CN115803058A - 结合c5的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种与人C5特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。还提供包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒、和药物组合物，以及使用该C5抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

Description

结合C5的抗体及其用途
相关申请和引用并入
本申请要求2020年7月15日提交的美国临时专利申请63/051,966的优先权。
前述申请、在其中引用的或在其审查过程中引用的所有文件(“申请引用文件”)，以及本文中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献资料、专利、公开的专利申请)(“本文引用文件”)，在本文引用文件中引用或提及的所有文件资料，以及在本文中或在本文经引用并入的任意文件中提及的任何制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本文，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入，如同各文件具体且个别地通过引用的方式并入。在本公开中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入，这些Genbank序列为本公开最早有效递交日的序列。
技术领域
本申请大体上涉及分离的单克隆抗体，特别是人源单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与人C5结合，具有高亲和力和功能性。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供可以包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本申请的C5抗体或其抗原结合部分的治疗方法。
背景技术
补体系统是先天免疫系统的一部分，由主要产生自肝脏的血浆蛋白组成。这些补体蛋白相互作用，使病原体易受调理素的作用，并诱导一系列炎症反应，帮助对抗感染。
补体系统的激活可以由三种途径启动，即经典途径、凝集素途径和替代途径，取决于情境的不同，其引起共同的终端途径，其中补体成分5(C5)被C5转化酶切割成C5a和C5b片段(Merle NS et al.，(2015)FrontImmunol.6：262)。C5a片段诱发炎症应答，募集吞噬细胞至感染部位，并激活白细胞、内皮细胞或血小板。C5b片段募集补体成分C6-C9并与其聚合，形成膜攻击复合物(MAC)，其在例如代谢惰性细胞和革兰氏阴性菌的靶细胞的细胞膜上产生大孔，并诱导细胞裂解(Koski CL et al.，(1983)Proc Natl AcadSci USA 80∶3816-3820；Lewis LA and Ram S (2014)Virulence 5：98-126)。对于耐受补体介导裂解的革兰氏阳性菌和代谢活跃细胞，多个MAC插入至靶细胞，诱导细胞钙离子流和随后的细胞凋亡(Cole DS，and Morgan BP.(2003)Clin Sci 1979(104)：455-66)。独立于补体系统，C5还可以被凝血酶在不同于C5转化酶的另一位点切割，生成中间体C5T和C5bT。这些中间体在凝血级联激活时转化为C5a和C5b(Merle NS et al.，(2015)同上)。
为避免在非感染区域的补体激活，以及随之而来的对健康组织的损伤，宿主细胞在细胞膜上表达多种调节性蛋白(Schmidt CQ et al.，(2016)Immunol Rev.(2016)274(2)：152-171)。调节因子减少的凋亡细胞诱导低水平的补体激活，并迅速由吞噬细胞清除(Verbovetski I et al.，(2002)JExp Med 196：1553-1561)。由基因缺陷引起的MAC抑制剂CD59缺乏，可能造成红细胞破坏，引起阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)(Holguin MH etal.，(1989)J Clin Invest 84：1387-1394)。除PNH外，补体系统的失调也与其他溶血性疾病的发病机制有关，例如非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)，其与C3转化酶突变有关，以及炎性疾病，例如重症肌无力，其中MAC的形成被证实是神经肌肉接头处神经传递中断的原因，以及以免疫介导的脱髓鞘和轴突损伤为特征的视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)。
C5抑制剂已被开发用于靶向过量的C5a生成和/或MAC形成。例如，依库珠单抗(eculizumab)，抑制C5切割成C5a和C5b的长效人源化单克隆抗体，已被临床批准用于PNH、aHUS、全身型重症肌无力(gMG)和NMOSD的治疗，并处于HELLP综合症、COVID-19等的临床试验中。瑞武丽珠单抗(Ravulizumab)是依库珠单抗类抗体，具有更长的半衰期，已经批准用于治疗PNH和aHUS。
与依库珠单抗治疗相关的一个主要问题是，用于细菌破坏的MAC的水平降低或者甚至缺乏，以及C5a依赖性吞噬细胞激活的水平降低或者甚至缺乏，导致患流行性脑脊髓膜炎的风险增加(McNamara LA et al.，(2017)Am J Transplant 17：2481-2484；Konar Metal.，(2017)Blood 130：891-899)。据报道，在功能上模拟金黄色葡萄球菌SSL7蛋白C端结构域的C5单域抗体，抑制MAC在宿主细胞上组装，而同时保持杀菌活性。该抗体对C5的低亲和力，排除了其在动物模型中的进一步评估，但具有类似选择性抑制作用的抗体可能是未来筛选的目标(Yatime L et al.，(2018)Front Immunol.9：2822)。依库珠单抗的另一个问题是，某些PNH患者的C5突变，如R885C，导致对依库珠单抗的应答不佳(Nishimura J et al.，(2014)NENGL JMED 370(7)：632-639)。结合不同的C5表位的抗体总是为携带这类C5突变的患者所需。
本申请中任何文件的引用或标示，并不是承认这些文件是本发明的现有技术。
发明内容
本申请提供分离的人源单克隆抗体，或其抗原结合部分，其结合C5(例如，人C5，包括野生型C5和带有R885H突变的C5变体)，与现有技术C5抗体例如依库珠单抗相比，具有相当的(如果不是更高的话)与人和/或猴C5的结合亲和力/能力，以及相当的(如果不是更高的话)对C5切割成C5a和C5b以及随之发生的补体介导的溶血和/或炎症的抑制作用。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括C5蛋白的检测以及与C5a和/或C5b过量生成相关的疾病的治疗和预防，例如溶血性疾病和炎性疾病。
因此，在一个方面，本申请涉及分离的人源单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与C5结合，其具有(i)重链可变区，其可以包含VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中该VHCDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、7和14；(2)SEQ ID NOs：2、8和15；(3)SEQ ID NOs：2、8和16；(4)SEQ ID NOs：3、9和17；(5)SEQ ID NOs：4、10和18；(6)SEQ ID NOs：4、11和18；(7)SEQ ID NOs：4、12和18；(8)SEQ ID NOs：5、12和18；或(9)SEQID NOs：6、13和19具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)轻链可变区，其可以包含VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中该VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：20、25和31；(2)SEQ ID NOs：20、26和32；(3)SEQ ID NOs：20、25和33；(4)SEQ ID NOs：21、27和34；(5)SEQ ID NOs：22、28和35；(6)SEQ ID NOs：23、29和36；或(7)SEQ ID NOs：24、30和37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区具有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，轻链可变区具有VL CDR1区、VLCDR2区和VL CDR3区，其中VH CDR1区、VH CDR2区、VH CDR3区、VL CDR1区、VL CDR2区和VLCDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、7、14、20、25和31；(2)SEQ ID NOs：2、8、15、20、26和32；(3)SEQ ID NOs：2、8、16、20、25和33；(4)SEQ ID NOs：3、9、17、21、27和34；(5)SEQ IDNOs：4、10、18、22、28和35；(6)SEQ ID NOs：4、11、18、22、28和35；(7)SEQ ID NOs：4、12、18、23、29和36；(8)SEQ ID NOs：5、12、18、23、29和36；或(9)SEQ ID NOs：6、13、19、24、30和37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区，其可以包含与SEQ ID NOs：38、39(X1＝I、X2＝I、X3＝S、X4＝F；X1＝L、X2＝M、X3＝G、X4＝L)、40、41(X1＝T、X2＝N；X1＝S、X2＝F)、42(X1＝R；X1＝K)或43具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含轻链可变区，其可以包含与SEQ ID NOs：44(X1＝S、X2＝S、X3＝F；X1＝T、X2＝H、X3＝I)、45、46、47、48或59具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：38和44(X1＝S、X2＝S、X3＝F)；(2)SEQ ID NOs：39(X1＝I、X2＝I、X3＝S、X4＝F)和59；(3)SEQ ID NOs：39(X1＝L、X2＝M、X3＝G、X4＝L)和44(X1＝T、X2＝H、X3＝I)；(4)SEQ ID NOs：40和45；(5)SEQ ID NOs：41(X1＝T、X2＝N)和46；(6)SEQ ID NOs：41(X1＝S、X2＝F)和46；(7)SEQ ID NOs：42(X1＝R)和47；(8)SEQ ID NOs：42(X1＝K)和47；或(9)SEQ ID NOs：43和48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含通过二硫键连接的重链和轻链，该重链可以包含重链可变区和重链恒定区，该轻链可以包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的C端与重链恒定区的N端相连，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端相连，其中重链可变区和轻链可变区可以包含上述氨基酸序列，该抗体或其抗原结合部分与C5结合。重链恒定区可以是人IgG1恒定区，具有例如SEQ ID No：49所示的氨基酸序列，轻链恒定区可以是人κ恒定区，具有例如SEQ ID No：50所示的氨基酸序列。重链恒定区也可以是人IgG2或IgG4恒定区，轻链恒定区可以是人λ恒定区。
在一些实施方式中，本申请的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链组成，其中各重链可以包含上述重链恒定区、重链可变区或CDR序列，各轻链可以包含上述轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中抗体与C5结合。本申请的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型的。在其他实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部位可以是单链可变片段(scFv)抗体、或抗体片段例如Fab或F(ab’)2片段。
