JP5480060B2 - 植物におけるgntiii発現 - Google Patents
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Description
本発明は、植物における哺乳類N-アセチルグルコサミニル-転移酵素III(GnTIII)の酵素の発現、並びにバイセクト型(bisected)オリゴ糖及び増加した量の末端GlcNAc残基を伴う糖蛋白質の生成におけるその使用に関する。本発明は更に、GnTIIIの触媒部位並びにゴルジ装置及び/又は小胞体(ER)蛋白質の膜貫通ドメイン又はER残留シグナルを含む修飾されたGNTIIIを含むハイブリッド蛋白質、並びに免疫原性キシロース及びフコース残基を欠いているオリゴ糖を伴う糖蛋白質の生成におけるその使用に関する。
N-アセチルグルコサミニル転移酵素(GlcNAc-転移酵素)は、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基が、典型的N-連結されたグリカンのトリマンノシルコア構造のマンノースのひとつに付加された「分岐された」酵素である。ほとんど又は全く配列相同性がない少なくとも6種のGlcNAc-転移酵素が知られている。これらのGlcNAc転移酵素は、異なる蛋白質構造に加え、異なる酵素特性及び基質特異性も有する。全て、細胞質ドメイン、膜貫通アンカー、及び触媒ドメインを伴う細胞外ステム領域を伴う典型的II型膜貫通蛋白質である。
従って、ヒト適合性の非-免疫原性のバイセクトされたオリゴ糖を伴う糖蛋白質を植物において生成する手段を提供する必要がある。
本発明の具体的態様において、植物宿主システムは更に、バイセクト型オリゴ糖、特にガラクトース残基を含む、異種糖蛋白質又はそれらの機能性断片を含む。GnTIIIは、該異種糖蛋白質上にバイセクト型N-GlcNAc残基を挿入する。
ひとつの態様において、本発明は、所望の糖蛋白質又はそれらの機能性断片を作成するための、本発明により企図された植物宿主システムの使用を企図する。別の態様において、本発明は、該糖蛋白質又はそれらの機能性断片が、バイセクト型オリゴ糖を含むことを企図する。更に別の態様において、本発明は、本発明により企図された方法により得られた植物-由来の糖蛋白質又はそれらの機能性断片を企図する。更に別の態様において、本発明は、医薬組成物製造に関して本発明により企図された、糖蛋白質又はそれらの機能性断片を企図する。更に別の態様において、本発明は、本発明により企図されたような糖蛋白質又はそれらの機能性断片を含有する組成物を企図する。
ひとつの態様において、本発明は、a)i)植物細胞、及びii)GNTIII酵素をコードしている核酸を含む発現ベクターを提供すること;並びに、b)該発現ベクターを、該植物細胞へ、該酵素が発現されるような条件下で導入することを含む、方法を企図する。別の態様において、本発明は、GNTIIIをコードしている該核酸は、配列番号:1の核酸配列を含む方法を企図する。
ひとつの態様において、本発明は、第一及び第二の発現ベクターを含む植物を企図し、該第一のベクターは、GNTIII酵素をコードしている核酸を含み、該第二のベクターは、異種蛋白質をコードしている核酸を含む。別の態様において、本発明は、該異種蛋白質は、抗体又は抗体断片であるものを企図する。
用語「蛋白質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸を含む化合物を意味し、互換的に使用される。遺伝子によりコードされた「蛋白質」又は「ポリペプチド」は、コードされたアミノ酸配列に限定されないが、蛋白質の翻訳後修飾を含む。
用語「糖蛋白質」は、セリン又はトレオニンのOH基を介して(Oグリコシル化)か、又はアスパラギンのアミドNH2を介して(Nグリコシル化)結合したかのいずれかの、糖部分に共有結合された蛋白質を意味する。「糖蛋白質」は、例えば、ほとんどの分泌蛋白質(血清アルブミンは主な例外である)及び形質膜の外面に曝された蛋白質を含むが、これらに限定されるものではない。認められる糖残基は、マンノース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース及びシアル酸を含むが、これらに限定されるものではない。
用語「部分」は、蛋白質に関する場合(「所定の蛋白質の部分」など)、その蛋白質の断片を意味する。これらの断片は、4個のアミノ酸残基から全アミノ配列から1個のアミノ酸を取り除いたものまでの範囲であることができる。
用語「融合」は、ポリペプチドに関して使用される場合、外因性蛋白質断片(融合パートナー)に結合した関心のある蛋白質を含むキメラ蛋白質を意味する。融合パートナーは、関心のあるポリペプチドの溶解度を増強すること、更には組換え融合ポリペプチドを宿主細胞から又は上清から又は両方から精製することができるよう「アフィニティタグ」を提供することを含む、様々な機能を利用することができる。望ましいならば、融合パートナーは、精製後に関心のある蛋白質から除去することができる。
ポリペプチドに適用される用語「実質的に同一」は、ふたつのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムGAP又はBESTFITなどにより、任意に並置された場合に、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性又はそれよりも多い(例えば、99%の配列同一性)を共有する。同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが好ましい。
