사용하여 제조되었다. 단클론성 항체를 생산하기 위한 다른 구현예는 B 림프구의 바이러스 또는 종양발생 형질전환 및 파지 디스플레이 기법을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체는 또한 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 개시의 항체는 또한, 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기법과 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[ Morrison, S. (1985) Science 229:1202). 일 구현예에서, 표준 분자 생물학 기법에 의해 얻어진 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 하나 이상의 발현 벡터에 삽입된다. 이러한 문맥에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 리게이션되는 것을 의미하고자 한다.
용어 "조절 서열"은 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 하고자 한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990))]에 기재되어 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로 또한, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복으로부터의 서열을 함유하는, SRα 프로모터 시스템으로 구성되었다(Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Natl. Acad. Sci. 8:466-472). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일하거나 별개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 가변 영역은 이들을 요망되는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩한 발현 벡터 내로 삽입함으로써임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하는 데 사용되고, 이로써 VH 분절은 벡터 내의 CH 분절(들)에 작동 가능하게 연결되고 VL 분절은 벡터 내의 CL 분절에 작동 가능하게 연결된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 항체 사슬 유전자는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 개시의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가 서열을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 네오 유전자(G418 선별을 위함)를 포함한다.
중쇄 및 경쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 하고자 한다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 개시의 항체를 발현하는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
본 개시의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 제87/04462호, WO 제89/01036호 및 EP 제338,841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체를 발현하게 하거나, 더욱 바람직하게는, 항체를 숙주 세포가 성장한 배양 배지 내로 분비하게 하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 2 개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하는 본 개시의 하나 이상의 항체를 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "이중특이적 분자"는 3개 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 이중특이적 분자는, FcR 결합 특이성 및 항-TROP2 결합 특이성 외에, 제3 특이성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 개시의 이중특이적 분자는 감소된 FcR 결합 친화성을 갖도록 조작될 수 있다.
이중특이적 분자는 다수의 상이한 형식 및 크기일 수 있다. 크기 스펙트럼의 한 말단에서, 이중특이적 분자는 동일한 특이성의 2 개의 결합 아암을 갖는 대신, 각각 상이한 특이성을 갖는 2 개의 결합 아암을 갖는 것을 제외하고는 전형적인 항체 형식을 보유한다. 다른 말단에는 펩티드 사슬, 소위 Bs(scFv)2 작제물에 의해 연결된 2개의 단쇄 항체 단편(scFv)으로 이루어진 이중특이적 분자가 있다. 중간-크기의 이중특이적 분자는 펩티딜 링커에 의해 연결된 2개의 상이한 F(ab) 단편을 포함한다. 이들 및 다른 형식의 이중특이적 분자는 유전 공학, 체세포 혼성화, 또는 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 치료제와 접합되어 면역접합체, 예컨대, 항체-약물 접합체(ADC)를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 항염증제 및 항암제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 펩티딜, 디설파이드 또는 하이드라존 링커와 같은 절단 가능한 링커를 통해 접합된다. 더욱 바람직하게는, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu와 같은 펩티딜 링커이다. ADC는 개시가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,087,600호; 제6,989,452호; 및 제7,129,261호; PCT 공개 제WO 02/096910호; 제WO 07/038,658호; 제WO 07/051,081호; 제WO 07/059,404호; 제WO 08/083,312호; 및 제WO 08/103,693호; 미국 특허 공개 제20060024317호; 제20060004081호; 및 제20060247295호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
종양용해 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시킨다. 본 개시의 항체는 종양용해 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 항체를 인코딩하는 종양용해 바이러스는 인간 신체에 도입될 수 있다.
또한 항-TROP2 scFv 또는 VHH 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되고, 항-TROP2 scFv 또는 VHH는 본원에 기재된 CDR 및 중쇄/경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항-TROP2 CAR은 (a) 항-TROP2 scFv 또는 VHH를 포함할 수 있는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다 CAR은 신생 수용체를 내형질 세망으로 유도하는 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 신호 펩티드를 함유할 수 있고, 수용체가 결합에 더욱 이용 가능하게 만드는 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 힌지 펩티드를 함유할 수 있다. CAR은 바람직하게는 세포내 신호전달 도메인에서 일차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 주로 사용되며 가장 효과적인 일차 세포내 신호전달 도메인은 ITAM을 함유하는 CD3-제타 세포질 도메인이며, 이의 인산화는 T 세포 활성화를 초래한다. 공동-자극 신호 전달 도메인은 CD28, CD137 및 OX40과 같은 공동-자극 단백질로부터 유래될 수 있다 CAR은 T 세포 확장, 지속성, 및 항-종양 활성을 향상시키는 인자, 예컨대, 사이토카인 및 공동-자극 리간드를 더 부가할 수 있다.
또한, 본원에 제공된 CAR을 포함할 수 있는 조작된 면역 효과기 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 또는 대안적으로, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포는 조성물이 한 종류 이상의 분자를 함유할 때 개별적으로 투여될 수 있다. 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가 약학적 활성 성분, 예컨대, 항종양제를 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 에멀션화제, 고형 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 성분을 산의 작용 및 불활성화를 초래할 수 있는 기타 자연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다. 본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여"는 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 것을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 관절낭하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 개시의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 이들은 또한 마이크로-에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이고, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%의 범위일 것이다.
투여량 요법은 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소하거나 증가할 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위형은 치료될 대상체를 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유한다. 대안적으로, 항체는 서방형 제형으로 투여될 수 있고, 이러한 경우에 투여가 덜 빈번하게 필요하다.
조성물의 투여의 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 방법은 한 달에 한 번씩 투여하는 것이다.
본 개시의 항-TROP2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 증가, 또는 질환 발병으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래한다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료를 위해, "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 또한 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 염증을 제거한다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 (1) 무니들 피하 주사 장치(예를 들어, 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 및 제4,596,556호); (2) 미세주입 펌프(미국 특허 제4,487,603호); (3) 경피 장치(미국 특허 제4,486,194호); (4) 주입 장치(미국 특허 제4,447,233호 및 제4,447,224호); 및 (5) 삼투 장치(미국 특허 제4,439,196호 및 제4,475,196호)와 같은 의료 장치를 통해 투여될 수 있고, 이의 개시는 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 단클론성 항체는 생체내에서 적절한 분배를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 보장하기 위해, 이들은 리포좀 내에서 제형화될 수 있는데, 이는 추가적으로 특정 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 향상시키기 위해 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 제5,416,016호; 및 제5,399,331호; 문헌[V. V. Ranade(1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
본 개시의 약학적 조성물은, 예를 들어, 과도한 TROP2 신호 전달을 갖는 종양의 치료를 포함하는 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다.