本申请还提供双特异性分子，其可以包含本申请的抗体或其抗原结合部分，与具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)连接。本申请还提供免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物，其可以包含本申请抗体或其抗原结合部分，与治疗剂例如细胞毒素相连。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以制备为嵌合抗原受体(CAR)的一部分。还提供免疫细胞，其可以包含该抗原嵌合受体，例如T细胞和NK细胞。本申请的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒结合使用。
本申请还涉及编码本申请抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及可以包含该核酸的表达载体、和可包含该表达载体的宿主细胞。还提供利用该宿主细胞制备本申请的C5抗体或其抗原结合部分的方法，其可以包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。
还提供组合物，其可以包含本申请的抗体或其抗原结合部分、或免疫偶联物、双特异性分子、溶瘤病毒、含CAR的免疫细胞、核酸分子或表达载体，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物还可以包含用于治疗特定疾病的治疗剂，例如抗炎性剂。
在另一方面，本申请提供一种用于治疗与过量C5a和/或C5b生成相关的疾病的方法，其可以包括向受试者施用治疗有效量的本申请组合物。
该疾病可以是补体介导的溶血性疾病。溶血性疾病包括，但不限于，PNH和aHUS。在一些实施方式中，用于治疗溶血性疾病的方法可以包括向受试者施用本申请抗体或其抗原结合部位、或者可选地能够表达该抗体或其抗原结合部分的核酸分子或载体。在一些实施方式中，受试者是人。
疾病可以是补体介导的炎性疾病，例如自身免疫性疾病。炎性疾病包括，但不限于，gMG和NMOSD。在一些实施方式中，用于治疗溶血性疾病的方法可以包括向受试者施用本申请抗体或其抗原结合部位、或者可选地能够表达这些抗体或其抗原结合部分的核酸分子或载体。在一些实施方式中，对患有gMG的受试者还可以施用强的松。在一些实施方式中，对患有NMOSD的受试者还可以施用硫唑嘌呤。在一些实施方式中，受试者是人。
基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
另外，本申请的目标是不在本申请中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本申请并不打算在本申请的范围内包含任何不符合USPTO(35 U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合EPC第53条(c)和EPC细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本申请同族或任何其他同族或任何第三方在先申请中涉及本申请人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。
应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；且术语例如“基本由…组成”或“基本由…构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如它们允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。
附图说明
以下以示例方式给出但不意在将本发明仅限于所述具体实施方式的详细描述，可以结合附图更好地进行理解。
图1A-1C示出在捕获ELISA中抗体A5H1D11A7、A5G2A1A1和A3B4H8H7(A)、A2E12G12H7和A5F3D5A1(B)、A4G10B7A7、A3C8E4H1、A6A1H9B7和A5G9C2C7(C)与人C5的结合力。
图2A-2C示出在间接ELISA中抗体A5H1D11A7、A5G2A1A1和A3B4H8H7(A)、A2E12G12H7和A5F3D5A1(B)、A4G10B7A7、A3C8E4H1、A6A1H9B7和A5G9C2C7(C)与猴C5的结合力。
图3A-3C示出在间接ELISA中抗体A5H1D11A7、A5G2A1A1和A3B4H8H7(A)、A2E12G12H7、A5F3D5A1、A4G10B7A7和A3C8E4H1(B)、A6A1H9B7和A5G9C2C7(C)与突变人C5的结合力。
图4A-4C示出在竞争ELISA中抗体A5H1D11A7、A5G2A1A1和A3B4H8H7(A)、A2E12G12H7和A5F3D5A1(B)、A4G10B7A7、A3C8E4H1、A6A1H9B7和A5G9C2C7(C)阻断依库珠单抗-人C5结合的能力。
图5示出在竞争ELISA中抗体A5H1D11A7阻断帕泽利单抗-人C5结合的能力。
图6A-6B示出抗体A5H1D11A7(A)和A3C8E4H1(B)的蛋白质热迁移检测结果。
图7A-7C示出在基于细胞的功能检测中抗体A5H1D11A7、A2E12G12H7和A5F3D5A1(A)、A4G10B7A7、A3C8E4H1和A6A1H9B7(B)、A5G2A1A1、A3B4H8H7和A5G9C2C7(C)对补体介导的溶血的作用。
图8示出在补体介导的溶血检测中经抗体A5H1D11A7处理的样品的溶血百分比。
图9示出在基于细胞的功能检测中抗体A5H1D11A7和A3C8E4H1对补体介导的溶血的作用。
具体实施方式
为确保更好地理解本申请，首次定义了一些术语。其他的定义贯穿具体描述而给出。
术语“C5”是指补体成分5。术语“C5”可以包括变体、异构体、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人C5蛋白特异的抗体，在某些情况下，可以与人以外物种例如猴的C5蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人C5蛋白特异的抗体可以完全地对人C5蛋白特异，并呈现为与其他物种或其他类型没有交叉反应性，或者可以与某些其他物种但非所有其他物种的C5发生交叉反应。
术语“人C5”是指具有来自人的氨基酸序列的C5蛋白，例如Genbank登录号为AAI13739.1的人C5的氨基酸序列。人C5蛋白可能包含在第885位氨基酸残基的突变。术语“猴C5”或“食蟹猴C5”是指具有来自猕猴的氨基酸序列的C5蛋白，例如NCBI参考号为XP_005580972.1的氨基酸序列。
本文所用的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。完整抗体可以包含经二硫键而内部连接的两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。各重链可以由重链可变区(缩写成VH)和重链恒定区组成。重链恒定区可以由CH1、CH2和CH3这三个结构域组成。各轻链可以由轻链可变区(缩写成VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区可以由CL这一个结构域组成。VH和VL可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着更加保守的称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL由三个CDR区和四个FR区组成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)，的结合。
本文所用的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指抗体上保留有特异性结合抗原(例如C5蛋白)能力的一个或多个片段。已显示出，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，可以包含由铰链区二硫键连接的两个Fab片段形成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)由VH结构域构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，包含单个可变结构域的重链可变区和两个恒定结构域。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由不同的基因编码，它们可以通过重组的方法经合成接头而连接，其中合成的接头使得它们可以制备为单个蛋白链，其中VL和VH配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird etal.，(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段经与完整抗体相同的方式进行应用筛选。
本文所用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，分离出的与C5蛋白特异性结合的抗体，基本不含特异结合C5蛋白之外蛋白的抗体)。然而，分离出的与人C5蛋白特异性结合的抗体可能与其他抗原，例如其他物种的C5蛋白，有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群中得到的抗体，即，包含该群的个体抗体是相同的，除可能以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)外。单克隆抗体是高度特异性的，靶向单一抗原位点。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优势在于其是通过杂交瘤培养而合成的，没有被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”是指该抗体从基本均一的抗体群中获得的特征，不应被解释为需要通过任何特定方法生成抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制成，包括例如杂交瘤方法。
本文所用的术语“人源抗体”意在包括具有骨架和CDR区得自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也得自人种系免疫球蛋白序列。本申请的人源抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，本文所用的术语“人源抗体”不意在包括在人骨架序列中植入得自另一哺乳动物物种种系的CDR序列的抗体。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。
词组“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
如本文所用的，“特异结合人C5”的抗体是指与人C5蛋白(以及可能的来自一种或多种非人物种的C5蛋白)结合但基本不与非C5蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”，即以KD值为5.0×10-8M以下，更优选2.0×10-9M以下，更优选1.0×10-9M以下，结合人C5蛋白。
如本文所用的，术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即，以KD为1×10-6M以上，更优选1×10-5M以上，更优选1×10-4M以上，更优选1×10-3M以上，更优选1×10-2M以上，结合蛋白或细胞。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指抗体对于靶抗原的KD为1.0×10-6M以下，更优选5.0×10-8M以下，更优选3.0×10-8M以下，更优选2.0×10-9M以下，更优选1.0×10-9M以下。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和性”结合可以会变化。例如，IgM同种型的“高亲和性”结合是指抗体的KD为10-6M以下，优选10-7M以下，甚至更优选10-8M以下。
本文所用术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”是指从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)获得的解离常数，表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法确定抗体的KD值。用于确定抗体KD的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如BiacoreTM系统。
术语“EC50”，也称为半最大效应浓度，是指在特定暴露时间后引起在基线和最高值之间的中间值反应的抗体浓度。
