JPWO2005017155A1 - フコーストランスポーター - Google Patents

Abstract

本発明は、フコーストランスポーターをコードする遺伝子、フコーストランスポーターポリペプチド、フコーストランスポーターに結合する化合物及びフコース輸送活性を阻害する化合物のスクリーニング方法、フコーストランスポーター機能が阻害された細胞、並びにフコーストランスポーター発現が阻害された細胞が提供され、さらに組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞のゴルジ体内に存在するフコースを減少させることを特徴とするタンパク質の製造方法、宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときに宿主細胞のゴルジ体内に存在するフコースを減少させることを特徴とするタンパク質へのフコースの付加阻害方法、ゴルジ体内に存在するフコースが減少した細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性を増加させる方法、及びゴルジ体内に存在するフコースが減少しているゴルジ体を有する細胞である。

Description

本発明は、フコーストランスポーターポリペプチド、フコーストランスポーターポリペプチドをコードするＤＮＡ、フコーストランスポーター機能が阻害された細胞、およびフコーストランスポーターに結合する化合物もしくはフコース輸送活性を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明は、さらにフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関する。

抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）活性やＣＤＣ（補体依存性細胞障害）活性により抗腫瘍効果を発揮しうる。抗体は糖鎖が結合した糖タンパク質であり、抗体の細胞障害活性の強さは抗体に結合する糖鎖の種類および量により変化しうることが知られている。特に、抗体と結合したフコースの量が細胞障害活性の強さに強く関わっていることが報告されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７（３０），２６７３３−２６７４０，２００２）。さらに、細胞障害活性が増強された抗体を得るために抗体産生の際に糖鎖へのフコースの結合を触媒する酵素を発現させないように操作し、フコースを有しない組換え抗体を作製する方法が報告されている（国際公開公報 ＷＯ００／６１７３９号公報）。

本発明は、細胞内においてフコースの輸送に関与しているフコーストランスポーター遺伝子またはポリペプチドを単離することを目的とし、さらにフコーストランスポーターの機能が阻害されている外来タンパク質産生用の細胞を得ることを目的とする。さらに、本発明は、フコーストランスポーターの機能を阻害し得る化合物を単離することを目的とする。さらに本発明は、容易かつ確実にフコースの結合が消失または低下した組換えタンパク質を製造する方法の提供を目的とする。特にフコースの結合が消失または低下し、細胞障害活性が増強された抗体を製造する方法の提供を目的とする。本発明は、さらにこのようなタンパク質を産生するための宿主細胞を提供することを目的とする。
抗体産生細胞中で抗体にフコースが結合する機構として、細胞内に取り込まれたフコースにＧＤＰが結合し、その後ＧＤＰ−フコースがゴルジ体中に取り込まれゴルジ体中でＧＤＰ−フコースのフコースがタンパク質に糖鎖として付加されているＮ−アセチルグルコサミンに転移することが知られている。具体的には、抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合する部位が２箇所あり、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルグルコサミン部分にフコースが結合する（Ｐａｔｅ Ｌ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２，１５８，８０１−８１５）。発明者等は、この機構について検討し、ＧＤＰ−フコースがゴルジ体に取り込まれるのを阻害できれば、タンパク質にフコースが結合するのを抑制できると予測し、ＧＤＰ−フコースをゴルジ体中に取り込む物質について鋭意検討を行い、該物質をフコーストランスポーターとして単離し、さらにフコーストランスポーターの機能が阻害されている細胞を組換えタンパク質製造のための宿主として用いることにより、フコースが結合せず細胞障害活性が増強された抗体が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明において、抗体へのフコースの付加を阻害するとは、製造される抗体全てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えポリペプチドまたはその断片、
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ（ａ）のポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチド
［２］以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ（ａ）のポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチド
［３］以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（ｃ）のＤＮＡがコードするポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ
［４］［２］または［３］のＤＮＡの断片または［２］または［３］のＤＮＡに相補的なＤＮＡの断片であって、少なくとも１５ヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、
［５］［２］または［３］のＤＮＡを含有する組換えベクター、
［６］［５］の組換えベクターを含む形質転換体、
［７］［６］の形質転換体を培養し、得られる培養形質転換体またはその培養上清からポリペプチドを回収することを含む、［１］のポリペプチドの製造方法、
［８］［１］のポリペプチドに結合する抗体、
［９］［１］に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該ポリペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
［１０］［９］の方法により単離し得る、［１］のポリペプチドに結合する化合物、
［１１］［１］に記載のポリペプチドのＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該ポリペプチドに被検試料とＧＤＰ−フコースを接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドのＧＤＰ−フコース取り込み能を検出する工程、および
（ｃ）ポリペプチドのＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する化合物を選択する工程、を含む方法、
［１２］［１１］の方法により単離し得る、［１］のポリペプチドのＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する化合物、
［１３］ゴルジ体内に存在するフコースが減少しているゴルジ体を有する細胞、
［１４］フコース輸送能が低下または欠損している細胞、
［１５］ゴルジ体へのフコース取り込み活性が低下または欠損している細胞、
［１６］フコーストランスポーターに結合する化合物またはフコース輸送活性を阻害する化合物で処理されている［１３］から［１５］のいずれかの細胞、
［１７］フコーストランスポーターの発現が人為的に抑制されている細胞、
［１８］フコーストランスポーターの発現がＲＮＡｉを用いて抑制されている［１７］の細胞、
［１９］フコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞、
［２０］動物細胞である［１３］から［１９］のいずれかの細胞、
［２１］動物がチャイニーズハムスター細胞である、［２０］の細胞、
［２２］動物細胞がＣＨＯ細胞である［２０］の細胞、
［２３］遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより行われる、［１９］から［２２］のいずれかの細胞、
［２４］フコーストランスポーターをコードする遺伝子をターゲットとしたターゲティングベクター、
［２５］フコーストランスポーターがチャイニーズハムスターフコーストランスポーターである［２４］のターゲティングベクター、
［２６］組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞のゴルジ体内に存在するフコースを減少させることを特徴とするタンパク質の製造方法、
［２７］組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することを特徴とするタンパク質の製造方法、
［２８］組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるフコーストランスポーターを介したフコースの取り込みを阻害することを特徴とするタンパク質の製造方法、
［２９］組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とするタンパク質の製造方法、
［３０］組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるフコーストランスポーターの発現を人為的に抑制することによりフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とする［２６］から［２９］のいずれかのタンパク質製造方法、
［３１］フコーストランスポーターの発現がＲＮＡｉを用いて抑制される［３０］のタンパク質製造方法、
［３２］組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるフコーストランスポーターをコードする遺伝子を欠損することによりフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とする［２６］から［３０］のいずれかのタンパク質製造方法、
［３３］タンパク質が抗体である［２６］から［３２］のいずれかの製造方法、
［３４］フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする［２６］から［３３］のいずれかの製造方法、
［３５］宿主細胞がＣＨＯ細胞である［２６］から［３４］のいずれかの製造方法、
［３６］宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときに宿主細胞のゴルジ体内に存在するフコースを減少させることを特徴とするタンパク質へのフコースの付加阻害方法、
［３７］宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときに宿主細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とするタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［３８］宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときにフコーストランスポーターの発現を人為的に抑制することを特徴とする［３６］または［３７］のタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［３９］フコーストランスポーターの発現がＲＮＡｉを用いて抑制される［３８］のタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［４０］宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときにフコーストランスポーターをコードする遺伝子を欠損することを特徴とする［３６］から［３８］のいずれかのタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［４１］宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときにフコーストランスポーターを介したフコースの取り込みを阻害することを特徴とするタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［４２］タンパク質が抗体である［３６］から［４１］のいずれかのタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［４３］宿主細胞がＣＨＯ細胞である［３６］から［４２］のいずれかのタンパク質へのフコース付加阻害方法、
［４４］ゴルジ体内に存在するフコースが減少した細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性を増加させる方法、
［４５］宿主細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害した細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法、
［４６］フコーストランスポーターの発現を人為的に抑制している細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法、
［４７］フコーストランスポーターをコードする遺伝子が欠損している細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法、
［４８］ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害して抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法、ならびに
［４９］宿主細胞がＣＨＯ細胞である［４４］から［４８］のいずれかの抗体の細胞障害活性増加方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−１７４００６号、２００３−１７４０１０号、２００３−２８２０８１号、２００３−２８２１０２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、ヒトおよびマウスＧＤＰフコーストランスポーターｃＤＮＡの配列とこれらの共通配列からＣＨＯ由来のＧＤＰフコーストランスポーターｃＤＮＡ取得のためにデザインしたプローブ作成用ＰＣＲプライマーの配列を示す図である。
図２は、クローニングにより得られたＣＨＯ細胞由来のＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡ配列を示した（小文字はベクター由来クローニング部位を示す）図である。ＧＤＰ−フコーストランスポーターゲノムＤＮＡ取得に用いたプローブ作成用ＰＣＲプライマーの配列を合わせて示した。
図３は、クローニングにより得られたＧＤＰフコーストランスポーター遺伝子の制限酵素地図を示す図であり、下線部はエクソン・イントロン境界部分の配列（小文字：イントロン）を示す。
図４は、ＣＨＯ由来ＧＤＰフコーストランスポーター遺伝子配列を示す図である。
図５は、ＳｉＲＮＡを用いたトランスポーター遺伝子阻害の結果を示す図である。
図６は、ターゲッティング（ＫＯ２）ベクターの構造とＰＣＲスクリーニングの概略を示す図である。
図７は、ＰＣＲスクリーニングの結果を示す写真である。
図８は、野生型染色体、及びノックアウト型染色体の制限酵素地図を示す図である。
図９は、サザンブロット法の結果を示す写真である。

