ES2348008T3

ES2348008T3 - Transportador de fucosa.

Info

Publication number: ES2348008T3
Application number: ES04746425T
Authority: ES
Inventors: Izumi C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA SUGO; Kiyoshi c/o Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha HABU; Masayuki c/o CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA TSUCHIYA; Kenju c/o Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha UENO; Yasuo c/o Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha SEKIMORI; Shigeyuki c/o Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IIJIMA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-18
Publication date: 2010-11-26
Anticipated expiration: 2024-06-18
Also published as: WO2005017155A1; JPWO2005017155A1; EP1642971A1; ATE474921T1; US20060246456A1; US7863042B2; DE602004028249D1; US20110070614A1; EP1642971A4; EP1642971B1; EP2228445A1

Abstract

Célula de hámsteres chino DXB11 en la que se destruye un gen transportador de fucosa.

Description

CAMPO TÉCNICO

En la presente memoria se da a conocer un polipéptido transportador de fucosa, un ADN que codifica el polipéptido transportador de fucosa, una célula con funciones inhibidas de transportador de fucosa y un procedimiento para identificar un compuesto que se une a un transportador de fucosa o un compuesto que inhibe la actividad del transporte de fucosa. Además en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para producir una proteína recombinante y particularmente un anticuerpo que utiliza la célula con funciones inhibidas de transportador de fucosa.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales mediante su actividad de ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo) o su actividad de CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Los anticuerpos son glucoproteínas unidas por la cadena de azúcar. Es conocido que una actividad citotóxica del anticuerpo puede variar en función de los tipos y cantidades de cadenas de azúcar que se unen al anticuerpo. En particular, se ha publicado que la cantidad de fucosa que se une a un anticuerpo está muy implicada en la actividad citotóxica (Shields et al., J. Biol. Chem., 277(30), 26733-26740, 2002). Además, se ha publicado un procedimiento para producir un anticuerpo recombinante que no tiene fucosa. Dicho procedimiento implica impedir que una enzima que cataliza el enlace de la fucosa a una cadena de azúcar se exprese en la producción del anticuerpo para obtener un anticuerpo con aumento de actividad citotóxica (publicación de la patente internacional WO 00/61739).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención consiste en aislar un gen del transportador de fucosa o el polipéptido intracelularmente implicado en el transporte de la fucosa. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en obtener una célula para producir una proteína extraña con funciones inhibidas de transportador de fucosa. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en aislar un compuesto que puede inhibir las funciones de transportador de fucosa. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir de manera fácil y fiable una proteína recombinante en la que el enlace de la fucosa se elimina o disminuye. En particular, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir un anticuerpo en el que el enlace de la fucosa se elimina o disminuye y cuya actividad citotóxica aumenta. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una célula hospedadora para producir dicha proteína.

En un mecanismo mediante el cual la fucosa se une a un anticuerpo en una célula que produce anticuerpos, es sabido que GDP se une a la fucosa que se ha incorporado a una célula. GDP-fucosa se incorpora a continuación al aparato de Golgi y a continuación la fucosa del GDP-fucosa se transfiere a la N-acetilglucosamina, que se ha añadido como una cadena de azúcar a la proteína dentro del aparato de Golgi. Específicamente, la zona Fc de una molécula de anticuerpo tiene dos zonas a las que se une una cadena de azúcar unida a N-glucósido. La fucosa se une a la porción de N-acetilglucosamina de una cadena de azúcar unida a N-glucósido (Pate L. Smith et al., J. Cell. Biol., 2002, 158, 801-815). En el contexto de la presente invención se ha estudiado este mecanismo y se ha deducido que si se puede inhibir la incorporación de GDP-fucosa en el aparato de Golgi, se puede suprimir el enlace de la fucosa a la proteína. Como resultado de estudios exhaustivos que se refieren a una sustancia que incorpora GDP-fucosa en el aparato de Golgi se aisló la sustancia como un transportador de fucosa y se ha descubierto que un anticuerpo al que no se une ninguna fucosa y que presenta aumento de actividad citotóxica puede obtenerse utilizando una célula (con funciones inhibidas de transportador de fucosa) como hospedador para la producción de la proteína recombinante. Por lo tanto, se ha concluido la presente invención.

En la presente invención, para satisfacer las condiciones cuando se inhibe la adición de fucosa a un anticuerpo, no es necesario que todos los anticuerpos producidos no experimenten la adición de fucosa a éstos, sino que la proporción de proteína a la que se ha añadido fucosa disminuiría entre las composiciones del anticuerpo.

La presente invención proporciona una célula, la utilización y el procedimiento tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En las mismas, se dan a conocer:

[1] Un polipéptido recombinante o un fragmento del mismo tal como se muestra en

(a): o (b):

(a): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2; o

(b): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2 por eliminación, sustitución, inserción o adición de 1 o varios aminoácidos y que es funcionalmente equivalente al polipéptido (a).

[2] Un ADN, que codifica el siguiente polipéptido (a) o (b):

[3] Un ADN, que comprende el siguiente ADN (c) o (d):

(c): un ADN que comprende la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 1; o

(d) un ADN que se hibrida en condiciones severas a un ADN constituido por una secuencia complementaria al ADN que comprende la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1 y que codifica un polipéptido que es funcionalmente equivalente al polipéptido codificado por el ADN (c).

[4] Un fragmento de ADN que es un fragmento del ADN según [2] o [3] o es un fragmento de un ADN que es complementario al ADN según [2] o [3] y que consta de por lo menos 15 nucleótidos.

[5] Un vector recombinante, que comprende el ADN según [2] o [3].

[6] Un transformado, que comprende el vector recombinante según [5].

[7] Un procedimiento para producir el polipéptido según [1], que comprende cultivar el transformado según [6] y recoger el polipéptido del transformado cultivado del sobrenadante del cultivo del mismo.

[8] Un anticuerpo, que se une al polipéptido según [1].

[9] Un procedimiento de identificación de un compuesto que se une al polipéptido según [1], que comprende las etapas siguientes:

(a) poner en contacto una muestra que va a analizarse con el polipéptido;

(b) detectar la actividad de enlace entre el polipéptido y la muestra que va a analizarse; y

(c) seleccionar un compuesto con actividad de enlace al polipéptido.

[10] Un compuesto que se une al polipéptido según [1], que puede aislarse por el procedimiento según [9].

[11] Un procedimiento de identificación de un compuesto que inhibe la actividad de transporte del GDP-fucosa del polipéptido según [1], que comprende las etapas siguientes:

(a): poner en contacto una muestra que va a analizarse y GDP-fucosa con el polipéptido;

(b) detectar la capacidad del polipéptido para incorporar GDP-fucosa; y

(c): seleccionar un compuesto que inhibe la actividad de transporte de GDP-fucosa de un polipéptido.

[12] Un compuesto que inhibe la actividad del polipéptido para transportador GDPfucosa según [1], que puede aislarse por el procedimiento según [11].

[13] Una célula, que presenta un aparato de Golgi en el que ha disminuido la fucosa.

[14] Una célula, que presenta una capacidad para transportar la fucosa disminuida

o que carece de dicha capacidad.

[15] Una célula que presenta una capacidad disminuida para incorporar la fucosa en un aparato de Golgi o que carece de dicha actividad.

[16] Célula según cualquiera de los apartados [13] a [15], que consiste en un compuesto que se une a un transportador de fucosa o un compuesto que inhibe la actividad de transporte de fucosa.

[17] Una célula en la que la expresión de un transportador de fucosa se suprime artificialmente.

[18] Célula según el apartado [17], en la que la expresión de un transportador de fucosa se suprime utilizando iARN.

[19] Una célula en la que se ha destruido el gen transportador de fucosa.

[20] Célula según cualquiera de los apartados [13] a [19], que es una célula animal.

[21] Célula según el apartado [20], en el que la célula animal es una célula de hámsteres chino.

[22] Célula según el apartado [20], en el que la célula animal es una célula de CHO.

[23] Célula según cualquiera de los apartados [19] a [22], en la que el gen se ha destruido por recombinación homóloga utilizando un vector de reconocimiento génico.

[24] Un vector de reconocimiento, que dirige un gen que codifica un transportador de fucosa.

[25] Vector de reconocimiento según el apartado [24], en el que el transportador de fucosa, es un transportador de fucosa de hámsteres chino.

[26] Un procedimiento para producir una proteína recombinante, en el que disminuye la fucosa que existe en el aparato de Golgi de una célula hospedadora.

[27] Un procedimiento para producir una proteína recombinante, en el que se inhibe la incorporación de la fucosa en el aparato de Golgi en una célula hospedadora.

[28] Un procedimiento para producir una proteína recombinante, en el que se inhibe la incorporación de la fucosa mediada por un transportador de fucosa en una célula hospedadora.

[29] Un procedimiento para producir una proteína recombinante, en el que se inhiben las funciones de transportador de fucosa de una célula hospedadora.

[30] Procedimiento para producir una proteína recombinante según cualquiera de los apartados [26] a [29], en el que las funciones de transportador de fucosa están inhibidas por supresión artificial de la expresión del transportador de fucosa en una célula hospedadora.

[31] Procedimiento para producir una proteína según el apartado [30], en el que la expresión del transportador de fucosa se suprime utilizando iARN.

[32] Procedimiento para producir una proteína recombinante según cualquiera de los apartados [26] a [30], en el que las funciones de transportador de fucosa se inhiben por supresión de un gen que codifica el transportador de fucosa en una célula hospedadora.

[33] Procedimiento de producción según cualquiera de los apartados [26] a [32], en el que la proteína es un anticuerpo.

[34] Procedimiento de producción según cualquiera de los apartados [26] a [33], en el que se produce una proteína sin fucosa añadida a la misma.

[35] Procedimiento de producción según cualquiera de los apartados [26] a [34], en el que la célula hospedadora es una célula CHO.

[36] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína, en el que la fucosa que existe en el aparato de Golgi en una célula hospedadora disminuye cuando se produce una proteína recombinante utilizando la célula hospedadora.

[37] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína, en el que las funciones de transportador de fucosa en una célula hospedadora disminuye se inhiben cuando se produce una proteína recombinante utilizando la célula hospedadora.

[38] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína, según el apartado [36] o [37], en el que la expresión del transportador de fucosa se suprime artificialmente cuando se produce una proteína recombinante utilizando una célula hospedadora.

[39] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína según el apartado [38], en el que la expresión del transportador de fucosa se suprime utilizando iARN.

[40] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína según cualquiera de los apartados [36] a [38], en el que se elimina un gen que codifica un transportador de fucosa cuando se produce una proteína recombinante utilizando una célula hospedadora.

[41] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína, en el que la incorporación de fucosa mediada por un transportador de fucosa se inhibe cuando se produce una proteína recombinante utilizando una célula hospedadora.

[42] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína según cualquiera de los apartados [36] a [41], en el que la proteína es un anticuerpo.

[43] Procedimiento para inhibir la adición de fucosa a una proteína según cualquiera de los apartados [36] a [42], en el que la célula hospedadora es una célula de CHO.

[44] Un procedimiento para aumentar la actividad citotóxica de un anticuerpo, en el que un anticuerpo se produce con una célula en la que la fucosa que existe en el aparato de Golgi ha disminuido.

[45] Un procedimiento para aumentar la actividad citotóxica de un anticuerpo, en el que un anticuerpo se produce con una célula hospedadora que tiene inhibidas las funciones de transportador de fucosa.

[46] Un procedimiento para aumentar la actividad citotóxica de un anticuerpo, en el que un anticuerpo se produce con una célula en la que la expresión de un transportador de fucosa se suprime artificialmente.

[47] Un procedimiento para aumentar la actividad citotóxica de un anticuerpo, en el que un anticuerpo se produce con una célula que carece de un gen que codifica un transportador de fucosa.

[48] Procedimiento para aumentar la actividad citotóxica de un anticuerpo, en el que un anticuerpo se produce inhibiendo la incorporación de la fucosa en el aparato de Golgi.

[49] Procedimiento para aumentar la actividad citotóxica de un anticuerpo, según cualquiera de los apartados [44] a [48], en el que la célula hospedadora es una célula CHO.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra secuencias de ADNc transportador de GDP-fucosa humano y de ratón y secuencias del cebador de PCR para producir una sonda, que se ha diseñado para obtener ADNc transportador de GDP-fucosa derivado de CHO procedente de estas secuencias comunes.

La figura 2 presenta una secuencia de ADNc transportador de GDP-fucosa derivado de las célula CHO obtenida por clonación (las letras minúsculas indican las zonas de clonación derivadas del vector). La figura 2 muestra también secuencias del cebador de PCR para producir una sonda que se ha utilizado para obtener el ADN genómico transportador de GDP-fucosa.

La figura 3 muestra una cartografía de la enzima de restricción de un gen transportador de GDP-fucosa obtenido por clonación. La parte subrayada indica una secuencia (letras minúsculas: intrón) situada en la parte límite entre un exón y un intrón.

La figura 4 muestra una secuencia del gen transportador de GDP-fucosa procedente de CHO.

La figura 5 muestra los resultados de la inhibición de un gen transportador utilizando ARNsi.

La figura 6 presenta la estructura de un vector de reconocimiento (KO2) y un subrayado de la identificación por PCR.

La figura 7 es una fotografía que presenta los resultados de la identificación por PCR.

La figura 8 presenta las cartografías de la enzima de restricción para un cromosoma natural y un cromosoma modificado genéticamente.

La figura 9 presenta fotografías que muestran los resultados de la puesta en práctica del procedimiento de inmunotransferencia Southern.

MEJOR MODO DE PONER EN PRÁCTICA LA INVENCIÓN

En la presente memoria se da a conocer un transportador de fucosa de hámsteres chino (CH).

Las células de ovario del hámsteres chino (células CHO) actualmente se utilizan extensamente como células hospedadoras para producir proteínas tales como anticuerpos. De este modo, el transportador de fucosa de hámsteres chino de la presente invención es particularmente útil.

Se describen además en la presente memoria polipéptidos que codifican ADN que son funcionalmente equivalentes al gen transportador de la fucosa del CH. Los ejemplos de dicho ADN incluyen el ADN que codifica un mutante, alelo, variante, homólogo o similar de un polipéptido transportador de fucosa del CH. En este contexto, "funcionalmente equivalente" indica que un polipéptido del asunto tiene funciones biológicas equivalentes a las del polipéptido transportador de fucosa del CH.

"Funciones biológicas equivalentes a las del transportador de fucosa de CH" indica la actividad de transporte de fucosa, y preferentemente la actividad de transporte de fucosa en las células CHO.

Como procedimiento para preparar un polipéptido que es funcionalmente equivalente a un polipéptido que es bien conocido por los expertos en la materia, se conoce un procedimiento para introducir la mutación en un polipéptido. Por ejemplo, los expertos en la materia pueden preparar un polipéptido que es funcionalmente equivalente al polipéptido transportador de fucosa del CH introduciendo de forma apropiada la mutación en los aminoácidos del polipéptido mediante la utilización, por ejemplo, del procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio (Gotoh, T. et al., (1995), Gene 152, 271275; Zoller, MJ, y Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, H.J. (1987), Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, T.A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 488-492; y Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766).

Además, la mutación del aminoácido también puede tener lugar en la naturaleza. De este modo, también se da a conocer en la presente memoria un polipéptido que consta de una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del polipéptido transportador de fucosa de CH por mutación de 1 o diversos aminoácidos que es funcionalmente equivalente al polipéptido. El número de aminoácidos mutados en dicho mutante es generalmente 30 aminoácidos o menos, preferentemente 15 aminoácidos o menos, más preferentemente 5 aminoácidos o menos y en particular preferentemente 3 aminoácidos o menos.

Es deseable que los restos de aminoácidos estén mutados para producir otros aminoácidos a la vez que se conservan las propiedades de una cadena lateral de aminoácido. Los ejemplos de dichas propiedades de una cadena lateral de aminoácido incluyen los aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T), aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L, I y P), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen grupo hidroxilo (S, T e Y), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen átomos de azufre (C y M), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen ácido carboxílico y amida (D, N, E y Q), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen bases (R, K y H) y aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen aromáticos (H, F, Y y W) (todas las letras mayúsculas entre paréntesis representan indicaciones en una sola letra para aminoácidos).

Es ya conocido que un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos por modificación tal como por eliminación de 1

o de diversos restos de aminoácidos, la adición de 1 o de diversos restos de aminoácidos, y/o la sustitución por otros aminoácidos conserva su actividad biológica (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M.J., y Smith M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433; Dalbadie-Mc Farland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1982) 79, 6409-6413).

Los ejemplos de polipéptido con una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del polipéptido transportador de fucosa del CH por adición de diversos aminoácidos incluyen polipéptidos de fusión que comprenden dichos polipéptidos. Dichos polipéptidos de fusión proceden de la fusión de dichos polipéptidos con otros polipéptidos. Dichos polipéptidos de fusión se dan a conocer también en la presente memoria. Para preparar un polipéptido de fusión, por ejemplo, ADN que codifica el polipéptido transportador de fucosa de CHO se liga a un ADN que codifica a otro polipéptido de modo que se igualan los marcos. El resultante se introduce a continuación en un vector de expresión y es expresado por un hospedador. Los ejemplos de otros polipéptidos que pueden fusionarse con el polipéptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan específicamente a, péptidos conocidos tales como FLAG (Hopp, T.P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 x His que consta de 6 restos de His (histidina), 10 x His, hemoaglutinina (HA) de la gripe, fragmentos c-myc humanos, fragmentos de VSV-GP, fragmentos de p18VIH, etiqueta de T7, etiqueta de HSV, etiqueta de E, fragmentos del antígeno SV40T, etiquetas de lck, fragmentos de α-tubulina, etiquetas de B y fragmentos de proteína C. Además, los ejemplos de otros polipéptidos que van a fusionarse con el polipéptido de la presente invención, incluyen GST (glutation-Stransferasa), HA (hemoaglutinina de la gripe), la zona constante de inmunoglobulina, β-galactosidasa y MBP (proteína de enlace de la maltosa). Estos polipéptidos y genes que codifican los polipéptidos están comercializados. Por consiguiente, puede prepararse un polipéptido de fusión fusionando un ADN que codifica dicho polipéptido comercializado con ADN que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y expresando a continuación el ADN de fusión así preparado.

Además, otro ejemplo del procedimiento para preparar un ADN que codifica un polipéptido que es funcionalmente equivalente a un polipéptido que es bien conocido por los expertos en la materia, es un procedimiento que utiliza técnicas de hibridación (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. 2a ed., 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Específicamente, las técnicas conocidas por los expertos en la materia son el aislamiento del ADN con mucha homología y una secuencia de ADN que codifica el polipéptido transportador de fucosa de CH o una parte del mismo y el aislamiento de un polipéptido funcionalmente equivalente al polipéptido transportador de fucosa de CH procedente del ADN.

