JP4632953B2 - Ｎｋ細胞に発現するタンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＫ細胞に発現する新規なタンパク質、および該タンパク質をコードするＤＮＡ、ならびに該分子の製造方法および用途に関する。

細胞障害性Ｔ細胞は、異物である特異的抗原ペプチドと複合体を形成したＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩ分子を認識し活性化され、標的細胞に対して障害活性を発揮するのに対し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は逆にＭＨＣクラスＩ分子を発現していない標的細胞をよく障害する。正常細胞表面上ではウイルス感染や癌化により、このようなＭＨＣクラスＩ分子の発現が抑制される。ＮＫ細胞はこうしたＭＨＣクラスＩ分子の発現が減少した異常細胞に対して障害活性を発揮し、自然免疫としてウイルス感染並びに癌化した細胞の排除機構において中心的役割を担っていると考えられている。実際、ＮＫ細胞はある種の癌細胞を自発的に障害する活性を有する細胞として見出された（非特許文献１参照）。またＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群と呼ばれる（染色体異常のため、１０歳を過ぎる頃には増悪期に入りウイルス感染が制御不能となり、悪性リンパ腫様病変をきたすとされ、２〜３ヵ月の経過で汎血球減少症のため死亡する）疾患は、ＮＫ細胞活性の欠損が原因であることから、ＮＫ細胞の生体内におけるこうした役割が支持される。

最近、NK1.1+CD3-細胞（NK細胞）を欠損したトランスジェニックマウスが作成され、その特徴を解析した結果、NK細胞が、
１）癌細胞の転移と増殖の抑制において重要な役割を果たす、
２）細菌エンドトキシンに応答するInterferon(IFN)γの主要産生細胞である、ことが示された（非特許文献２参照）。

一方、近年になり、同一のＴ細胞受容体を有し、ＮＫ細胞受容体も同時に保持する自然免疫と獲得免疫との性質を併せ持つ第４のリンパ球であるＮＫＴ細胞が肝臓、骨髄を中心とした極めて広範な臓器に分布し、かつこの細胞が免疫寛容、自己免疫疾患、肝炎、感染症といった多くの疾病に関与しているという知見が明らかにされている。多発性硬化症を早期に発病するマウスの研究から、リンパ球に含まれる免疫細胞のＮＫＴ細胞が、多発性硬化症の発病に何らかの関連を有することが分かった（非特許文献３参照）。また、主要な喘息症状であるアレルギー性気道過反応がＮＫＴ欠損マウスでは示されなかったことから、ＮＫＴ細胞を不活化して喘息を予防できる可能性が示唆される（非特許文献４参照）。このＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞と異なりＴ細胞レセプターに対する刺激、或いは樹上細胞上ＣＤ１ｄレセプターに提示される糖脂質であるアルファガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）により活性化されるという活性化機構が明らかとなっている（非特許文献３参照）。一方で、ＮＫ細胞と同様に、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が減少した細胞に対する障害活性を発揮することから、リンパ球集団の細胞障害活性における阻害的調節分子として同定されているＫｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下ＫＩＲ）と、ほぼ同様の機構で細胞障害活性を調節していると思われる。ところが既知のＫＩＲを発現していないＮＫＴサブセット群も知られており、活性化に対して負に働く阻害型受容体およびシグナルカスケードについては不明な点が多く、更なる研究が必要となっていた。

ＮＫＴ細胞の活性化に効果的なリガンド物質は明らかとなっているが、ＮＫ細胞を特異的に活性化する低分子リガンドは同定されていない。

Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９），４７，１８７−３７６ Ｓｕｎｇｊｉｎ Ｋｉｍ，Ｋｏｈｏ Ｉｉｚｕｋａ，Ｈｅｃｔｏｒ Ｌ．Ａｇｕｉｌａ，Ｉｒｖｉｎｇ Ｌ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，ａｎｄ Ｗａｙｎｅ Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００），９７，２７３１−２７３６ 原田通成・谷口克，蛋白質 核酸 酵素（２００２），４７，２１０９−２１１６ Ａｋｂａｒｉ Ｏ，Ｓｔｏｃｋ Ｐ，Ｍｅｙｅｒ Ｅ，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｓｉｄｏｂｒｅ Ｓ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ，Ｇｒｕｓｂｙ ＭＪ，ＤｅＫｒｕｙｆｆ ＲＨ，Ｕｍｅｔｓｕ ＤＴ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２００３），９，５８２−５８８

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＮＫ細胞を特異的に活性化または不活化する受容体分子を単離することにある。より詳しくは、ＮＫ細胞に発現する新規な受容体タンパク質、および該タンパク質をコードするＤＮＡ、および該分子の用途の提供を課題とする。

ＮＫ細胞の活性化機構は、タンパク質チロシンキナーゼによるリン酸化を介した正のシグナルカスケードとリン酸化を受けたシグナル伝達分子の脱リン酸による負のシグナルカスケードの調節により行われていることが示唆されている。この負のカスケードを駆動するための分子を認識するＮＫ細胞の阻害型受容体が、マウスでは細胞外にＣタイプレクチンドメインを有するＣタイプレクチンファミリーであるＬｙ４９分子群であり、ヒトでは細胞外に免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｉｇ）ドメインを有するＫＩＲ分子ファミリーが相当する。ＫＩＲ分子については、それが認識するＭＨＣアロタイプを含めた詳細が明らかとなってきている。ＮＫ細胞はＭＨＣクラスＩ分子の発現が減少した細胞に対する障害活性を発揮することから明らかなように、ＫＩＲ分子の多くが、多型を有し殆どの細胞で発現する古典的ＭＨＣクラスＩ分子を認識し負のシグナルを細胞内に伝達する。一方でＫＩＲ分子の中には非古典的ＭＨＣクラスＩ分子をリガンドとする分子種も有り、ＫＩＲ分子全体が自然免疫系において自己由来の異常細胞に対する監視機構の中心的役割を果たすとされている。