本発明は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）フコーストランスポーターを提供する。
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）は、現在、抗体などのタンパク質製造の際の宿主細胞として広く用いられているので、本発明のチャイニーズハムスターフコーストランスポーターは特に有用である。
本発明は、また、ＣＨフコーストランスポーター遺伝子と機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。このようなＤＮＡには、例えば、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドの変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするＤＮＡが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと同等の生物学的機能を有することを指す。
本発明において、ＣＨフコーストランスポーターと同等の生物学的機能とは、フコース輸送活性をいい、好ましくはＣＨＯ細胞におけるフコース輸送活性をいう。
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。
また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内、特に好ましくは３アミノ酸以内であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドには、これらポリペプチドを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、これらポリペプチドと他のポリペプチドとが融合したものであり、このような融合ポリペプチドも本発明に含まれる。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＣＨＯフコーストランスポーターポリペプチドをコードするＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のポリペプチドとの融合に付される他のポリペプチドは、特に限定されないが、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドとの融合に付される他のポリペプチドとして、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。これらのポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子は市販されており、市販されているこれらポリペプチドをコードするＤＮＡを本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドをコードするＤＮＡ配列もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いＤＮＡを単離すること、さらに、該ＤＮＡからＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを単離することは、周知の技術である。
本発明には、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、ヒトおよび他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ウシなど）由来のホモログなどが挙げられる。
ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドをコードするＤＮＡの配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、通常、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のポリペプチドには、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと機能的に同等であり、かつ該ポリペプチドのアミノ酸配列と高い相同性を有するポリペプチドも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９２％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
また、塩基配列レベルにおいて、通常、７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明のＤＮＡは、例えば、後述する本発明のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される。本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のポリペプチドをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のポリペプチドを発現する細胞、組織、臓器から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明は、上記本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたポリペプチドが、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドと同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明のポリペプチドを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明のポリペプチドはこのようなポリペプチドも包含する。
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のポリペプチドを発現している組織や細胞（例えば、精巣）の抽出物に対し、後述する本発明のポリペプチドに結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のポリペプチドの部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体の作製、本発明のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニングなどに利用し得る。
本発明の部分ペプチドは、免疫原とする場合には、通常、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明のポリペプチドの競合阻害剤として用いる場合には、少なくとも１００アミノ酸以上、好ましくは２００アミノ酸以上、さらに好ましくは３００アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のポリペプチドを適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のポリペプチドを発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持っている必要があり、さらに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）で用いられるｐＱＥ、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外の微生物も本発明のポリペプチドを製造するための宿主として用いることができ、この場合、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、例えば哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
このような方法により得られた本発明のポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、また、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、抗体の由来は限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体など、どのような抗体を用いてよい。さらに遺伝子組み換えによるキメラ抗体やヒト化抗体なども本発明の抗体に含まれる。
本発明において、感作抗原として使用されるポリペプチドは、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、蛋白質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とは蛋白質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のポリペプチド又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のポリペプチド又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、ポリペプチドを発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のポリペプチドを感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のポリペプチドをカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のポリペプチドのみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでポリペプチド、ポリペプチド発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、ポリペプチドへの結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの精製、検出に用いられる他、本発明のポリペプチドのアゴニストやアンタゴニストの候補になる。
ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ ９２／０１０４７，ＷＯ ９２／２０７９１，ＷＯ ９３／０６２１３，ＷＯ ９３／１１２３６，ＷＯ ９３／１９１７２，ＷＯ ９５／０１４３８，ＷＯ ９５／１５３８８を参考にすることができる。
さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）、Ｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のポリペプチドで使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のポリペプチドを添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。ポリペプチドとしてポリペプチドの断片、例えばそのＣ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のポリペプチドが含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該ポリペプチドとの免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のポリペプチドの検出又は測定方法を実施することができる。本発明のポリペプチドの検出又は測定方法は、ポリペプチドを特異的に検出又は測定することができるため、ポリペプチドを用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、ＣＨフコーストランスポーターポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、もしくは二本鎖以上でもよい。
ヌクレオチドはＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、また、ＤＮＡとＲＮＡが混合していてもよい。
このような核酸には、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を検出するためのプローブやプライマー、ＤＮＡチップの作製などに用いることが可能である。
また、本発明のポリペプチドの発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）が含まれる。本発明のポリペプチドの発現を阻害する場合、その標的部位は特に限定されず、タンパク質コード領域や５’非翻訳領域などを標的とすることが可能である。本発明のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣＨＯ細胞においてゴルジ体内へのフコースの輸送を阻害し、抗体へのフコースの付加を阻害することができるので、高細胞障害活性を持った抗体の作製などに有用である。
プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列中又はその相補配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号１の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ハイブリダイズの具体的な条件は、例えば上述の条件を挙げることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のポリペプチドの産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のポリペプチドの発現を抑制することにより、結果的に本発明のポリペプチドの作用を抑制する効果を有する。