TROP2가 종양 세포 증식과 관련이 있다는 점을 고려하여, 본 개시는 이를 필요로하는 대상체의 TROP2 관련 종양 또는 암을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 방법을 제공한다. 종양은 유방암, 대장암, 위선암, 식도암, 간세포암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 난소상피암, 전립선암, 췌장관선암, 두경부암, 편평상피세포암, 신장세포암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 여포성 갑상선암, 다형성 교모세포종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 항암 항체가 추가로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물이 대상체에서 종양 성장을 억제하는 데 효과적인 하나 이상의 추가 항체와 공동으로 투여되는 병용 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물 및 하나 이상의 추가 항체, 예컨대, 항-OX40 항체, 항-TIM-3 항체, 항-CD137 항체, 항-GITR 항체, 항-LAG-3 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 대상체에서 종양 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. TROP2 경로 차단은 또한 표준 암 치료와 추가로 조합될 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시는 진단 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 조직에서 TROP2의 존재 및 발현을 결정하기 위해 사용된다. 일 구현예에서, 진단은 예후를 나타내고, 또는 치료 및/또는 후속 치료를 지시한다. 예를 들어, TROP2 신호 전달은 종양의 치료를 목표로 할 수 있다. 일 구현에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 TROP2 관련 종양 또는 암의 예후 및 적절한 치료 및 후속 치료를 결정하기 위한 진단 키트 또는 방법에 사용된다.
본원에서 논의되는 치료제의 조합은 약학적으로 허용되는 담체에서 단일 조성물로서 동시에, 또는 약학적으로 허용되는 담체에서 각 작용제를 갖는 별개의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조합되는 치료제는 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 병용 요법의 1회 초과의 용량이 순차적으로 투여되는 경우, 순차적 투여의 순서는 각 투여 시점에 역전되거나 동일한 순서로 유지될 수 있고, 순차적 투여는 동시 투여, 또는 이들의 임의의 조합과 조합될 수 있다.
본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 TROP2-양성 조직(예컨대, 암)의 영상화를 위한 방법으로서, 방사성으로 표지된 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 식도 편평상피세포암, 대장암, 췌장암, 결장암, 유두상 갑상선암, 유방암 및 방광암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 TROP2 고발현 종양 또는 암의 분포를 추적/검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 발명 및 그 이점에 대해 상술하였지만, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에서 다양한 변경, 치환 및 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 개시는 하기 실시에에 의해 추가로 예시되며, 하기 실시예는 추가로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 젠뱅크 서열, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 참조로 본원에 포함된다.
실시예
실시예 1 마우스 항-TROP2 단클론성 항체의 생성
면역화
문헌[E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 건강한 성체 낙타를 면역화시켰다. C-말단에 인간 IgG1 Fc가 있는 자체 제조한 재조합 인간 TROP2 단백질(SEQ ID NO: 66에 기재된 아미노산 서열)을 면역원으로 사용하고, 자체 제조한 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 67에 기재된 아미노산 서열)을 항-혈청 역가를 결정하고 항원-특이적 항체를 분비하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 사용하였다.
면역화 투여량은 일차 면역화 및 부스트 면역화 모두 20 μg 인간 TROP2-Fc 단백질/마우스/주사를 함유하였다. 면역 반응을 증가시키기 위해, 완전 프로이트 애주번트(complete Freud's adjuvant) 및 불완전 프로이트 애주번트(incomplete Freud's adjuvant)(Sigma, St. Louis, Mo., USA)를 각각 일차 면역화 및 부스트 면역화에 사용하였다. 간략히, 애주번트-항원 혼합물을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 볼텍스를 사용하여 바이알에서 애주번트를 약하게 혼합하고, 요망되는 양의 애주번트를 오토클레이브처리된 1.5 ㎖ 마이크로-원심분리기 튜브로 옮겼다. 0.2 mg/㎖ 내지 0.27 mg/㎖ 범위의 농도로 PBS 또는 식염수에서 항원을 제조한 후, 계산된 양의 항원을 애주번트와 함께 마이크로-원심분리기 튜브에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2분 동안 약하게 볼텍싱함으로써 유중수 에멀션을 생성하였다. 그 후에, 애주번트-항원 에멀션을 동물 주사에 적절한 주사기 내에 넣었다. 총 20μg의 항원을 150 ㎕ 내지 -200 ㎕의 부피로 주사하였다. 각 동물을 면역화시킨 후, 항-혈청 역가에 따라 4회 내지 5회 부스트시켰다. 역가가 우수한 동물에게 융합 전에 복강내 주사에 의해 마지막 부스트 용량을 제공하였다.
하이브리도마 융합 및 스크리닝
뮤린 골수종 세포주의 세포(SP2/0-Ag14, ATCC#CRL-1581)를 융합 직전에 대수 성장기에 이를 때까지 배양하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를멸균 제조하고, 문헌[Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497(1975)]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 골수종 세포와 융합하였다. 이어서, 융합된 "하이브리드세포"를 DMEM/20% FCS/HAT 배지의 96-웰 플레이트에 분배하였다. 융합 7일 내지 10일 후, 현미경으로 하이브리도마 콜로니의 생존을 관찰하였다. 2주 후, 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 67로 자체 제조)을 사용하여 각 웰로부터의 상청액을 포획 ELISA로 처리하였다. 인간 TROP2 단백질에 결합한 양성 하이브리도마 분비 항체를 선택하고, 24-웰 플레이트로 옮겼다. 이들 하이브리도마 클론을 시노몰구스 TROP2 결합 활성에 대하여 추가로 시험하였다. 높은 특이적 인간 TROP2 결합 및 시노몰구스 Trop2 결합 활성을 나타낸 항체를 생성하는 하이브리도마 클론을 제한된 희석으로 서브클로닝하여 세포주의 클론성을 보장한 후, 단클론성 항체를 정제하였다. 간략히, PBS 완충액을 사용하여 5 내지 10 컬럼 부피로 단백질 A 세파로스 컬럼(출처 bestchrom(Shanghai) Biosciences, Cat#AA0273)을 세척하였다. 하이브리도마 단일 클론의 세포 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 단백질의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 PBS 완충액을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 컬럼을 용리 완충액(0.1 M 글리신-HCl, pH 2.7)으로 용출하고, 즉시 중화 완충액(1 M Tris-HCl, pH 9.0)을 사용하여 1.5 ㎖ 튜브에 수집하였다. 면역글로불린을 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새 PBS 중에 투석하였다.
실시예 2 BIACORE 표면 플라즈몬 공명을 이용한 마우스 항-TROP2 단클론성 항체의 결합 친화성 결정
Biacore T200 시스템 (GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 의해 실시예 1에서 생성된 정제된 항-TROP2 단클론성 항체(mAb)를 결합 친화성 및 결합 동역학에 대하여 특징화하였다.
