JP2001333787A - 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞 - Google Patents
動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞Info
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- JP2001333787A JP2001333787A JP2001062704A JP2001062704A JP2001333787A JP 2001333787 A JP2001333787 A JP 2001333787A JP 2001062704 A JP2001062704 A JP 2001062704A JP 2001062704 A JP2001062704 A JP 2001062704A JP 2001333787 A JP2001333787 A JP 2001333787A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物型の糖鎖を有する植物細胞を提供する。
【解決手段】 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞であ
って、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチル
グルコサミン残基にフコース残基を転移し得る、動物由
来の酵素をコードする遺伝子が導入された、植物細胞。
って、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチル
グルコサミン残基にフコース残基を転移し得る、動物由
来の酵素をコードする遺伝子が導入された、植物細胞。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物型糖鎖付加機
能をもつ植物細胞、該植物細胞から再生された植物体、
該植物細胞を生産する方法、該植物細胞を用いて動物型
糖タンパク質を生産する方法に関する。
能をもつ植物細胞、該植物細胞から再生された植物体、
該植物細胞を生産する方法、該植物細胞を用いて動物型
糖タンパク質を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物細胞を、従来の古典的な育種法によ
り改良するのではなく、遺伝子操作技術により植物細胞
を改良し、さらに、新たな形質または有用形質をも付与
することが可能となった。例えば、これまでに、耐病
性、除草剤耐性、日持ちなどが改良された植物体が創製
され、そして利用されている。また、従来、動物細胞、
酵母、大腸菌などの微生物を用いて生産されてきた有用
タンパク質が、植物細胞または植物体で生産できるよう
になってきた。
り改良するのではなく、遺伝子操作技術により植物細胞
を改良し、さらに、新たな形質または有用形質をも付与
することが可能となった。例えば、これまでに、耐病
性、除草剤耐性、日持ちなどが改良された植物体が創製
され、そして利用されている。また、従来、動物細胞、
酵母、大腸菌などの微生物を用いて生産されてきた有用
タンパク質が、植物細胞または植物体で生産できるよう
になってきた。
【０００３】現在までに、植物細胞または植物体におけ
る単純タンパク質または糖タンパク質を発現した例とし
て以下の報告がある。
る単純タンパク質または糖タンパク質を発現した例とし
て以下の報告がある。
【０００４】α−１−アンチトリプシンについて、Ａｐ
ｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １
９９９ Ｏｃｔ;５２（４）：５１６−２３ Ｔｅｒａｓ
ｈｉｍａ Ｍ，Ｍｕｒａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｕｒａ
Ｍ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｓ，Ｓｔｏｌｔｚ Ｔ，Ｃｈ
ｅｎ Ｌ，Ｄｒｏｈａｎ Ｗ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ
Ｌ，Ｋａｔｏｈ Ｓ；α−アミラーゼについて、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ） １９９２ Ｍａｒ；
１０（３）：２９２−６ Ｐｅｎ Ｊ，Ｍｏｌｅｎｄｉ
ｊｋ Ｌ，Ｑｕａｘ ＷＪ，Ｓｉｊｍｏｎｓ ＰＣ，ｖ
ａｎ Ｏｏｙｅｎ ＡＪ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ
ＰＪ，Ｒｉｅｔｖｅｌｄ Ｋ，Ｈｏｅｋｅｍａ Ａ；
ヘモグロビンについて、Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｍａ
ｒ ６；３８６（６６２０）：２９−３０ Ｄｉｅｒｙ
ｃｋ Ｗ，Ｐａｇｎｉｅｒ Ｊ，Ｐｏｙａｒｔ Ｃ，Ｍ
ａｒｄｅｎ ＭＣ，Ｇｒｕｂｅｒ Ｖ，ＢｏｕＲＮＡｔ
Ｐ，Ｂａｕｄｉｎｏ Ｓ，Ｍｅｒｏｔ Ｂ；キシラナー
ゼについて、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９
Ｍａｙ；１７（５）：４６６−９ Ｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ．
Ｂｏｒｉｓｊｕｋ ＮＶ，Ｂｏｒｉｓｊｕｋ ＬＧ，Ｌ
ｏｇｅｎｄｒａ Ｓ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｆ，Ｇｌｅｂ
ａ Ｙ，Ｒａｓｋｉｎ Ｉ；抗体について、Ｅｕｒ Ｊ
Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９ Ｊｕｎ；２６２（３）：
８１０−６ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒ，Ｓｃｈｕｍａｎｎ
Ｄ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｄｒｏｓｓａｒｄ
Ｊ，Ｓａｃｋ Ｍ，Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ Ｓ、Ｊ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９ Ｊｕｎ ２
４；２２６（１−２）：１−１０ Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｒ，Ｌｉａｏ ＹＣ，Ｄｒｏｓｓａｒｄ Ｊ．Ｃｕｒｒ
Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９
９；２３６：２７５−９２ Ｍａ ＪＫ， Ｖｉｎｅ
ＮＤ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９８
Ｎｏｖ １；２２０（１−２）：６９−７５ Ｖｅｒ
ｃｈ Ｔ，Ｙｕｓｉｂｏｖ Ｖ，Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ
Ｈ；フィターゼについて、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９ Ｏｃｔ １
４；２６４（１）：２０１−６ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｎ
ｇａｌ ｐｈｙｔａｓｅ （ｐｈｙＡ） ｅｘｐｒｅｓ
ｓｅｄ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ． Ｕｌ
ｌａｈ ＡＨ，Ｓｅｔｈｕｍａｄｈａｖａｎ Ｋ，Ｍｕ
ｌｌａｎｅｙ ＥＪ，Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ Ｔ，
Ａｕｓｔｉｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ １９９７ Ｊｕｌ；１１４（３）：１１
０３−１１ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ
ｓｏｙｂｅａｎ ｃｅｌｌ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｌｉ Ｊ，Ｈｅｇｅｍａｎ Ｃ
Ｅ，Ｈａｎｌｏｎ ＲＷ，ＬａｃｙＧＨ，Ｄｅｎｂｏｗ
ＭＤ，Ｇｒａｂａｕ ＥＡ；ヒト血清アルブミンにつ
いて、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １９９
０ Ｍａｒ；８（３）：２１７−２１ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅ
ｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ． Ｓｉｊｍｏｎｓ
ＰＣ，Ｄｅｋｋｅｒ ＢＭ，Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅ
ｒ Ｂ，Ｖｅｒｗｏｅｒｄ ＴＣ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｌｚｅｎ ＰＪ，Ｈｏｅｋｅｍａ Ａ；ヒトラクトアル
ブミンについて、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）
１９９８ Ｍａｒ；１２３（３）：４４０−４ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｌａ
ｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏ
ｂａｃｃｏ．Ｔａｋａｓｅ Ｋ，ＨａｇｉｗａｒａＫ；
ヒトインターフェロンについて、Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎ Ｒｅｓ １９９２ Ｄｅｃ；１２（６）：４４９
−５３ Ｅｄｅｌｂａｕｍ Ｏ，Ｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｈｏ
ｌｌａｎｄ Ｎ，Ｇａｆｎｉ Ｙ，Ｌｉｖｎｅｈ Ｏ，
Ｎｏｖｉｃｋ Ｄ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｓｅｌ
ａ Ｉ；ヒトイドウロニナーゼについて、Ｃｕｒｒ Ｔ
ｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９
９；２４０：９５−１１８ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐ
ｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ： ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａ
ｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．
Ｃｒａｍｅｒ ＣＬ，Ｂｏｏｔｈｅ ＪＧ，Ｏｉｓｈｉ
ＫＫ；ＧＭ−ＣＳＦについて、ＣＭＡＪ １９９５
Ａｕｇ １５；１５３（４）：４２７−９ Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ Ａ；ヒルジンについて、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ １９９５ Ｄｅｃ；２９（６）：１１６７−
８０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｌｙａｃｔｉｖｅ ｈｉｒｕｄｉｎ ｉｎ ｐｌａ
ｎｔ ｓｅｅｄｓ ｕｓｉｎｇｏｌｅｏｓｉｎ ｐａｒ
ｔｉｔｉｏｎｉｎｇ． Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ ＤＬ，Ｂ
ｏｏｔｈｅ ＪＧ，ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ ＧＪ，Ｙ
ｅｕｎｇ ＥＣ，Ｍｏｌｏｎｅｙ ＭＭ；ヒトラクトフ
ェリンについて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉ
ｆ １９９８ Ｊｕｎ；１３（１）：１２７−３５ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｃｔｏｆ
ｅｒｒｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃ
ｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｓａｌｍｏｎ Ｖ，Ｌｅｇｒａｎｄ
Ｄ，Ｓｌｏｍｉａｎｎｙ ＭＣ，ｅｌ Ｙａｚｉｄｉ
Ｉ，Ｓｐｉｋ Ｇ，Ｇｒｕｂｅｒ Ｖ，ＢｏｕＲＮＡ
ｔ Ｐ，Ｏｌａｇｎｉｅｒ Ｂ，Ｍｉｓｏｎ Ｄ，Ｔｈ
ｅｉｓｅｎ Ｍ，Ｍｅｒｏｔ Ｂ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ １９９４ Ｎｏｖ；１０６（３）：９７７−
８１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ
ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｃＤＮＡ ｉｎ ｔｏｂａｃ
ｃｏ ｃｅｌｌｓｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎｔｉｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）．Ｍｉｔｒａ Ａ，
Ｚｈａｎｇ Ｚ；アンジオテンシン転移酵素阻害ペプチ
ドについて（トマトおよびタバコ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ） １９９３Ａｕｇ；１１
（８）：９３０−２ Ｈａｍａｍｏｔｏ Ｈ，Ｓｕｇｉ
ｙａｍａＹ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｎ，Ｈａｓｈｉｄａ
Ｅ，Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｙ，Ｔａｋｅｍｏｔｏ Ｓ，
Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ，Ｏｋａｄａ Ｙ；ポリヒドロキ
シブチレンについて、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
１９９９ Ｏｃｔ；１７（１０）：１０１１−６ Ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆＡｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｆｏｒ
ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ−ｃ
ｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ） ｃｏｐｏ
ｌｙｍｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｌａｔｅｒ
Ｓ，Ｍｉｔｓｋｙ ＴＡ，Ｈｏｕｍｉｅｌ ＫＬ，Ｈａ
ｏ Ｍ，Ｒｅｉｓｅｒ ＳＥ，Ｔａｙｌｏｒ ＮＢ，Ｔ
ｒａｎ Ｍ，Ｖａｌｅｎｔｉｎ ＨＥ，Ｒｏｄｒｉｇｕ
ｅｚＤＪ，Ｓｔｏｎｅ ＤＡ，Ｐａｄｇｅｔｔｅ Ｓ
Ｒ，Ｋｉｓｈｏｒｅ Ｇ，Ｇｒｕｙｓ ＫＪ Ｐｌａｎ
ｔａ １９９９ Ｏｃｔ；２０９（４）：５４７−５０
Ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔ
ｅ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｏｉｌｓｅｅｄ
ｌｅｕｋｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ｂｒａｓｓｉｃａ ｎ
ａｐｕｓ．Ｈｏｕｍｉｅｌ ＫＬ，Ｓｌａｔｅｒ Ｓ，
ＢｒｏｙｌｅｓＤ，Ｃａｓａｇｒａｎｄｅ Ｌ，Ｃｏｌ
ｂｕｒｎ Ｓ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｋ，Ｍｉｔｓｋｙ
ＴＡ，Ｒｅｉｓｅｒ ＳＥ，Ｓｈａｈ Ｄ，Ｔａｙｌｏ
ｒ ＮＢ，Ｔｒａｎ Ｍ，Ｖａｌｅｎｔｉｎ ＨＥ，Ｇ
ｒｕｙｓ ＫＪ；グルコセレブロシダーゼについて、Ａ
ｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９６ Ｍａｙ２
５；７９２：６２−７１ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｕｍａｎｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ．ＣｒａｍｅｒＣＬ，Ｗｅ
ｉｓｓｅｎｂｏｒｎ ＤＬ，Ｏｉｓｈｉ ＫＫ，Ｇｒａ
ｂａｕ ＥＡ，Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｓ，Ｐｏｎｃｅ Ｅ，
Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ ＧＡ，Ｒａｄｉｎ ＤＮ Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
９９９；２４０：９５−１１８ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ： ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ
ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｔｒａｔｅｇｉｅ
ｓ．Ｃｒａｍｅｒ ＣＬ， Ｂｏｏｔｈｅ ＪＧ， Ｏ
ｉｓｈｉ ＫＫ；グルクロニダーゼについて、Ａｄｖ
Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９９；４６４：１２７
−４７ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆａｒｍｉｎｇ ｏｆ
ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ．Ｈｏｏｄ ＥＥ，
Ｋｕｓｎａｄｉ Ａ，Ｎｉｋｏｌｏｖ Ｚ，Ｈｏｗａｒ
ｄ ＪＡ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ １９９
８ Ｏｃｔ ５；６０（１）：４４−５２、Ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃｏｒｎ
ｓｅｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈ
ｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ．Ｋｕｓｎａ
ｄｉ ＡＲ，Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ ＲＬ，Ｈｏｏｄ
ＥＥ，Ｈｏｗａｒｄ ＪＡ，Ｎｉｋｏｌｏｖ ＺＬ；
エリスロポエチンについて、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ １９９５ Ｍａｒ；２７（６）：１１６３−７２
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ，Ｉｋｕｒａ Ｋ，Ｕｅｄａ
Ｍ，Ｓａｓａｋｉ Ｒ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９３ Ａｕｇ；５７
（８）：１２４９−５２ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ，Ｉ
ｓｈｉｉ Ａ，Ｉｋｕｒａ Ｋ，Ｕｅｄａ Ｍ，Ｓａｓ
ａｋｉ Ｒ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒ
ｂｏｘｙｌａｓｅ Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７ Ｊｕ
ｌ；３（７）：７９３−６ Ｍａ ＳＷ，ＺｈａｏＤ
Ｌ，Ｙｉｎ ＺＱ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ，Ｓｉｎｇ
ｈ Ｂ，Ｑｉｎ ＨＹ，Ｓｔｉｌｌｅｒ ＣＲ，Ｊｅｖ
ｎｉｋａｒ ＡＭ Ａｄｖ Ｅｘｐ ＭｅｄＢｉｏｌ
１９９９；４６４：１７９−９４ Ｍａ Ｓ，Ｊｅｖｎ
ｉｋａｒＡＭ、など。
ｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １
９９９ Ｏｃｔ;５２（４）：５１６−２３ Ｔｅｒａｓ
ｈｉｍａ Ｍ，Ｍｕｒａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｕｒａ
Ｍ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｓ，Ｓｔｏｌｔｚ Ｔ，Ｃｈ
ｅｎ Ｌ，Ｄｒｏｈａｎ Ｗ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ
Ｌ，Ｋａｔｏｈ Ｓ；α−アミラーゼについて、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ） １９９２ Ｍａｒ；
１０（３）：２９２−６ Ｐｅｎ Ｊ，Ｍｏｌｅｎｄｉ
ｊｋ Ｌ，Ｑｕａｘ ＷＪ，Ｓｉｊｍｏｎｓ ＰＣ，ｖ
ａｎ Ｏｏｙｅｎ ＡＪ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ
ＰＪ，Ｒｉｅｔｖｅｌｄ Ｋ，Ｈｏｅｋｅｍａ Ａ；
ヘモグロビンについて、Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｍａ
ｒ ６；３８６（６６２０）：２９−３０ Ｄｉｅｒｙ
ｃｋ Ｗ，Ｐａｇｎｉｅｒ Ｊ，Ｐｏｙａｒｔ Ｃ，Ｍ
ａｒｄｅｎ ＭＣ，Ｇｒｕｂｅｒ Ｖ，ＢｏｕＲＮＡｔ
Ｐ，Ｂａｕｄｉｎｏ Ｓ，Ｍｅｒｏｔ Ｂ；キシラナー
ゼについて、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９
Ｍａｙ；１７（５）：４６６−９ Ｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ．
Ｂｏｒｉｓｊｕｋ ＮＶ，Ｂｏｒｉｓｊｕｋ ＬＧ，Ｌ
ｏｇｅｎｄｒａ Ｓ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｆ，Ｇｌｅｂ
ａ Ｙ，Ｒａｓｋｉｎ Ｉ；抗体について、Ｅｕｒ Ｊ
Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９ Ｊｕｎ；２６２（３）：
８１０−６ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒ，Ｓｃｈｕｍａｎｎ
Ｄ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｄｒｏｓｓａｒｄ
Ｊ，Ｓａｃｋ Ｍ，Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ Ｓ、Ｊ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９ Ｊｕｎ ２
４；２２６（１−２）：１−１０ Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｒ，Ｌｉａｏ ＹＣ，Ｄｒｏｓｓａｒｄ Ｊ．Ｃｕｒｒ
Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９
９；２３６：２７５−９２ Ｍａ ＪＫ， Ｖｉｎｅ
ＮＤ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９８
Ｎｏｖ １；２２０（１−２）：６９−７５ Ｖｅｒ
ｃｈ Ｔ，Ｙｕｓｉｂｏｖ Ｖ，Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ
Ｈ；フィターゼについて、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９ Ｏｃｔ １
４；２６４（１）：２０１−６ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｎ
ｇａｌ ｐｈｙｔａｓｅ （ｐｈｙＡ） ｅｘｐｒｅｓ
ｓｅｄ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ． Ｕｌ
ｌａｈ ＡＨ，Ｓｅｔｈｕｍａｄｈａｖａｎ Ｋ，Ｍｕ
ｌｌａｎｅｙ ＥＪ，Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ Ｔ，
Ａｕｓｔｉｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ １９９７ Ｊｕｌ；１１４（３）：１１
０３−１１ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ
ｓｏｙｂｅａｎ ｃｅｌｌ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｌｉ Ｊ，Ｈｅｇｅｍａｎ Ｃ
Ｅ，Ｈａｎｌｏｎ ＲＷ，ＬａｃｙＧＨ，Ｄｅｎｂｏｗ
ＭＤ，Ｇｒａｂａｕ ＥＡ；ヒト血清アルブミンにつ
いて、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １９９
０ Ｍａｒ；８（３）：２１７−２１ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅ
ｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ． Ｓｉｊｍｏｎｓ
ＰＣ，Ｄｅｋｋｅｒ ＢＭ，Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅ
ｒ Ｂ，Ｖｅｒｗｏｅｒｄ ＴＣ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｌｚｅｎ ＰＪ，Ｈｏｅｋｅｍａ Ａ；ヒトラクトアル
ブミンについて、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）
１９９８ Ｍａｒ；１２３（３）：４４０−４ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｌａ
ｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏ
ｂａｃｃｏ．Ｔａｋａｓｅ Ｋ，ＨａｇｉｗａｒａＫ；
ヒトインターフェロンについて、Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎ Ｒｅｓ １９９２ Ｄｅｃ；１２（６）：４４９
−５３ Ｅｄｅｌｂａｕｍ Ｏ，Ｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｈｏ
ｌｌａｎｄ Ｎ，Ｇａｆｎｉ Ｙ，Ｌｉｖｎｅｈ Ｏ，
Ｎｏｖｉｃｋ Ｄ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｓｅｌ
ａ Ｉ；ヒトイドウロニナーゼについて、Ｃｕｒｒ Ｔ
ｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９
９；２４０：９５−１１８ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐ
ｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ： ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａ
ｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．
Ｃｒａｍｅｒ ＣＬ，Ｂｏｏｔｈｅ ＪＧ，Ｏｉｓｈｉ
ＫＫ；ＧＭ−ＣＳＦについて、ＣＭＡＪ １９９５
Ａｕｇ １５；１５３（４）：４２７−９ Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ Ａ；ヒルジンについて、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ １９９５ Ｄｅｃ；２９（６）：１１６７−
８０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｌｙａｃｔｉｖｅ ｈｉｒｕｄｉｎ ｉｎ ｐｌａ
ｎｔ ｓｅｅｄｓ ｕｓｉｎｇｏｌｅｏｓｉｎ ｐａｒ
ｔｉｔｉｏｎｉｎｇ． Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ ＤＬ，Ｂ
ｏｏｔｈｅ ＪＧ，ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ ＧＪ，Ｙ
ｅｕｎｇ ＥＣ，Ｍｏｌｏｎｅｙ ＭＭ；ヒトラクトフ
ェリンについて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉ
ｆ １９９８ Ｊｕｎ；１３（１）：１２７−３５ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｃｔｏｆ
ｅｒｒｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃ
ｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｓａｌｍｏｎ Ｖ，Ｌｅｇｒａｎｄ
Ｄ，Ｓｌｏｍｉａｎｎｙ ＭＣ，ｅｌ Ｙａｚｉｄｉ
Ｉ，Ｓｐｉｋ Ｇ，Ｇｒｕｂｅｒ Ｖ，ＢｏｕＲＮＡ
ｔ Ｐ，Ｏｌａｇｎｉｅｒ Ｂ，Ｍｉｓｏｎ Ｄ，Ｔｈ
ｅｉｓｅｎ Ｍ，Ｍｅｒｏｔ Ｂ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ １９９４ Ｎｏｖ；１０６（３）：９７７−
８１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ
ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｃＤＮＡ ｉｎ ｔｏｂａｃ
ｃｏ ｃｅｌｌｓｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎｔｉｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）．Ｍｉｔｒａ Ａ，
Ｚｈａｎｇ Ｚ；アンジオテンシン転移酵素阻害ペプチ
ドについて（トマトおよびタバコ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ） １９９３Ａｕｇ；１１
（８）：９３０−２ Ｈａｍａｍｏｔｏ Ｈ，Ｓｕｇｉ
ｙａｍａＹ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｎ，Ｈａｓｈｉｄａ
Ｅ，Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｙ，Ｔａｋｅｍｏｔｏ Ｓ，
Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ，Ｏｋａｄａ Ｙ；ポリヒドロキ
シブチレンについて、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
１９９９ Ｏｃｔ；１７（１０）：１０１１−６ Ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆＡｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｆｏｒ
ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ−ｃ
ｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ） ｃｏｐｏ
ｌｙｍｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｌａｔｅｒ
Ｓ，Ｍｉｔｓｋｙ ＴＡ，Ｈｏｕｍｉｅｌ ＫＬ，Ｈａ
ｏ Ｍ，Ｒｅｉｓｅｒ ＳＥ，Ｔａｙｌｏｒ ＮＢ，Ｔ
ｒａｎ Ｍ，Ｖａｌｅｎｔｉｎ ＨＥ，Ｒｏｄｒｉｇｕ
ｅｚＤＪ，Ｓｔｏｎｅ ＤＡ，Ｐａｄｇｅｔｔｅ Ｓ
Ｒ，Ｋｉｓｈｏｒｅ Ｇ，Ｇｒｕｙｓ ＫＪ Ｐｌａｎ
ｔａ １９９９ Ｏｃｔ；２０９（４）：５４７−５０
Ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔ
ｅ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｏｉｌｓｅｅｄ
ｌｅｕｋｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ｂｒａｓｓｉｃａ ｎ
ａｐｕｓ．Ｈｏｕｍｉｅｌ ＫＬ，Ｓｌａｔｅｒ Ｓ，
ＢｒｏｙｌｅｓＤ，Ｃａｓａｇｒａｎｄｅ Ｌ，Ｃｏｌ
ｂｕｒｎ Ｓ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｋ，Ｍｉｔｓｋｙ
ＴＡ，Ｒｅｉｓｅｒ ＳＥ，Ｓｈａｈ Ｄ，Ｔａｙｌｏ
ｒ ＮＢ，Ｔｒａｎ Ｍ，Ｖａｌｅｎｔｉｎ ＨＥ，Ｇ
ｒｕｙｓ ＫＪ；グルコセレブロシダーゼについて、Ａ
ｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９６ Ｍａｙ２
５；７９２：６２−７１ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｕｍａｎｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ．ＣｒａｍｅｒＣＬ，Ｗｅ
ｉｓｓｅｎｂｏｒｎ ＤＬ，Ｏｉｓｈｉ ＫＫ，Ｇｒａ
ｂａｕ ＥＡ，Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｓ，Ｐｏｎｃｅ Ｅ，
Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ ＧＡ，Ｒａｄｉｎ ＤＮ Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
９９９；２４０：９５−１１８ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ： ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ
ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｔｒａｔｅｇｉｅ
ｓ．Ｃｒａｍｅｒ ＣＬ， Ｂｏｏｔｈｅ ＪＧ， Ｏ
ｉｓｈｉ ＫＫ；グルクロニダーゼについて、Ａｄｖ
Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９９；４６４：１２７
−４７ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆａｒｍｉｎｇ ｏｆ
ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ．Ｈｏｏｄ ＥＥ，
Ｋｕｓｎａｄｉ Ａ，Ｎｉｋｏｌｏｖ Ｚ，Ｈｏｗａｒ
ｄ ＪＡ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ １９９
８ Ｏｃｔ ５；６０（１）：４４−５２、Ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃｏｒｎ
ｓｅｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈ
ｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ．Ｋｕｓｎａ
ｄｉ ＡＲ，Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ ＲＬ，Ｈｏｏｄ
ＥＥ，Ｈｏｗａｒｄ ＪＡ，Ｎｉｋｏｌｏｖ ＺＬ；
エリスロポエチンについて、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ １９９５ Ｍａｒ；２７（６）：１１６３−７２
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ，Ｉｋｕｒａ Ｋ，Ｕｅｄａ
Ｍ，Ｓａｓａｋｉ Ｒ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９３ Ａｕｇ；５７
（８）：１２４９−５２ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ，Ｉ
ｓｈｉｉ Ａ，Ｉｋｕｒａ Ｋ，Ｕｅｄａ Ｍ，Ｓａｓ
ａｋｉ Ｒ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒ
ｂｏｘｙｌａｓｅ Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７ Ｊｕ
ｌ；３（７）：７９３−６ Ｍａ ＳＷ，ＺｈａｏＤ
Ｌ，Ｙｉｎ ＺＱ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ，Ｓｉｎｇ
ｈ Ｂ，Ｑｉｎ ＨＹ，Ｓｔｉｌｌｅｒ ＣＲ，Ｊｅｖ
ｎｉｋａｒ ＡＭ Ａｄｖ Ｅｘｐ ＭｅｄＢｉｏｌ
１９９９；４６４：１７９−９４ Ｍａ Ｓ，Ｊｅｖｎ
ｉｋａｒＡＭ、など。
【０００５】有用タンパク質の生産のために、植物細胞
または植物体を宿主として用いる利点は、それがタンパ
ク質に糖鎖を付加する機能を有することである。
または植物体を宿主として用いる利点は、それがタンパ
ク質に糖鎖を付加する機能を有することである。
【０００６】遺伝子組換えタンパク質生産に一般的に用
いられている大腸菌には糖鎖付加機能はない。酵母は糖
鎖付加機能を有するが、動物とは異なる構造の糖鎖を付
加する。また動物においても、その種によって異なる構
造の糖鎖が付加される。さらに、動物の同一個体におい
てさえ、組織により、また発生および分化の段階などに
依存して、付加される糖鎖構造が大きく変わることが知
られている。
いられている大腸菌には糖鎖付加機能はない。酵母は糖
鎖付加機能を有するが、動物とは異なる構造の糖鎖を付
加する。また動物においても、その種によって異なる構
造の糖鎖が付加される。さらに、動物の同一個体におい
てさえ、組織により、また発生および分化の段階などに
依存して、付加される糖鎖構造が大きく変わることが知
られている。
【０００７】一般に、糖タンパク質の糖鎖構造は、その
結合様式により２種類に分類される。１つは、タンパク
質のアスパラギン残基に結合するＮ−結合型糖鎖であっ
て、他方は、タンパク質のセリンあるいはスレオニンに
結合するＯ−結合型糖鎖である。このうちＮ−結合型糖
鎖について注目すると、動物、植物、昆虫、酵母などで
は高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、およびそのハイブ
リッド型糖鎖が存在する。
結合様式により２種類に分類される。１つは、タンパク
質のアスパラギン残基に結合するＮ−結合型糖鎖であっ
て、他方は、タンパク質のセリンあるいはスレオニンに
結合するＯ−結合型糖鎖である。このうちＮ−結合型糖
鎖について注目すると、動物、植物、昆虫、酵母などで
は高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、およびそのハイブ
リッド型糖鎖が存在する。
【０００８】糖タンパク質糖鎖はコア構造（コア糖鎖）
を有している。コア糖鎖は、細胞の小胞体において、ま
ず脂質との複合体の形態で合成され、タンパク質に転移
する（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８５；
５４：６３１−６４ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ Ｒ， Ｋｏｒ
ｎｆｅｌｄ Ｓ）。そして、転移したコア糖鎖を有する
タンパク質は、小胞体からゴルジ体に輸送され、そこ
で、コア糖鎖にさらに糖が付加されて糖鎖が伸長してい
く。コルジ体におけるこの糖鎖の伸長は、末端部糖鎖合
成と呼ばれ、生物種に依存して大きく異なることが知ら
れている。
を有している。コア糖鎖は、細胞の小胞体において、ま
ず脂質との複合体の形態で合成され、タンパク質に転移
する（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８５；
５４：６３１−６４ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ Ｒ， Ｋｏｒ
ｎｆｅｌｄ Ｓ）。そして、転移したコア糖鎖を有する
タンパク質は、小胞体からゴルジ体に輸送され、そこ
で、コア糖鎖にさらに糖が付加されて糖鎖が伸長してい
く。コルジ体におけるこの糖鎖の伸長は、末端部糖鎖合
成と呼ばれ、生物種に依存して大きく異なることが知ら
れている。
【０００９】さらに、コア糖鎖内の還元末端部位に存在
するＮ-アセチルグルコサミン残基に付加するフコース
残基の結合様式も生物種により異なることから知られて
いる（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １
９９９ Ｄｅｃ ６；１４７３（１）：２１６−３６
Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ，Ｗｉ
ｌｓｏｎ ＩＢ，Ｍａｒｚ Ｌ）。
するＮ-アセチルグルコサミン残基に付加するフコース
残基の結合様式も生物種により異なることから知られて
いる（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １
９９９ Ｄｅｃ ６；１４７３（１）：２１６−３６
Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ，Ｗｉ
ｌｓｏｎ ＩＢ，Ｍａｒｚ Ｌ）。
【００１０】上記のように、植物は、動物と同様に糖鎖
付加機構を有しているので、有用糖タンパク質の生産宿
主として使用される可能性を持っている。しかし、生産
しようとするタンパク質が生理活性タンパク質である場
合、これらタンパク質の翻訳後修飾、特に糖鎖付加が首
尾良く行われなければ、生理活性タンパク質本来の活性
を示さないタンパク質もある。また、植物には、動物、
特にヒトの糖鎖付加機構と異なる機構も存在するため、
本来の糖タンパク質とは異なる構造の糖鎖が付加され、
得られた糖タンパク質がヒトに対して抗原性を示す可能
性が指摘されている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９
９９ Ａｐｒ；９（４）：３６５−７２Ｃａｂａｎｅｓ
−Ｍａｃｈｅｔｅａｕ Ｍ，Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−Ｌａ
ｉｎｅＡＣ，Ｌｏｕｔｅｌｉｅｒ−Ｂｏｕｒｈｉｓ
Ｃ，Ｌａｎｇｅ Ｃ，ＶｉｎｅＮＤ，Ｍａ ＪＫ，Ｌｅ
ｒｏｕｇｅ Ｐ，Ｆａｙｅ Ｌ）。
付加機構を有しているので、有用糖タンパク質の生産宿
主として使用される可能性を持っている。しかし、生産
しようとするタンパク質が生理活性タンパク質である場
合、これらタンパク質の翻訳後修飾、特に糖鎖付加が首
尾良く行われなければ、生理活性タンパク質本来の活性
を示さないタンパク質もある。また、植物には、動物、
特にヒトの糖鎖付加機構と異なる機構も存在するため、
本来の糖タンパク質とは異なる構造の糖鎖が付加され、
得られた糖タンパク質がヒトに対して抗原性を示す可能
性が指摘されている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９
９９ Ａｐｒ；９（４）：３６５−７２Ｃａｂａｎｅｓ
−Ｍａｃｈｅｔｅａｕ Ｍ，Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−Ｌａ
ｉｎｅＡＣ，Ｌｏｕｔｅｌｉｅｒ−Ｂｏｕｒｈｉｓ
Ｃ，Ｌａｎｇｅ Ｃ，ＶｉｎｅＮＤ，Ｍａ ＪＫ，Ｌｅ
ｒｏｕｇｅ Ｐ，Ｆａｙｅ Ｌ）。
【００１１】植物糖鎖の特徴的な構造は、コア糖鎖内の
還元末端部位に存在するＮ-アセチルグルコサミン残基
に付加するフコース残基の結合様式である。フコース残
基の結合様式は、これまでに、生物種により異なること
が報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ １９９９ Ｄｅｃ ６；１４７３（１）：２
１６−３６ Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ，Ａｌｔｍａｎ
ｎ Ｆ，ＷｉｌｓｏｎＩＢ，Ｍａｒｚ Ｌ）。植物では
α１，３−結合が（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９ Ｊａｎ；６３（１）：
３５−９ Ｐａｌａｃｐａｃ ＮＱ，Ｋｉｍｕｒａ
Ｙ，Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｓｅ
ｋｉ Ｔ；Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ １９９７ Ｎｏｖ；６１（１１）：１８６
６−７１ Ｋｉｍｕｒａ Ｙ，Ｏｈｎｏ Ａ，Ｔａｋａ
ｇｉ Ｓ；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１ Ｊ
ｕｌ １；１９９（１）：１６９−７９ Ｓｔｕｒｍ
Ａ）、ヒトやマウスなどの哺乳類ではα１，６−結合が
（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９１ Ｓｅｐ；１
（４）：３３７−４６ Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｍ，Ｋｏｂ
ａｔａ Ａ）それぞれ報告されている。図９に、植物と
動物の複合型糖鎖構造を示す。昆虫細胞ではα１，３−
結合とα１，６−結合の両方が見出されている（Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊＪ １９９８ Ｎｏｖ；１５（１１）：１
０５５−７０ Ｗｉｌｓｏｎ ＩＢ，Ａｌｔｍａｎｎ
Ｆ；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１ Ａｕｇ
１；１９９（３）：７４５−５１ Ｓｔａｕｄａｃｈｅ
ｒ Ｅ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ，Ｇｌｏｓｓｌ Ｊ，Ｍａ
ｒｚ Ｌ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｈ，Ｋａｍｅｒｌｉｎ
ｇ ＪＰ，Ｈａｒｄ Ｋ， Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ
ＪＦ）。
還元末端部位に存在するＮ-アセチルグルコサミン残基
に付加するフコース残基の結合様式である。フコース残
基の結合様式は、これまでに、生物種により異なること
が報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ １９９９ Ｄｅｃ ６；１４７３（１）：２
１６−３６ Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ，Ａｌｔｍａｎ
ｎ Ｆ，ＷｉｌｓｏｎＩＢ，Ｍａｒｚ Ｌ）。植物では
α１，３−結合が（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９ Ｊａｎ；６３（１）：
３５−９ Ｐａｌａｃｐａｃ ＮＱ，Ｋｉｍｕｒａ
Ｙ，Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｓｅ
ｋｉ Ｔ；Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ １９９７ Ｎｏｖ；６１（１１）：１８６
６−７１ Ｋｉｍｕｒａ Ｙ，Ｏｈｎｏ Ａ，Ｔａｋａ
ｇｉ Ｓ；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１ Ｊ
ｕｌ １；１９９（１）：１６９−７９ Ｓｔｕｒｍ
Ａ）、ヒトやマウスなどの哺乳類ではα１，６−結合が
（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９１ Ｓｅｐ；１
（４）：３３７−４６ Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｍ，Ｋｏｂ
ａｔａ Ａ）それぞれ報告されている。図９に、植物と
動物の複合型糖鎖構造を示す。昆虫細胞ではα１，３−
結合とα１，６−結合の両方が見出されている（Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊＪ １９９８ Ｎｏｖ；１５（１１）：１
０５５−７０ Ｗｉｌｓｏｎ ＩＢ，Ａｌｔｍａｎｎ
Ｆ；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１ Ａｕｇ
１；１９９（３）：７４５−５１ Ｓｔａｕｄａｃｈｅ
ｒ Ｅ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ，Ｇｌｏｓｓｌ Ｊ，Ｍａ
ｒｚ Ｌ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｈ，Ｋａｍｅｒｌｉｎ
ｇ ＪＰ，Ｈａｒｄ Ｋ， Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ
ＪＦ）。
【００１２】植物や昆虫に由来する糖タンパク質のα
１，３−結合を含む糖鎖部分は、ヒトに対する抗原性を
示す可能性がある（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９８
Ｎｏｖ；１５（１１）：１０５５−７０ Ｗｉｌｓｏ
ｎ ＩＢ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ；Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａ
ｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９ Ｆｅｂ−Ａ
ｐｒ；１１８（２−４）：４１１−３ Ｐｅｔｅｒｓｅ
ｎ Ａ，Ｇｒｏｂｅ Ｋ，Ｓｃｈｒａｍｍ Ｇ，Ｖｉｅ
ｔｈｓ Ｓ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ，Ｓｃｈｌａａｋ
Ｍ，Ｂｅｃｋｅｒ ＷＭ；Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅ
ｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９ Ｓｅｐ；１２０
（１）：３０−４２ Ｆｏｔｉｓｃｈ Ｋ，Ａｌｔｍａ
ｎｎ Ｆ，Ｈａｕｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｖｉｅｔｈｓ
Ｓ）。
１，３−結合を含む糖鎖部分は、ヒトに対する抗原性を
示す可能性がある（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９８
Ｎｏｖ；１５（１１）：１０５５−７０ Ｗｉｌｓｏ
ｎ ＩＢ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ；Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａ
ｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９ Ｆｅｂ−Ａ
ｐｒ；１１８（２−４）：４１１−３ Ｐｅｔｅｒｓｅ
ｎ Ａ，Ｇｒｏｂｅ Ｋ，Ｓｃｈｒａｍｍ Ｇ，Ｖｉｅ
ｔｈｓ Ｓ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ，Ｓｃｈｌａａｋ
Ｍ，Ｂｅｃｋｅｒ ＷＭ；Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅ
ｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９ Ｓｅｐ；１２０
（１）：３０−４２ Ｆｏｔｉｓｃｈ Ｋ，Ａｌｔｍａ
ｎｎ Ｆ，Ｈａｕｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｖｉｅｔｈｓ
Ｓ）。
【００１３】Ｎ−アセチルグルコサミン残基にフコース
残基を付加する酵素の遺伝子として、植物では、ヤエナ
リ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）からα１，３−フコシルトラ
ンスフェラーゼｃＤＮＡがクローニングされている（Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９ Ｊｕｌ ３０；２７
４（３１）：２１８３０−９ Ｌｅｉｔｅｒ Ｈ，Ｍｕ
ｃｈａ Ｊ，Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ，Ｇｒｉｍｍ
Ｒ，Ｇｌｏｓｓｌ Ｊ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ）。哺乳類
では、ヒトおよびブタからα１，６−フコシルトランス
フェラーゼｃＤＮＡがクローニングされている（Ｊ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １９９７ Ｍａｒ；１２
１（３）：６２６−３２ Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ，
Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｍｉｙｏｓｈｉ
Ｅ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
Ｎ； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１９９６ Ｎｏｖ １；
２７１（４４）：２７８１０−７ Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，
Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ，Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｅ，Ｉｈ
ａｒａ Ｙ，Ｓａｋｕｍａ Ｔ，Ｇａｏ ＣＸ，Ｔｅｓ
ｈｉｍａ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｓ，ＳｈｉｂａＴ，Ｔａｎ
ｉｇｕｃｈｉ Ｎ）。
残基を付加する酵素の遺伝子として、植物では、ヤエナ
リ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）からα１，３−フコシルトラ
ンスフェラーゼｃＤＮＡがクローニングされている（Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９ Ｊｕｌ ３０；２７
４（３１）：２１８３０−９ Ｌｅｉｔｅｒ Ｈ，Ｍｕ
ｃｈａ Ｊ，Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ，Ｇｒｉｍｍ
Ｒ，Ｇｌｏｓｓｌ Ｊ，Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ）。哺乳類
では、ヒトおよびブタからα１，６−フコシルトランス
フェラーゼｃＤＮＡがクローニングされている（Ｊ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １９９７ Ｍａｒ；１２
１（３）：６２６−３２ Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ，
Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｍｉｙｏｓｈｉ
Ｅ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
Ｎ； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１９９６ Ｎｏｖ １；
２７１（４４）：２７８１０−７ Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，
Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ，Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｅ，Ｉｈ
ａｒａ Ｙ，Ｓａｋｕｍａ Ｔ，Ｇａｏ ＣＸ，Ｔｅｓ
ｈｉｍａ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｓ，ＳｈｉｂａＴ，Ｔａｎ
ｉｇｕｃｈｉ Ｎ）。
【００１４】シロイズナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）においては、Ｎ-アセチルグルコ
サミン転移酵素Ｉ遺伝子の変異株が取得された。この変
異株では、Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ以降の
糖鎖プロセシングが停止していた（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ １９９３ Ａｕｇ；１０２（４）：１１０９
−１８ ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ Ａ，Ｓｔｕｒｍ
Ａ，Ｏ’ＮｅｉｌｌＪ，Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ Ｍ
Ｊ）。この変異株にヒト由来のＮ-アセチルグルコサミ
ン転移酵素ＩｃＤＮＡを導入すると、Ｎ-アセチルグル
コサミン転移酵素活性が回復した（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４Ｍａｒ １；９
１（５）：１８２９−３３ Ｇｏｍｅｚ Ｌ，Ｃｈｒｉ
ｓｐｅｅｌｓ ＭＪ）。これとは逆に、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＮ−アセチルグルコ
サミン転移酵素ＩｃＤＮＡをＮ-アセチルグルコサミン
転移酵素活性のないＣＨＯ細胞変異株Ｌｅｃ１に導入す
ると、ＣＨＯ細胞のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素
活性を回復できた（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９ Ａｕｇ １１；２６
１（３）：８２９−３２ Ｂａｋｋｅｒ Ｈ，Ｌｏｍｍ
ｅｎ Ａ，Ｊｏｒｄｉ Ｗ，Ｓｔｉｅｋｅｍａ Ｗ，Ｂ
ｏｓｃｈ Ｄ）。
ｔｈａｌｉａｎａ）においては、Ｎ-アセチルグルコ
サミン転移酵素Ｉ遺伝子の変異株が取得された。この変
異株では、Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ以降の
糖鎖プロセシングが停止していた（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ １９９３ Ａｕｇ；１０２（４）：１１０９
−１８ ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ Ａ，Ｓｔｕｒｍ
Ａ，Ｏ’ＮｅｉｌｌＪ，Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ Ｍ
Ｊ）。この変異株にヒト由来のＮ-アセチルグルコサミ
ン転移酵素ＩｃＤＮＡを導入すると、Ｎ-アセチルグル
コサミン転移酵素活性が回復した（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４Ｍａｒ １；９
１（５）：１８２９−３３ Ｇｏｍｅｚ Ｌ，Ｃｈｒｉ
ｓｐｅｅｌｓ ＭＪ）。これとは逆に、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＮ−アセチルグルコ
サミン転移酵素ＩｃＤＮＡをＮ-アセチルグルコサミン
転移酵素活性のないＣＨＯ細胞変異株Ｌｅｃ１に導入す
ると、ＣＨＯ細胞のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素
活性を回復できた（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９ Ａｕｇ １１；２６
１（３）：８２９−３２ Ｂａｋｋｅｒ Ｈ，Ｌｏｍｍ
ｅｎ Ａ，Ｊｏｒｄｉ Ｗ，Ｓｔｉｅｋｅｍａ Ｗ，Ｂ
ｏｓｃｈ Ｄ）。
【００１５】さらに、窒素固定菌Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｓｐ．ＮＧＲ２３４のｎｏｄファクター生合成に関わる
遺伝子のうち、ｎｏｄＺ遺伝子がフコース転移酵素をコ
ードすることが示された（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １
９９７ Ａｕｇ；１７９（１６）：５０８７−９３ Ｑ
ｕｅｓａｄａ−Ｖｉｎｃｅｎｓ Ｄ，ＦｅｌｌａｙＲ，
Ｎａｓｉｍ Ｔ，Ｖｉｐｒｅｙ Ｖ，Ｂｕｒｇｅｒ
Ｕ，Ｐｒｏｍｅ ＪＣ，Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ＷＪ，Ｊ
ａｂｂｏｕｒｉ Ｓ）。
ｓｐ．ＮＧＲ２３４のｎｏｄファクター生合成に関わる
遺伝子のうち、ｎｏｄＺ遺伝子がフコース転移酵素をコ
ードすることが示された（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １
９９７ Ａｕｇ；１７９（１６）：５０８７−９３ Ｑ
ｕｅｓａｄａ−Ｖｉｎｃｅｎｓ Ｄ，ＦｅｌｌａｙＲ，
Ｎａｓｉｍ Ｔ，Ｖｉｐｒｅｙ Ｖ，Ｂｕｒｇｅｒ
Ｕ，Ｐｒｏｍｅ ＪＣ，Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ＷＪ，Ｊ
ａｂｂｏｕｒｉ Ｓ）。
【００１６】また、Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎらは、Ｍｅｓｏ
ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉＮＺＰ２２１３では、α
１,３−フコシルトランスフェラーゼが、ｎｏｄファク
ター生合成に関与することを示した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １９９８ Ｊｕｎ２３；３７（２５）：９０
２４−３２ Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ ＭＭＡ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｌａｒａ ＩＭ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＢＯ，Ｂｏｃｋ
Ｋ，Ｈａｖｅｒｋａｍｐ Ｊ，Ｓｐａｉｎｋ ＨＰ，
Ｔｈｏｍａｓ−Ｏａｔｅｓ ＪＥ）。Ｍｅｓｏｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ由来のＮｏｄＺタンパク質は、Ｇ
ＤＰ−β−フコースのフコース残基を、キチンオリゴ糖
の還元末端Ｎ-アセチルグルコサミン残基のＣ６位に転
移する（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
Ｓ Ａ１９９７ Ａｐｒ ２９；９４（９）：４３３６
−４１ Ｑｕｉｎｔｏ Ｃ，Ｗｉｊｆｊｅｓ ＡＨＭ，
Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇ ＧＶ，Ｂｌｏｋ−Ｔｉｐ Ｌ，Ｌ
ｏｐｅｚ−Ｌａｒａ ＩＭ，Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｂ
Ｊ，Ｔｈｏｍａｓ−Ｏａｔｅｓ ＪＥ，Ｓｐａｉｎｋ
ＨＰ）。このＮｏｄＺタンパク質は、動物由来α１，６
-フコシルトランスフェラーゼと同じ酵素活性を持つ
が、アミノ酸配列レベルでの相同性はほとんどない（Ｇ
ｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９１ Ｄｅｃ；１
（６）：５７７−８４ Ｍａｃｈｅｒ ＢＡ，Ｈｏｌｍ
ｅｓ ＥＨ，Ｓｗｉｅｄｌｅｒ ＳＪ，Ｓｔｕｌｔｓ
ＣＬ，Ｓｒｎｋａ ＣＡ；Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｊ １
９９２ Ｎｏｖ；２４（１１）：７６１−７０ ｄｅ
ＶｒｉｅｓＴ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ Ｄ
Ｈ）。
ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉＮＺＰ２２１３では、α
１,３−フコシルトランスフェラーゼが、ｎｏｄファク
ター生合成に関与することを示した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １９９８ Ｊｕｎ２３；３７（２５）：９０
２４−３２ Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ ＭＭＡ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｌａｒａ ＩＭ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＢＯ，Ｂｏｃｋ
Ｋ，Ｈａｖｅｒｋａｍｐ Ｊ，Ｓｐａｉｎｋ ＨＰ，
Ｔｈｏｍａｓ−Ｏａｔｅｓ ＪＥ）。Ｍｅｓｏｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ由来のＮｏｄＺタンパク質は、Ｇ
ＤＰ−β−フコースのフコース残基を、キチンオリゴ糖
の還元末端Ｎ-アセチルグルコサミン残基のＣ６位に転
移する（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
Ｓ Ａ１９９７ Ａｐｒ ２９；９４（９）：４３３６
−４１ Ｑｕｉｎｔｏ Ｃ，Ｗｉｊｆｊｅｓ ＡＨＭ，
Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇ ＧＶ，Ｂｌｏｋ−Ｔｉｐ Ｌ，Ｌ
ｏｐｅｚ−Ｌａｒａ ＩＭ，Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｂ
Ｊ，Ｔｈｏｍａｓ−Ｏａｔｅｓ ＪＥ，Ｓｐａｉｎｋ
ＨＰ）。このＮｏｄＺタンパク質は、動物由来α１，６
-フコシルトランスフェラーゼと同じ酵素活性を持つ
が、アミノ酸配列レベルでの相同性はほとんどない（Ｇ
ｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９１ Ｄｅｃ；１
（６）：５７７−８４ Ｍａｃｈｅｒ ＢＡ，Ｈｏｌｍ
ｅｓ ＥＨ，Ｓｗｉｅｄｌｅｒ ＳＪ，Ｓｔｕｌｔｓ
ＣＬ，Ｓｒｎｋａ ＣＡ；Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｊ １
９９２ Ｎｏｖ；２４（１１）：７６１−７０ ｄｅ
ＶｒｉｅｓＴ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ Ｄ
Ｈ）。
【００１７】さらに、α１，６-フコシルトランスフェ
ラーゼ活性を持つＭ. ｌｏｔｉ由来ＮｏｄＺタンパク
質を、受精したゼブラフィッシュにマイクロインジェク
ションすると胚発生や、胴体と尻尾の奇形が生じた（Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ １９９７
Ｊｕｌ ２２；９４（１５）：７９８２−６ Ｂａｋ