オリゴヌクレオチドとしてＲＮＡを用いる場合、一般的にはＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅａｒｅｎｅｃｅ：ＲＮＡｉ）と呼ばれる。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のｍＲＮＡが特異的に分解され、蛋白質として発現されなくなる現象をいう。ＲＮＡｉの場合、通常、二本鎖ＲＮＡが用いられるが、特に限定されず、例えば、自己相補的な一本鎖ＲＮＡ中で形成される二本鎖を用いることも可能である。二本鎖を形成する領域は、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端など）が一本鎖等になっていてもよい。ＲＮＡｉに用いられるオリゴＲＮＡは、その長さは限定されない。本発明のオリゴＲＮＡの長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には、５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には、１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には、１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には、１９〜２３ｂｐ）である。
また、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドとこれに結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出し、そして本発明のポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する、ことを含む。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドのフコース輸送活性、特にＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドと被検試料とを接触せしめ、本発明のポリペプチドのフコース輸送活性を検出し、そして本発明のポリペプチドのフコース輸送活性を阻害する化合物を選択することを含む。
スクリーニングに用いられる本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製したポリペプチドとして、可溶型ポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明のポリペプチドを用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のポリペプチドのＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 １３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。
融合ポリペプチドにすることにより本発明のポリペプチドの性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 １３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のポリペプチド、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のポリペプチドの部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のポリペプチドを、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のポリペプチドの抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的には本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である^３５Ｓ−メチオニンや^３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明のポリペプチドを用いて、該ポリペプチドに結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、精巣）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識した本発明のポリペプチドと上記フィルターとを反応させ、本発明のポリペプチドと結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のポリペプチドを標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドに融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された腸性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これにより本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明のポリペプチドと結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、本発明のポリペプチドに結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のポリペプチドに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のポリペプチドと被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のポリペプチドと被検化合物との結合を評価することが可能である。
本発明のポリペプチドのフコース輸送活性を阻害する物質のスクリーニング方法は当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、本発明のポリペプチドを膜上（細胞膜、ゴルジ体膜、ウイルス膜、など）に発現させ、蛍光物質などで標識したフコースと、被験物質を接触させ、取り込まれたフコースの量を測定することにより、本発明のポリペプチドのフコース輸送活性を阻害する物質のスクリーニングを行うことが可能である。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節するための候補となり、細胞障害活性の高い抗体の作製への応用が考えられる。
本発明においてフコーストランスポーターとはフコース輸送活性を有するポリペプチドのことをいい、例えば、フコーストランスポーターが細胞膜上に発現している場合には通常、フコースを細胞内に取り込み、フコーストランスポーターがゴルジ膜上に発現している場合には通常、フコースをゴルジ体内に取り込む。本発明においては好ましいフコーストランスポーターはチャイニーズハムスターフコーストランスポーターであり、より好ましくは配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するフコーストランスポーターである。配列番号１にはチャイニーズハムスターフコーストランスポーター遺伝子の塩基配列を示す。
ゴルジ体内に存在するフコースを減少させる方法は特に限定されず、どのような方法で行ってもよいが、例えば、ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させる方法を挙げることができる。
ゴルジ体は主にゴルジ膜上に存在するフコーストランスポーターを介して、フコースをゴルジ体内に取り込んでいることから、該フコーストランスポーターの機能を阻害することにより、ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することができ、ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させることが可能である。
細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害するとは、フコーストランスポーターのフコース輸送活性を低下または消滅させることをいう。
細胞のフコーストランスポーターの機能の阻害はどのような方法で行われてもよく、当業者に公知の方法で行うことが可能である。具体的な方法としては、フコーストランスポーターの発現を阻害する等してフコーストランスポーター自体の数を減少させる方法や、フコーストランスポーターに対するアンタゴニストを用いる等してフコーストランスポーターの輸送能を低下させる方法等を挙げることができる。
フコーストランスポーターの発現阻害は、正常な輸送能を有するフコーストランスポーターの数が減少する限り、特に制限はされず、例えば、ゲノムに含まれるフコーストランスポーター遺伝子の除去、ｍＲＮＡへの転写の過程を阻害、ｍＲＮＡの分解、タンパク質への翻訳の過程を阻害、などにより阻害することが可能である。フコーストランスポーター遺伝子の発現を阻害する為の具体的な方法としては、例えば、フコーストランスポーターを標的としたターゲティングベクターなどを用いてフコーストランスポーターをコードする遺伝子を欠失（ノックアウト）する方法や、フコーストランスポーターをコードする遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡやＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いる方法などを挙げることができる。フコーストランスポーターを阻害された細胞は、いずれの方法を用いてフコーストランスポーター機能阻害した細胞でよいが、医薬品等の生産に用いる場合、好ましくは染色体の安定性の高い細胞としてＣｒｅ−ｌｏｘｐを用いない細胞が好ましい（Ｓｃｈｕｍｉｄｔ Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７，１３７０２−１３７０７（Ｆｅｂ ２００１）。
本発明の製造方法により作製されるタンパク質はどのようなタンパク質でもよいが、通常、糖タンパク質であり、好ましくは抗体である。
本発明の方法により作製する抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ ９２／０１０４７，ＷＯ ９２／２０７９１，ＷＯ ９３／０６２１３，ＷＯ ９３／１１２３６，ＷＯ ９３／１９１７２，ＷＯ ９５／０１４３８，ＷＯ ９５／１５３８８を参考にすることができる。
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９８８）８５，５８７９−５８８３）、Ｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
組み換えポリペプチドの製造方法は、当業者に知られている公知の方法で行うことが可能である。一般的にはポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、タンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
本発明の製造方法において製造されるタンパク質としては、結合したフコースにより細胞傷害活性が影響を受ける抗体が好ましい。
抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。
さらに、本発明は外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、外来タンパク質にフコースが付加されない細胞を包含する。
このような細胞は細胞内、例えば、ゴルジ体内に存在するフコースを減少させた細胞である。ゴルジ体内に存在するフコースを減少させる方法は特に限定されず、どのような方法で行ってもよいが、例えば、ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させる方法を挙げることができる。ゴルジ体は主にゴルジ膜上に存在するフコーストランスポーターを介して、フコースをゴルジ体内に取り込んでいることから、該フコーストランスポーターの機能を阻害することにより、ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することができ、ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させることが可能である。
細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害するとは、フコーストランスポーターのフコース輸送活性を低下または消滅させることをいう。
細胞のフコーストランスポーターの機能の阻害はどのような方法で行われてもよく、当業者に公知の方法で行うことが可能である。具体的な方法としては、フコーストランスポーターの発現を阻害する等してフコーストランスポーター自体の数を減少させる方法や、フコーストランスポーターに対するアンタゴニストを用いる等してフコーストランスポーターの輸送能を低下させる方法等を挙げることができる。
フコーストランスポーターの発現阻害は、正常な輸送能を有するフコーストランスポーターの数が減少する限り、特に制限はされず、例えば、ゲノムに含まれるフコーストランスポーター遺伝子の除去、ｍＲＮＡへの転写の過程を阻害、ｍＲＮＡの分解、タンパク質への翻訳の過程を阻害、などにより阻害することが可能である。フコーストランスポーター遺伝子の発現を阻害する為の具体的な方法としては、例えば、フコーストランスポーターを標的としたターゲティングベクターなどを用いてフコーストランスポーターをコードする遺伝子を欠失（ノックアウト）する方法や、フコーストランスポーターをコードする遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡやＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いる方法などを挙げることができ、これらの方法は後述する。