术语“IC50”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体而言，抑制50％特定生物学或生化功能的抗体浓度。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如溶血性疾病)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本申请抗体的用量。治疗有效量在所治疗疾病的背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际有效量。
本申请的多个方面在以下小节中作进一步详细描述。
本申请的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的C5抗体例如依库珠单抗相当的(若不是更佳的话)结合亲和力/能力，与人C5特异性结合。
本申请的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的C5抗体例如依库珠单抗相当或更高的活性抑制C5切割成C5a和C5b、以及因而的补体介导的炎症和/或溶血。
本申请的抗体是人源单克隆抗体。
本申请的抗体或其抗原结合部分入后所述以及在之后实施例中进行结构和化学表征。抗体的重/轻链可变区的氨基酸序列ID编号总结于以上表1中，一些抗体享有同一VH或VL。抗体的重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的人IgG1重链恒定区，抗体的轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的人κ恒定区。本申请的抗体也可以包含人IgG4重链恒定区和人λ轻链恒定区。
表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR已由Kabat编号体系确定。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列经其他体系例如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号体系/方法确定。
结合人C5的其他C5抗体的VH和VL序列(或CDR序列)可以与本公开的C5抗体的VH和VL序列(或CDR序列)“混合和匹配”。优选地，当VH和VL链(或这些链中的CDR)混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构上相似的VH序列代替。同样地，优选来自特定VH/VL配对的VL序列经结构类似的VL序列替换。
因此，在一个实施例中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以包括：
(a)可以包含上述表1中所列氨基酸序列的重链可变区；和
(b)可以包含上述表1中所列氨基酸序列的轻链可变区、或另一C5抗体的VL，其中该抗体特异性结合人C5。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以包括：
(a)列于上述表l中的重链可变区的CDRl、CDR2和CDR3；以及
(b)列于上述表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一C5抗体的CDR，其中该抗体特异结合人C5。
在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括C5抗体的重链可变CDR2区，结合有其他结合人C5抗体的CDR区，例如不同C5抗体的重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或轻链可变区CDRl、CDR2和或CDR3。
另外，如本领域所公知的，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对同源抗原的结合特异性，且基于相同的CDR3序列，可预见能产生具有相同结合特异性的多个抗体。参见例如Klimka et al.，British J.ofCancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J. Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi etal.，J. Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J. Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)以及Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)。也可参见美国专利6,951,646；6,914,128；6,090,38；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一个都通过引用的方式整体并入本文。
Figure BDA0004045568770000101
因而，在另一个实施方式中，本申请的抗体包含C5抗体重链可变区的CDR2，至少地C5抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一C5抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体可以与人C5特异性结合。优选这些抗体(a)竞争结合C5；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请C5抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含C5抗体轻链可变区的CDR2、或另一C5抗体轻链可变区的CDR2，其中该抗体能够与人C5特异性结合。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包含C5抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，或另一C5抗体重链和/或轻链可变区的CDR1，其中该抗体可以与人C5特异性结合。
在另一个实施方式中，本申请的抗体包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链和/或轻链可变区序列，其与本申请的C5抗体的可变区相比，区别在于具有一种或多个保守修饰。如本领域所理解的，可以进行一些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell etal.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835—41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6和Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
因而，在一个实施方式中，抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和/或具有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1序列可以包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
(b)重链可变区CDR2序列可以包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
(c)重链可变区CDR3序列可以包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3序列可以包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和
(e)该抗体特异结合人C5。
本申请的抗体具有以下一个或多个上述功能特点，例如与人C5高结合亲和力、以及对C5-IL6结合的阻断活性。
在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、人源化或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守的序列修饰”是指不会显著影响或改变含有这类氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。已定义出领域内具有相似侧链的氨基酸残基组。这些组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改造后的抗体可以使用本文所述的功能检测测试其保留下来的功能(即上述的功能)。
本申请的抗体可以用具备本申请C5抗体的一个或多个vH/VL序列的抗体为起始原料，制备成修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰。此外以及可选地，抗体可以通过修饰恒定区的残基来进行工程改造，以例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR植入可以用来工程改造抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，在个体抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，可以通过构建包含有将来自特定天然抗体的CDR序列植入到具有不同特性的不同抗体的骨架序列中的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体。(参见例如Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad。又参见U.S.A.86：10029-10033；美国专利5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6，180,370)。
因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDRl、CDR2和CDR3序列，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDRl、CDR2和CDR3序列。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的VH和VLCDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。
这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在VBase人种系序列数据库获得(可得自www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，也可以在Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836获得；上述文件各自的内容通过引用的方式明确并入本文。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7HuMAb小鼠中的重链种系序列可得自所附的Genbank登录号1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12HuMAb小鼠的重链种系序列可得自Genbank登录号1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)&3-23(AJ406678)。
通过使用本领域公知的称为空格BLAST的序列相似性搜索方法(Altschull etal.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与汇编蛋白序列数据库进行比较。
用于本申请抗体的优选骨架序列，是结构上与本申请抗体所用的骨架序列结构相似的那些。VH CDR1、CDR2和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到与种系序列相比包含一个或多个突变的骨架区中。例如，发现了，在一些情况下，为保持或增强抗体的抗原结合能力，将骨架区中突变残基是有益的(参见例如美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类的可变区修饰是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入(本领域所知的)保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常对CDR区的改变不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