ＫＩＲ分子中にはＬｙ４９同様、細胞質内ドメインにＩＴＩＭと呼ばれるＶ／Ｉ ＸＹＸＸ Ｌ／Ｖ（Ｖ；バリン、Ｉ；イソロイシン、Ｙ；チロシン、Ｌ；ロイシン、Ｘは任意のアミノ酸）モチーフを有する機能性配列が存在しており、本ＩＴＩＭモチーフ中のチロシン残基がリン酸化されると、本部位にＳＨ２ドメインを有するタンパク質チロシン脱リン酸化酵素であるＳＨＰ−１が結合する。ＮＫ細胞での正のシグナルカスケードの活性化に必須なチロシンリン酸化タンパク質（ＳＬＰ−７６分子がその候補として有力視されている。）をＳＨＰ−１が脱リン酸することにより、ＮＫ細胞の活性化を抑制している。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｖｅｎｔ．ｍ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐで公開されている、純化した免疫系細胞（単球・マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球など）のＳｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）解析データ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｓ，Ｂｌｏｏｄ（２００３），１０１，３５０９−３５１３）を参照した。解析データの中には、既知遺伝子配列の配列タグとして同定されたものの他に、未知遺伝子由来と考えられるものが多数同定され、かつ、そのなかに特徴的な発現プロファイルをもつものが同定された。

これらの中から、本発明者らは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に特異的に発現するＮＫＩＲ遺伝子を見出すことに成功した。その予想アミノ酸配列の特徴から、本遺伝子はＮＫ細胞及び一部のＴ細胞に発現し、リンパ球集団の細胞障害活性における阻害的調節分子として同定されているＫｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下ＫＩＲ）のホモログであることが示唆された。本ＮＫＩＲ遺伝子は、多くのＫＩＲ分子群が１９番染色体上にクラスターをなしているのに対して、第一番染色体にマップされる。また本発明者らは、創薬への応用の可能性を追求するために本遺伝子の特徴解析を行った。本発明の遺伝子のスプライシングバリアントと考えられる配列は報告（ＷＯ０１／４９７２８号）されており、ＮＣＢＩ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔにおいてはゲノム配列からの予測により、そのスプライシングバリアントがアサインされている（ＬＯＣ３４３４１３）ものの、その機能については全く知られていない。また、本発明の遺伝子と完全に一致する配列は、これまでのところ知られていない。

前述のようにＮＫ細胞は抗腫瘍、抗ウイルス活性を有することから、臨床応用の可能性としては、ＫＩＲに対するアンタゴニスト抗体を用いたＫＩＲの機能抑制による抗腫瘍効果、抗ウイルス効果が考えられる。また、ＮＫＴ細胞を標的とした場合、アンタゴニスト抗体を用いた抗Ｃ型肝炎等の抗ウイルス性疾患や抗癌、あるいはアゴニスト抗体を用いた抗アレルギー性疾患、抗喘息、抗自己免疫疾患への用途に対する可能性が期待される。

本発明は、ＮＫ細胞に発現する新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、およびこれらの製造方法および用途に関し、より具体的には、
〔１〕 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２、４または６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号２、４または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
〔２〕 配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の断片をコードするＤＮＡ、
〔３〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、
〔４〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含むベクター、
〔５〕 〔１〕もしくは〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔４〕に記載のベクターを保持する宿主細胞、
〔６〕 〔５〕に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質の製造方法、
〔７〕 〔３〕に記載のタンパク質に結合する抗体、
〔８〕 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質に対するリガンドの同定方法、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質または〔３〕に記載のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させる工程
（ｂ）候補化合物が〔３〕に記載のタンパク質または〔３〕に記載のタンパク質を発現している細胞に結合するか否かを検出する工程
〔９〕 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質に対するアゴニストの同定方法、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させる工程
（ｂ）候補化合物が〔３〕に記載のタンパク質の活性化の指標となるシグナルを発生させるか否かを検出する工程
〔１０〕 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質に対するアンタゴニストの同定方法、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させる工程
（ｂ）候補化合物の非存在下で検出した場合と比較して、〔３〕に記載のタンパク質の活性化の指標となるシグナルが減少するか否かを検出する工程
〔１１〕 〔８〕に記載の方法によって同定され得る、〔３〕に記載のタンパク質に対するリガンド、
〔１２〕 〔９〕に記載の方法により同定され得る、〔３〕に記載のタンパク質に対するアゴニスト、
〔１３〕 〔１０〕に記載の方法により同定され得る、〔３〕に記載のタンパク質に対するアンタゴニスト、
〔１４〕 以下の（ａ）または（ｂ）を少なくとも１つ含む、〔８〕から〔１０〕のいずれかに記載の方法に用いるためのキット、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質
（ｂ）〔５〕に記載の宿主細胞
〔１５〕 〔３〕に記載のタンパク質に対するアゴニスト（または〔１２〕に記載のアゴニスト）を有効成分として含有する、免疫抑制剤、
〔１６〕 〔３〕に記載のタンパク質に対するアゴニスト（または〔１２〕に記載のアゴニスト）を有効成分として含有する、アレルギー性疾患または自己免疫疾患治療剤、
〔１７〕 〔３〕に記載のタンパク質に対するアンタゴニスト（または〔１３〕に記載のアゴニスト）を有効成分として含有する、免疫増強剤、
〔１８〕 〔３〕に記載のタンパク質に対するアンタゴニスト（または〔１３〕に記載のアゴニスト）を有効成分として含有する、抗腫瘍または抗ウイルス剤、
〔１９〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡ、
〔２０〕 〔１９〕に記載のＤＮＡ、または〔７〕に記載の抗体を含む、〔３〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現の異常または活性の異常に関連した疾患の検査薬、を提供するものである。

また本発明の別の態様においては、
（ａ）本発明のタンパク質の、該タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストのスクリーニングのための使用
（ｂ）本発明のタンパク質に対するアゴニストの、免疫抑制剤の製造のための使用
（ｃ）本発明のタンパク質に対するアゴニストの、アレルギー性疾患もしくは自己免疫疾患治療剤の製造のための使用
（ｄ）本発明のタンパク質に対するアンタゴニストの、免疫増強剤の製造のための使用
（ｅ）本発明のタンパク質に対するアンタゴニストの、抗腫瘍剤もしくは抗ウイルス剤の製造のための使用
を、提供するものである。

さらに本発明は、以下の方法に関する。
（ａ）対象者（患者等）へ本発明のタンパク質に対するアゴニストを投与する工程を含む、免疫機能を抑制させる方法。
（ｂ）対象者（患者等）へ本発明のタンパク質に対するアゴニストを投与する工程を含む、アレルギー性疾患もしくは自己免疫疾患の治療方法（あるいは予防方法）。
（ｃ）対象者（患者等）へ本発明のタンパク質に対するアンタゴニストを投与する工程を含む、免疫機能を増強させる方法。
（ｄ）対象者（患者等）へ本発明のタンパク質に対するアンタゴニストを投与する工程を含む、癌（腫瘍）もしくはウイルス性疾患の治療方法（あるいは予防方法）。