このような、フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を宿主細胞として外来タンパク質を発現させることにより、フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。ここで、外来のタンパク質とはその細胞自体に由来しないタンパク質をいう。宿主細胞には特に制限はなく、例えば、組換えタンパク質を発現させた際に該タンパク質に糖が付加される細胞等を用いることができる。より具体的には種々の動物細胞などを用いることができ、好ましくはＣＨＯ細胞である。本発明においては特にフコーストランスポーター遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞を好適に使用することができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）などを例示することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。
上記の外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、フコーストランスポーターの機能が阻害されている細胞に産生させようとする抗体等の外来タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを組込めば、フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等が挙げられるが、宿主細胞をＣＨＯ細胞とする場合には哺乳動物由来のベクターを使用することが好ましい。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とする場合には、通常、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っており、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
細胞の培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
本発明の宿主細胞により作製されるタンパク質はどのようなタンパク質でもよいが、通常、糖タンパク質であり、好ましくは抗体である。
本発明の方法により作製する抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。抗体については既に上述されている。
フコーストランスポーターの発現が阻害されている細胞として、フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞が挙げられる。「遺伝子の破壊」とは、遺伝子の塩基配列に部分的な欠失、置換、挿入、付加等を行い、該遺伝子の発現を抑制することをいう。遺伝子の発現が完全に抑制されている場合だけでなく、部分的に抑制されている場合も本発明の「遺伝子の破壊」に含まれる。「遺伝子の欠損（ノックアウト）」および「遺伝子の不活性化」も「遺伝子の破壊」と同等の意味として用いられる。さらに、ジーンターゲティングを用いた相同組換えにより遺伝子が破壊された細胞を遺伝子がノックアウトされた細胞という。フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、フコーストランスポーターの発現が人為的に抑制されている細胞の１つである。フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、ゴルジ体内に存在するフコースの量がフコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない細胞に比べ有意に減少している細胞、細胞内におけるフコース輸送能が低下または欠損している細胞、細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性が低下または欠損している細胞である。ゴルジ体中のフコースの量は細胞よりゴルジ体を単離し糖を抽出し、抗原抗体反応、糖とレクチンの結合反応、液体クロマトグラフィー、電気泳動等により測定することができる。また、細胞内におけるフコース輸送能および細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性は例えば、蛍光物質やラジオアイソトープ等で標識したフコースを用いて測定することができる。
遺伝子の破壊は、例えば、相同組換え法により行うことが可能である。
相同組換え法は、染色体上の遺伝子と外来ＤＮＡとの間で相同的遺伝子組換えによって目的の遺伝子だけを任意に改変する方法をいい、タンパク質をコードする配列を分断する目的で、その遺伝子のエクソンに別のＤＮＡ配列を挿入する。ジーンターゲティングベクターを持つ細胞を同定しやすくするため、遺伝子を分断する配列には一般にバクテリア由来のネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを用いる。本明細書に記載のフコーストランスポーター遺伝子の配列情報を基にターゲティングベクターを設計・作製し、該ターゲティングベクターを用いて破壊しようとするフコーストランスポーター遺伝子を相同組換えすればよい。例えば、置換型ベクターは、導入する変異の５’および３’側に連結された相同領域、ポジティブセレクション用のマーカー、相同領域の外側でベクターを直鎖状化するための制限酵素部位、相同領域の外側に配置されたネガティブセレクション用のマーカー、変異検出用の制限酵素切断部位等を含むことができる。ターゲティングベクターは、山村研一ら編 トランスジェニック動物 共立出版株式会社 １９９７年３月１日、相沢慎一 ジーンターゲティング ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製 バイオマニュアルシリーズ８ 羊土社 １９９５、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９４４）、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、松村正實ら編 実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック（改定第３版）羊土社 １９９９ 等に記載の方法に従って作製することができる。ターゲティングベクターは挿入型および置換型のどちらを用いてもよい。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いたターゲティングにより組換えを起こさせることもできる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いたターゲティングは、例えば特表平１１−５０３０１５号公報に記載の方法に従って行うことができる。相同組換えを起こした相同組換え体の選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択等の公知の選択方法を用いればよい。相同組換え体の同定は、ＰＣＲ法でもサザンブロッティング法のいずれの方法をも用いることができる。
また、その他、フコーストランスポーターの発現が阻害されている細胞の作製方法としては、例えば、アンチセンス法、リボザイム法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法、ＲＮＡｉ法、ＲＤＯ法、ＴＦＯ法、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした哺乳動物から株化細胞を得る方法、等を挙げることができる。
アンチセンス法は、本発明のフコーストランスポーター遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより細胞におけるフコーストランスポーターの翻訳を阻害する方法である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列中又はその相補配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、配列番号１の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。ハイブリダイズの具体的な条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のポリペプチドの発現を抑制することにより、結果的に本発明のポリペプチドの作用を抑制する効果を有する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換する事も可能である。
リボザイム法は、核酸を切断する活性を有するＲＮＡを用いて細胞中でフコーストランスポーター遺伝子のｍＲＮＡを切断し、発現されないようにする方法である。リボザイムは、基質ＲＮＡに相補的な認識部位と、ループ状の酵素活性部位、およびこの酵素活性部位に付随するステムＩＩ領域とからなっており、認識部位を本発明のフコーストランスポーター遺伝子の一部と相補的になるように設計すればよい。前記アンチセンス法と同様にリボザイムを発現し得る適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換すればよい。リボザイム法は、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１７，１０９７（１９９９）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，１８８６（１９９９）の記載に従って行うことができる。アンチセンス法またはリボザイム法によりフコーストランスポーターが産生されなくなった細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
また、レトロウイルスを用いてフコーストランスポーター遺伝子を破壊することができる。宿主細胞にレトロウイルスを感染させて導入してから、フコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングすることにより、フコーストランスポーター活性を有しない細胞を得ることができる。細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロティングやノーザンブロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にスクリーニングしてもよい。
また、同様にトランスポゾンを用いてフコーストランスポーター遺伝子を破壊し、該遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングにより得て抗体の産生に用いてもよい。トランスポゾンのシステムはＮａｔｕｒｅＧｅｎｔ，，２５，３５，（２０００）等に記載の方法に従って構築すればよい。
さらに、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅａｒｅｎｅｃｅ：ＲＮＡｉ）を用いても本発明のフコーストランスポーターの発現が阻害された細胞を得ることもできる。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のｍＲＮＡが特異的に分解され、蛋白質として発現されなくなる現象をいう。ＲＮＡｉの場合、通常、二本鎖ＲＮＡが用いられるが、特に限定されず、例えば、自己相補的な一本鎖ＲＮＡ中で形成される二本鎖を用いることも可能である。二本鎖を形成する領域は、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端など）が一本鎖等になっていてもよい。ＲＮＡｉに用いられるオリゴＲＮＡは、その長さは限定されない。本発明のオリゴＲＮＡの長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には、５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には、１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には、１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には、１９〜２３ｂｐ）である。
上述のようにＲＮＡｉ法は、ある遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）が、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊する、という現象を利用した方法である。用いるフコーストランスポーター遺伝子の全長配列に対応する二本鎖ＲＮＡを用いてもよいし、一部の配列に対応する短い（例えば、２１〜２３ｂ）ｄｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）を用いてもよい。二本鎖ＲＮＡは、直接細胞に取り込ませてもよいし、二本鎖ＲＮＡを産生するベクターを作製し、宿主細胞に導入し細胞内で二本鎖ＲＮＡを産生させてもよい。例えば、本発明のフコーストランスポーターをコードするＤＮＡの全部または一部を逆向き反復配列となるようにベクターに組込み該ベクターを宿主細胞に導入すればよい。ＲＮＡｉ法は、Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１５５０２（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ，３９５，８５４，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，５０４９，（１９９９）、Ｃｅｌｌ，９５，１０１７，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４５１，（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１３９５９，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０，（２０００）等の記載に従って行うことができる。ＲＮＡｉ法によりフコーストランスポーターが産生されなくなった細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