因而，在另一实施方式中，本申请提供分离的C5单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，其可以包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
本申请的基因改造抗体包括，例如为提高抗体性能，对VH和/或VL的骨架残基中做出基因修饰的抗体。通常而言，做出这些骨架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于已得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过比较抗体骨架序列和得到抗体的种系序列而识别出来。
另一类的骨架修饰涉及对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体潜在的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
此外，或者作为骨架或CDR区内修饰的另一种选择，本申请的抗体可以基因修饰成包含Fc区内的修饰，通常是为改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，可以对本申请的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学基团)，或者修饰成改变其糖基化，同样是为改变抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方式中，CH1铰链区经修饰，改变，例如增加或减少，铰链区半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中作进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，抗体的Fc铰链区经突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域连接区，从而相较于与天然Fc-铰链结构域的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合，该抗体具有削弱的SpA结合。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
另外地或者可选地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。经证实，这些改变的糖基化形式增加或降低抗体的ADCC活性。这样的糖基化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而完成。糖基化系统改变的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。使用两种替换载体靶向破坏CHO/DG44细胞的FUT8基因，制备Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见美国专利20040110704和Yamane-Ohnuki etal.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了具有功能破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，从而通过降低或消除α-1，6键相关酶，在该细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的向结合抗体Fc区的N-乙酰氨基葡萄糖中添加岩藻糖的活性，或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开文本WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其向Asn(297)-连接糖添加岩藻糖的能力降低，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如在PCT公开文本WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。在植物体系中制备抗体的方法在对应Alston&Bird LLP律师记录号040989/314911的2006年8月11日提交的美国专利申请中有过记载。可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。
包含在本申请中的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的活性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与活性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。蛋白聚乙二醇化的方法在本领域内已知，且可以应用于本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同分类。
例如，抗体可以在轻链或者重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起抗体的免疫原性增高，或由于抗原结合的改变引起抗体的pK变化(Marshallet al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)JExp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选不包含可变区糖基化的C5抗体。这可以通过选择在可变区不包含糖基化基序的抗体或者通过使糖基化区域内的残基发生突变来实现。
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在N-G或D-G序列处，引起异天冬氨酸残基的生成，其向多肽链引入链接并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
各抗体将具有独特的等电点(pI)，其基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选pI值落在正常范围内的C5抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。
在另一方面，本申请提供编码本申请抗体重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解液中或处于部分纯化或基本纯化的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或者其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“处于基本纯化的状态”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可以不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，下文会进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，可以从基因库中回收编码这类抗体的核苷酸。
优选的本申请核酸分子包括编码C5单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在上下文中使用术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而使这两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框内。
编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以表达成一个连续的单链蛋白，其中VL和VH区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(990)Nature 348：552-554)。
可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的本领域所公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术制备本申请的单克隆抗体(mAbs)。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合的或人源化的抗体是本领域公知的。参见，例如美国专利4,816,567、5,225,539、5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370，上述文件的内容通过引用的方式整体并入本文。
本申请的抗体还可以使用例如本领域所公知的重组DNA技术与基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将通过标准分子生物技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到一个或多个表达载体中，从而使基因可操作地与转录和翻译调控序列相连接。在此背景下，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，从而使载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。
术语“调控序列”意在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。选择与使用的表达宿主细胞兼容的表达载体和表达控制序列。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，通过将可变区插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来构建任意抗体同种型的全长抗体基因，从而VH部分与载体中的CH部分可操作地连接，VL部分与载体中的CL部分可操作地连接。此外或者另外，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽可以在框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如，在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5，179,017)。例如，通常而言，可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素、或甲氨喋呤的抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨喋呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”意在包括多种将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的常用技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，在真核细胞中表达抗体是最优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞，因为这些真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌出适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起使用的dhfr-CHO细胞，dhfr-CHO细胞在Urlaub andChasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中有过描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以在宿主细胞中表达抗体的时间，或优选将抗体分泌在宿主细胞生长的培养液中，来制备抗体。使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
另一方面，本公开涉及双特异性分子，其可以包含一个或多个本申请抗体与至少一个其他功能性分子例如另一个肽或蛋白(例如另一抗体或受体的配体)相连，以生成与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用的，“双特异性分子”包括有三种或更多种特异性的分子。
在实施方式中，除Fc结合特异性和C5结合特异性外，双特异性分子还具有第三种特异性。第三种特异性可以是针对另一种补体蛋白，如C3，可以更好地抑制补体介导的炎症和/或溶血。