간략히, Biacore에 의해 제공되는 표준 아민 커플링 키트(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 일차 아민을 통해 CM5 칩(카르복시 메틸 덱스트란 코팅된 칩, GE healthcare #BR100530) 또는 단백질 G 칩에 염소 항-마우스 IgG 항체(GE healthcare, Cat#BR100838,　마우스 항체 포획 키트)를 공유 연결하였으며, 여기서 단백질 G 칩은 벤치마크의 친화성을 결정하기 위한 것이다(자체 제조한 사시투주맙, 본원에서 BM 또는 BM1이라고도 함, 각각 SEQ ID NO: 68 및 69에 기재된 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열). 칩(바이오센서) 표면 상의 미반응 모이어티를 에탄올아민으로 차단하였다. 실시예 1에서 생성된 항-TROP2 항체 및 2 ㎍/㎖ 농도의 벤치마크를 각각10 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. 이어서, 연속 희석된 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 67로 자체 제조) 또는 시노몰구스 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 70으로 자체 제조)을 160 nM에서 시작하여 HBS-EP+ 완충액(Biacore 제공)에서 2배 희석하여 30 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. 항원-항체 결합 동역학을 2분 동안 추적하고, 해리 동역학을 10분 동안 추적하였다. 결합 및 해리 곡선을 BIAcore 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅시켰다. KD, Ka 및 Kd 값을 결정하고 하기 표 2에 요약하였다.　
[표 2] 마우스 항-TROP2 항체의 결합 친화성
본 개시의 모든 마우스 항체는 벤치마크와 비교하여 비슷하거나 더 높은 결합 친화성으로 인간 TROP2 및 시노몰구스 TROP2에 특이적으로 결합하였다. 마우스 항체 A1E4F7D4, A1E11A12D1 및 C1B3B12D2는 인간 TROP2 및 시노몰구스 TROP2에 대한 가장 높은 결합 친화성을 나타냈다.
실시예 3 마우스 항-TROP2 단클론성 항체의 결합 활성
TROP2에 대한 본 개시의 마우스 항-TROP2 항체의 결합 활성을 포획 ELISA, 간접 ELISA 및 유세포 분석(FACS)을 통해 추가로 결정하였다.
포획 ELISA
간략히, 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중 2㎍/㎖의 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immuno Research, Cat#115-005-071) 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 4회 세척하고, 각각 100 ㎕의 연속 희석된 본 개시의 항-TROP2 항체, 벤치마크 또는 음성 대조군 hIgG(정맥 주사용 인간 면역글로불린(pH 4), Hualan Biological Engineering Inc.)(66.7 nM에서 시작하여 2.5% w/v 무지방 우유를 함유하는 PBST로 5배 연속 희석)와 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 다시 4회 세척하였다. 포획된 항-TROP2 항체를 함유하는 플레이트를 비오틴-표지 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 67로 자체 제조, PBST 중 2.5% w/v 무지방 우유 56.7 ng/㎖, 100 ㎕/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하고, 4회 세척하고, 스트렙타비딘 접합 HRP(PBST 중 1:10000 희석, Jackson Immuno Research, Cat#016-030-084, 100 ㎕/웰)와 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰 ELISA 기질 TMB(Innoreagents, Cat#S-002)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 실온에서 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. OD(450-630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 1a 및 도 1b에 나타나 있다.
간접 ELISA
시노몰구스 TROP2 단백질에 대한 본 개시의 항-TROP2 항체의 교차 반응을 시험하였다. 간략히, 96-웰 마이크로 플레이트를 4℃에서 밤새 탄산염/중탄산염 완충액(PH 9.6)에100 ㎕ 2 ㎍/㎖ 시노몰구스 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 70으로 자체 제조)로 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 4회 세척하고 100 ㎕/웰의 연속 희석된 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 대조군(66.7 nM에서 시작, PBST 중 2.5% w/v 무지방 우유로 5배 연속 희석)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 다시 4 회 세척하고, 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편(PBST 완충액에서 1:5000 희석, Jackson Immunoresearch, Cat#115-035-071, 100 ㎕/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰의 TMB(Innoreagents)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 실온에서 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. OD(450-630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 2a-2b
세포-기반 결합 FACS
세포 표면 TROP2 단백질에 대한 마우스 항-TROP2 항체의 결합 활성을 세포막 상에서 전장 인간 TROP2(uniprot#P09758, SEQ ID NO: 71)를 안정적으로 발현하는 Biosion 자체 제조 293F-TROP2 세포(클론 ID#3A8)를 사용하여 유세포 분석(FACS)에 의해 시험하였다. 293F-TROP2 세포는 293F 세포(Thermofisher Inc., Cat# 11625019)를 EcoR I 및 XbaI 부위 사이에 인간 TROP2 코딩 서열이 삽입된 pCMV-T-P 플라스미드로 리포펙타민 3000 형질감염 시약(Thermo Fisher)의 지침에 따라 형질감염시킴으로써 제조하였다.
293F-TROP2 세포를 세포 배양 플라스크로부터 수확하고, 2회 세척하고, 2% v/v 소 태아 혈청(FACS 완충액)을 함유하는 인산염 완충액(PBS)에 재현탁하였다. 이어서, 96-웰 플레이트에서 웰 당 2 x 105 293F-TROP2 세포를 FACS 완충액에서 다양한 농도(66.7 nM에서 시작하여 4배 연속 희석)의 항-TROP2 항체 또는 대조군 100 ㎕와 함께 얼음 위에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰 R-피코에리트린 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG(H+L)(FACS 완충액 중 1:1000 희석, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Cat#115-116-146)을 첨가하였다. 암소에서 4℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, FACS 완충액에 재현탁하였다. 형광을 Becton Dickinson FACS Canto II-HTS 장비를 사용하여 측정하고, MFI(평균 형광 강도)를 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 3a 및 3b에 나타나 있다.
도 1a 및1b에서 본 개시의 모든 마우스 항-TROP2 항체가 인간 TROP2에 특이적으로 결합했다는 것을 알 수 있다. 항체 A1E4F7D4, A1E11A12D1, B1G1F5A3 및 C1B3B12D2는 벤치마크보다 낮은 EC50을 보여주며 인간 TROP2 단백질에 더 효율적으로 결합한다는 것을 시사했으며, 항체 A1B12D2B4E7B3은 벤치마크보다 높은 Bmax를 보여주었다. 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 마우스 항-TROP2 항체 A1E4F7D4, A1E11A12D1 및 A1H3C5H8E12는 FACS 시험에서 벤치마크보다 유의하게 높은 결합능을 보여주었다.
도 2a 및 도 2b에 따르면, 본 개시의 모든 항체는 원숭이 TROP2에 특이적으로 결합하였고, 여기서 B1G1F5A3 및 C1B3B12D2는 벤치마크보다 높은 결합 활성으로 원숭이 TROP2 단백에 결합하였다.