さらに、ＲＤＯ法、ＴＦＯ法によっても本発明のフコーストランスポーターを破壊することができる。ＲＤＯ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ−ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖が結合した二本鎖であり、ＧＣクランプとＴループを有することを特徴とし、フコーストランスポーター遺伝子に対応したＲＤＯを用いることによりフコーストランスポーター遺伝子に変異を導入することができ、遺伝子を破壊することができる。ＲＤＯの構築は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，１３８６，（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４，２８５，（１９９８）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２５，１４６２，（１９９７）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，５，１９６０，（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７５，８２９，（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８７７４，（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８７６８，（１９９９）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２７，１３２３，（１９９９）、Ｉｎｖｅｓｔ，Ｄｅｍａｔｏｌ．，１１１，１１７２，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６，１３４３，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，４３，（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，５５５，（２０００）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８０，６２０，（２００２）等の記載に従い行なうことができる。三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、二本鎖のゲノムのＤＮＡにおける特異的部位に結合できるＤＮＡの短い一本鎖のＤＮＡセグメントであり、結合部位において変異を誘発できる。ＴＦＯの構築は、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８０，６２０，（２００２）等の記載に従って行なうことができる。
さらに、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、細胞にランダムに変異を導入しても得ることができる。ランダムに変異を導入する方法として、マーカーの入った遺伝子破壊ベクターを細胞のゲノムにランダムに導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法と、ＥＮＵ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）等の化学変異原でランダムな変異を導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法が挙げられる。フコーストランスポーターが産生されなくなった細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
さらに本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から得ることができる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物は、ＥＳ細胞のフコーストランスポーターを前記方法で破壊し、該ＥＳ細胞から例えば、ＷＯ０２／３３０５４号公報に記載の方法で作出することができる。この際用いる動物としては、限定されないがヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、マウス、ハムスター、ラット等が挙げられる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から株化細胞を作製することにより、フコーストランスポーター遺伝子を有しない株化細胞を得ることができる。
フコーストランスポーターの輸送能が低下または消失した細胞は種々の方法で得ることができるが、例えばフコーストランスポーターに結合し、細胞質からゴルジ体中へのフコースの輸送を阻害する化合物、すなわちフコーストランスポーターに対するアンタゴニスト、を用いてフコーストランスポーターの機能を阻害することにより得ることができる。本発明はそのような化合物により細胞のフコーストランスポーター機能を阻害する方法、およびそのような化合物によりフコーストランスポーター機能が阻害された細胞をも含む。フコーストランスポーター機能が阻害された細胞は、ゴルジ体内に存在するフコースの量がフコーストランスポーター機能が阻害されていない細胞に比べ有意に減少している細胞である。さらに、フコーストランスポーター機能が阻害された細胞はゴルジ膜におけるフコース輸送能が低下または欠損した細胞であり、また細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性が低下または欠損している細胞である。フコーストランスポーター機能を阻害する化合物として上述のスクリーニング方法により単離される化合物やフコーストランスポーター活性に結合する抗体が挙げられる。該化合物は、組換えタンパク質を産生させる宿主細胞の培地に添加すればよい。また、該化合物がタンパク質の場合は、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入した適当な発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該タンパク質を宿主細胞中で発現産生させればよい。
本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊又はフコーストランスポーターの輸送活性が阻害された宿主細胞で外来の組換えタンパク質を産生させた場合、細胞中のフコースがゴルジ体中にトランスポートされないためタンパク質にフコースが付加されない。フコーストランスポーター遺伝子が破壊された宿主細胞で産生した組換えタンパク質は、フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない宿主細胞で産生した組換えタンパク質に比較して結合しているフコース量が有意に少なく、好ましくは検出できない。外来タンパク質が抗体の場合、抗体１分子の２つのＨ鎖のＦｃ領域に存在する２箇所の糖鎖結合部位に結合したＮ−グリコシド結合糖鎖にフコースが結合していないものが得られる。このようなフコースが結合していない抗体は細胞傷害活性が増強されている。細胞への抗体遺伝子の組込みは通常の遺伝子工学的手法により行なうことができる。なお、本発明の細胞を用いて、抗体へのフコースの付加が阻害された抗体を製造する場合、製造される抗体全てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。
さらに、本発明は、フコーストランスポーター遺伝子の発現が阻害された動物（ヒトを除く）も包含する。このような動物を用いることによりｉｎ ｖｉｖｏで組換えポリペプチドを産生することができる。フコーストランスポーター遺伝子の発現が阻害された動物としては、上述のフコーストランスポーターノックアウト動物を挙げることができる。上述のように特定の遺伝子がノックアウトされたノックアウト動物の作製は既によく知られた技術であり、当業者は適宜フコーストランスポーター遺伝子ノックアウト動物を作製することが可能である。又、フコーストランスポーターに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を動物に導入する等して、フコーストランスポーター遺伝子の発現が阻害された動物を作製することが可能である。
これらの動物に目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを導入し、動物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物などを包含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
これにより得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明の製造方法により製造される抗体のＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することも可能である。例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能であるし、抗体ライブラリから取得することも可能である。ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。得られたハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結することによりＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。免疫の際の感作抗原としては特に限定されないが、例えば、目的の受容体の全長タンパク質や、部分ペプチド（例えば、細胞外領域）などを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３，３−４６．）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
抗体ライブラリについては既に多くの抗体ライブラリが公知になっており、又、抗体ライブラリの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリを入手することが可能である。
上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明の細胞を用いて産生させたタンパク質の糖鎖構造の解析は、２次元糖鎖マップ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，１７１，７３，（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法 高橋禮子編 学会出版センター（１９８９））等に記載の方法により行うことができる。さらに、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析により解析することもできる。
フコーストランスポーターに結合し、細胞質からゴルジ体中へのフコースの輸送を阻害する化合物は以下の方法でスクリーニングすることができる。すなわち、フコーストランスポーターとこれに結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出することにより、フコーストランスポーターに結合する活性を有する化合物を選択することができる。
さらに、フコーストランスポーターと被検試料とを接触せしめ、フコーストランスポーターのフコース輸送活性を検出することにより、フコーストランスポーターのフコース輸送活性を阻害する化合物を選択することができる。
スクリーニングに用いられる本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製したポリペプチドとして、可溶型ポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明のポリペプチドを用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のポリペプチドのＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 １３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。