双特异性分子可以以多种不同形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两条结合臂且各臂具有不同特异性，而非具有两条相同特异性的结合臂外。在另一个极端的是，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv′s)构成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学方法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，BioconjugateChemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)，以及其中引用的文献。
本申请的抗体可以与治疗剂结合，形成例如抗体-药物偶联物(ADC)的免疫偶联物。合适的治疗剂包括抗炎剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过可切割的接头结合，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、A1a-Asn-Val、Val-Leu-Lys、A1a-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7，129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中的描述进行制备。
本文还提供包含C5scFv的嵌合抗原受体(CAR)，该C5scFv包含本文所述的CDR和重/轻链可变区。
C5CAR可以包含(a)包含C5scFv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号结构域。
CAR可以在胞外抗原结合域的N-端含有指导新生受体进入内质网的信号肽、，以及在胞外抗原结合域的N-端的使受体更容易结合的铰链肽。CAR优选地在胞内信号传导结构域包含主要的胞内信号传导域和一个或多个共刺激信号传导域。主要使用的和最有效的主要胞内信号传导域是包含ITAM的CD3-ζ胞质结构域，其磷酸化会引起T细胞活化。共刺激信号传导域可以衍生自共刺激蛋白，例如CD28、CD137和OX40。
CAR还可以添加增强T细胞扩增、持久性和抗肿瘤活性的因子，例如细胞因子、和共刺激配体。
还提供基因改造的免疫效应细胞，其可以包含本文提供的CAR。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞、或胚胎干细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞。
在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其可以包含与药学上可接受的载体配制在一起的本申请的一种或多种抗体(或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)。当组合物中含有多于一种的抗体(或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)时，抗体(或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)可以单独给药。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的活性成分，例如另一抗体或药物，例如抗炎性剂。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。在Gennaro，ed.，Remington：The Science andPractice ofPharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中，对合适赋形剂的选择和使用有所讲解，其公开内容通过引用的方式并入本文。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输液)。基于给药途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其免受酸和其他可能使其失活的自然条件的影响。本文所用的术语“肠道外给药”是指非肠内和非局部外用的给药方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外的途径给药，例如外用、表皮或粘膜给药，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构中。
可以与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定给药方式而变，且通常是产生疗效的组合物的量。基本而言，以百分比计，该量是与药学上可接受载体组合在一起的约0.01％-约99％，优选约0.1％-约70％，最优选约1％PC约30％的有效成分。
调整给药方案以提供最佳的所需的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随着时间的推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度按比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀，配置剂量单位型的肠道外组合物。本文所用的剂量单位型是指物理上不连续的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与所需药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的给药频率降低。
对于组合物的给药，剂量范围可以为约0.0001-100mg/kg，通常为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以是按体重0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、或10mg/kg或在1—10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三至六个月一次。本申请C5抗体的最优剂量方案为按体重1mg/kg或3mg/kg，使用下述给药时间表中的一种方式静脉注射抗体：(i)每四周注射六次，然后每三个月注射一次；(ii)每三周一次；(iii)按体重3mg/kg注射一次，后按体重1mg/kg每三周一次。在实施方式中，调整剂量，保证血液中抗体浓度在约1-1000μg/ml，在一些方法中为25-300μg/ml。
“治疗有效剂量”的本申请C5抗体或其抗原结合部位、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物，优选地引起疾病症状严重程度的降低，疾病无症状期频率和持久度的增加、或预防疾病折磨造成的损伤或残疾。
药物组合物可以是控释剂型，包括植入体、经皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems.J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)，其公开内容通过引用的方式并入本文。
在某些实施方式中，可以配制本申请的单克隆抗体或其抗原结合部位，以确保在体内的合适分布。例如，为确保本申请的治疗抗体或其抗原结合部位可以穿越血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physio1.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Bio1.Chem.269：9090；Keinanen andLaukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
可以包含本申请的抗体或抗原结合部位、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物的药物组合物具有多种体内和体外用途，涉及例如具有过度C5a和/或C5b产生的炎性疾病或溶血性疾病的治疗。
基于本申请的C5抗体的抑制C5切割成C5a和C5b的能力，本申请提供用于治疗补体介导的炎性疾病例如自身免疫性疾病的方法，其可以包括向受试者施用本申请的药物组合物。炎性疾病包括，但不限于，gMG和NMOSD。
在另一方面，基于本申请的C5抗体的抑制C5切割成C5a和C5b的能力，本申请提供用于治疗补体介导的溶血性疾病的方法，其可以包括向受试者施用本申请的药物组合物。溶血性疾病包括，但不限于，PNH和aHUS。
在一方面，本申请提供联合疗法，其中本申请的药物组合物与对缓解炎症有效的一种或多种其他药物联合施用。这类药物可以是用于gMG患者的强的松、或用于NMOSD患者的硫唑嘌呤。在某些实施方式中，受试者是人。
本文讨论的治疗剂的联用可以作为在药学上可接受载体中的单一组分同步给药，或者作为各药物处于药学上可接受载体中的单独组合物同步给药。根据另一个实施方式，治疗剂的联用可以是按序施用。
此外，如果多于一剂的联合疗法需按序施用，按序给药的顺序可以在每个给药时间点颠倒或者保持相同的顺序，按序给药可以与同步给药相结合，或者任意组合。
尽管已经对本申请及其优势进行了详细的阐述，应当理解的是，可以在不脱离在所附权利要求中限定的本发明宗旨和范围的情况下，在本文中做出多种改变、替换和变动。
本申请通过以下实施例进一步阐明，实施例不应当解读为进一步的限制。所有图片和本申请中引用的参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用的方式明确地全部并入本文。
实施例
实施例1.使用杂交瘤技术生成人源C5单克隆抗体
免疫
使用转基因小鼠平台CAMouseHG(HG5042，重庆金迈博生物科技有限公司)制备全人源抗体。根据E Harlow，D.Lane，Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998中所述的方法免疫转基因小鼠。将重组人C5蛋白(Sino biological Inc.，Cat#13416-H18H)用作免疫原，并用于抗血清效价的确定和分泌抗原特异性抗体的杂交瘤的筛选。对于初次免疫，免疫剂量包含50μg人C5蛋白/小鼠/注射，对于增强免疫，为25μg人C5蛋白/小鼠/注射。为增加免疫应答，在初次免疫和增强免疫中分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma，St.Louis，Mo.，USA)。简而言之，如下制备佐剂-抗原混合物。首先，使用涡旋混合器在小瓶中轻柔地混合佐剂。将所需量的佐剂转移到高压灭菌的1.5mL微量离心管中。将抗原以0.25-0.5mg/ml的浓度配制在PBS或盐水中。然后将计算量的抗原加到含有佐剂的微量离心管中，经轻柔地涡旋2分钟混合所得溶液，形成油包水乳状液。之后将佐剂-抗原乳化物抽吸到合适的注射器中，进行动物注射。以150-200μl的体积，共注射50μg或25μg抗原。对各个动物进行免疫，之后基于抗血清效价进行3-4次加强。在杂交瘤融合前，通过腹腔注射对具有较好效价的动物进行最后一次加强。
杂交瘤融合和筛选
培养小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，ATCC#CRL-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。以无菌方式制备免疫小鼠脾细胞，并根据Kohler G，and Milstein C，”Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity,”Nature，256：495-497(1975)中提到的方法与小鼠骨髓瘤细胞融合。之后将融合的“杂交细胞”在DMEM/20％FCS/HAT培养基中于96孔细胞板铺板。融合后的7-10天，在显微镜下观察存活的杂交瘤群落。在两周后，使用人C5蛋白(Sino biological Inc.，Cat#13416-H18H)，对各孔的上清液进行捕获ELISA。选出分泌与人C5蛋白结合的抗体的阳性杂交瘤，并转移到24孔板中。对杂交瘤进一步测试，通过有限稀释，对产生显示出人C5高特异性结合力和补体介导溶血阻断活性的抗体的那些进行亚克隆，以确保细胞系的单克隆源性。之后，纯化单克隆抗体。简单而言，使用5-10倍柱体积的PBS缓冲液，冲洗蛋白A琼脂糖色谱柱(Cat#AA0273，bestchrom(Shanghai)Biosciences)。使本申请各单克隆杂交瘤的细胞上清液流经柱子，然后用PBS缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)的1.5mL管中。将含有免疫球蛋白的部分集中，并于4℃在PBS中透析过夜。
随后，如下所述对纯化的单克隆抗体的体外功能活性进行表征。
实施例2.使用BIACORE表面等离子体共振对C5单克隆抗体的结合亲和力确定
经Biacore T200系统(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)对实施例1中生成的纯化C5单克隆抗体(mAb)进行结合亲和力和结合动力学表征。
