BR112013031564B1

BR112013031564B1 - Métodos para geração e expressão de um polipeptídio e sistema de expressão

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Publication number: BR112013031564B1
Application number: BR112013031564-4A
Authority: BR
Inventors: Tarlan Mammedov; Vidadi Yusibov
Original assignee: Ibio, Inc
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2021-11-03
Also published as: EP2718444B1; US20140186886A1; CA2839932C; WO2012170678A1; EP2718444A1; BR112013031564A2; CA2839932A1; CN103906840A; CN103906840B; US11673926B2

Abstract

método para geração de um polipeptídio desglicosilado de interesse, método para expressão de um polipeptídio pngase f bacteriano ativo em uma planta de origem vegetal e sistema de expressão. são descritos materiais e métodos para desglicosilação in vivo de proteínas n-glicosiladas recombinantes por coexpressão com pngase f (peptídio: n-glicosidase f) bacteriano em plantas, usando-se um sistema de expressão transitória. são descritos métodos que, por exemplo, produzem proteínas recombinantes de interesse em plantas numa forma não glicosilada. é também fornecido um método de expressão de pngase f bacteriano ativo em plantas.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] Este documento relaciona-se com materiais e métodos para produção de proteínas recombinantes de interesse em plantas numa forma não glicosilada.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Expressão baseada em plantas foi investigada como um método para produção de proteínas farmacêuticas recombinantes. A tecnologia pode ser particularmente útil para expressão de proteínas glicosiladas. Glicoproteínas de mamíferos, por exemplo, são eficientemente glicosiladas quando expressas em plantas transgênicas.

[003] Entretanto, a capacidade de plantas de glicosilar proteínas também pode ser uma limitação da utilidade de sistemas de expressão baseados em plantas. Alguns eucariotas (tais como parasitas do gênero Plasmodium), por exemplo, não possuem mecanismo para glicosilação N-ligada. Proteínas naturais dessas espécies podem conter locais múltiplos para glicosilação em potencial que poderiam ser glicosilados de modo aberrante quando expressos em plantas, resultando em funcionalidade e imunogenicidade reduzidas em consequência de dobramento ou mascaramento incorreto/alterado de epítopos, por exemplo. De fato, a ligação de carboidrato pode interferir substancialmente nas propriedades físico-químicas de uma proteína e, portanto, pode alterar funções biológicas essenciais como imunogenicidade, atividade específica e interações ligante- receptor da proteína.

[004] N-glicosilação aberrante apresenta problemas para muitas aplicações terapêuticas. Por exemplo, células cancerosas frequentemente são caracterizadas por aumentos aberrantes em N-glicosilação de proteína [Mihai et al. (2009) Cancer Res. 69:5673]. Além disso, N-glicosilação aberrante de receptores da superfície celular, incluindo integrinas e caderinas, parece estar associada a alterações na progressão de carcinoma e metástase [Guo et al. (2002) Cancer Res. 62:6837-6845; Partridge et al. (2004) Science 306:120-124; e Isaji et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:19747-19754]. Além disso, existem diferençasestruturais importantes entre glicanos N-ligados de plantas e de mamíferos. Por exemplo, N-glicanos complexos de plantas contêm resíduos β1, 2-xilose e α1,3-fucose que não estão presentes em glicanos complexos humanos. Ademais, deve ser notado que, para diferentes estágios de glicosilação, proteínas recombinantes podem ser produzidas de múltiplas formas quando elas são expressas em plantas transgênicas, criando desse modo trabalho adicional para separar essas formas durante purificação da proteína.

[005] Têm sido envidados esforços para humanizar glicosilação N-ligada e N-glicanos de substâncias biofarmacêuticas expressas em plantas [Bakker et al. (supra); Saint-Jore-Dupas et al. (2007) Trends Biotechnol. 25(7):317-323; Frey at el. (2009) Plant Biotechnol. J. 7(1):33-48; Matsuo e Matsumura (2011) Plant Biotechnol. J. 9(2):264-281; Misaki et al. (2003) Glycobiol. 13(3):199- 205; Palacpac et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(8):4692-4697; Strasser et al. (2009) J. Biol. Chem. 284(31):20479-20485; e Vézina et al. (2009) Plant Biotechnol. J. 7(5):442-455].

[006] Entretanto, desglicosilação enzimática de proteínas in vivo não foi conseguida de modo satisfatório previamente em nenhum sistema eucariótico, incluindo sistemas vegetais. Por exemplo, estratégias como o uso de tunicamicina para bloquear N-glicosilação resultou numa expressão não uniforme de proteínas de origem vegetal ([Hori e Elbein (1981) Plant Physiol. 67:882-886; e Frank et al. (2008) Plant Physiol. 148(3):1354-1367].

RESUMO

[007] Este documento fornece materiais e métodos para produção de formas de proteínas desglicosiladas (p. ex., proteínas candidatas a vacina em particular ou proteínas terapêuticas) em células de origem vegetal usando-se métodos de expressão transitória. As proteínas produzidas por meio desses métodos podem ser especialmente úteis para sua funcionalidade e imunogenicidade.

[008] Este documento baseia-se, em parte, no desenvolvimento de métodos para produção de proteínas desglicosiladas em células de origem vegetal, por expressão transitória do Peptídio: N-glicosidase F (PNGase F) bacteriano numa célula, em combinação com outro polipeptídio de interesse. PNGase F bacteriano não foi previamente expresso em sistemas vegetais. Conforme descrito nos Exemplos a seguir, PNGase F bacteriano foi transitoriamente coexpresso com diversas proteínas recombinantes (especificamente, Pfs48F1E candidata a vacina contra malária, antígeno protetor [PA] de B. anthracis e anticorpo contra PA de B. anthracis) em N. benthamiana. PNGase F bacteriano foi plenamente ativo in vivo e clivado com sucesso em oligossacarídios N-ligados a partir de glicoproteínas alvos, resultando em uniformidade das proteínas expressas.

[009] Desse modo, os estudos descritos aqui demonstram que desglicosilação enzimática de proteínas pode ser conseguida in vivo usando-se uma enzima de desglicosilação introduzida em um sistema eucariótico. Essa estratégia pode ser utilizada para produzir proteínas e anticorpos terapêuticos de formas desglicosiladas em um sistema de expressão transitória vegetal. Isto pode ser muito importante para algumas proteínas, especialmente aquelas que não são glicosiladas em seu hospedeiro natural mas podem ser glicosiladas de modo aberrante quando expressas em outros hospedeiros eucarióticos, potencialmente resultando em funcionalidade e imunogenicidade reduzidas. Os métodos fornecidos aqui podem ter amplas aplicações na modificação de muitos alvos (p. ex., proteínas, anticorpos, candidatos a vacina) em plantas como N. benthamiana por coexpressão desses alvos com enzimas de modificação tais como PNGase F.

[010] Em um aspecto, este documento dá destaque a um método para geração de um polipeptídio desglicosilado de interesse. O método pode incluir produção de uma célula eucariótica que compreende (a) um primeiro ácido nucleico que compreende uma primeira sequência de nucleotídios que codifica um polipeptídio PNGase F bacteriano, em que a primeira sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídio PNGase F é expresso; e (b) um segundo ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídios que codifica o polipeptídio de interesse, em que a segunda sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídio de interesse é expresso, em que, por ação do polipeptídio PNGase, o polipeptídio de interesse é desglicosilado. O método pode incluir simultaneamente introdução do primeiro e do segundo ácido nucleico na célula, separadamente introduzindo-se o primeiro e o segundo ácido nucleico na célula. O primeiro e o segundo ácido nucleico podem estar presentes no mesmo constructo do ácido nucleico. A célula eucariótica pode ser uma célula de origem vegetal (p. ex., célula de Nicotiana benthamiana). A primeira sequência de nucleotídios pode ter pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. O polipeptídio PNGase F pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2. O primeiro e o segundo ácido nucleico podem ser introduzidos na célula por meio do constructo de um Agrobacterium.

[011] Em outro aspecto, este documento dá destaque a uma célula eucariótica compreendendo (a) um primeiro ácido nucleico que compreende uma primeira sequência de nucleotídios que codifica um polipeptídio PNGase F bacteriano, em que a primeira sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídio PNGase F é expresso; e (b) um segundo ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídios que codifica o polipeptídio de interesse, em que a segunda sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídio de interesse é expresso. A célula eucariótica pode ser uma célula de origem vegetal(p. ex., célula de Nicotiana benthamiana). A primeira sequência de nucleotídios pode ter pelo menos 90 por centode identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. O polipeptídio PNGase F pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2.

[012] Este documento também dá destaque a um método para expressão de um polipeptídio PNGase F bacteriano em uma célula de origem vegetal, compreendendo introdução em uma célula de origem vegetal de um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídios que codifica o polipeptídio PNGase F, em que a sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídio PNGase F é expresso. A sequência de nucleotídios pode ter pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. O polipeptídio PNGase F pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2. O ácido nucleico pode ser introduzido na célula de origem vegetal por meio do constructo de um Agrobacterium. A célula de origem vegetal pode ser uma célula de Nicotiana benthamiana.

[013] Em outro aspecto, este documento dá destaque a um sistema de expressão que compreende (a) um primeiro ácido nucleico que compreende uma primeira sequência de nucleotídios que codifica um polipeptídio PNGase F bacteriano, em que a primeira sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o primeiro ácido nucleico é introduzido em uma célula eucariótica e o promotor é ativado, o polipeptídio PNGase F é expresso; e (b) um segundo ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídios que codifica um polipeptídio de interesse, em que a segunda sequência de nucleotídios é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o segundo ácido nucleico é introduzido na célula eucariótica e o promotor é ativado, o polipeptídio de interesse é expresso. A primeira sequência de nucleotídios pode ter pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. O polipeptídio PNGase F pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2; e em que o polipeptídio mantém atividade de glicosidase. A célula eucariótica pode ser uma célula de origem vegetal (p. ex., célula de Nicotiana benthamiana).

[014] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente compreendido por especialistas o assunto aos quais esta invenção diz respeito. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados para prática da invenção, métodos e materiais apropriados são descritos adiante. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionados aqui são incorporados por referência em sua totalidade. Em caso de dúvida, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não têm por finalidade ser limitantes.

[015] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são demonstrados nos desenhos anexos e na descrição a seguir. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão compreensíveis com base na descrição e nos desenhos, bem como nas reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[016] A Figura 1 mostra as sequências de nucleotídios e aminoácidos de PNGase F que foram expressas em Nicotiana benthamiana conforme descrito aqui. A Figura 1A mostra a sequência de nucleotídios (SEQ ID NO:1) do gene de PNGase F de Elizabethkingia meningoseptica (GENBANK ® Accession no. J05411) como códon otimizado para expressão em N. benthamiana fundida com nucleotídios que codificam His6-tag e KDEL (SEQ ID NO.:5). A Figura 1B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO.:5) deduzida de PNGAse F. MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA (SEQ ID NO.:3) é o peptídio sinalizador de PR-1a de tabaco; DYKDDDDK (SEQ ID NO.:4) é um epítopo de FLAG.

[017] A Figura 2 mostra Western blots de extratos de folhas de N. benthamiana que coexpressam Pfs48F1 e PNGase F bacteriano. Amostras de folhas foram obtidas em 5 DPI (dias pós-infiltração), 6 DPI e 7 DPI e foram fixadas em tampão de extração para TSP (proteína solúvel total), tampão de extração com Triton X-100 para TSPT(TSP extraída com Triton X-100 a 0,5%) e tampão de extração com tampão de amostra de sulfato dodecílico de sódio IX para TP (proteína total). PNGase F (Figura 2A) foi detectado com anticorpo policlonal anti-FLAG; Pfs48F1E (Figura 2B) foi detectada com anticorpo monoclonal anti-His de camundongo. 1, TP; 2, TSP; 3, TSPT.

[018] A Figura 3 mostra um gel de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) de PNGase F purificado (Figura 3A) e um Western blot comparando desglicosilação de Pfs48F1 sob condições in vitro e in vivo (Figura 3B). Para a Figura 3A, PNGase F foi purificado de N. benthamiana usando-se uma coluna de agarose anti-FLAG conforme descrito no Exemplo 1 adiante, e a proteína purificada foi analisada por SDS- PAGE. Para o Western blot mostrado na Figura 3B, Pfs48F1 purificada foi incubada sob condições de não desnaturação com quantidades gradualmente aumentadas de PNGase F purificado de plantas ou com PNGase F obtido de New England Biolabs. A proteína Pfs48F1 foi detectada com o anticorpo monoclonal anti-His-tag. A desglicosilação de Pfs48F1 in vivo por PNGase F purificado ou comercial foi comparada com a desglicosilação de Pfs48F1 in vivo por PNGase F coexpresso (segunda faixa da direita). “MWM” refere-se a marcadores de peso molecular [SEEBLUE® Plus2 Pre-Stained Standard (Figura 3A) e MAGICMARKTM XP Western Protein Standard (Figura 3B); ambos os marcadores de Invitrogen; Carlsbad, CA].

[019] A Figura 4 representa Western blots mostrando coexpressão de antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis (Figura 4A) e anticorpo contra PA de B. anthracis (Figura 4B) com PNGase F. Para coexpressão de PNGase F com PA de B. anthracis e anticorpo contra PA de B. anthracis, estruturas de pGRD4-PA83-1/pBi-PNGase F e pBI-PA-A/pGRD4-PNGase F foram usadas para infiltração em plantas N. benthamiana. Amostras de folhas (obtidas em 5 DPI de plantas infiltradas com PA e em 6 DPI de plantas infiltradas com anticorpo contra anticorpo anti-PA de B. anthracis) foram fixadas em tampão de extração, centrifugadas e diluídas em SDS-tampão de amostra. Amostras de 10 μl foram conduzidas em SDS-PAGE antes de análise por Western blot. Faixas de PA foram sondadas com o anticorpo monoclonal anti-His. Anticorpos contra PA de B. anthracis foram sondados com anticorpos humanos anti-alfa de coelho.

[020] A Figura 5 ilustra resultados obtidos a partir de uma análise por ELISA comparativa de formas glicosiladas (diamantes) e não glicosiladas (quadrados) de Pfs48F1.Anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos I (Figura 5A), IIb (Figura 5B), III (Figura 5C) e V (Figura 5D) de Pfs48F1 foram usados na análise.

