CN117255806A - 结合trop2的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种与人TROP2特异性结合的分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用该TROP2抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

Description

结合TROP2的抗体及其用途
相关申请和引用并入
本申请要求2021年4月23日提交的美国临时专利申请63/178,741的优先权。
前述申请、在其中引用的所有文件(“申请引用文件”)、在本文中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本文引用文件”)、以及在本文引用文件中引用或提及的所有文件，连同本文或任意本文引用并入文件中提及的任何制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本文，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入，如同各文件具体且个别地通过引用的方式并入。在本公开中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入，这些Genbank序列为本公开最早有效递交日的序列。
发明领域
本申请大体上涉及分离的单克隆抗体，特别是小鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与人TROP2结合，具有高亲和力和功能性。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供可以包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用这些的治疗方法。
背景技术
TROP2是一种跨膜糖蛋白，又称为表皮糖蛋白1(EGP-1)、膜成分表面标志物-1(M1S1)、肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)和胃肠道抗原733-1(GA733-1)。各TROP2分子由疏水性前导肽、胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾部组成。胞质尾部含有高度保守的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)结合序列和位于303位的丝氨酸磷酸化位点(Zaman S et al.，(2019)Onco Targets Ther.12：1781-1790)。TROP2的结合搭档包括IFG-1、Claudin-1、Claudin-7、周期蛋白D1和PKC(Shvartsur A et al.，(2015)Genes Cancer.6(3-4)：84-105)。
TROP2在正常组织中低水平表达，在例如胚胎器官发育和胎儿生长中起作用，而在所有癌症类型中均发现TROP2表达上调，无论正常对应物的基线TROP2水平如何(MustataRC et al.，(2013)Cell Reports.5(2)：421-432；Guerra E et al.，(2012)PLoS ONE.7(11)：e49302；Trerotola M et al.，(2013)Oncogene.32(2)：222-233)。研究显示，TROP2表达所依赖的一些转录因子与癌症发展相关，例如TP63/TP53L和Wilm肿瘤1(WT1)，且已证实TROP2参与许多与肿瘤发生相关的细胞信号通路。例如，TROP2信号通路，通过β-连环蛋白信号通路，来调节细胞的自我更新和增殖，并因而促进癌细胞的干细胞样特性(Stoyanova Tet al.，(2012)Genes Dev.26(20)：2271-2285)。TROP2的过表达促进宫颈癌、卵巢癌、结肠癌和甲状腺癌的肿瘤侵袭，敲降TROP2降低癌细胞侵袭(Guan H et al.，(2017)BMCCancer.17(1)：486；Liu T et al.，(2013)PLoS One.8(9)：e75864；Wu B et al.，(2017)Exp Ther Med.14(3)：1947-1952；Zhao P et al.，(2018)Oncol Lett.15(3)：3820-3827)。最近，进一步发现TROP2信号转导会调节细胞迁移的信号通路。例如，据报道，TROP2调节β1整合素的功能，以促进前列腺癌的转移(Trerotola M et al.，(2013)CancerRes.73(10)：3155-3167)。
临床上，TROP2高表达与例如肝门胆管癌、宫颈癌、和胃癌的不良预后相关。在一项包括2,569例患者的元分析中，TROP2表达的增加在统计学上与一些实体瘤的较差总生存期以及无病生存期结果相关(Fong D et al.，(2008)Br J Cancer.99(8)：1290-1295；Ning Set al.，(2013)J Gastrointest Surg.17(2)：360-368；Liu T et al.，(2013)PLoS One.8(9)：e75864；Zhao W et al.，(2016)Oncotarget.7(5)：6136-6145；Zeng P et al.，(2016)Sci Rep.6：33658)。TROP2作为肿瘤标志物的作用也正在一些临床试验中测试。
由于其结构特点以及与癌症的相关性，TROP2已成为有吸引力的治疗靶点。已制备出多个TROP2抗体，且发现其中一些在异种移植小鼠模型中抑制乳腺癌进展和诱导细胞凋亡(Lin H et al.，(2014)Int J Cancer.134(5)：1239-1249)。然而，很可能由于其高内化速率，没有抗体表现出作为裸抗体的治疗价值，直到2015年IKEDA等人发现了具有更高结合亲和力和更低内化活性的Pr1E11(Ikeda M et al.，(2015)Biochem Biophys ResCommun.458(4)：877-82)。在后来的研究中，Pr1E11经确定在体内诱导有效的抗体依赖性细胞毒性，推测这与较高的细胞表面停留期相关(Ikeda M et al.，(2016)AnticancerRes.36(11)：5937-5944)。当前，大多数处于临床前和临床试验中的TROP2靶向治疗剂都是抗体-药物偶联物(ADC)，包括DS-1062a、IMMU-132和PF-06664178，迄今为止在实体瘤治疗中取得了一些令人鼓舞的结果，且毒性较为有限(Zaman S et al.，(2019)同上)。已开发出一种含有强效DNA拓扑异构酶I抑制剂(DXd)的新型TROP2导向抗体-药物偶联物(ADC)，datopotamab deruxtecan(Dato-DXd，DS-1062a)，并已在临床前模型中评估了其抗肿瘤活性和安全性(Daisuke Okajima et al.，Mol Cancer Ther，2021Dec；20(12)：2329-2340)。
需要另外的具有低内化活性以用作裸抗体、或具有高内化活性以用于ADC制备的TROP2抗体。
本申请中对于任何文件的引用或标识，并不是承认这些文件是本发明的现有技术。
发明内容
本申请提供分离的单克隆抗体，例如小鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其结合TROP2(例如人TROP2)，与现有技术TROP2抗体例如赛妥珠单抗(sacituzumab，IMMU-132的抗体部分)相比，具有相当的(如果不是更高的话)与人和/或猴TROP2的结合亲和力/能力、以及更高或更低的内化活性。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括体外TROP2蛋白检测以及TROP2相关疾病(例如癌症)的治疗。
因此，在一个方面，本申请涉及结合TROP2的分离的单克隆抗体(例如，小鼠源、嵌合或人源化抗体)或其抗原结合部分，其包含(i)重链可变区，其可以包含VH CDR1区、VHCDR2区和VH CDR3区，其中该VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区可以分别包含与(1)SEQ IDNOs：1、2和3；(2)SEQ ID NOs：7、8和3；(3)SEQ ID NOs：12、13和14；(4)SEQ ID NOs：18、19和20；(5)SEQ ID NOs：24、25和26；(6)SEQ ID NOs：30、31和32；或(7)SEQ ID NOs：35、36和37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，其可以包含VL CDRl区、VLCDR2区和VL CDR3区，其中该VL CDRl区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含与(1)SEQ IDNOs：4、5和6；(2)SEQ ID NOs：9、10和11；(3)SEQ ID NOs：15、16和17；(4)SEQ ID NOs：21、22和23；(5)SEQ ID NOs：27、28和29；(6)SEQ ID NOs：33、34和29；或(7)SEQ ID NOs：38、39和40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含具有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区的重链可变区，和具有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区的轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含与(1)SEQ IDNOs：1、2、3、4、5和6；(2)SEQ ID NOs：7、8、3、9、10和11；(3)SEQ ID NOs：12、13、14、15、16和17；(4)SEQ ID NOs：18、19、20、21、22和23；(5)SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29；(6)SEQID NOs：30、31、32、33、34和29；或(7)SEQ ID NOs：35、36、37、38、39和40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区，其可以包含与SEQ ID NOs：44、45、46(X1＝S、X2＝A；X1＝T、X2＝A；X1＝S、X2＝V)、47(X1＝R、X2＝R；X1＝A、X2＝T)、51、53、55、57、59或61具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NOs：44和47(X1＝A、X2＝T)的氨基酸序列可以分别由SEQ ID NOs：41和42的核苷酸序列编码。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含轻链可变区，其可以包含与SEQ ID NOs：48、49(X1＝D、X2＝L、X3＝V；X1＝E、X2＝V、X3＝L)、50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K；X1＝G、X2＝A、X3＝K；X1＝G、X2＝S、X3＝Y)、52、54、56、58、60或62具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NOs：48和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)的氨基酸序列可以分别由SEQ IDNOs：43和63的核苷酸序列编码。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：44和48；(2)SEW ID NOs：45和49(X1＝D、X2＝L、X3＝V)；(3)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝A)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(4)SEQ ID NOs：46(X1＝T、X2＝A)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(5)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝V)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(6)SEQ ID NOs：47(X1＝R、X2＝R)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(7)SEQ ID NOs：47(X1＝A、X2＝T)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(8)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝A)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(9)SEQ ID NOs：46(X1＝T、X2＝A)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(10)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝V)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(11)SEQ IDNOs：47(X1＝R、X2＝R)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(12)SEQ ID NOs：47(X1＝A、X2＝T)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(13)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(14)SEQ ID NOs：46(X1＝T、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(15)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝V)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(16)SEQ ID NOs：47(X1＝R、X2＝R)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(17)SEQ ID NOs：47(X1＝A、X2＝T)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(18)SEQ IDNOs：46(X1＝S、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(19)SEQ ID NOs：46(X1＝T、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(20)SEQ ID NOs：46(X1＝S、X2＝V)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(21)SEQ ID NOs：47(X1＝R、X2＝R)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(22)SEQ ID NOs：47(X1＝A、X2＝T)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(23)SEQ ID NOs：51和52；(24)SEQ ID NOs：53和54；(25)SEQ ID NOs：55和56；(26)SEQ ID NOs：57和58；(27)SEQ ID NOs：59和60；或(28)SEQID NOs：61和62具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含通过二硫键连接的重链和轻链，重链可以包含重链可变区和重链恒定区，轻链可以包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的C端与重链恒定区的N端相连，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端相连，其中重链可变区和轻链可变区可以包含上述的氨基酸序列，该抗体或其抗原结合部分与TROP2结合。重链恒定区可以是具有增强的FcR结合力的重链恒定区，例如具有SEQ IDNO.：64(XI＝R、X2＝E、X3＝M；X1＝K、X2＝D、X3＝L)所示氨基酸序列的人IgG1恒定区，或其功能片段。轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO.：65所示氨基酸序列的人κ恒定区，或其功能片段。重链恒定区也可以是基因改造成具有增强的FcR结合亲和力的人IgG2或IgG4恒定区，或其功能片段。SEQ ID NOs：64和65的氨基酸序列可分别由SEQ ID NOs：74和75的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，本申请的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或者由两条重链和两条轻链组成，其中各重链可以包含上述重链恒定区、重链可变区或CDR序列，各轻链可以包含上述轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中抗体与TROP2结合。本申请的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型的。在其他实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部位可以是单链可变片段(scFv)抗体、或抗体片段例如Fab或F(ab')2片段。
本申请还提供双特异性分子，其可以包含本申请抗体或其抗原结合部分，与具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)连接。本申请还提供免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物，其可以包含本申请的抗体或其抗原结合部分，与治疗剂例如细胞毒素(例如，SN-38)相连。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以作为嵌合抗原受体(CAR)的一部分。还提供免疫细胞，其可以包含抗原嵌合受体，例如T细胞和NK细胞。还提供配备有本申请的抗体或其抗原结合部分的溶瘤病毒。
抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、或双特异性分子可以经放射性标记并应用于临床成像，以例如，追踪/检测TROP2+肿瘤/癌症的分布，包括转移性TROP2+肿瘤/癌症的分布。放射性标记物包括，但不限于，3H。
本申请还提供编码本申请抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、免疫偶联物、或CAR的核酸分子，以及可包含该核酸分子的表达载体、和可包含该表达载体的宿主细胞。还提供采用该宿主细胞制备本申请的TROP2抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、免疫偶联物、或CAR的方法，其可以包括(i)在该宿主细胞中表达目标分子、以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离目标分子的步骤。
还提供药物组合物，其可以包含本申请的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、溶瘤病毒、CAR或CAR-T细胞、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物还可以包含用于治疗特定疾病的治疗剂，例如抗癌剂。
在另一方面，本申请提供一种在有需求的受试者中治疗与TROP2(例如，TROP2过量表达/信号转导)相关的疾病的方法，其可以包括向受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。疾病可以是肿瘤或癌症。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤，包括，但不限于，乳癌、结直肠癌、胃腺癌、食管癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、胰腺导管腺癌、头颈癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、膀胱肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、滤泡状甲状腺癌、和多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，可以进一步施用至少一种其他的抗癌抗体，例如VISTA抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体、TIM3抗体、STAT3抗体、和/或ROR1抗体。在某些实施方式中，受试者是人。
在另一方面，本申请提供一种在有需求的受试者中进行癌症成像的方法，包括向受试者施用本申请的放射性标记的TROP2抗体或其抗原结合部位、免疫偶联物、或双特异性分子。该方法可以用于追踪/检测TROP2高表达的肿瘤或癌症的分布，包括，但不限于，食管鳞状细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、结肠癌、甲状腺乳头状癌、乳癌、和膀胱癌。在某些实施方式中，受试者是人。
基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会是明晰的，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank条目、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
因而，本申请的目标是不在本申请中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本申请并不打算在本申请的范围内包含任何不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合EPC第53条(c)和EPC细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本申请同族或任何其他同族或任何第三方在先申请中涉及本申请人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。
应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；且术语例如“基本由...组成”或“基本由...构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如它们允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。
附图说明
以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
图1A-1B示出在捕获ELISA中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7和A1H3C5H8E12(A)、B1G1F5A3和C1B3B12D2(B)与人TROP2的结合力。
图2A-2B示出在间接ELISA中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7和A1H3C5H8E12(A)、B1G1F5A3和C1B3B12D2(B)与食蟹猴TROP2的结合力。
图3A-3B示出在基于细胞的FACS结合检测中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7和A1H3C5H8E12(A)、B1G1F5A3和C1B3B12D2(B)与表达人TROP2的293F-TROP2细胞的结合力。
图4A-4C示出在竞争ELISA检测中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12(A)、A1F1G12A7和A1B12D2B4E7B3(B)、B1G1F5A3和C1B3B12D2(C)阻断对照基准物-人TROP2结合的能力。
图5示出在竞争ELISA检测中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12阻断小鼠源抗体A1E4F7D4-人TROP2结合的能力。
图6示出在竞争ELISA检测中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12阻断小鼠源抗体A1E11A12D1-人TROP2结合的能力。
图7示出在竞争ELISA检测中小鼠源抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12阻断小鼠源抗体A1H3C5H8E12-人TROP2结合的能力。
图8示出小鼠源抗体-DTTP1170偶联物对293F-TROP2细胞的内化介导性细胞毒性。
图9A-9B示出在捕获ELISA中嵌合抗体A1E4F7D4和C1B3B12D2(A)、和A1F1G12A7(B)与人TROP2的结合力。
图10A-10B示出在间接ELISA中嵌合抗体A1E4F7D4和C1B3B12D2(A)、和A1F1G12A7(B)与食蟹猴TROP2的结合力。
图11A-11B示出在基于细胞的FACS结合检测中嵌合抗体A1E4F7D4和C1B3B12D2(A)、和A1F1G12A7(B)与表达人TROP2的293F-TROP2细胞的结合力。
图12示出嵌合抗体-DT3C偶联物对293F-TROP2细胞的内化介导性细胞毒性。
图13示出在捕获ELISA中huA1F4F7D4-V16与人TROP2的结合力。
图14示出在间接ELISA中huA1EAF7D4-V16与食蟹猴TROP2的结合力。
图15示出在基于细胞的FACS结合检测中huA1E4F7D4-V16与表达人TROP2的293F-TROP2细胞的结合力。
图16示出在竞争ELISA检测中抗体huA1E4F7D4-V16阻断对照基准物-人TROP2结合的能力。
图17示出huA1E4F7D4-V16-DT3C偶联物对293F-TROP2细胞的内化介导性细胞毒性。
图18示出huA1E4F7D4-V16的蛋白热迁移试验的结果。
图19示出在基于细胞的FACS结合检测中huA1E4F7D4-V16与表达人TROP2的293F-TROP2细胞的结合力。
图20示出huA1E4F7D4-V16-DT3C偶联物对293F-TROP2细胞的内化介导性细胞毒性。
具体实施方式
为确保更容易地理解本申请，首先定义一些术语。其他的定义贯穿具体描述而给出。
术语“TROP2”是指肿瘤相关钙离子信号转导子2，又称为表皮糖蛋白1、胃肠抗原733-1、和膜成分表面标志物-1。术语“TROP2”可以包含变体、异构体、同源物、直系同源体和旁系同源体。例如，对人TROP2蛋白特异的抗体，在某些情况下，可以与除人以外物种例如猴的TROP2蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人TROP2蛋白特异的抗体可以完全地对人TROP2蛋白特异，并呈现为与其他物种或其他类型没有交叉反应性，或者可以对某些其他物种但非所有其他物种的TROP2发生交叉反应。
术语“人TROP2”是指具有来自人的氨基酸序列的TROP2蛋白，例如SEQ ID NO：71所示的人TROP2的氨基酸序列。术语“猴TROP2”或“食蟹猴TROP2”是指具有来自豚尾猴或猕猴的氨基酸序列的TROP2蛋白，例如具有NCBI登录号XP_001114599.1或XP_011762693.1的氨基酸序列。
在某些情况下，本文所用的术语“抗体”是指通过至少一个抗原结合位点而识别或特异性结合靶标的免疫球蛋白分子，其中抗原结合位点通常位于免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所用的，术语包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链Fv(scFv)抗体、重链抗体(HCAb)、轻链抗体(LCAb)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白、和任何其他修饰的包含抗原结合位点的免疫球蛋白分子(例如，双可变区免疫球蛋白分子)，只要抗体表现出所需的生物活性。抗体也包括，但不限于，小鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的其重链恒定结构域的特征，抗体可以是五类主要免疫球蛋白类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)中的任意种。不同种类的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构象。抗体可以是裸露的或与其他分子偶联，包括但不限于毒素和放射性同位素。除非另有明确说明，本文所用的术语“抗体”包括完整抗体的“抗原结合部分”。IgG是可以包含经二硫键而内部连接的两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。各重链可以由重链可变区(缩写成VH)和重链恒定区组成。重链恒定区可以由CH1、CH2和CH3这三个结构域组成。各轻链可以由轻链可变区(本文中缩写成VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区可以由CL这一个结构域组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着更加保守的称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)，的结合。重链恒定区的“功能片段”是指恒定区的保留有全长恒定区功能的一部分，例如，介导抗体与免疫细胞和/或补体系统蛋白结合的能力。轻链恒定区的“功能片段”是指恒定区的保留有全长恒定区功能的一部分。
本文中与抗体关联使用的的术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，是指抗体上保留有特异性结合抗原(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白)能力的一个或多个片段。已显示出，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括，但不限于，(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)由VH结构域构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，包含单个可变结构域的重链可变区和两个恒定结构域。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由不同的基因编码，它们可以通过重组的方法经合成接头而连接，其中合成的接头使得它们可以制备为单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段经与完整抗体相同的方式进行应用筛选。
本文所用的“分离的”抗体或其抗原结合片段意在指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或其抗原结合片段(例如，分离出的与TROP2蛋白特异性结合的抗体，基本不含特异结合TROP2之外蛋白的抗体)。然而，分离出的与人TROP2蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段可能与其他抗原，例如其他物种的TROP2蛋白，有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
本文所用的术语“小鼠源抗体”意在包括骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，本文所用的术语“小鼠源抗体”不意在包括在小鼠骨架序列中植入得自另一哺乳动物物种种系的CDR序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而制备的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是含有某一物种的遗传物质以及另一物种遗传物质的抗体。
本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经修改以增加与人中天然生成的抗体变体的相似度的抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群中得到的抗体，即，除可能存在少量的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)外，含该群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体为高度特异，针对单一抗原位点。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优点是，它们通过杂交瘤培养而形成，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”是指该抗体从基本均质的抗体群中获得的特性，不应解释为需要通过任何特定方法而生产该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如，杂交瘤方法。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。
词组“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
如本文所用的，“特异结合人TROP2”的抗体是指与人TROP2蛋白(以及可能的来自一种或多种非人物种的TROP2蛋白)结合但基本不与非TROP2蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”，即以KD值为5.0×10-8M以下，更优选1.0×10-8M以下，更优选2.0×10-9M以下，结合人TROP2蛋白。
如本文所用的，术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即以KD为1×10-6M以上，更优选1×10-5M以上，更优选1×10-4M以上，更优选1×10-3M以上，更优选1×10-2M以上，结合蛋白或细胞。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指抗体对于靶抗原的KD为1.0×10-6M以下，更优选5.0×10-8M以下，更优选1.0×10-8M以下，更优选1.0×10-9M以下，更优选5.0×10-10M以下。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指抗体的KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
本文所用术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”是指从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)获得的解离常数，表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法确定抗体的KD值。用于确定抗体KD的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如BiacoreTM系统。
术语“EC50”，也称为半最大效应浓度，是指在特定暴露时间后引起在基线和最高值之间的中间值反应的抗体或其抗原结合部分的浓度。
术语“IC50”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体或其抗原结合部分而言，抑制50％特定生物或生化功能的抗体或其抗原结合部分的浓度。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如肿瘤)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本申请抗体或抗原结合部分的量。治疗有效量在所治疗疾病的背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际有效量。
本申请的抗体或其抗原结合部分，特异性结合人TROP2，与现有技术TROP2抗体例如赛妥珠单抗(IMMU-132的抗体部分)相比，具有相当的(若不是更高的话)人和/或猴TROP2结合亲和力/能力，以及更高或更低的内化活性。
本申请的抗体或其抗原结合部分是小鼠源、嵌合和人源化的。