简而言之，使用Biacore提供的标准胺偶联试剂盒(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)，将山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)经伯胺共价连接到CM5芯片(羧甲基右旋糖包被芯片，GE healthcare，Cat#BR-1005-30)。生物传感器表面未反应的基团用乙醇胺阻断。然后，使浓度13.3nM的纯化的本申请C5抗体和13.3nM的C5对照基准物抗体(依库珠单抗，内部制备，重链和轻链氨基酸序列为SEQ ID NOs：51和52；可伐利单抗(Crovalimab)，内部制备，重链和轻链氨基酸序列为SEQ ID NOs：55和56；帕泽利单抗(Pozelimab)，内部制备，重链和轻链氨基酸序列为SEQ ID NOs：57和58)，分别流至芯片，流速为10μl/min。三个C5对照基准物抗体的序列信息来自公开网站(https：//tabs.craic.com)。然后，将梯度稀释的重组人C5-his蛋白(Sino Biological Inc.，Cat#13416-H18H)、猴C5-his蛋白(Acro biosystems，Cat#CO5-C52Hx)、或突变人C5(R885H)-his蛋白(Acro biosystems，Cat#CO5-H52Hx)(80.0nM-2.5nM，2倍梯度稀释于HBS-EP+缓冲液)，以30μl/min的流速流到芯片上。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用BIAcore评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1Langmuir结合模型中。确定KD、Ka和Kd值，并总结在以下表2-1和表2-2中。
表2-1.C5抗体与人C5和猴C5的结合亲和力
Figure BDA0004045568770000221
所有本申请的C5抗体，以比对照基准物抗体相当或略高的结合亲和力，与野生型以及突变的人C5蛋白特异性结合，A3C8E4H1和A5H1D11A7示出最高的结合亲和力。
本申请所有的C5抗体与猴C5特异性结合，而对照基准物依库珠单抗不与其结合。
表2-2.C5抗体与突变人C5的结合亲和力
Figure BDA0004045568770000231
实施例3.C5抗体的结合活性
通过捕获ELISA和间接ELISA，对本申请抗体进一步测试其与C5的结合力。
3.1捕获ELISA
简而言之，用PBS中的2μg/ml亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗人IgG(JacksonImmuno Research，Cat#109-005-098)包被96微孔板，100μl/孔，37℃2小时。板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温-20，PBST)冲洗，再于4℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭过夜。再次冲洗板，分别与100μl/孔梯度稀释的本申请C5抗体、依库珠单抗和hIgG(静脉注射用人免疫球蛋白(pH 4)，华兰生物工程有限公司)(起始于66.7nM，5倍稀释于含2.5％脱脂牛奶的PBST)，37℃孵育40分钟，再次冲洗4次。含有捕获抗体的板与100μl/孔生物素标记的人C5-his蛋白(Sino biological Inc.，Cat#13416-H18H，0.99nM，于含2.5％脱脂牛奶的PBST中)，37℃孵育40分钟，洗涤4次，与链霉亲和素结合的HRP(1：5000稀释于PBST，Jackson Immuno Research Laboratories，Inc，Cat#016-030-084，100μl/孔)，于37℃孵育40分钟。在终洗后，板与100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，Cat#TMB-S-002)孵育。在室温3分钟后用50μl/孔1M H2SO4中止反应。在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC50值。
3.2间接ELISA
检测C5抗体与猴或人C5突变蛋白的交叉反应。
简而言之，用100μl/孔于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的1μg/ml猴C5-his蛋白(Acro biosystems，Cat#CO5-C52Hx)或2μg/m1人C5(R885H)-his蛋白(Acrobiosystems，Cat#CO5-H52Hx)包被96孔微孔板，37℃，2小时。ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温-20，PBST)冲洗，再于4℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭过夜。再次冲洗板，与100μl/孔梯度稀释的本申请C5抗体或对照(66.7-0.64nM，5倍梯度稀释于含2.5％脱脂牛奶的PBST)于37℃孵育40分钟。ELISA板冲洗4次，与100μl/孔过氧化物酶亲和纯化F(ab′)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异(1：5000稀释于PBST缓冲液，Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.，Cat#109-036-098)于37℃孵育40分钟。在终洗后，板与100μl/孔TMB(Innoreagents，Cat#TMB-S-002)孵育。在室温3分钟后用50μl/孔1M H25O4中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC50值。
两个检测的结果示于图1A-1C至3A-3C。
从图1A-1C可以看出，本申请的所有抗体，以比依库珠单抗更低的EC50和更高的Bmax(最大结合)，与人C5结合。
图2A-2C示出，本申请所有的抗体，以低EC50和高Bmax(最大结合)结合猴C5，依库珠单抗不与猴C5蛋白结合。
而且，如图3A-3C所示，本申请所有的抗体，以低EC50和高的Bmax(最大结合)结合突变人C5(R885H)蛋白，具有，而依库珠单抗不与突变人C5(R885H)蛋白结合。
实施例4.C5抗体对C5-对照基准物结合的阻断活性
在竞争ELISA检测中，测定本申请C5抗体阻断依库珠单抗-人C5结合的能力。
简而言之，将于PBS中的2μg/mL依库珠单抗包被于96孔微孔板，100μl每孔，37℃，2小时。之后板用清洗缓冲液冲洗，并于4℃用含5％w/v脱脂牛奶的PBST封闭过夜。次日，将本申请的C5抗体或对照用生物素标记的人C5-his蛋白(Sino biological Inc.，Cat#13416-H18H，0.99nM于含2.5％脱脂牛奶的PBST中)稀释，起始于80nM，4倍梯度稀释，室温孵育40分钟。冲洗板后，将抗体/C5-his混合物加至依库珠单抗包被板中，100μl每孔。37℃孵育40分钟后，用清洗缓冲液冲洗板。之后向板加入100μl/孔链霉亲和素结合的HRP，37℃孵育40分钟，检测结合于依库珠单抗的生物素标记的人C5-his。用洗涤缓冲液再次洗板。最后，加入TMB，用1M H2SO4中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC50值。
还在竞争ELISA检测中，测定本申请抗体A5H1D11A7阻断帕泽利单抗-人C5蛋白结合的能力。简而言之，用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的2μg/mL帕泽利单抗包被96孔微孔板，100μl/孔，4℃孵育过夜。ELISA板用清洗缓冲液(PBS+0.05％吐温-20，PBST)冲洗一次，之后于37℃用200μl/孔封闭缓冲液(5％w/v含脱脂牛奶的PBST)封闭2小时。封闭时，将本申请的C5抗体A5H1D11A7或对照用人C5(R885H)-his蛋白(Acro biosystems，Cat#CO5-H52Hx，40ng/mL于含2.5％脱脂牛奶的PBST中)稀释，起始于66.7nM，4倍梯度稀释，室温孵育40分钟。冲洗板后，将抗体/C5蛋白混合物加至帕泽利单抗包被板中，100μl每孔。37℃孵育40分钟后，用洗涤缓冲液冲洗板。之后向板加入100μl/孔结合HRP的抗His-标签抗体(Sinobiological，Cat#：105327-MM02T-H)，37℃孵育40分钟，检测结合于帕泽利单抗的人C5(R885H)-his。用洗涤缓冲液再次洗板。最后，加入TMB，用1M H2SO4中止反应。在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC50值。
结果如图4A-4C和图5所示。
从图4A-4C可以看出，本申请的C5抗体不能或仅能部分地阻断人C5-依库珠单抗相互作用，表明它们可能结合在与依库珠单抗不同的表位。
图5示出，C5抗体A5H1D11A7能够阻断C5与帕泽利单抗结合，表明抗体A5H1D11A7很可能与帕泽利单抗结合在相同或相似的表位。
实施例5.C5抗体的热稳定性
测试C5抗体A5H1D11A7和A3C8E4H1的热稳定性。简而言之，使用GloMeltTM热迁移蛋白稳定性试剂盒(Biotium，Cat#33022-T)，通过蛋白热迁移法测定Tm(熔融温度)。使GloMeltTM染料融化，达到室温。将装有染料的小瓶进行涡旋振荡和离心。然后，通过向95μLPBS中加入5μL 200×染料，制备10×染料。之后，向10μg抗体加入2μL 10×染料，之后将PBS加至20μL的总反应体积。简单地旋转含有染料和抗体的管子，并置于实时PCR热循环仪(Roche，LightCycler 48011)中，其设置为具有表3参数的熔融曲线程序。
表3.熔融曲线程序的参数
大概步骤 温度 升温速率 保持时间
初始保持 25℃ NA 30s
熔融曲线 25-99℃ 0.1℃/s NA
结果如图6A-6B和表4所示，表明这两个抗体在人体内很可能是稳定的。
表4.C5抗体的熔融温度
Figure BDA0004045568770000251
实施例6.C5抗体对补体介导的溶血的抑制作用
进一步对本申请C5抗体检测其对补体介导的溶血的抑制作用。
简而言之，将绵羊血红细胞(sRBC)(Zhengzhou Baiji biological Inc.，Cat#C0001)用含0.5nM MgCl2和0.15nM CaCl2的明胶/弗洛拿缓冲的生理盐水(GVB++)冲洗5次，以5.87×108个细胞/mL重新悬浮在同一缓冲液中。然后，将细胞混悬液与兔抗绵羊RBC免疫球蛋白(Zhengzhou Baiji biological Inc.，Cat#A0001，1∶1000稀释于GVB++)以1∶1体积比混合，37℃孵育30分钟。用GVB++冲洗细胞两次，在同一缓冲液中重悬，2×108个细胞/mL。向另外的圆底96孔微孔板中，向50μL含3％正常人血清(Geminibiological Inc.，Cat#100-512)的GVB++加入50μL梯度稀释的本申请C5抗体或对照(包含内部制备的CD22抗体作为阴性对照)(起始于1200nM，3倍梯度稀释于GVB++)，室温孵育30分钟。然后，向血清/抗体中加入50μL含增敏sRBC的悬浮液，每孔共150μL(正常人血清的最终比例为1％)，将所得混合物于37℃孵育1小时。孵育后，板于4℃以3000rpm离心5分钟。将上清液转移到平底96孔微孔板的孔中，于412nm进行OD测量。溶血百分比定义为100×[(OD抗体-OD背景)/(OD无抗体-OD背景)]。使用Graphpad Prism软件分析数据，得出IC50值。
结果如图7A-7C所示。
可以看出，本申请C5抗体能够以与依库珠单抗相比相当或略高的抑制活性抑制补体介导的溶血。
按照上述操作规程(略作修改)，对C5抗体A5H1D11A7再次测试其对补体介导的溶血的抑制作用，与现有技术C5抗体，包括依库珠单抗、瑞武丽珠单抗(内部制备，重链和轻链氨基酸序列为SEQ ID NOs：53和54)、可伐利单抗和帕泽利单抗进行比较。
简而言之，使用100％正常人血清(Gemini biological inc.，Cat#100-512)替代3％的正常人血清，50μl/孔；本申请C5抗体和对照制备时，2倍梯度稀释于GVB++，起始浓度为1800nM。
结果如图8所示。
根据图8，C5抗体A5H1D11A7显示出显著高于所有现有技术C5抗体的对于补体介导溶血的抑制作用。
按照上述操作规程(略作修改)，再次测试C5抗体A5H1D11A7和A3C8E4H1相对于现有技术C5抗体依库珠单抗的对补体介导溶血的抑制作用。具体而言，使用50％正常人血清(Gemini biological inc.，Cat#100-512)替代3％正常人血清，50μl/孔；将本申请C5抗体和对照在制备时2倍梯度稀释于GVB++，起始浓度为600nM。结果如图9所示。