[021] A Figura 6 ilustra a afinidade de ligação de mAb V a variantes de Pfs48F1. Ensaios cinéticos foram conduzidos conforme explicado no Exemplo 1 usando-se Pfs48F1 purificada de N. benthamiana transformada (Figura 6A), Pfs48F1 purificada desglicosilada com PNGase F in vitro (Figura 6 B) e Pfs48F1 desglicosilada in vivo purificada de N. benthamiana transformada que coexpressa PNGase F (Figura 6C). A desglicosilação in vivo de Pfs48F1 e a purificação de Pfs48F1 desglicosilada in vivo foram realizadas conforme descrito nos Exemplos aqui.

[022] A Figura 7 ilustra a afinidade de ligação de mAb a variantes de Pfs48F1, conforme mostrado por inibição de sinal gerado de mAb III livre por ligação das variantes de Pfs48F1.

[023] A Figura 8 representa um Western blot de Arm- Pfs48F1 expressa em N. benthamiana transformada. Amostras da folha de plantas transformadas foram obtidas em 7 DPI e foram fixadas em tampão de extração para TSP ou tampão de extração com SDS para TP, com ou sem ditiotreitol (DTT), conforme indicado.

[024] A Figura 9 ilustra a afinidade de ligação entre Pfs48F1 desglicosilada in vivo e Arm-Pfs48F1 direcionada a cloroplasto em relação a mAb III (Figura 9A) e mAb V conforme determinado com base em uma análise por ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[025] Os materiais e métodos descritos aqui podem ser usados para produzir formas desglicosiladas de proteínas (p. ex., proteínas candidatas a vacina e proteínas terapêuticas) em plantas (p. ex., N. benthamiana). Proteínas produzidas por tais métodos podem ser especialmente úteis por sua funcionalidade e imunogenicidade.

Definições

[026] Ácido nucleico: Os termos “ácido nucleico”, “polinucleotídio” e “oligonucleotídio” são usados de modo intercambiável aqui para se referir a um polímero de pelo menos três nucleotídios. Um nucleosídio compreende uma base nitrogenada ligada a uma molécula de açúcar. Em um polinucleotídio, grupos fosfato ligam-se covalentemente a nucleosídios adjacentes para formar um polímero. O polímero pode incluir nucleosídios naturais (p. ex., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina), análogos de nucleosídios, bases quimicamente modificadas, bases biologicamente modificadas (p. ex., bases metiladas), bases intercaladas e/ou açúcares modificados (p. ex., purinas ou pirimidinas modificadas). Ver em Kornberg e Baker (1992) DNA replication, 2nd Ed., Freeman, San Francisco, CA; Scheit (1980) Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, NY; e U.S. Patent Publication No. 20040092470 e respectivas referências uma discussão adicional de vários nucleotídios, nucleosídios e estruturas de cadeias que podem ser usados nos polinucleotídios descritos aqui. Um polinucleotídio pode ter qualquer comprimento e sequência e pode ser unifilamentado ou bifilamentado. Onde este documento fornece uma sequência de ácidos nucleicos, a sequência complementar também é fornecida. Além disso, onde uma sequência é fornecida como DNA, a sequência de RNA correspondente (isto é, a sequência em que T é substituída por U) também é fornecida.

[027] Constructo de ácido nucleico: O termo ““constructode ácido nucleico” é usado aqui para se referir a um ácido nucleico que foi modificado pela mão do homem ou é derivado desse ácido nucleico. Por exemplo, um constructo de ácido nucleico pode conter uma mutação, deleção ou substituição em relação a uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural. Um constructo de ácido nucleico pode compreender dois ou mais segmentos de ácido nucleico que são derivados ou originados de diferentes fontes tais como organismos diferentes (p. ex., um polinucleotídio recombinante). A sequência de uma ou mais porções de um constructo de ácido nucleico pode ser inteiramente inventada pelo homem.

[028] Sequência de ácido nucleico: O termo “sequência de ácido nucleico” conforme se usa aqui refere-se a um material de ácido nucleico propriamente dito e não é restrito à informação da sequência (isto é, a sucessão de letras escolhidas entre as cinco letras básicas A, G, C, T ou U) que caracteriza bioquimicamente um molécula específica de ácido nucleico (p. ex., DNA ou RNA).

[029] Gene: Para os propósitos deste documento, o termo “gene” tem seu significado conforme compreendido no assunto. Em geral, o termo “gene” refere-se a um ácido nucleico que inclui uma porção que codifica uma proteína; o termo opcionalmente pode abranger sequências reguladoras tais como promotores, intensificadores, finalizadores etc., além de codificação de sequências (quadros de leitura abertos). Esta definição não tem por objetivo excluir a aplicação do termo “gene” a unidades de expressão de codificação não proteica, mas, em vez disso, esclarecer que, na maioria dos casos, o termo conforme se usa neste documento se refere a um ácido nucleico que codifica proteína. Será percebido que a definição de gene pode incluir ácidos nucleicos que não codificam proteínas, mas, em vez disso, fornecem moldes para transcrição de moléculas funcionais de RNA tais como tRNAs ou rRNAs, por exemplo.

[030] Produto gênico ou produto de expressão: Um produto gênico ou produto de expressão é, em geral, um RNA transcrito do gene ou um polipeptídio codificado por um RNA transcrito do gene. Expressão de um gene ou de um polinucleotídio refere-se a (1) transcrição do RNA do gene ou polinucleotídio; (2) tradução do RNA transcrito do gene ou polinucleotídio, ou tanto (1) quanto (2).

[031] Vetor: “Vetor” refere-se a um ácido nucleico ou um vírus, um genoma viral ou uma respectiva porção (p. ex., um capsídio viral ou um componente de um genoma viral) que é capaz de mediar a entrada (p. ex., transferência ou transporte) de uma molécula de ácido nucleico em uma célula. Onde o vetor é um ácido nucleico, a molécula de ácido nucleico a ser transferida é geralmente ligada à - p. ex., inserida na - molécula de ácido nucleico vetora. Um vetor do tipo ácido nucleico pode incluir sequências que controlam replicação autônoma dentro de células hospedeiras apropriadas (p. ex., uma origem de replicação) ou pode incluir sequências suficientes para permitir integração de parte de todo o ácido nucleico com o DNA da célula hospedeira. Vetores do tipo ácido nucleico úteis incluem, por exemplo, plasmídios de DNA ou RNA, cosmídios e genomas virais ou suas porções ou ácidos nucleicos (DNA ou RNA) de ocorrência natural ou modificados que podem ser acondicionados em capsídios virais. Vetores do tipo plasmídios geralmente incluem uma origem de replicação e um ou mais marcadores selecionáveis. Plasmídios podem incluir parte ou a totalidade de um genoma viral (p. ex., um promotor, intensificador, processador viral ou sinais de acondicionamento etc.). Vírus ou suas porções (p. ex., capsídios virais) que podem ser usados para introduzir moléculas de ácido nucleico em células são referidos como vetores virais. Vetores virais do reino animal incluem adenovírus, retrovírus, lentivírus, vírus da vaccínia e outros poxvírus, vírus do herpes simples e outros. Vetores virais do reino vegetal incluem aqueles baseados em tobamovírus, ilarvírus etc. Vetores virais podem ou não conter informação genética viral suficiente para produção de vírus infecciosos quando introduzidos em células hospedeiras, isto é, vetores virais podem ser de replicação defeituosa, e tais vetores virais de replicação defeituosa podem ser preferíveis para determinadas modalidades da invenção. Onde há ausência de informação suficiente, eles podem ser, mas não têm de ser, supridos por uma célula hospedeira ou outro vetor introduzido na célula. Um “vetor de expressão” é um vetor que inclui uma ou mais sequências de controle da expressão, e uma “sequência de controle da expressão” é uma sequência de DNA que controla e regula a transcrição e/ou tradução de outra sequência de DNA.

[032] Polinucleotídio de interesse: Conforme se usa aqui, o termo “polinucleotídio de interesse” refere-se a qualquer sequência alvo a ser expressa na célula, conforme se descreve aqui. Um polinucleotídio de interesse pode ser, por exemplo, um polinucleotídio que codifica proteína, mas também pode ser uma sequência que fornece um molde para transcrição de um RNA estrutural ou um RNA ativo tal como, por exemplo, uma ribozima ou um RNA de interferência. Em algumas modalidades, um polinucleotídio pode ser um gene que não é expresso naturalmente no tipo de célula relevante ou não é expresso no nível que o polissacarídio é expresso quando expressão é conseguida por intervenção da mão do homem, conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, um polinucleotídio de interesse pode incluir sequências que não são naturalmente encontradas na célula relevante, mas são encontradas naturalmente em outros tipos de células ou organismos. Alternativamente ou adicionalmente, um polinucleotídio de interesse pode ser aquele que não é naturalmente associado às sequências vetoras às quais ele é associado de acordo com o presente documento.

[033] Operacionalmente ligado: Conforme se usa aqui, o termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma relação entre duas sequências de ácidos nucleicos em que a expressão de uma das sequências de ácidos nucleicos é, por exemplo, controlada, regulada ou modulada pela outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos é controlada por uma sequência promotora operacionalmente ligada; o processamento pós-transcrição de um ácido nucleico é controlado por uma sequência de processamento operacionalmente ligada; a tradução de uma sequência de ácidos nucleicos é controlada por uma sequência reguladora de tradução operacionalmente ligada; o transporte ou a localização de um ácido nucleico ou polipeptídio está sob controle de uma sequência de transporte ou localização operacionalmente ligada; e o processamento pós-tradução de um polipeptídio é controlado por uma sequência de processamento operacionalmente ligada. Uma sequência de ácidos nucleicos que é operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos em geral é ligada covalentemente, direta ou indiretamente, a essa sequência, embora qualquer associação tridimensional eficaz seja aceitável. Nota-se que uma única sequência de ácidos nucleicos pode ser operacionalmente ligada a uma pluralidade de outras sequências. Por exemplo, um único promotor pode controlar a transcrição de múltiplas espécies de RNA. Um sequência de codificação está “operacionalmente ligada” e “sob o controle” de uma sequência de controle de expressão em uma célula quando RNA-polimerase é capaz de transcrever a sequência de codificação em mRNA, que então pode ser traduzido na proteína codificada pela sequência de codificação.

[034] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” inclui células nas quais um vetor de expressão recombinante pode ser introduzido. Uma célula hospedeira para uso com os sistemas de expressão e métodos descritos geralmente é uma célula eucariótica, tal como uma célula de origem vegetal. Conforme se usa aqui, os termos “transformado” e “transfectado” abrangem a introdução de uma molécula de ácido nucleico (p. ex., um vetor) em uma célula por uma de diversas técnicas.

[035] Polipeptídio: Conforme se usa aqui, o termo “polipeptídio” refere-se a uma cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou da modificação pós- tradução (p. ex., glicosilação ou fosforilação). Peptídios podem incluir proteínas de comprimento normal ou seus fragmentos ou variantes. Um “polipeptídio de interesse” refere-se a uma sequência alvo expressa em uma célula, conforme se usa aqui. Em algumas modalidades, um polipeptídio de interesse pode ser um polipeptídio que não é expresso em sua forma natural no tipo de célula relevante ou não é expresso no nível em que o polipeptídio é expresso quando a expressão é alcançada por intervenção da mão do homem. Em determinadas modalidades, um polipeptídio de interesse pode incluir sequências que não são encontradas naturalmente na célula relevante, mas são encontradas naturalmente em outros tipos de células ou organismos.

[036] Identidade percentual: “Identidade” refere-se à extensão em que duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou duas ou mais sequências de aminoácidos são as mesmas. A identidade percentual entre duas sequências sobre uma janela de avaliação é computada por alinhamento das sequências, determinando-se o número de nucleotídios ou aminoácidos dentro da janela de avaliação que são opostos a um nucleotídio ou aminoácido idêntico, permitindo-se a introdução de lacunas para maximizar a identidade, dividindo-se pelo número total de nucleotídios ou aminoácidos na janela e multiplicando-se por 100.

[037] Identidade percentual para qualquer sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos é determinada como se segue. Primeiramente, uma sequência de ácidos nucleicos ou aminoácido é comparada com a sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos identificada usando-se o programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) da versão de BLASTZ independente contendo a versão BLASTN 2.0.14 e a versão BLASTP 2.0.14. Essa versão de BLASTZ independente pode ser obtida do web site de Fish & Richardson (World Wide Web em fr.com/blast) ou do web site do National Center for Biotechnology Information do governo dos EUA (World Wide Web em ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables). Instruções explicando a maneira como usar o programa Bl2seq podem ser encontradas no arquivo Leiame que acompanha BLASTZ.

[038] Bl2seq realiza uma comparação entre duas sequências usando o algoritmo BLASTN ou BLASTP. BLASTN é usado para comparar sequências de ácidos nucleicos, enquanto BLASTP é usado para comparar sequências de aminoácidos. Para comparar duas sequências de ácidos nucleicos, as opções são estabelecidas como se segue: -i é estabelecido para um arquivo contendo a primeira sequência de ácidos nucleicos a ser comparada (p. ex., C:\seq1.txt); -j é estabelecido para um arquivo contendo a segunda sequência de ácidos nucleicos a ser comparada (p. ex., C:\seq2.txt); -p é estabelecido para blastn; -o é estabelecido para qualquer nome de arquivo desejado (p. ex., C:\output.txt); -q é estabelecido para -1; -r é estabelecido para 2; e todas as outras opções são deixadas em seu contexto padrão. Por exemplo, o seguinte comando pode ser usado para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre duas sequências: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para se comparar duas sequências de aminoácidos, as opções de Bl2seq são estabelecidas como se segue: -i é estabelecido para um arquivo contendo a primeira sequência de aminoácidos a ser comparada (p. ex., C:\seq1.txt); -j é estabelecido para um arquivo contendo a segunda sequência de aminoácidos a ser comparada (p. ex., C:\seq2.txt); -p é estabelecido para blastp; -o é estabelecido para qualquer nome de arquivo desejado (p. ex., C:\output.txt); e todas as outras opções são deixadas em seu contexto padrão. Por exemplo, o seguinte comando pode ser usado para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre duas sequências de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq 1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Se a sequência alvo compartilhar homologia com qualquer porção da sequência identificada, então o arquivo de saída designado apresentará aquelas regiões de homologia como sequências alinhadas. Se a sequência alvo não compartilhar homologia com nenhuma porção da sequência identificada, então o arquivo de saída designado não apresentará sequências alinhadas. Uma vez alinhadas, o comprimento é determinado por contagem do número de resíduos de nucleotídios ou aminoácidos consecutivos a partir da sequência alvo apresentada em alinhamento com a sequência da sequência de iniciação identificada com qualquer posição ou terminação correspondente com qualquer outra posição correspondente. A posição correspondente é qualquer posição onde um resíduo de nucleotídio ou aminoácido idêntico é apresentado tanto na sequência alvo quanto na sequência identificada. Lacunas apresentadas na sequência alvo não são contadas uma vez que lacunas não são resíduos de nucleotídios ou aminoácidos. Do mesmo modo, lacunas apresentadas na sequência identificada não são contadas, porque resíduos de nucleotídios ou aminoácidos da sequência alvo são contados, nem resíduos de nucleotídios ou aminoácidos da sequência identificada.