실시예 4 에피토프 비닝
마우스 항-TROP2 항체의 에피토프 결합을 경쟁 ELISA 검정에서 시험하였다. 간략히, 37℃에서 2시간 동안 각각 100 ㎕의 PBS 중 1 ㎍/㎖ 벤치마크, 2 ㎍/㎖ 마우스 항체 A1E4F7D4, 2 ㎍/㎖ 마우스 항체 A1E11A12D1, 및 2 ㎍/㎖ 마우스 항체 A1H3C5H8E12로 96-웰 마이크로 플레이트를 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 차단하는 동안, 항-TROP2 항체 또는 대조군을 비오틴 표지 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 67, 2.5% w/v 무지방 우유 PBST 중 34 ng/㎖)로 희석하고(80 nM에서 시작하여 5배 연속 희석), 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 4회 세척 후, 항체/TROP2-his 단백질 혼합물을 항체 코팅 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 4회 세척하였다. 이어서, 플레이트에 100 ㎕의 퍼옥시다제 스트렙타비딘(PBST 완충액 중 1:10000 희석, Jackson Immunoresearch, Cat#016-030-084)을 첨가하여 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하고, 1M H2SO4를 사용하여 반응을 중단하였다. TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하고, OD(450 내지 630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, IC50 값을 보고하였다. 벤치마크-TROP2 결합을 차단하는 항체의 능력은 도 4a 내지 도 4c에 나타나 있고, TROP2의 A1E4F7D4, A1E11A12D1 및 A1H3C5H8E12와의 결합을 차단하는 항체의 능력은 도 5 내지 도 7에 각각 나타나 있다.
도 4a 내지 도 4c는 항-TROP2 항체 A1F1G12A7, A1B12D2B4E7B3 및 B1G1F5A3이 BM-인간 TROP2 결합을 차단할 수 있었다는 것을 보여주며, 이는 이 항체들과 벤치마크가 결합하는 에피토프가 중첩될 수 있다는 것을 시사한다. A1E4F7D4, A1E11A12D1, A1H3C5H8E12, C1B3B12D2를 포함하는 나머지 마우스 항-TROP2 항체는 벤치마크가 인간 TROP2에 결합하는 것을 차단하지 않았으며, 이는 이 항체들이 벤치마크와 다른 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 시사한다.,
도 5 내지 도7에 나타난 바와 같이, A1E4F7D4, A1E11A12D1 및 A1H3C5H8E12가 결합한 에피토프는 중첩되었으며, A1E4F7D4 및 A1E11A12D1가 결합한 에피토프는 A1H3C5H8E12가 결합한 에피토프보다 더 많은 아미노산 잔기를 포함하였다.
실시예 5 항-TROP2 항체의 세포 기반 내부화 검정
세포 기반 내부화 분석에서, Biosion 자체 제조 293F-TROP2 세포(클론 ID#3A8)를 사용하여 항-TROP2 항체의 내부화율을 정확하게 평가하였다. 먼저, SEQ ID NO: 72에 기재된 아미노산 서열을 사용하여 DTTP-1170라는 재조합 단백질을 합성하였다. 이어서, 10% v/v FBS(Gibco, Cat#10099-141)을 보충한 100 ㎕ FreeStyle293 배지(Gibco, Cat#12338-018)에서 5 x l03의 293F-TROP2 세포를 바닥이 평평한 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific Inc., Cat#167008)에 분주하였다. 세포 시딩 다음날, 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 본 개시의 마우스 항-TROP2 항체 또는 대조군 1.6 ㎍/㎖을 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 DTTP1170 단백질 1.6 ㎍/㎖과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 0.8 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 항체//DTTP1170 혼합물 100 ㎕를 세포 플레이트에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에 Cell Titer Glo 시약(Vazyme Biotech Co., Ltd, Cat#DD1101-02)을 첨가하여 실온에서 3-5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포 배양 플레이트를 Tecan infinite 200Pro 플레이트-리더로 분석하였다. Graphpad prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 IC50 값을 보고하였다. 세포 생존율에 대한 최대 50%의 억제를 달성한 항체 농도로 보고하였다.
mAb-DTTP 접합체가 표적 세포에 의해 내부화되었을 때 표적 세포 생존율은 현저하게 감소하였다. 접합체가 내부화되지 않은 경우, 배지 내의 유리 DTTP1170에서 세포 살상 활성이 없거나 거의 없었다. 결과는 도 8에 나타난 바와 같이, A1E4F7D4, A1B12D2B4E7B3, A1E11A12D1, A1F1G12A7, A1H3C5H8E12, B1G1F5A3, C1B3B12D2를 포함하는 본 개시의 모든 마우스 항체의 DTTP1170 접합체는 비교적 높은 비율로 내부화되었다.
실시예 6 키메라 항체의 생성 및 특징화
항-TROP2 마우스 mAb를 시퀀싱하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열 ID 번호를 표 1에 요약하였다.
항-TROP2 마우스 mAbA1E4F7D4, A1F1G12A7, C1B3B12D2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각 인간 IgG1 중쇄(SEQ ID NO: 64, X1=K, X2=D, X3=L) 및 인간 카파 경쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 65)에 프레임내에서 클로닝하였고, 여기서 가변 영역의 C-말단은 상응하는 불변 영역의 N-말단에 연결되었다.
인간 IgG1 중쇄 불변 영역에 연결된 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터, 및 인간 카파 경쇄 불변 영역에 연결된 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 1 mg/㎖의 PEI와 함께 1.1:1 비율의 경쇄 대 중쇄 작제물에서 50 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다.
세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하고, 펠렛 세포로 회전한 후, 키메라 항체를 상술된 바와 같이 세포 상청액에서 정제하였다. 정제된 항체를 약간 수정되거나 수정되지 않은 상기 실시예의 프로토콜 및 하기의 프로토콜에 따라 포획 ELISA, 간접 ELISA, 세포-기반 결합 FACS, BIAcore 친화성 시험, 에피토프 비닝 및 세포-기반 내부화 검정에서 시험하였다.
BIAcore 시험의 경우, 염소 항-인간 IgG(GE healthcare, Cat#BR100839, 인간 항체 포획 키트)를 염소 항-마우스 IgG 대신 CM5 칩에 공유 연결하였으며, 단백질 G 칩 대신 CM5 칩을 벤치마크에 사용하였다. 결과는 표 3에 나타나 있다.
포획 ELISA의 경우, AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편, 100 ㎕/웰 대신에 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immuno Research, Cat#109-005-098)을 사용하였다. 결과는 도 9a 및 도 9b에 나타나 있다.
간접 ELISA의 경우, 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편, 100 ㎕/웰 대신에 퍼옥시다제 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immunoresearch, Cat#109-036-098)을 사용하였다. 결과는 도 10a 및 도 10b에 나타나 있다.
세포-기반 결합 FACS의 경우, R-피코에리트린 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-마우스 IgG(H+L), 100 ㎕/웰 대신에 R-피코에리트린 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immunoresearch, Cat#109-115-098)을 사용하였다. 결과는 도 11a 및 도 11b에 나타나 있다.