Además en la presente memoria se da a conocer ADN que se hibrida en condiciones severas al ADN que codifica el polipéptido transportador de la fucosa del CH y que codifica a un polipéptido funcionalmente equivalente al polipéptido transportador de fucosa del CH. Los ejemplos de dicho ADN incluyen homólogos derivados de seres humanos o de otros animales (por ejemplo, ratas, conejos y ganado vacuno).

Las condiciones de hibridación para el aislamiento del ADN que codifica un polipéptido que es funcionalmente equivalente al polipéptido transportador de fucosa de CH pueden ser seleccionadas de manera apropiada por los expertos en la materia. Dichas condiciones severas de hibridación son, por ejemplo, condiciones poco severas. Dichas condiciones poco severas comprenden, en el lavado tras la hibridación, por ejemplo, 42ºC, 0,1 x SSC y 0,1% de SDS y preferentemente 50ºC, 0,1 x SSC y 0,1% SDS. Las condiciones de hibridación más preferidas son, por ejemplo, condiciones muy severas. Tales condiciones muy severas comprenden, por ejemplo, 65ºC, 0,1 x SSC y 0,1% de SDS. En estas condiciones cabe esperar que el ADN que tiene gran homología a medida que se eleva la temperatura pueda obtenerse eficazmente. Sin embargo, diversos factores tal como la temperatura y la concentración salina pueden influir en la severidad sobre la hibridación. Los expertos en la materia pueden realizar una severidad similar a la severidad anterior seleccionando de manera apropiada estos factores.

Además, el ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente al polipéptido transportador de fucosa de CH puede aislarse también por un procedimiento de ampliación de genes (por ejemplo, un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) utilizando cebadores que se sintetizan basándose en la información de la secuencia que se refiere al ADN que codifica el polipéptido transportador de fucosa de CH.

Un polipéptido que es codificado por ADN aislado por estas técnicas de hibridación y técnicas de ampliación génica y que es funcionalmente equivalente al polipéptido transportador de fucosa de CH presenta gran homología con el polipéptido transportador de fucosa de CH en cuanto a la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos del polipéptido dado a conocer en la presente memoria incluyen también polipéptidos que son funcionalmente equivalentes al polipéptido transportador de fucosa de CH y que tienen gran homología con la secuencias de aminoácidos del polipéptido. Dicha gran homología en el contexto de aminoácidos indica generalmente 70% o más de homología, preferentemente 80% o más de homología, más preferentemente 92% o más de homología y más preferentemente 95% o más de homología.

Además, dicha gran homología en el contexto de la secuencia de nucleótidos indica generalmente 70% o más de homología, preferentemente 80% o más de homología, más preferentemente 90% o más de homología y aún más preferentemente 95% o más de homología.

La homología de secuencias de aminoácidos o de secuencias de nucleótidos puede determinarse, por ejemplo, por algoritmo BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877, 1993) según Karlin y Altschul. Basándose en este algoritmo, se ha desarrollado un programa denominado BLASTN o un programa denominado BLASTX (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Cuando las secuencias nucleotídicas son analizadas por BLASTN basado en BLAST, se determinan parámetros que son, por ejemplo, puntuación = 100 y longitud de palabra = 12. Además, cuando las secuencias de aminoácidos se analizan por BLASTX basado en BLAST, se determinan parámetros que son puntuación = 50 y longitud de palabra = 3. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con hueco, se utilizan parámetros por defecto para cada programa. Se conocen técnicas específicas para estos procedimientos analíticos (http://www.ncbi.nlm.nib.gov).

El ADN dado a conocer en la presente memoria, se utiliza, por ejemplo, para la producción in vivo e in vitro del polipéptido dado a conocer en la presente memoria como se describe más adelante. El ADN dado a conocer en la presente memoria puede estar en cualquier forma con tal que pueda codificar el polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Específicamente, dicho ADN puede ser ADNc sintetizado a partir de ARNm, ADN genómico o ADN sintetizado químicamente. Además, en la presente memoria se incluye un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos basada en la degeneración del código genético, con tal que codifique el polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

El ADN dado a conocer en la presente memoria puede prepararse por procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, dicho ADN puede prepararse construyendo un banco de ADNc procedente de una célula que expresa el polipéptido de la presente invención y a continuación realizando la hibridación utilizando como sonda una parte de la secuencia de ADN dada a conocer en la presente memoria. Dicho banco de ADNc puede prepararse también por un procedimiento descrito, por ejemplo, en la bibliografía procedente (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Alternativamente, puede utilizarse también un banco de ADN comercial. Además, el ADN dado a conocer en la presente memoria puede prepararse también preparando ARN procedente de una célula que expresa el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, sintetizando el ADNc utilizando transcriptasa inversa, sintetizando oligo ADN basado en la secuencia de ADN dada a conocer en la presente memoria, realizando la reacción de PCR utilizando los resultantes como cebadores, y a continuación ampliando el ADNc que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Además, mediante la determinación de la secuencia nucleotídica del ADNc obtenido de esta manera, puede determinarse una zona de traducción codificada por la secuencia y puede obtenerse la secuencia de aminoácidos del polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Además, mediante el cribado de un banco de ADN genómico que utiliza el ADNc obtenido de este modo como sonda, puede aislarse un ADN genómico.

Específicamente, se realizan las etapas siguientes. En primer lugar, se aísla ARNm de las células, tejidos y órganos que expresan el polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Para aislar ARNm, se prepara ARN completo por un procedimiento conocido tal como ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) o un procedimiento AGPC (Chomczynski, P. y Sacchi, N, Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159). Se purifica a continuación el ARNm a partir del ARN completo utilizando un kit de purificación de ARNm (Pharmacia Corporation) o similar. Además, el ARNm puede prepararse también directamente utilizando un kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia Corporation).

El ADNc se sintetiza a partir del ARNm obtenido de este modo utilizando transcriptasa inversa. El ADNc puede sintetizarse también utilizando un kit de síntesis de la primera cadena de ADNc con transcriptasa inversa AMV (SEIKAGAKU CORPORATION) o similar. Además, mediante la utilización de cebadores y similares descrita en esta memoria, la síntesis de ADNc y la ampliación de ADNc pueden realizarse según el procedimiento 5’-RACE (Frohman, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998–9002; Belyavsky, A., et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) utilizando un kit 5’-Ampli FINDER RACE (producida por Clontech) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se prepara un fragmento de ADN diana a partir del producto obtenido de la PCR y a continuación se liga a un vector ADN. Además, se construye un vector recombinante utilizando el resultante, el vector recombinante se introduce en Escherichia coli o similar y a continuación se seleccionan las colonias preparando de este modo un vector recombinante deseado. La secuencia nucleotídica de un ADN diana puede confirmarse por un procedimiento conocido tal como un procedimiento de terminación de la cadena de didesoxi-nucleótido.

Además, con respecto al ADN dado a conocer en la presente memoria, una secuencia nucleotídica que tiene mayor eficacia de expresión puede diseñarse en vista de la frecuencia de utilización del codón de un hospedador para ser utilizada para la expresión (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, r43-74). Además, el ADN dado a conocer en la presente memoria puede alterarse utilizando un kit comercial o por un procedimiento conocido. Los ejemplos de dicha alteración incluyen la digestión con una enzima de restricción, la inserción de un oligonucleótido sintético o de un fragmento de ADN apropiado, la adición de un enlazador, y la inserción de un codón de iniciación (ATG) y/o de un codón de terminación (TAA, TGA, o TAG).

En la presente memoria se da a conocer un polipéptido codificado por el ADN anterior dado a conocer en la presente memoria. El polipéptido dado a conocer en la presente memoria, puede diferenciarse en la secuencia de aminoácidos, el peso molecular, el punto isoeléctrico o la presencia, ausencia o forma de la cadena de azúcar, debido a las células u hospedadores que producen tal polipéptido o a los procedimientos de purificación descritos más adelante. Sin embargo, el polipéptido obtenido de este modo se da a conocer en la presente memoria, siempre que presente funciones equivalentes a las del polipéptido transportador de fucosa del CH. Por ejemplo, cuando el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se expresa en las células procarióticas, tales como Escherichia coli, se añade un resto de metionina al terminal N de la secuencia de aminoácidos del polipéptido original. El polipéptido dado a conocer en la presente memoria también comprende dicho polipéptido.

El polipéptido dado a conocer en la presente memoria puede prepararse por un procedimiento conocido por los expertos en la materia como polipéptido recombinante o polipéptido natural. Dicho polipéptido recombinante puede purificarse y prepararse de la manera siguiente. El ADN que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, se incorpora a un vector de expresión apropiado, se recoge un transformado que se ha obtenido introduciendo el vector en una célula hospedadora apropiada y a continuación se obtiene el extracto. Posteriormente, el resultante se somete a cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase inversa o filtración en gel, cromatografía por afinidad utilizando una columna (en la que se ha inmovilizado un anticuerpo contra el polipéptido dado a conocer en la presente memoria) o cromatografía utilizando una combinación de diversas de dichas columnas.

Además, cuando el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se expresa como polipéptido de fusión con una proteína glutation-S-transferasa o como polipéptido recombinante al que se le han añadido diversas histidinas en las células hospedadoras (por ejemplo, células animales o Escherichia coli), el polipéptido recombinante expresado puede purificarse utilizando una columna con glutatión o una columna con níquel. Después de la purificación del polipéptido de fusión, si es necesario, otras zonas aparte del polipéptido diana pueden también escindirse y retirarse del polipéptido de fusión utilizando trombina o factor Xa.

En el caso de un polipéptido natural, dicho polipéptido puede aislarse por un procedimiento conocido por los expertos en la materia, tal como provocando que una columna de afinidad (a la que se ha unido un anticuerpo que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria tal como se describe a continuación) actúe sobre los extractos obtenidos de tejidos o células (por ejemplo, testículos) expresando el polipéptido dado a conocer en la presente memoria para purificación. Un anticuerpo utilizado en la presente memoria puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal.

También se describen en la presente memoria, péptidos parciales del polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Dichos péptidos parciales pueden utilizarse, por ejemplo, para producir un anticuerpo contra el polipéptido dado a conocer en la presente memoria o identificar un compuesto que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Cuando se utiliza como inmunógeno, el péptido parcial generalmente consta de una secuencia de aminoácidos de por lo menos 7 o más aminoácidos, preferentemente 8

o más aminoácidos, y más preferentemente 9 o más aminoácidos. Cuando se utiliza como inhibidor competitivo el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, dicho péptido parcial consta de una secuencia de aminoácidos de por lo menos 100 o más aminoácidos, preferentemente 200 o más aminoácidos, y más preferentemente 300 o más aminoácidos.

Dichos péptidos parciales pueden ser producidos por una técnica de modificación genética conocida como procedimiento de síntesis de péptidos, o escindiendo el polipéptido dado a conocer en la presente memoria con peptidasa apropiada. Los péptidos pueden sintetizarse, por ejemplo, por el método de síntesis en fase sólida o por un procedimiento de síntesis en fase líquida.

Además se da a conocer un vector en el que se inserta el ADN dado a conocer en la presente memoria. Dicho vector es útil para conservar el ADN dado a conocer en la presente memoria dentro de las células hospedadoras o que expresa el polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Por ejemplo, cuando se utiliza Escherichia coli como hospedador, dicho vector se amplía en grandes cantidades en Escherichia coli (por ejemplo, JM109, DH5α, HB101 y XL1-Blue) para la preparación en masa. Por consiguiente, los vectores utilizados en la presente memoria no están específicamente limitados, con tal que tengan "ori" para la ampliación en Escherichia coli y tengan un gen para la selección de Escherichia coli transformada (por ejemplo, un gen con resistencia a fármacos que permite la distinción por utilización de un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina o cloranfenicol).

Los ejemplos de dicho vector incluyen los vectores a base de M13, los vectores a base de pUC, pBR322, pBluescript y pCR-Script. Además, para la subclonación de ADNc

o la escisión de ADNc, los ejemplos de dicho vector incluyen, además de los vectores anteriores, pGEM-T, pDIRECT y pT7.

Cuando se utiliza un vector para producir el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, un vector de expresión es particularmente útil. Como vector de expresión, por ejemplo, cuando se utiliza un vector para la expresión en Escherichia coli, dicho vector debería tener las características anteriores que permiten la ampliación en Escherichia coli. Además, cuando un hospedador es Escherichia coli tal como JM109, DH5α, HB101 y XL1-Blue, dicho vector esencialmente tiene un activador que permite la expresión eficiente en Escherichia coli, tal como un activador lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), un activador araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043) o un activador T7. Los ejemplos de dicho vector incluyen, además de los vectores anteriores, pGEX-5X-1 (producido por Pharmacia Corporation), pQE utilizado en el "sistema QIAexpress" (producido por QIAGEN), pEGFP y pET (en este caso, un hospedador es preferentemente BL21 que expresa a T7 ARN polimerasa).

Además, dicho vector puede contener también una secuencia señal para la secreción de polipéptidos. Como secuencia señal para la secreción de polipéptidos, cuando los polipéptidos se producen en los periplasmas de Escherichia coli, puede utilizarse una secuencia señal peIB (Lei, S.P.et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Pueden introducirse vectores en células hospedadoras utilizando, por ejemplo, un método de cloruro de calcio y un método de electroporación.

Otros microorganismos aparte de Escherichia coli, pueden utilizarse también como hospedadores para producir el polipéptido de la presente invención. En este caso los ejemplos de vectores para producir el polipéptido dado a conocer en la presente invención, incluyen los vectores de expresión procedentes de mamíferos (por ejemplo, pcADN3 (producido por Invitrogen Corporation) y pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), pág. 5322), pEF, y pCDM8), vectores de expresión procedentes de células de insectos (por ejemplo, el "sistema de expresión de Bac-a-BAC" (producido por GIBCOBRL Life Technologies Inc.) y pBacPAK8), vectores de expresión procedentes de plantas (por ejemplo, pMH1 y pMH2), vectores de expresión procedentes de virus de animales (por ejemplo, pHSV, pVM y pAdexLcw), vectores de expresión procedentes de retrovirus (por ejemplo, pZIPneo), vectores de expresión procedentes de levaduras (por ejemplo, el "kit de expresión Pichia" (producido por Invitrogen Corporation), pNV11 y SP-Q01 y los vectores de expresión procedentes de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50).

Para la expresión en células animales tales como CHO, las células COS o las células NIH3T3, un vector utilizado en la presente memoria ha necesitado un activador para la expresión en las células, tal como un activador de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), un activador MMLV-LTR y un activador de EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids. Res. (1990), 18, 5322), o un activador de CMV. Resulta más preferido que dicho vector presente un gen para la selección de las células transformadas (por ejemplo, un gen con resistencia a fármacos que permite la distinción mediante la utilización de un fármaco (por ejemplo, neomicina y G418)). Ejemplos de vectores con tales propiedades incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CVM, pOPRSV y pOP13.

Además, un ejemplo de procedimiento para la expresión estable de un gen y la ampliación de numerosas copias de un gen en las células implica la introducción de un vector (por ejemplo, pCHOI) que tiene un gen DHFR complementario en las células de CHO que carecen de la serie de reacciones de síntesis de ácido nucleico, seguido de la ampliación utilizando metrotexato (MTX). Además, un ejemplo de procedimiento para la expresión temporal de un gen conlleva transformar las células COS que tienen un gen que expresa el antígeno SV40 T en el cromosoma con un vector (por ejemplo, pcD) que tiene un origen de replicación de SV40. Como punto de inicio de la replicación, un punto procedente de poliomavirus, adenovirus, virus de papiloma bovino (BPV) o similares pueden utilizarse también. Además, para ampliar el número de copias de un gen en un sistema de células hospedadoras, un vector de expresión puede contener como marcador de selección un gen de aminoglucósido transferasa (APH), un gen de timidina cinasa (TK), un gen de xantina-guanina fosforribosil transferasa (Ecogpt) de Escherichia coli, un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) o similares.

Mientras tanto, los ejemplos de un procedimiento para expresar in vivo el ADN dado a conocer en la presente memoria en animales implica incorporar el ADN dado a conocer en la presente memoria en un vector apropiado y a continuación introducir el vector en un cuerpo de animal, por ejemplo, por un método con retrovirus, un método con liposoma, un método con liposoma catiónico o un método con adenovirus. Ejemplos de vectores utilizados en la presente memoria comprenden de manera no limitativa, vectores de adenovirus (por ejemplo, pAdexlcw) y vectores de retrovirus (por ejemplo, pZIPneo). Las técnicas de ingeniería genética general incluyendo, por ejemplo, la inserción del ADN dado a conocer en la presente memoria en un vector, puede realizarse según un método convencional (Molecular Cloning 5.61-5.63). La administración en cuerpos vivos puede realizarse por un procedimiento ex vivo o un procedimiento in vivo.

Además, se da a conocer también en la presente memoria una célula hospedadora que tiene el vector dado a conocer en la presente memoria introducido en ésta. Dicha célula hospedadora en la que se introduce el vector no está específicamente limitada. Por ejemplo, pueden utilizarse Escherichia coli, varias células animales o similares. Dicha célula hospedadora puede utilizarse, por ejemplo, como sistema de producción para producir o expresar el polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Como sistema de producción para producir un polipéptido, pueden emplearse sistemas de producción in vitro e in vivo. Ejemplos de sistemas de producción in vitro incluyen un sistema de producción que utiliza células eucarióticas y un sistema de producción que utiliza células procarióticas.

Cuando se utilizan células eucarióticas, pueden utilizarse como hospedadores, por ejemplo, células animales, células vegetales y células micóticas. Como células animales, se conocen las células de mamíferos tales como CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, mieloma, BHK (riñón de cría de hámsteres), HeLa y Vero. Como células de anfibio, se conocen, por ejemplo, Xenopus oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358340). Como células de insecto se conocen, por ejemplo, Sf9, Sf21 y Tn5. Como células de CHO, pueden utilizarse preferentemente en particular, células dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, 4216-4220) o células K-1 de CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1968) 60, 1275) que carecen de un gen DHFR. Para la expresión de la masa en células animales, son particularmente preferidas las células CHO. Puede introducirse un vector en una célula hospedadora, por ejemplo, por un procedimiento con fosfato de calcio, un procedimiento con DEAE dextrano, un procedimiento que utiliza ribosoma catiónico DOTAP (producido por Boehringer Mannheim), un procedimiento de electroporación o lipofección.

Como células vegetales las células procedentes de Nicotiana tabacum, por ejemplo, son conocidas por comprender un sistema de producción de polipéptidos. Los polipéptidos pueden obtenerse cultivando los callos de células procedentes de Nicotiana tabacum. Como células micóticas, se conocen levaduras tales como las del género Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) y bacterias filamentosas tales como las del género Aspergillus (por ejemplo, Aspergillus niger).

Cuando se utilizan células procarióticas, puede utilizarse un sistema de producción que utiliza células bacterianas. Ejemplos de células bacterianas incluyen Escherichia coli

(E. coli), tales como JM109, DH5α y HB101. Además, se conoce también Bacillus subtilis.