用語「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「核酸」は、2個又はそれよりも多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは3個よりも多い、通常は10個よりも多いもので構成された分子を意味する。正確なサイズは、多くの要因により左右され、オリゴヌクレオチドの最終的機能又は用途によっても左右されるであろう。オリゴヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、逆転写、又はそれらの組合せを含むいずれかの方法で作成することができる。
本明細書において使用される核酸配列の「相補体」は、その核酸が核酸配列の核酸と全体の相補性を示しているヌクレオチド配列を意味する。例えば、本発明は、配列番号:1の相補体を企図している。
一本-鎖核酸配列に関して使用される場合、用語「実質的に相同」は、後述のような低ストリンジェンシー条件下で、一本-鎖核酸配列にハイブリダイズすることができるいずれかのプローブを意味する。
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合「低ストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブが使用される場合には、5X SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4(H2O及び1.85g/l EDTA, NaOHでpH7.4に調節)、0.1%SDS、5X Denhardt試薬[50X Denhardtは500ml中に以下を含む:5g Ficoll (タイプ400、Pharmacia社)、5g BSA(フラクションV;Sigma社)]及び100μg/ml変性したサケ精子DNAからなる溶液中で、42℃で結合又はハイブリダイズし、その後5X SSPE、0.1%SDSを含有する溶液中で42℃で洗浄するものと同等の条件を含む。
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合「高ストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブが使用される場合には、5X SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4(H2O及び1.85g/l EDTA, NaOHでpH7.4に調節)、0.5%SDS、5X Denhardt試薬及び100μg/ml変性したサケ精子DNAからなる溶液中で、42℃で結合又はハイブリダイズし、その後0.1X SSPE、1.0%SDSを含有する溶液中で42℃で洗浄するものと同等の条件を含む。
従って、用語「変種」及び「変異体」は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、他のもの、通常は関連したヌクレオチド酸(nucleotide acid)配列と、1個又は複数のヌクレオチドが異なる核酸配列を意味する。「変動」は、ふたつの異なるヌクレオチド配列間の差異であり;典型的には、ひとつの配列は参照配列である。
「スプライシング変異」は、正しいRNAスプライシングに影響することに、遺伝子発現に影響する何らかの変異を意味する。スプライシング変異は、スプライシング部位を変更するイントロン-エキソン境界の変異に起因することがある。
用語「試料鋳型」は、「標的」(以下に定義)の存在について分析される試料を起源とする核酸を意味する。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、試料中に存在してもしなくてもよい、試料鋳型以外の核酸を意味するように使用される。バックグラウンド鋳型は、ほとんどの場合(inadvertent)である。これは、キャリーオーバーの結果であるか、又は試料から精製除去されたと考えられる核酸夾雑物の存在に起因することがある。例えば、検出されるべきもの以外の生物由来の核酸は、被験試料中のバックグラウンドとして存在することがある。
用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素以外の、増幅に必要な試薬(デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液など)を意味する。典型的には、増幅試薬は、他の反応成分と共に、反応容器(試験官、マイクロウェルなど)に配置及び含まれる。
用語「遺伝子発現」は、遺伝子の「転写」による(すなわち、RNAポリメラーゼの酵素作用を介した)、遺伝子にコードされた遺伝子情報のRNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA、又はsnRNA)への転換、並びにmRNAの「翻訳」による、蛋白質への転換のプロセスを意味する。遺伝子発現は、そのプロセスの多くの段階で調節することができる。「アップレギュレーション」又は「活性化」は、遺伝子発現産物(すなわち、RNA又は蛋白質)の生成を増加する調節を意味するのに対し、「ダウンレギュレーション」又は「抑制」は、生成を減少する調節を意味する。アップ-レギュレーション又はダウン-レギュレーションに関与した分子(例えば、転写因子)は、各々、「アクチベーター」及び「リプレッサー」と称される。
用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現の一部の局面を制御する遺伝エレメントを意味する。例えば、プロモーターは、連結されたコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。別の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、停止シグナルなどである。