세포-기반 내부화 검정에서, DTTP1170 대신에 수용체 결합 도메인이 없는 디프테리아 독소(DT)와 스트렙토코커스 단백질 G(3C)의 C1, C2, C3 도메인으로 이루어진 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 갖는 DT3C라는 재조합 단백질을 사용하여 항체를 접합시켰다. 그리고, 자체 제조 항-CD22 항체를 대조군으로 사용하였다. 세포 시딩 다음날, 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 본 개시의 키메라 항-TROP2 항체 또는 대조군 40 ㎍/㎖을 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 DT3C 단백질 40 ㎍/㎖과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 20 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 항체//DT3C 혼합물 100 ㎕를 세포 플레이트에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 도 12에 나타나 있다.
[표 3] 인간 TROP2 및 시노몰구스 TROP2에 대한 키메라 항-TROP2 항체의 결합 친화성
*시험하지 않음
도 9a 및 도 9b, 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, 키메라 A1E4F7D4 및 C1B3B12D2 항체는 포획 ELISA 및/또는 세포-기반 결합 FACS 시험에서 벤치마크보다 높은 결합능을 보여주었으며, 키메라 A1F1G12A7 항체는 포획 ELISA 및 세포-기반 결합 FACS 시험에서 벤치마크보다 약간 낮은 결합능을 보여주었다.
도 10a 및 도 10b에 따르면, 키메라 A1E4F7D4, A1F1G12A7 및 C1B3B12D2 항체는 벤치마크와 유사한 결합 활성으로 원숭이 TROP2 단백질에 특이적으로 결합하였다.
도 12는 키메라 A1E4F7D4 및 키메라 C1B3B12D2 항체의 DT3C 접합체가 현재 임상에 사용되는 벤치마크-DT3C 접합체와 비교하여 유사하거나 더 높은 비율로 내부화되었다는 것을 보여주었다. 구체적으로, 키메라 A1E4F7D4-DT3C 접합체는 표적 세포에 의해 더 효율적으로 내부화되어 표적 세포의 사멸을 더 효과적으로 유발하였다 키메라 A1F1G12A7-DT3C 접합체의내부화율은 벤치마크-DT3C 접합체보다 훨씬 더 낮았다.
표 3에 요약된 것과 같이, BIAcore 시험에서 시험한 키메라 항체 A1E4F7D4 및 C1B3B12D2의 결합 친화성은 벤치마크보다 높았다.
실시예 7 항-TROP2 항체 A1E4F7D4의 인간화
마우스 항-TROP2 항체 A1E4F7D4을 인간화시키고 추가로 특징화하였다. 하기에서 상세히 기술되는 바와 같이 잘 확립된 CDR-접목 방법을 사용하여 항체의 인간화를 수행하였다.
간략히, 마우스 또는 키메라 항체 A1E4F7D4의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 블라스팅하였다. 가장 높은 상동성을 갖는 인간 생식계열을 선택하고 이러한 생식계열의 프레임워크를 사용하여 항체 A1E4F7D4의 프레임워크를 대체하였다. 구체적으로, A1E4F7D4의 CDR을 선택된 프레임워크에 삽입하고, 프레임워크 내의 잔기(들)를 추가로 역돌연변이시켜 더 많은 후보 중쇄/경쇄 가변 영역을 수득하였다. 총 21개의 예시적인 인간화 A1E4F7D4 항체, 즉, huA1E4F7D4-V1에서 huA1E4F7D4-V21까지의 항체를 수득하였고, 이의 중쇄/경쇄 가변 영역 서열 ID 번호를 표 1에 기재하였다.
인간 IgG1 중쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 64, X1=K, X2=D, X3=L)에 연결된 huA1E4F7D4-V1에서 huA1E4F7D4-V21 중 하나의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터와 인간 카파 경쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 65)에 연결된 인간화 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 1 mg/㎖의 PEI와 함께 1.1:1 비율의 경쇄 대 중쇄 작제물에서 50 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다.
실시예 8 예시적 인간화 항체의 특징화
인간화 항체 huA1E4F7D4-V1에서 huA1E4F7D4-V21을 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하여 약간 수정된 상기 실시예의 프로토콜에 따라 Biacore T200 시스템(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)을 통해 인간 TROP2에 대한 결합 친화성을 시험하였다.
염소 항-인간 IgG(GE healthcare, Cat#BR100839, 인간 항체 포획 키트)를 염소 항-마우스 IgG 대신에 CM5 칩에 공유 연결하였다. 정제된 항체 대신에 인간화 항체 huA1E4F7D4-V1에서 huA1E4F7D4-V21을 함유하는 세포 상청액을 사용하였다. 연속 희석한 인간 TROP2-his 단백질 대신에 40 nM 농도의 인간 TROP2-his 단백질을 사용하였다. Ka, Kd 및 KD 값을 결정하고 표 4에 요약하였다.
데이터는, 시험한 인간화 항체가 높은 인간 TROP2 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
인간화 항체 huA1E4F7D4-V16은 상술된 바와 같이 정제하여, 약간 수정된 상기 실시예의 프로토콜 및 하기의 프로토콜에 따라 Biacore, 포획 ELISA, 간접 ELISA, 세포-기반 결합 FACS, 경쟁 ELISA, 세포-기반 기능 검정 및 단백질 열이동 검정에서 시험하였다.
BIAcore 시험의 경우, 염소 항-인간 IgG(GE healthcare, Cat#BR100839, 인간 항체 포획 키트)를 염소 항-마우스 IgG 대신 CM5 칩에 공유 연결하였으며, 단백질 G 칩 대신 CM5 칩을 벤치마크에 사용하였다. 결과는 표 6에 나타나 있다.
포획 ELISA의 경우, AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편, 100 ㎕/웰 대신에 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immunoresearch, Cat#109-006-008)을 사용하였다. 결과는 도 13에 나타나 있다.
간접 ELISA의 경우, 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편, 100 ㎕/웰 대신에 퍼옥시다제 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immunoresearch, Cat#109-036-098)을 사용하였다. 결과는 도 14에 나타나 있다.
[표 4] 인간화 A1E4F7D4 mAb의 결합 친화성
세포-기반 결합 FACS의 경우, R-피코에리트린 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-마우스 IgG(H+L), 100 ㎕/웰 대신에 R-피코에리트린 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immunoresearch, Cat#109-115-098)을 사용하였다. 결과는 도 15에 나타나 있다.
세포-기반 내부화 검정에서, SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 갖는 DT3C 단백질을 사용하여 항체를 접합시켰다. 세포 시딩 다음날, 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 대조군 4.44 ㎍/㎖을 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 DT3C 단백질 4.44 ㎍/㎖과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 2.22 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 항체//DT3C 혼합물 100 ㎕를 세포 플레이트에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 도 17에 나타나 있다.