本申请的抗体或其抗原结合部分是在以下以及之后实施例中进行结构和化学表征的单克隆单体。本申请的重/轻链可变区和CDR的氨基酸序列ID编号总结于以下表1，一些抗体享有相同的VH或VL。抗体的重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：64(X1＝R、X2＝E、X3＝M；X1＝K、X2＝D、X3＝L)所示的氨基酸序列的人IgG1重链恒定区，或其功能片段，以及抗体的轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的人κ恒定区。本申请的抗体也可以包含人IgG2或IgG4重链恒定区。本申请的抗体也可以包含人κ轻链恒定区。
表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR已由Kabat编号体系确定。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列经其他体系例如Chothia、和IMGT、AbM或Contact编号体系/方法确定。
结合人TROP2的其他TROP2抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本公开的TROP2抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合和匹配”。优选地，在一些实施方式中的免疫球蛋白样抗体，当VH和VL链(或这些链中的CDR)混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构上相似的VH序列代替。同样地，优选来自特定VH/VL配对的VL序列经结构类似的VL序列替换。
因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以包含：
(a)包含上述表1中所列氨基酸序列的重链可变区；和/或
(b)包含上述表1中所列氨基酸序列的轻链可变区、或另一TROP2抗体的VL，其中该抗体特异性结合人TROP2。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以包含：
(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和/或
(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一TROP2抗体的CDR，其中该抗体特异结合人TROP2。
在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括TROP2抗体的CDR2区，结合有其他结合人TROP2抗体的CDR区，例如不同TROP2抗体的重链可变区CDR1和/或CDR3、和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
另外，如本领域所公知的，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对同源抗原的结合特异性，且基于相同的CDR3序列，可预见能产生具有相同结合特异性的多个抗体。
因而，在另一个实施方式中，本申请的抗体包含TROP2抗体重链可变区的CDR2，至少地TROP2抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一TROP2抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够与人TROP2特异性结合。优选这些抗体(a)竞争结合TROP2；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请TROP2抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含TROP2抗体轻链可变区的CDR2、或另一TROP2抗体轻链可变区的CDR2，其中该抗体能够与人TROP2特异性结合。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包含TROP2抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，或另一TROP2抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，其中该抗体能够与人TROP2特异性结合。
在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链和/或轻链可变区序列，其与本申请的TROP2抗体的可变区相比，区别在于具有一个或多个保守修饰。如本领域所理解的，可以进行一些不消除抗原结合的保守序列修饰。
因而，在一个实施方式中，抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和/或具有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
(b)重链可变区CDR2序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
(c)重链可变区CDR3序列包含如上表1所列的序列，及其保守修改；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和
(e)该抗体特异结合人TROP2。
在多个实施方式中，抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、嵌合、或人源化抗体。
本文所用的术语“保守的序列修饰”是指不会显著影响或改变含有这类氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。已定义出领域内具有相似侧链的氨基酸残基组。这些组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改造后的抗体可以使用本文所述的功能检测测试其保留下来的功能(即上述的功能)。
本申请的抗体可以用具备本申请TROP2抗体的VH/VL序列的抗体为起始原料而进行制备，以基因改造修饰的抗体。抗体可以通过修饰可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区内)的一个或多个残基来进行基因修饰。此外以及可选地，抗体可以通过修饰恒定区的残基来进行工程改造，以例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR植入可以用来工程改造抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，在个体抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，可以通过构建包含有将来自特定天然抗体的CDR序列植入到具有不同特性的不同抗体的骨架序列中的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(参见例如Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad。又可参见U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。
通过使用本领域公知的称为空格BLAST的序列相似性搜索方法(Altschul etal.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与汇编蛋白序列数据库进行比较。用于本申请抗体的优选骨架序列，是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。
另一类的可变区修饰是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入(本领域所知的)保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常对CDR区的改变不多于一个、两个、三个、四个或五个残基。
本申请的基因改造抗体包括，例如为提高抗体特性，在VH和/或VL的骨架残基中做出基因修饰的抗体。通常而言，做出这些骨架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于已得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过比较抗体骨架序列和得到抗体的种系序列而识别出来。
另一类的骨架修饰涉及对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
此外，或者作为对骨架或CDR区内修饰的另一种选择，本申请的抗体可以基因修饰成包含Fc区内的修饰，通常是为改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，可以对本申请的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学基团)，或者修饰成改变其糖基化，同样是为改变抗体的一个或多个功能特性。
在另一个实施方式中，抗体的Fc铰链区经突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域连接区，从而相较于与天然Fc-铰链结构域的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，该抗体具有削弱的SpA结合。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
另外地或者可选地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。经证实，这些改变的糖基化形式增加或降低抗体的ADCC活性。这样的糖基化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而完成。糖基化系统改变的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备糖基化改变的抗体。
包含在本申请中的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的活性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与活性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。蛋白聚乙二醇化的方法在领域内已知，且可以应用于本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同类别。
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起抗体的免疫原性增高，或由于抗原结合的改变引起抗体的pK变化(Marshall etal(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)JExp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序中。
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在N-G或D-G序列处，引起异天冬氨酸残基的生成，其向多肽链引入链接并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
各抗体将具有独特的等电点(pI)，其基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选pI值落在正常范围内的TROP2抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。
在另一方面，本申请提供编码本申请抗体重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解液中或处于部分纯化或基本纯化的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或者其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈处于基本纯化的状态”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可以包含或可以不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，下文会进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，可以从基因库中回收编码这类抗体的核酸。
优选的本申请核酸分子包括编码TROP2单克隆抗体的VH和/或序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和/或VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在上下文中使用术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而使这两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框内。
编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以表达成一个连续的单链蛋白，其中VL和VH区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。
可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的本领域所公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术制备本申请的单克隆抗体(mAb)。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合的或人源化的抗体是本领域公知的。
本申请的抗体还可以使用例如本领域所公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将通过标准分子生物技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到一个或多个表达载体中，从而使基因可操作地与转录和翻译调控序列相连接。在此背景下，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，从而使载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。
术语“调控序列”意在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。选择与使用的表达宿主细胞兼容的表达载体和表达控制序列。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，通过将可变区插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来构建任意抗体同种型的全长抗体基因，从而VH部分与载体中的CH部分可操作地连接，VL部分与载体中的CL部分可操作地连接。此外或者另外地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，进而信号肽在框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如，在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常而言，可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素、或甲氨喋呤的抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨喋呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
对于重链和/或轻链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”意在包括多种将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的常用技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，在真核细胞中表达抗体是最优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞，因为这些真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌出适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起使用的dhfr-CHO细胞，dhfr-CHO细胞在Urlaub andChasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中有过描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以在宿主细胞中表达抗体的时间，或优选将抗体分泌在宿主细胞生长的培养液中，来制备抗体。使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
另一方面，本公开涉及双特异性分子，其可以包含一个或多个本申请抗体，与至少一个其他功能性分子例如另一个肽或蛋白(例如，另一抗体或受体的配体)相连，以生成与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用的，“双特异性分子”包括有三种或更多种特异性的分子。在实施方式中，除Fc结合特异性和TROP2结合特异性外，双特异性分子还具有第三种特异性。在实施方式中，本申请的双特异性分子可以基因修饰成具有降低的FcR结合亲和力。
双特异性分子可以以多种不同形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两条结合臂且各臂具有不同特异性，而非具有两条相同特异性的结合臂外。在另一个极端的是，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学方法进行制备。
本申请的抗体可以与治疗剂结合，形成例如抗体-药物偶联物(ADC)的免疫偶联物。合适的治疗剂包括抗炎性剂和抗肿瘤剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过可切割的接头结合，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以按照美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中的描述进行制备。
溶瘤病毒优先侵染并杀灭癌细胞。本申请的抗体可以与溶瘤病毒一起使用。或者，编码本申请抗体的溶瘤病毒可以引入到人体中。