用語「アグロバクテリウム(Agrobacterium)」は、クラウンゴールを形成する、土壌性のグラム陰性桿状植物病原菌を意味する。用語「アグロバクテリウム」は、菌株アグロバクテリウム・ツメファシエンス(これは典型的には感染植物においてクラウンゴールを形成する)、及びアグロバクテリウム・リゾゲン(これは感染した宿主植物において毛状根疾患を生じる)を含むが、これらに限定されるものではない。植物細胞のアグロバクテリウムによる感染は、一般に、感染した細胞によるオパイン生成(例えば、ノパリン、アグロパイン、オクトパインなど)を生じる。従って、ノパリン生成を引き起こすアグロバクテリウム株(例えば、菌株LBA4301、C58、A208)は、「ノパリン-型」アグロバクテリアと称され;オクトパイン生成を引き起こすアグロバクテリウム株(例えば、菌株LBA4404、Ach5、B6)は、「オクトパイン-型」アグロバクテリアと称され;並びに、アグロパイン生成を引き起こすアグロバクテリウム株(例えば、菌株EHA105、EHA101、A281)は、「アグロパイン-型」アグロバクテリアと称される。
用語「プロモーター領域」は、DNAポリマーのコード領域の直ぐ上流の領域を意味し、及び典型的には長さが約500bp〜4kbの間であり、好ましくは長さが約1〜1.5kbである。
用語「調節エレメント」は、核酸配列(複数)の発現の一部の局面を制御する遺伝的エレメントを意味する。例えばプロモーターは、機能的に連結されたコード領域の転写開始を促進する調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。
発現ベクターに関する「スプライシングシグナル」は、真核宿主細胞における組換え転写産物のより高いレベルの発現を生じることが多い。スプライシングシグナルは、転写一次産物RNAからのイントロンの除去を媒介し、スプライシングドナー及びアクセプター部位からなる(Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring HarborLaboratory Press社、ニューヨーク[1989]、16.7-16.8頁)。通常使用されるスプライシングドナー及びアクセプター部位は、SV40の16S RNA由来のスプライシング接合部である。
用語「安定したトランスフェクション」又は「安定してトランスフェクションされた」とは、外来DNAの、トランスフェクションされた細胞のゲノムへの導入及び組込みを意味する。用語「安定したトランスフェクタント」は、ゲノムDNA中に安定して組込まれた外来DNAを有する細胞を意味する。
用語「マイクロ損傷」は、植物組織に関して使用される場合は、その組織に微視的損傷を導入することを意味する。マイクロ損傷は、例えば、ここで説明された粒子衝撃により実現される。
用語「外来遺伝子」は、実験操作により、細胞のゲノムに導入されるいずれかの核酸(例えば、遺伝子配列)を意味し、これは導入された遺伝子が天然の遺伝子に関して何らかの修飾(例えば、点変異、選択マーカー遺伝子の存在、又は他の同様の修飾)を含む限りは、その細胞に認められる遺伝子配列を含んでもよい。
用語「試料」は、最も広範な意味で使用される。ひとつの意味において、これは、動物細胞又は組織を意味する。別の意味において、これは、いずれかの給源から得られた標本又は培養物、更には生物学的試料及び環境試料を含むことを意味する。生物学的試料は、植物又は動物(ヒトを含む)から得ることができ、並びに液体、固形物、組織、及び気体を包含している。環境試料は、地表物質(surface matter)、土壌、水、及び産業試料などの環境材料を含む。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するように構築されるものではない。
本発明の植物宿主細胞において発現されたGnTIII(例えば、配列番号:1、図4A)は、哺乳類GnTIIIである。具体的態様において、GnTIIIは、ヒトGnTIII(例えば、配列番号:2、図4B)である。GnTIIIは同じく、具体的態様において、哺乳類GnTIIIのアミノ酸配列と80%の同一性、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、及び最も好ましくは少なくとも約97%(以後「相同ポリペプチド」と称す)であり、これは該哺乳類GnTIIIの活性を定性的に維持している。クエリーアミノ酸配列に対し少なくとも、例えば、95%の「同一性」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチド配列が平均して、クエリーアミノ酸配列の各100個のアミノ酸につき最大5個のアミノ酸変更を含み得る以外は、クエリー配列と同一である。別の表現をすると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大5%が、別のアミノ酸で挿入、欠失又は置換されてよい。これらの参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置、又は参照配列内の残基中で個別にもしくは参照配列内の1個又は複数の相接基のいずれかにおいて散在された、これらの末端位置の間のどこかで生じることができる。
ひとつの態様において、哺乳類GnTIII又は他の異種蛋白質、例えば異種糖蛋白質又は哺乳類グリコシルトランスフェラーゼなどをコードしている核酸は、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクター、又はRNAウイルスベクターの場合は、複製及び翻訳に必要なエレメント、更には選択マーカーを含むベクターへ挿入することができる。これらは、プロモーター領域、シグナル配列、5'非翻訳配列、構造遺伝子がそれに備えられ(equip)ているかどうかに応じて開始コドン、並びに転写及び翻訳終結配列を含むが、これらに限定されるものではない。このようなベクターを得る方法は、当該技術分野において公知である(総説については国際公開公報第01/29242号を参照)。