根据图9，A5H1D11A7和A3C8E4H1的曲线几乎完全重叠，IC50值相近。此外，A5H1D11A7和A3C8E4H1显示出比依库珠单抗更高的对于补体介导溶血的抑制力。
实施例7.C5抗体的测序
对本申请C5抗体进行测序，得到完整的重链和轻链可变区序列和恒定区序列。重链和轻链可变区的序列ID NO列于表1，且通过数据库序列比对，确定重链和轻链的同种型分别为人igG1和κ。
尽管本申请已经结合一个或多个实施方式进行了阐述，应当理解的是，本申请不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖可以包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可选方案、修改和等同物。所有本文中引用的参考文进一步通过引用的方式全文并入。
本申请中的序列总结如下。
Figure BDA0004045568770000271
Figure BDA0004045568770000281
Figure BDA0004045568770000291
Figure BDA0004045568770000301
Figure BDA0004045568770000311
Figure BDA0004045568770000321
Figure BDA0004045568770000331
Figure BDA0004045568770000341
***
已经在本申请的优选实施方式中进行了具体阐述，应当理解的是，由上述段落定义的本发明不限于在上述描述中列出的特定细节，可以在不脱离本发明宗旨或范围的情况下做出很多明显的变形。
序列表
<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司
<120> 结合C5的抗体及其用途
<130> 55532 00038
<150> US 63/051,966
<151> 2020-07-15
<160> 59
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7的VH CDR1
<400> 1
Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1和A3C8E4H1的VH CDR1
<400> 2
Ser Gly Ser Phe Tyr Trp Ser
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VH CDR1
<400> 3
Gly Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7、A6A1H9B7、和A4G10B7A7的VH CDR1
<400> 4
Ser Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5F3D5A1的VH CDR1
<400> 5
Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VH CDR1
<400> 6
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7的VH CDR2
<400> 7
His Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1和A3C8E4H1的VH CDR2
<400> 8
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VH CDR2
<400> 9
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7的VH CDR2
<400> 10
Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A6A1H9B7的VH CDR2
<400> 11
Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Ser Asn Phe Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A4G10B7A7和A5F3D5A1的VH CDR2
<400> 12
Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VH CDR2
<400> 13
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7的VH CDR3
<400> 14
Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Leu Asp Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1的VH CDR3
<400> 15
Gly Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3C8E4H1的VH CDR3
<400> 16
Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VH CDR3
<400> 17
Arg Ala Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7、A6A1H9B7、A4G10B7A7、和A5F3D5A1
的VH CDR3
<400> 18
His His Pro Ile Leu Ala Thr Ile Ser Pro Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VH CDR3
<400> 19
Glu Gly Leu Val Gly Val Ile His Gly Trp Asp Val
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7、A5G2A1A1和A3C8E4H1的VL CDR1
<400> 20
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asp Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VL CDR1
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7和A6A1H9B7的VL CDR1
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A4G10B7A7和A5F3D5A1的VL CDR1
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VL CDR1
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7和A3C8E4H1的VL CDR2
<400> 25
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1的VL CDR2
<400> 26
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VL CDR2
<400> 27
Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7和A6A1H9B7的VL CDR2
<400> 28
Gly Ala Ile Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A4G10B7A7和A5F3D5A1的VL CDR2
<400> 29
Ala Thr Ile Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VL CDR2
<400> 30
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7的VL CDR3
<400> 31
Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1的VL CDR3
<400> 32
Leu Gln Asp Asn Asn Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3C8E4H1的VL CDR3
<400> 33
Leu Gln Asp His Asn Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VL CDR3
<400> 34
Gln Gln Ala Asn Thr Phe Pro Leu Ile
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7和A6A1H9B7的VL CDR3
<400> 35
Gln Tyr Tyr Gly Ile Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A4G10B7A7和A5F3D5A1的VL CDR3
<400> 36
Gln Lys Tyr Ser Ile Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VL CDR3
<400> 37
Gln Gln Tyr Asn Ser Asn Ser Arg Thr
1 5
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7的VH
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Leu Asp Asn Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1和A3C8E4H1的VH
<220>
<221> 其他特征
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可以是Ile或Leu
<220>
<221> 其他特征
<222> (71)..(71)
<223> Xaa可以是Ile或Met
<220>
<221> 其他特征
<222> (102)..(102)
<223> Xaa可以是Ser或Gly
<220>
<221> 其他特征
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可以是Phe或Leu
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Xaa Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Phe Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Xaa Ser Val Asp Pro Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Xaa Gly Tyr Gly Tyr Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VH
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Trp Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7和A6A1H9B7的VH
<220>
<221> 其他特征
<222> (58)..(58)
<223> Xaa可以是Thr或Ser
<220>
<221> 其他特征
<222> (60)..(60)
<223> Xaa可以是Asn或Phe
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Xaa Asn Xaa Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His His Pro Ile Leu Ala Thr Ile Ser Pro Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A4G10B7A7和A5F3D5A1的VH
<220>
<221> 其他特征
<222> (74)..(74)
<223> Xaa可以是Arg或Lys
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Val Asp Xaa Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His His Pro Ile Leu Ala Thr Ile Ser Pro Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VH