ｋｅｒｓ Ｊ，Ｓｅｍｉｎｏ ＣＥ，Ｓｔｒｏｂａｎｄ
Ｈ，Ｋｉｊｎｅ ＪＷ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＷ，Ｓｐ
ａｉｎｋ ＨＰ；Ａｎｎ Ｎ Ｙ ＡｃａｄＳｃｉ １
９９８ Ａｐｒ １５；８４２：４９−５４ Ｓｅｍｉ
ｎｏ ＣＥ，Ａｌｌｅｎｄｅ ＭＬ，Ｂａｋｋｅｒｓ
Ｊ，Ｓｐａｉｎｋ ＨＰ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＰ）。
ラーゼ活性を持つＭ. ｌｏｔｉ由来ＮｏｄＺタンパク
質を、受精したゼブラフィッシュにマイクロインジェク
ションすると胚発生や、胴体と尻尾の奇形が生じた（Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ １９９７
Ｊｕｌ ２２；９４（１５）：７９８２−６ Ｂａｋ
ｋｅｒｓ Ｊ，Ｓｅｍｉｎｏ ＣＥ，Ｓｔｒｏｂａｎｄ
Ｈ，Ｋｉｊｎｅ ＪＷ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＷ，Ｓｐ
ａｉｎｋ ＨＰ；Ａｎｎ Ｎ Ｙ ＡｃａｄＳｃｉ １
９９８ Ａｐｒ １５；８４２：４９−５４ Ｓｅｍｉ
ｎｏ ＣＥ，Ａｌｌｅｎｄｅ ＭＬ，Ｂａｋｋｅｒｓ
Ｊ，Ｓｐａｉｎｋ ＨＰ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＰ）。
【００１８】また、植物細胞にヒト由来β１，４−ガラ
クトース転移酵素遺伝子ｃＤＮＡをタバコ培養細胞に導
入すると、植物細胞内でガラクトース残基を転移した糖
鎖構造が得られ、ヒト由来糖転移酵素遺伝子を導入する
ことで、植物細胞内糖鎖プロセシング経路をリモデリン
グできることが示されている（Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃ
ａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ａｐｒ １３；９６
（８）：４６９２−７ Ｐａｌａｃｐａｃ ＮＱ，Ｙｏ
ｓｈｉｄａ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｈ，Ｋｉｍｕｒａ Ｙ，
Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｓｅｋｉ
Ｔ）。
クトース転移酵素遺伝子ｃＤＮＡをタバコ培養細胞に導
入すると、植物細胞内でガラクトース残基を転移した糖
鎖構造が得られ、ヒト由来糖転移酵素遺伝子を導入する
ことで、植物細胞内糖鎖プロセシング経路をリモデリン
グできることが示されている（Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃ
ａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ａｐｒ １３；９６
（８）：４６９２−７ Ｐａｌａｃｐａｃ ＮＱ，Ｙｏ
ｓｈｉｄａ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｈ，Ｋｉｍｕｒａ Ｙ，
Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｓｅｋｉ
Ｔ）。
【００１９】さらに、Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ は、
タバコよりクローニングしたＮ-アセチルグルコサミン
転移酵素ＩｃＤＮＡを用いて、アンチセンス遺伝子サプ
レッション法あるいは転写後ジーンサイレンス法により
Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子発現を抑制し
たり、発現量を減少させることができることを示してい
る（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｆａｒｍｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏ
ｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ，Ａｕｇ．２９ Ｓ
ｅｐｔ．１，１９９９，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｏｏｋ，
Ｗ７９，ｐ．４６，Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ Ｈ）。
タバコよりクローニングしたＮ-アセチルグルコサミン
転移酵素ＩｃＤＮＡを用いて、アンチセンス遺伝子サプ
レッション法あるいは転写後ジーンサイレンス法により
Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子発現を抑制し
たり、発現量を減少させることができることを示してい
る（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｆａｒｍｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏ
ｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ，Ａｕｇ．２９ Ｓ
ｅｐｔ．１，１９９９，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｏｏｋ，
Ｗ７９，ｐ．４６，Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｎｅｒ Ｈ）。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記の
ような生物における異なる糖鎖付加機能の存在に起因す
る問題を鋭意研究し、本発明を完成するに至った。本発
明は、植物細胞に元来存在しなかったフコース転移酵素
の遺伝子を導入することにより、上記従来の課題を解決
し、動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞、該植物細胞か
ら再生された植物体、該植物細胞を生産する方法、該植
物細胞を用いて動物型糖タンパク質を生産する方法を提
供することを目的とする。
ような生物における異なる糖鎖付加機能の存在に起因す
る問題を鋭意研究し、本発明を完成するに至った。本発
明は、植物細胞に元来存在しなかったフコース転移酵素
の遺伝子を導入することにより、上記従来の課題を解決
し、動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞、該植物細胞か
ら再生された植物体、該植物細胞を生産する方法、該植
物細胞を用いて動物型糖タンパク質を生産する方法を提
供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明は、動物型糖鎖付
加機能をもつ植物細胞に関し、この植物細胞は、糖タン
パク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチルグルコサミン
残基にフコース残基を転移し得る、動物由来の酵素をコ
ードする遺伝子が導入されている。
加機能をもつ植物細胞に関し、この植物細胞は、糖タン
パク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチルグルコサミン
残基にフコース残基を転移し得る、動物由来の酵素をコ
ードする遺伝子が導入されている。
【００２２】好ましくは、上記動物由来の酵素は、α
１，６−フコシルトランスフェラーゼである。
１，６−フコシルトランスフェラーゼである。
【００２３】本発明は、１つの局面で、上記植物細胞か
ら再生された植物体に関する。
ら再生された植物体に関する。
【００２４】本発明は、１つの局面で、動物型糖鎖付加
機能をもつ植物細胞の生産方法に関し、この方法は、植
物細胞に、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセ
チルグルコサミン残基へのフコース残基の転移反応を行
い得る、動物由来の酵素をコードする遺伝子を導入する
工程を包含する。
機能をもつ植物細胞の生産方法に関し、この方法は、植
物細胞に、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセ
チルグルコサミン残基へのフコース残基の転移反応を行
い得る、動物由来の酵素をコードする遺伝子を導入する
工程を包含する。
【００２５】本発明は、１つの局面で、動物型糖鎖をも
つ糖タンパク質の生産方法に関し、この方法は、植物細
胞に、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチル
グルコサミン残基にフコース残基を転移し得る、動物由
来の酵素をコードする遺伝子および異種糖タンパク質を
コードする遺伝子を導入して形質転換植物細胞を得る工
程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を
包含する。
つ糖タンパク質の生産方法に関し、この方法は、植物細
胞に、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチル
グルコサミン残基にフコース残基を転移し得る、動物由
来の酵素をコードする遺伝子および異種糖タンパク質を
コードする遺伝子を導入して形質転換植物細胞を得る工
程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を
包含する。
【００２６】本発明はまた、上記方法によって得られた
動物型糖鎖をもつ糖タンパク質に関する。
動物型糖鎖をもつ糖タンパク質に関する。
【００２７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】本発明においては、他に特定されない限
り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分
析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの
手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して
行い得る。より詳細には、後述の−材料および方法−の
セクションこれら手法を記載する。
り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分
析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの
手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して
行い得る。より詳細には、後述の−材料および方法−の
セクションこれら手法を記載する。
【００２９】本発明の方法は、動物型糖鎖付加機能をも
つ植物細胞に関する。本明細書において、「動物型糖
鎖」とは、コア糖鎖内の還元末端部分に存在するＮ−ア
セチルグルコサミン残基に、フコース残基が、α１，６
−結合により結合している糖鎖を意味する。好ましく
は、上記フコース残基は、コア糖鎖の最内部にある、つ
まり、タンパク質のアスパラギン酸残基に結合するＮ−
アセチルグルコサミン残基に結合する。
つ植物細胞に関する。本明細書において、「動物型糖
鎖」とは、コア糖鎖内の還元末端部分に存在するＮ−ア
セチルグルコサミン残基に、フコース残基が、α１，６
−結合により結合している糖鎖を意味する。好ましく
は、上記フコース残基は、コア糖鎖の最内部にある、つ
まり、タンパク質のアスパラギン酸残基に結合するＮ−
アセチルグルコサミン残基に結合する。
【００３０】植物細胞は、任意の植物細胞であり得る。
植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植
物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養
細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましく
は培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植
物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得
る。 本発明の生産方法に使用され得る植物種の例とし
ては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、
ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙
げられる。
植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植
物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養
細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましく
は培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植
物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得
る。 本発明の生産方法に使用され得る植物種の例とし
ては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、
ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙
げられる。
【００３１】ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げ
られ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ト
ウガラシ、ペチュニアなどを含む。
ａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げ
られ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ト
ウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００３２】イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、
Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕ
ｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植
物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒ
エ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕ
ｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植
物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒ
エ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００３３】アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈ
ａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナ
ズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
ａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナ
ズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００３４】バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕ
ｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、また
はＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モ
モ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
ｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、また
はＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モ
モ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００３５】マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖ
ｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌ
ｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が
挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エ
ンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシ
などを含む。
ｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖ
ｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌ
ｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が
挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エ
ンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシ
などを含む。
【００３６】ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、
Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植
物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、
メロンなどを含む。
Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植
物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、
メロンなどを含む。
【００３７】シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄ
ｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソな
どを含む。
ｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソな
どを含む。
【００３８】ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌ
ｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植
物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュー
リップなどを含む。
ｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植
物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュー
リップなどを含む。
【００３９】アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａ
ｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウ
を含む。
ｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウ
を含む。
【００４０】セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉ
ｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、また
はＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシ
ウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
ｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、また
はＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシ
ウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００４１】本発明の生産方法に用いられる植物は、好
ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロ
コシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およ
びホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマ
ト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロ
コシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およ
びホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマ
ト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
【００４２】「還元末端アセチルグルコサミン残基にフ
コース残基を転移し得る酵素」とは、植物細胞内の糖タ
ンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生
じる還元末端アセチルグルコサミン残基にフコース残基
を転移し得る酵素である。このような酵素の例として
は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼが挙げられ
る。この酵素は、ＧＤＰ−フコースを糖供与体として、
糖タンパク質のＮ結合型糖鎖の最もペプチド鎖に近いＮ
−アセチルグルコサミンにα１，６−結合でフコースを
連結させる酵素である。この酵素は、任意の動物種に由
来し得るが、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒト
に由来することがより好ましい。
コース残基を転移し得る酵素」とは、植物細胞内の糖タ
ンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生
じる還元末端アセチルグルコサミン残基にフコース残基
を転移し得る酵素である。このような酵素の例として
は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼが挙げられ
る。この酵素は、ＧＤＰ−フコースを糖供与体として、
糖タンパク質のＮ結合型糖鎖の最もペプチド鎖に近いＮ
−アセチルグルコサミンにα１，６−結合でフコースを
連結させる酵素である。この酵素は、任意の動物種に由
来し得るが、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒト
に由来することがより好ましい。
【００４３】好ましくは、この酵素は、細胞内小器官に
局在化する酵素である。本発明者らは、特定の理論に拘
束されることは意図しないが、この酵素が細胞内小器官
（例えば、小胞体、ゴルジ体など）に存在することによ
って、植物細胞において異種タンパク質の還元末端部分
に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にフコース残
基がα１，６−結合により付加されるものと考えられ
る。
局在化する酵素である。本発明者らは、特定の理論に拘
束されることは意図しないが、この酵素が細胞内小器官
（例えば、小胞体、ゴルジ体など）に存在することによ
って、植物細胞において異種タンパク質の還元末端部分
に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にフコース残
基がα１，６−結合により付加されるものと考えられ
る。
【００４４】「還元末端アセチルグルコサミン残基にフ
コース残基を転移し得る酵素の遺伝子」は、この酵素を
コードすることが知られているヌクレオチド配列を用い
て任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを
購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なよう
に改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周
知である。
コース残基を転移し得る酵素の遺伝子」は、この酵素を
コードすることが知られているヌクレオチド配列を用い
て任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを
購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なよう
に改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周
知である。
【００４５】例えば、哺乳類では、ヒトおよびブタから
α１，６−フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡがクロ
ーニングされ（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １
９９７ Ｍａｒ；１２１（３）：６２６−３２ Ｙａｎ
ａｇｉｄａｎｉ Ｓ，Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｉｈａｒａ
Ｙ，Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｅ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｔ
ａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ；特開平１０−８４９７５、特開
平１０−４９５９；ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６
Ｎｏｖ １；２７１（４４）：２７８１０−７ Ｕｏｚ
ｕｍｉ Ｎ，Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ，Ｍｉｙｏｓｈ
ｉ Ｅ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｓａｋｕｍａ Ｔ，Ｇａｏ
ＣＸ，Ｔｅｓｈｉｍａ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｓ，Ｓｈｉｂ
ａ Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ；特開平１０−４９６
９、特開平９−２０１１９１）その構造が明らかにされ
ている。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡがクロ
ーニングされ（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １
９９７ Ｍａｒ；１２１（３）：６２６−３２ Ｙａｎ
ａｇｉｄａｎｉ Ｓ，Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｉｈａｒａ
Ｙ，Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｅ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｔ
ａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ；特開平１０−８４９７５、特開
平１０−４９５９；ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６
Ｎｏｖ １；２７１（４４）：２７８１０−７ Ｕｏｚ
ｕｍｉ Ｎ，Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ，Ｍｉｙｏｓｈ
ｉ Ｅ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｓａｋｕｍａ Ｔ，Ｇａｏ
ＣＸ，Ｔｅｓｈｉｍａ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｓ，Ｓｈｉｂ
ａ Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ；特開平１０−４９６
９、特開平９−２０１１９１）その構造が明らかにされ
ている。
【００４６】本明細書では、「遺伝子」とは、構造遺伝
子部分をいう。遺伝子には、植物での発現に適切なよう
に、プロモーター、オペレーター、およびターミネータ
ーなどの制御配列が連結され得る。
子部分をいう。遺伝子には、植物での発現に適切なよう
に、プロモーター、オペレーター、およびターミネータ
ーなどの制御配列が連結され得る。
【００４７】「異種糖タンパク質」とは、本発明に用い
られる植物において本来発現されない糖タンパク質をい
う。異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、
部位カイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパ
ク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ
（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ
−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕ
ｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａ
ｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモン
およびサイトカインの例としては、エンケファリン、イ
ンターフェロンアルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、
絨毛性性腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、イン
ターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、エ
リスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕ
ｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄
体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられ
る。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖなどが挙げら
れる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタ
ウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗
原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓのＧタン
パク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１
２０）などが挙げられる。レセプターおよびマトリック
スタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプター、フィブ
ロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子ＶＩＩ
Ｉなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、ア
ルブミン、補体系タンパク質、プラスミノーゲン、コル
チコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅ
ｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロ
キシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉ
ｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｃ）などが挙げられる。
られる植物において本来発現されない糖タンパク質をい
う。異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、
部位カイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパ
ク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ
（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ
−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕ
ｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａ
ｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモン
およびサイトカインの例としては、エンケファリン、イ
ンターフェロンアルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、
絨毛性性腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、イン
ターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、エ
リスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕ
ｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄
体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられ
る。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖなどが挙げら
れる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタ
ウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗
原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓのＧタン
パク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１
２０）などが挙げられる。レセプターおよびマトリック
スタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプター、フィブ
ロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子ＶＩＩ
Ｉなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、ア
ルブミン、補体系タンパク質、プラスミノーゲン、コル
チコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅ
ｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロ
キシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉ
ｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｃ）などが挙げられる。
【００４８】「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の
異種糖タンパク質をコードすることが知られているヌク
レオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよい
し、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での
発現に適切なように改変して用いてもよい。
異種糖タンパク質をコードすることが知られているヌク
レオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよい
し、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での
発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４９】還元末端アセチルグルコサミン残基にフコ
ース残基を転移し得る酵素および異種糖タンパク質の遺
伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入
される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、
同時に導入してもよい。植物細胞への遺伝子の導入方法
の例としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレ
ーション法、金粒子法などが挙げられる。
ース残基を転移し得る酵素および異種糖タンパク質の遺
伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入
される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、
同時に導入してもよい。植物細胞への遺伝子の導入方法
の例としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレ
ーション法、金粒子法などが挙げられる。
【００５０】遺伝子が導入された植物細胞は、当該分野
で公知の方法により、導入された遺伝子の発現が確認さ
れ得る。このような確認方法としては、銀染色、ウェス
タンブロッティング、ノザンハイブリダイゼーション、
酵素活性の検出などが挙げられる。導入された遺伝子を
発現する細胞は、形質転換細胞である。
で公知の方法により、導入された遺伝子の発現が確認さ
れ得る。このような確認方法としては、銀染色、ウェス
タンブロッティング、ノザンハイブリダイゼーション、
酵素活性の検出などが挙げられる。導入された遺伝子を
発現する細胞は、形質転換細胞である。
【００５１】還元末端アセチルグルコサミン残基にフコ
ース残基を転移し得る酵素および異種糖タンパク質を発
現する形質転換細胞は、動物型の糖鎖を有する異種糖タ
ンパク質を発現する。つまり、このようにして得られた
形質転換植物は、動物型の糖鎖付加機能を有する。形質
転換細胞を培養することにより、動物型の糖タンパク質
が大量に生産され得る。動物型の糖タンパク質は、コア
糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は、少なくと
も１つのマンノースおよび１つ以上のアセチルグルコサ
ミンから本質的になる。得られる糖タンパク質の外部糖
鎖は、非還元末端糖鎖部分を含む。外部糖鎖は、直鎖状
構造をもっていても分岐状構造をもっていてもよい。分
岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造の
いずれかであり得る。形質転換細胞により生産される糖
タンパク質は、好ましくは、糖タンパク質糖鎖のＮ−結
合型糖鎖の最もペプチド鎖に近いＮ−アセチルグルコサ
ミンにα１，６−結合するフコース残基を含む。
ース残基を転移し得る酵素および異種糖タンパク質を発
現する形質転換細胞は、動物型の糖鎖を有する異種糖タ
ンパク質を発現する。つまり、このようにして得られた
形質転換植物は、動物型の糖鎖付加機能を有する。形質
転換細胞を培養することにより、動物型の糖タンパク質
が大量に生産され得る。動物型の糖タンパク質は、コア
糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は、少なくと
も１つのマンノースおよび１つ以上のアセチルグルコサ
ミンから本質的になる。得られる糖タンパク質の外部糖
鎖は、非還元末端糖鎖部分を含む。外部糖鎖は、直鎖状
構造をもっていても分岐状構造をもっていてもよい。分
岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造の
いずれかであり得る。形質転換細胞により生産される糖
タンパク質は、好ましくは、糖タンパク質糖鎖のＮ−結
合型糖鎖の最もペプチド鎖に近いＮ−アセチルグルコサ
ミンにα１，６−結合するフコース残基を含む。
【００５２】得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の
状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと
分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよ
い。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果
実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと
分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよ
い。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果
実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
【００５３】形質転換植物細胞により生産された、動物
型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、植物細胞から単離また
は抽出されてもよい。糖タンパク質の単離方法は、当該
分野で公知である。あるいは、本発明の糖タンパク質
は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供さ
れ得る。本発明の植物細胞が産生する糖タンパク質は、
動物型の糖鎖を有するので、動物特にヒトに対して抗原
性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適し
ている。
型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、植物細胞から単離また
は抽出されてもよい。糖タンパク質の単離方法は、当該
分野で公知である。あるいは、本発明の糖タンパク質
は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供さ
れ得る。本発明の植物細胞が産生する糖タンパク質は、
動物型の糖鎖を有するので、動物特にヒトに対して抗原
性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適し
ている。
【００５４】
【実施例】実施例で用いた材料、試薬、操作手順は、後
述の−材料および方法−のセクションにまとめて記載す
る。
述の−材料および方法−のセクションにまとめて記載す
る。
【００５５】（実施例１：タバコ培養細胞へのα１，６
−フコシルトランスフェラーゼ（以下α１，６−ＦＴと
記載する）遺伝子の導入）タバコ培養細胞への遺伝子の
導入は、植物細胞感染能を持つアグロバクテリウムを利
用した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、双子葉植物の
形質転換に頻用されている。最近では、腫瘍形成にはＴ
ｉプラスミド上に存在するｖｉｒ領域にコードされた遺
伝子群が関与していることが明らかとなっている。植物
感染に際し、アグロバクテリウムは双子葉植物の分泌す
るフェノール系物質を感染シグナルとして受け取るとｖ
ｉｒ遺伝子群の転写は活性化され、その結果ｖｉｒ遺伝
子にコードされた数個のタンパク質がＴ−ＤＮＡ遺伝子
の切り出し、移行、組み込みに機能することが知られて
いる。また、Ｔ−ＤＮＡとｖｉｒ領域は、それぞれ単独
では腫瘍形成能を持たないが、それぞれ別のレプリコン
上にあっても同一のアグロバクテリウム中に存在すれば
腫瘍形成能を示す。バイナリーベクターを用いた外来遺
伝子の導入はこの性質を利用したものである。
−フコシルトランスフェラーゼ（以下α１，６−ＦＴと
記載する）遺伝子の導入）タバコ培養細胞への遺伝子の
導入は、植物細胞感染能を持つアグロバクテリウムを利
用した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、双子葉植物の
形質転換に頻用されている。最近では、腫瘍形成にはＴ
ｉプラスミド上に存在するｖｉｒ領域にコードされた遺
伝子群が関与していることが明らかとなっている。植物
感染に際し、アグロバクテリウムは双子葉植物の分泌す
るフェノール系物質を感染シグナルとして受け取るとｖ
ｉｒ遺伝子群の転写は活性化され、その結果ｖｉｒ遺伝
子にコードされた数個のタンパク質がＴ−ＤＮＡ遺伝子
の切り出し、移行、組み込みに機能することが知られて
いる。また、Ｔ−ＤＮＡとｖｉｒ領域は、それぞれ単独
では腫瘍形成能を持たないが、それぞれ別のレプリコン
上にあっても同一のアグロバクテリウム中に存在すれば
腫瘍形成能を示す。バイナリーベクターを用いた外来遺
伝子の導入はこの性質を利用したものである。
【００５６】本実施例では、糖転移酵素ヒト由来α１，
６−ＦＴ（配列番号２）のｃＤＮＡ（配列番号１）（α
１，６−ＦＴ遺伝子がサブクローニングされたｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＴは大阪大学医学部、谷口直之先生
より贈与された）をＴ−ＤＮＡ領域内に挿入したバイナ
リーベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−
ＤＨＦＲ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ−ＦＴを構築して
用いた。これらのバイナリーベクター構築のスキームを
図１と図２に示す。
６−ＦＴ（配列番号２）のｃＤＮＡ（配列番号１）（α
１，６−ＦＴ遺伝子がサブクローニングされたｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＴは大阪大学医学部、谷口直之先生
より贈与された）をＴ−ＤＮＡ領域内に挿入したバイナ
リーベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−
ＤＨＦＲ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ−ＦＴを構築して
用いた。これらのバイナリーベクター構築のスキームを
図１と図２に示す。
【００５７】まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＴを鋳
型としてＰＣＲにより増幅したα１，６−ＦＴ遺伝子断
片を制限酵素処理し、同様にＰＣＲによって制限酵素部
位を改変したｐＢＩ２２１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に挿入してｐＢ
Ｉ２２１−ＦＴベクターを作製した（図１）。プライマ
ーの作製にあたっては Ｙａｎａｇｉｄａｎｉらの報告
（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １９９７ Ｍａ
ｒ；１２１（３）：６２６−３２ Ｙａｎａｇｉｄａｎ
ｉ Ｓ，Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｍｉｙｏ
ｓｈｉ Ｅ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉ Ｎ； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１９９６ Ｎｏｖ
１；２７１（４４））を参照した。
型としてＰＣＲにより増幅したα１，６−ＦＴ遺伝子断
片を制限酵素処理し、同様にＰＣＲによって制限酵素部
位を改変したｐＢＩ２２１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に挿入してｐＢ
Ｉ２２１−ＦＴベクターを作製した（図１）。プライマ
ーの作製にあたっては Ｙａｎａｇｉｄａｎｉらの報告
（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １９９７ Ｍａ
ｒ；１２１（３）：６２６−３２ Ｙａｎａｇｉｄａｎ
ｉ Ｓ，Ｕｏｚｕｍｉ Ｎ，Ｉｈａｒａ Ｙ，Ｍｉｙｏ
ｓｈｉ Ｅ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉ Ｎ； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１９９６ Ｎｏｖ
１；２７１（４４））を参照した。
【００５８】さらにｐＢＩ２２１−ＦＴベクターから、
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター遺伝
子、α１，６−ＦＴとノパリンシンターゼターミネータ
ー遺伝子を含むＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、
３種の植物形質転換用バイナリーベクターｐＧＰＴＶ−
ＨＰＴ（ＡＴＣＣ７７３８９としてＡＴＣＣ（アメリカ
ン タイプカルチャー コレクション（アメリカ合衆国
メリーランド ２０８５２、ロックビル、パークロー
ン ドライブ １２３０１）より入手）、ｐＧＰＴＶ−
ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ７７３９０としてＡＴＣＣより入
手）、ｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ（ＡＴＣＣ７７３９１として
ＡＴＣＣより入手）に組み込んだ（図２）。この３種の
バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域にはそれぞれ異な
る薬剤耐性遺伝子が存在し、形質転換体植物細胞を取得
する際、異なる薬剤において選択が可能である。
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター遺伝
子、α１，６−ＦＴとノパリンシンターゼターミネータ
ー遺伝子を含むＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、
３種の植物形質転換用バイナリーベクターｐＧＰＴＶ−
ＨＰＴ（ＡＴＣＣ７７３８９としてＡＴＣＣ（アメリカ
ン タイプカルチャー コレクション（アメリカ合衆国
メリーランド ２０８５２、ロックビル、パークロー
ン ドライブ １２３０１）より入手）、ｐＧＰＴＶ−
ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ７７３９０としてＡＴＣＣより入
手）、ｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ（ＡＴＣＣ７７３９１として
ＡＴＣＣより入手）に組み込んだ（図２）。この３種の
バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域にはそれぞれ異な
る薬剤耐性遺伝子が存在し、形質転換体植物細胞を取得
する際、異なる薬剤において選択が可能である。
【００５９】ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−
ＤＨＦＲ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ−ＦＴと異なる薬
剤耐性遺伝子を含む３種の発現用ベクターを作製したの
は、形質転換細胞の選抜に用いた薬剤と導入した糖転移
酵素とが細胞に与える影響が未知数であるためである。
どの薬剤において確実に選抜がなされるのか不明であっ
たため、予め３種のα１，６−ＦＴ発現用ベクターを構
築した。また今後、複数の異種遺伝子を同一のクローン
に導入する際、作用機構の異なる選択マーカーをコード
する発現ベクターは有利であるとの観点からも３種のベ
クターを構築した。
ＤＨＦＲ−ＦＴ、ｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ−ＦＴと異なる薬
剤耐性遺伝子を含む３種の発現用ベクターを作製したの
は、形質転換細胞の選抜に用いた薬剤と導入した糖転移
酵素とが細胞に与える影響が未知数であるためである。
どの薬剤において確実に選抜がなされるのか不明であっ
たため、予め３種のα１，６−ＦＴ発現用ベクターを構
築した。また今後、複数の異種遺伝子を同一のクローン
に導入する際、作用機構の異なる選択マーカーをコード
する発現ベクターは有利であるとの観点からも３種のベ
クターを構築した。
【００６０】本実施例では作製したこれらの発現用ベク
ターのうち、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴを用いてタバコ
ＢＹ２培養細胞の形質転換を行った。
ターのうち、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴを用いてタバコ
ＢＹ２培養細胞の形質転換を行った。
【００６１】アグロバクテリウムの形質転換は、Ｂｅｖ
ａｎ．ら，のｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ法
（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．，１２，８７１１，１９８４）を用いて行った。ｐ
ＧＰＴＶ系プラスミド（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
１９９２ Ｄｅｃ；２０（６）：１１９５−７ Ｂｅ
ｃｋｅｒ Ｄ， Ｋｅｍｐｅｒ Ｅ， Ｓｃｈｅｌｌ
Ｊ， Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ Ｒ）をもつ大腸菌Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ｓｕＥ４４、
ΔｌａｃＵ１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓ
ｄＲ１７）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．：Ｆｏｃｕｓ ８
（２）、９（１９８６））、およびヘルパープラスミド
ｐＲＫ２０１３（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，８７１１，１９８４）を
もつ大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１を、それぞれ１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリ
ン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地で
３７℃で１晩、アグロバクテリウムＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株
（Ｅｌｉｚａｎｂｅｔｈ，Ｅ．Ｈ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６８，１２９１，１９８６）を、５０ｍｇ
／ｌのカナマイシン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコ
ールを含む２×ＹＴ培地で２８℃で２晩培養した。各培
養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブにとり集菌し
た後、ＬＢ培地で３回洗浄した。得られた菌体をそれぞ
れ１００μｌの２×ＹＴ培地に懸濁した後、３種類の菌
を混合し、２×ＹＴ寒天培地に塗抹し、２８℃で培養し
てｐＧＰＴＶ系プラスミドを大腸菌からアグロバクテリ
ウムに接合伝達させた。２日後、２×ＹＴ寒天培地上で
一面に増殖した菌体の一部を白金耳でかきとり、５０ｍ
ｇ／ｌのカナマイシン、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイ
クリン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬ
Ｂ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、
単一コロニーを選択した。
ａｎ．ら，のｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ法
（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．，１２，８７１１，１９８４）を用いて行った。ｐ
ＧＰＴＶ系プラスミド（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
１９９２ Ｄｅｃ；２０（６）：１１９５−７ Ｂｅ
ｃｋｅｒ Ｄ， Ｋｅｍｐｅｒ Ｅ， Ｓｃｈｅｌｌ
Ｊ， Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ Ｒ）をもつ大腸菌Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ｓｕＥ４４、
ΔｌａｃＵ１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓ
ｄＲ１７）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．：Ｆｏｃｕｓ ８
（２）、９（１９８６））、およびヘルパープラスミド
ｐＲＫ２０１３（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，８７１１，１９８４）を
もつ大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１を、それぞれ１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリ
ン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地で
３７℃で１晩、アグロバクテリウムＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株
（Ｅｌｉｚａｎｂｅｔｈ，Ｅ．Ｈ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６８，１２９１，１９８６）を、５０ｍｇ
／ｌのカナマイシン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコ
ールを含む２×ＹＴ培地で２８℃で２晩培養した。各培
養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブにとり集菌し
た後、ＬＢ培地で３回洗浄した。得られた菌体をそれぞ
れ１００μｌの２×ＹＴ培地に懸濁した後、３種類の菌
を混合し、２×ＹＴ寒天培地に塗抹し、２８℃で培養し
てｐＧＰＴＶ系プラスミドを大腸菌からアグロバクテリ
ウムに接合伝達させた。２日後、２×ＹＴ寒天培地上で
一面に増殖した菌体の一部を白金耳でかきとり、５０ｍ
ｇ／ｌのカナマイシン、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイ
クリン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬ
Ｂ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、
単一コロニーを選択した。
【００６２】タバコ培養細胞の形質転換は、Ａｎ，
Ｇ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｍａｎｎｕａｌ，
Ａ３，１．に記載の方法により行った。テトラサイクリ
ン１２．５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃で４８時間
培養したアグロバクテリウム（ｐＧＰＴＶ系のプラスミ
ドをもつＥＨＡ１０１株）と培養４日目のタバコ培養Ｂ
Ｙ２細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．
ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２（理化学研究所
ライフサイエンス筑波研究センター、ジーンバンク室植
物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１より細胞株名Ｂ
Ｙ２として入手））の懸濁液をそれぞれ１００μｌ、４
ｍｌずつシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃に暗所で静
置した。２日後シャーレの中の培養液を遠心管に移して
遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により上澄みを除い
た。次に新しい培地を入れて遠心分離し、細胞を、２０
ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、２５０ｍｇ／ｌのカルべ
ニシリンの入った改変ＬＳ寒天培地のプレートに塗抹
し、２５℃暗黒下で静置した。約２〜３週間後にカルス
化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているク
ローンを選択した。さらに２〜３週間後に、ハイグロマ
シン、カルベニシリンを加えた改変ＬＳ培地３０ｍｌに
移し、継代培養を行った。ハイグロマイシンによる選抜
の結果、形質転換体カルスの取得には通常の約２倍の期
間（約５週間）を要した。得られた形質転換体カルスは
さらにハイグロマイシンを含む選択培地上で約１ヶ月間
選抜を繰り返した。それらの耐性株の中から無作為に１
２株を選択し（ＢＹ２−ＦＴ２〜１３株）、ＤＮＡレベ
ルでの解析に用いた。
Ｇ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｍａｎｎｕａｌ，
Ａ３，１．に記載の方法により行った。テトラサイクリ
ン１２．５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃で４８時間
培養したアグロバクテリウム（ｐＧＰＴＶ系のプラスミ
ドをもつＥＨＡ１０１株）と培養４日目のタバコ培養Ｂ
Ｙ２細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．
ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２（理化学研究所
ライフサイエンス筑波研究センター、ジーンバンク室植
物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１より細胞株名Ｂ
Ｙ２として入手））の懸濁液をそれぞれ１００μｌ、４
ｍｌずつシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃に暗所で静
置した。２日後シャーレの中の培養液を遠心管に移して
遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により上澄みを除い
た。次に新しい培地を入れて遠心分離し、細胞を、２０
ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、２５０ｍｇ／ｌのカルべ
ニシリンの入った改変ＬＳ寒天培地のプレートに塗抹
し、２５℃暗黒下で静置した。約２〜３週間後にカルス
化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているク
ローンを選択した。さらに２〜３週間後に、ハイグロマ
シン、カルベニシリンを加えた改変ＬＳ培地３０ｍｌに
移し、継代培養を行った。ハイグロマイシンによる選抜
の結果、形質転換体カルスの取得には通常の約２倍の期
間（約５週間）を要した。得られた形質転換体カルスは
さらにハイグロマイシンを含む選択培地上で約１ヶ月間
選抜を繰り返した。それらの耐性株の中から無作為に１
２株を選択し（ＢＹ２−ＦＴ２〜１３株）、ＤＮＡレベ
ルでの解析に用いた。
【００６３】（ＢＹ２−ＦＴ細胞のＤＮＡレベルでの解
析）得られた形質転換体ＢＹ２−ＦＴ２〜１３株につい
て、それらのカルスから、後述の−材料および方法−の
セクション１０に記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを
調製しＰＣＲによる（後述の−材料および方法−のセク
ション１２を参照のこと）α１，６−ＦＴ遺伝子の組み
込みを調べた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた。
ＦＴ−Ｘｂａ：５’−ＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧ
ＧＡＴＴＡ（配列番号３）、およびＦＴ−Ｓａｌ：５’
−ＧＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＴＴＧＡＣ（配列番
号４）。得られたＰＣＲ増幅産物を後述の−材料および
方法−のセクション８に記載の方法に従って電気泳動し
た結果を図３に示す。
析）得られた形質転換体ＢＹ２−ＦＴ２〜１３株につい
て、それらのカルスから、後述の−材料および方法−の
セクション１０に記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを
調製しＰＣＲによる（後述の−材料および方法−のセク
ション１２を参照のこと）α１，６−ＦＴ遺伝子の組み
込みを調べた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた。
ＦＴ−Ｘｂａ：５’−ＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧ
ＧＡＴＴＡ（配列番号３）、およびＦＴ−Ｓａｌ：５’
−ＧＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＴＴＧＡＣ（配列番
号４）。得られたＰＣＲ増幅産物を後述の−材料および
方法−のセクション８に記載の方法に従って電気泳動し
た結果を図３に示す。
【００６４】図３に示すようにＢＹ２−ＦＴ２，３，
４，５，６，７，８，９，１０，１１，１３株の１１株
において１７００ｂｐ付近にα１，６−ＦＴ遺伝子領域
の増幅断片と思われるバンドが確認された。一方、野生
型タバコ培養細胞から調製したゲノムＤＮＡをテンプレ
ートとして用いた場合（図３中右端のＷＴで示されるレ
ーン）、バンドは見られなかった。このことから、ＢＹ
２−ＦＴ細胞においてα１，６−ＦＴ遺伝子が染色体上