Pueden obtenerse polipéptidos transformando estas células con un ADN diana y a continuación cultivando in vitro las células transformadas de este modo. El cultivo puede realizarse según un procedimiento conocido. Como solución de cultivo para las células animales, pueden utilizarse, por ejemplo, DMEM, MEM, RPMI1640 o IMDM. En este momento, puede utilizarse un fluido de suero tal como suero de ternero fetal (FCS) junto con estos. Alternativamente puede realizarse el cultivo sin suero. El pH durante el cultivo está comprendido preferentemente entre aproximadamente 6 y 8. El cultivo se lleva a cabo generalmente entre aproximadamente 30ºC y 40ºC durante aproximadamente 15 a 200 horas. Si es necesario, se realizan el intercambio de medio, aireación y agitación.

Mientras tanto, ejemplos de sistemas para la producción in vivo de polipéptidos incluyen los sistemas de producción que utilizan animales y los sistemas de producción que utilizan vegetales. El ADN diana se introduce en estos animales o plantas, se producen polipéptidos in vivo, en los animales o las plantas, y a continuación se recogen los polipéptidos. El término "hospedador" comprende estos, animales y vegetales.

Cuando se utilizan animales, existen sistemas de producción que utilizan mamíferos y sistemas de producción que utilizan insectos. Como mamíferos pueden utilizarse, cabras, cerdos, ovejas, ratones o vacas (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Además, cuando se utilizan mamíferos, pueden utilizarse animales transgénicos.

Por ejemplo, un ADN diana se prepara en forma de un gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido tal como la β-caseína de cabra, que únicamente se produce en la leche. Posteriormente, un fragmento de ADN que comprende el gen de fusión se inyecta en un embrión de cabra y a continuación el embrión se trasplanta a una cabra hembra. Un polipéptido diana puede obtenerse de la leche producida por cabras transgénicas nacidas de cabras que han aceptado dichos embriones, o de las descendencias de dichas cabras transgénicas. Para aumentar la cantidad de leche que contiene polipéptidos, producida por cabras transgénicas, puede utilizarse también una hormona apropiada para dichas cabras transgénicas (Ebert, K.M. et al., Bio/Tecnology (1994) 12, 699-702).

Además, como insectos, puede utilizarse, por ejemplo, el gusano de seda. Cuando se utilizan gusanos de seda, puede obtenerse un polipéptido diana del fluido corporal de un gusano de seda infectando el gusano de seda con un baculovirus, en el que se ha insertado un ADN que codifica el polipéptido diana (Susumu M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

Además, cuando se utilizan plantas, puede utilizarse, por ejemplo, el tabaco. Cuando se utiliza el tabaco, se inserta un ADN que codifica un polipéptido diana en un vector de expresión para una planta, tal como pMON 530, y a continuación se introduce el vector en bacterias tales como Agrobacterium tumefaciens. El tabaco tal como Nicotiana tabacum se infecta con dicha bacteria y a continuación puede obtenerse el polipéptido deseado de las hojas del tabaco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131138).

El polipéptido dado a conocer en la presente memoria, que se obtiene por dicho procedimiento puede aislarse del interior de las células huésped o del exterior de las células (por ejemplo, del medio) y purificarse a continuación como un polipéptido sustancialmente puro y uniforme. Para separar y purificar polipéptidos, pueden emplearse procedimientos de separación y purificación que se utilizan generalmente para la purificación de polipéptidos y no están específicamente limitados. Por ejemplo, pueden separarse y purificarse polipéptidos mediante la utilización de la selección y combinación apropiada de una columna de cromatografía, un filtro, ultrafiltración, precipitación por

sales,: precipitación en disolvente, extracción en disolvente, destilación,

inmunoprecipitación,: electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, un método de

concentración isoeléctrica, diálisis, recristalización y similares.

Los ejemplos de cromatografía incluyen cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía en fase inversa y cromatografía por adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estos tipos de cromatografía pueden llevarse a cabo utilizando cromatografía en fase líquida tal como HPLC o FPLC. La presente invención también comprende polipéptidos que se purifican en grandes concentraciones utilizando estos métodos de purificación.

Además, cuando una enzima apropiada para modificación de proteínas se produce para actuar en los polipéptidos antes o después de la purificación, la modificación puede realizarse de manera arbitraria o los péptidos pueden separarse parcialmente. Como enzimas para modificación de proteínas, se utilizan, por ejemplo, tripsina, quimiotripsina, lisilendopeptidasa, proteína cinasa y glucosidasa.

También se da a conocer en la presente memoria, un anticuerpo que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Ejemplos de formas de dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan específicamente a, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Además, los orígenes de dichos anticuerpos no están limitados. Puede utilizarse cualquier anticuerpo, tales como los anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de camello y anticuerpos humanos. Además, los anticuerpos híbridos o los anticuerpos humanizados producidos por recombinación genética están también incluidos en los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria.

Los polipéptidos que se utilizan como antígenos sensibilizantes en la presente memoria, pueden ser proteínas completas o péptidos parciales de una proteína. Ejemplos de dichos péptidos parciales de una proteína incluyen fragmentos (N)-terminales del grupo amino o fragmentos (C)-terminales del carboxilo de una proteína. "Anticuerpo" en la presente memoria significa un anticuerpo que reacciona con la proteína completa o un fragmento de la misma.

Un gen que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo dado a conocer en la presente memoria está insertado en un sistema de vector de expresión conocido. Las células hospedadoras descritas en la presente memoria se transforman con un vector y después el polipéptido diana o un fragmento del mismo se obtiene por un procedimiento conocido en el interior o en el exterior de las células hospedadoras. Dicho polipéptido o fragmento puede utilizarse como agente sensibilizante. Además, puede utilizarse también como antígeno sensibilizante, una célula que expresa al polipéptido, un lisado de dichas células o un polipéptido sintetizado químicamente dado a conocer en la presente memoria. Preferentemente, un péptido corto está unido de manera apropiada a una proteína transportadora tal como la hemocianina de la lapa californiana, la albúmina del suero bovino o la ovoalbúmina, a fin de preparar un antígeno.

Los mamíferos que se van a inmunizar con dicho antígeno sensibilizante no están específicamente limitados. Preferentemente, los mamíferos se seleccionan en vista de la compatibilidad con una célula madre que va a utilizarse para la fusión celular. En general, se utilizan animales del orden Rodentia, del orden Lagomorpha o del orden Primates.

Como animales del orden Rodentia, se utilizan, por ejemplo, ratones, ratas y hámsteres. Como animales del orden Lagomorpha, se utilizan, por ejemplo, conejos. Como animales del orden Primates, se utilizan, por ejemplo, monos. Como tales monos, se utilizan monos del orden Catarrhíni (monos del Viejo Mundo), tales como los monos que se alimentan de cangrejos, monos Rhesus, babuinos Hamadryas y chimpancés.

Los animales se inmunizan con un agente sensibilizante según un procedimiento conocido. En un procedimiento general, se inyecta por vía intraperitoneal o subcutánea un antígeno sensibilizante en los mamíferos. Específicamente, un antígeno sensibilizante se diluye y se pone en suspensión en una cantidad apropiada utilizando PBS (solución salina tamponada con fosfatos) o solución salina fisiológica. Si se desea, un adyuvante general, tal como el adyuvante completo de Freund, se mezcla en una cantidad apropiada con la suspensión. Después de la emulsión, el resultante se administra a los mamíferos. Además, resulta preferido administrar varias veces el antígeno sensibilizante (que se ha mezclado en una cantidad apropiada con el adyuvante incompleto de Freund) durante un período de cada 4 a 21 días. Además, en el momento de la inmunización con un antígeno sensibilizante, puede utilizarse un vehículo apropiado. La inmunización se realiza tal como se describió anteriormente. Se confirma un aumento en la concentración del anticuerpo deseado en el suero por un método normalizado.

En la presente, para obtener un anticuerpo policlonal contra el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, tras la confirmación de un aumento en la concentración de anticuerpo deseada en el suero, se extrae sangre de mamíferos que han sido sensibilizados con el antígeno. Se separa el suero de la sangre por un procedimiento conocido. Como anticuerpos policlonales pueden utilizarse también suero que contiene anticuerpos policlonales. Si es necesario, una fracción que contiene anticuerpos policlonales puede aislarse además del suero y utilizarse a continuación. Por ejemplo, puede prepararse inmunoglobulina G o M obteniendo una fracción para el reconocimiento de sólo el polipéptido dado a conocer en la presente memoria utilizando una columna de afinidad (con la que se ha acoplado el polipéptido dado a conocer en la presente memoria) y a continuación purificando la fracción utilizando una columna con proteína A o una columna con proteína G.

Para obtener un anticuerpo monoclonal, tras la confirmación de un aumento en la concentración deseada del anticuerpo en el suero de un mamífero que ha sido sensibilizado con el antígeno anterior, se extraen inmunocitos del mamífero y a continuación se someten a fusión celular. En este momento, un ejemplo particularmente preferido de dicho inmunocito que debe utilizarse para la fusión celular es un esplenocito. La otra célula (madre) que va a fusionarse con el inmunocito anterior, es preferentemente una célula de mieloma de mamífero y más preferentemente una célula de mieloma que ha adquirido propiedades para la selección de las células de fusión resultantes mediante la utilización de un fármaco.

La fusión celular del inmunocito anterior con una célula de mieloma puede realizarse según básicamente un procedimiento conocido tal como el procedimiento de Milstein et al. (Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Los hibridomas obtenidos por fusión celular se seleccionan en una solución de cultivo general para selección, tal como una solución de cultivo HAT (solución de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en dicha solución de cultivo HAT, es prolongado durante un tiempo suficiente para que mueran otras células (células no fusionadas) aparte de los hibridomas diana. En general, el cultivo se lleva a cabo durante varios días a varias semanas. A continuación, se realiza un procedimiento general de dilución limitativa. Después, se lleva a cabo la identificación y la clonación de

hibridomas para producir un anticuerpo diana.

Los hibridomas anteriores se obtienen inmunizando animales no humanos con un antígeno. Además de por este procedimiento, los hibridomas que producen un anticuerpo humano deseado que tienen actividad de fijación a un polipéptido pueden obtenerse también por sensibilización in vitro de linfocitos humanos, tales como los linfocitos humanos que han sido infectados con el virus EB, con un polipéptido, una célula que expresa el polipéptido o un lisado de los mismos, seguido de fusión de los linfocitos sensibilizados de este modo con células de mieloma con capacidad humana modificada para dividirse permanentemente, tal como U266 (publicación de patente JP (Kokai) nº 63-17688 A (1988)).

Posteriormente, los hibridomas obtenidos de este modo se trasplantan a una cavidad abdominal de ratón y a continuación se extrae la ascitis del ratón. El anticuerpo monoclonal obtenido de este modo puede prepararse por purificación utilizando, por ejemplo, una precipitación con sulfato amónico, una columna con proteína A, una columna con proteína G, cromatografía de intercambio iónico con DEAE, o una columna de afinidad con la que el polipéptido de la presente invención se ha acoplado. Dicho anticuerpo se utiliza también para la purificación o detección del polipéptido dado a conocer en la presente memoria, y se utiliza como candidato de un agonista o un antagonista del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Con el fin, por ejemplo, de reducir la antigenicidad heteróloga contra los seres humanos, el anticuerpo recombinante del gen alterado artificialmente tal como un anticuerpo híbrido o un anticuerpo humanizado puede utilizarse de manera apropiada. Dichos anticuerpos génicos recombinantes pueden producirse utilizando un procedimiento conocido. Un anticuerpo híbrido comprende la zona variable de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón y la zona constante de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humano. El ADN que codifica la zona variable de un anticuerpo de ratón está ligado al ADN que codifica la zona constante de un anticuerpo humano. El resultante se incorpora a un vector de expresión, y a continuación el vector se introduce en un hospedador para dar lugar a que el hospedador produzca el producto génico. De este modo puede obtenerse un anticuerpo génico recombinante. Un anticuerpo humanizado se denomina también a un anticuerpo humano reformado. Un anticuerpo humanizado se obtiene trasplantando la zona determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón en la zona determinante de complementariedad de un anticuerpo humano. Las técnicas generales de recombinación génica para esto son también conocidas. Específicamente, las secuencias de ADN diseñadas para que tengan la CDR de un anticuerpo de ratón ligada a la zona marco (FR) de un anticuerpo humano se sintetizan por el procedimiento de PCR en varios oligonucleótidos, oligonucleótidos adyacentes de los cuales tienen una zona de solapamiento en sus partes terminales. El ADN obtenido de este modo se liga al ADN que codifica la zona constante de un anticuerpo humano, el resultante se incorpora en un vector de expresión y a continuación el vector se introduce en un hospedador para dar lugar a que el hospedador produzca el producto génico, de modo que puede obtenerse un anticuerpo génico recombinante (ver la publicación de la solicitud de patente europea nº EP 239 400 y la publicación de la solicitud de patente internacional WO 96/02576). En cuanto a la FR de un anticuerpo humano, que está ligado por CDR, se selecciona la FR que permite la formación de un punto de fijación al antígeno con una buena zona determinante de complementariedad. Si es necesario, para la formación de un punto de fijación al antígeno con la zona determinante de complementariedad apropiada de un anticuerpo humano reformado, pueden sustituirse los aminoácidos de la zona marco de una zona variable (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856). Además, los procedimientos para obtener anticuerpos humanos son también conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo humano deseado con actividad de fijación a un antígeno puede obtenerse también sensibilizando un linfocito humano in vitro con un antígeno deseado o una célula que expresa un antígeno deseado y a continuación fusionando el linfocito sensibilizado a una célula de mieloma humana tal como U266 (ver la publicación de patente JP (Kokoku) nº 1-59878 B (1989)). Además, puede obtenerse un anticuerpo humano deseado inmunizando un animal transgénico que posee todos los repertorios de un gen de anticuerpo humano con un antígeno deseado (ver las publicaciones de la solicitud de patente internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, y WO 96/33735). Además, se conoce también una técnica mediante la cual se obtiene un anticuerpo humano por ensayo de adhesión celular sobre plástico utilizando un banco de anticuerpos humano. Por ejemplo, la zona variable de un anticuerpo humano se expresa como anticuerpo monocatenario (scFv) en la superficie de un fago por un procedimiento de presentación del fago. Puede seleccionarse un fago que se une a un antígeno. Una secuencia de ADN que codifica la zona variable de un anticuerpo humano que se une al antígeno puede determinarse analizando el gen del fago seleccionado de este modo. Cuando la secuencia de ADN del scFv que se une a un antígeno se pone de manifiesto, se construye un vector de expresión apropiado basado en la secuencia, y a continuación puede obtenerse un anticuerpo humano. Estos procedimientos son ya conocidos. En relación con estos procedimientos, puede hacerse referencia a los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388).

Además, el anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo o un producto modificado del anticuerpo, con tal que se una al polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Ejemplos de dicho fragmento de anticuerpo incluyen Fab, F(ab’)2, Fv o Fv(scFv) monocatenario en el que Fv de la cadena H y Fv de la cadena L, están unidos utilizando un enlazador apropiado (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 58795883) y un diacuerpo. Específicamente, se trata un anticuerpo con una enzima tal como papaína o pepsina para generar fragmentos de anticuerpo. Alternativamente, se construye un gen que codifica dicho fragmento de anticuerpo, el gen se introduce en un vector de expresión y a continuación el gen se expresa en una célula hospedadora apropiada (por ejemplo, ver Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; y Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). Se prepara un diacuerpo por dimerización; específicamente, enlazando dos fragmentos (por ejemplo, scFv), cada uno de los cuales se prepara enlazando 2 zonas variables que utilizan un enlazador o similar (en adelante denominado fragmento que compone un anticuerpo). Generalmente, un diacuerpo contiene dos VL y 2 VH (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448 (1993); EP 404 097; WO 93/11161; Johnson et al., Methods in Enzymol. 203, 88-98 (1991); Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996); Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994); John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999); Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448 (1993); y Atwell et al., Mol. Immunol. 33,

1301-1312. (1996)).

Como producto modificado de un anticuerpo, pueden utilizarse también anticuerpos a los que se han unido varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG). El término "anticuerpo" comprende también dicho producto modificado de un anticuerpo. Dichos productos modificados de un anticuerpo pueden obtenerse modificando químicamente un anticuerpo obtenido. Sus procedimientos han sido ya establecidos en este campo.

Los anticuerpos obtenidos como se describió anteriormente pueden purificarse hasta un nivel uniforme. Para separar y purificar los anticuerpos utilizados en la presente memoria, pueden utilizarse procedimientos de separación y purificación que se utilizan generalmente para polipéptidos. Pueden separarse y purificarse anticuerpos mediante la selección o combinación apropiada, por ejemplo, de una columna para cromatografía, tal como cromatografía de afinidad, un filtro, ultrafiltración, precipitación por sales, diálisis, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y un método de concentración isoeléctrica (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Sin embargo, los procedimientos para la separación y purificación no se limitan a los procedimientos anteriores. Las concentraciones de anticuerpos obtenidos anteriormente pueden medirse por medición de la absorbancia, ensayo de inmunosorbente con enzima ligada (ELISA) o similares.

Los ejemplos de una columna que debe utilizarse para cromatografía de afinidad incluyen una columna con proteína A y una columna con proteína G. Ejemplos de una columna que utiliza proteína A incluyen Hyper D, POROS y Sefarosa F.F. (Pharmacia).

Otros ejemplos de cromatografía además de la cromatografía de afinidad incluyen la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrófoba, la filtración en gel, la cromatografía en fase inversa y la la cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estos tipos de cromatografía pueden realizarse utilizando cromatografía en fase líquida, tal como HPLC o FPLC.

Como procedimiento de medición de la actividad de la fijación al antígeno del anticuerpo, pueden utilizarse medición de absorbancia, ELISA (ensayo inmunosorbente con enzima ligada), EIA (inmunoanálisis con enzima ligada), RIA (radioinmunoanálisis) o una técnica de anticuerpo fluorescente, por ejemplo, cuando se utiliza ELISA, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se añade a una placa en la que se ha inmovilizado el anticuerpo y a continuación se añade una muestra que contiene un anticuerpo diana, tal como el sobrenadante del cultivo de células productoras de anticuerpo o un anticuerpo purificado. Se añade un anticuerpo secundario que reconoce un anticuerpo marcado con una enzima tal como fosfatasa alcalina y a continuación se incuba la placa. Después del lavado se añade un sustrato de enzima tal como fosfato de p-nitrofenilo y a continuación se mide la absorbancia, para que pueda evaluarse la actividad de fijación al antígeno. Como polipéptido, puede utilizarse también un fragmento de polipéptido, tal como un fragmento que comprende el terminal C del polipéptido. Para la evaluación de la actividad del anticuerpo, puede utilizarse BIAcore (producido por Pharmacia).