図１は、Hisトラップカラムを用いて精製したNKIR融合タンパク質のSDS-PAGE電気泳動による分析結果を示す写真である。 図２は、抗NKIRポリクローナル抗体によるNKIRタンパク質の検出を示す写真である。 図３は、RT-PCRによる組織発現解析の結果を示す写真である。AはMTCパネルIおよびIIについて、BはImmune SystemおよびBlood Fractionについて示す。以下に各レーンについて示す。A：レーン１：心臓、レーン２：脳、レーン３：胎盤、レーン４：肺、レーン５：肝臓、レーン６：骨格筋、レーン７：腎臓、レーン８：膵臓、レーン９：脾臓、レーン10：胸腺、レーン11：前立腺、レーン12：精巣、レーン13：卵巣、レーン14：小腸、レーン15：大腸、レーン16：末梢血白血球B：レーン１：脾臓、レーン２：リンパ節、レーン３：胸腺、レーン４：末梢血白血球、レーン５：扁桃、レーン６：胎児肝臓、レーン７：骨髄、レーン８：単核細胞、レーン９：休止CD8+細胞、レーン10：休止CD4+細胞、レーン11：休止CD14+細胞、レーン12：休止CD19+細胞、レーン13：活性化CD19+細胞、レーン14：活性化単核細胞、レーン15：活性化CD4+細胞、レーン16：活性化CD8+細胞 図４は、NK-92細胞株が発現する天然NKIRタンパク質の抗NKIRポリクローナル抗体による検出を示す写真である。 図５は、NK-92細胞株の抗NKIRポリクローナル抗体によるフローサイトメトリー解析を示す図である。 図６は、COS-7株でのNKIR遺伝子の一過性発現に対するフローサイトメトリー解析を示す図である。 図７は、ヒトNKIRをqueryにblast検索を行い、得られたマッチするマウス染色体配列とのアライメントを示す図である。 図８は、ヒト−マウスNKIR配列のアライメントを示す図である。 図９は、各形質転換導入株のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。 図１０は、ルシフェラーゼ活性を指標としたITIM活性のアッセイ結果を示すグラフである。 図１１−１は、実施例１６において選択された3クローンのCD8キメラ構造を示す図である。 図１１−２は、実施例１７で使用する抗CD8抗体、LT8（Serotec）とヤギ抗マウスIgG-FITCコンジュゲート抗体（Coulter）を用いたこれらクローンのFACS解析の結果を示す図である。A:F11クローン、LT8（１次抗体）なし、B：F11クローン、LT8（１次抗体）あり、C：CD8キメラクローン、LT8（１次抗体）なし、D：CD8キメラクローン、LT8（１次抗体）あり 図１２は、実施例１７のレポーターアッセイによるITIM機能活性測定の結果を示す図である。LT8：抗CD8抗体（LT8）、CL：クロスリンカー（ラット抗マウスIgG1抗体）

本発明者らは、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲを用いてＮＫ細胞に特異的に発現する遺伝子をクローニングした。得られたクローンには、スプライスバリアントと思われるクローンが複数含まれたため、本来の配列を得るため５’ＲＡＣＥを行い、ＫＩＲメンバーであることが推察されるＮＫＩＲ遺伝子を同定した。該遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。さらに、ＮＫ−９２株より調製した全ＲＮＡを用いて、５’並びに３’ＲＡＣＥ法により再度ＮＫＩＲ遺伝子の全長クローニングを行ったところ、５’端に３６塩基のシグナル様配列を有し、３’端側におよそ５００塩基伸長した配列を有するクローンが得られた。該クローンの塩基配列を配列番号：３に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。さらにマウスＮＫＩＲ配列のクローニングを行い、得られた塩基配列を配列番号：５に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。

本発明は、ＮＫ細胞に発現する新規なタンパク質、および該タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡの好ましい態様としては、下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡである。

（ａ）配列番号：２、４、または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４または６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：２、４または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ（より好ましくは、配列番号：１、３、または５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：２、４または６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ）

本発明は、本発明者らにより同定されたＮＫ細胞発現タンパク質（配列番号：２、４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）（以下、「ＮＫＩＲタンパク質」と記載する場合あり）と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、これらタンパク質の変異体、ヒトおよびマウス以外の生物のホモログ等が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質がＮＫＩＲタンパク質と同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを指す。このような活性としては、例えば、ＫＩＲが有する活性、ＮＫ細胞による細胞障害活性に対する抑制活性、或いは細胞の活性化において同様の細胞内シグナル伝達が介在するＴ細胞或いはマスト細胞などの免疫系細胞を宿主として形質導入したＫＩＲ分子によるそれぞれの細胞種の活性化シグナル伝達に対する抑制活性、等を挙げることができる。従って、対象となるタンパク質が本発明者らによって同定されたタンパク質と同等の生物学的あるいは生化学的な活性を有しているか否かは、例えば、形質導入などにより当該分子種を導入した免疫系細胞の活性化シグナルに対する阻害活性を、細胞質内カルシウム濃度の測定により検出する方法（Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ Ｐ，Ｆｒｉｄｍａｎ ＷＨ，Ｖｉｖｉｅｒ Ｅ，Ｄａｅｒｏｎ Ｍ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９），１６２，３１６８−３１７５）、またはカルシニューリンカスケード制御下にあるＮＦ−ＡＴシス配列を有したレポーター遺伝子の発現を測定することにより検出する方法（Ｆｒｙ ＡＭ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ，Ｗｅｉｓｓ Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９９６），１８４，２９５−３００）、或いは宿主としてマスト細胞を用いた場合には同様にＣａカスケードの下流にあるセロトニンの放出を^３Ｈラベルしたセロトニンの測定により検出する方法（Ｂｌｅｒｙ Ｍ，Ｄｅｌｏｎ Ｊ，Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ａ，Ｃａｍｂｉａｇｇｉ Ａ，Ｏｌｃｅｓｅ Ｌ，Ｂｉａｓｓｏｎｉ Ｒ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ｌ，Ｃｈａｖｒｉｅｒ Ｐ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ，Ｄａｅｒｏｎ Ｍ，Ｖｉｖｉｅｒ Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９７），２７２，８９８９−８９９６．）によって評価することが可能である。

あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、例えば、タンパク質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げられる。具体的には、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、人工的か自然に生じたものかを問わず、本発明者らにより同定されたＮＫＩＲタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内）であると考えられる。