哺乳類GnTIIIの発現は、糖蛋白質上のバイセクトされたN-グリカンへつながる。バイセクトされたN-グリカンは、一部の哺乳類糖蛋白質の生物学的活性にとって重要である。特に、バイセクトされたモノクローナル抗体は、増強されたADCC(抗体-依存型細胞毒性)を有する。バイセクトされた構造の導入は、糖蛋白質の新規又は最適化された機能及び増加したバイオアベイラビリティにつながり、例えば、アンテナリティ型の増加は、低下した腎クリアランスのために、半減期を増大する。従って、本発明は、バイセクトしているオリゴ糖、特にバイセクトしているGlcNAc残基を有する該異種糖蛋白質を含む植物宿主システム、及び該糖蛋白質を生成する方法を指示する。
本発明は更に、哺乳類GnTIIIの触媒部分及び蛋白質の膜貫通部分を含む単離されたハイブリッド蛋白質に関し、該蛋白質は、真核細胞の小胞体又はゴルジ装置に常在する。本発明は、修飾された哺乳類GnTIIIにも関し、ここで膜貫通ドメインは、除去されるが、ERにおける該GnTIIIの残留のためのKDELのような残留シグナルを含んでいる。
GnTIIIの植物への導入の植物糖蛋白質のグリカン上のバイセクト型オリゴ糖の出現に対する作用が、評価される。GnTIIIに関するヒト遺伝子は、クローニングされ、並びにタグを付けた融合蛋白質の発現の分析のためのC-末端c-mycタグが提供され、及び全体がタバコ内の導入のための植物調節エレメントの制御下に配置される。GnTIIIは、植物において発現されること、及び発現は、内因性植物糖蛋白質上にバイセクト型オリゴ糖構造を生じることが示されている。少なくとも2個のGlcNAc残基を含むN-グリカンの量は、正常タバコ植物において認められるものと比べ2倍以上多い。驚くべきことに、内因性植物糖蛋白質の単離されたグリカンのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)分析から明らかであるように、GnTIIIの発現も、複合型N-グリカン分解産物の顕著な減少を生じる。これらのデータは、N-グリカン上のバイセクトされた構造の導入を生じるタバコ中のGnTIIIの発現は、グリカンをβ-N-アセチルヘキサミニダーゼによる分解から保護することを示唆している。β-N-アセチルヘキサミニナーゼは、典型的にはトリマンノシルコア(Man-α-1-3及びMan-α-1-6)上に存在するGlcNAc-β1-2リンケージ中でもとりわけ非還元末端GlcNAcに及びβ-N-アセチルグルコサミン(GalNAC)切断に対し、広範な特異性を有する。
PACクローンRP5-1104E15 GnTIII(配列番号:1、図4A)を、Pieter J. de Jong, Children's Hospital Oakland Research Institute(CHORI)から入手し、及びSanger Centerを通じて求め、クローンセットHBRC_1.scの一部を入手した。このクローンは、ホモ・サピエンス、男性の血液が起源であり、http://www.sanger.ac.uk/Teams/Team63/CloneRequest/から求めることができる(ヒト染色体22q12.3-13.1由来;The Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge,CB 10 1 SA, 英国;www.sanger.ac.uk)。
タバコ葉の総蛋白質抽出物を、既報のように調製した(Bakkerら、「Galactose-extended glycans of antibodies produced by transgenic plants」、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、98:2899-2904 (2001))。試料に存在する蛋白質の量を、ウシ血清アルブミンを標準として用いるBradford法により推定した(Bradford, M.M.、「A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding」、Anal Biochem、72:248-254 (1976))。一定量の蛋白質試料を、還元条件下で10又は12%SDS-PAGEゲル(Bio-Rad社)上に流した。Rainbowカラー分子量蛋白質マーカーは、Amersham社から得た。ウェスタンブロット分析を、本質的に説明されたように行った(Bakkerら、「Galactose-extended glycans of antibodies produced by transgenic plants」、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、98:2899-2904 (2001))。分離した蛋白質を、ニトロセルロース(BA85、Schleicher及びSchuell又はTrans-Blot Transfer Medium、Bio-Rad社)に、Bio-Radミニトランスブロット電気泳動式移動セルを用い、3[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスルホン酸(CAPS)緩衝液中で60分間かけて移した。GnTIII-c-myc融合蛋白質の発現を、ペルオキシダーゼ標識したc-myc抗体を用いる、アフィノブロッティングにより分析した。内因性タバコ糖蛋白質のバイセクトしているオリゴ糖の導入は、ビオチン化した赤血球凝集フィトヘマグルチニン(E-PHA;Vector Laboratories社)と一緒のインキュベーションにより可視化した。検出は、LumiAnalystソフトウェア(ver.3.0)を使用するLumi-Imager F1装置(Boehringer Mannheim社、マンハイム、独国)上で、Roche社(Roche Diagnostics社、マンハイム、独国)のLumi-Lightウェスタンブロット基質を使用する増強された化学発光により行った。