El procedimiento para detectar o medir el polipéptido dado a conocer en la presente memoria comprende poner en contacto el anticuerpo con una muestra que supuestamente contiene el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y detectar

o medir un complejo inmunitario del anticuerpo y el polipéptido. Mediante la utilización de estas técnicas, puede realizarse el procedimiento para detectar o medir el polipéptido dado a conocer en la presente invención. El procedimiento para detectar o medir el polipéptido dado a conocer en la presente memoria permite la detección específica o la medición de polipéptido. Por consiguiente, el procedimiento es útil en varios experimentos y similares que utilizan polipéptidos.

También se da a conocer en la presente memoria ADN que codifica el polipéptido transportador de fucosa CH o un polinucleótido que comprende por lo menos 15 nucleótidos complementarios con una cadena complementaria de ADN.

En la presente "cadena complementaria" indica una cadena que es complementaria de la otra cadena cuando las dos cadenas forman un ácido nucleico bicatenario; es decir, un par de bases constituido por A:T (en el caso del ARN, "U") o un par de bases constituido por G:C. Además, "complementaria" no se limita a un caso en el que una secuencia es completamente complementaria de una secuencia por lo que se refiere a una zona constituida por al menos 15 nucleótidos de la secuencia. Una secuencia complementaria, que puede utilizarse en la presente memoria presenta por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente 90% y aún más preferentemente 95% o más homología por lo que se refiere a la secuencia nucleotídica. Como algoritmo para la determinación de la homología, puede usarse el algoritmo descrito en esta memoria.

Los oligonucleótidos complementarios utilizados pueden ser monocatenarios, bicatenarios o de mayor número de cadenas.

Los nucleótidos pueden ser ADN, ARN o mezclas de ADN y ARN.

Dicho ácido nucleico puede utilizarse para sondas y cebadores que han de utilizarse para detectar o ampliar ADN que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, sondas y cebadores que han de utilizarse para detectar la expresión de dicho ADN, la producción de chips de ADN y similares.

Además, en la presente memoria se incluyen nucleótidos o derivados nucleotídicos (por ejemplo, un oligonucleótido complementario, un ribozima o los ADN que los codifican) para controlar la expresión del polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Cuando la expresión del polipéptido dado a conocer en la presente memoria está inhibida, una zona diana para esto no está específicamente limitada. Una zona que codifica una proteína, una zona 5’ sin traducción o similares pueden ser diana. Por ejemplo, un oligonucleótido complementario que inhibe la expresión del polipéptido dado a conocer en la presente memoria puede inhibir el transporte de fucosa en el aparato de Golgi en células CHO, con el fin de poder inhibir la adición de fucosa a un anticuerpo. Por lo tanto, dicho oligonucleótido complementario es útil para la producción de un anticuerpo con gran actividad citotóxica y similares.

Cuando se utiliza un cebador, la zona lateral 3’ está concebida para que sea una zona complementaria, y una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, una

etiqueta o similares puede añadirse al lado 5’.

Un ejemplo de oligonucleótido complementario es un oligonucleótido complementario que se hibrida en cualquier posición en la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1 o una secuencia complementaria de la misma. Preferentemente, dicho oligonucleótido complementario corresponde por lo menos a 15 nucleótidos de la secuencia, en la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1. Más preferentemente, dicho oligonucleótido complementario se caracteriza porque al menos 15 nucleótidos de la secuencia contienen un codón de iniciación de la traducción. Las condiciones de hibridación específicas son, por ejemplo, las condiciones anteriores.

Como oligonucleótidos complementarios, pueden utilizarse productos derivados o modificados de los mismos. Ejemplos de dichos productos modificados incluyen los productos de tipo fosfonato de metilo o de tipo fosfonato de etilo tales como fosfonato de alquilo inferior modificado, fosforotioato modificado y fosforoamidita modificada.

Los ejemplos de dichos oligonucleótidos complementarios, incluyen no solamente oligonucleótidos complementarios (en los que todos los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos que componen una zona predeterminada de ADN o ARNm forman una secuencia complementaria), sino que incluyen además, con tal que el ADN o el ARNm y los oligonucleótidos puedan hibridarse específicamente con la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1, los oligonucleótidos en los que está presente una incompatibilidad de 1 o diversos nucleótidos.

El derivado oligonucleotídico complementario actúa sobre las células que producen el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y se unen ADN o ARNm codificando el polipéptido, inhibiendo con ello la transcripción o traducción y favoreciendo la degradación del ARNm. Como resultado de la supresión de la expresión del polipéptido dado a conocer en la presente memoria, el derivado tiene un efecto de suprimir la acción del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Cuando se utiliza ARN como oligonucleótido, tiene lugar un fenómeno que generalmente se denomina interferencia por ARN (iARN). La iARN es un fenómeno mediante el cual cuando se introduce ARN bicatenario (ARNds) en una célula, el ARNm intracelular correspondiente a la secuencia de ARN, se degrada específicamente de modo que el gen no se expresa como proteína. En el caso de iARN, se utiliza generalmente ARN bicatenario, pero iARN no se limita a esto. Por ejemplo, pueden utilizarse también dobles cadenas que se forman en los ARN monocatenarios complementarios. En cuanto a las zonas donde se forman dobles cadenas, pueden formarse dobles cadenas en todas las zonas o cadenas unitarias o similares en zonas parciales (por ejemplo, en ambos extremos o en un extremo). La longitud del oligo ARN que ha de utilizarse para iARN no está limitada. La longitud del oligoARN de la presente invención es, por ejemplo, 5 a 1.000 nucleótidos (en el caso de cadenas dobles, 5 a 1000 pb, preferentemente 10 a 100 nucleótidos (en el caso de dobles cadenas, 10 a 100 pb), preferentemente además 15 a 25 nucleótidos (en el caso de dobles cadenas, 15 a 25 pb), y en particular, preferentemente 19 a 23 nucleótidos (en el caso de dobles cadenas, 19 a 23 pb).

Además, en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para identificar un compuesto que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Dicho procedimiento comprende poner en contacto al polipéptido dado a conocer en la presente memoria con una muestra que ha de analizarse que contiene supuestamente un compuesto que se fija al polipéptido, detectando la actividad de fijación entre el polipéptido y la muestra que ha de analizarse, y a continuación seleccionando el compuesto que tiene actividad de fijación al polipéptido descrito en la presente memoria.

Además, en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para identificar una sustancia que inhibe la actividad de transporte de la fucosa, y específicamente la actividad de transporte de GDP-fucosa, del polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Dicho procedimiento comprende poner en contacto el polipéptido dado a conocer en la presente memoria con una muestra que va a analizarse, detectar la actividad de transporte de la fucosa del polipéptido dado a conocer en la presente memoria y a continuación seleccionar un compuesto que inhibe la actividad de transporte de la fucosa del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

El polipéptido dado a conocer en la presente memoria que se utiliza para la identificación puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido obtenido en la naturaleza o un péptido parcial. Además, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria que ha de utilizarse para la identificación puede estar en una forma mediante la cual se expresa en la superficie de la célula o en forma de una fracción de membrana. Ejemplos de una muestra que va a analizarse no están específicamente limitados e incluyen extractos celulares, sobrenadantes de cultivo celular, productos de fermentación de microorganismos, extractos de organismos marinos, extractos de plantas, polipéptidos purificados o purificados ordinariamente, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos de bajo peso molecular y compuestos naturales. El polipéptido dado a conocer en la presente memoria (que se pone en contacto con dicha muestra que ha de analizarse) puede ponerse en contacto en forma de, por ejemplo, un polipéptido purificado, un polipéptido soluble, un polipéptido unido a un vehículo, un polipéptido que se fusiona con otro polipéptido, un polipéptido expresado en la membrana celular o una fracción de la membrana, con una muestra que va a analizarse.

Como procedimiento para la identificación de un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, pueden utilizarse muchos procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Dicha identificación puede realizarse, por ejemplo, por un procedimiento de inmunoprecipitación. Específicamente, dicha identificación puede realizarse de la forma siguiente. Un gen que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se inserta en un vector para expresar un gen extraño, tal como pSV2neo, pcADN I o pCD8, de modo que el gen se expresa en células animales o similares. Como activadores para ser utilizados para la expresión, pueden utilizarse algunos activadores utilizados generalmente. Ejemplos de dicho activador incluyen un activador precoz de SV40 (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, Londres, págs. 83-141 (1982)); un activador de EF1α (Kim et al., Gene 91, págs. 217-223. (1990)), un activador de CAG (Niwa et al., Gene 108, págs. 193-200 (1991)), un activador LTR de RSV (Cullen Methods in Enzimology, 152, págs. 684-704 (1987)), un activador de SRα (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, pág. 466 (1988)), un activador precoz inmediato de CMV (Seed y Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 84, págs. 3365-3369 (1987)); un activador tardío de SV40 (Gheysen y Fiers, J. Mol. Appl. Genet. 1, págs. 385-394 (1982)), un activador tardío de Adenovirus (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9, pág. 946 (1989)) y un activador TK del HSV.

Los ejemplos de un procedimiento para expresar un gen extraño introduciendo el gen en células animales incluyen un procedimiento de electroporación (Chu, G. et al., Nucl. Acid. Res. 15, 1311-1326 (1987)), un procedimiento con fosfato de calcio (Chen, C. y Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987)), un procedimiento con DEAE dextrano (Lopata, M. A. et al., Nucl. Acid. Res. 12, 5707-5717 (1984)); Sussman, D.J. y Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985)), y un procedimiento con lipofectina (Derijard, B., Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T., et al., Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K., et al., Science, 259, 230-234 (1993)). Puede utilizarse cualquiera de estos procedimientos.

El polipéptido dado a conocer en la presente memoria puede expresarse como polipéptido de fusión introduciendo una secuencia de reconocimiento (epítopo) de un anticuerpo monoclonal cuya especificidad se ha aclarado, en el terminal N o C del polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Como sistema epítopo-anticuerpo que va a utilizarse en la presente memoria, puede utilizarse un sistema comercial (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)). Están comercializados un vector que permite la expresión de un polipéptido de fusión con β-galactosidasa, una proteína que se fija a la maltosa, glutation-S-transferasa, una proteína fluorescente verde (GFP) o similares a partir de un punto de clonación.

Para mantener inalteradas las propiedades del polipéptido dado a conocer en la presente memoria tanto como sea posible cuando se prepara en forma de un polipéptido de fusión, se ha publicado un procedimiento en el que solamente se introduce una pequeña parte del epítopo constituida por varios a más de una docena de aminoácidos, para preparar un polipéptido de fusión. Por ejemplo, epítopos tales como polihistidina (Histag), hemoaglutinina HA de la gripe, c-myc humana, FLAG, una glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-GP), una proteína con T7 gen 10 (T7-tag), una glucoproteína del virus del herpes simple humano (HSV-tag) y una E-tag (un epítopo en un fago monoclonal) y anticuerpos monoclonales que reconocen dichos epítopos pueden utilizarse como sistemas epítopo-anticuerpo para identificar polipéptidos que se unen al polipéptido dado a conocer en la presente memoria (Experimental Medicine, 13, 85-90 (1995)).

En inmunoprecipitación, dicho anticuerpo se añade a una solución de lisis celular preparada utilizando un tensioactivo apropiado, a fin de formar un complejo inmunitario. El complejo inmunitario comprende el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, un polipéptido capaz de unirse a éste y un anticuerpo. Además de la utilización de un anticuerpo contra el epítopo anterior, la inmunoprecipitación puede realizarse también utilizando un anticuerpo contra el polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Dicho anticuerpo contra el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, puede prepararse, por ejemplo, introduciendo un gen que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria en un vector de expresión de Escherichia coli apropiado para la expresión en Escherichia coli, purificando el polipéptido expresado de esta manera y a continuación inmunizando conejos, ratones, ratas, cabras, pollos o similares con el polipéptido. Además, dichos anticuerpos pueden prepararse también inmunizando un péptido parcial del polipéptido sintetizado dado a conocer en la presente memoria con los animales anteriores.

Los complejos inmunitarios pueden precipitarse utilizando, por ejemplo, Proteína A Sefarosa o Proteína G Sefarosa si los anticuerpos son anticuerpos IgG de ratón. Además, cuando el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se prepara como, por ejemplo, un polipéptido de fusión con un epítopo tal como GST, puede formarse también un complejo inmunitario utilizando una sustancia tal como glutatión Sefarosa 4B que se une específicamente a dicho epítopo de manera similar a la del caso en que se utiliza un anticuerpo del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Los procedimientos generales para la inmunoprecipitación se pueden realizar según, por ejemplo, un procedimiento descrito en la bibliografía (Harlow, E. y Lane, D.: Antibodies, págs. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, Nueva York (1988)).

La SDS-PAGE se utiliza generalmente para el análisis de polipéptidos inmunoprecipitados. Mediante la utilización del gel con una concentración apropiada, puede analizarse un polipéptido unido basándose en el peso molecular del polipéptido. En ese momento es generalmente difícil detectar dicho polipéptido que se ha unido al polipéptido dado a conocer en la presente memoria mediante un procedimiento de tinción general de polipéptidos, tal como la tinción Coomassie o la tinción con plata. La sensibilidad de la detección puede mejorarse cultivando células en una solución de cultivo que contiene 35S-metionina o 35S-cisteína, que es un isótopo radioactivo a fin de marcar polipéptidos en las células y detectarlas a continuación. Si la cantidad molecular de un polipéptido se pone de manifiesto, dicho polipéptido diana puede purificarse directamente en el gel de SDS-poliacrilamida y a continuación puede determinarse la secuencia del mismo.

Además, como método de aislamiento de un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, puede utilizarse, por ejemplo, un método de inmunotransferencia Western (Skolnik, E. Y., et al., Cell, (1991), 65, 83-90). Específicamente, se construye un banco de ADNc de células, tejidos u órganos (por ejemplo, de testículos) que se prevé que expresan un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria utilizando un vector de fago (por ejemplo, λgt11 y ZAP). El resultado se expresa a continuación en LB-agarosa y a continuación el polipéptido expresado se inmoviliza en un filtro. El polipéptido purificado y marcado dado a conocer en la presente memoria se produce para reaccionar con el filtro anterior. Posteriormente, se detectan las placas que expresan polipéptidos que se unen al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, basándose en los marcadores. Ejemplos de un procedimiento para marcar el polipéptido dado a conocer en la presente memoria incluyen un procedimiento que utiliza el enlace entre la biotina y la avidina, un procedimiento que utiliza un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido dado a conocer en la presente memoria o un polipéptido (por ejemplo, GST) que se fusiona con el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, un procedimiento que utiliza un radioisótopo y un procedimiento que utiliza fluorescencia.

Otra forma de realización del procedimiento de identificación dado a conocer en la presente memoria es un procedimiento que se realiza utilizando un sistema de 2 híbridos que utilizan células (Fields, S., y Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994), 10, 286-292; Dalton, S. y Treisman, R. (1992), Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element., Cell 68, 597-612; "MATCHMAKER Two-Hybrid System", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMARKER One-Hybrid System" (todos estos sistemas y kits son producidos por Clontech) e "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (producido por Stratagene Corp.).

En el sistema de 2 híbridos, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria

o un péptido parcial del mismo se fusiona con una zona de fijación SRF al ADN o una zona GAL4 de fijación al ADN y a continuación el producto se expresa en células de levadura. Se construye un banco de ADNc que se expresa mientras se está fusionando con una zona de activación de la transcripción de VP16 o GAL4 a partir de las células que se prevé que expresan un polipéptido que se fija al polipéptido dado a conocer en la presente memoria. El banco de ADNc se introduce a continuación en las células de levadura anteriores. Un ADN procedente del banco se aísla a partir de un clon positivo detectado. (Un clon positivo puede confirmarse cuando un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria se expresa en una célula de levadura, después de lo cual se activa debido al enlace de los dos). Introduciendo el ADN aislado en Escherichia coli para la expresión, puede obtenerse el polipéptido codificado por el ADNc. Por consiguiente, puede prepararse un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria o el gen del mismo.

Los ejemplos de un gen informador que ha de utilizarse en el sistema de 2 híbridos comprenden de manera no limitativa además de un gen HIS3, un gen Ade2, un gen LacZ, un gen CAT, un gen de luciferasa y un gen PAI-1 (inhibidor tipo 1 del activador de plasminógeno). La identificación por el procedimiento de 2 híbridos puede realizarse también utilizando células de mamífero además de levadura.

Un compuesto que se une al polipéptido dado a conocer en la presente invención puede identificarse también utilizando cromatografía de afinidad. Por ejemplo, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria está inmovilizado por un vehículo de una columna de afinidad y a continuación se aplica una muestra que va a ser analizada, que se prevé que exprese un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Ejemplos de muestra que ha de ser analizada en este caso incluyen un extracto celular y un lisado celular. Tras la aplicación de una muestra que se va a analizar, se lava la columna y a continuación puede prepararse un polipéptido que se ha unido al polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido obtenido de este modo se analiza y a continuación se sintetiza un oligo ADN basado en la secuencia. Un ADN que codifica el polipéptido puede obtenerse cribando un banco de ADNc que utiliza el ADN como sonda.

Además, un ejemplo de un procedimiento para aislar no solamente un polipéptido sino además un compuesto (incluyendo agonistas y antagonistas) que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, que es conocido por los expertos en la materia, es un procedimiento que implica producir un compuesto sintético, un banco de productos naturales, o un banco de presentación de péptidos al fago aleatorio para actuar sobre el polipéptido inmovilizado y a continuación identificar una molécula que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, o un procedimiento de identificación utilizando alta resolución basado en la tecnología de la química combinatoria (Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (Estados Unidos) 26 julio 1996, 273, págs. 458-64; Verdine GL.,

The combinatorial chemistry of nature, Nature (Inglaterra) 7 nov. 1996, 384, págs. 11-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial Chemistry, Nature (Inglaterra) 7 nov. 1996, 384, págs. 17-9).

Un biosensor que utiliza el fenómeno de resonancia de plasmones de superficie puede utilizarse también como medio para detectar o medir compuestos ligados. Con dicho biosensor, la interacción entre el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y un compuesto que va a ser analizado puede observarse en tiempo real en forma de señales de resonancia de plasmones de superficie utilizando una cantidad fina de polipéptidos sin marcarlos (por ejemplo, producidos por BIAcore o Pharmacia). Por consiguiente, mediante la utilización de un biosensor producido por BIAcore o similar puede evaluarse el enlace entre el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y un conjunto que va ser analizado.

Un procedimiento para identificar una sustancia que inhibe la actividad de transporte de la fucosa del polipéptido dado a conocer en la presente memoria puede realizarse por un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se expresa sobre una membrana (por ejemplo, membrana celular, membrana del aparato de Golgi o membrana vírica). La fucosa marcada con una sustancia fluorescente o similar se pone en contacto con una sustancia que va a analizarse y a continuación se mide la cantidad de fucosa incorporada. De este modo puede identificarse una sustancia que inhibe la actividad de transporte de la fucosa del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Un compuesto que puede aislarse mediante el cribado dado a conocer en la presente memoria es un candidato para regular la actividad del polipéptido dado a conocer en la presente memoria y puede aplicarse para la producción de un anticuerpo con gran actividad citotóxica.