また、変異導入部位は特に制限されないが、後述のモチーフもしくはドメイン以外の部位であることが好ましい。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。

ＮＫＩＲタンパク質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、ＮＫＩＲタンパク質（配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。

本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。

また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ＮＫＩＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１、３、または５）もしくはその一部を基に、同種または異種生物由来のＤＮＡ試料から、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡからＮＫＩＲタンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することも通常行いうることである。

本発明には、ＮＫＩＲタンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードし、ＮＫＩＲタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、ヒトあるいはマウスおよび他の哺乳動物のホモログ（例えば、ラット、ウサギ、ウシ、サル、等がコードするタンパク質）が挙げられる。

ＮＫＩＲタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

また、ハイブリダイゼーションにかえて、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）を用いて、本発明者らにより同定されたタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１、３、または５）の一部を基にプライマーを設計し、本発明者らにより同定されたタンパク質をコードするＤＮＡ配列と相同性の高いＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡを基に本発明者らにより同定されたタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることも可能である。

本発明のタンパク質は「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。本発明のタンパク質には、リーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含まれていてもよい。

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、ＮＫＩＲタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、これらタンパク質（配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のタンパク質には、ＮＫＩＲタンパク質と機能的に同等であり、かつ該タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。タンパク質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。

アミノ酸配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えば、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。

本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質は、本発明のタンパク質と機能的に同等である限り、本発明に含まれる。

本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。

また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち、目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。

天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。

本発明は、また、本発明のタンパク質の断片（部分ペプチド）を提供する。こうした断片は全体的に前記本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明のタンパク質の断片は、通常、８アミノ酸残基以上、好ましくは１２アミノ酸残基以上（例えば、１５アミノ酸残基以上）の配列からなるタンパク質の断片である。好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む一連の残基の二連の残基の欠失したアミノ酸配列を有するトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）ポリペプチドが含まれる。また、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減少した断片を含めて、本発明のタンパク質の活性を媒介するものである。例えば、リガンドが結合して細胞内へシグナル伝達を行う活性を有する断片が挙げられる。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。これらのタンパク質断片は、抗原活性を含めた本発明のタンパク質の生物学的または生化学的活性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的なこうした置換は、Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕとＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒの間、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｕの間、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの間、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で起こる。

本発明の上記タンパク質断片は特に制限されないが、後述のモチーフもしくはドメインを少なくとも含むような断片であることが好ましい。

上記断片は、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合するリガンドとなる化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに利用し得る。

本発明のタンパク質断片（部分ペプチド）は、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。タンパク質断片（部分ペプチド）の合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。

また、本発明における「リガンド」とは、本発明のタンパク質に結合する分子を意味する。リガンドには天然リガンドおよび合成リガンドが含まれる。「アゴニスト」とは、本発明のタンパク質に結合し、それを活性化する分子を意味する。一方「アンタゴニスト」とは、本発明のタンパク質の活性化を阻害する分子を意味する。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治療可能な疾患の遺伝子治療、あるいは遺伝子診断などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。

本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号：１、３、または５）の一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよく、あるいは市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成後、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号：１、３、または５）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。

また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。

具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器（例えば、ＮＫ細胞や後述の実施例において発現が認められた組織）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。

得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。

また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。

本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１、３、または５に示す各塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションにおける条件は当業者であれば適宜選択することができるが、具体的には上記した条件を用いることができる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである。

本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。

本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。

また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。

大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。

ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のタンパク質コードする遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。

また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

一方、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、例えば、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。

例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。

また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。

さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。

これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。

本発明は、本発明の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、本発明のタンパク質の製造方法を提供する。

タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。

なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

本発明は、また、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。

抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。

本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。

本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。

げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。

ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。

モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。

細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。

次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。

例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。

ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。

このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。

さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。

抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。

前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。

アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。

アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。

これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触させ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、本発明のタンパク質を用いた種々の実験等に有用である。

本発明はまた、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡを提供する。

ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。

このような核酸には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）が含まれる。また、このような核酸は、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。

プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。

本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の異常または本発明のタンパク質の活性（機能）の異常に関連した疾患の検査薬を提供する。

その一つの態様は、上記した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡを含む検査薬である。該ＤＮＡは、上記本発明の検査方法において、本発明のタンパク質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を検出するためのプローブとして、本発明のタンパク質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を増幅するためのプライマーとして用いることができる。本発明のＤＮＡは、例えば市販のＤＮＡ合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。本発明のＤＮＡをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ＤＮＡの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。

本発明の検査薬の他の一つの態様は、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体を含む検査薬である。該抗体は、上記の本発明の検査方法において、本発明のタンパク質を検出するために用いられる。抗体は、本発明のタンパク質を検出可能であればその形態に制限はない。検査のための抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。抗体は必要に応じて標識されていてもよい。

上記の検査薬においては、有効成分であるＤＮＡや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。

また、本発明の受容体タンパク質は、そのリガンド、アゴニスト、またはアンタゴニストの同定に有用である。本発明は、本発明のタンパク質を用いた、該タンパク質のリガンド、アゴニスト、アンタゴニストの同定（スクリーニング）方法を提供する。

本発明のリガンドの同定方法の好ましい態様においては、まず、本発明のタンパク質または該タンパク質を発現している細胞と候補化合物（被検試料）を接触させ、次いで候補化合物が本発明のタンパク質または該タンパク質を発現している細胞に結合するか否かを検出（結合活性を評価）する。次いで、結合活性を有する化合物をリガンドとして選択する。

本発明の同定（スクリーニング）方法に用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。候補化合物としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。候補化合物を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、可溶型タンパク質として、担体に結合させた形態として、他のタンパク質との融合タンパク質として、細胞膜上に発現させた形態として、あるいは膜画分として候補化合物（被検試料）に接触させることができる。

本発明のタンパク質を用いて、例えば該タンパク質に結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターへ挿入し、動物細胞等で該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば特に制限されない。

動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法であってもよい。

特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のタンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。

融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。

免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。

免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。

免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。

免疫沈降されたタンパク質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である^３５Ｓ−メチオニンや^３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。

また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、ＮＫ細胞）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識した本発明のタンパク質と上記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。

また、本発明の上記同定（スクリーニング）方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を得ることができる。これにより本発明のタンパク質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することが可能である。２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。

本発明のタンパク質と結合する候補化合物のスクリーニングは、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される候補化合物を適用する。この場合の候補化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。候補化合物を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。