融合ポリペプチドにすることにより本発明のポリペプチドの性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 １３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のポリペプチド、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のポリペプチドの部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のポリペプチドを、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のポリペプチドの抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的には本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である^３５Ｓ−メチオニンや^３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明のポリペプチドを用いて、該ポリペプチドに結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、精巣）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識した本発明のポリペプチドと上記フィルターとを反応させ、本発明のポリペプチドと結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のポリペプチドを標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドに融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これにより本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明のポリペプチドと結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、本発明のポリペプチドに結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のポリペプチドに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のポリペプチドと被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のポリペプチドと被検化合物との結合を評価することが可能である。
本発明のポリペプチドのフコース輸送活性を阻害する物質のスクリーニング方法は当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、本発明のポリペプチドを膜上（細胞膜、ゴルジ体膜、ウイルス膜、など）に発現させ、蛍光物質などで標識したフコースと、被験物質を接触させ、取り込まれたフコースの量を測定することにより、本発明のポリペプチドのフコース輸送活性を阻害する物質のスクリーニングを行うことが可能である。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節するための候補となり、細胞障害活性の高い抗体の作製への応用が考えられる。
抗体の細胞障害活性
本発明の方法で製造される抗体は細胞障害活性が増加した抗体である。
本発明における細胞障害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１） エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０^６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％ ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
（３）標的細胞の調製
膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−２等）を（０．２ｍ Ｃｉの^５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０^５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＰｅｐＴ抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
［実施例１］チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株からのＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子断片の取得
ヒト（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ３２６１９９）およびマウス（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＫ０５０３１１）ＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡ配列はＮＣＢＩデータベースより入手した。ＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣで解析し、ヒトとマウスでホモロジーの高い配列（第１図）部分を用いてプライマーをデザインし、ＣＨＯ細胞株ＤＸＢ１１よりＲＮＡ抽出キット（ＴＡＫＡＲＡ：ｃａｔｒｉｍｏｘ １４ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて抽出したｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲキット（ＴＯＹＯＢＯ：ＲＴ−ＰＣＲＨｉｇｈ）にてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にサブクローニングし、配列を確認した後、適当な制限酵素で切り出し、ライブラリースクリーニングのためのプローブとして用いた。
［実施例２］ ＧＤＰ−フコーストランスポーター全長ｃＤＮＡのクローニング
実施例１で得られたＧＤＰ−フコーストランスポーター断片をＲａｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、α３２Ｐ ｄＣＴＰでラベルした。ＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡライブラリーはＣＨＯ−Ｋ１株由来のもの（ＬａｍｂｄａＺＡＰ−ＣＭＶ ＸＲ Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用し、スクリーニングは基本的にマニュアルに従った。すなわち、一次スクリーニングでは、１０^６のファージを１０枚のプレートに大腸菌（ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）に感染後、ソフトアガーと共に撒き、得られたプラークをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ ＮＸ：Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。膜は定法によりアルカリ・中和処理し、ＵＶ固定後、上記プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。得られた陽性クローンについて、二次、三次スクリーニングを行い、最終的に９つの単一化された陽性クローンを得た。各クローンはヘルパーファージ（ＥｘＡｓｉｓｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と共に大腸菌（ＸＬＯＬＲ）に感染させ、プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ ＥＸ）として回収し、配列を調べた（第２図）。マウスとヒトトランスポーター遺伝子の配列の比較を第１図に示した。ＣＨＯ細胞由来の配列と比較するとヒトの配列との相同性は８５．３％、マウスの配列とは９１．５％であった。
［実施例３］ ＧＤＰ−フコーストランスポーターゲノムＤＮＡのクローニング
５’、３’側それぞれの遺伝子断片をプローブにする目的で、実施例１で得たＧＤＰ−フコーストランスポーター断片を鋳型にプライマーをデザインし、ＰＣＲにて５’側、３’側それぞれの断片を得た。プライマーは、実施例１で用いたＲＴ−ＰＣＲ用プライマーと、マウスゲノムから予想されたエキソン１、２に相当する配列を得ることが出来るようなプライマーの組み合わせ（第３図）をデザインした。ＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡライブラリー（ＣＨＯ−Ｋ１株由来Ｌａｍｂｄａ ＦＩＸ ＩＩ Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い、実施例２に示した方法で、５’、３’プローブのラベルとスクリーニングを行い、最終的に１１の陽性クローンを得た。このうち７つのクローンについて大腸菌（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＡ）に感染させ、１００ｍＬの液体培養からファージを回収し、ＱＩＡＧＥＮ Ｌａｍｂｄａキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてファージＤＮＡを回収した。回収したファージＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、サザンブロットハイブリダイゼーションで独立したクローンの選別とマッピングを行った。
［実施例４］ ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＧＤＰ−フコーストランスポーターゲノムＤＮＡ配列の決定
実施例３で得られたＣＨＯゲノム遺伝子を含むＤＮＡを各種制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動後、定法に従い、実施例２で得たＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの５’側および３’側断片をプローブとしたサザンブロッティングにより制限酵素地図を作成した（第３図）。それぞれにハイブリダイズするバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、添付マニュアルにしたがって回収した。回収したＤＮＡ断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社）に導入した。得られた組換え大腸菌からプラスミドを回収し、ＡＢＩ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで解析を行った（第４図、配列番号１）。
［実施例５］ ＲＮＡｉを用いたＣＨＯ細胞でのＧＤＰ−フコーストランスポーターの発現抑制
ＤＧ４４細胞５ｘ１０^５ ｃｅｌｌｓを５ｍＬの１０％ＦＣＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社）、２００μｍｏｌ／ＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸを含んだＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁してファルコン２５ｃｍ^２培養ボトルに播いた。２４時間後にＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対する合成ｓｉＲＮＡ（センス鎖ＵＡＡ ＣＣＵ ＣＵＧ ＣＣＵ ＣＡＡ ＧＵＡ ＣｄＴｄＴ（配列番号３）及びアンチセンス鎖ＧＵＡ ＣＵＵ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＧＵＵ ＡｄＴｄＴ（配列番号４））（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２〜５００ｎＭトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収した。細胞からＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ反応をＴａｑＭａｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ及びＴａｑＭｑａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行いＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によりＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの発現を定量化した。その結果、ｍＲＮＡレベルではＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子発現が抑制されていた。
図５に結果を示す。図５に示すグラフはＰＢＳをトランスフェクション後４８時間のＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子発現を１００とした相対的な値である。
［実施例６］ ＣＨＯ細胞におけるフコーストランスポーター遺伝子の破壊
ターゲッティングベクターの構築
ｐＫＪ２ベクター（Ｐｏｐｏ Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ．２８，ｐ２９９−３０８，１９９０）よりマウスｐｇｋ−１遺伝子のプロモーターをＥｃｏＲ Ｉ−Ｐｓｔ Ｉによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＥｃｏＲ Ｉ−Ｐｓｔ ＩサイトにクローニングしてｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１を作製した。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子（Ｈｙｇ^ｒ）はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（インビトロジェン社）よりＨｙｇ５−ＡＶとＨｙｇ３−ＢＨのプライマーでＰＣＲすることによって、Ｈｙｇ^ｒの５’側にＥｃｏ Ｔ２２ＩサイトとＫｏｚａｋ配列を付加し、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ付加シグナルまでの領域を含む３’側にはＢａｍＨ Ｉサイトを付加してＨｙｇ^ｒを抜き出した。
フォワードプライマー