"Transportador de fucosa" hace referencia a un polipéptido que tiene actividad de transporte de fucosa. Por ejemplo, cuando un transportador de fucosa se expresa en la membrana celular, generalmente incorpora fucosa en las células. Cuando un transportador de fucosa se expresa en la membrana de Golgi, generalmente incorpora fucosa en el aparato de Golgi. Un transportador de fucosa preferido es un transportador de fucosa del hámsteres chino, y un ejemplo más preferido es un transportador de fucosa que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2. La SEC. ID. nº 1 presenta la secuencia nucleotídica del gen transportador de fucosa del hámsteres chino.

Un procedimiento para disminuir la fucosa que existe en el aparato de Golgi no está específicamente limitado. Es decir, dicha fucosa puede disminuir por cualquier método. Un ejemplo de dicho método es un método mediante el cual disminuye la cantidad de fucosa que debe incorporarse en el aparato de Golgi.

El aparato de Golgi incorpora fucosa dentro del mismo principalmente mediante transportadores de fucosa que existen en la membrana de Golgi. Por inhibición de las funciones del transportador de la fucosa, la incorporación de la fucosa al aparato de Golgi puede inhibirse y la cantidad de fucosa que ha de incorporarse al aparato de Golgi puede disminuirse.

Inhibir las funciones de transportador de fucosa de las células significa producir una disminución o desaparición de la actividad del transporte de fucosa de un transportador de fucosa.

Las funciones de transportador de fucosa de las células pueden inhibirse por cualquier procedimiento, es decir, por un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Ejemplos específicos de dicho procedimiento incluyen un procedimiento mediante el cual el número de transportadores de fucosa disminuye al inhibir la expresión del transportador de fucosa, o similar, y un procedimiento mediante el cual la capacidad de transporte de fucosa de un transportador de fucosa se reduce mediante la utilización, por ejemplo, de un antagonista para el transportador de fucosa.

Un procedimiento para inhibir la expresión del transportador de fucosa no está específicamente limitado, con tal que disminuya el número de transportadores de fucosa con capacidad normal de transporte. La expresión del transportador de fucosa puede inhibirse, por ejemplo, por eliminación de un gen transportador de fucosa contenido en un genoma, la inhibición del procedimiento para la transcripción a ARNm, la degradación de ARNm o la inhibición del proceso para la traducción en proteínas. Ejemplos específicos de un procedimiento para inhibir la expresión de un gen transportador de fucosa incluyen un procedimiento que implica eliminar (modificar genéticamente) un gen que codifica un transportador de fucosa utilizando un vector de reconocimiento o similar que dirige al transportador de fucosa, un procedimiento que utiliza un ADN complementario para un gen que codifica un transportador de fucosa o un procedimiento que utiliza interferencia por ARN (iARN). Las células que tienen transportadores de fucosa inhibidos pueden ser células que tienen funciones de transportadores de fucosa que han sido inhibidas por cualquier procedimiento. Para la utilización en la producción de productos farmacéuticos y similares, las células para las que no se utiliza Cre-loxp son preferibles como células con cromosomas muy estables (Schumidt E.E. et al., PNAS 97, 13702-13707 (Feb. 2001)).

La proteína producida por el procedimiento de producción dado a conocer en la presente memoria puede ser cualquier proteína. En general, dicha proteína es una glucoproteína y preferentemente un anticuerpo.

Los tipos de anticuerpos que se producen por el procedimiento dado a conocer en la presente memoria no están específicamente limitados. Por ejemplo, pueden utilizarse de manera apropiada anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de oveja, anticuerpos de camello, anticuerpos humanos y anticuerpo recombinante con gen alterado (con el fin, por ejemplo, de reducir la antigenicidad heteróloga contra seres humanos) tal como un anticuerpo híbrido o un anticuerpo humanizado. Dichos anticuerpos génicos recombinantes pueden producirse utilizando un procedimiento conocido. Un anticuerpo híbrido comprende la zona variable de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón y la zona constante de las cadenas pesada y ligera de una anticuerpo humano. El ADN que codifica la zona variable de un anticuerpo de ratón está ligado al ADN que codifica la zona constante de un anticuerpo humano. El resultante se incorpora en un vector de expresión, y a continuación se introduce el vector en un hospedador para dar lugar a que el hospedador produzca el producto génico. De este modo puede obtenerse un anticuerpo génico recombinante. Un anticuerpo humanizado se denomina también anticuerpo humano reformado. Un anticuerpo humanizado se obtiene trasplantando la zona determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón a la zona determinante de complementariedad de un anticuerpo humano. Las técnicas de recombinación génica generales para esto son también conocidas. Específicamente, las secuencias de ADN diseñadas para que tengan la CDR de un anticuerpo de ratón ligada a la zona del marco (FR) de un anticuerpo humano se sintetizan por el procedimiento de PCR procedente de varios oligonucleótidos, oligonucleótidos adyacentes de los que tienen una zona de solapamiento en sus partes terminales. El ADN obtenido de este modo se liga al ADN que codifica la zona constante de un anticuerpo humano, el resultante se incorpora en un vector de expresión y a continuación el vector se introduce en un hospedador para dar lugar a que el hospedador produzca el producto génico, a fin de que pueda obtenerse el anticuerpo génico recombinante (ver la publicación de solicitud de patente europea EP 239 400 y la publicación de solicitud de patente internacional WO 96/02576). Como FR de un anticuerpo humano, que está ligada por CDR, se selecciona la FR que permite la formación de un punto de fijación al antígeno con una zona determinante de complementariedad adecuada. Si es necesario, para la formación de un punto de fijación al antígeno que tiene la zona determinante de complementariedad apropiada de un anticuerpo humano reformado, pueden sustituirse los aminoácidos de la zona del marco de una zona variable del anticuerpo (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856). Además, se conocen también los procedimientos para obtener anticuerpos humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humano deseado con actividad de enlace a un anticuerpo puede obtenerse también sensibilizando un linfocito humano in vivo con un antígeno deseado o una célula que expresa un antígeno deseado y a continuación fusionando el linfocito sensibilizado a una célula de mieloma humano tal como U266 (ver la publicación patente JP (Kokoku) nº 1-59878 B (1989)). Además, puede obtenerse un anticuerpo humano deseado inmunizando un animal transgénico que tiene todos los repertorios de un gen de anticuerpo humano con un antígeno deseado (véanse las publicaciones de solicitud de patente internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/2558, WO 96/34096 y WO 96/33735). Además, se conoce una técnica mediante la cual se obtiene un anticuerpo humano por ensayo de adhesión al plástico utilizando un banco de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la zona variable de un anticuerpo humano se expresa como anticuerpo monocatenario (scFv) sobre la superficie de un fago por un método de exposición en fagos. Un fago que se une a un antígeno puede seleccionarse. Una secuencia de ADN que codifica la zona variable de un anticuerpo humano que se une al antígeno puede determinarse analizando el gen del fago seleccionado de este modo. Cuando la secuencia de ADN de scFv que se une a un antígeno se pone de manifiesto, se construye un vector de expresión apropiado basándose en la secuencia, y a continuación puede obtenerse un anticuerpo humano. Estos procedimientos son ya conocidos. Haciendo referencia a estos procedimientos, pueden citarse los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388.

Además, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de peso molecular inferior tal como un fragmento de anticuerpo o un producto modificado del anticuerpo, con tal que dicho anticuerpo pueda unirse a un antígeno. Ejemplos de dicho fragmento de anticuerpo incluyen Fab, F(ab’)2, Fv o Fv(scFv) monocatenario en el que Fv de la cadena H y Fv de la cadena L, están unidos utilizando un enlazador apropiado (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) y un diacuerpo. Para obtener dicho fragmento de anticuerpo, se construye un gen que codifica dicho fragmento de anticuerpo, y a continuación el gen se expresa en una célula hospedadora apropiada (por ejemplo, ver Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; y Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). Se prepara un diacuerpo por dimerización; específicamente, enlazando dos fragmentos (por ejemplo, scFv), cada uno de los cuales se prepara enlazando 2 zonas variables utilizando un enlazador o similar (en adelante, denominado fragmento que compone un anticuerpo). Generalmente, un diacuerpo 2 VL y 2 VH (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448 (1993); documentos EP 404 097 y WO 93/11161; Johnson et al., Methods in Enzymol. 203, 88-98 (1991); Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996); Perisic et al., Structure, 2, 12171226, (1994); John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999); Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448 (1993); y Atwell et al., Mol. Immunol. 33, 1301-1312. (1996)).

Como producto modificado de un anticuerpo, pueden utilizarse también anticuerpos a los que se han unido varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG). Además, a un anticuerpo puede unirse un isótopo radioactivo, un agente terapéutico químico, una sustancia citotóxica tal como una toxina procedente de una bacteria, o similares. En particular, es útil un anticuerpo radiomarcado. Dicho producto modificado de un anticuerpo puede obtenerse modificando químicamente un anticuerpo obtenido. Además, los procedimientos para modificar anticuerpos han sido ya creados en este campo.

Un polipéptido recombinante puede producirse por un procedimiento conocido por los expertos en la materia. En general, dicho polipéptido recombinante puede purificarse y prepararse de la manera siguiente. El ADN que codifica un polipéptido se incorpora a un vector de expresión apropiado, se recoge un transformado que se ha obtenido introduciendo el vector en una célula hospedadora apropiada y a continuación se obtiene el extracto. Posteriormente, el resultante se somete a cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase inversa o filtración en gel, cromatografía por afinidad utilizando una columna (en la que se ha inmovilizado un anticuerpo contra el polipéptido dado a conocer en la presente memoria) o cromatografía utilizando la combinación de varias de dichas columnas.

Además, cuando la proteína se expresa como polipéptido de fusión con una proteína glutation-S-transferasa o como polipéptido recombinante al que se han añadido diversas histidinas en las células hospedadoras (por ejemplo, células animales o Escherichia coli), el polipéptido recombinante expresado puede purificarse utilizando una columna con glutatión o una columna con níquel. Después de la purificación del polipéptido de fusión, si es necesario, otras zonas aparte del polipéptido diana pueden también escindirse y separarse del polipéptido de fusión utilizando trombina o factor Xa.

La proteína que va a producirse por el procedimiento de producción dado a conocer en la presente memoria es preferentemente un anticuerpo con actividad citotóxica que está afectado por el enlace de la fucosa a éste.

Un procedimiento para producir un anticuerpo utilizando técnicas de recombinación genética, que es bien conocido por los expertos en la materia, implica incorporar un gen de anticuerpo en un vector apropiado, introducir el vector en un hospedador, y de este modo dar lugar a la producción del anticuerpo utilizando técnicas de recombinación genética (por ejemplo, ver Carl, A. K., Borrebaeck, James W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicada en Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).

Además, la presente invención comprende una célula hospedadora que puede producir una proteína extraña, en la que no se añade fucosa a la proteína extraña.

Dichas células se caracterizan porque la fucosa que existe en las células, como por ejemplo en el aparato de Golgi, ha disminuido. Un método para reducir la fucosa que existe en el aparato de Golgi no está específicamente limitado. Es decir, dicha fucosa puede reducirse por cualquier método. Un ejemplo de dicho método es un método mediante el cual disminuye la cantidad de fucosa que debe incorporarse en el aparato de Golgi. El aparato de Golgi incorpora fucosa dentro del mismo principalmente mediante transportadores de fucosa que existen en la membrana de Golgi. Por inhibición de las funciones del transportador de la fucosa, puede inhibirse la incorporación de la fucosa en el aparato de Golgi y la cantidad de fucosa que ha de incorporarse en el aparato de Golgi puede disminuir.

Un procedimiento para inhibir la expresión del transportador de fucosa no está específicamente limitado, con tal que disminuya el número de transportadores de fucosa con capacidad normal de transporte. La expresión del transportador de fucosa puede inhibirse, por ejemplo, por eliminación de un gen transportador de fucosa contenido en un genoma, la inhibición del procedimiento para la transcripción al ARNm, la degradación del ARNm o la inhibición del proceso para la traducción en proteínas. Ejemplos específicos de un procedimiento para inhibir la expresión de un gen transportador de fucosa incluyen un procedimiento que implica eliminar (modificar genéticamente) un gen que codifica un transportador de fucosa utilizando un vector de reconocimiento o similar que dirige al transportador de fucosa, un procedimiento que utiliza un ADN complementario para un gen que codifica un transportador de fucosa o un procedimiento que utiliza interferencia por ARN (iARN). Estos procedimientos se describirán a continuación.

La proteína que no tiene fucosa que se une a ésta, puede obtenerse expresando una proteína extraña que utiliza dichas células con funciones inhibidas de transportador de fucosa como células hospedadoras. En la presente memoria, una proteína extraña significa una proteína que no procede de la propia célula. Las células hospedadoras no están específicamente limitadas. Por ejemplo, pueden utilizarse células en las que se añade azúcar a una proteína recombinante cuando se expresa la proteína. Más específicamente, pueden utilizarse varias células animales o similares. Preferentemente pueden utilizarse células CHO. En particular, las células CHO en las que se ha modificado genéticamente un gen transportador de fucosa pueden utilizarse de manera apropiada. Como células animales, se conocen las células de mamíferos tales como CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, mieloma, BHK (riñón de cría de hámsteres), HeLa y Vero. Como células de anfibio, se conocen, por ejemplo, Xenopus oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340). Como células de insecto se conocen, por ejemplo, Sf9, Sf21 y Tn5. Como células de CHO, pueden utilizarse preferentemente en particular, células dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1968) 77, 4216-4220) o células K-1 de CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 60, 1275) que carecen de un gen DHFR. Para la expresión de la masa en células animales, son particularmente preferidas las células CHO.

La proteína que no tiene ninguna fucosa que se una a esta, puede obtenerse incorporando un gen que codifica a una proteína extraña tal como un anticuerpo que va a ser producido en un vector de expresión y a continuación incorporando el vector de expresión en las células hospedadoras que pueden producir dicha proteína extraña; es decir, células con funciones inhibidas del transportador de fucosa. Ejemplos de vectores incluyen los vectores de expresión procedentes de mamíferos (por ejemplo, pcADN3 (producido por Invitrogen Corporation) y pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), pág. 5322), pEF, y pCDM8), vectores de expresión procedentes de células de insectos (por ejemplo, el "sistema de expresión de baculovirus Bac-a-BAC" (producido por GIBCOBRL Life Technologies Inc.) y pBacPAK8), vectores de expresión procedentes de plantas (por ejemplo, pMH1 y pMH2), vectores de expresión procedentes de virus de animales (por ejemplo, pHSV, pVM y pAdexLcw), vectores de expresión procedentes de retrovirus (por ejemplo, pZIPneo), vectores de expresión procedentes de levaduras (por ejemplo, el "kit de expresión Pichia" (producido por Invitrogen Corporation), pNV11 y SP-Q01) y los vectores de expresión procedentes de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50). Cuando las células CHO se utilizan como células hospedadoras, resulta preferido utilizar un vector procedente de un mamífero.

Para la expresión en células animales tales como células de CHO, las células COS

o las células NIH3T3, generalmente un vector utilizado en la presente memoria ha necesitado un activador para la expresión en las células, tal como un activador de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), un activador de MMLV-LTR y un activador de EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids. Res. 1990, 18, 5322), o un activador de CMV. Resulta más preferido que dicho vector presente un gen para la selección de las células transformadas (por ejemplo, un gen con resistencia a fármacos que permite la distinción mediante la utilización de un fármaco (por ejemplo, neomicina y G418)). Ejemplos de vectores con tales propiedades incluyen pMAM, pDR2, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

Además, un ejemplo de procedimiento para la expresión estable de un gen y la ampliación de numerosas copias de un gen en las células implica la introducción de un vector (por ejemplo, pCHOI) que presenta un gen DHFR complementario en las células de CHO que carecen de la serie de reacciones de síntesis de ácido nucleico, seguido de la ampliación utilizando metrotexato (MTX). Además, un ejemplo de procedimiento para la expresión temporal de un gen conlleva transformar las células COS que tienen un gen que expresa el antígeno SV40 T en el cromosoma con un vector (por ejemplo, pcD) que tiene un origen de replicación de SV40. Como punto de inicio de la replicación, puede utilizarse también un punto procedente de poliomavirus, adenovirus, virus de papiloma bovino (BPV)

o similares. Además, para ampliar el número de copias de un gen en un sistema de células hospedadoras, un vector de expresión puede contener como marcador de selección un gen de aminoglucósido transferasa (APH), un gen de timidina cinasa (TK), un gen de xantina-guanina fosforribosil transferasa (Ecogpt) de Escherichia coli, un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) o similares.

Puede introducirse un vector en una célula hospedadora, por ejemplo, por un procedimiento con fosfato de calcio, un procedimiento con DEAE dextrano, un procedimiento que utiliza ribosoma catiónico DOTAP (producido por Boehringer Mannheim), un procedimiento de electroporación o lipofección.

El cultivo celular puede realizarse según un procedimiento conocido. Como solución de cultivo para células animales, pueden utilizarse, por ejemplo, DMEM, MEM, RPMI1640 o IMDM. En este momento, puede utilizarse junto con éstos un fluido de suero tal como suero de ternero fetal (FCS). Alternativamente puede realizarse el cultivo sin suero. El pH durante el cultivo está comprendido preferentemente entre aproximadamente 6 y 8. El cultivo se lleva a cabo generalmente entre aproximadamente 30ºC y 40ºC durante aproximadamente 15 a 200 horas. Si es necesario, se realizan el intercambio de medio, aireación y agitación.

La proteína producida por las células hospedadoras dada a conocer en la presente memoria puede ser cualquier proteína. En general, dicha proteína es una glucoproteína y preferentemente un anticuerpo.

Los tipos de anticuerpo que se producen por el procedimiento dado a conocer en la presente memoria no están específicamente limitados. Por ejemplo, pueden utilizarse de manera apropiada anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de oveja, anticuerpos de camello, anticuerpos humanos y anticuerpo recombinante de gen alterado (con el fin, por ejemplo, de reducir la antigenicidad heteróloga contra seres humanos) tal como un anticuerpo híbrido o un anticuerpo humanizado. Dichos anticuerpos génicos recombinantes pueden producirse utilizando un procedimiento conocido. La información acerca de los anticuerpos se ha descrito ya anteriormente.