[039] A identidade percentual sobre determinado comprimento é definida contando-se o número de posições correspondentes sobre esse comprimento e dividindo-se esse número pelo comprimento e em seguida multiplicando-se o valor resultante por 100. Por exemplo, se (1) uma sequência alvo de 1000 nucleotídios for comparada com a sequência mostrada na SEQ ID NO:1, (2) o programa Bl2seq apresenta200 nucleotídios da sequência alvo alinhados com uma regiãoda sequência mostrada na SEQ ID NO:1 onde o primeiro e oúltimo nucleotídio dessa região de 200 nucleotídios são justapostos e (3) o número de justaposições sobre esses 200 nucleotídios alinhados é 180, de modo que a sequência alvo de 1000 nucleotídios contém um comprimento de 200 e uma identidade percentual sobre esse comprimento de 90 (isto é, [180:200] * 100 = 90).

[040] Será percebido que uma única sequência alvo de ácidos nucleicos ou aminoácidos que se alinha com uma sequência identificada pode ter muitos diferentes comprimentos, cada comprimento tendo sua própria identidade percentual. Além disso, observa-se que o valor da identidade percentual é arredondado para o decimal mais próximo. Por exemplo, 78.11, 78.12, 78.13 e 78.14 sãoarredondados descendentemente para 78.1, ao passo que 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 e 78.19 são arredondadosascendentemente para 78.2. Também se observa que o valor do comprimento será sempre um número inteiro.

[041] Isolado: Conforme se usa aqui, o termo “isolado” refere-se a um composto ou entidade que (a) é submetido a separação de pelo menos algum dos componentes aos quais normalmente se associa (p. ex., purificação); (b) a sintetização in vitro; e/ou (c) a produção ou preparação por um processo que envolve a mão do homem.

[042] Naturalmente: Os termos “naturalmente” e “deocorrência natural”, conforme se usa aqui, referem-se a processos, eventos ou coisas que ocorrem em sua forma relevante na natureza. Ao contrário, o termo “de ocorrência não natural” refere-se a processos, eventos ou coisas cuja existência ou forma envolve a mão do homem.

[043] Desglicosilado: O termo “desglicosilado”,conforme se usa aqui com relação a polipeptídios produzidos na presença de - ou de outro modo expostos a - um polipeptídio PNGase F, refere-se a polipeptídios que possuem um grau menor de glicosilação N-ligada do aqueleque possuiriam se não fossem produzidos na presença do - oude outro modo expostos ao - polipeptídio PNGase F. Polipeptídios “desglicosilados” podem ter um nível de glicosilação N-ligada que é reduzido em pelo menos cerca de 10 por cento (p. ex., 10 por cento, 20 por cento, 30 por cento, 40 por cento, 50 por cento, 60 por cento, 70 por cento, 80 por cento 90 por cento ou 100 por cento) em comparação com o nível de glicosilação N-ligada dos mesmos polipeptídios que não são produzidos na presença de - ou de outro modo expostos a - um polipeptídio PNGase F.

Ácidos nucleicos e vetores

[044] Os ensinamentos fornecidos aqui podem ser usados com a finalidade de liberar para uma célula e/ou expressar em uma célula (p. ex., célula de origem vegetal) qualquer polinucleotídio de interesse. Polinucleotídios que codificam proteínas podem expressar, por exemplo, enzimas, antibióticos, hormônios, citocinas, fatores de regulação, proteínas estruturais ou qualquer outra proteína ou polipeptídio de interesse. Proteínas codificadas podem ser proteínas de ocorrência natural ou podem ser proteínas desenvolvidas ou geneticamente modificadas incluindo, por exemplo, proteínas de fusão (a exemplo de proteínas de fusão que incorporam parte ou a totalidade de uma proteína viral de origem vegetal tal como proteína de movimento ou proteína de revestimento). Em algumas modalidades, o polinucleotídio de interesse pode conter uma porção que codifica um marcador, tal como um marcador 6X-His, um marcador HA, um marcador Myc ou um marcador FLAG. Esses marcadores podem simplificar o isolamento e/ou a purificação da proteína. Em algumas modalidades, o marcador pode ser um marcador clivável (p. ex., um marcador clivável por uma protease tal como trombina), de modo que o marcador pode facilmente ser removido após purificação, resultando em uma proteína com sequência do ripo selvagem.

[045] Em algumas modalidades, um polinucleotídio pode codificar proteína terapeuticamente ativa. Proteínas ilustrativas incluem, sem limitação, hormônios (p. ex., insulina, hormônio tireoideo, catecolaminas, gonadotropinas, hormônios tróficos, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, calcitonina, hormônio estimulante do folículo e leptinas), hormônios do crescimento (p. ex., hormônio do crescimento humano), fatores do crescimento (p. ex., fator do crescimento epidérmico, fator do crescimento neural, fator do crescimento derivado de plaquetas, fator do crescimento semelhante à insulina e o equivalente), receptores de fator do crescimento, citocinas e proteínas do sistema imune (p. ex., interleucinas, fator estimulante de colônia [CSF], fator estimulante de colônias de granulócitos [G-CSF], fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos [GM-CSG], eritropoietina, fator de necrose tumoral [TNF], receptor de TNF [forma solúvel], interferons, integrinas, adressinas, selectinas, receptores de adesão, receptores de células T, imunoglobulinas, antígenos do complexo principal de histocompatibilidade solúvel, antígenos imunologicamente ativos como antígenos ou alérgenos bacterianos, parasitários ou virais, autoantígenos e anticorpos), enzimas (p. ex., ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase, enzimas de biossíntese ou de degradação do colesterol, enzimas esteroidogênicas, cinases, DNAses, fosfodiesterases, metilases, desmetilases, desidrogenases, celulases, proteases, lipases, fosfolipases, aromatases, citocromos, adenilato- ou guanilato-ciclases, neuraminidases e o equivalente), receptores (p. ex., receptores de hormônio esteroide e receptores peptídicos), proteínas de ligação (p. ex., proteínas de ligação a esteroide, proteínas de ligação ao hormônio do crescimento ou ao fator do crescimento e o equivalente), fatores de transcrição ou tradução, oncoproteínas ou proto- oncoproteínas (p. ex., proteínas do ciclo celular), proteínas musculares (p. ex., miosina, tropomiosina e o equivalente), mieloproteínas, proteínas neuroativas, proteínas de supressão do crescimento tumoral (p. ex., angiostatina ou endostatina, ambas as quais inibem a angiogênese), proteínas antissepse (p. ex., proteína de aumento da permeabilidade bactericida), proteínas estruturais (p. ex., colágeno, fibroína, fibrinogênio, elastina, tubulina, actina e miosina) e proteínas sanguíneas (p. ex., trombina, albumina sérica, Fator VII, Fator VIII, insulina, Fator IX, Fator X, ativador do plasminogênio tecidual, Proteína C, fator de von Willebrand, antitrombina III, glicocerebrosidase, eritropoietina e fator estimulante de colônias de granulócitos [G-CSF] ou Fator VIII modificado, anticoagulantes tais como huridina e o equivalente]. Evidentemente, este documento não é limitado a proteínas aprovadas para uso terapêutico, mas também abrange expressão de quaisquer polinucleotídios, seja ele codificador de proteína ou não, e particularmente abrange expressão de qualquer polinucleotídio que codifica qualquer proteína terapeuticamente ativa, seja de origem procariótica, seja de origem eucariótica.

[046] Em algumas modalidades, um polinucleotídio pode codificar um ou mais componentes de vacina. Em geral, pode ser desejável que uma vacina inclua proteínas, ou porções de proteínas, a que um sistema imune humano ou animal seja exposto quando o indivíduo humano ou animal for infectado com um patógeno ou for submetido a algum outro evento indesejável (p. ex., desenvolvimento de um tumor). Proteínas e polipeptídios que podem ser formulados em uma vacina incluem, sem limitação, proteínas de revestimento viral, proteínas G virais, proteínas da parede celular microbiana, proteínas de toxina microbiana e antígenos específicos de tumor.

[047] Em algumas modalidades, um polinucleotídio pode ser usado para expressar uma enzima que sintetiza ou modifica um agente biologicamente ativo. Por exemplo, determinadas enzimas (p. ex., sintases policetídicas, sintases polipeptídicas e sintases terpênicas) sintetizam pequenas moléculas com atividades biológicas interessantes, incluindo atividades terapêuticas (p. ex., atividades antibióticas, anticancerosas ou imunossupressoras). Além disso, grande número de enzimas que modificam substratos proteicos ou pequenas moléculas (p. ex., cinases, hidrolases e transferases) é conhecido. Ver, por exemplo, em U.S. Patent No. 6,500,644 proteínas adicionais que podem ser expressas em plantas usando-se os sistemas de expressão descritos aqui. Em algumas modalidades, um polinucleotídio pode codificar um reagente diagnóstico ou de pesquisa incluindo, por exemplo, um anticorpo. Em ainda outras modalidades, um polinucleotídio pode codificar uma proteína relevante do ponto de vista nutricional. Tais proteínas incluem, por exemplo, proteínas que são encontradas naturalmente em alimentos consumidos por seres humanos ou animais domesticados (tais como gatos e cães). Outros exemplos incluem proteínas com uma composição equilibrada de aminoácidos, como proteínas com uma composição tal como aquela usada para nutrição parenteral total.

[048] Um polinucleotídio conforme fornecido aqui pode codificar um polipeptídio PNGase F ou um fragmento de um polipeptídio PNGase F que mantém atividade de glicosidase. PNGase F é uma enzima com 34.8 kDa secretada pela bactéria Gram-negativa Flavobacterium meningosepticum [Plummer et al. (1984) J. Biol. Chem. 259(17):10700-10704; e Tarentino et al. (1990) J. Biol. Chem. 265(12):6961-6966]. PNGase F cliva uma ligação entre os resíduos mais internos de GlcNAc e asparagina de alta manose, origossacarídios híbridos e complexos em glicoproteínas N-ligadas a menos que o núcleo α(1-3) seja fucosilado. Em geral, os polinucleotídios PNGase F descritos aqui codificam um polipeptídio PNGase F funcional, ou um de seus fragmentos, que pode fornecer atividade de desglicosilação quando expresso em uma célula. Métodos para determinação sobre se um polipeptídio PNGase F ou fragmento possui atividade de glicosidase incluem aqueles conhecidos no assunto. Por exemplo, a atividade de glicosidase de um polipeptídio PNGase F pode ser testada in vivo conforme descrito no Exemplo 1 adiante. Em geral, um fragmento de polipeptídio PNGase F conforme fornecido aqui pode manter atividade de glicosidase em um nível que é de pelo menos 10 por cento (p. ex., pelo menos 10 por cento, pelo menos 20 por cento, pelo menos 25 por cento, pelo menos 30 por cento, pelo menos 40 por cento, pelo menos 50 por cento, pelo menos 60 por cento, pelo menos 70 por cento, pelo menos 75 por cento, pelo menos 80 por cento ou pelo menos 90 por cento) do nível de atividade de glicosidase de um polipeptídio PNGase F com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2.

[049] Vetores contendo ácidos nucleicos tais como aqueles descritos aqui também são fornecidos. Nos vetores de expressão descritos aqui, um ácido nucleico (p. ex., um ácido nucleico que codifica PNGase F ou que codifica um polipeptídio de interesse) pode ser operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle de expressão. Exemplos de sequências de controle de expressão incluem promotores, intensificadores e regiões de término da transcrição. Um promotor é uma sequência de controle de expressão que compreende uma região de uma molécula de DNA, usualmente dentro de 100 a 500 nucleotídios a jusante do ponto em que a transcrição se inicia (em geral, próximo ao local de iniciação para RNA-polimerase II). Para se conduzir uma sequência de codificação sob o controle de um promotor, é necessário posicionar o local de iniciação da tradução do quadro de leitura traducional do polipeptídio entre um e cerca de cinquenta nucleotídios a jusante do promotor. Intensificadores fornecem especificidade de expressão em termos de tempo, localização e nível. Ao contrário de promotores, intensificadores podem funcionar quando localizados em várias distâncias do local de transcrição. Um intensificador também pode estar localizado a jusante do local de iniciação.

[050] Vetores de expressão apropriados incluem, sem limitação, plasmídios e vetores derivados de, por exemplo, bacteriófago, baculovírus, vírus do mosaico do tabaco e outros vírus planos, vírus do herpes, citomegalovírus, retrovírus, vírus da vaccínia, adenovírus e vírus associados a adenovírus. Numerosos vetores e sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis de corporações como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

[051] Um vetor de expressão pode incluir uma sequência marcadora destinada a facilitar manipulação e/ou localização subsequente da sequência de ácidos nucleicos expressa (p. ex., purificação ou localização). Sequências marcadoras, tais como sequências marcadoras de proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S-transferase (GST), poli-histidina, c-myc, hemaglutinina ou FlagTM (Kodak, New Haven, CT), em geral são expressas como uma fusão com o polipeptídio codificado. Tais marcadores podem ser inseridos em qualquer lugar dentro do polipeptídio, incluindo o terminal carboxila ou amino.

Polipeptídios

[052] Os materiais e métodos descritos aqui são aplicáveis à produção de polipeptídios, particularmente polipeptídios desglicosilados, em células eucarióticas (p. ex., células de origem vegetal). Conforme indicado anteriormente, em algumas modalidades os polipeptídios podem ser proteínas farmacêuticas, embora os métodos geralmente não sejam limitados pelo(s) uso(s) particular(es) dos polipeptídios. Por exemplo, enzimas para uso em qualquer uma de uma ampla variedade de processos industriais ou processos de reparação biológica (p. ex., enzimas que degradam poluentes) podem ser produzidas. Desse modo, a descrição fornecida aqui, bem como nas reivindicações, deve ser considerada como aplicativa a quaisquer ácidos nucleicos ou proteínas de interesse mesmo se não for explicitamente indicado, incluindo aqueles com aplicações terapêuticas e aqueles sem aplicações terapêuticas.