グリカン構造の分析のために、細胞蛋白質を、ヒトGnTIIIで形質転換した選択された植物のタバコ葉から単離した(GnTIII-17)。蛋白質単離及びN-グリカン調製は、既報のように行った(Elbersら、2001)。N-グリカンを、多孔質でない黒鉛化したカーボンブラックカラム(Carbograph Ultra Clean Tubes、Alltech Associates社)上で脱塩し、その後説明されたように質量分析した。MALDI-TOFスペクトルは、Micromass社(マンチェスター、英国)のTof spec E MALDI-TOF質量分析装置において測定した。質量分析は、本質的に既報のように、2,5-ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして使用し行った(Elbersら、2001)。
内因性糖蛋白質を、対照タバコ植物及び選択されたGnTIII-17植物の若葉から単離し、ヒトGnTIII発現の糖蛋白質にN-連結されたグリカンの構造に対する作用について詳細に調べた。MALDI-TOFを用いる、対照野生型タバコ植物の葉に存在する糖蛋白質から単離されたN-グリカンの構造の植物GnTIII-17由来のものとの比較を、図1に示した。MALDI-TOFは、N-グリカンのプール(グライコフォーム)における様々な分子種の検出を可能にし、並びにd、Man5からn、Man9の範囲の高-マンノース(Man)-型N-グリカンの及び切断構造a、XM3GN2からm、GN3FXM3GN2までの成熟N-グリカンの(M+Na)+付加体に割当てられたイオン混合を示した。(構造については表1参照;データの要約は表2参照)。対照植物(図1A)で特徴付けられたN-グリカンに加え、植物GnTIII-17(図1B)からのグリカン混合物のMALDI-TOF MSは、ヒトGnTIII酵素の作用から生じるN-連結されたグリカンに割当てられた少なくとも2種のイオンを示した(比較については表1及び表2参照)。これらのオリゴ糖GN3XM3GN2(i)及びGN3FXM3GN2(k)は、各々、集団の8%及び31%を示し、N-連結されたグリカンのトリマンノシルコア構造の3個のマンノースのひとつに連結された3個のGlcNAc残基を含む。
抽出物のMALDI-TOF分析は、ここでグライコフォーム集団の少なくとも40%は、GnTIII酵素の作用により、細胞タバコ蛋白質の複合型N-連結されたグリカンにおけるバイセクトしているGlcNAcを有することを明確に示した。野生型タバコの約30%と比べ、GnTIII-17の内因性糖蛋白質の複合型N-連結されたグリカンの集団の70%よりも多くが、2又は3個の末端GlcNAc残基を有する(表1)。タバコにおけるGnTIIIの発現時にバイセクト型複合型N-連結されたグリカンの少なくとも40%の観察された新規合成(図1B、表1及び表2)は、FXM3GN2(b、30%から4%)及びGNFXM3GN2(f、10から2%)の大きい消失並びにGN2FXM3GN2(j、29%から19%)の程度の小さい消失と同時に起こる。加えて、GN2XM3GN2(h)の野生型タバコの4%からGnTIII-17の14%への著しい増加も同時に起こる。GnTIII植物における後者のGN2XM3GN2(h)が、N-連結されたグリカンのトリマンノシルコアのβ-連結されたマンノースに連結された第二のGlcNAcを有し、これはGnTIII活性の結果であるか、もしくはトリマンノシルコアの第二のα-連結されたマンノースに連結された第二のGlcNAcを有するかどうかは、依然調べられるべきである(前記参照)。
ヒトGNTIII遺伝子を、その3'c-myc免疫検出タグと共に、プラスミドpAMV-GNTIIIから、下記の方法によるPCRにより得た。各々、hGNTIII遺伝子の5'末端及び3'末端に相同なプライマーMS20及びMS19を設計し、並びにPmeI部位及び停止コドンをこの遺伝子の3'末端に追加して合成した。
MS20(5' NcoI部位):5'-CCATGGTGATGAGACGCTAC-3' (配列番号:5)
MS19(3' 停止及びPmeI部位の追加):5'-GTTTAAACCTAGGATCCTAATTCAGATCCTCT-3' (配列番号:6)。
NcoI及びPmeIによる消化後、PCR-由来のhGNTIII断片を、pDAB4005のNcoI及びPmeI消化後のベクター断片左側に連結し、中間体プラスミドpDAB7119を作成した(配列番号:9)(図6A及び6B)。中間体プラスミドpDAB7119を、SpeI及びSphIにより切断し、hGNTIII植物発現カセットを放出し、これをT4 DNAポリメラーゼで処理し、平滑末端を作成した。
プラスミドpDAB7113を、培地(LB+amp)2Lで増殖し、Qiagen Plasmid Gigaキットにより精製し、植物細胞形質転換のために精製したプラスミド5mgを作成した。
プラスミドpDAB7113を、本質的にこれらの引用例に記されたような、ウィスカ-媒介したDNA導入により、下記のように、メイズ細胞へ導入した(Frame, B.ら、「Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation」、Plant J.、6:941-948 (1994);Thompson, J.ら、「Maize transformation utilizing silicon carbide whiskers: a review」、Euphytica、85:75-80 (1995);P. Song、C. Q. Cai、M. Skokut、B.Kosegi、及びJ. Petolino、「Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in Whiskers-derived transgenic maize」、Plant Cell Rep.、20:948-954 (2002);両方とも、本明細書に参照として組入れられている。)。