Un ejemplo de una célula en la que la expresión del transportador de fucosa se ha inhibido es una célula en la que un gen que codifica a un transportador de fucosa está destruido. "Destrucción de un gen" hace referencia a la supresión de la expresión del gen por eliminación parcial, sustitución, inserción, adición o similar realizada en la secuencia nucleotídica del gen. "Destrucción de un gen" incluye no solamente un caso en el que la expresión del gen se ha suprimido completamente, sino también un caso en el que la expresión del gen se ha suprimido parcialmente. "Eliminación (modificación genética) de un gen" e "inactivación de un gen" se utilizan también para que tengan un significado equivalente al de "destrucción de un gen". Además, las células que tienen un gen destruido por recombinación homóloga que utilizan reconocimiento génico se denominan células transgénicas. Una célula en la que un gen que codifica un transportador de fucosa se ha destruido es un ejemplo de una célula en la que la expresión del transportador de fucosa se ha suprimido artificialmente. Una célula en la que un gen que codifica un transportador de fucosa se ha destruido es una célula en la que la cantidad de fucosa que existe en el aparato de Golgi ha disminuido de manera significativa en comparación con una célula en la que un gen transportador de fucosa no se ha destruido, una célula en la que la capacidad celular del transporte de fucosa ha disminuido o se ha eliminado, o una célula en la que la actividad intracelular para incorporar fucosa en el aparato de Golgi se ha reducido o eliminado. La cantidad de fucosa en el aparato de Golgi puede medirse aislando el aparato de Golgi de una célula, extrayendo el azúcar y a continuación llevando a cabo una reacción de antígeno con anticuerpo, una reacción de enlace entre el azúcar y la lectina, cromatografía líquida, electroforesis o similar. Además, la capacidad de transporte de la fucosa intracelular y la actividad intracelular para incorporar la fucosa en el aparato de Golgi puede medirse, por ejemplo, utilizando fucosa marcada con una sustancia fluorescente, un radioisótopo o similar.

Un gen puede destruirse, por ejemplo, por un procedimiento de recombinación homóloga.

Dicho procedimiento de recombinación homóloga hace referencia a un procedimiento mediante el cual solamente el gen diana se altera arbitrariamente por recombinación homóloga del gen entre un gen en un cromosoma y un ADN extraño. Otra secuencia de ADN se inserta en un exón de un gen a fin de dividir una secuencia que codifica una proteína. Para facilitar la identificación de una célula que tiene un vector de reconocimiento génico, se utiliza generalmente un marcador de selección tal como un gen con resistencia a la neomicina procedente de una bacteria como secuencia para dividir el gen. Un vector de reconocimiento se diseña y se produce basándose en la información de la frecuencia del gen transportador de fucosa descrita en la presente memoria y el gen transportador de fucosa que va a destruirse se somete a continuación a recombinación homóloga utilizando el vector de reconocimiento. Por ejemplo, un vector de sustitución puede contener una zona homóloga que ha estado ligada a los lados 5’ y 3’ de la mutación que va a introducirse, un marcador de selección positivo, una zona de la enzima de restricción para linealizar el vector fuera de la zona homóloga, un marcador de selección negativo dispuesto fuera de la zona homóloga, una zona de escisión de la enzima de restricción para detectar la mutación y similares. Los vectores de reconocimiento pueden producirse según los procedimientos descritos en, por ejemplo, editados por Kenichi Yamamura et al., Transgenic Animal, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD., 1 marzo 1997; Shinichi Aizawa, Gene Targeting, Production of Mutant Mice using ES cells, Bio Manual Series 8, YODOSHA CO., LTD., 1995; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1944); Joyner, A. L., Gene Targeting, A Practical Approach Series, IRL Press (1993) y editado por Masami Matsumura et al., Experimental Medicine, Separate Volume, New Genetic Engineering Handbook (3ª versión revisada), YODOSHA CO., LTD., 1999. Pueden utilizarse vectores de reconocimiento tanto de inserción como de sustitución. Además, la recombinación puede producirse también por reconocimiento utilizando un sistema Cre-lox. El reconocimiento utilizando el sistema Crelox puede realizarse según un procedimiento descrito, por ejemplo, en la publicación de patente JP (Kohyo) nº 11-503015 A (1999). Como procedimiento para seleccionar recombinantes homólogos que han experimentado recombinación homóloga, puede utilizarse un procedimiento de selección conocido, tal como la selección positiva, selección de activador, selección negativa o selección de poliA. Para la identificación de un recombinante homólogo, puede utilizarse tanto el procedimiento de la PCR como el

procedimiento de inmunotransferencia Southern.

Además, ejemplos de un procedimiento para producir una célula en la que la expresión del transportador de fucosa está inhibida, incluye un procedimiento complementario, un procedimiento con ribozima, un procedimiento que utiliza un retrovirus, un procedimiento que utiliza un transposón, un procedimiento con iARN, un procedimiento con RDO, un procedimiento con TFO y un procedimiento para obtener células creadas partir de mamíferos en el que se ha modificado genéticamente un gen transportador de fucosa.

Un procedimiento complementario es un procedimiento para inhibir la traducción del transportador de fucosa en las células utilizando un oligonucleótido complementario del gen transportador de fucosa dado a conocer en la presente memoria. Un ejemplo de oligonucleótido complementario es un oligonucleótido complementario que se hibrida en cualquier posición en la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1 o una secuencia complementaria de la misma. Por ejemplo, dicho oligonucleótido complementario corresponde generalmente a por lo menos 15 nucleótidos de la secuencia en la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1. Más preferentemente, dicho oligonucleótido complementario se caracteriza porque por lo menos 15 nucleótidos de la secuencia contienen un codón de iniciación de la traducción. Ejemplos de dichos oligonucleótidos complementarios incluyen no solamente oligonucleótidos complementarios (en los que todos los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos que componen una zona predeterminada de ADN o ARNm forman una secuencia complementaria), sino que incluyen también, con tal que el ADN o el ARNm y los oligonucleótidos puedan hibridar específicamente a la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 1, los oligonucleótidos en los que está presente una incompatibilidad de 1 o diversos nucleótidos. Las condiciones específicas para la hibridación son, por ejemplo, condiciones poco severas, dichas condiciones poco severas comprenden, en el lavado después de la hibridación, por ejemplo, 42ºC, 0,1 x SSC y 0,1% de SDS y preferentemente 50ºC, 0,1 x SSC y 0,1% de SDS. Más preferentemente las condiciones de hibridación, son, por ejemplo, condiciones muy severas. Dichas condiciones muy severas comprenden, por ejemplo, 65ºC, 5 x SSC, y 0,1% de SDS. Sin embargo, diversos factores tales como la temperatura y la concentración salina pueden influir en la severidad en relación con la hibridación. Los expertos en la materia pueden realizar una severidad similar a la anterior severidad seleccionando de manera apropiada estos factores.

Como oligonucleótidos complementarios, pueden utilizarse productos derivados o modificados de los mismos. Ejemplos de dichos productos modificados incluyen productos tipo fosfonato de metilo o tipo fosfonato de etilo, tal como fosfonato de alquilo inferior modificado, fosforotioato modificado y fosforoamidato modificado.

Dicho oligonucleótido complementario actúa sobre las células que producen el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y se unen al ADN o ARNm que codifica el polipéptido, inhibiendo de este modo la trascripción o traducción y favoreciendo la degradación del ARNm. Como resultado de la supresión de la expresión del polipéptido dado a conocer en la presente memoria, el oligonucleótido complementario tiene un efecto de supresión de la acción del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Un oligonucleótido complementario se inserta corriente abajo de un activador de un vector de expresión apropiado y a continuación las células hospedadoras pueden transformarse con el vector de expresión.

Un procedimiento con ribozima conlleva la escisión del ARNm de un gen transportador de fucosa en las células que utilizan ARN con actividad para escindir ácidos nucleicos, a fin de evitar la expresión del gen. Un ribozima comprende una zona de reconocimiento complementaria para un ARN sustrato, una zona activa de la enzima en forma de bucle y una zona germinal II que acompaña a la zona activa de la enzima. Dicha zona de reconocimiento puede diseñarse para que sea complementaria con una parte del gen transportador de fucosa. De manera similar a ésta en el procedimiento complementario anterior, se inserta una ribozima corriente abajo de un activador de un vector de expresión apropiado que permite la expresión de la ribozima. Las células hospedadoras se transforman a continuación con el vector de expresión. El procedimiento con ribozima puede realizarse según las descripciones en Cell Technology, 12, 239 (1993); BIO/TECHNOLOGY, 17, 1097, (1999); Hum. Mol. Genet., 5, 1083 (1995); Cell Technology, 13, 255 (1994) y Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 1886 (1999). La identificación de las células que no han podido producir ningún transportador de fucosa debido al procedimiento complementario o al procedimiento con ribozima pueden realizarse utilizando la actividad de transportador de fucosa como índice. Alternativamente, dicha identificación puede llevarse a cabo por inmunotransferencia Western o inmunotransferencia Northern utilizando la transcripción o expresión del gen transportador de fucosa como índice.

Además, un gen transportador de fucosa puede destruirse utilizando un retrovirus. Se introduce un retrovirus en las células hospedadoras infectando las células hospedadoras con el retrovirus. A continuación, se identifican las células que tienen genes transportadores de fucosa destruidos. De este modo, pueden obtenerse células que no tienen actividad de transportador de fucosa. Pueden identificarse células utilizando la actividad de transportador de fucosa como índice. Alternativamente, las células pueden identificarse también por inmunotransferencia Western o inmunotransferencia Northern utilizando la transcripción o la expresión del gen transportador de fucosa como índice.

Además, un gen transportador de fucosa se destruye de manera similar utilizando un transposón. A continuación, las células con genes transportadores de fucosa destruidos se obtienen por cribado. Las células obtenidas de este modo pueden utilizarse también para la producción de anticuerpos. Un sistema de transposón puede construirse según un procedimiento descrito en NatureGent, 25, 35, (2000) o similar.

Además, pueden obtenerse también células en las que la expresión del transportador de fucosa está inhibida utilizando la interferencia por ARN (iARN). La iARN es un fenómeno por el cual cuando se introduce ARN bicatenario (ARNds) en una célula, el ARNm intracelular correspondiente a la secuencia de ARN se degrada específicamente de modo que el gen no se expresa como proteína. En el caso de la iARN, se utiliza generalmente el ARN bicatenario, pero la iARN no se limita a éste. Por ejemplo, pueden utilizarse también las cadenas dobles que se forman en los ARN monocatenarios autocomplementarios. Con respecto a las zonas donde se forman dobles cadenas, pueden formarse dobles cadenas en todas las zonas o pueden formarse cadenas individuales o similares en zonas parciales (por ejemplo, ambos extremos o un extremo). La longitud del oligo ARN que puede utilizarse para la iARN no está limitada. La longitud del oligo ARN de la presente invención es, por ejemplo, 5 a 1000 nucleótidos (en el caso de dobles cadenas, 5 a 1.000 pb), preferentemente 10 a 100 nucleótidos (en el caso de cadenas dobles, 10 a 100 pb), más preferentemente 15 a 25 nucleótidos (en el caso de cadenas dobles 15 a 25 pb) y en particular preferentemente 19 a 23 nucleótidos (en el caso de cadenas dobles, 19 a 23 pb).

Como se describió anteriormente, el procedimiento de la iARN hace uso de un fenómeno mediante el cual un ARN bicatenario (ARNds) que es homólogo a un gen y que consta de ARN transcrito y ARN complementario destruye una parte homóloga de un producto de transcripción génica (ARNm). Un ARN bicatenario que corresponde a la secuencia completa de un gen transportador de fucosa que va a ser utilizado en la presente puede utilizarse o puede utilizarse también un ARNds corto (por ejemplo, 21 a 23 bases) (ARN de interferencia pequeño; ARNsi) que corresponde a una secuencia parcial. Un ARN bicatenario puede incorporarse directamente en una célula. Alternativamente, se construye un vector que produce un ARN bicatenario, el vector se introduce en una célula hospedadora, y a continuación el ARN bicatenario puede producirse dentro de la célula. Por ejemplo, el conjunto o una parte del ADN que codifica el transportador de fucosa de la presente invención se incorpora en un vector de modo que se convierte en una secuencia invertida repetida, y a continuación el vector puede introducirse en una célula hospedadora. El procedimiento de iARN puede realizarse según las descripciones en Nature, 391, 806, (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 15502 (1998); Nature, 395, 854, (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5049 (1999); Cell, 95, 1017, (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 1451 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol., 2, 70, (2000); y similares. La identificación de las células que se han vuelto incapaces de producir cualquier transportador de fucosa como resultado de la utilización del procedimiento con iARN puede llevarse a cabo utilizando actividad de transportador de fucosa como índice. Alternativamente, dicha identificación puede realizarse por inmunotransferencia Western o inmunotransferencia Northern utilizando la transcripción o expresión del gen transportador de fucosa como índice.

El transportador de fucosa puede destruirse también por un procedimiento con RDO o un procedimiento con TFO. RDO (oligonucleótido ARN-ADN híbrido) es una doble cadena formada uniendo una cadena de ADN a una cadena de ARN, y se caracteriza porque tiene una grapa GC y un bucle T. Mediante la utilización de RDO correspondiente a un gen transportador de fucosa, puede introducirse la mutación en el gen transportador de fucosa y puede destruirse el gen. RDO puede construirse según las descripciones en Science, 273, 1386, (1996); Nature Medicine, 4 285, (1998); Hepatology, 25 1462, (1997); Gene Therapy, 5, 1960, (1999); J. Mol. Med., 75, 829, (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 8774, (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 8768, (1999); Nuc. Acids. Res., 27, 1323, (1999); Invest. Dermatol., 111, 1172, (1998); Nature Biotech., 16, 1343, (1998); Nature Biotech., 18, 43, (2000); Nature Biotech., 18, 555, (2000); J. Mol. Med., 80, 620, (2002); y similares. Un oligonucleótido de triple formación (TFO) es un segmento de ADN monocatenario que puede unirse a una zona especifica del ADN genómico bicatenario y puede provocar la mutación en su punto de unión. TFO puede construirse según las descripciones en J. Mol. Med., 80, 620, (2002); y similares.

Además, puede obtenerse una célula en la que el gen transportador de fucosa se destruye introduciendo al azar la mutación en una célula. Ejemplos de un procedimiento para introducir la mutación al azar en una célula incluyen un procedimiento que implica introducir al azar un vector de destrucción del gen que contiene un marcador en el genoma de una célula y a continuación cribar una célula con un gen transportador de fucosa destruido, y un procedimiento que implica la introducción al azar de la mutación utilizando un mutágeno químico tal como ENU (N-etil-N-nitrosourea) y a continuación identificar dicha célula que tiene un gen transportador de fucosa destruido. La identificación de las células que se han convertido en incapaces de producir algún transportador de fucosa puede realizarse utilizando la actividad del transportador del transportador de fucosa como índice. Alternativamente, dicha identificación puede realizarse por inmunotransferencia Western o inmunotransferencia Northern utilizando la transcripción o expresión del gen transportador de fucosa como índice.

Además, la célula dada a conocer en la presente memoria con un gen transportador de fucosa destruido puede obtenerse también a partir de un animal que tiene un gen transportador de fucosa transgénico. Dicho animal con un gen transportador de fucosa transgénico puede producirse destruyendo un transportador de fucosa de una célula ES por el procedimiento anterior y a continuación produciendo a partir de la célula ES según, por ejemplo, un procedimiento dado a conocer en la publicación WO 02/33054. Los ejemplos de animales que se utilizan en este caso comprenden de manera no limitativa a, cabras, cerdos, ovejas, vacas, ratones, hámsters y ratas. Las células creadas que no tienen genes transportadores de fucosa pueden obtenerse produciendo dichas células creadas a partir de animales que tienen un gen transportador de fucosa transgénico.

Las células en las que la capacidad de transporte de fucosa se ha reducido o desaparecido pueden obtenerse por varios procedimientos. Por ejemplo, dichas células pueden obtenerse inhibiendo las funciones de transportador de fucosa utilizando un compuesto (específicamente un antagonista del transportador de fucosa) que se une al transportador de fucosa y a continuación inhibe el transporte de fucosa en el citoplasma dentro del aparato de Golgi. En la presente memoria se da a conocer también un procedimiento para inhibir las funciones celulares del transportador de fucosa utilizando dicho compuesto y células en las que las funciones del transportador de fucosa están inhibidas por dicho compuesto. Las células en las que se han inhibido las funciones del transportador de fucosa son células en las que la cantidad de fucosa que existe en el aparato de Golgi ha disminuido significativamente en comparación con las células en las que no se han inhibido las funciones del transportador de fucosa. Además, las células en las que se han inhibido las funciones del transportador de fucosa son células en las que se ha reducido o eliminado la capacidad de transporte de fucosa en la membrana de Golgi. Dichas células también significan células en las que se ha reducido o eliminado la actividad intracelular para incorporar la fucosa en el aparato de Golgi. Ejemplos de dicho compuesto que inhibe las funciones de dicho de transportador de fucosa incluye un compuesto que se aísla por el procedimiento de cribado anterior y un anticuerpo que se une a la actividad del transportador de fucosa. Dicho compuesto puede añadirse a un medio para células hospedadoras que se originan para producir una proteína recombinante. Además, cuando dicho compuesto es proteína, el ADN que codifica la proteína se introduce en un vector de expresión apropiado, las células hospedadoras se transforman con el vector de expresión y a continuación la proteína puede expresarse y producirse en las células hospedadoras.

Cuando la proteína recombinante extraña se produce en células hospedadoras con genes transportadores de fucosa destruidos o la actividad de transporte de fucosa del transportador de fucosa de la presente invención está inhibida, la fucosa intracelular no se transporta al interior del aparato de Golgi. De este modo, la fucosa no se añade a la proteína. En el caso de dicha proteína recombinante producida en las células hospedadoras que tienen genes transportadores de fucosa destruidos, la cantidad de fucosa unida es significativamente inferior o preferentemente incapaz de ser detectada, en comparación con el caso de la proteína recombinante producida en células hospedadoras que tienen un gen transportador de fucosa sin destruir. Cuando una proteína extraña es un anticuerpo, puede obtenerse un producto en el que ninguna fucosa está uniendo una cadena de azúcar unida a N-glucósido que se une a 2 puntos de fijación de la cadena de azúcar en 1 molécula de un anticuerpo; es decir, que existe en la zona Fc compuesta de 2 cadenas H. Dicho anticuerpo sin ninguna cadena que se una a éste presenta aumento de actividad citotóxica. La incorporación de un gen de anticuerpo en una célula puede llevarse a cabo por una técnica general de ingeniería genética. Además, cuando se produce un anticuerpo para el que la adición de fucosa al mismo está inhibida utilizando la célula de la presente invención, no es necesario que todos los anticuerpos producidos experimenten la adición de la fucosa al mismo. La proporción de proteína a la que se ha añadido fucosa en composiciones de anticuerpo se reduciría.