得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。

本発明において、結合した候補化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のタンパク質と候補化合物との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。従って、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のタンパク質と候補化合物との結合を評価することが可能である。

さらに、上記した本発明の方法によって同定され得るリガンドもまた、本発明に含まれる。

本発明のタンパク質に対するアゴニストの同定方法の好ましい態様においては、まず、本発明のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させ、候補化合物が本発明のタンパク質の活性化の指標となるシグナルを発生するか否かを検出する。即ち、本発明の受容体タンパク質に対し候補化合物を作用させ、本発明のタンパク質がアゴニスト刺激に応答して発生するシグナルの有無を指標として、候補化合物がアゴニストであるか否かを判定する方法である。

本発明者らは、本発明の受容体タンパク質が発生するシグナルによって、免疫抑制作用が誘起されることを見出した。従って、本発明の上記シグナルの有無の検出は、例えば、免疫抑制作用の誘起の有無等を測定することによって行うことができる。元来交叉性のないマウスとヒト間の免疫系を免疫能欠損マウス中にヒト造血幹細胞を移植することによりヒト免疫系を再構築したヒト型モデルマウス（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ Ｈ，Ｎｉｓｈｉｋｏｍｏｒｉ Ｒ，Ｈｅｉｋｅ Ｔ，Ｉｔｏ Ｍ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｋａｔａｍｕｒａ Ｋ ａｎｄ Ｎａｋａｈａｔａ Ｔ，Ｂｌｏｏｄ（２００３），１０２，８７３−８８０）を用いて実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）を誘導した後、アゴニスト候補物質を投与しかかるマウスに対するＥＡＥ評価（後肢の麻痺、尿失禁及び体重減少の定量）を行うことによる研究例などが一例となりうる。上記方法においては、上記シグナルが検出された場合に、候補化合物はアゴニストであるものと判定される。なお上記方法によって同定され得るアゴニストもまた、本発明に含まれる。

また本発明は、本発明のタンパク質に対するアゴニストを有効成分として含有する、免疫抑制剤を提供する。本発明の免疫抑制剤は、例えば、アレルギー性疾患（例えば、アレルギー性喘息等）、自己免疫疾患等の治療に有効であるものと期待される。従って本発明は、本発明のタンパク質に対するアゴニストを有効成分として含有する、アレルギー性疾患、または自己免疫疾患治療剤を提供する。

本発明のタンパク質に対するアンタゴニストの同定方法の好ましい態様においては、まず、本発明のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させ、次いで、候補化合物の非存在下で検出した場合と比較して、本発明のタンパク質の活性化の指標となるシグナルが減少するか否かを検出する。

本発明の受容体タンパク質の発生するシグナルを減少（抑制）させることにより、例えば、免疫増強作用（例えば、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性等）が引き起こされるものと考えられる。従って、本発明の上記シグナルの減少は、例えば、免疫増強作用の上昇を検出することにより、測定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてはＮＫ細胞による標的細胞（例えば、Ｋ−５６２株などのＮＫ感受性株）に対する細胞障害活性をかかるアンタゴニスト候補物質の存在或いは非存在下で測定、比較することにより、またｉｎ ｖｉｖｏでは先に記したヒト免疫系を再構築したヒト型モデルマウスを用いてウイルス感染ヒト細胞、或いはヒト癌組織を移植した後アンタゴニスト候補物質を投与し、かかるマウスに対する移植ウイルス感染細胞或いは癌組織に対する細胞障害活性を評価することによる研究例などが一例となりうる。

上記方法においては、上記シグナルの減少が検出された場合に、候補化合物はアンタゴニストであるものと判定される。なお上記方法によって同定され得るアンタゴニストもまた、本発明に含まれる。

また本発明は、本発明のタンパク質に対するアンタゴニストを有効成分として含有する、免疫増強剤を提供する。本発明の免疫増強剤は、例えば、抗腫瘍剤、または抗ウイルス剤として有効であるものと期待される。従って本発明は、本発明のタンパク質に対するアンタゴニストを有効成分として含有する、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤を提供する。

また、アゴニストまたはアンタゴニストなどの本発明のタンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。

本発明は、また、上記同定（スクリーニング）方法に用いるためのキットを提供する。該キットは、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を発現する細胞を含む。該キットには、ＮＫＩＲタンパク質のリガンド、アゴニスト、あるいはアンタゴニストの候補となる化合物が含まれていてもよい。

本発明のタンパク質、または本発明の同定（スクリーニング）方法により単離しうる化合物、本発明の上記薬剤をヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

本発明のタンパク質の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１００μｇから２０ｍｇであると考えられる。

本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を調節する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。

非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

〔実施例１〕 全長配列のクローニング
本発明者らは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｖｅｎｔ．ｍ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐで公開されている免疫系細胞のＳＡＧＥ（ＳＡＧＥ：ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）解析データ中に、ＮＫ細胞に特異的な未知遺伝子配列タグ（表１）を見出し、該当するタグが公開公報（ＷＯ０１４９７２８）ＡＸ１９１６１９中にあるのを見出した。表１は、配列タグ（ＴＧＣＣＧＣＡＴＡＡ）のＮＫ細胞由来ライブラリーにおける選択的な出現を表す。

これに基づきコーディング領域全体を増幅するプライマー（ＳＡ１（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡ−３’／配列番号：７）、ＳＡ２（５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡ−３’／配列番号：８））を設計し、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲを用いて遺伝子をクローニングした。得られたクローンの塩基配列を配列番号：１に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また詳細な手順を以下に示す。

（１）ｐＧＥＭＴＥ＿ＮＫ１の作成
以下の反応条件でＰＣＲを行った。
鋳型：ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｅｅｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）
プライマー：ＳＡ１⇔ＳＡ２
反応条件：９６℃で１分
９６℃で３０秒、７２℃で４分、５サイクル
９６℃で３０秒、７０℃で４分、５サイクル
９６℃で２０秒、６８℃で４分、２５サイクル

ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いて（バッファー，ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅは添付）ＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動により約１．５ｋｂのバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後、ｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入しｐＧＥＭＴＥ＿ＮＫ１を作成した。塩基配列はプライマー−ＳＡ１〜７、Ｔ７、ＳＰ６を用いて確認した。
ＳＡ３：５’−ＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧ−３’／配列番号：９
ＳＡ４：５’−ＧＣＣＡＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＡＡＡＧ−３’／配列番号：１０
ＳＡ５：５’−ＣＣＴＣＣＧＡＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＣ−３’／配列番号：１１
ＳＡ６：５’−ＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧ−３’／配列番号：１２
ＳＡ７：５’−ＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡ−３’／配列番号：１３
Ｔ７プロモータープライマー：５’−ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣ−３’／配列番号：１４
ＳＰ６プロモータープライマー：５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ−３’／配列番号：１５