[053] Uma proteína ou polipeptídio expressa(o) pode ou não ser aquela(e) que não é expressa(o) na planta na natureza. Exemplos não limitantes de polipeptídios que podem ser expressos em uma célula (p. ex., célula de origem vegetal) de acordo com os métodos descritos aqui incluem proteínas farmacêuticas, tais como hormônios (p. ex., insulina, hormônio tireoideo, catecolaminas, gonadotropinas, hormônios tróficos, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, calcitonina, hormônio estimulante do folículo e leptinas), hormônios do crescimento (p. ex., hormônio do crescimento humano), fatores do crescimento (p. ex., fator do crescimento epidérmico, fator do crescimento neural, fator do crescimento derivado de plaquetas, fator do crescimento semelhante à insulina e o equivalente), receptores do fator do crescimento, citocinas e proteínas do sistema imune (p. ex., interleucinas, CSF, G-CSF, GM-CSG, eritropoietina, TNF, receptor de TNF [forma solúvel], interferons, integrinas, adressinas, selectinas, receptores de adesão, receptores de células T, imunoglobulinas, antígenos do complexo principal de histocompatibilidade solúvel, antígenos imunologicamente ativos como antígenos ou alérgenos bacterianos, parasitários ou virais, autoantígenos e anticorpos), enzimas (p. ex., ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase, enzimas de biossíntese ou de degradação do colesterol, enzimas esteroidogênicas, cinases, DNAses, fosfodiesterases,metilases, desmetilases, desidrogenases, celulases,proteases, lipases, fosfolipases, aromatases, citocromos, adenilato- ou guanilato-ciclases, neuraminidases e o equivalente), receptores (p. ex., receptores de hormônio esteroide e receptores peptídicos), proteínas de ligação (p. ex., proteínas de ligação a esteroide, proteínas de ligação ao hormônio do crescimento ou ao fator do crescimento e o equivalente), fatores de transcrição ou tradução, oncoproteínas ou proto-oncoproteínas (p. ex., proteínas do ciclo celular), proteínas musculares (p. ex., miosina, tropomiosina e o equivalente), mieloproteínas, proteínas neuroativas, proteínas de supressão docrescimento tumoral (p. ex., angiostatina ou endostatina, ambas as quais inibem a angiogênese), proteínas antissepse (p. ex., proteína de aumento da permeabilidadebactericida), proteínas estruturais (p. ex., colágeno, fibroína, fibrinogênio, elastina, tubulina, actina e miosina) e proteínas sanguíneas (p. ex., trombina, albumina sérica, Fator VII, Fator VIII, insulina, Fator IX, Fator X, ativador do plasminogênio tecidual, Proteína C, fator de von Willebrand, antitrombina III, glicocerebrosidase, eritropoietina e G-CSF, ou Fator VIII modificado, e anticoagulantes tais como huridina) e o equivalente.

[054] Em algumas modalidades, um polipeptídio expresso pode ser uma proteína ou polipeptídio antigênico. Por exemplo, os métodos descritos aqui podem ser usados para produzir proteínas (ou porções delas) de organismos infecciosos que são reconhecidos pelo sistema imune de um indivíduo infectado. Tais proteínas ou polipeptídios podem ser úteis para o desenvolvimento de vacinas destinadas a proteção contra infecção pelos organismos relevantes. Para citar apenas alguns exemplos específicos, proteínas antigênicas úteis do antraz [p. ex., fator letal (LF) de B. anthracis ou PA], da cólera (Vibrio cholerae),citomegalovírus, cepas enterotoxigênicas de E. coli, vírus da doença do pé e da boca, hepatite B (p. ex., antígeno de superfície da hepatite B ou HBsAg), hepatite C (p. ex., proteína nuclear do HCV), vírus da imunodeficiência humana (p. ex., Tat, Rev, Nef, gp160 ou gp120), vírus do papiloma humano (p. ex., E7 ou E6), influenza (p. ex., HA ou NA), malária (p. ex., Pfs25, Pfs28, Pfs 48/45 ou Pfs 230 de Plasmodium falciparum), vírus do sarampo, vírus Norwalk, peste (p. ex., F1 ou LcrV de Yersinia Pestis), Pseudomonas aeruginaosa, vírus da raiva, vírus sincicial respiratório (p. ex., proteína F ou proteína G), rinovírus, rotavírus, Staphylococcus aureus, vírus da gastroenteritetransmissível, tripanossomos (p. ex., alfa-tubulina ou beta-tubulina de Trypanosoma brucei), tuberculose ou SARS podem ser produzidos de acordo com os métodos presentemente descritos.

Sistemas de expressão e células hospedeiras

[055] Este documento também fornece sistemas de expressão que podem ser usados para produzir polipeptídios desglicosilados em células hospedeiras (p. ex., células de origem vegetal). Os sistemas de expressão podem incluir um vetor de expressão que contenha uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídio PNGase F, bem como um vetor de expressão contendo um polinucleotídio de interesse que codifica um polipeptídio ou proteína de interesse. Em alguns casos, a sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídio PNGase F e o polinucleotídio de interesse que codifica o polipeptídio ou a proteína de interesse podem ser incluídos no mesmo constructo do ácido nucleico. As sequências polinucleotídicas que codificam o polipeptídio PNGase F e o polipeptídio ou a proteína de interesse podem cada um estar ligados operacionalmente a um promotor, de modo que, quando os polinucleotídios são introduzidos em uma célula eucariótica (p. ex., uma célula de N. benthamiana) e os promotores são ativados (p. ex., condicionalmente ou constitutivamente), o polipeptídio PNGase F e o polipeptídio ou a proteína de interesse são expressos. Os promotores que são operacionalmente ligados à sequência de codificação do PNGase F e à sequência de codificação para o polipeptídio de interesse podem ser os mesmos ou diferentes. Em alguns casos, o polinucleotídio que codifica o polipeptídio PNGase F pode ter uma sequência com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência (p. ex., pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade sequência ou 100 por cento de identidade sequência) em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. Em alguns casos, o polipeptídio PNGase F codificado pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência (p. ex., pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade de sequência ou 100 por cento de identidade sequência) em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2.

[056] Qualquer um de uma variedade de sistemas pode ser usado para expressar proteínas ou polipeptídios em plantas, através de transformação transitória ou estável. Tecnologias para proteínas ou polipeptídios de expressão transitória em tecidos vegetais podem utilizar, por exemplo, vírus de plantas. Transformação viral pode ser um método relativamente rápido e de baixo custo para transformação de embriões e plantas que podem ser coletados sem uma demora experimental ou geracional antes da obtenção do produto desejado. Por outro lado, vírus que não são atenuados podem infectar outras plantas, potencialmente causando preocupações ambientais.

[057] Em algumas modalidades, a expressão de um polipeptídio de interesse pode estar sob o controle de um promotor constitutivo. Em outras modalidades, a expressão de um polipeptídio de interesse pode ser induzível ou pode estar sob o controle de um promotor que é regulado de modo tecidual, por sincronização ou pelo desenvolvimento. Em alguns casos, por exemplo, a produção de um RNA que codifica o polipeptídio de interesse pode estar sob o controle de um promotor induzível (p. ex., induzível exogenamente). Promotores induzíveis exogenamente podem ser usados para aumentar ou diminuir a expressão de um transcrito em resposta a um estímulo externo em vez de um estímulo interno. Diversos fatores ambientais podem atuar como esses estímulos externos. Em algumas modalidades, a transcrição pode ser controlada por um promotor induzível por calor tal como um promotor de choque térmico, por exemplo.

[058] Promotores induzíveis externamente podem ser em particular úteis no contexto de condições de crescimento controladas e reguláveis. Por exemplo, usando-se um promotor de choque térmico, a temperatura de um ambiente fechado pode simplesmente ser aumentada para induzir expressão do transcrito relevante. Será percebido, evidentemente, que um promotor induzível por calor não é útil ao ar livre porque a temperatura ao ar livre não pode ser controlada. Outros promotores induzíveis externamente que podem ser usados incluem promotores induzíveis pela luz, que podem ser mantidos como promotores constitutivos se a luz no ambiente fechado e regulável estiver sempre ligada. Alternativamente, a expressão de um polipeptídio de interesse pode ser desencadeada em um período particular durante o desenvolvimento simplesmente por acionamento da luz.

[059] Em outras modalidades, um promotor induzível por meios químicos pode ser usado para induzir expressão de um polipeptídio de interesse. Em tais modalidades, a substância química poderia ser vaporizada ou aspergida por aerossol em uma semente, embrião ou planta para induzir expressão do polipeptídio relevante. A aspersão por aerossol e a vaporização podem ser precisamente controladas e dirigidas em uma semente, embrião ou planta particular conforme desejado. Um ambiente fechado é desprovido de janela ou correntes de ar, que poderiam dispersar a substância química para fora do recipiente pretendido, de modo que a substância química permanece no recipiente para o qual ela foi requerida.

[060] Este documento também fornece sistemas de expressão com as vantagens de sistemas de expressão viral (p. ex., expressão rápida, níveis elevados de produção) e de transformação mediada por Agrobacterium (p. ex., administração controlada). Por exemplo, este documento fornece sistemas em que um constructo de Agrobacterium (isto é, um constructo que replica em Agrobacterium e, portanto, pode ser liberado para células de origem vegetal por liberação do Agrobacterium) inclui um promotor vegetal que, após ser introduzido em uma planta, controla a expressão de sequências virais (p. ex., incluindo sequências de replicação viral) que transporta um gene para uma proteína ou polipeptídio de interesse. Esse sistema permite expressão transitória controlada e em alto nível de proteínas ou polipeptídios em plantas.

[061] Em alguns casos, um polipeptídio desglicosilado pode ser produzido em uma planta transgênica em que um transgene de PNGase F e/ou um transgene que codifica um polipeptídio de interesse é estavelmente integrado no DNA genômico e é expresso (p. ex., em núcleos celulares). Métodos para geração de tais plantas são conhecidos no assunto.

[062] Células hospedeiras contendo os ácidos nucleicos e vetores descritos aqui também são fornecidas. Uma molécula de ácido nucleico (p. ex., um vetor) pode ser introduzida em uma célula hospedeira por uma de diversas técnicas incluindo, sem limitação, técnicas que são bem estabelecidas dentro do assunto. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transformação baseada em Agrobacterium (incluindo transformação mediada por vácuo). Ver, por exemplo, os Exemplos adiante. Métodos apropriados para transformação e transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989). Eles incluem, por exemplo, precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, choque térmico, lipofecção, microinjeção e transferência de ácido nucleico mediada por vírus. Além disso, DNA exposto pode ser liberado diretamente em células in vivo (ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,580,859 e 5,589,466).

[063] Qualquer planta suscetível a transfecção transitória pode ser utilizada de acordo com os sistemas e métodos fornecidos aqui. Em geral, pode ser desejável usar plantas que são capazes de crescer em condições definidas, tais como sistemas de estufa e/ou aquosos. Também pode ser desejável selecionar plantas que não são geralmente consumidas por seres humanos ou animais domesticados e/ou que usualmente não fazem parte da cadeia alimentar humana, de modo que elas podem ser cultivadas do lado de fora sem preocupação de que o polinucleotídio expresso possa ser ingerido indesejavelmente. Em algumas modalidades,entretanto, pode ser desejável usar plantas comestíveis.

[064] As características desejáveis da planta podem ser determinadas pelo polinucleotídio particular a ser expresso. Por exemplo, quando o polinucleotídio codifica uma proteína a ser produzida em alto rendimento (como pode ser o caso, por exemplo, quando proteínas terapêuticas devem ser expressas), pode ser útil selecionar plantas com biomassa relativamente elevada (p. ex., tabaco, que também pode ser particularmente útil por outras razões, isto é, por ter um período de crescimento curto e não fazer parte da cadeia alimentar humana). Em algumas modalidades, plantas de cultura ou plantas relacionadas com cultura podem ser usadas.

[065] Plantas que podem ser particularmente úteis com os sistemas e métodos de expressão descritos aqui incluem, sem limitação, angiospermas (p. ex., Nicotiana, incluindo N. benthamiana), briófitos (p. ex., Hepaticae, Musci etc.), pteridófitos (p. ex., samambaias, rabo-de-cavalo e licopódio), gimnospermas (p. ex., coníferas, sagus, Ginko, Gnetales) e algas (p. ex., Chlorophyceae, Phaeophyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae e Euglenophyceae).

[066] Os sistemas e métodos fornecidos aqui podem ser usados para transfectar e/ou expressar um polinucleotídio em plantas em qualquer estágio de desenvolvimento incluindo, por exemplo, plantas naturais, mudas, brotos e sementes. Os sistemas e métodos podem ser usados para transfectar qualquer parte de uma planta (p. ex., raízes, folhas, troncos etc.).

Métodos

[067] Este documento também fornece métodos para produção de um polipeptídio desglicosilado de interesse em uma célula (p. ex., célula de origem vegetal). Em geral, os métodos podem incluir liberação para uma célula de um vetor que codifica PNGase F e um vetor de expressão que codifica o polipeptídio de interesse. Por exemplo, um método para produção de um polipeptídio de interesse pode incluir introdução em uma célula eucariótica (p. ex., célula de origem vegetal, como uma célula de N. benthamiana) de um primeiro ácido nucleico que codifica um polipeptídio PNGase F bacteriano e um segundo ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. As sequências de nucleotídios dentro do primeiro e do segundo ácido nucleico que codificam o polipeptídio PNGase F e o polipeptídio de interesse podem ser operacionalmente ligadas a promotores, de modo que, quando os promotores são ativados (p. ex., constitutivamente ou condicionalmente), o polipeptídio PNGase F e o polipeptídio de interesse são expressos, e, por ação do polipeptídio PNGase F, o polipeptídio de interesse é desglicosilado. Métodos para avaliação do nível de glicosilação incluem aqueles conhecidos no assunto (p. ex., eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio- poliacrilamida [SDS-PAGE] e análise por Western blotting, conforme descrito nos Exemplos a seguir, bem como espectrometria de massa e detecção de glicano).

[068] Os promotores ligados ao primeiro e ao segundo ácido nucleico podem ser os mesmos promotores ou promotores diferentes. Além disso, o primeiro e o segundo ácido nucleico podem estar contidos dentro de construtos separados ou dentro de um único constructo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídio PNGase F pode incluir uma sequência com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência (p. ex., pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento deidentidade de sequência ou 100 por cento de identidade de sequência) em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. Em alguns casos, o polipeptídio PNGase F codificado pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência (p. ex., pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento deidentidade de sequência ou 100 por cento de identidade de sequência) em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2.