に組み込まれていることが確認された。
４，５，６，７，８，９，１０，１１，１３株の１１株
において１７００ｂｐ付近にα１，６−ＦＴ遺伝子領域
の増幅断片と思われるバンドが確認された。一方、野生
型タバコ培養細胞から調製したゲノムＤＮＡをテンプレ
ートとして用いた場合（図３中右端のＷＴで示されるレ
ーン）、バンドは見られなかった。このことから、ＢＹ
２−ＦＴ細胞においてα１，６−ＦＴ遺伝子が染色体上
に組み込まれていることが確認された。
【００６５】（ＢＹ２−ＦＴ細胞のＲＮＡレベルでの解
析）ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ解析の結果、α１，６−
ＦＴ遺伝子の導入が確認された形質転換体のうち増殖の
速いＢＹ２−ＦＴ２，３，４，６の４株について、後述
の−材料および方法−のセクション１１に記載の方法に
従ってＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを行った（後述の
−材料および方法−のセクション１３を参照のこと）。
結果を図４に示す。上記と同じプライマーを用いてＲＴ
−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物を上記のＤＮＡと同
様の条件で電気泳動したところ、図４に示すように、４
株とも１７００ｂｐ付近にα１，６−ＦＴ遺伝子の増幅
断片と思われるバンドが確認された。野生型ＢＹ２サン
プルにおいてバンドは確認されず（図４中ＷＴで示され
るレーン）、またＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列を
もとに設計したプライマー（ＣａＭＶ ｐｒｉｍｅｒ）
（配列番号５）とＦＴ−Ｓａｌプライマーを用いて行っ
たＲＴ−ＰＣＲではバンドは見られなかった（図４、レ
ーンＡ）：ＣａＭＶ ｐｒｉｍｅｒ:５'−ＣＧＴＣＴＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴ（配列番号５）。
析）ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ解析の結果、α１，６−
ＦＴ遺伝子の導入が確認された形質転換体のうち増殖の
速いＢＹ２−ＦＴ２，３，４，６の４株について、後述
の−材料および方法−のセクション１１に記載の方法に
従ってＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを行った（後述の
−材料および方法−のセクション１３を参照のこと）。
結果を図４に示す。上記と同じプライマーを用いてＲＴ
−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物を上記のＤＮＡと同
様の条件で電気泳動したところ、図４に示すように、４
株とも１７００ｂｐ付近にα１，６−ＦＴ遺伝子の増幅
断片と思われるバンドが確認された。野生型ＢＹ２サン
プルにおいてバンドは確認されず（図４中ＷＴで示され
るレーン）、またＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列を
もとに設計したプライマー（ＣａＭＶ ｐｒｉｍｅｒ）
（配列番号５）とＦＴ−Ｓａｌプライマーを用いて行っ
たＲＴ−ＰＣＲではバンドは見られなかった（図４、レ
ーンＡ）：ＣａＭＶ ｐｒｉｍｅｒ:５'−ＣＧＴＣＴＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴ（配列番号５）。
【００６６】今回、ＲＮＡサンプルの調製に用いたキッ
トでは、回収したＲＮＡ液中にゲノムＤＮＡのコンタミ
ネーションも考えられたため、回収したＲＮＡサンプル
は全てＤＮａｓｅ処理した後、ＲＴ−ＰＣＲに供した。
ＤＮａｓｅ処理後のＲＮＡサンプルを鋳型としたＰＣＲ
反応ではバンドは確認されず（図４、レーンＢ）、これ
により得られたバンドはＤＮＡのコンタミネーションに
よる増幅断片ではないことが確認された。 （α１，６−ＦＴ酵素活性の確認）今回、α１，６−Ｆ
Ｔ活性測定に使用したα１，６−ＦＴ活性測定キットに
は基質糖鎖として図１０の一番に上に示した構造をもつ
蛍光標識糖鎖が含まれている。これは東洋紡（株）にお
いてＹａｚａｗａら及びＳｅｋｏらの報告（Ｇｌｙｃｏ
ｃｏｎｊ Ｊ １９９８ Ｓｅｐ；１５（９）：８６３
−７１ Ｙａｚａｗａ Ｓ， Ｋｏｃｈｉｂｅ Ｎ，
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｔ， Ｓｈｉｍａ Ｃ， Ｔａｋ
ａｉ Ｉ， Ａｄａｃｈｉ Ｍ， Ａｓａｏ Ｔ， Ｈ
ａｄａ Ｔ，Ｅｎｏｋｉ Ｙ， Ｊｕｎｅｊａ ＬＲ；
Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ １９９７
Ａｐｒ １７；１３３５（１−２）：２３−３２ Ｓｅ
ｋｏ Ａ， Ｋｏｋｅｔｓｕ Ｍ， Ｎｉｓｈｉｚｏｎ
ｏ Ｍ， Ｅｎｏｋｉ Ｙ， Ｉｂｒａｈｉｍ ＨＲ，
Ｊｕｎｅｊａ ＬＲ， Ｋｉｍ Ｍ， Ｙａｍａｍｏ
ｔｏ Ｔ）を参考に卵黄から、アスパラギン残基が結合
した糖鎖（Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎ）を調製し、アス
パラギン残基に蛍光物質（４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉ
ｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ （ＮＢＤ−Ｆ，同仁
化学研究所)）を付加したもの（Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａ
ｓｎ−ＮＢＤ）である。従来、糖転移酵素の活性測定に
は基質糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識
したＰＡ化糖鎖が用いられるが、このＰＡ化糖鎖は還元
末端のＮ−アセチルグルコサミンが開環構造をとるため
α１，６−ＦＴの基質糖鎖とはなり得ない。そのためα
１，６−ＦＴ活性測定には様々なアクセプター糖鎖と手
法が模索されてきた。
トでは、回収したＲＮＡ液中にゲノムＤＮＡのコンタミ
ネーションも考えられたため、回収したＲＮＡサンプル
は全てＤＮａｓｅ処理した後、ＲＴ−ＰＣＲに供した。
ＤＮａｓｅ処理後のＲＮＡサンプルを鋳型としたＰＣＲ
反応ではバンドは確認されず（図４、レーンＢ）、これ
により得られたバンドはＤＮＡのコンタミネーションに
よる増幅断片ではないことが確認された。 （α１，６−ＦＴ酵素活性の確認）今回、α１，６−Ｆ
Ｔ活性測定に使用したα１，６−ＦＴ活性測定キットに
は基質糖鎖として図１０の一番に上に示した構造をもつ
蛍光標識糖鎖が含まれている。これは東洋紡（株）にお
いてＹａｚａｗａら及びＳｅｋｏらの報告（Ｇｌｙｃｏ
ｃｏｎｊ Ｊ １９９８ Ｓｅｐ；１５（９）：８６３
−７１ Ｙａｚａｗａ Ｓ， Ｋｏｃｈｉｂｅ Ｎ，
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｔ， Ｓｈｉｍａ Ｃ， Ｔａｋ
ａｉ Ｉ， Ａｄａｃｈｉ Ｍ， Ａｓａｏ Ｔ， Ｈ
ａｄａ Ｔ，Ｅｎｏｋｉ Ｙ， Ｊｕｎｅｊａ ＬＲ；
Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ １９９７
Ａｐｒ １７；１３３５（１−２）：２３−３２ Ｓｅ
ｋｏ Ａ， Ｋｏｋｅｔｓｕ Ｍ， Ｎｉｓｈｉｚｏｎ
ｏ Ｍ， Ｅｎｏｋｉ Ｙ， Ｉｂｒａｈｉｍ ＨＲ，
Ｊｕｎｅｊａ ＬＲ， Ｋｉｍ Ｍ， Ｙａｍａｍｏ
ｔｏ Ｔ）を参考に卵黄から、アスパラギン残基が結合
した糖鎖（Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎ）を調製し、アス
パラギン残基に蛍光物質（４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉ
ｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ （ＮＢＤ−Ｆ，同仁
化学研究所)）を付加したもの（Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａ
ｓｎ−ＮＢＤ）である。従来、糖転移酵素の活性測定に
は基質糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識
したＰＡ化糖鎖が用いられるが、このＰＡ化糖鎖は還元
末端のＮ−アセチルグルコサミンが開環構造をとるため
α１，６−ＦＴの基質糖鎖とはなり得ない。そのためα
１，６−ＦＴ活性測定には様々なアクセプター糖鎖と手
法が模索されてきた。
【００６７】今回、後述の−材料と方法−のセクション
の１８．３に示した条件で反応産物のＨＰＬＣ解析を行
うと、未反応の基質は約９．５分に溶出し（図５の
上）、また以下に示すように調製したα１，６−フコシ
ル化糖鎖標準品は約１５分に溶出した（図５の下）。上
記ＲＮＡレベルでの解析においてｍＲＮＡの発現が確認
されたＢＹ２−ＦＴ２，３，４，６株について、後述の
−材料と方法−のセクションの１４または１８．１に従
い粗酵素液を調製した後、α１，６−ＦＴ活性測定キッ
トと酵素反応させた反応液をＨＰＬＣにより分析した結
果、ＢＹ２−ＦＴ３，４，６株から得られた粗酵素液の
反応液において約１５分に溶出するピーク成分が確認さ
れた（図６の真中および下、ならびに図７の上）。これ
はα１，６−フコシル化糖鎖標準品の溶出時間と一致す
る。
の１８．３に示した条件で反応産物のＨＰＬＣ解析を行
うと、未反応の基質は約９．５分に溶出し（図５の
上）、また以下に示すように調製したα１，６−フコシ
ル化糖鎖標準品は約１５分に溶出した（図５の下）。上
記ＲＮＡレベルでの解析においてｍＲＮＡの発現が確認
されたＢＹ２−ＦＴ２，３，４，６株について、後述の
−材料と方法−のセクションの１４または１８．１に従
い粗酵素液を調製した後、α１，６−ＦＴ活性測定キッ
トと酵素反応させた反応液をＨＰＬＣにより分析した結
果、ＢＹ２−ＦＴ３，４，６株から得られた粗酵素液の
反応液において約１５分に溶出するピーク成分が確認さ
れた（図６の真中および下、ならびに図７の上）。これ
はα１，６−フコシル化糖鎖標準品の溶出時間と一致す
る。
【００６８】また、タバコ培養細胞を含む植物に内在す
るα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（α１，３−
ＦＴ）について、Ｓｔｕｄａｃｈｅｒらの報告（Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９５ Ｄｅｃ；１２（６）：７
８０−６ Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ， Ｄａｌｉｋ
Ｔ， Ｗａｗｒａ Ｐ， Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ， Ｍａ
ｒｚ Ｌ；Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９８ Ｊａ
ｎ；１５（１）：８９−９１ Ｒｏｉｔｉｎｇｅｒ
Ａ， Ｌｅｉｔｅｒ Ｈ， ＳｔａｕｄａｃｈｅｒＥ，
Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ）によるとＭｕｎｇ ｂｅａｎ由
来のα１，３−ＦＴはＭｎ2+やＺｎ2+などの２価の陽イ
オン絶対要求性があり、非存在下では活性を持たない。
今回使用したα１，６−ＦＴ活性測定用キットやα１，
６−ＦＴ粗酵素液中にも２価の陽イオンは添加しておら
ず、この点からＨＰＬＣ解析において溶出時間約１５分
に見られるピークは、α１，３−フコシル化糖鎖ではな
いことが示唆される。事実、野生型ＢＹ２サンプルのＨ
ＰＬＣチャートにおいて、１５分の位置にピークは見ら
れなかった（図７の下）。
るα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（α１，３−
ＦＴ）について、Ｓｔｕｄａｃｈｅｒらの報告（Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９５ Ｄｅｃ；１２（６）：７
８０−６ Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ， Ｄａｌｉｋ
Ｔ， Ｗａｗｒａ Ｐ， Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ， Ｍａ
ｒｚ Ｌ；Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９８ Ｊａ
ｎ；１５（１）：８９−９１ Ｒｏｉｔｉｎｇｅｒ
Ａ， Ｌｅｉｔｅｒ Ｈ， ＳｔａｕｄａｃｈｅｒＥ，
Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ）によるとＭｕｎｇ ｂｅａｎ由
来のα１，３−ＦＴはＭｎ2+やＺｎ2+などの２価の陽イ
オン絶対要求性があり、非存在下では活性を持たない。
今回使用したα１，６−ＦＴ活性測定用キットやα１，
６−ＦＴ粗酵素液中にも２価の陽イオンは添加しておら
ず、この点からＨＰＬＣ解析において溶出時間約１５分
に見られるピークは、α１，３−フコシル化糖鎖ではな
いことが示唆される。事実、野生型ＢＹ２サンプルのＨ
ＰＬＣチャートにおいて、１５分の位置にピークは見ら
れなかった（図７の下）。
【００６９】（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ
比活性の測定）ＢＹ２−ＦＴ３、４、６株について得ら
れた粗タンパク質抽出液のα１，６−フコシルトランス
フェラーゼ比活性を測定した。比活性は、ＨＰＬＣのク
ロマトグラムから、後述の−材料と方法−のセクション
の１８．４に示した方法で求めた。その結果、形質転換
されていないＢＹ２株（表１中ＷＴで示される）におい
ては検出限界以下であったのに対し、ＢＹ２−ＦＴ６株
で比活性が最も高く、６．０３ Ｕ／ｍｇタンパク質で
あった（表１）。ここで、１Ｕとは１分間あたり１ｐｍ
ｏｌの基質を変換する酵素量とした。
比活性の測定）ＢＹ２−ＦＴ３、４、６株について得ら
れた粗タンパク質抽出液のα１，６−フコシルトランス
フェラーゼ比活性を測定した。比活性は、ＨＰＬＣのク
ロマトグラムから、後述の−材料と方法−のセクション
の１８．４に示した方法で求めた。その結果、形質転換
されていないＢＹ２株（表１中ＷＴで示される）におい
ては検出限界以下であったのに対し、ＢＹ２−ＦＴ６株
で比活性が最も高く、６．０３ Ｕ／ｍｇタンパク質で
あった（表１）。ここで、１Ｕとは１分間あたり１ｐｍ
ｏｌの基質を変換する酵素量とした。
【００７０】
【表１】 （実施例２：α１，６−ＦＴのタバコ培養細胞内糖タン
パク質への影響）アスパラギン結合型糖鎖の還元末端に
存在するＮ−アセチルグルコサミンにα１，６−結合し
たフコース残基と強く結合するエンドウ豆レクチン（Ｐ
ＳＡ）を用いて、導入したα１，６−ＦＴのＢＹ２−Ｆ
Ｔ細胞内糖タンパク質糖鎖に与える影響を調べた。ま
ず、後述の−材料および方法−のセクション１４に記載
に従いＢＹ２−ＦＴ細胞より粗タンパク質抽出液を調製
し、吸光度Ａ280を測定することで粗タンパク質濃度の
概略値を求めた（−材料および方法−のセクション１
５）。これに基づき後述の−材料および方法−のセクシ
ョン１６および１７に記載に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、そしてレクチン染色を行った。
パク質への影響）アスパラギン結合型糖鎖の還元末端に
存在するＮ−アセチルグルコサミンにα１，６−結合し
たフコース残基と強く結合するエンドウ豆レクチン（Ｐ
ＳＡ）を用いて、導入したα１，６−ＦＴのＢＹ２−Ｆ
Ｔ細胞内糖タンパク質糖鎖に与える影響を調べた。ま
ず、後述の−材料および方法−のセクション１４に記載
に従いＢＹ２−ＦＴ細胞より粗タンパク質抽出液を調製
し、吸光度Ａ280を測定することで粗タンパク質濃度の
概略値を求めた（−材料および方法−のセクション１
５）。これに基づき後述の−材料および方法−のセクシ
ョン１６および１７に記載に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、そしてレクチン染色を行った。
【００７１】その結果、図８に示すように、非形質転換
体ＢＹ２株（図中右端のＷＴで示されるレーン）と比
べ、形質転換体からは細胞内糖タンパク質糖鎖にレクチ
ンが反応したことを示す、約２３ｋＤａの大きさの染色
が見られた。このことから、ＢＹ２−ＦＴ２、３、およ
び４株細胞において、α１，６−フコース残基を持つ糖
タンパク質が存在することが示唆された。非形質転換体
ＢＹ２株細胞（ＷＴ）についても若干の染色が見られる
が、これは用いたＰＳＡが植物複合型糖鎖に存在するα
１，３−フコース残基を含む他のフコース残基とも親和
性を有するためであると考えられる。なお、図８中Ａで
示されるレーンは、ポジテイブコントロールとして用い
たＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎを泳動したゲルをブロッ
トしたレーンであり、レクチンとの反応が陽性であるこ
とがわかる。
体ＢＹ２株（図中右端のＷＴで示されるレーン）と比
べ、形質転換体からは細胞内糖タンパク質糖鎖にレクチ
ンが反応したことを示す、約２３ｋＤａの大きさの染色
が見られた。このことから、ＢＹ２−ＦＴ２、３、およ
び４株細胞において、α１，６−フコース残基を持つ糖
タンパク質が存在することが示唆された。非形質転換体
ＢＹ２株細胞（ＷＴ）についても若干の染色が見られる
が、これは用いたＰＳＡが植物複合型糖鎖に存在するα
１，３−フコース残基を含む他のフコース残基とも親和
性を有するためであると考えられる。なお、図８中Ａで
示されるレーンは、ポジテイブコントロールとして用い
たＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎを泳動したゲルをブロッ
トしたレーンであり、レクチンとの反応が陽性であるこ
とがわかる。
【００７２】（実施例３：形質転換タバコ培養細胞が産
生する糖タンパク質の糖鎖構造の解析）細胞増殖が最も
速いＢＹ２−ＦＴ３株を選抜し、α１，６ＦＴ遺伝子導
入形質転換細胞が産生する糖タンパク質の糖鎖構造を解
析した。
生する糖タンパク質の糖鎖構造の解析）細胞増殖が最も
速いＢＹ２−ＦＴ３株を選抜し、α１，６ＦＴ遺伝子導
入形質転換細胞が産生する糖タンパク質の糖鎖構造を解
析した。
【００７３】１．ＢＹ２−ＦＴ３株の産生する糖タンパ
ク質の調製 ７〜１０日間培養したタバコ培養細胞ＢＹ２−ＦＴ３株
の培養細胞（湿重量約３ｋｇ）を、ガラスホモジナイザ
ーで処理することによって破砕し細胞溶解液を得た。こ
の細胞溶解液を、１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃
で遠心分離することによって糖タンパク質を含む上清を
得た。この上清を、ｄＨ2Ｏ（脱イオン水）に対して透
析した後（１．５×１０4倍希釈）凍結乾燥して粉末サ
ンプルを得た。
ク質の調製 ７〜１０日間培養したタバコ培養細胞ＢＹ２−ＦＴ３株
の培養細胞（湿重量約３ｋｇ）を、ガラスホモジナイザ
ーで処理することによって破砕し細胞溶解液を得た。こ
の細胞溶解液を、１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃
で遠心分離することによって糖タンパク質を含む上清を
得た。この上清を、ｄＨ2Ｏ（脱イオン水）に対して透
析した後（１．５×１０4倍希釈）凍結乾燥して粉末サ
ンプルを得た。
【００７４】２．Ｎ結合型糖鎖の調製 次いで、この粉末サンプルを、１００℃で１０時間ヒド
ラジン分解することによって、糖タンパク質に含まれる
糖鎖を切り出した。このヒドラジン分解物に、過剰のア
セトンを加え、４℃、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心
分離することで糖鎖を沈殿させた。得られた沈殿物に、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および無水酢酸を添加
し、糖鎖をＮアセチル化した。次いで、得られた反応物
を、Ｄｏｗｅｘ ５０×２（室町化学工業）を用いて脱
塩処理し、さらに、０．１ Ｎアンモニア水で平衡化し
たＴＳＫ ｇｅｌ ＴＯＹＯ ＰＥＲＡＬ ＨＷ−４０
（ＴＯＳＯＨ）ゲル濾過カラム（２．５×３０ｃｍ）を
通すことで、Ｎ結合型糖鎖を回収した。
ラジン分解することによって、糖タンパク質に含まれる
糖鎖を切り出した。このヒドラジン分解物に、過剰のア
セトンを加え、４℃、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心
分離することで糖鎖を沈殿させた。得られた沈殿物に、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および無水酢酸を添加
し、糖鎖をＮアセチル化した。次いで、得られた反応物
を、Ｄｏｗｅｘ ５０×２（室町化学工業）を用いて脱
塩処理し、さらに、０．１ Ｎアンモニア水で平衡化し
たＴＳＫ ｇｅｌ ＴＯＹＯ ＰＥＲＡＬ ＨＷ−４０
（ＴＯＳＯＨ）ゲル濾過カラム（２．５×３０ｃｍ）を
通すことで、Ｎ結合型糖鎖を回収した。
【００７５】３．ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖の調
製 回収したＮ結合型糖鎖を２アミノピリジンを用いてＰＡ
化した。ＰＡ化糖鎖はは、０．１Ｎアンモニア水溶液で
平衡化したＴＳＫ ｇｅｌ ＴＯＹＯ ＰＥＲＡＬ Ｈ
Ｗ−４０（ＴＯＳＯＨ）ゲル濾過カラム（２．５×３０
ｃｍ）に通すことによって精製した。
製 回収したＮ結合型糖鎖を２アミノピリジンを用いてＰＡ
化した。ＰＡ化糖鎖はは、０．１Ｎアンモニア水溶液で
平衡化したＴＳＫ ｇｅｌ ＴＯＹＯ ＰＥＲＡＬ Ｈ
Ｗ−４０（ＴＯＳＯＨ）ゲル濾過カラム（２．５×３０
ｃｍ）に通すことによって精製した。
【００７６】４．ＨＰＬＣによるＰＡ化糖鎖の分画と解
析 ＰＡ化糖鎖構造は、逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓ
ｅ、ＲＰ）およびサイズ分画（ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉ
ｏｎａｔｉｏｎ、ＳＦ）ＨＰＬＣの利用、エキソグリコ
シダーゼ消化による二次元糖鎖マッピング、そしてＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を行うことで解析した。
析 ＰＡ化糖鎖構造は、逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓ
ｅ、ＲＰ）およびサイズ分画（ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉ
ｏｎａｔｉｏｎ、ＳＦ）ＨＰＬＣの利用、エキソグリコ
シダーゼ消化による二次元糖鎖マッピング、そしてＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を行うことで解析した。
【００７７】ＨＰＬＣ分析には、ＨＩＴＡＣＨＩ ＦＬ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ−７４８０を備えたＨＩＴＡＣ
ＨＩ ＨＰＬＣ システムを用い、励起及び蛍光波長を
各々３１０ ｎｍ、３８０ ｎｍとして蛍光強度を測定
した。 Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−Ｐ ｃｏｌｕｍｎ
（６×２５０ｍｍ; ナカライテスク）を用いたＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ分析では、流速１．２ｍｌ／分の下で０．０２％
ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を、４０分間で
０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出させ
た。また、Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ｃｏｌ
ｕｍｎ（４．６×２５０ｍｍ； 昭和電工）を用いたＳ
Ｆ−ＨＰＬＣ分析では、流速０．７ｍｌ／分の下でｄＨ
2Ｏ−アセトニトリル混合液中のアセトニトリル濃度
を、２５分間で２６％から５０％に上昇させることでＰ
Ａ化糖鎖を溶出させた。
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ−７４８０を備えたＨＩＴＡＣ
ＨＩ ＨＰＬＣ システムを用い、励起及び蛍光波長を
各々３１０ ｎｍ、３８０ ｎｍとして蛍光強度を測定
した。 Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−Ｐ ｃｏｌｕｍｎ
（６×２５０ｍｍ; ナカライテスク）を用いたＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ分析では、流速１．２ｍｌ／分の下で０．０２％
ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を、４０分間で
０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出させ
た。また、Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ｃｏｌ
ｕｍｎ（４．６×２５０ｍｍ； 昭和電工）を用いたＳ
Ｆ−ＨＰＬＣ分析では、流速０．７ｍｌ／分の下でｄＨ
2Ｏ−アセトニトリル混合液中のアセトニトリル濃度
を、２５分間で２６％から５０％に上昇させることでＰ
Ａ化糖鎖を溶出させた。
【００７８】逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ、Ｒ
Ｐ）およびサイズ分画（ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａ
ｔｉｏｎ、ＳＦ）ＨＰＬＣの両溶出時間を比較する二次
元糖鎖マッピングにより糖鎖構造を推定した。
Ｐ）およびサイズ分画（ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａ
ｔｉｏｎ、ＳＦ）ＨＰＬＣの両溶出時間を比較する二次
元糖鎖マッピングにより糖鎖構造を推定した。
【００７９】５．エキソグリコシダーゼ消化によるＰＡ
化糖鎖の解析 Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； Ｒｏｃｈｅ）酵素消化反
応については、各ＰＡ化糖鎖を３ｍＵのＮアセチルグル
コサミニダーゼを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．４５）の下で、３７℃で２日間反応させた。
また、α-L-フコシダーゼ（ｂｏｖｉｎｅｋｉｄｎｅ
ｙ；ｓｉｇｍａ）酵素反応については、１０ｍＭのα-
Ｌ-フコシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．４５）の下で、３７℃で２日間反応させた。
各酵素消化反応は１００℃で３分間煮沸することで停止
させ、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を
ＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間を既知の糖鎖の
溶出時間と比較した。
化糖鎖の解析 Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； Ｒｏｃｈｅ）酵素消化反
応については、各ＰＡ化糖鎖を３ｍＵのＮアセチルグル
コサミニダーゼを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．４５）の下で、３７℃で２日間反応させた。
また、α-L-フコシダーゼ（ｂｏｖｉｎｅｋｉｄｎｅ
ｙ；ｓｉｇｍａ）酵素反応については、１０ｍＭのα-
Ｌ-フコシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．４５）の下で、３７℃で２日間反応させた。
各酵素消化反応は１００℃で３分間煮沸することで停止
させ、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を
ＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間を既知の糖鎖の
溶出時間と比較した。
【００８０】６．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｒ
Ｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて行った。
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｒ
Ｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて行った。
【００８１】７．ＢＹ２−ＦＴ３株細胞由来のＰＡ化糖
鎖の構造 ＢＹ２−ＦＴ３株細胞約３ｋｇより調製したＰＡ化糖鎖
は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＦ−ＨＰＬＣを利用して精
製した。ＲＰ−ＨＰＬＣで分画した各フラクション（１
〜１０）（図１１のＡにそのクロマトグラムを示す）を
回収した後、それぞれＳＦ−ＨＰＬＣに供した。ＲＰ−
ＨＰＬＣで分画したフラクション１から９までのピーク
をさらにＳＦ−ＨＰＬＣ分析すると合計５５のピークが
得られた（データの一部を図１１のＢに示す）。これら
ピークのいくつかには、複数種のＰＡ化糖鎖が含まれて
いることがあったので、その場合には、再度ＳＦ−ＨＰ
ＬＣにより糖鎖を完全に精製した。
鎖の構造 ＢＹ２−ＦＴ３株細胞約３ｋｇより調製したＰＡ化糖鎖
は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＦ−ＨＰＬＣを利用して精
製した。ＲＰ−ＨＰＬＣで分画した各フラクション（１
〜１０）（図１１のＡにそのクロマトグラムを示す）を
回収した後、それぞれＳＦ−ＨＰＬＣに供した。ＲＰ−
ＨＰＬＣで分画したフラクション１から９までのピーク
をさらにＳＦ−ＨＰＬＣ分析すると合計５５のピークが
得られた（データの一部を図１１のＢに示す）。これら
ピークのいくつかには、複数種のＰＡ化糖鎖が含まれて
いることがあったので、その場合には、再度ＳＦ−ＨＰ
ＬＣにより糖鎖を完全に精製した。
【００８２】これら５５のピークに相当するフラクショ
ンのうち、４Ｄ−Ｖ、５Ａ−ＩＩＩ、５Ｃ−ＩＩＩ、５
Ｄ−ＩＩ、６Ｂ、６Ｆ−Ｉ、７Ｅは、フコシダーゼで切
断でき、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて分解産物の溶出時間が
分解前のものと比べて前に移動した（データは示さ
ず）。これは、これらの糖鎖にα１，６−フコースが結
合していることを示している（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ
１９９８ Ｊａｎ；１５（１）：８９−９１ ＨＰＬ
Ｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｃ ｔｏ Ａｓｎ−ｌｉｎｋｅ
ｄ ＧｌｃＮＡｃ ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅｓ． Ｒｏｉｔｉｎｇｅｒ Ａ，Ｌｅｉｔｅｒ
Ｈ， Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ， Ａｌｔｍａｎｎ
Ｆ．）。
ンのうち、４Ｄ−Ｖ、５Ａ−ＩＩＩ、５Ｃ−ＩＩＩ、５
Ｄ−ＩＩ、６Ｂ、６Ｆ−Ｉ、７Ｅは、フコシダーゼで切
断でき、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて分解産物の溶出時間が
分解前のものと比べて前に移動した（データは示さ
ず）。これは、これらの糖鎖にα１，６−フコースが結
合していることを示している（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ
１９９８ Ｊａｎ；１５（１）：８９−９１ ＨＰＬ
Ｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｃ ｔｏ Ａｓｎ−ｌｉｎｋｅ
ｄ ＧｌｃＮＡｃ ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅｓ． Ｒｏｉｔｉｎｇｅｒ Ａ，Ｌｅｉｔｅｒ
Ｈ， Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ Ｅ， Ａｌｔｍａｎｎ
Ｆ．）。
【００８３】各糖鎖を２次元糖鎖マッピング、エキソグ
リコシダーゼ消化、あるいはＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ
分析に供し、構造解析をした。その結果である糖鎖の構
造を図１２〜１４にまとめた。
リコシダーゼ消化、あるいはＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ
分析に供し、構造解析をした。その結果である糖鎖の構
造を図１２〜１４にまとめた。
【００８４】フラクション４Ｄ−Ｖ、５Ｃ−ＩＩＩ、お
よび５Ｄ−ＩＩ中のＰＡ化糖鎖のｍ／ｚは１４１３．５
９であり、これはＭ３ＦＦＸ（１４１３．３３）に一致
した。これをフコシダーゼ処理したものは、２次元マッ
ピングでＭ３ＦＸに一致し、ｍ/ｚは１２６７．３６で
あり、これもＭ３ＦＸ（１２６７．１９）に一致した。
よび５Ｄ−ＩＩ中のＰＡ化糖鎖のｍ／ｚは１４１３．５
９であり、これはＭ３ＦＦＸ（１４１３．３３）に一致
した。これをフコシダーゼ処理したものは、２次元マッ
ピングでＭ３ＦＸに一致し、ｍ/ｚは１２６７．３６で