（２）ｐＣＯＳ＿ＮＫ１の作成
ｐＧＥＭＴＥ−ＮＫ１をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約１．５ｋｂのバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後、ｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＣＯＳ−ＮＫ１を作成した。

（３）ｐＣＨＯ２−ＮＫ１−ＦＬＡＧの作成
以下の反応条件でＰＣＲを行った。
鋳型：ｐＧＥＭＴＥ−ＮＫ１
プライマー：ＳＡＳ１（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣ−３’／配列番号：１６）⇔ＳＡＳ２（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣ−３’／配列番号：１７）
反応条件：９４℃で２分
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分、２５サイクル

ＫＯＤ ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて（バッファー、ｄＮＴＰｓ，ＭｇＳＯ_４は添付）ＰＣＲを行った。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製後、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断しアガロースゲル電気泳動により約１ｋｂのバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後、ｐＣＨＯ２−ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＨＯ２−ＮＫ１−ＦＬＡＧを作成した。塩基配列はプライマー−ＳＡＳ１、ＳＡＳ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、ＥＦ１α、ｐｏｌｙＡを用いて確認した。
ＥＦ１α：５’−ＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡ−３’／配列番号：１８
ＩｇＧ１ ｐｏｌｙＡ５’−ＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＧＣＡ−３’／配列番号：１９

（４）ｐＣＨＯ２−ＳＧＮＫ１−ＦＬＡＧの作成
以下の反応条件でＰＣＲを行った。
Ａ：鋳型：ｐＣＯＳ２−ＳＧｈＭＰＬ−ＦＬＡＧ
プライマー：Ｈｍｐｌ−ｓｉｇ１（５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣ−３’／配列番号：２０）⇔ＮＫ１−ｓｉｇ２（５’−ＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧ−３’／配列番号：２１）
Ｂ：鋳型：ｐＧＥＭＴＥ−ＮＫ１
プライマー：ＮＫ１−ｓｉｇ１（５’−ＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＴ−３’／配列番号：２２）⇔ＳＡＳ２
Ｃ：鋳型：反応系ＡとＢの産物を混合したもの
プライマー：Ｈｍｐｌ−ｓｉｇ１⇔ＳＡＳ２
反応条件：９４℃で２分
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分、２５サイクル

ＫＯＤ ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて（バッファー、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４は添付）ＰＣＲを行った。反応系ＣのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製後、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断しアガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂのバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後、ｐＣＨＯ２−ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＣＨＯ２−ＳＧＮＫ１−ＦＬＡＧを作成した。塩基配列はＰｒｉｍｅｒ−ＮＫ１−ｓｉｇ１、ＮＫ１−ｓｉｇ２、ＳＡＳ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、ＥＦ１α、ｐｏｌｙＡを用いて確認した。

以上の（１）から（４）の工程により得られたクローンの塩基配列を決定したところ４２９アミノ酸からなる膜タンパク質と予想された。この配列を相模中研の配列（ＷＯ０１／４９７２８号）と比較したところ、中央部分の配列は相模中研の配列と同じであるが、Ｎ末は差が認められ、タンパク質配列にも差があることが判明した。今回クローニングしたクローンはＣ末端側は得られた全クローンで同一だったが、５’側はスプライスバリアントらしきクローンも複数得られたため、本来の配列を確認するため以下のように５’ＲＡＣＥを行った。

ＮＫ細胞よりＲＮＡ−Ｂｅｅ＿ＲＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて抽出したＲＮＡ（０．４μｇ／μｌ，２０μｌ ｉｎ ＤＥＰＣ−ＤＤＷ）１μｇからＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，１００μｌ ｉｎ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）を合成し５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを以下の反応条件で行った。

１回目 鋳型：５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，２．５μｌ
プライマー：１０ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒａ Ａ Ｍｉｘ（添付、１ｘにて使用）⇔ＳＡＳ２
１０ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：（ｌｏｎｇ，０．４μＭ：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’／配列番号：２３）
（ｓｈｏｒｔ，２μＭ：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’／配列番号：２４）
２回目 鋳型：１回目ＰＣＲ産物，５μｌ
プライマー：Ｎｅｓｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ（ＮＵＰ）（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’／配列番号：２５）⇔ＳＡ４
反応条件：９４℃で３０秒
９４℃で５秒、７２℃で３分、５サイクル
９４℃で５秒、７０℃で１０秒、７２℃で３分、５サイクル
９４℃で５秒、６８℃で１０秒、７２℃で３分、３０サイクル
７２℃で７分

２回目ＰＣＲのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約６５０ｂｐのバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後、ｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入した。塩基配列をＰｒｉｍｅｒ−ＳＡ３、４、Ｔ７、ＳＰ６、ＮＵＰを用いて確認した。

その結果、配列を確認した５クローン全てのコーディング配列が今回の塩基配列と一致した（うち、１クローンは５’が短かった）。従って、今回得たクローンが実際に発現している塩基配列であると考えられた。

Ｐｒｏｓｉｔｅ、Ｐｆａｍ、Ｐｓｏｒｔ等によるモチーフ検索の結果より、以下のような配列上の特徴を検出した。
Ｎ型糖鎖付加部位（Ｎ［＾Ｐ］［ＳＴ］［＾Ｐ］） ６０：ＮＱＴＬ，２４５：ＮＨＳＡ，２６８：ＮＹＳＣ
ＩＴＩＭモチーフ（Ｙｘｘ［ＶＬ］） ３５１：ＹＡＮＶ，３６６：ＹＳＶＶ
Ｉｇ様ドメイン ２７−８０，１２０−１７７，２１６−２７３
膜貫通ドメイン ３０９−３２５

今回単離された遺伝子はＦｃＲスーパーファミリーに属する古典的ＭＨＣクラスＩをリガンドとして認識する抑制性受容体（ＫＩＲ）メンバーであることが、上記の配列情報から推察された。この遺伝子はＮＫ細胞に特異的に発現する特徴を有することから、以下ではＮＫＩＲ遺伝子と呼称する。

〔実施例２〕ウサギポリクローナル抗体によるＮＫＩＲタンパク質の検出
大腸菌発現系を構築し、ＮＫＩＲ細胞外ドメインの融合タンパク質の発現精製を行った（図１）。詳細な手順を以下に示す。