[069] Também são fornecidos aqui métodos para expressão de um polipeptídio PNGase F em uma célula de origem vegetal. Os métodos podem incluir, por exemplo, introdução em uma célula de origem vegetal (p. ex., célula de N. benthamiana) de um ácido nucleico que codifica um polipeptídio PNGase F bacteriano. O ácido nucleico pode incluir uma sequência de nucleotídios que codifica o polipeptídio PNGase F e que está operacionalmente ligada a um promotor, de modo que, quando o ácido nucleico é introduzido na célula de origem vegetal, o polipeptídio PNGase F é expresso. Em alguns casos, o ácido nucleico pode incluir uma sequência com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência (p. ex., pelo menos 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade desequência ou 100 por cento de identidade de sequência) em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o polipeptídio PNGase F codificado pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 por cento de identidade de sequência (p. ex., pelo menos 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade desequência ou 100 por cento de identidade de sequência) em relação à sequência mostrada na SEQ ID NO:2.

[070] Vetores de expressão podem ser liberados para plantas usando-se técnicas que são conhecidas no assunto. Por exemplo, um vetor pode ser aplicado diretamente a uma planta (isto é, por inoculação abrasiva, inoculação por aerossol mecanizada, infiltração a vácuo, bombardeamento de partículas ou eletroporação). Alternativamente, vírions podem ser preparados (p. ex., de plantas previamente infectadas) e podem ser aplicados a outras plantas de acordo com técnicas conhecidas. Os vetores de expressão podem ser introduzidos na célula simultaneamente ou sequencialmente. Quando introdução sequencial é usada, qualquer duração de tempo apropriada pode transcorrer entre a introdução do primeiro vetor de expressão (em geral, o vetor que codifica PNGase F) e a introdução do segundo vetor de expressão (em geral, o vetor que codifica o polipeptídio de interesse). Por exemplo, a introdução do primeiro e do segundo vetor de expressão pode ser separada por 1 a 60 minutos, 1 a 24 horas ou 1 a 30 dias.

[071] Deve-se observar que, em algumas modalidades, o primeiro vetor de expressão, o segundo vetor de expressão ou ambos os vetores de expressão podem ser estavelmente transformados em células de origem vegetal, de modo que uma linha transgênica é gerada. Por exemplo, se uma planta é transgênica para sequências que codificam PNGase F, ela pode ser transitoriamente transformada com um vetor que codifica o polipeptídio de interesse, de modo que o polipeptídio de interesse expresso é desglicosilado.

[072] Em algumas modalidades, transformação mediada por Agrobacterium pode ser usada para se introduzir um ou mais constructos em uma célula. Agrobacterium é um gênero representativo da família Gram-negativa Rhizobiaceae. Esse gênero é responsável por tumores em plantas tais como escoriação da coroa e doença da raiz peluda. Em tecido vegetal desdiferenciado, que é característico de tumores, derivados de aminoácidos conhecidos como opinas são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizados pela planta. Os genes bacterianos responsáveis por expressão de opinas são uma fonte conveniente de elementos controles para epítopos de expressão quimérica. De acordo com os métodos descritos aqui, o sistema de transformação mediada por Agrobacterium pode ser usado para gerar plantas que expressam um polipeptídio de interesse na forma desglicosilada.

[073] Métodos de transformação mediada porAgrobacterium podem facilmente ser aplicados para regenerar plantas que expressam proteínas farmacêuticas. Em geral, transformação de plantas com Agrobacterium envolve transformação do crescimento de células da planta em cultura tecidual por cultivo concomitante com um Agrobacterium tumefaciens que transporta um vetor de origem vegetal/bactariana contendo, por exemplo, um gene que codifica uma proteína farmacêutica. O Agrobacterium transfere o vetor para a célula hospedeira da planta e é então eliminado por meio de tratamento antibiótico. Células de plantas transformadas que expressam proteínafarmacêutica podem ser selecionadas, diferenciadas e regeneradas em plantinhas completas [Hellens et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:819-832; Pilon-Smits et al. (1999) Plant Physiolog. 119(1):123-132; Barfield e Pua (1991) Plant Cell Reports 10(6/7):308-314; e de la Riva et al. (1998) Electronic J. Biotechnol. 1(3):versão on-line ISSN 0717-3458].

[074] Vetores de expressão agrobacteriana podem incluir um gene (ou epítopo de expressão) que codifica uma proteína farmacêutica desenvolvida para operação em plantas, com sequências acompanhantes a montante e a jusante do epítopo de expressão. As sequências acompanhantes geralmente são de origem plasmidial ou viral e fornecem características necessárias para o vetor transferir DNA de bactérias para o hospedeiro vegetal desejado. O constructo do vetor bacteriano/vegetal básico pode fornecer uma ampla faixa de hospedeiros de origem de replicação procariota e um marcador selecionável do procariota. Marcadores selecionáveis procarióticos apropriados incluem, por exemplo, marcadores que conferem resistência a antibióticos tais como ampicilina ou tetraciclina. Outras sequências de DNA que codificam funções adicionais bem conhecidas no assunto podem também estar presentes no vetor. Por exemplo, se a expressão do polipeptídio de interesse não for passível de detecção, o constructo do vetor bacteriano/vegetal também pode incluir um gene marcador selecionável para determinação sobre se uma célula de origem vegetal foi transformada (p. ex., o gene nptll de resistência a canamicina).

[075] Certos vetores podem incluir o ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. Um, dois ou mais vetores de expressão podem ser usados em determinada transformação. O vetor recombinante de expressão pode conter pelo menos os seguintes elementos além da sequência de codificação de proteína: uma região promotora, sequências não traduzidas 5’ da planta, códon de iniciação (dependendo de o gene expresso ter ou não o seu próprio) e sequências de término da transcrição e da tradução. Além disso, finalizadores da transcrição e da tradução e/ou sequências de secreção de sinal que permitem processamento e translocação da proteína podem ser incluídos. Uma variedade de promotores, sequências de sinalização e finalizadores da transcrição e da tradução são descritos, por exemplo, em Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324 e em U.S. patent No. 5,888,789. Ademais, genes estruturais para resistência a antibiótico podem ser usados para seleção [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807]. Locais singulares da enzima de restrição nas terminações 5’ e 3’ do epítopo podem permitir fácil inserção em um vetor preexistente.

[076] Outros sistemas de vetor binário que podem ser usados por transformação mediada por Agrobacterium são descritos em, por exemplo, PCT Publication No. WO00206012. Discussão adicional de transformação mediada por Agrobacterium é encontrada em Gelvin (2003) Microbiol. Mol. Biol. Reviews 67(1):16-37 e em Lorence e Verpoorte (2004) Methods Mol. Biol. 267:329-350.

[077] Em algumas modalidades, um sistema para expressão rápida (p. ex., transitória) de proteínas ou polipeptídios em plantas pode utilizar um constructo agrobacteriano para liberar um sistema de expressão viral que codifica a proteína ou o polipeptídio de interesse. Em particular, pode ser preparado um “vetor de lançamento” que contém sequências agrobacterianas (incluindo sequências de replicação) e sequências virais de plantas (incluindo sequências de autorreplicação) que transportam um ácido nucleico que codifica a proteína ou o polipeptídio de interesse. O vetor de lançamento pode ser introduzido no tecido da planta mediante, por exemplo, agroinfiltração, que pode permitir liberação substancialmente sistêmica. Para transformação transitória, cópias de T-DNA não integrado do vetor de lançamento podem permanecer transitoriamente presentes no núcleo e podem ser transcritas, resultando em expressão do polipeptídio codificado [Kapila et al. (1997) Plant Sci. 122:101-108]. Ao contrário da expressão de vetores virais, a expressão transitória mediada por Agrobacterium não resulta em expressão sistêmica do gene de interesse. Uma vantagem desse sistema é a capacidade de clonar genes maiores que 2 kb para gerar constructos impossíveis de se obter com vetores virais [Voinnet et al. (2003) Plant J. 33:949-956]. Além disso, usando-se tal técnica, é possível transformar a planta com mais de um transgene, de modo que proteínas multiméricas (p. ex., antibióticos ou subunidades de proteínas complexadas) podem ser expressas e montadas. Ademais, a possibilidade de coexpressão de transgenes múltiplos por meio de coinfiltração com diferentes Agrobacterium pode ser alcançada, seja por infiltração separada, seja por meio de culturas misturadas.

[078] Em algumas modalidades, um vetor de lançamento pode incluir sequências que permitem seleção (ou pelo menos detecção) em Agrobacteria e também seleção/detecção em tecidos infiltrados. Além disso, vetores de lançamento geralmente incluem sequências que são transcritas na planta para permitir produção de RNA viral, seguida por geração de proteínas virais. A produção de proteínas virais e de RNA viral pode permitir produção rápida de cópias múltiplas de RNA que codificam a proteína farmaceuticamente ativa de interesse. Essa produção pode resultar em produção proteica rápida da proteína de interesse em um período de tempo relativamente curto. Desse modo, um sistema altamente eficiente para produção de proteína pode ser gerado.

[079] Agroinfiltração com vetores de expressão viral pode ser usada para produzir quantidades limitadas de um polipeptídio particular com o objetivo de verificar o nível de expressão antes de se decidir sobre se ele é significativo na geração de plantas transgênicas. Alternativamente ou adicionalmente, técnicas de agroinfiltração com vetores de expressão viral podem ser úteis para geração rápida de plantas capazes de produzir grandes quantidades de proteína como uma plataforma de produção primária. Assim, esse sistema de expressão transitória pode ser usado em escala industrial.

[080] Também é fornecida aqui qualquer uma de uma variedade de diferentes plasmídios agrobacterianos, plasmídios binários e derivados deles (p. ex., pBI V, pBI l22l e pGreen), que podem ser usados neste e em outros aspectos dos sistemas e métodos descritos aqui. Numerosos vetores apropriados são conhecidos no assunto e podem ser controlados e/ou modificados de acordo com métodos conhecidos nesse campo ou com aqueles aqui descritos com a finalidade de se utilizar nos métodos fornecidos e descritos neste documento.

[081] Um vetor ilustrativo é pGRD4, que se baseia no vírus do mosaico do tabaco (TMV) e foi modificado geneticamente usando-se o sistema pGreen/Soup como um vetor de expressão binário por introdução do promotor 35 S do vírus do mosaico da couve-flor, o finalizador nos, e da sequência de ribozima do peixe-martelo pelo vetor de lançamento pBID4. Ver, por exemplo, Shoji, et al. (2009) Vaccine 27:1087-1092. Outro vetor de lançamento é conhecido como pBID4. Esse vetor contém o promotor 35 S do vírus do mosaico da couve-flor (um vírus de DNA de plantas) que controla a transcrição inicial do genoma viral recombinante após introdução em plantas e o finalizador nos, o finalizador transcricional da nopalina-sintase de Agrobacterium. O vetor ainda contém sequências do genoma do vírus do mosaico do tabaco incluindo genes para replicação viral (126/183K) e movimento entre células (MP). O vetor ainda contém um gene que codifica um polipeptídio de interesse, inserido em um único local de clonagem dentro de sequências do genoma do vírus do mosaico do tabaco e sob controle transcricional do promotor de mRNA subgenômico da proteína de revestimento. Como esse “gene alvo” (isto é, gene que codifica uma proteína ou polipeptídio de interesse) substitui sequências de codificação para a proteína de revestimento do TMV, o vetor viral resultante é desprovido de autorreplicação. Sequências nas extremidades esquerda e direita (LB e RB) delimitam a região do vetor de lançamento que é transferido para células vegetais após infiltração de plantas com Agrobacterium que transporta o vetor. Mediante introdução de Agrobacteria que transporta esse vetor para o tecido da planta (em geral por agroinfiltração mas alternativamente por injeção ou outros meios), múltiplas cópias de DNA unifilamentado (ssDNA) de sequência entre LB e RB são geradas e liberadas em questão de minutos. Essas sequências introduzidas então podem ser amplificadas por replicação viral. Tradução do gene alvo pode resultar em acúmulo de grandes quantidades da proteína ou do polipeptídio de interesse em curto período de tempo.

[082] Em algumas modalidades, expressão transitória mediada por Agrobacterium pode produzir até cerca de 5 g ou mais da proteína alvo de interesse por kg de tecido da planta. Por exemplo, em algumas modalidades, até cerca de 4, 3, 2, 1 ou 0,5 g de proteína podem ser produzidos por kgde tecido da planta. Em alguns casos, pelo menos cerca de 20-500 mg, cerca de 50-500 mg, cerca de 50-200 mg ou cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190 ou cerca de 200, 250, 300, 350, 400, 450,500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,1500, 1750, 2000, 2500, 3000 mg ou mais de proteína alvopor kg de tecido da planta podem ser produzidos. Nota-se que, em alguns casos, o nível de expressão da proteína pode ser menor, de modo que cerca de 0.1 μg a 20 mg por kg de tecido da planta (p. ex., cerca de 0.1-10 μg, cerca de 1050 μg, cerca de 50-500 μg ou cerca de 500 μg para 1 mg por kg de tecido da planta) podem ser produzidos, particularmente no caso do polipeptídio PNGase F.

[083] Em algumas modalidades, esses níveis de expressãopodem ser conseguidos dentro de cerca de 6, 5, 4, 3 ou 2semanas de infiltração. Em alguns casos, tais níveis de expressão podem ser alcançados dentro de cerca de 10, 7, 5,4, 3, 2 dias, ou mesmo 1 dia, a partir de introdução doconstructo de expressão. Assim, o período de tempo a partir da introdução (p. ex., infiltração) até a coleta é menor que cerca de 2 semanas, 10 dias, 1 semana ou menos. Além disso, um aspecto muito atrativo dessas modalidades é que proteína pode ser produzida dentro de cerca de 8 semanas ou menos a partir da seleção da sequência de aminoácidos (mesmo com inclusão do tempo para estudos de expressão “preliminar”). Ademais, cada lote de proteína geralmente pode ser produzido dentro de cerca de 8 semanas, 6 semanas, 5 semanas ou menos. Especialistas no assunto perceberão que esses números podem variar até certo grau dependendo do tipo de planta usado. Os brotos, incluindo os de ervilhas, em sua maioria, irão situar-se dentro dos números fornecidos. Outros ajustes esperados serão evidentes para especialistas no assunto com base na biologia das plantas em particular utilizadas.

[084] Produtos de expressão de polinucleotídios podem ser isolados dos tecidos da planta que os expressa e podem ser formulados para seu uso pretendido (p. ex., como agentes farmacêuticos ou diagnósticos ou como reagentes). Em alguns casos, um produto de expressão pode ser formulado em conjunto com alguns ou com a totalidade dos tecidos da planta em que o produto é expresso.