Además, en la presente memoria se dan a conocer animales (excluyendo seres humanos) en los que se inhibe la expresión del gen transportador de fucosa. Un polipéptido recombinante puede producirse in vivo utilizando dichos animales. Un ejemplo de dicho animal en el que se inhibe la expresión del gen transportador de fucosa es el animal transgénico transportador de fucosa anterior. La producción de animales transgénicos en los que un gen especifico está modificado genéticamente tal como se describió anteriormente es ya una técnica conocida. Los expertos en la materia pueden producir de manera apropiada dichos animales transgénicos con gen transportador de fucosa. Además, los animales en los que se inhibe la expresión del gen transportador de fucosa pueden producirse, por ejemplo, introduciendo un gen que expresa un oligonucleótido complementario para un transportador de fucosa.

La proteína diana que codifica el ADN se introduce en estos animales, se producen polipéptidos in-vivo en los animales, y a continuación se recogen los polipéptidos. El término "hospedador" comprende estos animales y similares. Cuando se utilizan animales, existen sistemas de producción que utilizan mamíferos y sistemas de producción que utilizan insectos. Como mamíferos, se pueden utilizar cabras, cerdos, ovejas, ratones o vacas (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechonology Applications, 1993).

Por ejemplo se prepara un ADN diana en forma de fusión con un gen que codifica un polipéptido tal como β-caseína de cabra que se produce únicamente en la leche. Posteriormente, un fragmento de ADN que comprende el gen de fusión se inyecta en un embrión de cabra y a continuación el embrión se trasplanta a una cabra hembra. Un polipéptido diana puede obtenerse de la leche producida por cabras transgénicas nacidas de cabras que han aceptado dichos embriones o de las descendencias de dichas cabras transgénicas. Para aumentar la cantidad de leche que contiene polipéptidos, producida por cabras transgénicas, puede utilizarse también una hormona apropiada para dichas cabras transgénicas (Ebert, K. M. et al., BioTechnology, (1994) 12, 699-702).

El polipéptido obtenido de este modo puede aislarse del interior de las células hospedadoras o del exterior de las células (por ejemplo, del medio) y purificarse a continuación como un polipéptido sustancialmente puro y uniforme. Para separar y purificar polipéptidos, pueden emplearse los procedimientos de separación y purificación que se utilizan generalmente para la purificación de polipéptidos y no están específicamente limitados. Por ejemplo, pueden separarse y purificarse polipéptidos mediante la utilización de la selección y combinación apropiadas de una columna de cromatografía, un filtro, ultrafiltración, precipitación con sales, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDSpoliacrilamida, un procedimiento de isoelectroenfoque, diálisis, recristalización y similares.

Ejemplos de cromatografía incluyen cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía en fase inversa y cromatografía por adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estos tipos de cromatografía pueden llevarse a cabo utilizando cromatografía en fase líquida tal como HPLC o FPLC.

Puede utilizarse también una secuencia conocida para un gen que codifica la cadena H o la cadena L de un anticuerpo que es producido por el procedimiento de producción de la presente invención. Además, dicho gen puede obtenerse también por un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede clonarse un gen que codifica un anticuerpo y obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal o puede obtenerse también a partir de un banco de anticuerpos. Los hibridomas pueden producirse básicamente utilizando una técnica conocida como la descrita a continuación. Específicamente, puede producirse un hibridoma utilizando un agente sensibilizante, un antígeno deseado o una célula que expresa un antígeno deseado, llevando a cabo la inmunización según un procedimiento de inmunización general que utiliza dicho antígeno, fusionando el inmunocito obtenido de este modo con una célula madre conocida por un procedimiento general de fusión celular y a continuación cribando la célula que produce el anticuerpo monoclonal (hibridoma) por un procedimiento de cribado. El ADNc de una zona variable del anticuerpo (zona V) se sintetiza a partir del ARNm del hibridoma obtenido de este modo utilizando transcriptasa inversa. El ADNc se liga al ADN que codifica una zona constante deseada del anticuerpo (zona C) de modo que puede obtenerse un gen que codifica la cadena H o la cadena L. Un agente sensibilizante en la inmunización no está específicamente limitado. Por ejemplo, puede utilizarse la proteína completa de un receptor diana, un péptido parcial (por ejemplo, zona extracelular) y similares. Pueden prepararse antígenos por un procedimiento conocido por expertos en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse antígenos según un procedimiento que utiliza vaculovirus (por ejemplo, documento WO 98/46777). Pueden producirse hibridomas según, por ejemplo, el procedimiento de Milstein et. al., (Kohler, G., y Milstein, C., Methods Enzymol. 1981, 73, 3-46) o similares. Cuando la inmunogenicidad de un antígeno es baja, dicho antígeno está unido a una macromolécula con inmunogenicidad tal como la albúmina, y a continuación se realiza la inmunización.

En cuanto a un banco de anticuerpos, se conocen ya muchos bancos de anticuerpos. Además, se conoce un procedimiento de producción de un banco de anticuerpos, por consiguiente, los expertos en la materia pueden obtener de manera apropiada un banco de anticuerpos.

Los anticuerpos que se expresan y producen como se describió anteriormente pueden purificarse por un procedimiento conocido que se utiliza para la purificación general de proteínas. Los anticuerpos pueden separarse y purificarse por selección o combinación apropiada de, por ejemplo, una columna de afinidad (por ejemplo, columna con proteína A), una columna de cromatografía, un filtro, ultrafiltración, precipitación por sales y diálisis (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Puede utilizarse un método conocido para medir la actividad de fijación al antígeno (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, ELISA (ensayo inmunosorbente con enzima ligada), EIA (inmunoanálisis con enzima ligada), RIA (radioinmunoanálisis) o un inmunoanálisis fluorescente.

La estructura de la cadena de azúcar de la proteína producida utilizando la célula de la presente invención puede analizarse por un procedimiento descrito en el procedimiento de cartografía de la cadena de azúcar en dos dimensiones (Anal. Biochem, 171, 73 (1988); Biochemical Experimental Methods 23-Methods for Studyng Glycoprotein Sugar Chains, editada por Reiko Takahashi, Centro de Publicaciones Japonesas Académicas (1989)). Además, las cadenas de azúcar pueden analizarse también por espectrometría de masas tal como MALDI-TOF-MS.

Un compuesto que se une a un transportador de fucosa y a continuación inhibe el transportador de fucosa del citoplasma en el aparato de Golgi puede identificarse por el método siguiente. Específicamente, un transportador de fucosa se pone en contacto con una muestra que va a ser analizada que supuestamente contiene un compuesto que se une al transportador de fucosa, y a continuación se detecta la actividad de enlace entre el polipéptido y la muestra que va a analizarse, de modo que puede seleccionarse un compuesto con actividad de enlace para el transportador de fucosa.

Además, un transportador de fucosa se pone en contacto con una muestra que va a analizarse y a continuación se detecta la actividad de transporte de fucosa del transportador de fucosa, de modo que puede seleccionarse un compuesto que inhibe la actividad de transporte de fucosa del transportador de fucosa.

El polipéptido dado a conocer en la presente memoria que se utiliza para la identificación puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido de la naturaleza o un polipéptido parcial. Además, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria que va a utilizarse para la identificación puede estar en una forma con la que se expresa en la superficie celular o en forma de una fracción de membrana. Ejemplos de una muestra que va a ser analizada no están específicamente imitados e incluyen extractos celulares, sobrenadantes de cultivo celular, productos de fermentación de microorganismos, extractos de organismos marinos, extractos de plantas, polipéptidos purificados o purificados ordinariamente, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos de bajo peso molecular y compuestos naturales. El polipéptido dado a conocer en la presente memoria (que se pone en contacto con dicha muestra que ha de analizarse) puede ponerse en contacto en forma de, por ejemplo, un polipéptido purificado, un polipéptido soluble, un polipéptido unido a un vehículo, un polipéptido que se fusiona con otro polipéptido, un polipéptido expresado en la membrana celular o una fracción de la membrana, con una muestra que va a analizarse.

Como procedimiento para la identificación de un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, pueden utilizarse muchos procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Dicha identificación puede realizarse, por ejemplo, por un procedimiento de inmunoprecipitación. Específicamente, dicha identificación puede realizarse de la forma siguiente. Un gen que codifica el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se inserta en un vector para expresar un gen extraño, tal como pSV2neo, pcADN I o pCD8, de modo que el gen se expresa en células animales o similares. Como activadores para ser utilizados para la expresión, pueden utilizarse algunos activadores utilizados generalmente. Ejemplos de dicho activador incluyen un activador precoz de SV40 (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, Londres, págs. 83-141 (1982)); un activador de EF1α (Kim et al., Gene 91, págs. 217-223. (1990)), un activador de CAG (Niwa et al., Gene 108, págs. 193-200 (1991)), un activador LTR de RSV (Cullen, Methods in Enzimology, 152, págs. 684-704 (1987)), un activador de SRα (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, pág. 466 (1988)), un activador precoz inmediato de CMV (Seed y Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci.

Ejemplos de un procedimiento para expresar un gen extraño introduciendo el gen en células animales incluyen un procedimiento de electroporación (Chu, G. et al., Nucl. Acid. Res. 15, 1311-1326 (1987)), un procedimiento con fosfato de calcio (Chen, C. y Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987)), un procedimiento con DEAE dextrano (Lopata, M. A. et al., Nucl. Acid. Res. 12, 5707-5717 (1984)); Sussman, D.J. y Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985)), y un procedimiento con lipofectina (Derijard, B., Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T., et al., Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K., et al., Science, 259, 230-234 (1993)). Puede emplearse cualquiera de estos procedimientos.

Para mantener inalteradas las propiedades del polipéptido dado a conocer en la presente memoria tanto como sea posible cuando se prepara en forma de un polipéptido de fusión, se ha publicado un procedimiento en el que solamente se introduce una pequeña parte del epítopo constituida por varios a más de una docena de aminoácidos, a fin de preparar un polipéptido de fusión. Por ejemplo, epítopos tales como polihistidina (His-tag), hemoaglutinina HA de la gripe, c-myc humana, FLAG, una glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-GP), una proteína con T7 gen 10 (T7-tag), una glucoproteína del virus del herpes simple humano (HSV-tag) y una E-tag (un epítopo en un fago monoclonal) y anticuerpos monoclonales que reconocen dichos epítopos pueden utilizarse como sistemas epítopo-anticuerpo para identificar polipéptidos que se unen al polipéptido dado a conocer en la presente memoria (Experimental Medicine, 13, 85-90 (1995)).

Los procedimientos generales para inmunoprecipitación se pueden realizar según, por ejemplo, un procedimiento descrito en la bibliografía (Harlow, E. y Lane, D.: Antibodies, págs. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, Nueva York (1988)).

La SDS-PAGE se utiliza generalmente para el análisis de polipéptidos inmunoprecipitados. Mediante la utilización del gel con una concentración apropiada, puede analizarse un polipéptido unido basándose en el peso molecular del polipéptido. En ese momento es generalmente difícil detectar dicho polipéptido que se ha unido al polipéptido dado a conocer en la presente memoria mediante un procedimiento de tinción general de polipéptidos, tal como la tinción Coomassie o la tinción con plata. La sensibilidad de la detección puede mejorarse cultivando células en una solución de cultivo que contiene 35S-metionina o 35S-cisteína, que es un isótopo radioactivo, a fin de marcar polipéptidos en las células y detectarlas a continuación. Si la cantidad molecular de un polipéptido se pone de manifiesto, dicho polipéptido diana puede purificarse directamente en el gel de SDS-poliacrilamida y a continuación puede determinarse la secuencia del mismo.

Además, como método de aislamiento de un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, puede utilizarse, por ejemplo, un método de inmunotransferencia Western (Skolnik, E. Y., et al., Cell, (1991), 65, 83-90). Específicamente, se construye un banco de ADNc de células, tejidos u órganos (por ejemplo, de testículos) que se prevé que expresen un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria utilizando un vector de fago (por ejemplo, λgt11 y ZAP). El resultante se expresa continuación en LB-agarosa y a continuación el polipéptido expresado se inmoviliza en un filtro. El polipéptido purificado y marcado dado a conocer en la presente memoria se produce para reaccionar con el filtro anterior. Posteriormente, se detectan las placas que expresan polipéptidos que se unen al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, basándose en los marcadores. Ejemplos de un procedimiento para marcar el polipéptido dado a conocer en la presente memoria incluyen un procedimiento que utiliza el enlace entre la biotina y la avidina, un procedimiento que utiliza un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido dado a conocer en la presente memoria o un polipéptido (por ejemplo, GST) que se fusiona con el polipéptido dado a conocer en la presente memoria, un procedimiento que utiliza un radioisótopo y un procedimiento que utiliza fluorescencia.

Otra forma de realización del procedimiento de identificación dado a conocer en la presente memoria es un procedimiento que se realiza utilizando un sistema de 2 híbridos que utilizan células (Fields, S., y Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994), 10, 286-292; Dalton, S. y Treisman, R. (1992), Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element., Cell 68, 597-612; "MATCHMARKER Two-Hybrid System", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER One-Hybrid System" (todos estos sistemas y kits son producidos por Clontech) e "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (producido por Stratagene Corp.).

o un péptido parcial del mismo se fusiona con una zona de fijación SRF al ADN o una zona GAL4 de fijación al ADN y a continuación el producto se expresa en células de levadura. Se construye un banco de ADNc que se expresa mientras se está fusionando con una zona de activación de la transcripción de VP16 ó GAL4 a partir de las células que se prevé que expresen un polipéptido que se fija al polipéptido dado a conocer en la presente memoria. El banco de ADNc se introduce a continuación en las células de levadura anteriores. Un ADNc procedente del banco se aísla a partir de un clon positivo detectado. (Un clon positivo puede confirmarse cuando un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria se expresa en una célula de levadura, después de lo cual se activa debido al enlace de los dos). Introduciendo el ADN aislado en Escherichia coli para la expresión, puede obtenerse el polipéptido codificado por el ADNc. Por consiguiente, puede prepararse un polipéptido que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria o el gen del mismo.

Los ejemplos de un gen informador que ha de utilizarse en el sistema de 2 híbridos incluyen, pero no se limitan a, además de un gen HIS3, un gen Ade2, un gen LacZ, un gen CAT, un gen de luciferasa y un gen PAI-1 (inhibidor tipo 1 del activador de plasminógeno). La identificación por el procedimiento de 2 híbridos puede realizarse también utilizando

células de mamífero además de levadura.

Además, un ejemplo de un procedimiento para aislar no solamente un polipéptido sino además un compuesto (incluyendo agonistas y antagonistas) que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, que es conocido por los expertos en la materia, es un procedimiento que implica producir un compuesto sintético, un banco de productos naturales, o un banco de presentación de péptidos al fago aleatorio para actuar sobre el polipéptido inmovilizado y a continuación identificar una molécula que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria, o un procedimiento de identificación utilizando alta resolución basado en la tecnología de la química combinatoria (Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (Estados Unidos) 26 julio 1996, 273, págs. 458-64; Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature, Nature (Inglaterra) 7 nov. 1996, 384, págs. 11-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial Chemistry, Nature (Inglaterra) 7 nov. 1996, 384, págs. 17-9).

En la presente invención, un biosensor que utiliza el fenómeno de resonancia de plasmones de superficie puede utilizarse también como medio para detectar o medir compuestos ligados. Con dicho biosensor, la interacción entre el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y un compuesto que va a ser analizado puede observarse en tiempo real en forma de señales de resonancia de plasmones de superficie utilizando una cantidad fina de polipéptidos sin marcarlos (por ejemplo, producidos por BIAcore o Pharmacia). Por consiguiente, mediante la utilización de un biosensor producido por BIAcore o similar puede evaluarse el enlace entre el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y un conjunto que va ser analizado.

Un procedimiento para identificar una sustancia que inhibe la actividad de transporte de la fucosa del polipéptido dado a conocer en la presente memoria puede realizarse por un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, el polipéptido dado a conocer en la presente memoria se expresa sobre una membrana (por ejemplo, membrana celular, membrana del aparato de Golgi o membrana vírica). La fucosa marcada con una sustancia fluorescente o similar se pone en contacto con una sustancia que va a analizarse y a continuación se mide la cantidad de fucosa incorporada. De este modo puede identificarse una sustancia que inhibe la actividad de transporte de la

fucosa del polipéptido dado a conocer en la presente memoria.

Actividad citotóxica de anticuerpos

Los anticuerpos producidos por el procedimiento dado a conocer en la presente invención han aumentado la actividad citotóxica.

Los ejemplos de actividad citotóxica incluyen la actividad por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la actividad por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La actividad por CDC significa la actividad citotóxica de un sistema complementario. La actividad por ADCC significa la actividad para dañar una célula diana. Específicamente, cuando una actividad específica se acopla a un antígeno de la superficie celular de una célula diana, una célula que conserva el receptor Fcγ (por ejemplo, un inmunocito) se une a la fracción Fc del anticuerpo mediante un receptor Fcγ, dañando la célula diana.

Si un anticuerpo tiene o no actividad por ADCC o tiene actividad por CDC puede medirse por un procedimiento conocido (por ejemplo, Current protocols in Immunology, capítulo 7, Immunologic studies in humans, Editor John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993))

Específicamente, se preparan las células efectoras, una solución del complemento y células diana.

(1): Preparación de células efectoras

Se extrae el bazo de un ratón CBA/N o similar, y a continuación se separan los esplenocitos en un medio RPMI1640 (producido por GIBCO). Después de lavar con el mismo medio que contiene suero bobino fetal al 10% (FBS producido por HyClone), se preparan las células a una concentración de 5 x 106/ml, preparando de este modo células efectoras.

(2): Preparación de una solución del complemento

Baby Rabbit Complement (producido por CEDARLANE LABORATORIES LIMITED) se diluye 10 veces en un medio que contiene FBS al 10% (producido por GIBCO), preparando de este modo una solución del complemento.

(3): Preparación de células diana

Se marcan estirpes de células de cáncer pancreático (por ejemplo, AsPC-1y Capan-2) por radioactividad cultivando las estirpes celulares con cromato sódico con 51Cr 0,2 mCi (producido por Amersahm Pharmacia Biotech) en un medio DMEM que contiene FBS al 10% a 37ºC durante 1 hora. Después del marcado radiactivo, las células se lavan tres veces en un medio RPMI1640 que contiene FBS al 10% y a continuación se preparan a una concentración celular de 2 x 105/ml, preparando de este modo las células diana.

Posteriormente, se mide la actividad por ADCC o la actividad por CDC. Para medir la actividad por ADCC, se añaden las células diana y los anticuerpos en cantidades de 50 µl cada una a una placa de 96 pocillos con fondo en U (producida por Beckton Dickinson) y a continuación se dejan reaccionar en hielo durante 15 minutos. Después, se añaden 100 µl de células efectoras, seguido de 4 horas de cultivo en una incubadora con gas dióxido de carbono. La concentración en anticuerpo final es de 0 ó 10 µg/ml. Tras el cultivo, se recogen 100 µl del sobrenadante, y a continuación se mide la radioactividad utilizando un contador gamma (COBRAIIAUTO-GMMA, modelo D5005 producido por Packard Instrument Company). La actividad citotóxica (%) puede calcularse por (A-C)/(BC) x 100. "A" indica la radioactividad (cpm) en cada muestra, "B" indica la radioactividad (cpm) en una muestra enriquecida con NP-40 al 1% (producido por NACALAI TESQUE INC.) "C" indica radioactividad (cpm) en una muestra que contiene solo células diana.