（１）ＮＫＩＲ融合タンパク質大腸菌発現プラスミドｐＥＴ３２ａ−ＮＫ−ｓｏｌの作製
以下の反応条件でＰＣＲを行った。
鋳型：ｐＧＥＭＴＥ−ＮＫ１
プライマー：ＮＫｆｕｓｉｏｎ（５’−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＴＴ−３’／配列番号：２６）⇔ＮＫｒ２（５’−ＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣ−３’／配列番号：２７）
反応条件：９４℃で２分
９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分、２５サイクル

ＫＯＤ ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて（バッファー、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４は添付）ＰＣＲを行った。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製後、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断しアガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂのバンドを切り出した。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲカラムで精製した後、ｐＥＴ−３２（ａ）（ノバジェン）のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩサイトに挿入しｐＥＴ３２ａ−ＮＫ−ｓｏｌを作製した。

（２）ＮＫＩＲタンパク質動物細胞発現プラスミドｐＣＯＳ２−ＮＫ−ＦＬＡＧの作製
以下の反応条件でＰＣＲを行った。
鋳型：ｐＧＥＭＴＥ−ＮＫ１
プライマー：ＮＫｆｌａｇ（５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＴＴ−３’／配列番号：２８）⇔ＮＫｒ１（５’−ＣＧＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＴＣ−３’／配列番号：２９）
反応条件：９４℃で２分
９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分、２５サイクル

ＫＯＤ ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて（バッファー、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４は添付）ＰＣＲを行った。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製後、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで切断しアガロースゲル電気泳動により約１．３ｋｂのバンドを切り出した。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲカラムで精製した後、ｐＣＯＳ２のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに挿入しｐＣＯＳ２−ＮＫ−ＦＬＡＧを作製した。

（３）ＮＫＩＲ融合タンパク質およびＮＫＩＲウサギポリクローナル抗体の調製
チオレドキシン融合タンパク質発現プラスミドｐＥＴ３２ａ−ＮＫ−ｓｏｌにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養した大腸菌懸濁液を終濃度１％になるように５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地へと拡大伝播して６００ｎｍでの吸光度が０．４になるまで培養を行った後、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加してタンパク質発現誘導を行った。４．５時間培養を行った後遠心して菌体沈殿物を回収、ＰＢＳに懸濁した。超音波破砕機により菌体破砕後に遠心し上清を捨て、沈殿画分を回収した。７Ｍ尿素を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で可溶化した後、０．４５μｍのフィルターろ過を行った。ろ液よりＨｉｓＴｒａｐキット（アマシャムバイオサイエンス）を用いて、ＮＫＩＲ融合タンパク質を分離した。溶出液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）に対して透析して可溶化した融合タンパク質サンプルを得た。期待通りの分子量の融合タンパク質が得られていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシー染色により確認した。

得られたＮＫＩＲ融合タンパク質を免疫原としてウサギを免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。抗原タンパク質を０．２ｍｇ／０．５ｍｌに調製し、フロイント完全アジュバント（ベクトンディッキンソン）を０．５ｍｌを加え１ｍｌを皮内へ接種（１日、４日、１１日）した。１９日、２６日、３３日目に抗原タンパク質０．０５ｍｇを静注した。試採血を行い、抗体価があがっていることを確認後、採血を行い、抗血清をプロテインＡアフィニティーカラムに供し抗体タンパク質を精製した。得られたポリクローナル抗体がＣＯＳ−７動物細胞で一過的に発現したＮＫＩＲへの結合性を示すことを、以下のウエスタンブロッティングにより確認した。

FuGENE6（ロシュダイアグノティクス）を用いて製造者の指示に従い、pCOS2-NK-FLAG をCOS-7細胞へと導入した。２日間培養した後、細胞を可溶化液(10% グリセロール, 50mM Tris pH7.6, 150mM NaCl, 5mM NP-40, プロテアーゼ阻害剤 complete)を加え懸濁した後に遠心し、可溶化膜タンパク質成分が含まれる上清を得た。可溶化画分に抗FLAG M2抗体レジンを添加し、FLAG-NKIRを免疫沈降した。得られたサンプルをSDS-PAGE後に、PVDF膜へと転写し、抗NKIRポリクローナル抗体を用いて検出した。1次抗体としてウサギより得られたポリクローナル抗体（4.1 mg/ml IgG）を1000倍希釈にて、2次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体（アマシャムバイオサイエンス）を3000倍希釈にて使用した。検出にはECLウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス）を用いた。また対照として抗FLAG M2抗体（シグマ）を1000倍希釈にて、2次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体（アマシャムバイオサイエンス）を3000倍希釈にて使用してFLAG-NKIRタンパク質の存在を確認した（図２）。

〔実施例３〕 組織発現解析及びＮＫ細胞株における発現解析
市販ｃＤＮＡパネル（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣ）ｐａｎｅｌ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を鋳型に用いてＰＣＲにより組織発現プロファイルを解析した。

以下の反応条件でＰＣＲを行った。
鋳型：ＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉ，ＩＩ，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ及びＨｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
プライマー：ＮＫＩＲ０７（５’−ＡＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＴＣ−３’／配列番号：３０）⇔ＮＫＩＲ０８（５’−ＴＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＣＧＧＴ−３’／配列番号：３１）
反応条件：９４℃で３０秒
９４℃で３０秒、６５℃で２分、３５サイクル

ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いて（バッファー、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅは添付）ＰＣＲを行った。反応は５０μｌで行い反応液５μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供し０．６ｋｂ長バンドの出現を確認した。コントロール反応にはＭＴＣ ｐａｎｅｌに付属のＧ３ＰＤＨ ｐｒｉｍｅｒをプライマーに使用した。

その結果、脾臓、白血球といった免疫系に特異的に発現していることが示された（図３）。上記ＭＴＣパネルのＢｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎ及びＩｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍのサブセットを用いて解析対象を増やしたところＢｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎでは単核球、ｒｅｓｔｉｎｇ ＣＤ８＋、またＩｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍでは脾臓、白血球の他、リンパ節に限局した発現が確認された（図３）。

株化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株である、ＡＴＣＣより購入したＮＫ−９２株（カタログ番号：ＣＲＬ−２４０７）より調製した細胞溶解液を用いたウエスタンブロッティング解析を行った。