[085] No caso de ser desejável isolar um produto de expressão de parte ou da totalidade do tecido da planta que o expressa, qualquer técnica de purificação disponível pode ser usada. Uma ampla variação de procedimentos de fracionamento e separação é descrita em, por exemplo, Scopes et al., Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed.; Janson et al., Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 1998, Springer-Verlag, NY, 1993; e Roe, Protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001. Frequentemente, pode ser útil conferir ao produto mais de cerca de 50% de pureza (p. ex., mais de cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza).

[086] No caso em que se queira formular o produto em conjunto com material vegetal, costuma ser desejável utilizar uma planta que não seja tóxica para o receptor relevante (p. ex., um ser humano ou outro animal). Tecidos de origem relevantes (p. ex., folhas) podem ser coletados e processados de acordo com técnicas conhecidas no assunto, com a devida consideração para manutenção da atividade do produto expresso. Em algumas modalidades, pode ser útil expressar o polinucleotídio em uma planta comestível (e, especificamente, em porções comestíveis da planta) de modo que o material subsequentemente possa ser consumido como alimento. Por exemplo, no caso em que o polinucleotídio codifica uma proteína relevante do ponto de vista nutricional ou uma proteína terapêutica que é ativa após liberação oral (quando apropriadamente formulada), pode ser útil produzir a proteína em uma porção comestível da planta e formular o polinucleotídio expresso para liberação oral associado a parte ou à totalidade do material da planta com o qual o polinucleotídio foi expresso.

[087] No caso em que o polinucleotídio codifica um componente de vacina, o componente pode ser formulado de acordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, um componente de vacina pode ser formulado em associação a um ou mais materiais transportadores orgânicos ou inorgânicos, líquidos ou sólidos, farmaceuticamente apropriados. Um componente de vacina produzido conforme descrito aqui pode ser empregado em formas de apresentação tais como comprimidos, cápsulas, trociscos, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas de gel, pílulas, comprimidos revestidos, cremes, unguentos, aerossóis, embalagens de pó, soluções líquidas, solventes, diluentes, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes espessantes e emulsificantes, conservantes e agentes de ligação sólidos, contanto que a atividade biológica da proteína não seja destruída por essa forma de apresentação.

[088] Em geral, essas composições podem incluir qualquer uma ou mais de uma variedade de transportadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis ou uma combinação deles. Transportadores, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis úteis incluem, por exemplo, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e o equivalente, que são compatíveis com administração farmacêutica. Materiais ilustrativos são mostrados a seguir. Nota-se que composições de vacinas podem incluir um ou mais adjuvantes para intensificar a imunogenicidade da vacina quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, uma composição de vacina pode incluir um adjuvante tal como, sem limitação, extratos de Quillaja saponaria (QS; incluindo subfrações purificadas de QS de valor alimentar como Quil A e QS-21), sulfato de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, MF59, Malp2, adjuvante de Freund incompleto, adjuvante de Freund completo e lipídio A monofosforílico 3-O-desacilado (3D- MPL). Outros adjuvantes ilustrativos incluem oligonucleotídios imunomoduladores, como sequências CpG não metiladas conforme descrito em WO 96/02555. Combinação de diferentes adjuvantes, incluindo aqueles mencionados aqui, também são propostas. Por exemplo, QS-21 pode ser formulada em conjunto com 3D-MPL, a saber, numa proporção de QS- 21:3D-MPL da ordem de 1:10 a 10:1; 1:5 a 5:1; ou substancialmente 1:1. Doses de extratos purificados de QS apropriadas para uso em uma formulação de vacina humana em geral são de 0.01 mg a 10 mg por quilograma de peso corporal.

[089] No caso em que o polinucleotídio codifica um agente terapêutico, o agente pode ser formulado de acordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um produto farmaceuticamente ativo pode ser formulada juntamente com um ou mais materiais transportadores orgânicos ou inorgânicos, líquidos ou sólidos, farmaceuticamente adequados. Um produto farmaceuticamente ativo produzido pode ser empregado em formas de apresentação do tipo comprimidos, cápsulas, trociscos, dispersões, suspensões, soluções, cremes, unguentos, aerossóis, embalagens de pó, soluções líquidas, solventes, diluentes, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes espessantes e emulsificantes, conservantes e agentes de ligação sólida, contanto que a atividade biológica do produto não seja destruída por tal forma de apresentação.

[090] Materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, açúcares como lactose, glicose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes como gordura de cacau e ceras para supositórios; óleos como óleo de amendoim, óleo da semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis como propilenoglicol; ésteres como oleato etílico e laurato etílico; ágar; agentes de tamponamento como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirógeno; salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; e soluções de tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes não tóxicos compatíveis (p. ex., laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio), agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes de fragrância, conservantes e antioxidantes, de acordo com a decisão do formulador (ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975). Por exemplo, um produto de expressão de polinucleotídio pode ser fornecido como uma composição farmacêutica por meio de mistura, granulação, fabricação em drágeas, dissolução, liofilização ou processos similares convencionais.

[091] Em algumas modalidades, o efeito de uma preparação farmacêutica pode ser prolongado por retardo na absorção do produto farmaceuticamente ativo (p. ex., proteína). Por exemplo, a absorção de um produto que é injetado por via subcutânea ou intramuscular pode ser realizada usando-se uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com pouca solubilidade aquosa. A taxa de absorção do produto então depende de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho e da forma. Alternativamente, retardo na absorção de um produto administrado por via parenteral pode ser realizado por dissolução ou suspensão do produto em um veículo oleoso. Formas injetáveis de depósito são preparadas por formação de matrizes de microcápsulas da proteína em polímeros biodegradáveis como polilactida-poliglicolida. Dependendo da proporção entre o produto e o polímero e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis de depósito podem ser preparadas por aprisionamento do produto em lipossomos ou microemulsões, que são compatíveis com tecidos corporais.

[092] Preparações de produtos farmaceuticamente ativos administradas por via entérica podem ser introduzidas na forma sólida, semissólida, de suspensão ou de emulsão e podem ser compostas com qualquer transportador farmaceuticamente aceitável (p. ex., água, agentes de suspensão e agentes emulsificantes). Um produto de expressão também pode ser administrado por meio de bombas ou formas de liberação continua, especialmente quando administrado como uma medida preventiva, ou seja, para impedir o desenvolvimento de doença em um indivíduo ou para melhorar ou retardar uma doença já estabelecida.

[093] Produtos farmaceuticamente ativos, opcionalmente em conjunto com tecidos de origem vegetal, podem ser particularmente bem apropriados para administração oral como composições farmacêuticas. Materiais de origem vegetal coletados podem ser processados por qualquer uma de uma variedade de maneiras (p. ex., dessecação ao ar, congelamento-dessecação ou extração), dependendo das propriedades do produto terapêutico desejado e de sua forma desejada. Em algumas modalidades, tais composições podem ser ingeridas por via oral isoladamente ou ingeridas juntamente com alimento ou bebida. Composições para administração oral podem incluir plantas transfectadas; extrações de plantas transfectadas; e proteínas purificadas de plantas transfectadas fornecidas como pós secos, gêneros alimentícios, solventes aquosos e não aquosos, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não aquosos incluem, sem limitação, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, óleo de peixe e ésteres orgânicos injetáveis. Transportadores aquosos incluem água, soluções de água e álcool, emulsões ou suspensões, incluindo veículos parenterais em meio salino ou tamponado compreendendo solução de cloreto de sódio, solução de dextrose de Ringer, dextrose mais solução de cloreto de sódio, solução de Ringer contendo lactose e óleos fixados. Exemplos de pós secos incluem qualquer um da biomassa da planta transfectada que tenha sido dessecado (p. ex., por congelamento-dessecação, dessecação ao ar ou dessecação por aspersão). Por exemplo, uma planta pode ser dessecada ao ar mediante sua colocação em um dessecador de ar a cerca de 120 graus Fahrenheit até que a biomassa contenha menos de cerca de 5% de umidade em peso. A planta dessecada pode ser armazenada por processamento adicional como um sólido total ou pode ser ainda processada por trituração até uma malhagem desejada. Alternativamente, processo de congelamento-dessecação pode ser usado para produtos que são sensíveis a dessecamento por ar. Os produtos podem ser congelados-dessecados colocando-os em um dessecador a vácuo e submetendo-os a dessecação e congelamento sob vácuo até que a biomassa contenha menos de cerca de 5% de umidade em peso. O material dessecado pode ser ainda processa conforme descrito aqui.

[094] Outro método que pode ser usado para se obter produtos farmaceuticamente ativos expressos em planta consiste em extração. Plantas transfectadas podem ser extraídas e removidas dos produtos desejados a partir de biomassa residual, aumentando portanto a concentração e a pureza do produto. Plantas podem ser extraídas em uma solução tamponada.

[095] Por exemplo, plantas coletadas frescas podem ser transferidas em uma proporção de um para um em peso em uma quantidade de água gelada que foi tamponada com, por exemplo, tampão de fosfato. Inibidores da protease também podem ser adicionados. As plantas podem ser desintegradas por mistura ou trituração vigorosa enquanto suspensas na solução tampão, e a biomassa extraída pode ser removida por filtração ou centrifugação. O produto polipeptídico conduzido em solução pode ser ainda purificado por etapas adicionais ou pode ser convertido em um pó seco por congelamento-dessecação ou precipitação. A extração pode também ser realizada por compressão em uma prensa ou por esmagamento à medida que as plantas são passadas em cilindros de rolamento estreitamente espaçados. Os fluidos expressos de plantas esmagadas podem ser coletados e processados de acordo com métodos conhecidos no assunto. Extração por compressão permite a liberação dos produtos em uma forma mais concentrada, mas o rendimento total do produto pode ser menor do que o rendimento alcançado quando o produto é extraído em solução.

[096] Preparações de proteínas (p. ex., extrações, pós, preparações dessecadas e produtos proteicos purificados) também podem estar na forma encapsulada com ou sem um ou mais excipientes conforme observado acima. Formas de apresentação sólida do tipo tabletes, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e coberturas externas tais como revestimentos entéricos, revestimentos de liberação controlada e outrosrevestimentos bem conhecidos no campo de formulação farmacêutica. O produto ativo em tais formas de apresentação sólidas pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte como sacarose, lactose ou amido. Essas formas de apresentação também podem incluir substâncias adicionais à exceção de diluentes inertes - por exemplo, lubrificantes do processo de produção de comprimidos e outros auxiliares do processo de produção de comprimidos tais como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de apresentação podem também compreender agentes de tamponamento e/ou agentes de opacificação e podem ser de uma composição de tal modo que libere o(s) ingrediente(s) ativo(s) apenas, ou preferencialmente, em determinada parte do trato intestinal, por exemplo. Exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.

[097] As composições farmacêuticas podem seradministradas de modo terapêutico ou profilático. Em algumas modalidades, uma composição pode ser usada para tratar ou evitar uma doença. Por exemplo, qualquer indivíduo acometido de uma doença ou que está em risco de desenvolver uma doença pode ser tratado. Será compreendido que um indivíduo pode ser considerado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnosticado com nenhum sintoma da doença. Por exemplo, se o indivíduo tiver um marcador genético particular identificado como em associação a risco aumentado de desenvolvimento de determinada doença, esse indivíduo será considerado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se membros da família de um indivíduo tiverem sido diagnosticados com determinada doença, como câncer, o indivíduo pode ser considerado em risco de desenvolver essa doença.

[098] Formas de apresentação líquidas para administração oral incluem, mas não se limitam a, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas de apresentação líquidas podem conter diluentes inertes comumente usados no assunto como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato etílico, acetato etílico, álcool benzílico, benzoato benzílico, propilenoglicol, 1,3- butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, de amendoim, de milho, de germe de trigo, de oliva, de rícino e de sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitan e respectivas misturas. Além de diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes de umidificação, emulsificantes e agentes de suspensão, adoçantes, aromatizantes e agentes de fragrância.

[099] Composições para administração retal ou vaginal podem ser supositórios, que podem ser preparados por mistura de uma composição com um ou mais excipientes ou transportadores não irritantes apropriados como gordura de cacau, polietilenoglicol ou uma cera para supositório que são sólidos em temperatura ambiente mas líquidos em temperatura corporal e, portanto, derretem-se no reto ou na cavidade vaginal e liberam a proteína ativa.

[100] Formas de apresentação para administração tópica ou transdérmica de uma composição farmacêutica incluem pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, aerossóis, inalantes ou emplastros. O produto ativo, ou sua preparação, é administrado em condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários conforme pode ser requerido. Também se propõe que formulações oftálmicas, gotas otológicas e gotas oculares estejam incluídas dentro do alcance deste documento. Além disso, este documento propõe o uso de emplastros transdérmicos, que podem proporcionar liberação controlada de uma proteína farmaceuticamente ativa para o corpo. Essas formas de apresentação podem ser preparadas por suspensão ou dispersão do produto farmaceuticamente ativo no meio apropriado. Promotores de absorção podem também ser usados para aumentar o fluxo da proteína farmaceuticamente ativa através da pele. A taxa pode ser controlada tanto por fornecimento de uma membrana de controle da taxa quanto por dispersão da proteína farmaceuticamente ativa em uma matriz de polímero ou gel.

[101] As composições em geral são administradas em quantidades e por duração de tempo de acordo com o necessário para se alcançar o resultado desejado. Em algumas modalidades, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de uma composição farmacêutica é uma quantidade eficaz para tratamento, atenuação ou prevenção de uma doença em um hospedeiro. Assim, a “quantidade eficaz para tratar, atenuar ou prevenir doença”, conforme se usa aqui, refere-se a uma quantidade não tóxica mas suficiente da composição farmacêutica para tratar, atenuar ou prevenir doença em qualquer hospedeiro.

[102] A quantidade exata necessária irá variar de um indivíduo para outro, dependendo da espécie, da idade e da condição geral do indivíduo, do estágio da doença, da mistura farmacêutica particular, de seu modo de administração e do equivalente. Plantas infectadas e/ou suas preparações proteicas são preferivelmente formuladas na forma unitária de dosagem para proporcionar facilidade de administração e uniformidade da dose. A expressão “forma unitária de dosagem”, conforme se usa aqui, refere-se a uma unidade fisicamente distinta do produto de expressão do polinucleotídio farmaceuticamente ativo apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreensível, entretanto, que o uso diário total de uma composição é preferivelmente decidido por um médico atendente dentro do alcance do julgamento médico consistente. O nível da dose terapeuticamente eficaz específica para qualquer paciente ou organismo em particular pode depender de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio em tratamento e a gravidade do distúrbio; a atividade do composto específico empregado; a composição específica empregada; a idade, o peso corporal, o estado de saúde de modo geral, o sexo do paciente, a dieta do paciente, a condição farmacocinética do paciente, o tempo de administração, a via de administração e a taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou concomitantemente com o composto específico empregado; e fatores equivalentes bem conhecidos nos campos médicos.