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Leu Val Gly Val Ile His Gly Trp Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5H1D11A7和A3C8E4H1的VL
<220>
<221> 其他特征
<222> (18)..(18)
<223> Xaa可以是Ser或Thr
<220>
<221> 其他特征
<222> (92)..(92)
<223> Xaa可以是Ser或His
<220>
<221> 其他特征
<222> (106)..(106)
<223> Xaa可以是Phe或Ile
<400> 44
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Xaa Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asp Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Xaa Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Xaa Lys
100 105
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A2E12G12H7的VL
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Val Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Thr Phe Pro Leu
85 90 95
Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A3B4H8H7和A6A1H9B7的VL
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Gly Ala Ile Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln Tyr Tyr Gly Ile Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A4G10B7A7和A5F3D5A1的VL
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile His Ala Thr Ile Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Ser Ile Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G9C2C7的VL
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Asn Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定区
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链恒定区
<400> 50
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 51
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Eculizumab的重链
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 52
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Eculizumab的轻链
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
195 200
<210> 53
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ravulizumab的重链
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
420 425 430
Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 54
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ravulizumab的轻链
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 55
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Crovalimab的重链
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
325 330 335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro
450
<210> 56
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Crovalimab的轻链
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 57
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pozelimab的重链
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Thr Met Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pozelimab的轻链
<400> 58
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ala Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5G2A1A1的VL
<400> 59
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asp Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Asn Asn Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Phe Lys
100 105

Claims (19)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与补体成分5结合，包含：
(i)重链可变区，其可以包含VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中该VH CDR1区、VHCDR2区和VH CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、7和14；(2)SEQ ID NOs：2、8和15；(3)SEQ ID NOs：2、8和16；(4)SEQ ID NOs：3、9和17；(5)SEQ ID NOs：4、10和18；(6)SEQ IDNOs：4、11和18；(7)SEQ ID NOs：4、12和18；(8)SEQ ID NOs：5、12和18；或(9)SEQ ID NOs：6、13和19具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)轻链可变区，其可以包含VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中该VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：20、25和31；(2)SEQ ID NOs：20、26和32；(3)SEQ ID NOs：20、25和33；(4)SEQ ID NOs：21、27和34；(5)SEQ ID NOs：22、28和35；(6)SEQ ID NOs：23、29和36；或(7)SEQ ID NOs：24、30和37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1区、VH CDR2区、VH CDR3区、VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、7、14、20、25和31；(2)SEQ ID NOs：2、8、15、20、26和32；(3)SEQ IDNOs：2、8、16、20、25和33；(4)SEQ ID NOs：3、9、17、21、27和34；(5)SEQ ID NOs：4、10、18、22、28和35；(6)SEQ ID NOs：4、11、18、22、28和35；(7)SEQ ID NOs：4、12、18、23、29和36；(8)SEQID NOs：5、12、18、23、29和36；或(9)SEQ ID NOs：6、13、19、24、30和37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区包含与SEQ ID NOs：38、39(X1＝I、X2＝I、X3＝S、X4＝F；X1＝L、X2＝M、X3＝G、X4＝L)、40、41(X1＝T、X2＝N；X1＝S、X2＝F)、42(X1＝R；X1＝K)或43具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该轻链可变区包含与SEQ ID NOs：44(X1＝S、X2＝S、X3＝F；X1＝T、X2＝H、X3＝I)、45、46、47、48或59具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区和该轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NOs：38和44(X1＝S、X2＝S、X3＝F)；(2)SEQ ID NOs：39(X1＝I、X2＝I、X3＝S、X4＝F)和59；(3)SEQ ID NOs：39(X1＝L、X2＝M、X3＝G、X4＝L)和44(X1＝T、X2＝H、X3＝I)；(4)SEQ ID NOs：40和45；(5)SEQ ID NOs：41(X1＝T、X2＝N)和46；(6)SEQ ID NOs：41(X1＝S、X2＝F)和46；(7)SEQ ID NOs：42(X1＝R)和47；(8)SEQ ID NOs：42(X1＝K)和47；或(9)SEQ ID NOs：43和48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，该重链恒定区具有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，与重链可变区相连，该轻链恒定区具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，与轻链可变区相连。
7.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
8.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与野生型人C5结合；(b)与携带R885C突变的人C5结合；(c)与猴C5结合；(d)阻断补体介导的溶血；和/或(e)阻断补体介导的炎症。
9.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为人源抗体。
10.一种核苷酸，其编码权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
11.一种表达载体，其包含权利要求10所述的核苷酸。
12.一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的表达载体。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体。
14.如权利要求13所述的药物组合物，还包含抗炎剂。
15.一种用于治疗与过度的C5a和/或C5b生成相关的疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中疾病为炎性疾病。
17.如权利要求16所述的方法，其中炎性疾病为全身型重症肌无力或视神经脊髓炎谱系疾病。
18.如权利要求15所述的方法，其中疾病为溶血性疾病。
19.如权利要求18所述的方法，其中溶血性疾病为阵发性睡眠性血红蛋白尿症或非典型溶血性尿毒综合征。
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