リバースプライマー

このＨｙｇ^ｒ（Ｅｃｏ Ｔ２２Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ）フラグメントをｐＢＳＫ−ＰＧＫのＰｓｔ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉサイトに挿入し、ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｈｙｇ^ｒを作製した。フコーストランスポーターのターゲッティングベクター（以下、ＫＯ２ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクター（Ｙａｇｉ Ｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８７，ｐ９９１８−９９２２，１９９０）にフコーストランスポーターの５’側（配列番号１のＮｏ．２７８０のＳｍａ ＩからＮｏ．４２３２のＢａｍＨ Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４２８４からＮｏ．１０９３４のＳａｃ Ｉまで）、及びｐｇｋ−１−Ｈｙｇ^ｒフラグメントを各々挿入することで構築した（図６）。ＫＯ２ベクターはＮｏｔ Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ２ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４６塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
ＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ ＨＴ−（インビトロジェン社、ｃａｔ １２０５２−０９８）にＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）（インビトロジェン社 ｃａｔ．１１０６７−０３０）とペニシリンストレプトマイシン（インビトロジェン社 ｃａｔ．１５１４０−１２２）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ ＨＴ−の容量に対して、それぞれ１／１００量を加えた。これを培養用の培地（以下、ＳＦＭＩＩ（＋）と称する）としてＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株を継代し、さらに遺伝子導入後の細胞の培養もこのＳＦＭＩＩ（＋）で行った。８Ｘ１０^６個のＣＨＯ細胞を０．８ｍＬのダルベッコリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す。インビトロジェン社 ｃａｔ １４１９０−１４４）に懸濁した。細胞懸濁液に３０μｇのターゲッティングベクター（ＫＯ２ベクター）を加え、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（４ｍｍ）（バイオラッド社 ｃａｔ．１６５２０８８）に細胞懸濁液を移した。氷上で１０分間放置した後に、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（バイオラッド社ｃｏｄｅ Ｎｏ．３４０ＢＲ）で１．５ｋＶ，２５μＦＤの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を２００ｍｌのＳＦＭＩＩ（＋）培地に懸濁して２０枚の９６穴平底プレート（ＩＷＡＫＩ社 ｃａｔ．１８６０−０９６）に１００μｌ／ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをＣＯ_２インキュベータ内で、２４時間、３７℃で培養した後、ハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社 ｃａｔ．１０６８７−０１０）による選抜を開始した。ハイグロマイシンＢは３００μｇ／ｍｌになるようにＳＦＭＩＩ（＋）に溶解し、１００μｌ／ウェル添加した。
相同組み換え体はＰＣＲ法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いるＣＨＯ細胞は９６穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を５０μｌ／ウェル加えて５５℃、２時間インキュベーションし、続いて９５℃、１５分加熱することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲの鋳型とした。細胞溶解用の緩衝液は、１ウェルあたり１０ Ｘ ＬＡ緩衝液ＩＩ（ＴａＫａＲａ社 ＬＡ Ｔａｑに添付）５μｌ、１０％ ＮＰ−４０（ロッシュ社 ｃａｔ．１ ３３２ ４７３）２．５μｌ、プロティナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、ＴａＫａＲａ社 ｃａｔ．９０３３）４μｌ、及び蒸留水（ナカライテスク社 ｃａｔ．３６４２１−３５）３８．５μｌで構成されている。ＰＣＲ反応混合物は上記のＰＣＲサンプル１μｌ、１０ Ｘ ＬＡ緩衝液５μｌ、ＭｇＣｌ_２（２５ｍＭ）５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、プライマー（各１０μＭ）２μｌ、ＬＡ Ｔａｑ（５ＩＵ／μｌ ｃａｔ．ＲＲ００２Ｂ）０．５μｌ、及び蒸留水２９．５μｌ（全５０μｌ）とした。また、ＰＣＲの条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、及び７０℃にて３分間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７０℃にて７分の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こしたＣＨＯ細胞のサンプルでは、約２．０ｋｂのバンドが増幅される。プライマーはＴＰ−Ｆ４がＫＯ２ベクターの外で５’側のフコーストランスポーターのゲノム領域に配置し、ＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１はＫＯ２ベクター内のハイグロマイシン耐性遺伝子内に配置した。
フォワードプライマー