[103] A invenção será ainda descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o alcance da invenção descrito nas reivindicações.

EXEMPLOSExemplo 1 - Materiais e Métodos

[104] Clonagem e expressão de PNGase F em N. benthamiana. O gene de PNGase F foi otimizado para expressão em N. benthamiana (para otimização do códon, estabilidade do mRNA, nocaute da sequência de desestabilização do RNA etc.) e sintetizado por GENEART AG (Regensburg, Alemanha) com sítios PacI (3’-término) e XhoI (3’-término, após parada do códon) de acompanhamento. Para expressar PNGase em plantas N. benthamiana usando-se um sistema de expressão transitória, nucleotídios que codificam o peptídio de sinal (aminoácidos 1-40) foram removidos da sequência de PNGase F e nucleotídios que codificam o peptídio de sinal de PR-1 do tabaco (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA; SEQ ID NO:3) foram adicionados à extremidade 5’ da sequência de codificação. Sequências que codificam um sinal de retenção de ER (KDEL; SEQ ID NO:5) e um marcador de afinidade do epítopo FLAG (SEQ ID NO:4) foram adicionados à extremidade 3’. A sequência resultante foi inserida no vetor de lançamento pGRD4 [Roy et al. (2010) Virol. 405(1):93-99] ou no vetor de expressão binária pBIl2l [Chen et al. (2003) Mol. Breeding 11:287-293] usando-se os locais da enzima de restrição PacI-XhoI para se obter pGRD4- e pBI-PNGase F, respectivamente. pGRD4- e pBI-PNGase F (juntamente com pSoup para pGRD4-PNGase F, que fornecem funções de replicação em trans [Hellens et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42(6):819-832], foram então introduzidos na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens. A cepa bacteriana resultante foi cultivada em meio de BBL (10 g/L de hidrolisado de soja, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 50 mg/L de canamicina) por uma noite a 28°C. Bactérias foram introduzidas por infiltração manual nas plantas N. benthamiana com 6 semanas de vida que cresceram no solo. Cinco, seis e sete dias após infiltração, tecido das folhas foi coletado e homogeneizado usando-se um misturador de esferas. Os extratos foram clareados por centrifugação (13.000xg) e usados para análises posteriores.

[105] Purificação de PNGase F: PNGase F foi purificado usando-se cromatografia de coluna para anticorpo anti-FLAG com o objetivo de confirmar sua atividade de desglicosilação in vitro. Oito gramas de folhas congeladas foram fixados em 24 mL de tampão de TBS (50 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM de NaCl) usando-se um pilão e triturador. Fragmentos das plantas foram removidos por filtração através de Miracloth (Calciochem, San Diego, CA) seguida por centrifugação a 13.000xg por 10 minutos e então filtração através de um filtro de seringa de 0.22 mícrons (ACROS organics). Uma coluna contendo 1 mL de gel de afinidade Anti-FLAG M21 (Cat. No. A2220, Sigma, St. Louis, MO) foi preparada de acordo com as instruções do fabricante, e 24 ml de sobrenadante claro foram misturados com 1 ml do gel e submetidos a rotação a 4°C por 1 hora, após o que a mistura total foi retornada para a coluna e a coluna foi lavada com 20 volumes de tampão de TBS. Proteínas ligadas foram eluídas usando-se 0.1 M de tampão de glicina, pH de 3.5, em 6 tubos com volume de 500 μL, e 5 μL de 1 M de Tris-Cl foram imediatamente adicionados a cada tubo para neutralizar o tampão de glicina.

[106] Capacidade de desglicosilação do PNGase F purificado de N. benthamiana: Para testar a capacidade de desglicosilação do PNGase F purificado in vitro e também comparar a extensão de desglicosilação de 48F1 in vitro e in vivo, diferentes quantidades (10-200 ng) de PNGase F purificado foram incubadas com Pfs48F1 (expressa em, e purificada de, N. benthamiana) a 37°C por 1 hora em tampão de PBS, e 0.75 μg de Pfs48F1 não desglicosilada e glicosilada juntamente com Pfs48F1 desglicosilada in vivo foi analisado por Western blotting. Para testar se PNGase F expresso desglicosilou proteínas de N. benthamiana, proteínas totais de N. benthamiana controles (não transformada) e N. benthamiana transformada com PNGase F bacteriano, PNGase F+p19 (supressor de silenciamento do RNA da planta) e p19, foram comparadas por SDS-PAGE. Punções (20 mg cada) de cada folha foram fixadas usando-se um misturador de esferas (Zymo research) a 4°C por 2 minutos, e, após duas etapas de centrifugação a 13.00xg por 10 minutos, as amostras foram fervidas com tampão de amostra para SDS IX e 10 μL de cada amostra foram carregados em SDS-PAGE.

[107] Coexpressão de Pfs48F1, PA de B. Anthracis e anticorpo contra PA (C) de B. Anthracis com PNGase F: Para coexpressar Pfs48F1, PA de B. Anthracis e anticorpo contra PA (C) de B. Anthracis com PNGase F, os constructos de pBI-Pfs48F1/pGRD4-PNGase F, pGRD4-PA83-1/pBI-PNGase F e pBI- PA/pGRD4-PNGase F foram usados para infiltração em plantasde N. benthamiana. As sequências de Pfs48F1 (aminoácidos 28-401, GENBANK® accession No. EU366251), PA de B. Anthracis (aminoácidos 30-764, GENBANK® accession No. AAA22637) e HC e LC de anticorpo anti-PA [Mett et al. (2011) Hum. Vaccin. 7:183-190] foram inseridos no vetor de lançamento (pGRD4) ou no vetor de expressão binária pBI usando-se os sítios PacI e XhoI da enzima de restrição. Transformação de Agrobacterium, infiltração da planta e extração da proteína da folha foram realizadas conforme descrito abaixo.

[108] Análise por Western blot: Amostras de proteínas de N. benthamiana infiltrada foram preparadas como se segue. Amostras da folha foram obtidas em 5, 6 e 7 DPI eforam fixadas em tampão de extração para TSP, tampão de extração com 0.5% de Triton X-100 para TSPT e tampão de extração com tampão da amostra de sulfato dodecílico de sódio IX (SDS) para TP. Essas amostras proteicas foram centrifugadas a 13.000xg por 10 minutos para remover fragmentos insolúveis e foram separadas em géis de SDS- poliacrilamida a 10%, transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (Millipore; Billerica, MA) e bloqueadas com I-block a 5% (Applied Biosystems; Carlsbad, CA). Para detecção de Pfs48F1, a membrana foi incubada com um anticorpo primário contra poli-His (Roche Applied Science; Indianapolis, IN), seguido por anticorpoanticamundongo de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP). Para detecção de PNGase F, anticorpo monoclonal anti-FLAG (Cat. No. F2555; Sigma) produzido em coelho foi usado como o anticorpo primário, e IgG anticoelho conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) foi usada como o anticorpo secundário. Proteínas reagindo com os anticorpos anti-His/FLAG foram visualizadas usando-se SUPERSIGNAL® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology; Rockford, IL). A imagem foi obtida usando-se o programa GeneSnap em um GENEGNOMETM equantificada usando-se o programa Gene Tools (Syngene; Frederick, MD).

[109] Construção do plasmídio para expressão de Pfs48F1 dirigida a cloroplasto: Um gene que codifica uma sequência de 38 aminoácidos(MLIAGPQAFPGAIAAPISYAYAVKGRKPRFFQTAKGSVRI; SEQ ID NO:6) que abrange o domínio do braço da Proteína de Revestimento do Vírus da Necrose do Pepino, que comprovadamente funciona como um peptídio transitório de cloroplasto [Xiang et al. (2006) J. Virol. 80(16):7952-64] em plantas infectadas (N. benthamiana) teve o códon otimizado para N. benthamiana e montado em dois oligos:

[110] 1) 5’-AGTCTTAATTAAATGCTTATTGCTCACCCACAAGCTTTCCCAGGAGCTATTGCTGCTCC AATTTCTTACGCTACGCTG-3’ ( SEQ ID NO:7): e

[111] 2) 5’-GAGTCCGTCTCAAATCCTCACAGATCCCTTAGCAGTCTGGAACCTTGCCTTCCTACCCT TCACAGCGTAAGCGTAAGAAA-3’ (SEQ ID NO:8). Foi realizada amplificação por PCR usando-se promotores 5’-AGTCttaattaaATGCTTATTGCTCACCCAC-3’ (para a frente) (SEQ ID NO:9) e 5’-gagtccgtctcaAATCCTCACAGAT-3’ (reverso) (SEQ ID NO:10). Os locais de restrição PacI e BsmBI estão sublinhados. Foi realizada amplificação por PCR usando-se Phusion Flash High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs) com 35 ciclos de desnaturação a 98°C por 1 segundo, fusão a 58°C por 5 segundos e extensão a 72°C por 7 segundos, com uma extensão final a 72°C por 60 segundos, empregando-se os oligos descritos acima como o molde de DNA. O produto da PCR foi digerido com PacI e BsmBI paraclonagem posterior. Amplificação do gene de Pfs48F1 foi realizada usando-se promotores 5’-gagtccgtctcaGATTAACAACGATTTCTGCAAGC-3’ (para a frente) (SEQ ID NO:11) e 5’-gagtcctcgagTCAGTGGTGGTGATGGTGATGA-3’(reverso) (SEQ ID NO:12) e pGRD4-48F1 como molde do DNA. Os locais de restrição BsmBI e XhoI estão sublinhados. PCR foirealizada usando-se Phusion Flash High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, cat. No. F-548L) com 35 ciclos de desnaturação a 98°C por 10 segundos, fusão a 65°C por 5 segundos e extensão a 72°C por 15 segundos, com uma extensão final a 72°C por 60 segundos. O produto da PCR foi digerido com BsmBI e XhoI. Produtos da PCR foram clonadosno vetor pGRD4 digerido com PacI e XhoI para gerar o plasmídio de expressão Arm-Pfs48F1. A proteína foi introduzida e expressa em plantas de N. benthamiana conforme descrito abaixo.

[112] Purificação de Pfs48F1 desglicosilada in vivo: Para purificação da proteína recombinante Pfs48F1 desglicosilada de plantas de N. benthamiana, 50 g dematerial da planta, infiltrados com pBI-Pfs48F1 e pGRD4-PNGase F, foram homogeneizados em 150 ml de tampão de extração e incubados com 0.5% de Triton (concentração final) por 20 minutos a 4°C com agitação.Após incubação, o lisado foi centrifugado a 48.000 g por 40 minutos, e extrato bruto foi filtrado através de Miracloth, carregado em 5 mL de His Trap FF (Cat. No. 17-5255-01, GE Healthcare) e lavado com 15 volumes de 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 8.0, 0.5 M de NaCl e 20 mM deimidazol. As proteínas foram eluídas com 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 8.0, 0.5 M de NaCl e 20 mM deimidazol. A fração eluída foi concentrada e dialisada em PBS, pH de 7.5.

[113] Purificação de Pfs48F1 de plantas N. benthamiana:Para purificação da proteína recombinante Pfs48F1 de plantas N. benthamiana, 750 g de material da planta foramhomogeneizados em 2.25 L de tampão de extração e incubados com 0.5% de Triton (concentração final) por 20 minutos a 4°C com agitação. Após incubação, o lisado foi centrifugadoa 48.000 g por 40 minutos, e extrato bruto foi filtrado através de Miracloth e carregado em uma coluna com 70 mL deChelating Sepharose Big Beads carregado com Ni. A coluna foi lavada com 15 volumes de 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 8.0, 0.5 M de NaCl, 20 mM de imidazol eglicerol a 20%. As proteínas foram eluídas com 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 8.0, 0.5 M de NaCl, 300mM de imidazol e glicerol a 20%. A fração proteica eluída foi dialisada primeiro em 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6.5, 50 mM de NaCl, 10 mM de EDTA e glicerol a 10% e então em 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6.5, e glicerol a 10%. Após centrifugação com velocidade reduzida, a amostra dialisada foi carregada em 5 mL de Capto Q, equilibrada com 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6.5 e glicerol a 10%. Proteínas foram eluídas com tampão de fosfato de sódio, pH de 6.5, glicerol a 10% e 600 mM de NaCl. A fração eluída foi concentrada até 2.6 mg/mL e dialisada em PBS, pH de 7.5.

[114] Análise comparativa por ELISA: Detecção dasformas desglicosilada e glicosilada de Pfs48F1 por mAbs de rato desenvolvidos contra vários epítopos (I, IIb, III e V) da proteína de superfície Pfs48F1 de Plasmodium falciparum [Outchkourov et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:17148-17156; e Roeffen et al. (2001) Exp. Parasitol. 97:45-49] foi avaliada usando-se ELISA. Placas de ELISA (placas MaxiSorp com 96 alvéolos [NUNC, Rochester, NY])foram revestidas com um mAB anti-4xHis (Qiagen Cat. No. 34670; Valencia, CA) em PBS numa proporção de 50 μL/alvéolo (5 μg/mL) por uma noitea 4°C. Após bloqueio com I-block a 0.5% em PBS, quantidadesdesejadas (1-1000 ng) das formas desglicosilada e glicosilada de Pfs48F1 foram adicionadas e incubadas por 2horas. Após lavagem das placas, 50 μL (2 μg/mL em I-block) de mAbs desenvolvidos contra Pfs48/45 foram adicionados eincubados por 2 horas. Anticorpos ligados foram detectados usando-se um anticorpo monoclonal antirrato conjugado com HRP (1:25.000 em I-block) e visualizados empregando-se o- fenilenodiamina (OPD) como um substrato, em um comprimento de onda de 490 nm.