本文还提供包含TROP2 scFv或VHH片段的嵌合抗原受体(CAR)，该TROP2scFv或VHH片段包含本文所述的CDR和重/轻链可变区。
TROP2 CAR可以包含(a)可包含TROP2 scFv或VHH的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号结构域。CAR可以在胞外抗原结合域的N端含有指导新生受体进入内质网的信号肽，以及在胞外抗原结合域的N-端的使受体更容易结合的铰链肽。CAR优选地在胞内信号转导结构域包含主要的胞内信号转导域和一个或多个共刺激信号转导域。主要使用的和最有效的主要胞内信号转导域是包含ITAM的CD3-ζ胞质结构域，其磷酸化会引起T细胞活化。共刺激信号转导域可以衍生自共刺激蛋白，例如CD28、CD137和OX40。CAR还可以添加增强T细胞扩增、持续性和抗肿瘤活性的因子，例如细胞因子和共刺激配体。
还提供基因修饰的免疫效应细胞，其可以包含本文提供的CAR。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞、或胚胎干细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞。
在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其可以包含与药学上可接受的载体配制在一起的本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物、或核酸分子、表达载体或宿主细胞。当组合物中含有多于一种的分子时，抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物、核酸分子、表达载体或宿主细胞可分开给药。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的活性成分，例如抗肿瘤药物。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。在Gennaro，ed.，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中，对合适赋形剂的选择和使用有所讲解，其公开内容通过引用的方式并入本文。
优选地，该药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。基于给药途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其免受酸和其他可能使其失活的自然条件的影响。本文所用的术语“肠道外给药”是指非肠内和非局部外用的给药方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外的途径给药，例如外用、表皮或粘膜给药，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可呈无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制成微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将随治疗主体和特定给药方式而变，且通常是产生疗效的组合物的量。一般来说，以百分比计，这个量的范围是与药学上可接受的载体一起的活性成分的约0.01％-约99％。
调整给药方案以提供最佳的所需的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀，配置剂量单位型的肠道外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗个体的物理离散单位；每一单位含有经计算以结合所需药物载体产生期望治疗效果的预定量的活性成分。另外，抗体也可以缓释剂型给药，这种情况下需要的给药频率较低。
对于组合物的给药，剂量范围可以为约0.0001-100mg/kg。示例性治疗方案是每月给药一次。
“治疗有效剂量”的本申请TROP2抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物、核酸分子、表达载体或宿主细胞，优选地引起疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期频率和持久度的增加，或预防疾病折磨造成的损伤或残疾。例如，对于荷瘤受试者的治疗，与未接受治疗的受试者相比，“治疗有效剂量”优选将炎症消除至少约20％、更优选为至少约40％，甚至更优选为至少约60％，更优选为至少约80％。
药物组合物可以是控释剂型，包括植入体、经皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems.J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)，上述文献的公开内容通过引用的方式并入本文。
在某些实施方式中，可以配制本申请的单克隆抗体，以确保在体内的合适分布。例如，为确保本申请的治疗抗体或其抗原结合部位可以穿越血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本申请的药物组合物具有多种体外和体内用途，涉及例如对有过度TROP2信号转导的肿瘤的治疗。
鉴于TROP2与肿瘤细胞增殖相关，本申请提供用于在有需要的受试者中治疗TROP2相关肿瘤或癌症的方法，其可以包括向受试者施用本申请的药物组合物。肿瘤可以是实体瘤或血液瘤，包括，但不限于，乳癌、结直肠癌、胃腺癌、食管癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、胰腺导管腺癌、头颈癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、膀胱肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、滤泡性甲状腺癌、和胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，还可以施用至少一种其他的抗癌抗体。在某些实施方式中，受试者是人。
在另一个方面，本申请提供联合治疗的方法，其中本申请的药物组合物与一种或多种对抑制受试者中肿瘤生长有效的其他抗体共同施用。在一个实施方式中，本申请提供一种用于抑制受试者中肿瘤生长的方法，其可以包括向受试者施用本申请的药物组合物和一种或多种其他抗体，例如OX40抗体、TIM-3抗体、CD137抗体、GITR抗体、LAG-3抗体、PD-L1抗体和PD-1抗体。在某些实施方式中，受试者是人。TROP2信号通路阻断还可以与标准肿瘤治疗相结合。
在另一个方面，本申请提供诊断方法、组合物和试剂盒。在实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分用于确定组织中TROP2的存在和表达。在实施方式中，诊断可提示预后和/或指导治疗和/或跟踪治疗。例如，可以靶向TROP2信号转导来用于肿瘤的治疗。在实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分用于诊断试剂盒或方法中，以确定TROP2相关肿瘤或癌症的预后和适当治疗与随访。
本文讨论的治疗剂的联合可以作为在药学上可接受载体中的单一组合物同步给药，或者作为各药物处于药学上可接受载体中的单独组合物同步给药。在另一个实施方式中，治疗剂的联用可以按序施用。
此外，如果多于一剂的联合疗法需按序施用，按序给药的顺序可以在每个给药时间点颠倒或者保持相同的顺序，按序给药可以与同步给药相结合，或者任意组合。
本申请进一步提供一种在有需求受试者中对TROP2阳性组织，例如癌症组织，进行成像的方法，包括向受试者施用本申请的放射性标记的TROP2抗体或其抗原结合部位、免疫偶联物、或双特异性分子。该方法可以用于示踪/检测TROP2高表达的肿瘤或癌症的分布，包括，但不限于，食管鳞状细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、结肠癌、甲状腺乳头状癌、乳癌、和膀胱癌。在某些实施方式中，受试者是人。
尽管已经对本申请及其优势进行了详细的阐述，应当理解的是，可以在不脱离在所附权利要求中限定的本发明宗旨和范围的情况下，在本文中做出多种改变、替换和变动。
本申请在以下实施例中进一步阐明，实施例不应当解读为进一步的限制。所有附图和贯穿本申请引用的所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容，均通过引用的方式明确地并入本文。
实施例
实施例1.制备小鼠源TROP2单克隆抗体
免疫
根据E Harlow，D.Lane，Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998中所述的方法免疫小鼠。将内部制备的C端带有人IgG1 Fc的重组人TROP2蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO：66)用作免疫原，将内部制备的人TROP2-his蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO：67)用于抗血清效价的确定和分泌抗原特异性抗体的杂交瘤的筛选。
对于初次免疫和增强免疫，免疫剂量包含20μg人TROP2-Fc蛋白/小鼠/注射。为增加免疫应答，在初次免疫和增强免疫中分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma，St.Louis，Mo.，USA)。简而言之，如下制备佐剂-抗原混合物。首先，使用涡旋混合器在小瓶中轻柔地混合佐剂，将所需量的佐剂转移到高压灭菌的1.5mL微量离心管中。将抗原以0.2-0.27mg/ml的浓度配制在PBS或盐水中，然后将计算量的抗原加到含有佐剂的微量离心管中。经轻柔地涡旋2分钟混合所得溶液，形成油包水乳状液。之后将佐剂-抗原乳化物抽吸到合适的注射器中，进行动物注射。以150-200μl的体积，共注射20μg抗原。对各个动物进行免疫，之后基于抗血清效价进行4-5次加强。在杂交瘤融合前，通过腹腔注射对具有较好效价的动物进行最后一次加强。
杂交瘤融合和筛选
培养小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，ATCC#CRL-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。以无菌方式制备免疫小鼠脾细胞，并根据Kohler G，and Milstein C，″Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity，′′Nature，256：495-497(1975)中提到的方法与骨髓瘤细胞融合。之后将融合的“杂交细胞”在DMEM/20％FCS/HAT培养基中于96孔细胞板中铺板。融合后的7-10天，在显微镜下观察存活的杂交瘤群落。在两周后，使用人TROP2-his蛋白(内部制备，SEQ ID NO：67)，对各孔的上清液进行捕获ELISA。选出分泌与人TROP2蛋白结合的抗体的阳性杂交瘤，并转移到24孔板中。进一步测试这些杂交瘤对食蟹猴TROP2的结合活性。通过有限稀释，对产生显示出人TROP2高特异性结合和食蟹猴TROP2结合活性的抗体的杂交瘤进行亚克隆，以确保细胞系的单克隆源性，之后纯化单克隆抗体。简单而言，使用5-10倍柱体积的PBS缓冲液，冲洗蛋白A琼脂糖色谱柱(bestchrom(Shanghai)Biosciences，Cat#AA0273)。使单克隆杂交瘤的细胞上清液流经柱子，然后用PBS缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1MTris-HCl，pH9.0)的1.5mL管中。将含有免疫球蛋白的部分集中，并于4℃在PBS中透析过夜。
实施例2.使用BIACORE表面等离子体共振对小鼠源TROP2单克隆抗体的结合亲和 力确定
经Biacore T200系统(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)对实施例1中生成的纯化小鼠源TROP2单克隆抗体(mAb)进行结合亲和力和结合动力学表征。
简而言之，使用Biacore提供的标准胺偶联试剂盒(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)，将山羊抗小鼠IgG抗体(GEhealthcare，Cat#BR100838，小鼠抗体捕获试剂盒)经伯胺共价连接到CM5芯片(羧甲基右旋糖包被芯片，GE healthcare，Cat#BR100530)，或蛋白G芯片(GEhealthcare，Cat#29-1793-15)，其中蛋白G芯片用于对照基准物(内部制备，赛妥珠单抗，在本文中又称BM或BM1，重链和轻链氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：68和69)的亲和力测定。芯片(生物传感器)表面未反应的基团用乙醇胺阻断。使实施例1中制备的TROP2抗体和对照基准物，以2μg/ml的浓度，分别流至芯片，流速为10μl/min。然后，将起始浓度160nM，2倍稀释于HBS-EP+缓冲液(Biacore提供)的梯度稀释人TROP2-his蛋白(内部制备，SEQ IDNO：67)或食蟹猴TROP2-his蛋白(内部制备，SEQ ID NO：70)，以30μl/min的流速流到芯片上。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用BIAcore评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1 Langmuir结合模型中。确定KD、Ka和Kd值，并总结在以下表2中。
本申请所有的小鼠源抗体，相比于对照基准物，均以相当或更高的结合亲和力与人TROP2以及食蟹猴TROP2特异性结合。小鼠源抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1和C1B3B12D2示出最高的人TROP2和食蟹猴TROP2结合亲和力。
表2.小鼠源TROP2抗体的结合亲和力
实施例3.小鼠源TROP2单克隆抗体的结合活性
通过捕获ELISA、间接ELISA和流式细胞术(FACS)确定本申请小鼠源TROP2抗体对TROP2的结合活性。
捕获ELISA
简而言之，用100μl 2μg/ml亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗小鼠IgG(JacksonImmuno Research，Cat#115-005-071)的PBS溶液包被96孔板，4℃过夜。板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗，再于37℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭2小时。冲洗板4次，分别与100μl梯度稀释的本申请TROP2抗体、对照基准物或阴性对照hIgG(静脉注射用人免疫球蛋白(pH4)，华兰生物工程有限公司)(5倍稀释于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中，起始浓度66.7nM)37℃孵育40分钟，再次冲洗4次。含有捕获TROP2抗体的板与生物素标记的人TROP2-his蛋白(内部制备，SEQ ID NO：67，56.7ng/mL于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中，100μl/孔)，37℃孵育40分钟，洗涤4次，与链霉亲和素结合的HRP(1∶10000稀释于PBST，Jackson Immuno Research，Cat#016-030-084，100μl/孔)，于37℃孵育40分钟。在终洗后，板与100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，Cat#TMB-S-002)于室温孵育。在室温3-10分钟后用50ul/孔1M H2SO4中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC50值。结果如图1A-1B所示。
间接ELISA
检测本申请TROP2抗体与食蟹猴TROP2蛋白的交叉反应。简而言之，用100μl于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的2μg/ml食蟹猴TROP2-his蛋白(内部制备，SEQ ID NO：70)包被96孔板，4℃过夜。ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗一次，再于37℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭2小时。冲洗板4次，与100μl/孔梯度稀释的本申请TROP2抗体或对照(起始浓度66.7nM，5倍梯度稀释于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中)于37℃孵育40分钟。ELISA板再冲洗4次，与过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释于PBST缓冲液，JacksonImmunoresearch，Cat#115-035-071，100μl/孔)于37℃孵育40分钟。在终洗后，板与100μl/孔TMB(Innoreagents)于室温孵育。在室温3-10分钟后用50μl/孔1M H2SO4中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用GraphpadPrism软件对数据进行分析，得出EC50值。结果如图2A-2B所示。
基于细胞的结合FACS
使用博奥信内部制备的在细胞膜上稳定表达全长人TROP2(uniprot#P09758，SEQID NO：71)的293F-TROP2细胞(克隆ID#3A8)，经流式细胞术(FACS)检测小鼠源TROP2抗体与细胞表面TROP2蛋白的结合活性。根据1ipofectamine 3000转染试剂(Thermo Fisher)的说明书，通过使用在EcoRI和XbaI位点之间插入有人TROP2编码序列的pCMV-T-P质粒转染293F细胞(Thermofisher Inc.，Cat#11625019)来制备293F-TROP2细胞。