Además, para medir la actividad por CDC, se añaden células diana y anticuerpos anti-PepT en cantidades de 50 µl cada una a una placa de 96 pocillos de fondo plano (producida por Beckton Dickinson) y a continuación se dejan reaccionar en hielo durante 15 minutos. Posteriormente, se añaden 100 µl de una solución de complemento, seguido de 4 horas de cultivo en una incubadora con gas dióxido de carbono. La concentración final de anticuerpos es de 0 ó 3 µg/ml. Tras el cultivo, se recogen 100 µl del sobrenadante y a continuación se mide la radioactividad utilizando un contador gamma. La actividad citotóxica puede calcularse de manera similar a la utilizada para la medición de la actividad por ADCC.

EJEMPLOS

La presente invención se describirá específicamente en los ejemplos siguientes. Sin embargo, los ejemplos se proporcionan a título no limitativo del alcance técnico de la presente invención.

[EJEMPLO 1] Obtención del fragmento del gen transportador de GDP-fucosa de la estirpe de las células de ovario del hámsteres chino (CHO)

La secuencia del ADNc del transportador de GDP-fucosa humano (nº de registro AF326199) y lo mismo del transportador de GDP-fucosa de ratón (nº de registro AK050311) se obtuvieron de la base de datos NCBI. Una vez analizadas las secuencias utilizando GENETYX-SV/RC, se diseñaron cebadores utilizando fracciones de secuencias (figura 1) en las que se observó gran homología entre las secuencias humana y de ratón. Se llevó a cabo a continuación la RT-PCR utilizando poliA+ ARN extraído de una estirpe de células CHO (DXB11) utilizando un kit de extracción de ARN (TAKARA: catrimox 14 RNA isolation kit) como plantilla y un kit de RT-PCR (TOYOBO: RP-PCRHigh). El fragmento obtenido de este modo se subclonó en pBluescriptSK+. Una vez confirmada su secuencia, se escindió con una enzima de restricción apropiada y a continuación se utilizó como sonda para el cribado del banco.

[EJEMPLO 2] Clonación del ADNc completo del transportador de GDP-fucosa

El fragmento transportador de GDP-fucosa obtenido en el Ejemplo 1 se marcó con α32p dCTP utilizando un sistema aleatorio de marcado del cebador (Amersham). El banco de ADNc derivado de células CHO utilizado en la presente memoria procedía específicamente de la estirpe celular CHO-K1 (LamdaZAP-CMV XR Library: Stratagene Corp.). El cribado se llevó a cabo básicamente según los manuales. Específicamente, en el cribado primario se infectó Escherichia coli (XL-1-Blue MRF’) con 106 fagos y a continuación se inoculó junto con agar-agar blando en 10 placas. Las placas obtenidas de este modo se transfirieron a membranas de nilón (Hybond NX: Amersham). Las membranas se sometieron a tratamiento alcalino y de neutralización según un procedimiento normalizado. Después de la reticulación con UV, se llevó a cabo la hibridación utilizando la sonda anterior. Se realizaron el cribado secundario y el cribado terciario de los clones positivos obtenidos. Por último, se obtuvieron 9 clones positivos purificados. Se infectó Escherichia coli (XLOLR) con cada clon y un fago colaborador (fago colaborador resistente a interferencias de ExAsist: Stratagene Corp). Los resultantes se recogieron como plásmidos (pCMV-Script EX) y a continuación se examinaron las secuencias (figura 2). La figura 1 muestra la comparación entre la secuencia del gen transportador de ratón y la del gen transportador humano. Cuando se comparaba con la secuencia procedente de las células CHO, se observó que la homología con la secuencia humana era del 85,3% y la homología con la secuencia de ratón se observó que era del 91,5%.

[EJEMPLO 3] Clonación del ADN genómico del transportador de GDP-fucosa

Para preparar un fragmento de gen del lado 5' y lo mismo del lado 3' como sondas, se diseñaron cebadores utilizando el fragmento de transportador de GDP-fucosa obtenido en el Ejemplo 1 como plantilla. El fragmento del lado 5' y el fragmento del lado 3' se obtuvieron por PCR. En cuanto a los cebadores, una combinación (figura 3) del cebador para RT-PCR utilizado en el Ejemplo 1 y un cebador (con el que pueden obtenerse las secuencias correspondientes al exón 1 y al exón 2 previstas a partir de un genoma de ratón). El marcado de las sondas 5' y 3' y el cribado se llevaron a cabo por el procedimiento mostrado en el Ejemplo 2 utilizando un banco de ADN genómico procedente de células CHO (banco FIX II Lambda procedente de la estirpe celular CHOK1: Stratagene Corp.). Por último se obtuvieron 11 clones positivos. De estos clones, se utilizaron 7 clones para infectar a Escherichia coli (XL-1 Blue MRA). Se recogieron los fagos en 100 ml de un cultivo líquido y a continuación se recogió el ADN del fago utilizando un Qiagen Lambda kit (QIAGEN). El ADN del fago recogido de este modo se digirió con una enzima de restricción apropiada, seguido de selección y cartografía de los clones independientes por hibridación por inmunotransferencia Southern.

[EJEMPLO 4] Determinación de la secuencia de ADN genómico del transportador de GDP-fucosa de las células CHO-K1

El ADN que comprende el gen genómico de CHO obtenido en el Ejemplo 3 se digirió con varias enzimas de restricción y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Posteriormente, según un procedimiento normalizado, se produjo una cartografía de la enzima de restricción (figura 3) por inmunotransferencia Southern utilizando los fragmentos del lado 5' y del lado 3’ del ADNc transportador de GDP-fucosa obtenido en el Ejemplo 2 como sondas. Las bandas que hibridan respectivamente estos fragmentos se escindieron y a continuación se recogieron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) según los manuales adjuntos. Se ligaron los fragmentos de ADN recogidos pBluescriptSK+ utilizando un kit de ligadura de ADN rápido (Roche) y a continuación se introdujo el resultante en la cepa DH5α de Escherichia coli (TOYOBO CO., LTD.). Se recogieron los plásmidos de la Escherichia coli recombinante obtenida de este modo y a continuación se analizaron utilizando un analizador genético ABI3100 (figura 4, SEC. ID. nº 1).

[EJEMPLO 5] Supresión de la expresión del transportador de GDP-fucosa en células CHO utilizando iARN

Se pusieron en suspensión 5 x 105 células DG44 en un medio IMDM (Invitrogen Corp.) que contenían 5 ml de FCS al 10% (MOREGATE BIOTECH), 200 µmoles/l de geneticina (Invitrogen Corp.) y 200 nmoles/l de MTX. El resultante se inoculó a continuación en un frasco de cultivo Falcon de 25 cm2. 24 horas después, el ARNsi sintético (cadena transcripta UAA CCU CUG CCU CAA GUA CdTdT (SEC. ID. nº 3) y la cadena complementaria GUA CUU GAG GCA GAG GUU AdTdT (SEC. ID. nº 4)) (B-Bridge Internacional Inc.) para un transportador de GDP-fucosa se transfectaron (2 nM a 500 nM) utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen Corp.). 48 horas después de la transfección, se recolectaron las células. Se extrajo ARN de las células utilizando un sistema de aislamiento de ARN completo SV (Promega Corp.). La reacción RT-PCR se llevó a cabo utilizando un TaqMan PCR Corereagent kit y reactivos de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems). Se cuantificó la expresión del transportador de GDP-fucosa utilizando PRISM7700 (Applied Biosystems). Como resultado se suprimió la expresión de gen transportador de GDP-fucosa a nivel de ARNm.

La figura 5 muestra los resultados. Un gráfico en la figura 5 muestra los valores relativos cuando la expresión del gen transportador de GDP-fucosa 48 horas después de la transfección de PBS se determinó que era 100.

[EJEMPLO 6] Destrucción del gen transportador de fucosa en células CHO

Construcción del vector de reconocimiento

Un activador del gen pgk-1 de ratón se escindió con EcoR I-Pst I procedente de un vector pKJ2 (Popo H, Biochemical Genetics vol. 28, págs. 299-308, 1990) y a continuación se clonó en la secuencia EcoR I-Pst I pBluescript (Stratagene Corp.), produciendo de este modo pBSK-pgk-1. Se sometió a PCR un gen resistente a higromicina (Hygr) utilizando pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen Corp.) y los cebadores Hyg5-AV y Hyg3-BH. De este modo una zona Eco T22I y una secuencia Kozak se añadieron al lado 5’ de Hygr y se añadió una secuencia BamH I al lado 3’ que comprende una zona que se extiende a una señal de adición poliA de SV40, extrayendo de este modo Hygr.

Cebador transcripto

Hyg5-AV 5’-ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3’ (SEC ID nº: 5)

Cebador complementario

Hyg3-BH 5’-GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C-3’ (SEC ID nº: 6)

El fragmento Hygr (Eco T22I-BamH I) se insertó en la secuencia Pst I-BamH I de pBSK-PGK, produciendo de este modo pBSK-pgk-1-Hig '. Se construyó un vector de reconocimiento (en adelante denominado vector KO2) para un transportador de fucosa (figura 6) insertando respectivamente el lado 5’ (del nº 2780 Sma I al nº 4232 BamH I en la SEC. ID. nº 1, lado 3’ (comprendido entre el nº 4284 y el nº 10934 Sac I) y fragmentos de pgk-1-Hygr del transportador de fucosa en un vector pMC1DT-A (Yagi T., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 87, págs. 9918-9922, 1990). El vector KO2 se escindió con Not Iya continuación se introdujo en las células. Mediante la utilización del vector KO2, el transportador de fucosa perderá 46 pares de bases del exón 1 que comprenden el codón de iniciación y la pérdida de funciones relevantes.

Introducción en células CHO

Se añadieron suplemento HT (100 x) (Invitrogen Corp.: cat. 11067-030) y penicilina estreptomicina (Invitrogen Corp. cat: 15140-122) a CHO-S-SFMII HT-(Invitrogen Corp. cat: 12052-098) en un volumen de una centésima del volumen de CHO-S-SFMII HT-. La solución se utilizó como medio para cultivo (en adelante denominado SFMII (+)). La estirpe celular DXB11 de las células CHO se subcultivó y las células después de la transferencia génica se cultivaron también en SFMII (+). Se suspendieron 8 x 106 células CHO en 0,8 ml de tampón fosfato de Dulbecco (en adelante abreviado como "PBS"; (Invitrogen Corp. cat: 14190-144). Se añadieron 30 µg del vector de reconocimiento (vector KO2) a la suspensión celular. La suspensión celular se transfirió a una Gene Pulser Cuvette (4 mm) (Bio-Rad Laboratories Inc.: cat 1652088). Después se dejó resposar la suspensión en hielo durante 10 minutos, se introdujo el vector en las células por un procedimiento de electroporación utilizando GENE-PULSER II (Bio-Rad Laboratories Inc.: código nº 340BR) en condiciones de 1,5 kV y 25 µFD. Después de la introducción del vector, las células se pusieron en suspensión en 200 ml de medio SFMII(+). Se inocularon a continuación las células a razón de 100 µl/pocillo en veinte placas de fondo plano de 96 pocillos (IWAKI & CO., LTD.: cat 1860-096). Se cultivaron las células en las placas en una incubadora con CO2 durante 24 horas a 37ºC, seguido de selección utilizando higromicina B (Invitrogen Corp.: cat. 10687-010). La higromicina B se disolvió en SFMII(+) a una concentración de 300 µg/ml y a continuación se añadió a razón de 100 µl/pocillo.

Se cribaron recombinantes homólogos por el procedimiento de la PCR. Las células CHO utilizadas en el cribado se cultivaron en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Tras la eliminación de los sobrenadantes del cultivo, se añadió un tampón para la lisis celular a razón de 50 µl/pocillo. Tras la incubación a 55ºC durante 2 horas, se inactivó la proteinasa K por calentamiento ulterior a 95ºC durante 15 minutos, a fin de preparar una plantilla para PCR. El tampón para la lisis celular por pocillo estaba compuesto de 5 µl de 10 x tampón LA II (acoplado a TaKaRa La Taq), 2,5 µl de NP-40 al 10% (Roche: cat. 1 332 473), 4 µl de proteinasa K (20 mg/ml y TaKaRa: cat. 9033) y 38,5 µl de agua destilada (NACALAI TESQUE, INC.: cat. 36421-35). Se determinó que una mezcla de reacción por PCR contiene 1 µl de la muestra de PCR anterior, 5 µl de 10 x tampón LA, 5 µl de MgCl2 (25 mM), 5 µl de dNTP (2,5 mM), 2 µl de cada cebador (10 µM de cada uno), 0,5 µl de LA Taq (5 UI/µl y cat. RR002B) y 29,5 µl de agua destilada (50 µl totales). Además, las condiciones de PCR consisten en el precalentamiento a 95ºC durante 1 minuto, cada 40 ciclos de ampliación (constando cada ciclo de 95ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 3 minutos) y calentamiento adicional a 70ºC durante 7 minutos.

Los cebadores son como se muestran a continuación. En la muestras de células CHO en las que ha tenido lugar la recombinación homóloga, se amplió una banda de aproximadamente 2,0 kb. En cuanto a los cebadores, TP-F4 se situó en la zona genómica del transportador de fucosa en el lado 5’ fuera del vector KO2 y THygro-R1 se situó dentro de un gen con resistencia a la higromicina en el vector KO2.

Cebador transcripto

TP-F4 5’-GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACT CGC-3’ (SEC ID nº: 7)

Cebador complementario

THygro-Fl 5’-GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGG AAT AGC-3’ (SEC ID nº: 8)

El número de células de CHO analizadas de este modo fue 537. De estas células, 17 se consideraron que eran recombinantes homólogos (la eficacia de la recombinación homóloga fue aproximadamente de 3,2% en este período).

La figura 7 muestra los datos resultantes cuando los productos de PCR en el cribado se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las bandas de 2,0 kb aparecieron en las muestras indicadas con "O". Estos clones se consideró que eran recombinantes homólogos. A continuación, se escindieron bandas de 2,0 kb del gel y después se purificaron utilizando un Mag Extractor (TOYOBO CO., LTD.: cat. NPK-601). 200 ng del producto de PCR purificado se sometieron a secuenciación directa utilizando TP-F4 y THygro-F1. De este modo se confirmó que el producto de la PCR tiene una secuencia nucleotídica resultante de la recombinación homóloga, dando como resultado en conclusión que el producto era un recombinante homólogo.

Dicha confirmación se realizó también por el procedimiento de inmunotransferencia Southern. Las células cultivadas en una placa de 24 pocillos se recogieron, se preparó ADN genómico según un procedimiento normalizado, y a continuación se llevó a cabo la inmunotransferencia de Southern. Se preparó una sonda de 387 pb procedente de la zona comprendida entre nº 2, 113 y nº 2, 500 de la SEC. ID. nº 1 por el procedimiento de PCR utilizando los 2 tipos de cebador siguientes. La sonda preparada de este modo se utilizó para confirmación por el procedimiento de inmunotransferencia de Southern. El ADN genómico se escindió con BgI II o EcoR I.

Cebador transcripto

Bgl-F: 5’-TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC-3’ (SEC ID nº: 9) Cebador complementario

Bgl-R: 5’-CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C-3’ (SEC ID nº: 10)

Como resultado de la escisión con Bgl II, apareció una banda de 3,0 kb aproximadamente del cromosoma del transportador de fucosa original y apareció una banda de 5,0 kb del cromosoma transgénico. Además, como resultado de la escisión con EcoR I apareció una banda de aproximadamente de 8,7 kb procedente del cromosoma del transportador de fucosa original y apareció una banda de 4,5 kb procedente del cromosoma transgénico (figura 8). La figura 9 muestra los datos cuando se llevó a cabo realmente la transferencia Southern.

Texto sin listado de secuencias

SEC. ID. nº: 3 y 4: ARN sintético

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

Como se da a conocer en la presente memoria, puede obtenerse un polipéptido transportador de fucosa y un gen transportador de fucosa. Además, se obtiene una célula que produce proteínas recombinantes con un gen transportador de fucosa destruido. Cuando la proteína recombinante se produce en la célula, puede producirse una proteína recombinante en la que adición de fucosa se reduce o se elimina. Particularmente cuando la proteína es un anticuerpo, la actividad citotóxica aumenta debido a la adición reducida de fucosa o a la eliminación a la adición de fucosa. Por consiguiente, dicha proteína es útil como producto farmacéutico de anticuerpos con efecto antitumoral.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha

<120> Transportador de fucosa

<130> P024742EP

<140> 04746425.0

<141> 2004-06-18

<150> JP 2003174010

<151> 2003-06-18

<150> JP 2003174006

<151> 2003-06-18

<150> JP 2003282081

<151> 2003-07-29

<150> JP 2003282102

<151> 2003-07-29

<160> 15

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 10939

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 1

imagen1

imagen2

imagen3

<210> 2

<211> 352

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 2

imagen4

imagen3

<210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ARNsi sintético

<400> 3

uaaccucugc cucaaguact t: 21

<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ARNsi sintético

<400> 4

guacuugagg cagagguuat t: 21

<210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 5

atgcatgcca ccatgaaaaa gcctgaactc acc: 33

<210> 6 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 6

ggatcccagg ctttacactt tatgcttc: 28

<210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 7

ggaatgcagc ttcctcaagg gactcgc: 27

<210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 8

gcactcgtcc gagggcaaag gaatagc: 27

<210> 9

<211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 9

tgtgctggga attgaaccca ggac: 24

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 10

ctacttgtct gtgctttctt cc: 22

<210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 11

tgcagatcgc gctggtggtc tc: 22

<210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 12

gcccctgacc caggtgtagg c: 21

<210> 13 <211> 20

-64

<212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 13

gctccttctt ggtctatacc: 20

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleótido

<400> 14

agaccacttc cttctatgcc: 20

<210> 15 <211> 2424 <212> ADN <213> Cricetulus griseus

<400> 15

imagen5

imagen3

Claims

Reivindicaciones

1.

Célula de hámsteres chino DXB11 en la que se destruye un gen transportador de fucosa.
2.

Célula según la reivindicación 1, en la que la célula de hámsteres chino es una célula de CHO.
3.

Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen se destruye por recombinación homóloga utilizando un vector de reconocimiento génico.
4.

Utilización de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para producir una proteína recombinante.
5.

Utilización según la reivindicación 4, en la que la proteína recombinante es un anticuerpo.
6.

Procedimiento para producir una proteína recombinante utilizando la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como célula hospedadora.
7.

Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la proteína recombinante es un anticuerpo.