[115] Análise de afinidade de ligação de mAb V a variantes de Pfs48F1 glicosiladas e desglicosiladas: A Kd de ligação do mAb V a variantes de Pfs48F1 desglicosiladase glicosiladas avaliada usando-se o instrumento KinExA 3200[Sapydine, Boise, ID; Blake et al. (1999) Anal. Biochem. 272:123-134] por determinação da quantidade de anticorpo livre que permanece em solução após equilibração com o par de ligação a Pfs48F1 foi alcançada. As concentrações de mAb V foram mantidas constantes enquanto a proteína Pfs48F1 glicosilada ou desglicosilada selecionada foi diluída em série. mAb V foi misturado com Pfs48F1 glicosilada a 107 nM, 69 nM e 22 nM; com Pfs48F1 desglicosilada a 42.4 nM, 16.2 nM e 4 nM; e com Pfs48F1 desglicosilada in vivo a 42.4nM, 10.6 nM e 4 nM. O tampão de condução foi 1x PBSD, pH de115.5, com azida sódica a 0.02% como conservante. As amostrase o anticorpo secundário foram diluídos usando-se tampão de condução suplementado com 1 mg/mL de albumina sérica bovina(BSA). O anticorpo secundário foi antirrato conjugado de cabra conjugado com Dylight 649 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) usado a 0.5 μg/mL. Pfs48F1 tratada com PNGase foi usada como o reagente de revestimento para o conjunto de microesferas em fluxo (microesferas PMMA, Sapydine) em todos os experimentos. A taxa de fluxo para todas as amostras e para o anticorpo de marcação foi de 0.25 mL/min. O volume da amostra variou de 0.35-3.0 mL.

[116] Os dados de titulação resultantes de três diferentes concentrações do anticorpo equilibradas com cada Pfs48F1 foram ajustados para um modelo de ligação global de 1:1 incluindo o programa KinExA (versão 3.1.2). Os dados gerados para mAb V e Pfs48F1 foram ajustados para o modelo de ligação 1:1 padrão em que Kd, concentração no local de ligação ativo (ABC) e sinal máximo e mínimo foram determinados. Neste caso, a concentração de Pfs48F1 (glicosilada) foi determinada por densitometria versus BSA usando-se SDS-PAGE corada com Coomassie. Os dados gerados para mAb V com as versões desglicosiladas de Pfs48F1 foram ajustados para o mesmo modelo de ligação 1:1, mas usando-se um modelo de concentração de antígeno [Xie et al. (2005) J. Immunol. Meth. 304:1-14]. Nesse modelo, a Kd e os parâmetros de sinal foram determinados a partir do ajuste bem como de LCM. LCM relaciona-se com uma concentração desconhecida do ligante em relação à ABC (do experimento com mAb V e Pfs48F1), que permite comparação direta de dados de ligação quando a concentração de antígeno é menos bem caracterizada ou desconhecida. Neste caso, a concentração da Pfs48F1 desglicosilada in vivo foi estimada usando-se Western blotting, de modo que a análise de ligação foi padronizada para a concentração de Pfs48F1 glicosilada.

[117] Análise quantitativa de inibição de mAb III por variantes de Pfs48F1 glicosiladas e desglicosiladas: Análise quantitativa de inibição de mAb III por variantes de Pfs48F1 (glicosiladas e desglicosiladas por PNGase F in vitro e in vivo) foi realizada usando-se um instrumento KinExA 3200. Soluções contendo mAb III em concentrações proteicas no sítio de ligação de 140 nM e nominais de 70 nM e uma das variantes de Pfs48 (glicosilada ou desglicosilada por PNGase F) em uma concentração final de 250 nM foram preparadas e incubadas, e a quantidade de mAb livre em cada mistura da reação foi determinada usando-se o instrumento KinExA. A concentração inicial de cada variante de Pfs48F1 na mistura da reação foi baseada no valor de LCM determinado nos experimentos de mAb V. O sinal gerado por mAb II na solução sem Pfs48F1 foi considerado como 100%.

Exemplo 2 - Expressão de PNGase F bacteriano em N.benthamiana

[118] A sequência de codificação de PNGase F (314 aminoácidos representando o comprimento total, proteína cataliticamente ativa sem a sequência de sinal) foi otimizada (Figura 1), clonada no vetor de expressão pGRD4 e expressa conforme descrito no Exemplo 1. O nível médio deexpressão de PNGase F foi de aproximadamente 150 mg/kg de biomassa fresca. Expressão de PNGase F foi confirmada poranálise de imunotransferência usando-se anticorpomonoclonal anti-FLAG (ver Figura 2A).

Exemplo 3 - Coexpressão de Pfs48F com PNGase bacteriano

[119] Vacina antimalária com Pfs48F1E candidata foi transitoriamente coexpressa com PNGase F bacteriano em N. benthamiana para testar se oligossacarídios N-ligados seriam clivados de Pfs48F1 em um ambiente in vivo. PNGase F foi expresso com um epítopo FLAG seguido por um sinal de retenção no C-terminal, KDEL (SEQ ID NO:5). Os resultados são apresentados na Figura 2. PNGase F coexpresso foi ativo in vivo e clivado com sucesso nos oligossacarídios N- ligados de Pfs48F1. Pfs48F1 produzida após digestão de PNGase F migrou similarmente para Pfs48F1 que foi desglicosilada enzimaticamente usando-se uma fonte comercial de PNGase F (New England Biolabs) in vitro (Figura 2B). O nível de expressão de Pfs48F1 desglicosilada foi de cerca de 50 mg/kg quando Pfs48F1 (pGRD4-PNGase F) foi coexpressa com PNGase F (pBIl2l-Pfs48F!). A solubilidade de Pfs48F1 desglicosilada foi de cerca de 95 por cento. Expressão de PNGase F foi confirmada por análise de imunotransferência (Fig. 2A).

Exemplo 4 - Coexpressão de antígeno protetor (PA) deBacillus anthracis e anticorpo contra PA de Bacillusanthracis (C) com PNGase F

[120] A estratégia de desglicosilação foi aplicada a duas outras glicoproteínas - antígeno protetor (PA) de B. anthracis e anticorpo contra PA de B. anthracis. Resultados da coexpressão são apresentados na Figura 4. A troca de mobilidade foi observada na cadeia pesada (HC), que possui um local de glicosilação, mas não houve troca na cadeia leve (LC) que não possui locais de glicosilação. Tais resultados, junto a coexpressão com Pfs48F1, indicaram que PNGase F clivou com sucesso os glicanos N-ligados de todas as glicoproteínas testadas e que essa estratégia pode ser usada para produzir proteínas e anticorpos terapêuticos numa forma desglicosilada em N. benthamiana usando-se um sistema de expressão transitória.

Exemplo 5 - Purificação de PNGase F de N. benthamiana

[121] Para confirmar atividade in vitro de PNGase F, a enzima recombinante foi purificada de N. benthamiana usando-se uma coluna de agarose anti-FLAG conforme descrito no Exemplo 1. A proteína PNGase F purificada foi analisada por SDS-PAGE (Figura 3A). Coloração com Coomassie mostrou que PNGase purificado exibiu alto nível de homogeneidade. A capacidade de desglicosilação do PNGase F purificado foi testada usando-se glicoproteína Pfs48F1E, expressa em N. benthamiana. Os resultados são apresentados na Figura 3B. PNGase F da planta purificado foi capaz de desglicosilar Pfs48F1 in vitro, e o grau de desglicosilação foi aumentado por aumento da quantidade de PNGase purificado. A desglicosilação de Pfs48F1 por PNGase F purificado produzido pela planta e por PNGase F comercial (New England Biolabs; Ipswich) foi comparada com a desglicosilação de Pfs48F1 in vivo por PNGase F coexpresso.

Exemplo 6 - Avaliação de antigenicidade de formas desglicosilada e glicosilada de Pfs48F1

[122] Para avaliar antigenicidade (capacidade de atrair anticorpo) de formas desglicosilada e glicosilada de Pfs48F1, as duas formas de proteínas são testadas usando-se ELISA conforme mencionado no Exemplo 1. Quatro mAbs que detectam epítopos I, IIb, II e V da proteína de superfície de P. falciparum foram usados no teste. Os resultados são mostrados nas Figuras 5A, 5B, 5C e 5D, respectivamente. Em comparação com a forma glicosilada (diamantes), Pfs48F1 desglicosilada (quadrados) foi mais facilmente identificada em três de quatro mAbs. A detecção de mAb IIb (mAb IIb; Figura 5B) mostrou apenas sinal de nível residual com a forma glicosilada de Pfs48F1, e a correlativa desglicosilada não mostra melhor afinidade. Isto sugere que a detecção inadequada do epítopo por mAb IIb decorre de razões à exceção de glicosilação aberrante da proteína Pfs48F1.

Exemplo 7 - Afinidade de ligação de mAb V a Pfs48F1 produzida na planta

[123] O mAb desenvolvido contra o epítopo V de Pfs48F1 foi selecionado para se avaliar quantitativamente a afinidade de ligação do anticorpo a proteínas Pfs48F1 glicosiladas e desglicosiladas. As avaliações foram conduzidas conforme descrito no Exemplo 1. A Figura 6A ilustra resultados obtidos com Pfs48F1 glicosilada, em que o valor da Kd foi de 11.48 nM. Uma afinidade mais potente foi observada em Pfs48F1 desglicosilada in vitro, que mostrou um valor de Kd de 4.76 nM (Figura 6B). Pfs48F1 desglicosilada in vivo mostrou a atividade mais forte de ligação a mAb V, com um valor de Kd de 2.57 nM. Conforme notado na Figura 3B, a desglicosilação in vivo (2.a faixa da direita) foi mais eficaz em remover carboidratos do que tratamentos in vitro (2.a-6.a faixas da esquerda). Os resultados exibidos na Figura 6, combinados com os resultados exibidos na Figura 3B, mostraram que desglicosilação extensa de Pfs48F1 in vivo melhora ainda mais a afinidade de ligação da proteína a mAb V.

Exemplo 8 - Comparação de inibição qualitativa entre mAb III e variantes de Pfs48F1

[124] O efeito de glicosilação sobre a afinidade de ligação de Pfs48F1 a mAb III foi examinado conforme descrito no Exemplo 1. Com o nível do sinal de mAb não ligado estabelecido em 100%, a ligação de um ligante ao mAb resultará em “inibição” do sinal. A extensão de inibição do sinal pode, portanto, ser interpretada como uma mediada de afinidade de ligação. Quando adicionadas à solução de mAb II, todas as três variantes de Pfs48F1 resultaram em inibição do sinal conforme mostrado na Figura 7. A inibição mais forte de sinal foi observada quando o mAb foi misturado com Pfs48F1 desglicosilada in vivo. Esses resultados mostraram que desglicosilação in vivo resulta em afinidade de ligação mais forte e antigenicidade melhorada de Pfs48F1 em comparação com Pfs48F1 desglicosilada in vitro e Pfs48F1 glicosilada.

Exemplo 9 - Comparação com Pfs48F1 dirigida a cloroplastos

[125] Cloroplastos de plantas podem ser usados para produção de proteínas [Verma et al. (2008) Nature Protocols 3:739-758). O uso de cloroplastos de plantas, denominado Tecnologia de Transformação de Cloroplasto (CTT), pode produzir dobramento apropriado e ligação correta de proteínas a dissulfeto em grandes quantidades. Do mesmo modo que sistemas bacterianos de expressão, cloroplastos não glicosilam suas proteínas.

[126] Para comparar produtos obtidos por desglicosilação in vivo e CTT, Pfs48F1 foi expressa em células de origem vegetal usando-se um método convencional que desvia a glicosilação por direcionamento da proteína para o cloroplasto. Uma fusão de Pfs48F1 com um sinal direcionado para cloroplasto com 38 aminoácidos (Arm- Pfs48F1) foi expressa no citoplasma conforme explicado no Exemplo 1, e sua antigenicidade foi comparada com Pfs48F1 desglicosilada in vivo.

[127] Um Western blot de amostras da folha de N. benthamiana transformada para expressar Arm-Pfs48F1 mostrou que a proteína Arm-Pfs48F1 foi expressa com sucesso em plantas escolhidas como alvo e que uma porção significativa da Pfs48F1 expressa total foi encontrada na fração solúvel conforme detectado a partir das faixas de TSP (Figura 8). Análise comparativa por ELISA foi realizada usando-se Pfs48F1 desglicosilada in vivo e Arm-Pfs48F1 conforme explicado no Exemplo 1. A Figura 9 mostra resultados obtidos com mAb III (painel A) e com mAb 5 (painel B). Embora o método de escolha de cloroplasto como alvo impeça que Arm-Pfs48F1 seja glicosilada, a proteína resultante não exibiu um nível detectável de afinidade para os anticorpos.Por outro lado, Pfs48F1 desglicosilada in vivo exibiu afinidade para ambos os anticorpos, conforme evidenciado com base no aumento de sinal à medida que mais proteína foi adicionada à reação. Esses resultados mostraram que a desglicosilação de Pfs48F1 in vivo por PNGase F resultou em uma proteína que foi mais rapidamente reconhecida pelos anticorpos do que aquela de cloroplasto como alvo.OUTRAS MODALIDADES

[128] Deve ser compreensível que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição precedente destina-se a ilustrar e não a limitar o alcance da invenção, que é definido pelo alcance das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do objeto das reivindicações a seguir.

Claims

1. Método para geração de um polipeptídio desglicosilado de interesse caracterizado por compreender a produção de uma célula de origem vegetal que compreende:(a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio N-glicosidase F (PNGase F) bacteriano conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, em que a primeira sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídeo PNGase F é expresso transitoriamente; e(b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse, em que a segunda sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídio de interesse é expresso, e em que o polipeptídeo de interesse inclui um sítio de glicosilação,em que o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são co-expressos na célula de origem vegetal e o polipeptídeo PNGase F e o polipeptídeo de interesse incluem uma sequência de secreção de sinal, eem que, por ação do polipeptídio PNGase F, o polipeptídio de interesse é desglicosilado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo ácido nucleicos estão presentes no mesmo constructo de ácido nucleico.

3. Método para expressão de um polipeptídio PNGase F bacteriano ativo em uma célula de origem vegetal, caracterizado por compreender introduzir na célula de origem vegetal um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 que codifica o polipeptídeo PNGase F bacteriano, em que a sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor induzível de modo que, quando o promotor é ativado, o polipeptídeo PNGase F é transitoriamente expresso.

4. Sistema de expressão caracterizado por compreender:(a) um primeiro ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídio PNGase F bacteriano, em que a primeira sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o primeiro ácido nucleico é introduzido em uma célula de origem vegetal e o promotor é ativado, o polipeptídeo PNGase F é transitoriamente expresso; e(b) um segundo ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse, em que a segunda sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor de modo que, quando o segundo ácido nucleico é introduzido na célula de origem vegetal e o promotor é ativado, o polipeptídeo de interesse é expresso, em que o polipeptídeo de interesse contém um sítio de glicosilação, e em que o polipeptídeo PNGase F e o polipeptídeo de interesse incluem uma sequência de secreção de sinal.em que o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são co-expressos na célula de origem vegetal.