열 이동 검정의 경우, 단백질 열 이동 검정을 이용하여 GloMelt™ 열 이동 단백질 안정성 키트(Biotium, Cat# 33022-T)를 사용함으로써 Tm(용융 온도)을 결정하였다. 간략히, GloMelt™ 염료가 해동되고 실온에 도달하도록 하였다. 염료가 들어 있는 바이알을 볼텍싱하고 원심분리하였다. 이어서, 5 ㎕의 200x 염료를 95 ㎕의 PBS에 첨가함으로써 10x 염료를 제조하였다. 2 ㎕의 10x 염료 및 10 ㎍의 인간화 항체를 첨가하고, 총 반응 부피가 20 ㎕가 되도록 PBS를 첨가하였다. 염료 및 항체가 들어 있는 튜브를 잠시회전시키고, 표 5에서의 매개변수를 갖는 용융 곡선 프로그램으로 설정된 실시간 PCR 열 순환기(Roche, LightCycler 480 II)에 배치하였다. 결과는 도 18에 나타나 있다.
[표 5] 용융 곡선 프로그램에 대한 매개변수
벤치마크-인간 TROP2 결합에 대한 huA1E4F7D4-V16의 차단 활성 결과는 도 16에 나타나 있다.
[표 6] 인간화 mAb의 결합 친화성
표 6에 따르면, 항체 huA1E4F7D4-V16은 키메라 A1E4F7D4 항체와 비슷하고 벤치마크보다 높은 인간 및 원숭이 TROP2 단백질에 대한 결합 친화성을 보여주었다.
도 13 및 도 15에 나타난 바와 같이, 인간화 항체 huA1E4F7D4-V16은 벤치마크보다 낮은 EC50으로 인간 TROP2에 특이적으로 결합하였으며, 이는 인간 TROP2 단백질에 더 효율적으로 결합한다는 것을 시사한다. 도 14에 나타난 바와 같이, huA1E4F7D4-V16은 벤치마크와 비교하여 비슷한 활성으로 원숭이 TROP2에 결합하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 인간화 항체 huA1E4F7D4-V16은 인간 TROP2에 결합하는 벤치마크(TROP2 BM1)를 차단하지 않았으며, 이는 이 항체가 벤치마크(TROP2 BM1)와 다른 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 시사한다..
도 17은 huA1E4F7D4-V16-DT3C 접합체가 벤치마크-DT3C 접합체보다 더 높은 비율로 내부화되었다는 것을 보여주며, 이는 huA1E4F7D4-V16-DT3C 접합체가 표적 세포에 의해 더 효율적으로 내부화되어 표적 세포의 사멸을 더 효과적으로 유발한다는 것을 의미한다.
또한, 도 18에 나타난 바와 같이, huA1E4F7D4-V16의 용융 온도는 71.5℃와 87.5℃이었다.
실시예 9 인간화 항체 huA1E4F7D4-V16의 특징화
인간화 항체 huA1E4F7D4-V16을 각각 SEQ ID NO: 76 및 77의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열로 자체 제조한 BM2라고도 하는 다토포타맙의 유사체(Daiichi Sankyo의 anti-trop2 mAb, Dato-DXd, DS-1062a)와 비교하여, 약간 수정되거나 수정되지 않은 상기 실시예의 프로토콜 및 하기의 프로토콜에 따라 Biacore, 세포-기반 결합 FACS, 세포-기반 내부화 검정 및 에피토프 그룹화 ELISA에서 시험하였다.
BIAcore의 결과는 표 7에 나타나 있다.
세포-기반 결합 FACS의 결과는 도 19에 나타나 있다.
세포-기반 내부화 검정에서, SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 갖는 DT3C 단백질을 사용하여 항체를 접합시켰다. 세포 시딩 다음날, 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 huA1E4F7D4-V16 또는 대조군 4.44 ㎍/㎖을 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 DT3C 단백질 4.44 ㎍/㎖과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 2.22 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 항체//DT3C 혼합물 100 ㎕를 세포 플레이트에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 도 20에 나타나 있다.
[표 7] huA1E4F7D4-V16의 결합 친화성
결과는, huA1E4F7D4-V16이 BM2보다 인간 TROP2에 대한 친화성이100배 이상 높고 세포 결합능이 더 우수하며, BM2와 비슷한 내부화율을 가진다는 것을 보여주었다.
에피토프 비닝
에피토프 비닝 ELISA를 수행하여 huA1E4F7D4-V16 및 BM1 또는 BM2가 결합한 에피토프가 어느 정도 중첩되는지를 결정하였다.
먼저, 포획 ELISA를 수행하여 에피토프 비닝 시험에 적합한 비오틴-표지 인간 Trop2 단백질의 농도를 결정하였다. 간략히, 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 각각 PBS 중 2 ㎍/㎖의 huA1E4F7D4-V16, BM1 또는 BM2 100 ㎕/웰로 코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 PBST 중 5% 무지방 우유로 차단하였다. 플레이트를 4회 세척하고, 2.5% 무지방 우유 PBST(1.3 ㎍/㎖에서 시작하여 5배 연속 희석)에 연속 희석된 100 ㎕/웰의 비오틴 인간 Trop2-his 단백질(SEQ ID NO: 67)을 첨가하여 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 4회 세척하고 100 ㎕/웰의 HRP-스트렙타비딘(Jackson Immuno Research, Cat#016-030-084)을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 40분 동안 다시 한 번 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 다시 세척하고, RT에서 15분 동안 발색을 위해 100 ㎕/웰 TMB를 첨가한 후 50 ㎕ 1M H2SO4로 퀀싱하였다. 450 nm에서 OD 값을 판독하였다. 에피토프 비닝 시험을 위해 항체의 OD450 값이 약 2.0가 되는 농도의 항체를 선택하였다.
위에서 결정된 적절한 농도로 에피토프 그룹화 ELISA을 수행하였다. 간략히, 37℃에서 2시간 동안 각각 100 ㎕의 PBS 중 2 ㎍/㎖ BM1, 2 ㎍/㎖ BM2, 2 ㎍/㎖ huA1E4F7D4-V16로 96-웰 마이크로 플레이트를 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 차단하는 동안, huA1E4F7D4-V16, BM1 및 BM2를 각각 인간 비오틴-인간 Trop2 단백질과 혼합하였으며, 여기서 huA1E4F7D4-V16, BM1 및 BM2의 혼합물의 최종 농도는 15 ㎍/㎖l이었으며, 인간 비오틴-인간 Trop2 단백질의 최종 농도는 위에서 결정된 최종 농도였다. 혼합물을 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 4회 세척 후, 항체/비오틴-TROP2-his 단백질 혼합물을 항체 코팅 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 HRP-스트렙타비딘을 첨가하고 40분 동안 인큐베이션한 후 OD450 값을 결정하고 교차 경쟁 능력을 계산하였다(항체 X의 교차 경쟁 능력(%) = (항체 X의 OD450 - 블랭크의 OD450) / (무 mAb의 OD450 - 블랭크의 OD450)*100%).
