JP2019504638A - Endo hとの同時発現によってインビボn−脱グルコシル化組換えタンパク質の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
植物は、代替発現系として現われ、標的タンパク質を産生するために産業界および学術界でますます使用されている。しかしながら、タンパク質をグリコシル化する植物の能力は、N−グルコシル化を必要としないタンパク質にとって重要な制限であることができる。例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)タンパク質、またはヒト第XIII因子のA鎖は、N結合型グリカンを保有しないか、またはBacillus anthracisisの防御抗原(PA)は、糖タンパク質ではない;しかしながら、これらのタンパク質は、酵母、哺乳動物、または植物系における発現中に、異常にグリコシル化されることができる潜在的なN結合型グルコシル化部位を含み、エピトープの不正確/改変されたフォールディングおよび/またはマスキングのために機能性および免疫原性が低下する可能性がある。この問題を克服するために、本発明者らは、最近、一過性の発現植物と同時発現されることにより、インビボでのタンパク質の酵素的脱グルコシド化の戦略を開発し(W IPO特許出願WO/2012/170678)、これは、マラリアワクチン候補Pfs48/45の産生を可能にし、高い透過遮断(TB)活性を提供することができる(Mamedovら、2012年)。また、他の脱グルコシル化抗原は、グリコシル化形態と比較してよりも、マウスにおいて毒素中和抗体応答の有意に高いレベルを誘導した(Mamedovら、原稿が提出された)。PNGase F処理(インビボ脱グルコシド化)は、オリゴ糖をそのまま除去するが、NxS/T部位(配列)におけるアスパラギン(N)のアスパラギン酸(D)への脱アミド化による脱グルコシル化タンパク質におけるアミノ酸変化を引き起こす。この研究において、非N−グルコシル化形態の植物における標的タンパク質の産生のための戦略が開発されたが、得られる脱グルコシル化タンパク質のNxS/T部位のアミノ酸変化なしで、これは、植物またはネイティブ様の折り畳みを有する他の真核生物系の産生を提供することができる。したがって、一過性の発現系を使用して、植物におけるEndo−β−NアセチルグルコサミニダーゼH(Endo H)との同時発現によって組換えN−グルコシル化タンパク質のインビボ脱グルコシル化のための材料および方法が、本発明に記載される。植物における活性Endo Hを発現させる方法がまた提供される。
発明者らの以前の研究において、発明者らは、細菌のPNGase Fとの同時発現標的タンパク質によって、インビボで標的タンパク質の脱グルコシル化を実証した(Mamedov T. W0/2012/170678, 2012年;Mamedovら、2012年)。PNGase Fによる脱グルコシル化(インビボまたはインビトロ)は、オリゴ糖をインタクトに除去するが、NxS/T部位(配列)におけるアスパラギン(N)のアスパラギン酸(D)への脱アミド化によって、脱グリコシル化タンパク質でアミノ酸変化を引き起こす。この時点で、N結合グリカンのキトビオースコアの2つのGlcNAc残基の間を切断を触媒するEndo−β−N−アセチルグルコサミニダーゼH(Endo H)などの他の脱グリコシル化酵素は、アスパラギンに結合し(図1)、PNGase Fと反対に、Endo Hによる脱グリコシル化は、得られる脱グリコシド化タンパク質のNxS/T部位のアミノ酸配列に変更をもたらさない。Endo H処理は、脱グリコシル化タンパク質をもたらす場合のアミノ酸の変化を産生しないので、発明者は、Endo Hによって産生された脱グリコシド化タンパク質は、より自然なフォールディングを有し得し、したがって、同じたんぱく質のPNGase F脱グリコシル化形態と比較して、より良好な機能活性(免疫原性、受容体結合、タンパク質−抗体相互作用、酵素活性等)であることを仮定する。発明者は、Endo H切断は、アスパラギンに結合される1つのGlcNAc残基を残したまま、残りのモノサッカライドは電荷を与え、それによって、脱グリコシル化タンパク質の溶解性および安定性を増加させることも仮定した。
上記のように、PNGase F処理(インビボ脱グリコシル化)は、オリゴ糖をインタクトで除去するが、NxS/T部位(配列)におけるアスパラギンからアスパラギン酸への脱アミド化による脱グリコシル化タンパク質におけるアミノ酸変化を引き起こす。Endo H処理は、得られる脱グリコシル化タンパク質のNxS/T部位におけるアミノ酸変化をもたらさない。この時点で、Endo Hによって産生された脱グリコシル化タンパク質は、より自然なフォールディングを有し得、それによって、同じたんぱく質のPNGase F処理形態と比較して、より良い機能活性(免疫原性、受容体結合、タンパク質−抗体相互作用、酵素活性等)を有することを仮定した。Endo H切断は、アスパラギンに結合される1つのGlcNAc残基のままであるので、残りのモノサッカライドは、電荷を与え、それによって、脱グリコシル化タンパク質の溶解性および安定性を増加させ得ることも仮説が立てられた。この研究において、発明者は、植物の脱グリコシル化細菌酵素Endo Hの発現を初めて証明する。発明者はまた、N. benthamiana植物におけるインビボでのEndo Hによる標的タンパク質の脱グリコシル化を初めて証明する。