从细胞培养瓶中收获293F-TROP2细胞，洗涤两次，在含2％v/v胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)(FACS缓冲液)中重悬。之后，在96孔板中，每孔2×105个293F-TROP2细胞，在冰上，与100μl处于多种浓度的TROP2抗体或对照(起始浓度为66.7nM，4倍梯度稀释于FACS缓冲液)孵育40分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并加入100μL/孔R-藻红蛋白亲和纯化F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1000稀释于FACS缓冲液，Jackson ImmunoresearchLaboratories，Inc.，Cat#115-116-146)。4℃避光孵育40分钟后，细胞洗2次并用FACS缓冲液重悬。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS设备进行荧光测定，用MFI(平均荧光强度)与抗体浓度作图。采用Graphpad Prism软件进行数据分析，得出EC50值。结果如图3A-3B所示。
从图1A-1B可以看出，本申请所有的小鼠源TROP2抗体特异性结合人TROP2。抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1、B1G1F5A3和C1B3B12D2示出比对照基准物低的EC50，表明它们更高效地结合人TROP2蛋白，抗体A1B12D2B4E7B3示出比对照基准物更高的Bmax。如图3A-3B所示，在FACS检测中，小鼠源TROP2抗体A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12显示出比对照基准物更高的结合力。
根据图2A-2B，本申请所有的抗体特异性结合猴TROP2，其中B1G1F5A3和C1B3B12D2以高于对照基准物的结合活性结合猴TROP2蛋白。
实施例4.表位聚类
在竞争ELISA检测中，测定小鼠源TROP2抗体的表位结合。简而言之，将100μl于PBS中的1μg/mL对照基准物、2μg/mL小鼠源抗体A1E4F7D4、2μg/mL小鼠源抗体A1E11A12D1、和2μg/mL小鼠源抗体A1H3C5H8E12分别包被于96孔板，37℃2小时。ELISA板用冲洗缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗一次，再用200μl封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)37℃封闭2小时。封闭时，用生物素标记的人TROP2-his蛋白(SEQ ID NO：67，34ng/mL于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中)稀释TROP2抗体或对照，起始浓度80nM，5倍梯度稀释，室温孵育40分钟。冲洗板4次后，将抗体/TROP2-his蛋白混合物加至抗体包被的板中，100μl/孔。37℃孵育40分钟后，用洗涤缓冲液再次冲洗板4次。之后加入100μl链霉亲和素-过氧化物酶(1∶10000稀释于PBST缓冲液，Jackson Immunoresearch，Cat#016-030-084)，板于37℃孵育40分钟。用洗涤缓冲液再次洗涤板。最后，加入TMB，用1M H2SO4终止反应。在酶标仪中对各孔吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC50值。抗体阻断对照基准物-TROP2结合的能力如图4A-4C所示，抗体阻断TROP2与A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12结合的能力分别如图5-7所示。
从图4A-4C可以看出，TROP2抗体A1F1G12A7、A1B12D284E7B3和B1G1F5A3能够阻断BM-人TROP2结合，表明它们结合的表位和对照基准物结合的表位可能重叠。剩余的小鼠源TROP2抗体，包括A1E4F7D4、A1E11A12D1、A1H3C5H8E12和C1B3B12D2，没有阻断对照基准物结合人TROP2，表明它们很可能结合在与对照基准物不同的表位上。
如图5-7所示，A1E4F7D4、A1E11A12D1和A1H3C5H8E12结合的表位重叠，A1E4F7D4和A1E11A12D1结合的表位比A1H3C5H8E12结合的表位跨越更多的氨基酸残基。
实施例5.TROP2抗体的基于细胞的内化实验
在基于细胞的内化实验中，使用博奥信内部制备的293F-TROP2细胞(克隆ID#3A8)精准评估TROP2抗体的内化速率。首先，使用SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列合成名为DTTP-1170的重组蛋白。然后，将于100μL补充有10％v/v FBS(Gibco，Cat#10099-141)的FreeStyle293培养液(Gibco，Cat#12338-018)中的5×103个293F-TROP2细胞，在96孔平底板(Thermo Fisher Scientific Inc.，Cat#167008)中铺板。在细胞接种的次日，将本申请小鼠源TROP2抗体或对照(1.6μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)，与DTTP1170蛋白(1.6μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)以1∶1体积比混合，室温孵育30分钟，之后梯度稀释于细胞培养液，3倍梯度稀释，起始浓度0.8μg/mL。然后，将100μl梯度稀释的抗体/DTTP1170混合物加至细胞板中，在CO2孵育器中37℃孵育72小时。向板中加入细胞滴度Glo试剂(Vazyme Biotech Co.，Ltd，Cat#DD1101-02)，室温孵育3-5分钟。然后，使用Tecan infinite 200Pro酶标仪分析细胞培养板。使用Graphpad prism软件分析数据，以达到细胞活力50％最大抑制的抗体浓度输出为IC50值。
当mAb-DTTP偶联物由靶细胞内化时，靶细胞活力明显下降。如果偶联物没有被内化，则培养基中的游离DTTP1170没有或几乎没有细胞杀伤活性。结果如图8所示，显示出本申请所有小鼠源抗体(包括A1E4F7D4、A1B12D2B4E7B3、A1E11A12D1、A1F1G12A7、A1H3C5H8E12、B1G1F5A3和C1B3B12D2)的DTTP1170偶联物，均以较高的的内化速率内化。
实施例6.嵌合抗体的制备和表征
对TROP2小鼠源mAb进行测序，重链和轻链可变区的序列ID号总结在表1中。
TROP2小鼠源mAb A1E4F7D4、A1F1G12A7和C1B3B12D2的重链和轻链可变区以在可读框内的形式分别克隆至人IgG1重链(SEQ ID NO.：64，X1＝K，X2＝D，X3＝L)和人κ轻链恒定区(SEQ ID NO.：65)，其中可变区的C端与各自恒定区的N端相连。
将各个包含编码与人IgG1重链恒定区相连的重链可变区的核苷酸的载体，和各个含有编码与人κ轻链恒定区相连的轻链可变区的核苷酸的载体，以1.1∶1的轻∶重链构建体比，瞬时转染到50ml含有1mg/mL PEI的293F悬浮细胞培养物中。
在摇瓶中6天后，收获细胞上清液，旋转离心使细胞成团，然后从上述细胞上清液中纯化出嵌合抗体。遵循上述实施例的操作流程(修改或不做修改)以及以下所述的操作规程，在捕获ELISA、间接ELISA、基于细胞的结合FACS、BIAcore亲和力测试、表位聚类和基于细胞的内化实验中测试纯化的抗体。
对于BIAcore，使用山羊抗人IgG(GEhealthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)，取代山羊抗小鼠IgG，与CM5芯片共价连接，对照基准物使用CM5芯片而非蛋白G芯片。结果如表3所示。
对于捕获ELISA，使用亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-005-098)来替代亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗小鼠IgG，100μl/孔。结果如图9A-9B所示。
对于间接ELISA，使用过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异的F(ab′)2片段山羊抗人IgG(JacksonImmunoresearch，Cat#109-036-098)替代过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗小鼠IgG，100μl/孔。结果如图10A-10B所示。
在基于细胞的结合FACS中，使用R-藻红蛋白亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch，Cat#109-115-098)替代R-藻红蛋白亲和纯化F(a＝b′)2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)，100μl/孔。结果如图11A-11B所示。
在基于细胞的内化实验中，使用氨基酸序列为SEQ ID NO：73，由缺乏受体结合域的白喉毒素(DT)与链球菌蛋白G的C1、C2和C3结构域(3C)构成的称为DT3C的重组蛋白，代替DTTP1170来偶联抗体。使用内部制备的CD22抗体作为阴性对照。在细胞接种的次日，本申请的嵌合TROP2抗体或对照(40μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)与DT3C蛋白(40μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)以1∶1体积比混合，室温孵育30分钟，之后梯度稀释于细胞培养液，3倍梯度稀释，起始浓度20μg/mL。然后，将100μl梯度稀释的抗体/DT3C混合物加至细胞板中，在CO2孵育器中7℃孵育72小时。结果如图12所示。
表3.嵌合TROP2抗体与人TROP2以及食蟹猴TROP2的结合亲和力
*未测试
从图9A-9B和图11A-11B可以看出，在捕获ELISA和/或基于细胞的结合FACS检测中，嵌合的A1E4F7D4和C1B3B12D2抗体显示出高于对照基准物的结合力，而在捕获ELISA和基于细胞的结合FACS检测中，嵌合抗体A1F1G12A7抗体的结合力略低于对照基准物。
根据图10A-10B，嵌合A1E4F7D4、A1F1G12A7和C1B3B12D2抗体特异性地结合猴TROP2蛋白，结合活性与对照基准物相当。
图12示出，与目前在临床使用的对照基准物-DT3C偶联物相比，嵌合A1E4F7D4和嵌合C1B3B12D2抗体的DT3C偶联物以相似或更高的速率内化。具体地说，嵌合A1E4F7D4-DT3C偶联物更高效地被靶细胞内化，以更高效的方式导致靶细胞死亡。而嵌合A1F1G12A7-DT3C偶联物的内化速率远低于对照基准物-DT3C偶联物。
如表3中所总结的，在BIAcore检测中测试的嵌合抗体A1E4F7D4和C1B3B12D2的结合亲和力均高于对照基准物。
实施例7.TROP2抗体A1E4F7D4的人源化
将小鼠源TROP2抗体A1E4F7D4进行人源化，并进一步表征。抗体的人源化使用确立的CDR移植技术进行，其在下文中详细描述。
简而言之，将小鼠源或嵌合抗体A1E4F7D4的轻链和重链可变区序列在人免疫球蛋白基因数据库中进行比对。选出同源性最高的人类种系，这些种系的框架被用来替代抗体A1E4F7D4的框架。具体地，将A1E4F7D4的CDR插入到选中的框架中，对框架中的残基进一步回复突变，以获得更多候选的重链/轻链可变区。一共得到21个示例性人源化A1E4F7D4抗体，即huA1E4F7D4-V1至huA1E4F7D4-V21，其重/轻链可变区序列ID号列于表1。
将各个包含编码与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：64，XI＝K，X2＝D，X3＝L)相连的huA1E4F7D4-V1至huA1E4F7D4-V21之一的重链可变区的核苷酸的载体，和各个包含编码与人κ轻链恒定区(SEQ ID NO：65)相连的人源化轻链可变区的核苷酸的载体，以1.1∶1的轻：重链构建体比，瞬时转染到50ml含有1mg/mLPEI的293F悬浮细胞培养物中。
实施例8.示例性人源化抗体的表征
在摇瓶中6天后，收获含有人源化抗体huA1E4F7D4-V1至huA1E4F7D4-V21的细胞上清液，并根据略加修改的上述实施例中的操作规程，通过Biacore T200系统(GEhealthcare，Pittsburgh，PA，USA)检测其与人TROP2的结合亲和力。
将山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)，替代山羊抗小鼠IgG，与CM5芯片共价连接。用含有人源化抗体huA1E4F7D4-V1至huA1E4F7D4-V21的细胞上清液替代纯化的抗体。用浓度为40nM的人TROP2-his蛋白替代梯度稀释的人TROP2-his蛋白。确定Ka、Kd和KD值，并总结在下表4中。
数据显示，所测试的人源化抗体具有较高的人TROP2结合亲和力。
如上所述纯化人源抗体huA1E4F7D4-V16，并按照上述实施例的操作流程(稍加修改)以及以下所述的操作规程，在Biacore、捕获ELISA、间接ELISA、基于细胞的结合FACS、竞争ELISA、基于细胞的功能试验和蛋白热迁移实验中进行测试。
对于BIAcore，使用山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)替代山羊抗小鼠IgG，与CM5芯片共价连接，对照基准物使用CM5芯片而非蛋白G芯片。结果如表6所示。
对于捕获ELISA，使用亲和纯化Fcγ片段特异的F(ab′)2片段山羊抗人IgG(JacksonImmuno Research，Cat#109-006-008)来替代亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗小鼠IgG，100μl/孔。结果如图13所示。
对于间接ELISA，使用过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异的F(ab′)2片段山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch，Cat#109-036-098)来替代过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗小鼠IgG，100μl/孔。结果如图14所示。
在基于细胞的结合FACS中，使用R-藻红蛋白亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch，Cat#109-115-098)来替代R-藻红蛋白亲和纯化F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)，100μl/孔。结果如图15所示。
在基于细胞的内化实验中，使用氨基酸序列为SEQ ID NO：73的DT3C蛋白来偶联抗体。在细胞接种的次日，本申请的TROP2抗体或对照(4.44μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)与DT3C蛋白(4.44μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)以1∶1体积比混合，室温孵育30分钟，之后梯度稀释于细胞培养液，3倍梯度稀释，起始浓度2.22μg/mL。然后，将100μl梯度稀释的抗体/DT3C混合物加至细胞板中，在CO2孵育器中，37℃孵育72小时。结果如图17所示。
表4.人源化A1E4F7D4 mAb的结合亲和力
对于热迁移实验，使用GloMeltTM热迁移蛋白稳定性试剂盒(Biotium，Cat#33022-T)测定Tm(熔融温度)。简而言之，使GloMeltTM染料融化，达到室温。将装有染料的小瓶进行涡旋振荡和离心。然后，通过向95μL PBS中加入5μL 200×染料，制备10×染料。加入2μL 10×染料和10μg人源化抗体，PBS加至20vL总反应体积。简单地旋转含有染料和抗体的管子，并置于实时PCR热循环仪(Roche，LightCycler480II)中，其设置为具有表5参数的熔融曲线程序。结果如图18所示。
表5.熔融曲线程序参数
大概步骤 温度 升温速率 保持时间
初始保持 25℃ NA 30s
熔融曲线 25-99℃ 0.1℃/s NA
huA1E4F7D4-V16对对照基准物-人TROP2结合的阻断活性的结果示于图16中。
表6.人源化mAb的结合亲和力
根据表6所示，抗体huA1E4F7D4-V16显示出与嵌合A1E4F7D4抗体相当的人和猴TROP2蛋白结合亲和力，其高于对照基准物。
从图13和15可以看出，人源化抗体huA1E4F7D4-V16特异性结合人TROP2，EC50低于对照基准物，表明其更高效地与人TROP2蛋白结合。如图14所示，huA1E4F7D4-V16以与对照基准物相当的活性与猴TROP2结合。
如图16所示，人源化抗体huA1E4F7D4-V16没有阻断对照基准物(TROP2 BM1)与人TROP2的结合，表明该抗体很可能结合在与对照基准物(TROP2 BM1)不同的表位。
图17示出，huA1E4F7D4-V16-DT3C偶联物以高于对照基准物-DT3C偶联物的速率被内化，表明huA1E4F7D4-V16-DT3C偶联物更高效地被靶细胞内化，以更高效的方式造成靶细胞死亡。
此外，如图18所示，huA1E4F7D4-V16的熔融温度是71.5℃和87.5℃。
实施例9.人源化抗体huA1E4F7D4-V16的表征
按照上述实施例中的操作流程(修改或不做修改)以及以下所述的操作规程，在Biacore、基于细胞的结合FACS、基于细胞的内化实验和表位聚类ELISA中测试人源化抗体huA1E4F7D4-V16，与德达博妥单抗(Datopotamab，第一三共的TROP2mAb，Dato-DXd，DS-1062a)的类似物作比较，其又称为BM2，内部制备，重链和轻链氨基酸序列分别为SEQ IDNOs：76和77。
对于BIAcore，结果如表7所示。
对于基于细胞的结合FACS，结果如图19所示。
在基于细胞的内化实验中，氨基酸序列为SEQ ID NO：73的DT3C蛋白用于偶联抗体。在细胞培养的次日，将huA1E4F7D4-V16或对照(4.44μg/mL于含10％v/vFBS的FreeStyle293培养液中)与DT3C蛋白(4.44μg/mL于含10％v/v FBS的FreeStyle293培养液中)以1∶1体积比混合，室温孵育30分钟，之后梯度稀释于细胞培养液，3倍梯度稀释，起始浓度为2.22μg/mL。然后，将100μl梯度稀释的抗体/DT3C混合物加至细胞板中，在CO2孵育器中，37℃孵育72小时。结果如图20所示。
结果显示，huA1E4F7D4-V16对人TROP2的结合亲和力，比BM2高100多倍，细胞结合能力比BM2更好，内化速率与BM2相当。
表7.huA1E4F7D4-V16的结合亲和力
表位聚类
表位聚类ELISA用于测定huA1E4F7D4-V16结合的表位与BM1或BM2结合的表位是否在一定程度上重叠。