あり、これもＭ３ＦＸ（１２６７．１９）に一致した。
【００８５】フラクション６Ｂ、および５Ａ−ＩＩＩ中
のＰＡ化糖鎖のｍ／ｚは、１２５１．５７であり、これ
はＭ２ＦＦＸ（１２５１．１９）（図１４）と一致し
た。これをフコシダーゼ処理したものは、ｍ/ｚは１１
０５．７９であり、これもＭ２ＦＸ（１１０５．０５）
に一致した。
のＰＡ化糖鎖のｍ／ｚは、１２５１．５７であり、これ
はＭ２ＦＦＸ（１２５１．１９）（図１４）と一致し
た。これをフコシダーゼ処理したものは、ｍ/ｚは１１
０５．７９であり、これもＭ２ＦＸ（１１０５．０５）
に一致した。
【００８６】フラクション６Ｆ−Ｉ中のＰＡ化糖鎖のｍ
／ｚは１６１６．１４であり、これはＧｎ1Ｍ３ＦＦＸ
（１６１６．５２）（図１４）に一致した。これをフコ
シダーゼ処理したものは、２次元マッピングでＧｎ1Ｍ
３ＦＸに一致した。また、ｍ/ｚは１４７１．３５であ
り、これもＧｎ1Ｍ３ＦＸ（１４７０．３８）に一致し
た。
／ｚは１６１６．１４であり、これはＧｎ1Ｍ３ＦＦＸ
（１６１６．５２）（図１４）に一致した。これをフコ
シダーゼ処理したものは、２次元マッピングでＧｎ1Ｍ
３ＦＸに一致した。また、ｍ/ｚは１４７１．３５であ
り、これもＧｎ1Ｍ３ＦＸ（１４７０．３８）に一致し
た。
【００８７】フラクション７Ｅ中のＰＡ化糖鎖のｍ／ｚ
は１４５９．３３であり、これはＭ５Ｆ（１４５９．３
６）（図１４）に一致した。これをフコシダーゼ処理す
ると、２次元マッピングでＭ５Ａ（図１２）に一致し、
またｍ/ｚは１３１３．４３であり、これもＭ５Ａ（１
３１３．２２）に一致した。
は１４５９．３３であり、これはＭ５Ｆ（１４５９．３
６）（図１４）に一致した。これをフコシダーゼ処理す
ると、２次元マッピングでＭ５Ａ（図１２）に一致し、
またｍ/ｚは１３１３．４３であり、これもＭ５Ａ（１
３１３．２２）に一致した。
【００８８】フラクション５ＣＩＩ３ＩＩおよび５ＤＩ
２ＩＩ中のＰＡ化糖鎖は、２次元マッピングにおいてＭ
５Ａに一致し、そしてｍ/ｚもまた１３１３．１４でＭ
５Ａ（１３１３．２２）に一致した。
２ＩＩ中のＰＡ化糖鎖は、２次元マッピングにおいてＭ
５Ａに一致し、そしてｍ/ｚもまた１３１３．１４でＭ
５Ａ（１３１３．２２）に一致した。
【００８９】フラクション４Ｆ中のＰＡ化糖鎖は、２次
元マッピングにおいてＭ６Ｂに一致し、ｍ/ｚもまた１
４７５．８２でＭ６Ｂ（１４７５．３６）に一致した。
元マッピングにおいてＭ６Ｂに一致し、ｍ/ｚもまた１
４７５．８２でＭ６Ｂ（１４７５．３６）に一致した。
【００９０】フラクション３Ｂ中のＰＡ化糖鎖は、２次
元マッピングにおいてＭ７Ｂに一致し、ｍ/ｚもまた１
６３８．３５でＭ７Ｂ（１６３７．５０）に一致した。
元マッピングにおいてＭ７Ｂに一致し、ｍ/ｚもまた１
６３８．３５でＭ７Ｂ（１６３７．５０）に一致した。
【００９１】フラクション２Ｃ中のＰＡ化糖鎖は、２次
元マッピングにおいてＭ７Ａに一致し、ｍ/ｚもまた１
６３８．３３でＭ７Ａ（１６３７．５０）に一致した。
元マッピングにおいてＭ７Ａに一致し、ｍ/ｚもまた１
６３８．３３でＭ７Ａ（１６３７．５０）に一致した。
【００９２】フラクション２Ｄおよびピーク１Ｅ中のＰ
Ａ化糖鎖は、２次元マッピングにおいてＭ８Ａに一致
し、ｍ/ｚもまた１８００．４４でＭ８Ａ（１７９９．
６４）に一致した。
Ａ化糖鎖は、２次元マッピングにおいてＭ８Ａに一致
し、ｍ/ｚもまた１８００．４４でＭ８Ａ（１７９９．
６４）に一致した。
【００９３】また、フラクション１ＡＩＩＩおよび２Ａ
中のＰＡ化糖鎖はＭ３ＦＸに、フラクション５ＣＩＩＩ
中のＰＡ化糖鎖は、Ｍ３Ｘに、それぞれ２次元マッピン
グで一致した。フラクション７Ｃ中のＰＡ化糖鎖をＮア
セチルグルコサミニダーゼ切断処理するとＳＦ−ＨＰＬ
Ｃ分析でその溶出位置がＧｌｃＮＡＣ１個分移動した。
この切断断片は、２次元マッピングでＭ３Ｘに一致し
た。ｍ/ｚは１３２４．８３でＧｎＭ３Ｘ（１３２４．
２４）に一致した。これからフラクション７Ｃ中のＰＡ
化糖鎖はＧｎ1Ｍ３Ｘと考えられる。（各糖鎖の構造に
ついては図１３を参照のこと）。
中のＰＡ化糖鎖はＭ３ＦＸに、フラクション５ＣＩＩＩ
中のＰＡ化糖鎖は、Ｍ３Ｘに、それぞれ２次元マッピン
グで一致した。フラクション７Ｃ中のＰＡ化糖鎖をＮア
セチルグルコサミニダーゼ切断処理するとＳＦ−ＨＰＬ
Ｃ分析でその溶出位置がＧｌｃＮＡＣ１個分移動した。
この切断断片は、２次元マッピングでＭ３Ｘに一致し
た。ｍ/ｚは１３２４．８３でＧｎＭ３Ｘ（１３２４．
２４）に一致した。これからフラクション７Ｃ中のＰＡ
化糖鎖はＧｎ1Ｍ３Ｘと考えられる。（各糖鎖の構造に
ついては図１３を参照のこと）。
【００９４】フラクション５ＣＩＩ２およびフラクショ
ン５ＤＩ１中のＰＡ化糖鎖をＮアセチルグルコサミニダ
ーゼ処理すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析でその溶出位置が
それぞれＧｌｃＮＡｃ１個分移動した。切断断片は２次
元マッピングでそれぞれＭ３Ｘに一致した。ｍ/ｚは１
３２４．６１でＧｎＭ３Ｘ（１３２４．２４）に一致し
た。これから、フラクション５ＣＩＩ２およびフラクシ
ョン５ＤＩ１中のＰＡ化糖鎖はＧｎ1Ｍ３Ｘと考えられ
る。これは、フラクション７Ｃ中のＰＡ化糖鎖とは、Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ分析でその溶出位置が異なるので構造変異
体と推測される。
ン５ＤＩ１中のＰＡ化糖鎖をＮアセチルグルコサミニダ
ーゼ処理すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析でその溶出位置が
それぞれＧｌｃＮＡｃ１個分移動した。切断断片は２次
元マッピングでそれぞれＭ３Ｘに一致した。ｍ/ｚは１
３２４．６１でＧｎＭ３Ｘ（１３２４．２４）に一致し
た。これから、フラクション５ＣＩＩ２およびフラクシ
ョン５ＤＩ１中のＰＡ化糖鎖はＧｎ1Ｍ３Ｘと考えられ
る。これは、フラクション７Ｃ中のＰＡ化糖鎖とは、Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ分析でその溶出位置が異なるので構造変異
体と推測される。
【００９５】フラクション４ＥＩ中のＰＡ化糖鎖は、Ｎ
アセチルグルコサミニダーゼ切断処理すると、ＳＦ−Ｈ
ＰＬＣ分析でその溶出位置がＧｌｃＮＡｃ１個分移動し
た。この切断断片は２次元マッピングでＭ３ＦＸに一致
した。ｍ/ｚは１４７１.２１でＧｎＭ３ＦＸ（１４７
０.３８）に一致した。これから、これから、フラクシ
ョン４ＥＩ中のＰＡ化糖鎖はＧｎ1Ｍ３ＦＸであると推
定された。
アセチルグルコサミニダーゼ切断処理すると、ＳＦ−Ｈ
ＰＬＣ分析でその溶出位置がＧｌｃＮＡｃ１個分移動し
た。この切断断片は２次元マッピングでＭ３ＦＸに一致
した。ｍ/ｚは１４７１.２１でＧｎＭ３ＦＸ（１４７
０.３８）に一致した。これから、これから、フラクシ
ョン４ＥＩ中のＰＡ化糖鎖はＧｎ1Ｍ３ＦＸであると推
定された。
【００９６】フラクション２ＢＩＩ中のＰＡ化糖鎖は、
Ｎアセチルグルコサミニダーゼ処理すると、ＳＦ−ＨＰ
ＬＣ分析でその溶出位置がＧｌｃＮＡｃ１個分移動し
た。これはＭ３ＦＸに一致する。ｍ/ｚは１４７１.２９
でＧｎＭ３ＦＸ（１４７０.３８）に一致した。従っ
て、フラクション２ＢＩＩ中のＰＡ化糖鎖はＧｎ1Ｍ３
ＦＸと推定された。フラクション２ＢＩＩ中のＰＡ化糖
鎖は、フラクション４ＥＩ中のＰＡ化糖鎖とは、ＲＰ−
ＨＰＬＣにおける溶出位置が異なるので構造変異体と推
測される。
Ｎアセチルグルコサミニダーゼ処理すると、ＳＦ−ＨＰ
ＬＣ分析でその溶出位置がＧｌｃＮＡｃ１個分移動し
た。これはＭ３ＦＸに一致する。ｍ/ｚは１４７１.２９
でＧｎＭ３ＦＸ（１４７０.３８）に一致した。従っ
て、フラクション２ＢＩＩ中のＰＡ化糖鎖はＧｎ1Ｍ３
ＦＸと推定された。フラクション２ＢＩＩ中のＰＡ化糖
鎖は、フラクション４ＥＩ中のＰＡ化糖鎖とは、ＲＰ−
ＨＰＬＣにおける溶出位置が異なるので構造変異体と推
測される。
【００９７】フラクション３Ａ中のＰＡ化糖鎖は、ｍ/
ｚが１６７４．５６でＧｎ２Ｍ３ＦＸ（１６７３．５
７）に一致した。Ｎアセチルグルコサミニダーゼ切断処
理するとＳＦ−ＨＰＬＣ分析でその溶出位置が２Ｇｌｃ
ＮＡｃ単位移動した。この切断断片は２次元マッピング
でＭ３ＦＸに一致する。これからフラクション３Ａ中の
ＰＡ化糖鎖はＧｎ２Ｍ３ＦＸと推定された。
ｚが１６７４．５６でＧｎ２Ｍ３ＦＸ（１６７３．５
７）に一致した。Ｎアセチルグルコサミニダーゼ切断処
理するとＳＦ−ＨＰＬＣ分析でその溶出位置が２Ｇｌｃ
ＮＡｃ単位移動した。この切断断片は２次元マッピング
でＭ３ＦＸに一致する。これからフラクション３Ａ中の
ＰＡ化糖鎖はＧｎ２Ｍ３ＦＸと推定された。
【００９８】その他の糖鎖は、ｍ／ｚ値や２次元マッピ
ングなどのデータを考え合わせても、該当するＮ−結合
型糖鎖は見られないため、Ｎ−結合型糖鎖ではないと判
断された。
ングなどのデータを考え合わせても、該当するＮ−結合
型糖鎖は見られないため、Ｎ−結合型糖鎖ではないと判
断された。
【００９９】以上の分析の結果、Ｎ−結合型糖鎖の存在
比を％で表示した。高マンノース型糖鎖が１０.８％、
複合型糖鎖が２８．１％、α１，６−フコースが結合し
た糖鎖が６１.１％であった。α１，６-フコース転移酵
素遺伝子で形質転換したＢＹ２−ＦＴ３株の細胞内糖鎖
の６１.１％にα１，６-フコースが結合していた。
比を％で表示した。高マンノース型糖鎖が１０.８％、
複合型糖鎖が２８．１％、α１，６−フコースが結合し
た糖鎖が６１.１％であった。α１，６-フコース転移酵
素遺伝子で形質転換したＢＹ２−ＦＴ３株の細胞内糖鎖
の６１.１％にα１，６-フコースが結合していた。
【０１００】上記に示したように、α１，６−フコース
転移酵素遺伝子で形質転換したＢＹ２−ＦＴ３株では、
細胞内糖鎖の６１.１％にα１，６−フコースが結合し
ていた。しかし、このα１，６−フコースが結合した糖
鎖のほとんどに、α１，３−フコースまたはβ１，２−
キシロースもまた付加されていた。α１，３-フコース
またはβ１，２−キシロースは動物に対して抗原性を示
す可能性が報告されているので、これら糖鎖を、動物に
対して抗原性を示す可能性をない構造にするために、α
１，３−フコース転移酵素、あるいはβ１，２−キシロ
ース転移酵素を不活性化することが必要である。これ
は、α１，３−フコース転移酵素活性、またはβ１，２
−キシロース転移酵素活性を持たない、変異体宿主植物
をスクリーニングするか、作製するか、または酵素遺伝
子を用いた遺伝子発現抑制を実施することで達成され
る。
転移酵素遺伝子で形質転換したＢＹ２−ＦＴ３株では、
細胞内糖鎖の６１.１％にα１，６−フコースが結合し
ていた。しかし、このα１，６−フコースが結合した糖
鎖のほとんどに、α１，３−フコースまたはβ１，２−
キシロースもまた付加されていた。α１，３-フコース
またはβ１，２−キシロースは動物に対して抗原性を示
す可能性が報告されているので、これら糖鎖を、動物に
対して抗原性を示す可能性をない構造にするために、α
１，３−フコース転移酵素、あるいはβ１，２−キシロ
ース転移酵素を不活性化することが必要である。これ
は、α１，３−フコース転移酵素活性、またはβ１，２
−キシロース転移酵素活性を持たない、変異体宿主植物
をスクリーニングするか、作製するか、または酵素遺伝
子を用いた遺伝子発現抑制を実施することで達成され
る。
【０１０１】遺伝子発現抑制は、アンチセンス法による
抑制（Ｗｅｎｄｅｒｏｔｈ Ｉ，ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗ
ｎ Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ Ｎ-ａｃｅｔ
ｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
Ｉ（ＧｎＴＩ） ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｎ ｔｈ
ｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｇｌ ｍｕｔａｎｔ
ａｎｄ ｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｌａｎｔｓ．
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０００ Ｊｕｌ；
（３）：１０９７−１１０８ ）、ＤＮＡ-ＲＮＡキメラ
オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異体の作
成（Ｂｅｅｔｈａｍ ＰＲ，Ｋｉｐｐ ＰＢ，Ｓａｗｙ
ｃｋｙＸＩ，Ａｒｎｔｚｅｎ ＣＪ，Ｍａｙ ＧＤ．A
ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｎ
ｔ ｇｅｎｏｍｉｃｓ： ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ/
ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃａｕｓ
ｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍ
ｕｔａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９ Ｊｕｌ；９６（１
５）：８７７４-８７７８）、植物ウィルスを用いた遺
伝子サイレンス法（Ｃｏｖｅｙ ＳＮ，Ａｌ-Ｋａｆｆ
ＮＳ． Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎ
ｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｊｕｎ；４３（２-３）：３
０７-３２２）などを用いて実施され、このような技法
は当該分野で公知である。
抑制（Ｗｅｎｄｅｒｏｔｈ Ｉ，ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗ
ｎ Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ Ｎ-ａｃｅｔ
ｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
Ｉ（ＧｎＴＩ） ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｎ ｔｈ
ｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｇｌ ｍｕｔａｎｔ
ａｎｄ ｉｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｌａｎｔｓ．
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０００ Ｊｕｌ；
（３）：１０９７−１１０８ ）、ＤＮＡ-ＲＮＡキメラ
オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異体の作
成（Ｂｅｅｔｈａｍ ＰＲ，Ｋｉｐｐ ＰＢ，Ｓａｗｙ
ｃｋｙＸＩ，Ａｒｎｔｚｅｎ ＣＪ，Ｍａｙ ＧＤ．A
ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｎ
ｔ ｇｅｎｏｍｉｃｓ： ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ/
ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃａｕｓ
ｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍ
ｕｔａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９ Ｊｕｌ；９６（１
５）：８７７４-８７７８）、植物ウィルスを用いた遺
伝子サイレンス法（Ｃｏｖｅｙ ＳＮ，Ａｌ-Ｋａｆｆ
ＮＳ． Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎ
ｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｊｕｎ；４３（２-３）：３
０７-３２２）などを用いて実施され、このような技法
は当該分野で公知である。
【０１０２】（実施例４：形質転換タバコ細胞の再生に
よる植物体の作成および植物体で産生される糖タンパク
質の解析） １．無菌タバコ植物体の作成 １.５ｍｌ容微量遠心チューブに、タバコ（Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ１株（日本たばこ産業
株式会社葉タバコ研究所、静岡県磐田郡豊田町東原７０
０から入手した）の種子を入れ、７０％エタノールを添
加し、３分間振り混ぜることによりタバコの種子を滅菌
した。次いで、エタノール溶液を棄て、１ｍｌの滅菌水
でタバコの種子を洗浄した。続いてアンチホルミン溶液
（市販の次亜塩素酸ナトリウム溶液を１０倍に希釈して
用いた）を１ｍｌ入れて、チューブを時々振り混ぜなが
ら１５分間放置した。次いで、アンチホルミン溶液を棄
てて、タバコの種子を滅菌水で３回洗浄した。
よる植物体の作成および植物体で産生される糖タンパク
質の解析） １．無菌タバコ植物体の作成 １.５ｍｌ容微量遠心チューブに、タバコ（Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ１株（日本たばこ産業
株式会社葉タバコ研究所、静岡県磐田郡豊田町東原７０
０から入手した）の種子を入れ、７０％エタノールを添
加し、３分間振り混ぜることによりタバコの種子を滅菌
した。次いで、エタノール溶液を棄て、１ｍｌの滅菌水
でタバコの種子を洗浄した。続いてアンチホルミン溶液
（市販の次亜塩素酸ナトリウム溶液を１０倍に希釈して
用いた）を１ｍｌ入れて、チューブを時々振り混ぜなが
ら１５分間放置した。次いで、アンチホルミン溶液を棄
てて、タバコの種子を滅菌水で３回洗浄した。
【０１０３】別に、シャーレ内でオーグペニン（明治製
菓製）を最終濃度１６０ｍｇ/ｌとなるように希釈し、
シャーレ内の滅菌した濾紙を浸し、この濾紙上でタバコ
の種子を発芽させた。発芽した種子は、ＭＳ培地に移し
明所で培養した。生育したタバコＳＲ１株植物体の茎頂
から約４ｃｍの部位をメスで切とり、新しいＭＳ培地に
突き刺すことによって植え継ぎ、さらに明所で培養し
た。
菓製）を最終濃度１６０ｍｇ/ｌとなるように希釈し、
シャーレ内の滅菌した濾紙を浸し、この濾紙上でタバコ
の種子を発芽させた。発芽した種子は、ＭＳ培地に移し
明所で培養した。生育したタバコＳＲ１株植物体の茎頂
から約４ｃｍの部位をメスで切とり、新しいＭＳ培地に
突き刺すことによって植え継ぎ、さらに明所で培養し
た。
【０１０４】２．タバコ植物体の形質転換 Ａｎらの方法（Ａｎ，Ｇ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｐ．Ｒ．，Ｍ
ｉｔｒａ，Ａ．ａｎｄＨａ，Ｓ．Ｂ．（１９８８） Ｂ
ｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａ
３，１-１９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｄｏｒｄｒｅｃｈ
ｔ）に従ってタバコ植物体の形質転換を行った。
ｉｔｒａ，Ａ．ａｎｄＨａ，Ｓ．Ｂ．（１９８８） Ｂ
ｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａ
３，１-１９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｄｏｒｄｒｅｃｈ
ｔ）に従ってタバコ植物体の形質転換を行った。
【０１０５】要約すれば、ポットから無菌タバコの葉を
切り取り、シャーレの中で１ｃｍ角の大きさ（リーフデ
ィスク）に切り取った。別の滅菌シャーレに移し、抗生
物質を含む２×ＹＴ培地で、２８℃、２日間培養したア
グロバクテリウム培養液（ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴを
持つアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株）５ｍｌを入れ
てよく混合した後３分間静置した。このリーフディスク
を取り出し、付着した余分の菌液を滅菌キムタオルで拭
き取った後、ＭＳ-ＮＢ培地（１ＬあたりＭｕｒａｓｈ
ｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ ｐｌａｎｔ ｓａｌｔ ｍｉｘｔ
ｕｒｅ ４．３ｇ、ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ、５％ Ｍ
ＥＳ-ＫＯＨ（ｐＨ５．７） １０ｍｌ、 ｇｅｌｌａ
ｎ ｇｕｍ ３ｇ、ＮＡＡ ０．１ｍｇ、ＢＡＰ １．
０ｍｇ、ｔｈｉａｍｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
１０ｍｇ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｉｄ １ｍｇ、ｐ
ｙｒｉｄｏｘｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ １ｍ
ｇ）上に置床し、２５℃明所で培養した。
切り取り、シャーレの中で１ｃｍ角の大きさ（リーフデ
ィスク）に切り取った。別の滅菌シャーレに移し、抗生
物質を含む２×ＹＴ培地で、２８℃、２日間培養したア
グロバクテリウム培養液（ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴを
持つアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株）５ｍｌを入れ
てよく混合した後３分間静置した。このリーフディスク
を取り出し、付着した余分の菌液を滅菌キムタオルで拭
き取った後、ＭＳ-ＮＢ培地（１ＬあたりＭｕｒａｓｈ
ｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ ｐｌａｎｔ ｓａｌｔ ｍｉｘｔ
ｕｒｅ ４．３ｇ、ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ、５％ Ｍ
ＥＳ-ＫＯＨ（ｐＨ５．７） １０ｍｌ、 ｇｅｌｌａ
ｎ ｇｕｍ ３ｇ、ＮＡＡ ０．１ｍｇ、ＢＡＰ １．
０ｍｇ、ｔｈｉａｍｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
１０ｍｇ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｉｄ １ｍｇ、ｐ
ｙｒｉｄｏｘｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ １ｍ
ｇ）上に置床し、２５℃明所で培養した。
【０１０６】２日後、滅菌水の入った５０ｍｌ容コニカ
ルチューブにリーフディスクを移し、よく振り混ぜて洗
浄した。リーフディスクの水分を滅菌したキムタオルで
拭き取った後、これを除菌培地に置き、２５℃で１週間
培養した。続いてリーフディスクをｈｙｇｒｏｍｙｃｉ
ｎ Ｂ（終濃度２０ｍｇ/Ｌ）およびｃａｒｂｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｎ（終濃度２５０ｍｇ/Ｌ）を含むＭＳ-ＮＢ培
地（シュート形成培地）に移し、大きくなったカルスを
適宜シュート形成培地を含むガラス製ポットに無菌的に
植え継いだ。約１ヶ月後に茎葉部の発達したシュートを
切り取り、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（終濃度２０ｍｇ
/Ｌ）およびｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（終濃度２５
０ｍｇ/Ｌ）を含むＭＳ-ＮＢ培地（ルート形成培地）
（但し、上記基本ＭＳ−ＮＢ培地よりＢＡＰおよびＮＡ
Ａを除く）に無菌的に植え継ぎ、ルートが出るまで、２
５℃明所で培養した。ポット内で大きく成長した植物体
を鉢に移し、植物体を生育させ、形質転換体植物体ＦＴ
（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、およびＦＴ３を
得た。
ルチューブにリーフディスクを移し、よく振り混ぜて洗
浄した。リーフディスクの水分を滅菌したキムタオルで
拭き取った後、これを除菌培地に置き、２５℃で１週間
培養した。続いてリーフディスクをｈｙｇｒｏｍｙｃｉ
ｎ Ｂ（終濃度２０ｍｇ/Ｌ）およびｃａｒｂｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｎ（終濃度２５０ｍｇ/Ｌ）を含むＭＳ-ＮＢ培
地（シュート形成培地）に移し、大きくなったカルスを
適宜シュート形成培地を含むガラス製ポットに無菌的に
植え継いだ。約１ヶ月後に茎葉部の発達したシュートを
切り取り、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（終濃度２０ｍｇ
/Ｌ）およびｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（終濃度２５
０ｍｇ/Ｌ）を含むＭＳ-ＮＢ培地（ルート形成培地）
（但し、上記基本ＭＳ−ＮＢ培地よりＢＡＰおよびＮＡ
Ａを除く）に無菌的に植え継ぎ、ルートが出るまで、２
５℃明所で培養した。ポット内で大きく成長した植物体
を鉢に移し、植物体を生育させ、形質転換体植物体ＦＴ
（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、およびＦＴ３を
得た。
【０１０７】３．タバコ植物体からの染色体ＤＮＡの調
製 形質転換体植物体ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、Ｆ
Ｔ２、およびＦＴ３から得られた約１００ｍｇの各植物
体試料を、液体窒素中で凍結した。この凍結試料を粉砕
した後、ＤＡｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、キットの指示書に従って、各
試料から染色体ＤＮＡを調製した。
製 形質転換体植物体ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、Ｆ
Ｔ２、およびＦＴ３から得られた約１００ｍｇの各植物
体試料を、液体窒素中で凍結した。この凍結試料を粉砕
した後、ＤＡｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、キットの指示書に従って、各
試料から染色体ＤＮＡを調製した。
【０１０８】次いで、実施例１に記載のＢＹ２−ＦＧ細
胞のゲノムＤＮＡの増幅と同様の条件でＰＣＲを行い、
α１，６−ＦＴ遺伝子が形質転換植物体の染色体へ組み
込まれていることを確認した。プライマーとしては、Ｃ
ａＭＶ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧ
ＣＡＡＧＴＧＧＡＴ）とＦＴ-Ｓａｌ（５’−ＧＧＡＴ
ＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＴＴＧＡＣ）とを用いた。
胞のゲノムＤＮＡの増幅と同様の条件でＰＣＲを行い、
α１，６−ＦＴ遺伝子が形質転換植物体の染色体へ組み
込まれていることを確認した。プライマーとしては、Ｃ
ａＭＶ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧ
ＣＡＡＧＴＧＧＡＴ）とＦＴ-Ｓａｌ（５’−ＧＧＡＴ
ＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＴＴＧＡＣ）とを用いた。
【０１０９】得られたＰＣＲ増幅産物を、実施例１と同
様に電気泳動した結果を図１４に示す。図１４に示され
るようにＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、お
よびＦＴ３において１７００ｂｐ付近にα１，６−ＦＴ
遺伝子領域の増幅断片と思われるバンドを確認すること
ができた。その一方、野生型ＳＲ１から調製したゲノム
DNAをテンプレートとして用いた場合、１７００ｂｐ付
近にバンドは見られなかった。このことから、形質転換
体植物体ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、お
よびＦＴ３においてα１，６−ＦＴ遺伝子が染色体上に
組み込まれていることが確認された。
様に電気泳動した結果を図１４に示す。図１４に示され
るようにＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、お
よびＦＴ３において１７００ｂｐ付近にα１，６−ＦＴ
遺伝子領域の増幅断片と思われるバンドを確認すること
ができた。その一方、野生型ＳＲ１から調製したゲノム
DNAをテンプレートとして用いた場合、１７００ｂｐ付
近にバンドは見られなかった。このことから、形質転換
体植物体ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、お
よびＦＴ３においてα１，６−ＦＴ遺伝子が染色体上に
組み込まれていることが確認された。
【０１１０】４．α１−６ＦＴ形質転換体植物体で産生
された糖タンパク質の解析；レクチン染色 実施例２と同様に、アスパラギン結合型糖鎖の還元末端
に存在するＮ−アセチルグルコサミンにα１，６結合し
たフコース残基と強く結合するエンドウ豆レクチン（Ｐ
ＳＡ）（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ，Ｔｓｕｊｉ Ｔ， Ｏ
ｓａｗａ Ｔ．，（１９８２） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅ Ｒｅｓ．,１１０，２８３-２８９，Ｄｅｂｒａｙ
Ｈ．，Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ Ｊ．，（１９８９）Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，１８５，１５-２
６）を用いて、導入したα１，６−ＦＴの形質転換体で
産生された糖タンパク質を解析した。
された糖タンパク質の解析；レクチン染色 実施例２と同様に、アスパラギン結合型糖鎖の還元末端
に存在するＮ−アセチルグルコサミンにα１，６結合し
たフコース残基と強く結合するエンドウ豆レクチン（Ｐ
ＳＡ）（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ，Ｔｓｕｊｉ Ｔ， Ｏ
ｓａｗａ Ｔ．，（１９８２） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅ Ｒｅｓ．,１１０，２８３-２８９，Ｄｅｂｒａｙ
Ｈ．，Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ Ｊ．，（１９８９）Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，１８５，１５-２
６）を用いて、導入したα１，６−ＦＴの形質転換体で
産生された糖タンパク質を解析した。
【０１１１】結果を図１５に示す。図１５に示されるよ
うに対照であるＳＲ１植物体と比べ、形質転換体植物体
ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、およびＦＴ
３では、糖タンパク質糖鎖にレクチンが反応したことを
示す染色が見られた。このことから、形質転換体植物体
においてα１，６フコース残基を持つ糖タンパク質の存
在が示された。
うに対照であるＳＲ１植物体と比べ、形質転換体植物体
ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、ＦＴ１、ＦＴ２、およびＦＴ
３では、糖タンパク質糖鎖にレクチンが反応したことを
示す染色が見られた。このことから、形質転換体植物体
においてα１，６フコース残基を持つ糖タンパク質の存
在が示された。
【０１１２】なお、ＳＲ１植物体ついても若干のレクチ
ン反応が見られるが、この弱いレクチン反応は、タバコ
培養細胞をα１，６−ＦＴ遺伝子により形質転換し、Ｐ
ＳＡレクチンにより陽性クローンを選抜した場合にも観
察された。これは、用いたＰＳＡレクチンが植物複合型
糖鎖に存在するα１，３フコース残基を含む他のフコー
ス残基とも親和性を有するためであると考えられる。
ン反応が見られるが、この弱いレクチン反応は、タバコ
培養細胞をα１，６−ＦＴ遺伝子により形質転換し、Ｐ
ＳＡレクチンにより陽性クローンを選抜した場合にも観
察された。これは、用いたＰＳＡレクチンが植物複合型
糖鎖に存在するα１，３フコース残基を含む他のフコー
ス残基とも親和性を有するためであると考えられる。
【０１１３】以下、上記実施例用いた材料および方法を
要約する。 −材料および方法− １．使用植物、菌株、プラスミド （１．１．使用植物）植物における形質転換体として、
タバコＢＹ２培養細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２）を
用いた。 （１．２．使用菌株）使用菌株を表２に示す。
要約する。 −材料および方法− １．使用植物、菌株、プラスミド （１．１．使用植物）植物における形質転換体として、
タバコＢＹ２培養細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２）を
用いた。 （１．２．使用菌株）使用菌株を表２に示す。
【０１１４】
【表２】 （１．３．使用プラスミド）使用プラスミドを表３に示
す。
す。
【０１１５】
【表３】 ２．培地 （２．１．バクテリア培養用培地）２×ＹＴ培地：Ｂａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／ｌを用
いた。平板培地には１２ｇ／ｌの精製寒天粉末を加え
た。必要に応じて終濃度がそれぞれアンピシリン（明治
製菓（株））５０ｍｇ／ｌ、カナマイシン（明治製菓