発明者らは、組換え植物産生Endo Hisを完全にインビボで活性化し、PA83およびPfs48/45タンパク質からN結合型グリカンを成功裏に切断することを証明する。また、PA83とEndo Hの同時発現は、細菌PNGase Fによってインビボグリコシル化分子のサイズに類似したPA83の蓄積をもたらした。重要なことに、発明者らの予備の安定性分析の結果は、インビボ脱グリコシル化PA83におけるEndo Hは、特に昇温で、同じたんぱく質のグリコシル化またはPNGase F脱グリコシル化(インビボ)形態と比較して、より安定であるようであることを証明する。結論として、全てのこれらの結果は、Endo H同時発現戦略は、天然型のN. benthamianaベースの一過性発現系において、非グリコシル化組換えタンパク質を産生するために使用されることができることを示唆する。また、この研究の結果は、炭疽菌およびPfs48/45ワクチンとしてEndo H脱グリコシル化PA83の可能性を明らかにし、前臨床開発のためのそのさらなる特徴付けを支持する。これらの結果は、Endo Hは、全ての試験された糖タンパク質からN結合型グリカンを成功裏に切断することを証明し、Endo H同時発現戦略は、非グリコシル化ワクチン抗原、治療タンパク質、抗体および細菌タンパク質(特にワクチン抗原候補)酵素を製造するために使用することができることを示唆する。また、本発明は、バイオエネルギー/バイオ燃料収率を増加させるため、並びに特に天然添加物を製造するための、食品品質を改善するための任意の真核生物系における工業的酵素、特に細菌起源の酵素の製造に使用されることができる。
N. benthamianaにおけるEndo Hのクローニングおよび発現。Endo H遺伝子(GenBank受託番号AAA26738.1)を、GENEART AG(Thermo Fisher Scientific)によって合成されるN. benthamianaplantsandでの発現で最適化した。N. benthamianaplantsにおいてEndo Hを一時的に発現するために、シグナルペプチド(アミノ酸1〜42)をEndo H配列から除去し、Nicotianatabacum PR−1aシグナルペプチド(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA)をN末端に加えた。また、KDEL配列(ER保持シグナル)およびFLAGエピトープ(アフィニティー精製タグ)をC末端に加えた。得られた配列を修飾pGreen II(pGR−M)またはpB121(Chenら、2003年)二次元発現ベクターに挿入して、それぞれpGR−M−Endo H FおよびpBI−Endo Hを得た。
313個のアミノ酸(シグナル配列を持たない触媒的に活性なタンパク質の完全長1〜42アミノ酸)を包含する細菌Endo H遺伝子配列をN. benthamiana植物で発現のために最適化され(図2)、pGR−Mベクターにクローニングし、実験手順に記載されるようにN. benthamiana植物で発現させた。また、Endo H対PNGase Fによるインビボ脱グリコシル化を比較するめに、314個のアミノ酸を包含する細菌PNGase F遺伝子配列をN. benthamiana植物で発現のために最適化し、先に記載したように発現させた(Mamedovら、2012年)。N. benthamianaにおいてEndo Hand PNGase Fの発現を、抗FLAGモノクロナール抗体(mAb)を使用してウェスタンブロット分析によって確認した(図3)。図3に示されるように、PNPNGase Fは、SDS−PAGEで約35kDで移動し(続いてウェスタンブロット)、これは、Endo Hは、PNGase Fタンパク質よりも早く約25kDaで移動する。Endo HおよびPNGase Fを発現するN. benthamiana植物は、目に見える症状の発症または標的の同時発現が最も高いレベルに到達したときに増殖の変化なしに、浸潤後7、8および9日(dpi)に健康状態を維持したことに留意すべきである(図4)。
PA83を装飾するN結合オリゴ糖のインビボ切断を評価するために、Endo Hand PA83を、共耕地浸潤(co−agroinfiltration)を介してN. benthamiana植物において一時的に同時発現させた。参考として、細菌PNGase Fも、共耕地浸潤を介してN. benthamiana植物において一時的に同時発現させた。B. anthracisのPAは、糖タンパク質ではないが、N. benthamiana植物において発現される場合にグリコシル化される。5dpiで行ったウェスタンブロット分析は、Endo Hで同時発現したPA83の移動度の急速な上昇を立証し(図5)、タンパク質脱グリコシル化を示す。また、SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析によって示されるように、Endo Hとの同時発現は、細菌PNGase Fによってインビボ脱グリコシル化分子とサイズが類似しているPA83の蓄積をもたらし(Mamedovら、2012年)、PA83は酵素的に脱グリコシル化されたことを示唆する(図5)。