항체는 교차 경쟁 능력이 80% 이상일 때 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주되었다.　
결과는 하기 표 8에 나타나 있다. huA1E4F7D4-V16은 인간 TROP2에 결합하는 벤치마크를 차단하지 않았으며, 이는 이 항체가 BM1 및 BM2와 다른 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
[표 8] 에피토프 비닝 결과
본 개시는 하나 이상의 구현예와 연관되어 상술되었지만, 본 개시는 이들 구현예로 제한되지 않고, 본 설명은 첨부된 청구항의 사상 및 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형, 및 등가물을 포괄하는 것으로 하고자 함이 이해되어야 한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 추가로 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 출원의 서열은 하기에서 요약된다.
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본 발명의 바람직한 구현예가 이와 같이 상세히 기술되었지만, 상기 단락에 의해 정의된 발명은, 이의 다수의 분명한 변동이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어남 없이 가능함에 따라 상기 설명에 기재된 특정 세부 사항으로 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Biosion Inc. <120> ANTIBODIES BINDING TROP2 AND USES THEREOF <130> 55532 000XX <150> US 63/178,741 <151> 2021-04-23 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse, chimeric and humanized A1E4F7D4 <400> 1 Thr His Trp Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse, chimeric and humanized A1E4F7D4 <400> 2 Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of mouse, chimeric and humanized A1E4F7D4, and mouse A1E11A12D1 <400> 3 Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of mouse, chimeric and humanized A1E4F7D4 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of mouse, chimeric and humanized A1E4F7D4 <400> 5 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of mouse, chimeric and humanized A1E4F7D4 <400> 6 Gln His Ser His Ser Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse A1E11A12D1 <400> 7 Thr Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse A1E11A12D1 <400> 8 Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Tyr Ser Tyr Cys Asp Glu Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of mouse A1E11A12D1 <400> 9 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Ala Ile His 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of mouse A1E11A12D1 <400> 10 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of mouse A1E11A12D1 <400> 11 Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse A1H3C5H8E12 <400> 12 Asn Tyr Trp Ile Asp 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse A1H3C5H8E12 <400> 13 Asn Ile Phe Pro Gly Gly Phe Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of mouse A1H3C5H8E12 <400> 14 Gly Gly Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of mouse A1H3C5H8E12 <400> 15 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of mouse A1H3C5H8E12 <400> 16 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of mouse A1H3C5H8E12 <400> 17 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse and chimeric A1F1G12A7 <400> 18 Ser Tyr Gly Val His 1 5 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse and chimeric A1F1G12A7 <400> 19 Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of mouse and chimeric A1F1G12A7 <400> 20 Asp Gly Asp Tyr Glu Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of mouse and chimeric A1F1G12A7 <400> 21 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of mouse and chimeric A1F1G12A7 <400> 22 Leu Ala Ser Asp Gln Asp Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of mouse and chimeric A1F1G12A7 <400> 23 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse A1B12D2B4E7B3 <400> 24 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse A1B12D2B4E7B3 <400> 25 Tyr Ile Tyr Pro Asn His Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of mouse A1B12D2B4E7B3 <400> 26 Glu Asn Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of mouse A1B12D2B4E7B3 <400> 27 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of mouse A1B12D2B4E7B3 <400> 28 Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of mouse A1B12D2B4E7B3 and mouse B1G1F5A3 <400> 29 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse B1G1F5A3 <400> 30 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse B1G1F5A3 <400> 31 Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Ser Gly Phe Asn Gln Lys Phe Lys 1 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<220> <223> VL CDR1 of mouse and chimeric C1B3B12D2 <400> 38 Lys Cys Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Gln Glu Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of mouse and chimeric C1B3B12D2 <400> 39 Trp Ala Ser Ile Arg Glu Pro 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of mouse and chimeric C1B3B12D2 <400> 40 Gln His Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 41 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric A1E4F7D4 <400> 41 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggcaaaac ctgggacctc agtgaagatg 60 tcctgcgagg cttctggcta ctcctttact acccactgga tacactggat gaagcagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttttccta gcaatgctta tgctgtttat 180 aatcagaaat tcagggacag ggccataatg actgcagaca gatcctccac tacagcctat 240 atacaactca ccggcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagccagt 300 tactttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345 <210> 42 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of huA1E4F7D4-V6, huA1E4F7D4-V11, huA1E4F7D4-V16 and huA1E4F7D4-V21 <400> 42 caagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaagg cctctggcta cagcttcacc acccactgga tccactgggt gagacaagcc 120 cctggccaag gcctggagtg gattggcacc atcttcccta gcaatgccta tgctgtgtac 180 aatcagaagt tcagagacag agccaccatg acagctgaca caagcatcag cacagcctac 240 attgagctga gcagactgag atctgatgac acagctgtgt actactgtgc tagagctagc 300 tactttgact actggggcca aggcaccaca gtgacagtga gcagc 345 <210> 43 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse and chimeric A1E4F7D4 <400> 43 gacatcttgt tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcact 60 ttctcctgca gggccagtca gaacattggc acaagcatac actggtttca gcaaagaaca 120 actggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 agatttagtg gcagtggatc agggacagat tttactcttc acatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cacattatta ctgtcaacat agtcatagct ggccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataca a 321 <210> 44 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric A1E4F7D4 <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr His 20 25 30 Trp Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Ala Ile Met Thr Ala Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of huA1E4F7D4-V1 <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr His 20 25 30 Trp Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr 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Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of huA1E4F7D4-V5, huA1E4F7D4-V6, huA1E4F7D4-V10, huA1E4F7D4-V11, huA1E4F7D4-V15, huA1E4F7D4-V16, huA1E4F7D4-V20 and huA1E4F7D4-V21 <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be Arg or Ala <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa can be Arg or Thr <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr His 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Ala Thr Met Thr Xaa Asp Xaa Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 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115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys His Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln 385 390 395 400 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 405 410 415 Ser Asp Thr Ala Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg 420 425 430 Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 435 440 445 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 450 455 460 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg 465 470 475 480 Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Tyr Ser Gly Asn Tyr Tyr Ser Asn Tyr Thr 485 490 495 Val Ala Asn Tyr Gly Thr Thr Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 500 505 510 Ser His His His His His His 515 <210> 73 <211> 624 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DT3C protein <400> 73 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser 20 25 30 Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro 35 40 45 Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly 50 55 60 Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp 65 70 75 80 Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu 85 90 95 Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr 100 105 110 Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu 115 120 125 Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu 130 135 140 Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser 145 150 155 160 Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp 165 170 175 Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr 180 185 190 Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala 195 200 205 Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys 210 215 220 Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile 225 230 235 240 Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser 245 250 255 Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu 260 265 270 Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr 275 280 285 Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp 290 295 300 Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu 305 310 315 320 Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val 325 330 335 Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val 340 345 350 Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro 355 360 365 Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val 370 375 380 Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg 385 390 395 400 Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys His Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala 405 410 415 Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu 420 425 430 Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys 435 440 445 Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr 450 455 460 Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val 465 470 475 480 Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val 485 490 495 Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp 500 505 510 Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly 515 520 525 Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val 530 535 540 Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val 545 550 555 560 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 565 570 575 Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln 580 585 590 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 595 600 605 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu His His His His His His 610 615 620 <210> 74 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region of chimeric and humanized IgG antibodies <400> 74 gcctctacta aagggccctc ggtattcccg ctggcacctt catcaaagtc cacttcagga 60 ggaacagcag cacttggatg tctcgttaag gactatttcc cagaaccagt cactgtttcc 120 tggaattcag gagcacttac atcaggagtg cacacatttc ctgcagtgct tcaatcatca 180 ggactttact cactatcctc ggtagtcacg gtgccttcat catcacttgg aacacaaaca 240 tacatctgca acgtgaacca caaaccttcg aatactaaag tcgataagaa ggtcgagcct 300 aaatcatgcg ataagaccca tacatgccct ccttgccctg cacctgaact tcttggaggg 360 ccgagtgtgt ttctgtttcc tcctaagccc aaggatacac ttatgatctc aagaacacct 420 gaagtgacat gcgtggtggt ggatgtgtca cacgaagatc ctgaagtgaa atttaactgg 480 tacgtggatg gagtggaagt gcacaacgca aagactaagc ctagagaaga acaatacaac 540 tcaacataca gagtggtgtc agtgcttaca gtgcttcacc aagattggct taacggaaag 600 gagtataaat gcaaagtgtc aaacaaagca cttcctgcac ctatcgagaa gactatatca 660 aaagcaaaag gacaacctag agaacctcaa gtgtacacac ttcctccttc aagagatgaa 720 cttacaaaga atcaggtgag tttgacttgc cttgtaaagg gcttctaccc gtcagatatc 780 gcagtggaat gggaatcaaa cggacaacct gagaataatt ataagactac gcctcctgtg 840 cttgattcag atggatcatt cttcttgtat tcaaagttaa cagttgacaa gtctcgttgg 900 caacaaggaa acgtgttcag ctgttcagtg atgcacgaag cacttcacaa ccactacaca 960 cagaagtctc tctcactttc acctggaaag tga 993 <210> 75 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region of chimeric and humanized IgG antibodies <400> 75 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324 <210> 76 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of BM2 <400> 76 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 77 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of BM2 <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (20)

  1. (i) VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역(여기서, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역, 및 VH CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3; (2) 각각 SEQ ID NO: 7, 8 및 3; (3) 각각 SEQ ID NO: 12, 13 및 14; (4) 각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; (5) 각각 SEQ ID NO: 24, 25 및 26; (6) 각각 SEQ ID NO: 30, 31 및 32; 또는 (7) 각각 SEQ ID NO: 35, 36 및 37과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함); 및/또는
    (ii) VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역(여기서, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역, 및 VL CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 6; (2) 각각 SEQ ID NO: 9, 10 및 11; (3) 각각 SEQ ID NO: 15, 16 및 17; (4) 각각 SEQ ID NO: 21, 22 및 23; (5) 각각 SEQ ID NO: 27, 28 및 29; (6) 각각 SEQ ID NO: 33, 34 및 29; 또는 (7) 각각 SEQ ID NO: 38, 39 및 40과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함)을 포함하는, TROP2에 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 44, 45, 46 (X1=S, X2=A; X1=T, X2=A; X1=S, X2=V), 47 (X1=R, X2=R; X1=A, X2=T), 51, 53, 55, 57, 59 또는 61과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 48, 49(X1=D, X2=L, X3=V; X1=E, X2=V, X3=L), 50(X1=Q, X2=S, X3=K; X1=G, X2=A, X3=K; X1=G, X2=S, X3=Y), 52, 54, 56, 58, 60 또는 62와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
  4. 제3항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 (1) SEQ ID NO: 44 및 48; (2) 각각 SEQ ID NO: 45 및 49(X1=D, X2=L, X3=V); (3) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (4) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (5) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (6) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (7) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 49(X1=E, X2=V, X3=L); (8) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (9) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (10) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (11) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (12) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 50(X1=Q, X2=S, X3=K); (13) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (14) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (15) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (16) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (17) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 50(X1=G, X2=A, X3=K); (18) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=A) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (19) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=T, X2=A) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (20) 각각 SEQ ID NO: 46(X1=S, X2=V) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (21) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=R, X2=R) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (22) 각각 SEQ ID NO: 47(X1=A, X2=T) 및 50(X1=G, X2=S, X3=Y); (23) 각각 SEQ ID NO: 51 및 52; (24) 각각 SEQ ID NO: 53 및 54; (25) 각각 SEQ ID NO: 55 및 56; (26) 각각 SEQ ID NO: 57 및 58; (27) 각각 SEQ ID NO: 59 및 60; 또는 (28) 각각 SEQ ID NO: 61 및 62과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역에 연결된 SEQ ID NO: 64(X1=R, X2=E, X3=M; or X1=K, X2=D, X3=L)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 가변 영역에 연결된 SEQ ID NO: 65을 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형인, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 제1항에 있어서, (a) 인간 TROP2에 결합하고; (b) 원숭이 TROP2에 결합하고/하거나; (c) TROP2+ 세포에 의해 내부화되는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 제1항에 있어서, 마우스, 키메라 또는 인간화 항체인, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 치료제에 연결된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 면역접합체.
  10. 제9항에 있어서, 치료제가 세포 독성제일 수 있는, 면역접합체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 치료제가 SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있는, 면역접합체.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는, 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  14. 게놈에 통합된 제13항의 발현 벡터 또는 제12항의 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 면역접합체, 제12항의 핵산 분자, 제13항의 발현 벡터 또는 제14항의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 항종양제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 과도한 TROP2 신호 전달과 관련된 질환 치료용 약물을 제조하는, 약학적 조성물의 용도.
  18. 제17항에 있어서, 질환은 암인, 용도.
  19. 제17항에 있어서, 질환은 유방암, 대장암, 위선암, 식도암, 간세포암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 난소상피암, 전립선암, 췌장관선암, 두경부암, 편평상피세포암, 신장세포암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 여포성 갑상선암, 또는 다형성 교모세포종인, 용도
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 방사성으로 표지하여 대상체에서 암을 영상화하는, 방법.
KR1020237040489A 2021-04-23 2022-04-21 Trop2에 결합하는 항체 및 이의 용도 KR20230175298A (ko)

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