各トランスジェニック単離体からの組織を、凍結乾燥装置において個別に凍結乾燥し、及びDNAを標準方法(DNAeasy 96植物用キット、Qiagen社)により抽出した。挿入されたトランスジェニックDNAのコピー数を、Third Wave Technologies社(Third Wave Technologies社、マジソン、WI、twt.com)から入手可能なInvader Operatingシステムにより推定した。Third Wave Technologies社により、PAT選択マーカーに特異的なプライマーを設計し、及びそのコピー数を、内因性メイズα-チューブリン遺伝子のゲノムDNAコピー数と比べて推定した。
100個の個別に単離された独自のトランスジェニック事象(event)からのカルス試料を、下記のように抽出した。各事象からの試料を、各ウェルに鉄及びタングステン製のビーズがはいった96-ウェルクラスターチューブボックス(Costar 1.2mlポリプロピレン、蓋付き)中で新たに凍結した。抽出緩衝液(25mMリン酸ナトリウム、pH6.6、100mM NaCl、30mM硫酸水素ナトリウム、1%v/v TritonX-100)450μlを、各ウェルに添加し、試料のボックスを、Kleco Bead Mill上で最高速度で3分間粉砕した。このプレートを、2500rpmで10分間遠心した(4℃)。抽出物を、96-ウェルの深いウェルプレートに移し、貯蔵のために凍結した。個々の事象のこれらの抽出物について、全てのスクリーニングアッセイを行った。
100個の個別に単離した独自のトランスジェニック事象由来のカルス試料を、以下のように抽出した。各事象からの試料を、各ウェル中に鉄及びタングステン製ビーズが入った96-ウェルクラスターチューブボックス(Costar 1.2mlポリプロピレン製、蓋付き)中で新たに凍結した。各ウェルに抽出緩衝液(25mMリン酸ナトリウム、pH6.6、100mM NaCl、30mM硫酸水素ナトリウム、1%v/v TritonX-100)450ulを追加し、この試料ボックスを、Kleco Bead Mill上で最高速度で、3分間粉砕した。このプレートを、2500rpmで10分間遠心した(4℃)。抽出物を、96-ウェルの深いウェルプレートに移し、貯蔵のために凍結した。全てのスクリーニングアッセイを、個々の事象のこれらの抽出物について行った。
試料を、E-PHAを使用するレクチンブロッティングを基にしたGnTIII導入遺伝子発現について陽性と試験したいくつかのメイズカルス事象の一緒にしたカルスから調製した。カルス組織を、新たに収集し、-80℃で凍結保存し、その後液体窒素中で細かい粉末に粉砕した。秤量した試料を、抽出緩衝液(5mM EDTA、0.5mM PMSF、20mM硫酸水素ナトリウム、150mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、及び0.4mM PVPP可溶性MW40,000)に添加し、30分間4℃で攪拌した。5000xGで4℃で遠心後、上清を収集した。硫酸アンモニウム及び洗浄用緩衝液(5mM EDTA、150mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4)を、上清に添加し、硫酸アンモニウム最終濃度20%(w/v)を実現した。5000xGで4℃で5分間遠心後、上清を新たなチューブへ移し、追加の硫酸アンモニウムと洗浄用緩衝液を添加し、硫酸アンモニウム最終濃度60%(w/v)を実現した。この調製物を、4℃で一晩攪拌し、その後10,000xGで20分間遠心した。このペレットを、5mlの洗浄用緩衝液中に回収し、-80℃で凍結し、その後4℃で乾燥するまで凍結乾燥した。試料を、グリカン分析のために実験施設に送付した。
形質転換したカルスからの植物再生のために、組織を、MS基本塩及びビタミン(Murashige T.及びF. Skoog、Physiol Plant、15:473-497 (1962))、30g/lショ糖、5mg/l 6-ベンジルアミノプリン(BA)、0.025mg/l 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)、1mg/lハービエース(市販の配合物20%ビアラホス、明治製菓、東京、日本)、及び2.5g/l Gelrite、pH5.7を含有する再生培地上に置いた。培養物を、光下で生育した。茎頂が長さ1〜3cmに到達した時点で、これらを、SH基本塩及びビタミン(Schenk R.及びA.C. Hildebrandt、Can J Bot、50:199-204 (1972))、10g/lショ糖、1g/l myo-イノシトール、及び2.5g/l Gelrite、pH5.8を含有する容器に移した。
内因性糖蛋白質を、対照トウモロコシカルス、及びE-PHAを用いるレクチンブロッティングを基に選択されたGnTIIを発現しているトウモロコシカルスから単離した。加えて本発明は、c-mycタグ付けした試料の抽出も企図している。E-PHA及びc-mycタグ付き試料は、前記定義の項に定義したように、カルス、植物細胞、植物組織又は植物全体であることができる。カルス中に存在する糖蛋白質から単離されたN-グリカンの構造の比較は、図9A及び9Bに示された。MALDI-TOFは、N-グリカンのプール(グライコフォーム)中の様々な分子種の検出を可能にし、d、Man5からl、Man8の範囲の高-マンノース(Man)-型N-グリカンの、及びa、XM3GN2からm、bGN3FXM3GN2の切断構造の成熟N-グリカンの、(M+Na)+付加体に割当てられたイオンの混合を示した(表3参照)。