Pfs48/45は、透過遮断(TB)vaccme開発の主要候補の1つである。Pfs48/45を装飾するN結合型オリゴ糖のインビボ切断を評価するために、Plasmodium falciparumの細菌Endo HおよびPfs48/45タンパク質は、pGR−M−Pfs48/45およびpGR−M−Endo H構築物との共耕地浸潤を介してN. benthamiana植物において一時的に同時発現された。SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析によって示されるように、Endo Hとの同時発現は、約60kDaの分子量を有するPfs48/45の蓄積をもたらし、これは、PNGase Fによってインビトロ脱グリコシド化分子のサイズに類似し(図4、Mamedovら、2012年参照)、Pfs48/45は、酵素的にグルコシド化されていたことを示す(図5)。Endo Hは、PA83およびPfs48/45タンパク質から成功裏にN結合型グリカンを切断し、植物産生Endo Hは、インビボで酵素的に活性であることを証明し、Endo H同時発現戦略は、N. benthamianaベースの一過性発現系において非グルコシル化形態の治療タンパク質を産生するために使用されることができることを示唆する。
Endo HおよびPNGase Fは、同時発現し、PA83の脱グリコシル化形態は、HisPur(商標)Ni−NTA樹脂(ThermoFisher scientific、カタログ番号8822)を使用して精製した。SDS−PAGEおよびクーマシー染色によって示されるように(図5A)、精製されたタンパク質は、高度に均質である。また、SDS−PAGEおよび(図5A)およびウェスタンブトット分析によって示されるように、Endo Hとの同時発現は、細菌PNGase Fによってインビボ脱グリコシル化分子のサイズに類似するPA83の蓄積をもたらした。タンパク質の特性についてEndo HおよびPNGase Fによって脱グリコシル化の影響を評価するために、PA83タンパク質の脱グリコシル化形態を、37℃および4℃の処理形態で、PA83の異なる形態の予備安定性試験を行ったところ、インビボグリコシル化PA83のEndo Hは、特に上昇した(37℃)温度で、PNGase Fグリコシル化形態と比較して、わずかにより安定しているようであることがわかった。
インビボグリコシル化PA83変異体におけるグリコシル化されたEndo HまたはPNGase Fに対する抗PAモノクロナール抗体の結合は、IMAC精製PA83抗原およびBacillus anthracis防御抗原抗体(MA1−21675)を使用して実施した。抗PA抗体(抗Bacillus anthracis防御抗原抗体、BAP0101、カタログ番号ab1988、Abcam)は、インビボ脱グリコシル化PA83タンパク質において、植物産生グリコシル化およびEndo HまたはPNGase Fに同様の結合を示した(データ示さず)。
IN VIVO DE-GLYCOSYLATION OF RECOMBINANT PROTEINS BY CO-EXPRESSION
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Claims (15)
- 以下を使用することによって目的のN−脱グリコシル化ポリペプチドを生成するための方法:
(a)細菌のEndo H(Endo−β−N−アセチルグルコサミダーゼH、End H、EC3.2.1.96)をコードする第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸、ここで、第1のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化されると、Endo Hポリペプチドが発現される場合のようなプロモーターに操作可能に連結され;および
(b)目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸、ここで、第2のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、目的のポリペプチドが発現されるようなプロモーターに操作可能に連結され、
(c)およびEndo Hポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチドは、脱グリコシド化され、得られたポリペプチドのNxS/T部位(配列)におけるアミノ酸変化なしで、PNGase Fの作用とは反対に、これは、NxS/T部位(配列)におけるアスパラギン(N)のアスパラギン酸(D)への脱アミド化による脱グリコシド化タンパク質標的中のアミノ酸変化を引き起こし、
(d)細菌のEndo H(Endo−β−N−アセチルグルコサミニダーゼH、Endo H、EC3.2.1.96)ポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸、ここで、第1のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、Endo Hポリヌクレオチドが発現されるようなプロモーターおよび目的の標的ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第2の核酸に操作可能に連結され、
(e)Endo Hポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチドは、NxS/T部位(配列)のアミノ酸変化なしで、脱グリコシド化され、および