首先，采用捕获ELISA来确定适合于表位聚类检测的生物素标记的人Trop2蛋白的浓度。简单地说，分别用2μg/mlhuA1E4F7D4-V16、BM1或BM2的PBS溶液包被96孔板，100μl/孔，4℃过夜，用含5％脱脂牛奶的PBST于37℃封闭2小时。板冲洗4次，加入100μl/孔于含2.5％脱脂牛奶的PBST中的梯度稀释的生物素-人Trop2-his蛋白(SEQ ID NO：67，起始浓度为1.3μg/ml，5倍梯度稀释)，37℃孵育40分钟。然后，板冲洗4次，加入100μl/孔HRP-链霉亲和素(Jackson Immuno Research，Cat#016-030-084)。将板于37℃再孵育40分钟。然后，再次洗板，加入100μl/孔TMB，室温显色15分钟，再用50μl1M H2SO4淬灭。读取450nm处的OD值。选取OD450在约2.0处的抗体浓度用于表位聚类检测。
用上述确定的合适浓度，进行表位聚类ELISA。简单地说，分别用100μl BM1(2μg/mL)、BM2(2μg/mL)和huA1E4F7D4-V16(2μg/mL)的PBS溶液包被96孔板，37℃2小时。ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗一次，再于37℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭2小时。在封闭时，将huA1E4F7D4-V16、BM1和BM2分别与人生物素-人Trop2蛋白混合，其中，在混合物中，huA1E4F7D4-V16、BM1和BM2的终浓度为15μg/ml，人生物素-人Trop2蛋白为上述测定的终浓度。将上述混合物于室温孵育40分钟。板冲洗4次后，将抗体/生物素-TROP2-his蛋白混合物加入至抗体包被的板中，每孔100μl，于37℃再孵育40分钟。然后加入100μl/孔HRP-链霉亲和素，孵育40分钟。之后，测定OD450值，计算交叉竞争能力(抗体X的交叉竞争能力(％)＝(抗体X的OD450-空白的OD450)/(无mAb的OD450-空白的OD450)*100％)。
当交叉竞争能力高于80％时，将抗体视为结合在相同表位。
结果如下表8所示。可以看出，huA1E4F7D4-V16没有阻断对照基准物与人TROP2的结合，表明其很可能结合在不同于BM1和BM2的表位。
表8.表位聚类结果
尽管本申请已经结合一个或多个实施方式在以上进行了阐述，应当理解的是，本申请不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可选方案、修改和等同物。所有本文中引用的文献进一步通过引用的方式全文并入。
本申请中的序列总结如下。
***
已经在本发明的优选实施方式中进行了具体阐述，应当理解的是，由上述段落定义的本发明不限于在上述描述中列出的特定细节，可以在不脱离本发明宗旨和范围的情况下做出很多明显的变形。
序列表
<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司
<120> 结合TROP2的抗体及其用途
<130> 55532 00123
<150> US 63/178,741
<151> 2021-04-23
<160> 77
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源、嵌合和人源化A1E4F7D4的VH CDR2
<400> 2
Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
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Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源、嵌合和人源化A1E4F7D4、以及小鼠源A1E11A12D1的VH CDR3
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<213> 人工序列
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Gly
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1H3C5H8E12的VL CDR3
<400> 17
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VH CDR1
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Ser Tyr Gly Val His
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VH CDR2
<400> 19
Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VH CDR3
<400> 20
Asp Gly Asp Tyr Glu Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VL CDR1
<400> 21
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VL CDR2
<400> 22
Leu Ala Ser Asp Gln Asp Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VL CDR3
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Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Asp Tyr Tyr Met Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3的VH CDR2
<400> 25
Tyr Ile Tyr Pro Asn His Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3的VH CDR3
<400> 26
Glu Asn Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3的VL CDR1
<400> 27
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3的VL CDR2
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Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3和小鼠源B1G1F5A3的VL CDR3
<400> 29
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VH CDR1
<400> 30
Asp Tyr Ser Met Asn
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VH CDR2
<400> 31
Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Ser Gly Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VH CDR3
<400> 32
Glu Gln Asp Asn Ser Gly Tyr Cys Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VL CDR1
<400> 33
Arg Ser Ser Leu Asn Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu His
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<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VL CDR2
<400> 34
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VH CDR1
<400> 35
Lys Phe Trp Ile Gly
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VH CDR2
<400> 36
Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VH CDR3
<400> 37
Glu Gly Ser Ser Gly Tyr
1 5
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VL CDR1
<400> 38
Lys Cys Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Gln Glu Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VL CDR2
<400> 39
Trp Ala Ser Ile Arg Glu Pro
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VL CDR3
<400> 40
Gln His Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 41
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1E4F7D4的VH
<400> 41
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggcaaaac ctgggacctc agtgaagatg 60
tcctgcgagg cttctggcta ctcctttact acccactgga tacactggat gaagcagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttttccta gcaatgctta tgctgtttat 180
aatcagaaat tcagggacag ggccataatg actgcagaca gatcctccac tacagcctat 240
atacaactca ccggcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagccagt 300
tactttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 42
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V6、huA1E4F7D4-V11、huA1E4F7D4-V16和huA1E4F7D4-V21
的VH
<400> 42
caagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg cctctggcta cagcttcacc acccactgga tccactgggt gagacaagcc 120
cctggccaag gcctggagtg gattggcacc atcttcccta gcaatgccta tgctgtgtac 180
aatcagaagt tcagagacag agccaccatg acagctgaca caagcatcag cacagcctac 240
attgagctga gcagactgag atctgatgac acagctgtgt actactgtgc tagagctagc 300
tactttgact actggggcca aggcaccaca gtgacagtga gcagc 345
<210> 43
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1E4F7D4的VL
<400> 43
gacatcttgt tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcact 60
ttctcctgca gggccagtca gaacattggc acaagcatac actggtttca gcaaagaaca 120
actggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
agatttagtg gcagtggatc agggacagat tttactcttc acatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cacattatta ctgtcaacat agtcatagct ggccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataca a 321
<210> 44
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1E4F7D4的VH
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr His
20 25 30
Trp Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Ile Met Thr Ala Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V1的VH
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr His
20 25 30
Trp Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Ile Met Thr Ala Asp Arg Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V2-huA1E4F7D4-V4、huA1E4F7D4-V7-huA1E4F7D4-V9、
huA1E4F7D4-V12-huA1E4F7D4-V14、和huA2G10B1C2-V17-huA1E4F7D4-V19
的VH
<220>
<221> 其他特征
<222> (28)..(28)
<223> Xaa可以是Ser或Thr
<220>
<221> 其他特征
<222> (68)..(68)
<223> Xaa可以是Ala或Val
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Thr His
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Xaa Thr Met Thr Ala Asp Arg Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V5、huA1E4F7D4-V6、huA1E4F7D4-V10、huA1E4F7D4-V11、
huA1E4F7D4-V15、huA1E4F7D4-V16、huA1E4F7D4-V20和huA1E4F7D4-V21
的VH
<220>
<221> 其他特征
<222> (72)..(72)
<223> Xaa可以是Arg或Ala
<220>
<221> 其他特征
<222> (74)..(74)
<223> Xaa可以是Arg或Thr
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr His
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Phe Pro Ser Asn Ala Tyr Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Thr Met Thr Xaa Asp Xaa Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1E4F7D4的VL
<400> 48
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Thr Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu His Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala His Tyr Tyr Cys Gln His Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V1-huA1E4F7D4-V6的VL
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是Asp或Glu
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Ile或Val
<220>
<221> 其他特征
<222> (78)..(78)
<223> Xaa可以是Val或Leu
<400> 49
Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V7 - huA1E4F7D4-V21的VL
<220>
<221> 其他特征
<222> (42)..(42)
<223> Xaa可以是Gln或Gly
<220>
<221> 其他特征
<222> (43)..(43)
<223> Xaa可以是Ser或Ala
<220>
<221> 其他特征
<222> (49)..(49)
<223> Xaa可以是Lys或Tyr
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Xaa Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1E11A12D1的VH
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Met Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Tyr Ser Tyr Cys Asp Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1E11A12D1的VL
<400> 52
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Ala
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Tyr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 53
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1H3C5H8E12的VH
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Gly Phe Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1H3C5H8E12的VL