対照カルスにおいて特徴付けられたN-グリカン(図9A)に加え、GnTIIIを発現している選択されたトウモロコシカルス由来のグリカン混合物のMALDI-TOF MS(図9B)は、ヒトGnTIII酵素の作用から生じるN-連結されたグリカンに割当てられた少なくとも1種のイオンを示した(比較のために表3参照)。オリゴ糖GN3XM3GN2(m)は、この集団の20%を示し、及びN-連結されたグリカンのトリマンノシルコア構造の3個のマンノースのひとつに各々連結された3個のGlcNAc残基を含む。ここで行ったMALDI-TOFによるグリカン構造の分析は、マンノースにβ(1,2)-又はβ(1,4)-連結されたGlcNAc残基の間を識別することができない。従って、構造GN2XM3GN2 (h)及びGN2FXM3GN2 (k)は、バイセクトしているオリゴ糖を有するかどうか又はどの程度有するかは、明らかではなかった。形質転換されない対照トウモロコシ細胞と比較したGnTIIIトウモロコシ細胞における数は両方とも増加した。これらの構造は、正常及びバイセクト型オリゴ糖の混合物又は単独の化合物であることを明らかにするためには、追加実験が必要である。
加えてMALDI-TOF質量分析データ(図11)は、バイセクト型GlcNAc構造を明らかにしている。
内因性糖蛋白質は、対照トウモロコシ植物葉、及びE-PHAを用いるウェスタンブロッティング又はレクチンブロッティングによるc-mycタグ配列の存在に関する分析を基に選択されたGnTIIIを発現している選択されたトウモロコシ植物葉から単離した。葉中に存在する糖蛋白質から単離されたN-グリカンの構造の比較は、表6に示した。MALDI-TOFは、N-グリカン(グライコフォーム)の様々な分子種の検出を可能にし、f、Man6からh、Man8の範囲の高-マンノース(Man)-型N-グリカンの、並びに対照トウモロコシ植物における、a、XM3GN2からg、GN2FXM3GN2の切断構造の成熟N-グリカンの、及びトランスジェニックGnTIIIトウモロコシ植物におけるi、bGN3FXM3GN2までの、(M+Na)+付加体に割当てられたイオンの混合を示した。
様々な参考文献が本明細書に引用され、それらの開示もその全体が本明細書に参照として組入れられている。
Claims (37)
- 外来UDP-N-アセチルグルコサミン:β-Dマンノシドβ(1,4)-N-アセチルグルコサミニル転移酵素(GnTIII)の酵素を含むトランスジェニック植物又はその一部であって、該トランスジェニック植物又はその一部は、該トランスジェニック植物又はその一部内の該GnTIII酵素の発現から生じるバイセクト型オリゴ糖をもつ糖蛋白質を生産する、前記植物又はその一部。
- 異種糖蛋白質をさらに含み、該異種糖蛋白質は、前記トランスジェニック植物又はその一部内の前記GnTIII酵素の発現から生じるバイセクト型オリゴ糖を含む、請求項1に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記GnTIIIが、ヒトGnTIIIである、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記GnTIIIが、哺乳動物GnTIIIの活性部位と蛋白質のトランスメンブラン領域を含むハイブリッド蛋白質であり、かつ、真核細胞の小胞体又はゴルジ体内に存在する、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記GnTIIIが、哺乳動物GnTIIIの活性部位と糖転移酵素のトランスメンブラン領域を含むハイブリッド蛋白質である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記GnTIIIが、哺乳動物GnTIIIの活性部位と、マンノシダーゼI、マンノシダーゼII、GnTI、GnTII、XylT、及びFucTからなる群から選ばれる糖転移酵素のトランスメンブラン領域を含むハイブリッド蛋白質である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記GnTIIIが、小胞体保持シグナルを含む改変哺乳動物GnTIIIである、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 植物の一部である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 細胞、葉、胚芽、カルス、茎、果皮、プロトプラスト、根、塊茎、穀粒、胚乳及び胚からなる群より選択される植物の部分である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 植物全体である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記異種糖蛋白質の蛋白質が、抗体又はその抗原結合性断片である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記トランスジェニック植物又はその一部が、タバコ植物又はその一部である、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- N-グリカン生合成を提供する輸送体及び酵素からなる群より選択される機能性蛋白質を更に含む、請求項2に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 前記酵素が、ヒトβ-1,4ガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項13に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- 増加したガラクトース残基を有する異種糖蛋白質を更に含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物又はその一部。