(f)Endo Hポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチドは、脱グルコシル化され、Endo Hポリペプチド切断が、1つのGlcNAc残基がアスパラギンに結合したまま、残りのものサッカライドが荷電を与え、それによって脱グルコシド化ポリペプチドの溶解度および安定性を増加させ、および
(g)非グリコシド化ワクチン抗原、治療タンパク質、抗体および細菌タンパク質(特に、ワクチン抗原候補)酵素を産生する。また、本発明は、バイオエネルギー/バイオ燃料の収率を増加させるため、並びに特に天然添加物を製造するための食品品質を改善するための、任意の真核生物系における工業的酵素、特に細菌起源の酵素の製造のために使用されることができる。 - 前記真核細胞が植物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞が、Nicotiana benthamiana細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチド配列は、配列番号1に記載の配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- Endo Hポリペプチドは、配列番号2に記載の配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 第1および第2の核酸は、アクロバクテリウム構築物を介して細胞に導入される、請求項1に記載の方法。
- 以下を使用することによって目的のN−脱グルコシル化ポリペプチドを生成するための方法:
(a)目的の細菌Endo H(Endo−β−N−アセチルグルコサミニダーゼH、Endo H、EC3.2.1.96)ポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸;および
(b)目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸、ここで、第2のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、目的のポリペプチドが発現されるようなプロモーターに操作可能に連結され、Endo Hポリヌクレオチドの作用によって、目的のポリペプチドが脱グルコシド化され、得られたポリヌクレオチドのNxS/T部位(配列)においてアミノ酸変化なしで、PNGase Fの作用と反対に、これは、NxS/T部位(配列)のアスパラギン(N)のアスパラギン酸(D)への脱アミド化によって脱グルコシル化タンパク質標的のアミノ酸変化を引き起こし、
(c)細菌Endo H(Endo−β−N−アセチルグルコサミニダーゼH、Endo H、EC3.2.1.96)ポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列を含む第1の核酸、ここで、第1のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、Endo Hポリペプチドが発現されるプロモーターおよびPA83またはPfs48/45ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸に操作可能に連結され、
(d)Endo Hポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチド、PA83またはPfs48/45ポリペプチドは、NxS/T部位(配列)におけるアミノ酸変化なしで、脱グリコシド化され、および
(e)Endo Hポリペプチドの作用によって、PA83のポリペプチドまたはPfs48/45ポリペプチドは、脱グルコシル化され、Endo Hポリペプチドの切断が、1つのGlcNAc残基がアスパラギン酸に結合したままであり、残りのモノサッカライドが電荷を与え、それによって脱グルコシル化ポリペプチドの溶解度および安定性を増加させ、および
(f)脱グルコシド化PA83ポリペプチドは、Endo Hの作用によって生成され、同じポリペプチドのグリコシル化またはPNGase F脱グルコシル化(インビボ)形態と比較してより安定であるようであり、
(g)グリコシル化PA83ポリペプチドは、anthrax vaccmeとしてEndo Hの作用によって生成される。 - 前記真核細胞が植物細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記植物細胞が、Nicotiana benthamiana細胞である、請求項7に記載の方法。
- 第1のヌクレオチド配列は、配列番号1に記載の配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項7に記載の方法。
- Endo Hポリペプチドは、配列番号2に記載の配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項7に記載の方法。
- 第1および第2の核酸は、アクロバクテリウム構築物を介して細胞に導入される、請求項7に記載の方法。
- 目的のワクチンの製造に使用するためにEndo Hの目的の標的との同時発現による目的の生成物。
- 炭疽ワクチンの製造に使用するためのEndo HとPA83との同時発現によって産生される生成物。
- マラリアワクチンの製造に使用するためにEndo Hとpfs48/45との同時発現によって産生される生成物。
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