（株））５０ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシン（和光純薬）
２０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール(和光純薬)２５ｍ
ｇ／ｌ，リファンピシン（和光純薬）50 mg/l, ストレ
プトマイシン（和光純薬）20 mg/l となるように加え
た。 （２．２．タバコ培養細胞用培地）
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／ｌを用
いた。平板培地には１２ｇ／ｌの精製寒天粉末を加え
た。必要に応じて終濃度がそれぞれアンピシリン（明治
製菓（株））５０ｍｇ／ｌ、カナマイシン（明治製菓
（株））５０ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシン（和光純薬）
２０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール(和光純薬)２５ｍ
ｇ／ｌ，リファンピシン（和光純薬）50 mg/l, ストレ
プトマイシン（和光純薬）20 mg/l となるように加え
た。 （２．２．タバコ培養細胞用培地）
【０１１６】
【表４】 を用いた。また、ムラシゲ・スクーク培地用混合塩類
（和光純薬）を用いて上記の組成となるように調製した
ものも用いた。 改変ＬＳ寒天培地：改変ＬＳ培地のＫＨ2ＰＯ4を１７０
ｍｇ／ｌにし、ＫＯＨでｐＨ５．８に調節し、さらにゲ
ランガム（和光純薬）３ｇ／ｌを加えた。必要に応じ
て、終濃度がそれぞれカナマイシン１５０ｍｇ／ｌ,カ
ルベニシリン（和光純薬）２５０ｍｇ／ｌ, ハイグロマ
イシン２０ｍｇ／ｌ, メソトレキサート（和光純薬）
０．１ｍｇ／ｌ,ビアラホス（明治製薬）１０ｍｇ／ｌ
を加えた。
（和光純薬）を用いて上記の組成となるように調製した
ものも用いた。 改変ＬＳ寒天培地：改変ＬＳ培地のＫＨ2ＰＯ4を１７０
ｍｇ／ｌにし、ＫＯＨでｐＨ５．８に調節し、さらにゲ
ランガム（和光純薬）３ｇ／ｌを加えた。必要に応じ
て、終濃度がそれぞれカナマイシン１５０ｍｇ／ｌ,カ
ルベニシリン（和光純薬）２５０ｍｇ／ｌ, ハイグロマ
イシン２０ｍｇ／ｌ, メソトレキサート（和光純薬）
０．１ｍｇ／ｌ,ビアラホス（明治製薬）１０ｍｇ／ｌ
を加えた。
【０１１７】３．実験試薬、酵素 試薬は特に指定のない限り、和光純薬工業、ナカライテ
スクのものを用いた。制限酵素、修飾酵素は、東洋紡、
宝酒造、ニッポンジーン、シグマ、ＮＥＢ、のものをそ
れぞれの説明書に従って使用した。
スクのものを用いた。制限酵素、修飾酵素は、東洋紡、
宝酒造、ニッポンジーン、シグマ、ＮＥＢ、のものをそ
れぞれの説明書に従って使用した。
【０１１８】４．大腸菌の形質転換 （４．１．コンピテントセルの調製）宿主大腸菌を２ｍ
ｌの２×ＹＴ培地に植菌し、その一晩培養液を坂口フラ
スコに入れた２００ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌した。３
７℃で６００ｎｍにおける濁度が０．６になるまで振と
う培養し、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分間、０
℃）し、上澄み液を捨て、菌体を５０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、１５％グリセロール混合液５ｍｌに懸濁した後、
エッペンドルフチューブに分注し、コンピテントセルと
して−８０℃で保存した。 （４．２．大腸菌の形質転換）コンピテントセルを氷中
で解凍後、１〜１５μlのＤＮＡ溶液を加え、氷中に３
０分放置した。４２℃に９０秒間置き、直ちに氷中に戻
した。１ｍｌの２×ＹＴ培地を加えて３７℃で１時間培
養し、適当な抗生物質を含む寒天培地に広げ、３７℃で
一晩培養した。
ｌの２×ＹＴ培地に植菌し、その一晩培養液を坂口フラ
スコに入れた２００ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌した。３
７℃で６００ｎｍにおける濁度が０．６になるまで振と
う培養し、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分間、０
℃）し、上澄み液を捨て、菌体を５０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、１５％グリセロール混合液５ｍｌに懸濁した後、
エッペンドルフチューブに分注し、コンピテントセルと
して−８０℃で保存した。 （４．２．大腸菌の形質転換）コンピテントセルを氷中
で解凍後、１〜１５μlのＤＮＡ溶液を加え、氷中に３
０分放置した。４２℃に９０秒間置き、直ちに氷中に戻
した。１ｍｌの２×ＹＴ培地を加えて３７℃で１時間培
養し、適当な抗生物質を含む寒天培地に広げ、３７℃で
一晩培養した。
【０１１９】５．アグロバクテリウムの形質転換 Ｂｅｖａｎらのｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ法を用いて行っ
た。ｐＧＰＴＶ系プラスミドを持つ大腸菌、ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌を３７℃で一晩、
アグロバクテリウムＥＨＡ１０１株もしくはＬＢＡ４４
０４株を２８℃で二晩、それぞれの抗生物質の入った培
地で培養した。
た。ｐＧＰＴＶ系プラスミドを持つ大腸菌、ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌を３７℃で一晩、
アグロバクテリウムＥＨＡ１０１株もしくはＬＢＡ４４
０４株を２８℃で二晩、それぞれの抗生物質の入った培
地で培養した。
【０１２０】各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチュ
ーブにとり集菌した後、２×ＹＴ培地で２回洗浄した。
これらの菌体を１ｍｌの２×ＹＴ培地に懸濁後、３種の
菌を混合して２×ＹＴ培地にまき、２８℃で培養してプ
ラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムに接合伝達さ
せた。２日後、２×ＹＴ培地上で一面に増殖した菌体を
白金耳でかきとり、抗生物質を含む２×ＹＴ寒天培地上
に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニー
を選択した。
ーブにとり集菌した後、２×ＹＴ培地で２回洗浄した。
これらの菌体を１ｍｌの２×ＹＴ培地に懸濁後、３種の
菌を混合して２×ＹＴ培地にまき、２８℃で培養してプ
ラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムに接合伝達さ
せた。２日後、２×ＹＴ培地上で一面に増殖した菌体を
白金耳でかきとり、抗生物質を含む２×ＹＴ寒天培地上
に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニー
を選択した。
【０１２１】６．タバコ培養細胞の形質転換 （６．１．タバコ培養細胞の継代培養）３００ｍｌのマ
イヤーフラスコに改変ＬＳ培地を９５ｍｌ入れ、温度
（２５〜２７℃）、撹拌速度（１２０ｒｐｍ）、暗所下
で培養を行った。そして、７日毎に定常期に達した細胞
を２ｍｌずつ植え継いだ。また、７日目に十分量の細胞
数が得られない場合、植え継ぐ量を２倍の４ｍｌとし
た。 （６．２．タバコ培養細胞の形質転換）抗生物質を含む
２×ＹＴ培地中２８℃で２日間培養したアグロバクテリ
ウム培養液（ｐＧＰＴＶ系プラスミドを持つＥＨＡ１０
１株、ＬＢＡ４４０４株）、１００μlと培養４日目の
タバコ培養細胞懸濁液４ｍｌをシャーレに入れてよく混
合し、２５℃で暗所で静置した。２日後シャーレのなか
の培養液を遠心管に移して遠心分離（１，０００ｒｐ
ｍ、５分間）により上澄みを除いた。次に２５０ｍｇ／
ｌのカルベニシリンを含む新しい培地を入れて遠心分離
し、細胞を洗浄した。この操作を３回繰り返し、アグロ
バクテリウムを除いた培養細胞を２０ｍｇ／ｌのハイグ
ロマイシン、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む改
変ＬＳ寒天培地にまき、２５℃暗所で培養した。約２〜
３週間後にカルス化した細胞を新しい改変ＬＳ寒天培地
上に移し、増殖しているクローンを選択した。さらに２
〜３週間後に直径１ｃｍ程度に成長したカルスをハイグ
ロマイシン、カルベニシリンを含む改変ＬＳ培地３０ｍ
ｌに移し、継代培養を行った。
イヤーフラスコに改変ＬＳ培地を９５ｍｌ入れ、温度
（２５〜２７℃）、撹拌速度（１２０ｒｐｍ）、暗所下
で培養を行った。そして、７日毎に定常期に達した細胞
を２ｍｌずつ植え継いだ。また、７日目に十分量の細胞
数が得られない場合、植え継ぐ量を２倍の４ｍｌとし
た。 （６．２．タバコ培養細胞の形質転換）抗生物質を含む
２×ＹＴ培地中２８℃で２日間培養したアグロバクテリ
ウム培養液（ｐＧＰＴＶ系プラスミドを持つＥＨＡ１０
１株、ＬＢＡ４４０４株）、１００μlと培養４日目の
タバコ培養細胞懸濁液４ｍｌをシャーレに入れてよく混
合し、２５℃で暗所で静置した。２日後シャーレのなか
の培養液を遠心管に移して遠心分離（１，０００ｒｐ
ｍ、５分間）により上澄みを除いた。次に２５０ｍｇ／
ｌのカルベニシリンを含む新しい培地を入れて遠心分離
し、細胞を洗浄した。この操作を３回繰り返し、アグロ
バクテリウムを除いた培養細胞を２０ｍｇ／ｌのハイグ
ロマイシン、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む改
変ＬＳ寒天培地にまき、２５℃暗所で培養した。約２〜
３週間後にカルス化した細胞を新しい改変ＬＳ寒天培地
上に移し、増殖しているクローンを選択した。さらに２
〜３週間後に直径１ｃｍ程度に成長したカルスをハイグ
ロマイシン、カルベニシリンを含む改変ＬＳ培地３０ｍ
ｌに移し、継代培養を行った。
【０１２２】７．プラスミドＤＮＡの少量調製 大腸菌やアグロバクテリウムからのプラスミドの少量調
製はＢｉｒｎｂｏｉｎとＤｏｌｙのアルカリ抽出法に従
った。抗生物質を含む２×ＹＴ培地で一晩培養（アグロ
バクテリウムは二晩）した菌体をエッペンドルフチュー
ブに移し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間、室
温）により集菌した。この菌体を１００μlのＳｏｌｕ
ｔｉｏｎ Ｉ（アグロバクテリウムの場合は５ｍｇ／ｌ
のｌｙｓｏｚｙｍｅを含む）に懸濁し、室温に5分間放
置した。次に、２００μlのＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩを
加え、よく混合し、氷中に５分間静置した。１５０μl
のＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩを加え、よく混合し、氷中
に５分間静置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５
分間、室温）後、上清を別のチューブに移し、ＲＮＡｓ
ｅ処理（３７℃、３０分間）を行った。フェノール−ク
ロロホルム抽出後エタノール沈殿を行い、適当量のＴＥ
ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
製はＢｉｒｎｂｏｉｎとＤｏｌｙのアルカリ抽出法に従
った。抗生物質を含む２×ＹＴ培地で一晩培養（アグロ
バクテリウムは二晩）した菌体をエッペンドルフチュー
ブに移し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間、室
温）により集菌した。この菌体を１００μlのＳｏｌｕ
ｔｉｏｎ Ｉ（アグロバクテリウムの場合は５ｍｇ／ｌ
のｌｙｓｏｚｙｍｅを含む）に懸濁し、室温に5分間放
置した。次に、２００μlのＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩを
加え、よく混合し、氷中に５分間静置した。１５０μl
のＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩを加え、よく混合し、氷中
に５分間静置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５
分間、室温）後、上清を別のチューブに移し、ＲＮＡｓ
ｅ処理（３７℃、３０分間）を行った。フェノール−ク
ロロホルム抽出後エタノール沈殿を行い、適当量のＴＥ
ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【０１２３】
【表５】 ８．ＤＮＡの電気泳動 ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒにより作成した１．０〜１．５％
（ｗ／ｖ）アガロースを使用した。試料に１/５量のＧ
ｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、ゲルのス
ロットに注入した。泳動装置はＭｕｐｉｄ−２（コスモ
バイオ）を用い、１×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ中、１００
Ｖの定電圧下で行った。泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロマイド水溶液に２０分間浸して染色
した後、トランスイルミネーター上で観察した。
（ｗ／ｖ）アガロースを使用した。試料に１/５量のＧ
ｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、ゲルのス
ロットに注入した。泳動装置はＭｕｐｉｄ−２（コスモ
バイオ）を用い、１×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ中、１００
Ｖの定電圧下で行った。泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロマイド水溶液に２０分間浸して染色
した後、トランスイルミネーター上で観察した。
【０１２４】９．泳動ゲルからのＤＮＡ断片の回収 Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ ．２（フナコ
シ）を用いて行った。目的断片を含むアガロースゲルを
エッペンドルフチューブに移し、１／２倍量のＴＢＥ
ｍｏｄｉｆｉｅｒ、４．５倍量のＮａＩを加え、５５℃
で完全にゲルを溶かした。これに５μlのＭａｔｒｉｘ
を加えてよく混合し、氷中で10分間放置した。軽く遠心
分離した後、上清を捨て、２００μlのＷａｓｈ ｂｕ
ｆｆｅｒで３度沈殿を洗浄した。この沈殿を６μlのＴ
Ｅ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５５℃で５分から１０分間
加熱溶出後遠心分離し、ＤＮＡ溶液である上清を得た。
シ）を用いて行った。目的断片を含むアガロースゲルを
エッペンドルフチューブに移し、１／２倍量のＴＢＥ
ｍｏｄｉｆｉｅｒ、４．５倍量のＮａＩを加え、５５℃
で完全にゲルを溶かした。これに５μlのＭａｔｒｉｘ
を加えてよく混合し、氷中で10分間放置した。軽く遠心
分離した後、上清を捨て、２００μlのＷａｓｈ ｂｕ
ｆｆｅｒで３度沈殿を洗浄した。この沈殿を６μlのＴ
Ｅ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５５℃で５分から１０分間
加熱溶出後遠心分離し、ＤＮＡ溶液である上清を得た。
【０１２５】１０．タバコからの染色体ＤＮＡの調製 （１０．１．タバコ培養細胞からの染色体ＤＮＡの調
製）ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）を用いて行っ
た。タバコ培養細胞約０．１ｇにＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ
を３００μｌ加えて撹拌し、さらにＳｏｌｕｔｉｏｎＩ
Ｉを１５０μｌ加えてボルテックスにより撹拌して完全
に混合した。５０℃で１５分間保温した後、Ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎ ＩＩＩを１５０μｌ加えて撹拌し、氷上に１５
分間放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分
間、４℃）後、上清をとりエタノール沈殿を２度行っ
た。沈殿を２０μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、１
μｌのＲＮＡｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理
した。（１０．２．タバコカルスからの染色体ＤＮＡの
調製）カルス体からの染色体ＤＮＡの調製はＤＮｅａｓ
ｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡ
ＧＥＮ）を用いて行った。直径約１ｃｍに成長したカル
スを液体窒素で凍結した後、乳鉢、乳棒を用いて粉末状
になるまで破砕した。この粉末（１００ｍｇ）をサンプ
ルとしてキットの説明書に従いＤＮＡを調製した。
製）ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）を用いて行っ
た。タバコ培養細胞約０．１ｇにＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ
を３００μｌ加えて撹拌し、さらにＳｏｌｕｔｉｏｎＩ
Ｉを１５０μｌ加えてボルテックスにより撹拌して完全
に混合した。５０℃で１５分間保温した後、Ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎ ＩＩＩを１５０μｌ加えて撹拌し、氷上に１５
分間放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分
間、４℃）後、上清をとりエタノール沈殿を２度行っ
た。沈殿を２０μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、１
μｌのＲＮＡｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理
した。（１０．２．タバコカルスからの染色体ＤＮＡの
調製）カルス体からの染色体ＤＮＡの調製はＤＮｅａｓ
ｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡ
ＧＥＮ）を用いて行った。直径約１ｃｍに成長したカル
スを液体窒素で凍結した後、乳鉢、乳棒を用いて粉末状
になるまで破砕した。この粉末（１００ｍｇ）をサンプ
ルとしてキットの説明書に従いＤＮＡを調製した。
【０１２６】１１．タバコ培養細胞カルスからの全ＲＮ
Ａの調製 カルス体からの全ＲＮＡの調製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎ
ｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行っ
た。操作にあたり、乳鉢、乳棒と滅菌水は０．０５％
ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ処理し
た後、オートクレーブ（１２０℃、３０分間）したもの
を使用した。直径約１ｃｍに成長したカルスを液体窒素
で凍結した後、乳鉢、乳棒を用いて粉末状になるまで破
砕し、この粉末（約１００ｍｇ）をサンプルとしてキッ
トの説明書に従いＲＮＡを調製した。
Ａの調製 カルス体からの全ＲＮＡの調製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎ
ｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行っ
た。操作にあたり、乳鉢、乳棒と滅菌水は０．０５％
ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ処理し
た後、オートクレーブ（１２０℃、３０分間）したもの
を使用した。直径約１ｃｍに成長したカルスを液体窒素
で凍結した後、乳鉢、乳棒を用いて粉末状になるまで破
砕し、この粉末（約１００ｍｇ）をサンプルとしてキッ
トの説明書に従いＲＮＡを調製した。
【０１２７】１２．ＰＣＲ （１２．１．反応系）染色体ＤＮＡ 1μｌ、１０×Ｐ
ＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造 ＴａｋａｒａＥｘ Ｔａ
ｑ付属）５μl、ｄＮＴＰｓ（宝酒造Ｔａｋａｒａ Ｅ
ｘ Ｔａｑ付属、２．５ｍＭ）４μｌ、ｐｒｉｍｅｒ
(各２０ｐｍｏｌ)、Ｔａｋａｒａ ＥｘＴａｑ（５Ｕ／
μｌ、宝酒造）０．５μｌ、滅菌水を５０μｌになるよ
うに加えた。 （１２．２．反応条件）反応は以下に示す条件下で行っ
た。サーマルサイクラーはＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７０
０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
ＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造 ＴａｋａｒａＥｘ Ｔａ
ｑ付属）５μl、ｄＮＴＰｓ（宝酒造Ｔａｋａｒａ Ｅ
ｘ Ｔａｑ付属、２．５ｍＭ）４μｌ、ｐｒｉｍｅｒ
(各２０ｐｍｏｌ)、Ｔａｋａｒａ ＥｘＴａｑ（５Ｕ／
μｌ、宝酒造）０．５μｌ、滅菌水を５０μｌになるよ
うに加えた。 （１２．２．反応条件）反応は以下に示す条件下で行っ
た。サーマルサイクラーはＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７０
０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【０１２８】
【表６】 １３．ＲＴ−ＰＣＲ （１３．１．逆転写反応）ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖ
ｅｒ．２．１（宝酒造）を用いて行った。Ｋｉｔに付属
しているＭｇＣｌ2（５ｍＭ）４μl、１０×ＲＮＡ Ｐ
ＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２μｌ、ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ
2Ｏ ８．５μｌ、ｄＮＴＰｓ（１ｍＭ）２μｌ、ＲＮＡ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１Ｕ／μｌ）０．５μｌ、
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（０．２
５Ｕ／μｌ）１μｌ、ＯｌｉｇｏｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ
Ｐｒｉｍｅｒ（０．１２５μＭ）１μｌ、と上記１１
に従い調製したＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ １μｌを混合
し、以下のプログラムで反応を行った。サーマルサイク
ラーはＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた：サイクル数１ ５０℃ ３
０分；９９℃ ５分；５℃ ５分。 （１３．２．逆転写反応後のＰＣＲ）ＭｇＣｌ2（２．
５ｍＭ）６μｌ、１０×ＲＮＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ
８μｌ、蒸留滅菌水６３．５μｌ、ＴａＫａＲａ Ｔ
ａｑ（２．５ Ｕ／１００μｌ）０．５μｌ、Ｐｒｉｍ
ｅｒ（２０ｐｍｏｌ）を混合し、上記１３．１の逆転写
反応を終了したチューブに添加した。マイクロ遠心機で
約１０秒遠心した後、以下に示す条件で反応を行った：
ＳｔａｇｅＩ サイクル数１ ９４℃２分；Ｓｔａｇｅ
ＩＩ サイクル数４５ ９４℃ ３０秒、６０℃ ３０
秒、７２℃ １．５分。
ｅｒ．２．１（宝酒造）を用いて行った。Ｋｉｔに付属
しているＭｇＣｌ2（５ｍＭ）４μl、１０×ＲＮＡ Ｐ
ＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２μｌ、ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ
2Ｏ ８．５μｌ、ｄＮＴＰｓ（１ｍＭ）２μｌ、ＲＮＡ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１Ｕ／μｌ）０．５μｌ、
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（０．２
５Ｕ／μｌ）１μｌ、ＯｌｉｇｏｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ
Ｐｒｉｍｅｒ（０．１２５μＭ）１μｌ、と上記１１
に従い調製したＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ １μｌを混合
し、以下のプログラムで反応を行った。サーマルサイク
ラーはＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた：サイクル数１ ５０℃ ３
０分；９９℃ ５分；５℃ ５分。 （１３．２．逆転写反応後のＰＣＲ）ＭｇＣｌ2（２．
５ｍＭ）６μｌ、１０×ＲＮＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ
８μｌ、蒸留滅菌水６３．５μｌ、ＴａＫａＲａ Ｔ
ａｑ（２．５ Ｕ／１００μｌ）０．５μｌ、Ｐｒｉｍ
ｅｒ（２０ｐｍｏｌ）を混合し、上記１３．１の逆転写
反応を終了したチューブに添加した。マイクロ遠心機で
約１０秒遠心した後、以下に示す条件で反応を行った：
ＳｔａｇｅＩ サイクル数１ ９４℃２分；Ｓｔａｇｅ
ＩＩ サイクル数４５ ９４℃ ３０秒、６０℃ ３０
秒、７２℃ １．５分。
【０１２９】１４．タバコ培養細胞からの粗タンパク質
抽出液の調製 植え継ぎ７日目のタバコ培養細胞を遠心分離（３，００
０ｒｐｍ、１５分間、４℃）にて収穫した後、得られた
タバコ培養細胞と同体積の５０ｍＭ リン酸ナトリウム
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）を加え、穏やかに転倒混和
し細胞を洗浄した。この作業を3回繰り返した後、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により収穫
した細胞をハンディーホモヂナイザー（２０ｍｌ ＩＫ
ＥＭＯＴＯ）に移し細胞を破砕した。その後、細胞破砕
液を５０ml遠心チューブに移し、遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ、２０分間、４℃）して粗タンパク質抽出液で
ある上清を得た。必要に応じて、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔ
（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ）を５０ｍ
ｌの抽出液当たり1錠加えた。さらに粗タンパク質の濃
縮が必要な際には７０％飽和となるように硫酸アンモニ
ウム（和光純薬）を加え、氷上で４から５時間静置した
後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）
して得られたタンパク質を５００μｌの滅菌水に懸濁し
て以後の解析に用いた。
抽出液の調製 植え継ぎ７日目のタバコ培養細胞を遠心分離（３，００
０ｒｐｍ、１５分間、４℃）にて収穫した後、得られた
タバコ培養細胞と同体積の５０ｍＭ リン酸ナトリウム
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）を加え、穏やかに転倒混和
し細胞を洗浄した。この作業を3回繰り返した後、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により収穫
した細胞をハンディーホモヂナイザー（２０ｍｌ ＩＫ
ＥＭＯＴＯ）に移し細胞を破砕した。その後、細胞破砕
液を５０ml遠心チューブに移し、遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ、２０分間、４℃）して粗タンパク質抽出液で
ある上清を得た。必要に応じて、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔ
（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ）を５０ｍ
ｌの抽出液当たり1錠加えた。さらに粗タンパク質の濃
縮が必要な際には７０％飽和となるように硫酸アンモニ
ウム（和光純薬）を加え、氷上で４から５時間静置した
後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）
して得られたタンパク質を５００μｌの滅菌水に懸濁し
て以後の解析に用いた。
【０１３０】１５．タンパク質の定量 ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）を用いて行った。このキットはＬｏｗｌｙ−Ｆ
ｏｌｉｎ法に基づいている。説明書の指示に従い反応液
を混合し、室温で１５分間放置した。その後、７５０ｎ
ｍ吸光度を測定した。仔牛血清アルブミンを標準として
０．０５〜０．４ｍｇ／ｍｌの範囲で検量線を引いてタ
ンパク質量を求めた。
Ｒａｄ）を用いて行った。このキットはＬｏｗｌｙ−Ｆ
ｏｌｉｎ法に基づいている。説明書の指示に従い反応液
を混合し、室温で１５分間放置した。その後、７５０ｎ
ｍ吸光度を測定した。仔牛血清アルブミンを標準として
０．０５〜０．４ｍｇ／ｍｌの範囲で検量線を引いてタ
ンパク質量を求めた。
【０１３１】１６．タンパク質の電気泳動 （１６．１．トリス-グリシンドデシル硫酸ナトリウム-
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）Ｌａｅｍｍｌｉの方
法に従い、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動用
ゲルとしては分離ゲルに１２．５％、濃縮用ゲルに２．
５％のポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス
アクリルアミド＝３０：０．８）、泳動用緩衝液として
はトリス-グリシン緩衝液を用いた。試料１２μｌは試
料用緩衝液中で１００℃で３分間加熱して変性させ、１
００Ｖの定電圧で泳動を行った。（１６．２．分子量マ
ーカー）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）Ｌａｅｍｍｌｉの方
法に従い、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動用
ゲルとしては分離ゲルに１２．５％、濃縮用ゲルに２．
５％のポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス
アクリルアミド＝３０：０．８）、泳動用緩衝液として
はトリス-グリシン緩衝液を用いた。試料１２μｌは試
料用緩衝液中で１００℃で３分間加熱して変性させ、１
００Ｖの定電圧で泳動を行った。（１６．２．分子量マ
ーカー）
【０１３２】
【表７】 （１６．３タンパク質の染色）クマシーブルー染色と銀
染色を行った。クマシーブルー染色は染色液（０．１％
クマシーブリリアントブルーＲ−２５０、メタノール：
酢酸：水＝５：５：２（ｖ／ｖ）混液）中にゲルを３０
分間浸して染色後、脱染色液（メタノール：酢酸：水＝
２：１：７（ｖ／ｖ）混液）中で一晩振とうして脱染色
を行った。銀染色は和光純薬製の銀染色キットを使い、
方法はキットの説明書に従った。
染色を行った。クマシーブルー染色は染色液（０．１％
クマシーブリリアントブルーＲ−２５０、メタノール：
酢酸：水＝５：５：２（ｖ／ｖ）混液）中にゲルを３０
分間浸して染色後、脱染色液（メタノール：酢酸：水＝
２：１：７（ｖ／ｖ）混液）中で一晩振とうして脱染色
を行った。銀染色は和光純薬製の銀染色キットを使い、
方法はキットの説明書に従った。
【０１３３】１７．レクチン染色 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをｂｌｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆ
ｆｅｒ中で１５分間平衡化させた後、セミドライタイプ
ブロッティング装置（セミドライトランスファー装置Ｂ
Ｅ−３１０バイオクラフト）を用いて、１ｍＡ／ｃｍ2
の定電流で６０分〜７０分間タンパク質を、ＰＶＤＦメ
ンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ
ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｂｌｏｔｔｉｎｇ， ０．２ mｍ）にブロッティン
グした。ブロッティング後、ＰＶＤＦメンブレンを０．
６％Ｈ2Ｏ2/メタノール（v/v）溶液中に浸し、タバコ培
養細胞内在性のペルオキシダーゼのブロッキングを行っ
た。ブロッキング後、ＰＶＤＦメンブレンをｗａｓｈｉ
ｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄（１０分間、３回）した。次
に５％ Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋを含むｗａｓｈｉｎｇ ｂ
ｕｆｆｅｒ中にメンブレンを浸し室温で２時間穏やかに
反応させた後、同様にｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで
ＰＶＤＦメンブレンを洗浄した。その後、ペルオキシダ
ーゼ標識ＰＳＡレクチン（１ｍｇ／ｍｌ， ＥＹ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．）をｗａｓｈｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒで１０００倍希釈したものにＰＶＤＦメン