- a)植物全体である請求項1に記載の植物又はその一部と、異種糖蛋白質を発現している植物とを、交配する工程、
b)該交配から後代を収穫する工程、及び
c)所望の後代植物を選択する工程を含む、
方法であって、ここで、該所望の後代植物内で発現される異種糖蛋白質がバイセクト型オリゴ糖をもつ、前記方法。 - 植物には通常存在しないGnTIII酵素をコードしている核酸配列、及び異種糖蛋白質をコードしている核酸配列を植物又はその一部に導入する工程、並びに
該異種糖蛋白質を単離する工程
を含む、バイセクト型オリゴ糖を有する異種糖蛋白質の取得方法。 - 前記植物又はその一部が、植物細胞であり、かつ、該植物細胞が、植物へ再生される、請求項17に記載の方法。
- 前記核酸配列が、該植物又はその一部を、GnTIIIをコードする核酸配列を含む第一のベクター、及び異種糖蛋白質をコードしている核酸配列を含む第二のベクターにより形質転換することにより、該植物又はその一部に導入される、請求項17に記載の方法。
- 前記核酸配列が、該植物又はその一部の、GnTIIIをコードする核酸配列、及び異種糖蛋白質をコードしている核酸配列を含むベクターによる形質転換により、植物又はその一部へ導入される、請求項17に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物又はその一部を栽培することを含む、バイセクト型オリゴ糖を有する異種糖蛋白質の取得方法。
- a)請求項1〜15のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物又はその一部を栽培する工程、並びに
b)異種蛋白質の単離のための、該植物又はその一部を収穫し及び分別する工程
を含む、所望の糖蛋白質の取得方法。 - 請求項16に記載の方法により入手可能な植物。
- a)N-グリカン生合成を提供する輸送体又は酵素からなる群より選択される機能性蛋白質を含む植物と、植物全体である請求項2に記載の植物又はその一部とを交配する工程、
b)該交配から後代を収穫する工程、及び
c)所望の後代を選択する工程
を含む、植物又はその一部を得る方法。 - 請求項24に記載の方法により得られたトランスジェニック植物。
- a)GnTIII酵素をコードする核酸配列、及び植物に通常存在しない輸送体又は酵素からなる群より選択される機能性蛋白質をコードする核酸配列を、異種糖蛋白質を発現する植物又はその一部に導入する工程、並びに
b)該糖蛋白質を単離する工程
を含む、植物又はその一部において発現されたバイセクト型オリゴ糖を有する異種糖蛋白質のガラクトシル化を増加する方法。 - 医薬組成物の製造において使用するための植物由来の糖蛋白質であって、該糖蛋白質が、請求項17〜20、及び22のいずれか1項に記載の方法により製造され、かつ、GN2XM3GN2、GN2FXM3GN2、GN3XM3GN2、及びGN3FXM3GN2{式中、GNは、N-アセチルグルコサミンであり、Xは、β1,2−キシロースであり、Fは、α1,3−フコースであり、そしてMは、マンノースである。}からなる群から選ばれるモチーフを含む少なくとも1ついにN-グリカンを含む、前記糖蛋白質。
- 前記糖蛋白質は、抗体、ホルモン、成長因子、成長因子受容体、抗原、サイトカイン、又は血液蛋白質である、請求項27に記載の植物由来の糖蛋白質。
- a.i)植物細胞、及びii)GNTIII酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する工程;並びに
b.該発現ベクターを、該植物細胞に、該酵素が発現されて該植物細胞内で同じく発現される糖蛋白質上へのバイセクト型オリゴ糖の形成をもたらす条件下で導入する工程
を含む、方法。 - 前記GNTIII酵素をコードしている核酸が、配列番号:1の核酸配列を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記GnTIIIが、哺乳動物GnTIIIの活性部位と蛋白質のトランスメンブラン領域を含むハイブリッド蛋白質であり、かつ、真核細胞の小胞体又はゴルジ体内に存在する、請求項29に記載の方法。
- 真核細胞の小胞体又はゴルジ体内に存在する前記蛋白質が、糖転移酵素である、請求項31に記載の方法。
- 前記糖転移酵素が、マンノシダーゼI、マンノシダーゼII、GnTI、GnTII、XylT、及びFucTからなる群から選ばれる、請求項32に方法。
- 前記GnTIIIが、小胞体保持シグナルを含む改変哺乳動物GnTIIIである、請求項29に記載の方法。
- 異種糖蛋白質をコードしている核酸を含む第二の発現ベクターを提供する工程;並びに
該第二の発現ベクターを、該異種蛋白質が発現される条件下で前記植物細胞に導入する工程
をさらに含む、請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。 - 異種糖蛋白質をコードしている核酸を含む第二の発現ベクターを提供する工程;
該第二の発現ベクターを、該異種蛋白質が発現される条件下で前記植物細胞に導入する工程
をさらに含み、ここで、前記異種蛋白質が、抗体又は抗体断片である、請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。 - a)i) GNTIII酵素をコードしている核酸を含む第一の発現ベクターを含む第一の植物、及びii) 異種蛋白質をコードする核酸を含む第二の発現ベクターを含む第二の植物を提供する工程;並びに
b)該第一の植物と該第二の植物とを交配し、ハイブリッド酵素及び該異種蛋白質を発現している後代を作成する工程;
を含み、ここで、該後代内で発現される異種糖蛋白質はバイセクト型オリゴ糖を含む、前記方法。
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