<400> 54
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VH
<400> 55
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Gly Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Asp Tyr Glu Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合A1F1G12A7的VL
<400> 56
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asp Gln Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3的VH
<400> 57
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn His Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源A1B12D2B4E7B3的VL
<400> 58
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 59
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VH
<400> 59
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Asn Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Ser Gly Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gln Asp Asn Ser Gly Tyr Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源B1G1F5A3的VL
<400> 60
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ala Val Arg Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Asn Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VH
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Phe
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Phe Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠源和嵌合C1B3B12D2的VL
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Cys Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Gln Glu Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Met Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Pro Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 63
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huA1E4F7D4-V12 - huA1E4F7D4-V16的VL
<400> 63
gagattgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgagcctgt cccctgggga gagagctacc 60
ctgagctgca gagcttctca gaacattggc acaagcatcc actggtttca gcagaagcct 120
gggggcgccc ctagactgct gatcaagtat gcctctgaga gcatctctgg catccctagc 180
agattctctg gctctggctc tggcacagac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct 240
gaggactttg ctgtgtacta ctgtcagcac agccacagct ggcccttcac ctttggccaa 300
ggcaccaagc tggagatcaa g 321
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合和人源化IgG抗体的重链恒定区
<220>
<221> 其他特征
<222> (97)..(97)
<223> Xaa可以是Arg或Lys
<220>
<221> 其他特征
<222> (239)..(239)
<223> Xaa可以是Glu或Asp
<220>
<221> 其他特征
<222> (241)..(241)
<223> Xaa可以是Met或Leu
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Xaa Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Xaa Glu
225 230 235 240
Xaa Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合和人源化IgG抗体的轻链恒定区
<400> 65
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 66
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TROP2-Fc蛋白
<400> 66
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys His Thr Ala Ala Gln Asp Asn Cys Thr Cys
20 25 30
Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg
35 40 45
Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr
50 55 60
Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met Ser Ala Pro Lys
65 70 75 80
Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn
85 90 95
Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala
100 105 110
Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly
115 120 125
Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu
130 135 140
Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala
145 150 155 160
Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe
165 170 175
Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala Ala Val His Tyr
180 185 190
Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn Thr Ser Gln Lys
195 200 205
Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Glu Arg
210 215 220
Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly Gly Leu Asp Leu
225 230 235 240
Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr
245 250 255
Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg Leu Thr Glu Pro
260 265 270
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 67
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TROP2-his蛋白
<400> 67
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys His Thr Ala Ala Gln Asp Asn Cys Thr Cys
20 25 30
Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg
35 40 45
Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr
50 55 60
Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met Ser Ala Pro Lys
65 70 75 80
Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn
85 90 95
Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala
100 105 110
Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly
115 120 125
Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu
130 135 140
Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala
145 150 155 160
Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe
165 170 175
Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala Ala Val His Tyr
180 185 190
Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn Thr Ser Gln Lys
195 200 205
Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Glu Arg
210 215 220
Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly Gly Leu Asp Leu
225 230 235 240
Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr
245 250 255
Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg Leu Thr His His
260 265 270
His His His His His His His His
275 280
<210> 68
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 赛妥珠类似物的重链
<400> 68
Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 69
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 赛妥珠单抗类似物的轻链
<400> 69
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 70
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TROP2-his蛋白
<400> 70
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Val Ala Val
50 55 60
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Asn Glu His Ala
85 90 95
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105 110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120 125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185 190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200 205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
210 215 220
Tyr Phe Glu Arg Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235 240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250 255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg
260 265 270
His His His His His His His His His His
275 280
<210> 71
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长人TROP2
<400> 71
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val
50 55 60
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala
85 90 95
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105 110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120 125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185 190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200 205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
210 215 220
Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235 240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250 255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg
260 265 270
Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu
275 280 285
Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly
290 295 300
Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu
305 310 315 320
Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325 330 335
<210> 72
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DTTP-1170蛋白
<400> 72
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Lys His Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln
385 390 395 400
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
405 410 415
Ser Asp Thr Ala Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg
420 425 430
Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
435 440 445
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
450 455 460
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Tyr Ser Gly Asn Tyr Tyr Ser Asn Tyr Thr
485 490 495
Val Ala Asn Tyr Gly Thr Thr Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
500 505 510
Ser His His His His His His
515
<210> 73
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DT3C蛋白
<400> 73
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser
20 25 30
Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro
35 40 45
Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly
50 55 60
Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp
65 70 75 80
Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr
100 105 110
Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu
115 120 125
Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu
130 135 140
Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser
145 150 155 160
Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp
165 170 175
Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr
180 185 190
Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala
195 200 205
Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys
210 215 220
Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile
225 230 235 240
Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser
245 250 255
Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu
260 265 270
Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr
275 280 285
Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp
290 295 300
Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu
305 310 315 320
Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val
325 330 335
Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val
340 345 350
Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro
355 360 365
Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val
370 375 380
Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys His Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala
405 410 415
Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu
420 425 430
Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys
435 440 445
Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr
450 455 460
Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val
465 470 475 480
Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val
485 490 495
Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp
500 505 510
Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly
515 520 525
Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val
530 535 540
Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val
545 550 555 560
Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
565 570 575
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln
580 585 590
Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala
595 600 605
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu His His His His His His
610 615 620
<210> 74
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合和人源化IgG抗体的重链恒定区
<400> 74
gcctctacta aagggccctc ggtattcccg ctggcacctt catcaaagtc cacttcagga 60
ggaacagcag cacttggatg tctcgttaag gactatttcc cagaaccagt cactgtttcc 120
tggaattcag gagcacttac atcaggagtg cacacatttc ctgcagtgct tcaatcatca 180
ggactttact cactatcctc ggtagtcacg gtgccttcat catcacttgg aacacaaaca 240
tacatctgca acgtgaacca caaaccttcg aatactaaag tcgataagaa ggtcgagcct 300
aaatcatgcg ataagaccca tacatgccct ccttgccctg cacctgaact tcttggaggg 360
ccgagtgtgt ttctgtttcc tcctaagccc aaggatacac ttatgatctc aagaacacct 420
gaagtgacat gcgtggtggt ggatgtgtca cacgaagatc ctgaagtgaa atttaactgg 480
tacgtggatg gagtggaagt gcacaacgca aagactaagc ctagagaaga acaatacaac 540
tcaacataca gagtggtgtc agtgcttaca gtgcttcacc aagattggct taacggaaag 600
gagtataaat gcaaagtgtc aaacaaagca cttcctgcac ctatcgagaa gactatatca 660
aaagcaaaag gacaacctag agaacctcaa gtgtacacac ttcctccttc aagagatgaa 720
cttacaaaga atcaggtgag tttgacttgc cttgtaaagg gcttctaccc gtcagatatc 780
gcagtggaat gggaatcaaa cggacaacct gagaataatt ataagactac gcctcctgtg 840
cttgattcag atggatcatt cttcttgtat tcaaagttaa cagttgacaa gtctcgttgg 900
caacaaggaa acgtgttcag ctgttcagtg atgcacgaag cacttcacaa ccactacaca 960
cagaagtctc tctcactttc acctggaaag tga 993
<210> 75
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合和人源化IgG抗体的轻链恒定区
<400> 75
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 76
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BM2的重链
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 77
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BM2的轻链
<400> 77
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (20)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与TROP2结合，包含：
(i)重链可变区，其包含VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中所述VH CDR1区、VHCDR2区和VH CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs:1、2和3；(2)SEQ ID NOs:7、8和3；(3)SEQID NOs:12、13和14；(4)SEQ ID NOs:18、19和20；(5)SEQ ID NOs:24、25和26；(6)SEQ IDNOs:30、31和32；或(7)SEQ ID NOs:35、36和37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)轻链可变区，其包含VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中所述VL CDR1区、VLCDR2区和VL CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs:4、5和6；(2)SEQ ID NOs:9、10和11；(3)SEQID NOs:15、16和17；(4)SEQ ID NOs:21、22和23；(5)SEQ ID NOs:27、28和29；(6)SEQ IDNOs:33、34和29；或(7)SEQ ID NOs:38、39和40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NOs:44、45、46(X1＝S、X2＝A；X1＝T、X2＝A；X1＝S、X2＝V)、47(X1＝R、X2＝R；X1＝A、X2＝T)、51、53、55、57、59、或61具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NOs:48、49(X1＝D、X2＝L、X3＝V；X1＝E、X2＝V、X3＝L)、50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K；X1＝G、X2＝A、X3＝K；X1＝G、X2＝S、X3＝Y)、52、54、56、58、60或62具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NOs:44和48；(2)SEQ ID NOs:45和49(X1＝D、X2＝L、X3＝V)；(3)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝A)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(4)SEQ ID NOs:46(X1＝T、X2＝A)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(5)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝V)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(6)SEQ ID NOs:47(X1＝R、X2＝R)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(7)SEQ IDNOs:47(X1＝A、X2＝T)和49(X1＝E、X2＝V、X3＝L)；(8)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝A)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(9)SEQ ID NOs:46(X1＝T、X2＝A)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(10)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝V)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(11)SEQ ID NOs:47(X1＝R、X2＝R)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(12)SEQ ID NOs:47(X1＝A、X2＝T)和50(X1＝Q、X2＝S、X3＝K)；(13)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(14)SEQ ID NOs:46(X1＝T、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(15)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝V)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(16)SEQ ID NOs:47(X1＝R、X2＝R)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(17)SEQID NOs:47(X1＝A、X2＝T)和50(X1＝G、X2＝A、X3＝K)；(18)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(19)SEQ ID NOs:46(X1＝T、X2＝A)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(20)SEQ ID NOs:46(X1＝S、X2＝V)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(21)SEQ ID NOs:47(X1＝R、X2＝R)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(22)SEQ ID NOs:47(X1＝A、X2＝T)和50(X1＝G、X2＝S、X3＝Y)；(23)SEQ ID NOs:51和52；(24)SEQ ID NOs:53和54；(25)SEQ ID NOs:55和56；(26)SEQ ID NOs:57和58；(27)SEQ ID NOs:59和60；或(28)SEQ ID NOs:61和62具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:64(X1＝R、X2＝E、X3＝M；或X1＝K、X2＝D、X3＝L)所示的氨基酸序列，且与所述重链可变区相连，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，且与所述轻链可变区相连。
6.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
7.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)结合人TROP2；(b)结合猴TROP2；和/或(c)由TROP2+细胞内化。
8.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为小鼠源的、嵌合的、或人源化的。
9.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
10.如权利要求9所述的免疫偶联物，其中所述治疗剂为细胞毒素。
11.如权利要求9或10所述的免疫偶联物，其中所述治疗剂为包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的蛋白，或包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的蛋白。
12.一种核酸分子，其编码权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
13.一种表达载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。
14.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的表达载体、或包含整合在其基因组中的权利要求12所述的核酸分子。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求9至11中任一项所述的免疫偶联物、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的表达载体、或权利要求14所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，还包含抗肿瘤剂。
17.权利要求15或16所述的药物组合物在制备一种用于治疗与过度的TROP2信号转导相关的疾病的药物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其中该疾病是癌症。
19.如权利要求17所述的用途，其中该癌症是乳癌、结直肠癌、胃腺癌、食管癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、胰腺导管腺癌、头颈癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、膀胱肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、滤泡状甲状腺癌、或多形性胶质母细胞瘤。
20.一种用于在有需求的受试者中进行癌症成像的方法，包括向受试者施用权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分经放射性标记。
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