リバースプライマー

解析したＣＨＯ細胞の数は５３７個であり、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１７個であった（この時の相同組み換え効率は約３．２％）。
図７はスクリーニングのＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動したときのデータを示している。○のついたサンプルで２．０ｋｂのバンドが出現したことから、これらのクローンが相同組み換え体と考えられた。そこで、２．０ｋｂのバンドをゲルから切り出し、Ｍａｇ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社、ｃａｔ．ＮＰＫ−６０１）で精製した。精製したＰＣＲ産物の２００ｎｇをＴＰ−Ｆ４、及びＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１でダイレクトシーケンスを行い、ＰＣＲ産物が相同組み換えを起こしたときに生じる塩基配列であることを確認し、相同組み換え体であると判断した。
さらに、サザンブロット法によっても確認を行った。２４穴プレートで培養した細胞を回収し、定法に従ってゲノムＤＮＡを調整し、サザンブロットを行った。配列番号１のＮｏ．２，１１３−Ｎｏ．２，５００の領域から、以下の二種類のプライマーを用いてＰＣＲ法により３８７ｂｐのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノムＤＮＡはＢｇｌ ＩＩ、もしくはＥｃｏＲ Ｉで切断した。
フォワードプライマー

リバースプライマー

Ｂｇｌ ＩＩによる切断によって、元々のフコーストランスポーターの染色体からは約３．０ｋｂ、ノックアウトされた染色体からは約５．０ｋｂのバンドがそれぞれ出現する。また、ＥｃｏＲ Ｉによる切断によって、元々のフコーストランスポーター染色体からは約８．７ｋｂ、ノックアウトされた染色体からは約４．５ｋｂのバンドがそれぞれ出現する（図８）。図９は実際にサザンブロットを行ったときのデータを示したものである。

配列番号３および４：合成ＲＮＡ

本発明により、フコーストランスポーターポリペプチドおよびフコーストランスポーター遺伝子が得られる。また、フコーストランスポーター遺伝子が破壊された組換えタンパク質産生細胞が得られ、該細胞で組換えタンパク質を産生させた場合、フコースの付加が低下または消失した組換えタンパク質が製造できる。特にタンパク質が抗体の場合、フコースの付加が低下または消失することにより細胞障害活性が増強され、抗腫瘍作用をもった抗体医薬として有用である。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。

【配列表】

Claims (49)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えポリペプチドまたはその断片。
   （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ（ａ）のポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチド
2. 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ（ａ）のポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチド
3. 以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含むＤＮＡ。
   （ｃ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ
   （ｄ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（ｃ）のＤＮＡがコードするポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ
4. 請求項２または３に記載のＤＮＡの断片または請求項２または３に記載のＤＮＡに相補的なＤＮＡの断片であって、少なくとも１５ヌクレオチドからなるＤＮＡ断片。
5. 請求項２または３に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
6. 請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
7. 請求項６に記載の形質転換体を培養し、得られる培養形質転換体またはその培養上清からポリペプチドを回収することを含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
8. 請求項１に記載のポリペプチドに結合する抗体。
9. 請求項１に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、
   （ａ）該ポリペプチドに被検試料を接触させる工程、
   （ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、および
   （ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
10. 請求項９に記載の方法により単離し得る、請求項１に記載のポリペプチドに結合する化合物。
11. 請求項１に記載のポリペプチドのＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
    （ａ）該ポリペプチドに被検試料とＧＤＰ−フコースを接触させる工程、
    （ｂ）該ポリペプチドのＧＤＰ−フコース取り込み能を検出する工程、および
    （ｃ）ポリペプチドのＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する化合物を選択する工程、を含む方法。
12. 請求項１１に記載の方法により単離し得る、請求項１に記載のポリペプチドのＧＤＰ−フコース輸送活性を阻害する化合物。
13. ゴルジ体内に存在するフコースが減少しているゴルジ体を有する細胞。
14. フコース輸送能が低下または欠損している細胞。
15. ゴルジ体へのフコース取り込み活性が低下または欠損している細胞。
16. フコーストランスポーターに結合する化合物またはフコース輸送活性を阻害する化合物で処理されている請求項１３から１５のいずれか１項に記載の細胞。
17. フコーストランスポーターの発現が人為的に抑制されている細胞。
18. フコーストランスポーターの発現がＲＮＡｉを用いて抑制されている請求項１７記載の細胞。
19. フコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞。
20. 動物細胞である請求項１３から１９のいずれか１項に記載の細胞。
21. 動物がチャイニーズハムスター細胞である、請求項２０記載の細胞。
22. 動物細胞がＣＨＯ細胞である請求項２０記載の細胞。
23. 遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより行われる、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の細胞。
24. フコーストランスポーターをコードする遺伝子をターゲットとしたターゲティングベクター。
25. フコーストランスポーターがチャイニーズハムスターフコーストランスポーターである請求項２４記載のターゲティングベクター。
26. 組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞のゴルジ体内に存在するフコースを減少させることを特徴とするタンパク質の製造方法。
27. 組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することを特徴とするタンパク質の製造方法。
28. 組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるフコーストランスポーターを介したフコースの取り込みを阻害することを特徴とするタンパク質の製造方法。
29. 組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とするタンパク質の製造方法。
30. 組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるフコーストランスポーターの発現を人為的に抑制することによりフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とする請求項２６から２９のいずれか１項に記載のタンパク質製造方法。
31. フコーストランスポーターの発現がＲＮＡｉを用いて抑制される請求項３０記載のタンパク質製造方法。
32. 組換えタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞におけるフコーストランスポーターをコードする遺伝子を欠損することによりフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とする請求項２６から３０のいずれか１項に記載のタンパク質製造方法。
33. タンパク質が抗体である請求項２６から３２のいずれか１項に記載の製造方法。
34. フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする請求項２６から３３のいずれか１項に記載の製造方法。
35. 宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項２６から３４のいずれか１項に記載の製造方法。
36. 宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときに宿主細胞のゴルジ体内に存在するフコースを減少させることを特徴とするタンパク質へのフコースの付加阻害方法。
37. 宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときに宿主細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害することを特徴とするタンパク質へのフコース付加阻害方法。
38. 宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときにフコーストランスポーターの発現を人為的に抑制することを特徴とする請求項３６または３７に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
39. フコーストランスポーターの発現がＲＮＡｉを用いて抑制される請求項３８記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
40. 宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときにフコーストランスポーターをコードする遺伝子を欠損することを特徴とする請求項３６から３８のいずれか１項に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
41. 宿主細胞を用いて組換えタンパク質を製造するときにフコーストランスポーターを介したフコースの取り込みを阻害することを特徴とするタンパク質へのフコース付加阻害方法。
42. タンパク質が抗体である請求項３６から４１のいずれか１項に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
43. 宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項３６から４２のいずれか１項に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
44. ゴルジ体内に存在するフコースが減少した細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性を増加させる方法。
45. 宿主細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害した細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法。
46. フコーストランスポーターの発現を人為的に抑制している細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法。
47. フコーストランスポーターをコードする遺伝子が欠損している細胞で抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法。
48. ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害して抗体を作製することを特徴とする抗体の細胞障害活性増加方法。
49. 宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項４４から４８のいずれか１項に記載の抗体の細胞障害活性増加方法。

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