ブレンを浸し、室温で９０分間反応させた。反応後、上
記と同様にメンブレンを洗浄した後ＰＯＤイムノステイ
ンセット（和光純薬）を用い、発色反応を行った。Ｗａ
ｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒの組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０。
ｆｅｒ中で１５分間平衡化させた後、セミドライタイプ
ブロッティング装置（セミドライトランスファー装置Ｂ
Ｅ−３１０バイオクラフト）を用いて、１ｍＡ／ｃｍ2
の定電流で６０分〜７０分間タンパク質を、ＰＶＤＦメ
ンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ
ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｂｌｏｔｔｉｎｇ， ０．２ mｍ）にブロッティン
グした。ブロッティング後、ＰＶＤＦメンブレンを０．
６％Ｈ2Ｏ2/メタノール（v/v）溶液中に浸し、タバコ培
養細胞内在性のペルオキシダーゼのブロッキングを行っ
た。ブロッキング後、ＰＶＤＦメンブレンをｗａｓｈｉ
ｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄（１０分間、３回）した。次
に５％ Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋを含むｗａｓｈｉｎｇ ｂ
ｕｆｆｅｒ中にメンブレンを浸し室温で２時間穏やかに
反応させた後、同様にｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで
ＰＶＤＦメンブレンを洗浄した。その後、ペルオキシダ
ーゼ標識ＰＳＡレクチン（１ｍｇ／ｍｌ， ＥＹ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．）をｗａｓｈｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒで１０００倍希釈したものにＰＶＤＦメン
ブレンを浸し、室温で９０分間反応させた。反応後、上
記と同様にメンブレンを洗浄した後ＰＯＤイムノステイ
ンセット（和光純薬）を用い、発色反応を行った。Ｗａ
ｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒの組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０。
【０１３４】１８．α１，６−フコシルトランスフェラ
ーゼ活性測定 （１８．１．粗酵素液の調製）培養７日目の形質転換体
タバコ培養細胞を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２０分
間、４℃）によって収穫した後、上記１４と同様に抽出
ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を洗浄、再収穫した。その
後、ハンディーホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、
遠心分離（１２，０００ ｒｐｍ、２０分間、４℃）し
て得られた上清を粗酵素液とした。抽出ｂｕｆｆｅｒの
組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．１７５％ ＣＨＡＰＳ。 （１８．２．α１，６−フコシルトランスフェラーゼの
酵素反応）α１，６−活性測定に際し、操作は全て暗所
下で行った。東洋紡（株）より贈与されたα１，６−フ
コシルトランスフェラーゼ活性測定用基質液（１５μ
l）の入ったチューブに上記１９．１で調製した粗酵素
液５μlを混合し、３７℃、３時間の酵素反応を行っ
た。１分間の煮沸により酵素反応を停止させた後、チュ
ーブを直ちに氷中に移し１分間放置した。さらにスピン
ダウンによって滴を落とした後、蒸留水８０μｌを加え
遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１分間、４℃）した。
得られた上清のうち３０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。
用いたα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性測定
用基質液１５μｌあたりの内訳は、０．５ＭＭＥＳ／Ｎ
ａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５ ８μｌ、１ｎｍｏ
ｌｅ／μｌＧｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＮＢＤ １μ
ｌ、５ｎｍｏｌｅ／ｍｌ ＧＤＰ−Ｆｕｃｏｓｅ (和
光純薬)２μl、ＭｉｌｌｉＱ水４μlである。用いたＨ
ＰＬＣシステム（日立社製）は、インターフェイス（L-
7000）、蛍光検出器（ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−７４８
０）、ポンプ（ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−７１００）、カラ
ムオーブン（ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−７３００）から成
る。 （１８．３．酵素活性の有無）ＨＰＬＣ分析により行っ
た。カラムは逆相系のＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８
ＧＰ１５０−４．６(５μｍ)（関東化学４．６×１５
０ｍｍ）を使用した。α１，６−ＦＴ活性測定に用いた
基質糖鎖は蛍光標識されており、蛍光検出器（Ｅｘ；４
７０ｎｍ、Ｅｍ；５３０ｎｍ）によって特異的に検出す
ることが可能である。また、α１，６−フコシル化糖鎖
標準品にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性
測定用基質混合物にα１，６−フコシルトランスフェラ
ーゼ（４０ｍＵ／ｍｌ、東洋紡）５μｌを加え、上記の
１．１８に従って３７℃、１５分間反応させたものを使
用した。 （１８．４．活性測定）以下の条件でのＨＰＬＣ分析に
より得られる基質と反応物のピークの面積比を取り、粗
酵素液タンパク質１ｍｇ当たり１分間に転移するフコー
ス量として活性値を求めた。粗酵素液中の総タンパク質
の定量は上記の１５に従って行った。
ーゼ活性測定 （１８．１．粗酵素液の調製）培養７日目の形質転換体
タバコ培養細胞を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２０分
間、４℃）によって収穫した後、上記１４と同様に抽出
ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を洗浄、再収穫した。その
後、ハンディーホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、
遠心分離（１２，０００ ｒｐｍ、２０分間、４℃）し
て得られた上清を粗酵素液とした。抽出ｂｕｆｆｅｒの
組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．１７５％ ＣＨＡＰＳ。 （１８．２．α１，６−フコシルトランスフェラーゼの
酵素反応）α１，６−活性測定に際し、操作は全て暗所
下で行った。東洋紡（株）より贈与されたα１，６−フ
コシルトランスフェラーゼ活性測定用基質液（１５μ
l）の入ったチューブに上記１９．１で調製した粗酵素
液５μlを混合し、３７℃、３時間の酵素反応を行っ
た。１分間の煮沸により酵素反応を停止させた後、チュ
ーブを直ちに氷中に移し１分間放置した。さらにスピン
ダウンによって滴を落とした後、蒸留水８０μｌを加え
遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１分間、４℃）した。
得られた上清のうち３０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。
用いたα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性測定
用基質液１５μｌあたりの内訳は、０．５ＭＭＥＳ／Ｎ
ａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５ ８μｌ、１ｎｍｏ
ｌｅ／μｌＧｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＮＢＤ １μ
ｌ、５ｎｍｏｌｅ／ｍｌ ＧＤＰ−Ｆｕｃｏｓｅ (和
光純薬)２μl、ＭｉｌｌｉＱ水４μlである。用いたＨ
ＰＬＣシステム（日立社製）は、インターフェイス（L-
7000）、蛍光検出器（ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−７４８
０）、ポンプ（ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−７１００）、カラ
ムオーブン（ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−７３００）から成
る。 （１８．３．酵素活性の有無）ＨＰＬＣ分析により行っ
た。カラムは逆相系のＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８
ＧＰ１５０−４．６(５μｍ)（関東化学４．６×１５
０ｍｍ）を使用した。α１，６−ＦＴ活性測定に用いた
基質糖鎖は蛍光標識されており、蛍光検出器（Ｅｘ；４
７０ｎｍ、Ｅｍ；５３０ｎｍ）によって特異的に検出す
ることが可能である。また、α１，６−フコシル化糖鎖
標準品にはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性
測定用基質混合物にα１，６−フコシルトランスフェラ
ーゼ（４０ｍＵ／ｍｌ、東洋紡）５μｌを加え、上記の
１．１８に従って３７℃、１５分間反応させたものを使
用した。 （１８．４．活性測定）以下の条件でのＨＰＬＣ分析に
より得られる基質と反応物のピークの面積比を取り、粗
酵素液タンパク質１ｍｇ当たり１分間に転移するフコー
ス量として活性値を求めた。粗酵素液中の総タンパク質
の定量は上記の１５に従って行った。
【０１３５】
【表８】
【０１３６】
【発明の効果】動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞、該
植物細胞から再生された植物体、該植物細胞を生産する
方法、該植物細胞を用いて動物型糖タンパク質を生産す
る方法が提供される。本発明の植物細胞により産生され
る糖タンパク質は、動物型の糖鎖を有するので、動物特
にヒトに対して抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む
動物への投与に適している。
植物細胞から再生された植物体、該植物細胞を生産する
方法、該植物細胞を用いて動物型糖タンパク質を生産す
る方法が提供される。本発明の植物細胞により産生され
る糖タンパク質は、動物型の糖鎖を有するので、動物特
にヒトに対して抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む
動物への投与に適している。
【０１３７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kazuhito FUJIYAMA <120> Plant cell haivng an animal type sugar chain adding mechanism <130> J1-00356672 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1759 <212> DNA <213> human <220> <221> CDS <222> (17)..(1744) <400> aaaatctctc tagaaa atg cgg cca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg 52 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met 1 5 10 ctc att ctt ttt gcc tgg ggg acc ttg ctg ttt tat ata ggt ggt cac 100 Leu Ile Leu Phe Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His 15 20 25 ttg gta cga gat aat gac cat cct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc 148 Leu Val Arg Asp Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser 30 35 40 aag att ctg gca aag ctt gaa cgc tta aaa cag cag aat gaa gac ttg 196 Lys Ile Leu Ala Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu 45 50 55 60 agg cga atg gcc gaa tct ctc cgg ata cca gaa ggc cct att gat cag 244 Arg Arg Met Ala Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln 65 70 75 ggg cca gct ata gga aga gta cgc gtt tta gaa gag cag ctt gtt aag 292 Gly Pro Ala Ile Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys 80 85 90 gcc aaa gaa cag att gaa aat tac aag aaa cag acc aga aat ggt ctg 340 Ala Lys Glu Gln Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu 95 100 105 ggg aag gat cat gaa atc ctg agg agg agg att gaa aat gga gct aaa 388 Gly Lys Asp His Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys 110 115 120 gag ctc tgg ttt ttc cta cag agt gaa ttg aag aaa tta aag aac tta 436 Glu Leu Trp Phe Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu 125 130 135 140 gaa gga aat gaa ctc caa aga cat gca gat gaa ttt ctt ttg gat tta 484 Glu Gly Asn Glu Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu 145 150 155 gga cat cat gaa agg tct ata atg acg gat cta tac tac ctc agt cag 532 Gly His His Glu Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln 160 165 170 aca gat gga gca ggt gat tgg cgg gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca 580 Thr Asp Gly Ala Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr 175 180 185 gaa ctg gtt cag cgg aga ata aca tat ctt cag aat ccc aag gac tgc 628 Glu Leu Val Gln Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys 190 195 200 agc aaa gcc aaa aag ctg gtg tgt aat atc aac aaa ggc tgt ggc tat 676 Ser Lys Ala Lys Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr 205 210 215 220 ggc tgt cag ctc cat cat gtg gtc tac tgc ttc atg att gca tat ggc 724 Gly Cys Gln Leu His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly 225 230 235 acc cag cga aca ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act 772 Thr Gln Arg Thr Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr 240 245 250 ggt gga tgg gag act gta ttt agg cct gta agt gag aca tgc aca gac 820 Gly Gly Trp Glu Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp 255 260 265 aga tct ggc atc tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gtg aag gac aaa 868 Arg Ser Gly Ile Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys 270 275 280 aat gtt caa gtg gtc gag ctt ccc att gta gac agt ctt cat ccc cgt 916 Asn Val Gln Val Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg 285 290 295 300 cct cca tat tta ccc ttg gct gta cca gaa gac ctc gca gat cga ctt 964 Pro Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu 305 310 315 gta cga gtg cat ggt gac cct gca gtg tgg tgg gtg tct cag ttt gtc 1012 Val Arg Val His Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val 320 325 330 aaa tac ttg atc cgc cca cag cct tgg cta gaa aaa gaa ata gaa gaa 1060 Lys Tyr Leu Ile Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu 335 340 345 gcc acc aag aag ctt ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtc 1108 Ala Thr Lys Lys Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val 350 355 360 aga cgc aca gac aaa gtg gga aca gaa gct gcc ttc cat ccc att gaa 1156 Arg Arg Thr Asp Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu 365 370 375 380 gag tac atg gtg cat gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctt gca cgc aga 1204 Glu Tyr Met Val His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg 385 390 395 atg caa gtg gac aaa aaa aga gtg tat ttg gcc aca gat gac cct tct 1252 Met Gln Val Asp Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser 400 405 410 tta tta aag gag gca aaa aca aag tac ccc aat tat gaa ttt att agt 1300 Leu Leu Lys Glu Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser 415 420 425 gat aac tct att tcc tgg tca gct gga ctg cac aat cga tac aca gaa 1348 Asp Asn Ser Ile Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu 430 435 440 aat tca ctt cgt gga gtg atc ctg gat ata cat ttt ctc tct cag gca 1396 Asn Ser Leu Arg Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala 445 450 455 460 gac ttc cta gtg tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cga gtt gct tat 1444 Asp Phe Leu Val Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr 465 470 475 gaa att atg caa aca cta cat cct gat gcc tct gca aac ttc cat tct 1492 Glu Ile Met Gln Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser 480 485 490 tta gat gac atc tac tat ttt ggg ggc cag aat gcc cac aat caa att 1540 Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile 495 500 505 gcc att tat gct cac caa ccc cga act gca gat gaa att ccc atg gaa 1588 Ala Ile Tyr Ala His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu 510 515 520 cct gga gat atc att ggt gtg gct gga aat cat tgg gat ggc tat tct 1636 Pro Gly Asp Ile Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser 525 530 535 540 aaa ggt gtc aac agg aaa ttg gga agg acg ggc cta tat ccc tcc tac 1684 Lys Gly Val Asn Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr 545 550 555 aaa gtt cga gag aag ata gaa acg gtc aag tac ccc aca tat cct gag 1732 Lys Val Arg Glu Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu 560 565 570 gct gag aaa taa agtcgactca gatgg 1759 Ala Glu Lys 575 <210> 2 <211> 575 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ile 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ile 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Ala 500 505 510 His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 tggttcctgg cgttggatta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 ggatatgtgg ggtacttgac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 cgtcttcaaa gcaagtggat 20
【図１】本発明の植物細胞の作成に用いたベクターｐＢ
Ｉ２２１−ＦＴの構築を示す図である。ｐＢＩ２２１−
ＦＴベクター中の唯一のＳａｃＩ部位をＳａｌＩ部位に
変換し、α１，６−ＦＴ遺伝子を挿入した。
Ｉ２２１−ＦＴの構築を示す図である。ｐＢＩ２２１−
ＦＴベクター中の唯一のＳａｃＩ部位をＳａｌＩ部位に
変換し、α１，６−ＦＴ遺伝子を挿入した。
【図２】本発明の植物細胞の作成に用いたベクターｐＧ
ＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴの構築を示す図である。
ＰＴＶ−ＨＰＴ−ＦＴの構築を示す図である。
【図３】形質転換体ＢＹ２−ＦＴ２〜１３から調製し、
ＰＣＲにより増幅したゲノムＤＮＡを電気泳動した後発
色したゲルの写真である。
ＰＣＲにより増幅したゲノムＤＮＡを電気泳動した後発
色したゲルの写真である。
【図４】形質転換体ＢＹ２−ＦＴ２、３、４および６か
ら調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡを増幅したＤＮＡ
を電気泳動した後発色したゲルの写真である。
ら調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡを増幅したＤＮＡ
を電気泳動した後発色したゲルの写真である。
【図５】ＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図６】ＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図７】ＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図８】本発明の植物細胞において生産された糖タンパ
ク質のレクチンを用いた分析結果を示す、ゲル電気泳動
ゲルからブロットした後発色させたＰＶＤＦメンブレン
の写真である。
ク質のレクチンを用いた分析結果を示す、ゲル電気泳動
ゲルからブロットした後発色させたＰＶＤＦメンブレン
の写真である。
【図９】植物と動物の複合型糖鎖構造を示す図である。
複合型糖鎖構造のコア部分において、植物型糖鎖にはキ
シロース残基が存在するのに対し、動物型糖鎖にはキシ
ロース残基は存在しない。また、最内部のＮアセチルグ
ルコサミンに結合したフコース残基は、動物型ではα
１，６−結合で結合しているのに対し、植物型ではα
１，３−結合で結合している。
複合型糖鎖構造のコア部分において、植物型糖鎖にはキ
シロース残基が存在するのに対し、動物型糖鎖にはキシ
ロース残基は存在しない。また、最内部のＮアセチルグ
ルコサミンに結合したフコース残基は、動物型ではα
１，６−結合で結合しているのに対し、植物型ではα
１，３−結合で結合している。
【図１０】α１，６−ＦＴの活性測定に使用した基質糖
鎖の構造、および活性測定系の概略を示す図である。
鎖の構造、および活性測定系の概略を示す図である。
【図１１】形質転換体ＢＹ２−ＦＴ３培養細胞で産生さ
れた糖タンパク質のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムであ
る。
れた糖タンパク質のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムであ
る。
【図１２】形質転換体ＢＹ２−ＦＴ３培養細胞で産生さ
れた糖タンパク質の糖鎖構造（高マンノース型糖鎖）の
解析結果を示す図である。
れた糖タンパク質の糖鎖構造（高マンノース型糖鎖）の
解析結果を示す図である。
【図１３】形質転換体ＢＹ２−ＦＴ３培養細胞で産生さ
れた糖タンパク質の糖鎖構造（複合型糖鎖）の解析結果
を示す図である。
れた糖タンパク質の糖鎖構造（複合型糖鎖）の解析結果
を示す図である。
【図１４】形質転換体ＢＹ２−ＦＴ３培養細胞で産生さ
れた糖タンパク質の糖鎖構造（α１，６−フコースの結
合した糖鎖）の解析結果を示す図である。
れた糖タンパク質の糖鎖構造（α１，６−フコースの結
合した糖鎖）の解析結果を示す図である。
【図１５】形質転換体植物体ＦＴ（１）、ＦＴ（２）、
ＦＴ１、ＦＴ２、およびＦＧ３から調製し、ＰＣＲによ
り増幅したゲノムＤＮＡを電気泳動した後発色したゲル
の写真である。
ＦＴ１、ＦＴ２、およびＦＧ３から調製し、ＰＣＲによ
り増幅したゲノムＤＮＡを電気泳動した後発色したゲル
の写真である。
【図１６】本発明の形質転換植物体において生産された
糖タンパク質のレクチンを用いた分析結果を示す、ゲル
電気泳動ゲルからブロットした後発色させたＰＶＤＦメ
ンブレンの写真である。
糖タンパク質のレクチンを用いた分析結果を示す、ゲル
電気泳動ゲルからブロットした後発色させたＰＶＤＦメ
ンブレンの写真である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 関 達治 大阪府豊中市新千里西町２−１ １−1015 号 (72)発明者 藤山 和仁 大阪府吹田市山田西１−28 Ａ18−308
Claims (7)
- 【請求項１】 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞であ
って、 糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端アセチルグルコ
サミン残基にフコース残基を転移し得る、動物由来の酵
素をコードする遺伝子が導入された、植物細胞。 - 【請求項２】 前記動物由来の酵素が、α１，６−フコ
シルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の植物
細胞。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の植物細胞から
再生された植物体。 - 【請求項４】 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞の生
産方法であって、 植物細胞に、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端ア
セチルグルコサミン残基へのフコース残基の転移反応を
行い得る、動物由来の酵素をコードする遺伝子を導入す
る工程を包含する、方法。 - 【請求項５】 動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方
法であって、 植物細胞に、糖タンパク質に含まれる糖鎖の還元末端ア
セチルグルコサミン残基にフコース残基を転移し得る、
動物由来の酵素をコードする遺伝子および異種糖タンパ
ク質をコードする遺伝子を導入して形質転換植物細胞を
得る工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する
工程、を包含する、方法。 - 【請求項６】 動物型糖鎖を持つ糖タンパク質の生産方
法であって、 還元末端アセチルグルコサミン残基にフコース残基を転
移し得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子
を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
該酵素を細胞内小器官で発現させる工程、を包含する、
方法。 - 【請求項７】 請求項６に記載の方法によって得られた
動物型糖鎖をもつ糖タンパク質。
Priority Applications (16)
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|---|---|---|---|
| JP2001062704A JP5623683B2 (ja) | 2000-03-22 | 2001-03-06 | 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞 |
| IL15773602A IL157736A0 (en) | 2001-03-06 | 2002-03-06 | Plant cell having animal-type sugar chain adding function |
| EP08020953A EP2078455A1 (en) | 2001-03-06 | 2002-03-06 | Plant cell having animal-type sugar chain adding function |
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