ＮＫ−９２株を１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）存在下、ＮＫ−９２継代培地（１２．５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１２．５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），０．１ｍｇ／ｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），０．１ｍｇ／ｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１００μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ｍＭ葉酸（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）および２０ｍＭミオ−イノシトール（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）含有α−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にて培養し得られた１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓを５００μｌのＮＰ４０溶解バッファー（１％ ＮＰ４０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁し、氷上で３０分静置後１５０００ｒｐｍのマイクロ遠心にて上静を分画し、細胞溶解液としてウエスタンブロッティング解析に用いた。

細胞溶解液のタンパク質濃度をＰＩＥＲＣＥ製のウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）をコントロールとしてＤｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定し決定した。

ウエスタンブロッティング解析の為のＳＤＳ−ＰＡＧＥにはＰＡＧ−Ｍｉｎｉ（４−２０％ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ、第一化学薬品株式会社）を用いて１０μｇ及び２０μｇのＮＫ−９２株の細胞溶解液を供した。ポジティブコントロールとしてポリクローナル抗体調製用にウサギに免疫した際に使用した免疫源をＮＰ４０溶解バッファーにて２００倍に希釈した標品１μｌを同時に供した。電気泳動は２０ｍＡの条件で行い、泳動後のゲルをＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて２０ｖｏｌｔｓにて４５分の条件でＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。ウエスタンブロッティングはＥＣＬ＋ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてマニュアルの方法に従い行った。但し、ブロッキング試薬にはＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２％濃度で用いた。１次抗体として前述のウサギより得られたポリクローナル抗体（４．１ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ）を１０００倍希釈にて、また２次抗体として抗ウサギＩｇ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ロバ由来）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を３０００倍希釈にて使用し、抗ＮＫＩＲポリクローナル抗体に対して交叉する分子種を確認した。

その結果、大腸菌で発現したＮＫＩＲ蛋白をウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体に交叉するおよそ６０ｋＤａの分子量を有するタンパク質がＮＫ−９２株で発現していることが示された（図４）。

さらに、本ＮＫＩＲ分子がＮＫ細胞表面に発現していることを確認するために、抗ＮＫＩＲポリクローナル抗体を用いたＮＫ−９２株のフローサイトメトリー解析を行った。

５ｘ１０^５細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファー（２．５％ウシ胎仔血清、０．０２％ ＮａＮ_３ｉｎリン酸緩衝生理食塩水）に懸濁後、終濃度８２μｇ／ｍｌになるように抗ＮＫＩＲポリクローナル抗体を添加した。ネガティブコントロールとして同濃度のウサギ精製ＩｇＧを添加した細胞も調製した。氷上１時間静置後、低速遠心（３００ｘｇ，５ｍｉｎ．）にて細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファーにて洗浄して再度低速遠心にて細胞を回収した。次にヤギ由来ＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を終濃度１４μｇ／ｍｌで含むＦＡＣＳバッファーにて回収した細胞を懸濁後、氷上にて３０分静置した。低速遠心での細胞回収、並びにＦＡＣＳバッファーによる洗浄を行った後５００μｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁してフローサイトメトリー解析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＥＰＩＣＳ）を行った。結果、本ＮＫＩＲ分子が細胞表面に発現していることが示された（図５）。

〔実施例４〕 ＮＫ−９２株由来ｃＤＮＡを用いたＲＡＣＥ法によるＮＫＩＲ遺伝子の全長クローニング
ＮＫ−９２株より調製した全ＲＮＡを用いて５’−並びに３’−ＲＡＣＥ法により再度ＮＫＩＲ遺伝子の全長クローニングを行った。

実施例３に記載の方法で培養された５．４ｘ１０^７のＮＫ−９２細胞より全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて調製し、３７７．７μｇの全ＲＮＡを得た。このように調製した１μｇのＲＮＡを鋳型として、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して５’−ＲＡＣＥ並びに３’−ＲＡＣＥを行った。遺伝子特異的なプライマーとして、５’−ＲＡＣＥではＮＫＩＲ０８を、３’−ＲＡＣＥではＮＫＩＲ０７を用いた。両反応共に１次ＰＣＲ反応にておよそ１．３ｋｂ長の主要増幅産物が得られたため、本増幅断片をアガロースゲルより切り出しＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて精製後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。生じたＴＯＰ１０Ｆ’由来の形質転換株各８株を２ｍｌの０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、培養大腸菌よりプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製し配列を決定した。その結果、５’−ＲＡＣＥ反応からは、これまで確定していた配列以外に５’末端に３６塩基長い挿入を有するｃＤＮＡ配列が得られ、ｐＴＯＰＯＮＫＩＲ６２６として以後の検討に用いた。また、３’−ＲＡＣＥからはおよそ５００塩基下流に伸長しているｃＤＮＡクローン、ｐＴＯＰＯＮＫＩＲ６２０が得られた。この塩基配列を配列番号：３として、また該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４として配列表中に示す。該配列がヒトゲノム上１番染色体のＮＫＩＲ領域に確認された。

そこで、５’端の３６塩基の挿入配列に着目して、実施例１で割り当てた配列と新たに単離した配列とをそれぞれ有する発現ベクターを、ベクター骨格としてｐＣＯＳ１を用いて構築しＣＯＳ−７細胞に一過性発現させた。

ｐＧＥＭ−ＴＥ ＮＫ１を鋳型にしてＮＫＩＲ０９（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡ−３’／配列番号：３２）及びＮＫＩＲ１０（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＧ−３’／配列番号：３３）プライマーを共に０．２μＭ用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲキットはＨＦ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行い、反応条件として９４℃で３０秒の変性の後、９４℃、１５秒＋５５℃、３０秒＋７２℃、１分のサイクルを２５サイクルの後、７２℃で５分の伸長反応を行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、生じた１．５ｋｂ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングし大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製し配列解析を行った。ＰＣＲエラーのないクローン、ｐＴＯＰＯＮＫＩＲ２１９を以後の検討に選択した。

次に５μｇのｐＴＯＰＯＮＫＩＲ２１９並びに１．１５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を各々２０ｕｎｉｔｓのＥｃｏＲＩ並びにＢａｍＨＩにて３７℃、１時間消化した後アガロースゲル電気泳動に供しそれぞれ生じた１．５ｋｂ及び３．０ｋｂの断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した後４０μｌの溶出液の内それぞれ１μｌをＬｉｇａＦＡＳＴ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし、大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製し、ＰｓｔＩ消化により制限チェックし１．３ｋｂ長の消化断片が観察されたクローン、ｐＢＳＮＫＩＲ２２４を以後の検討に用いた。続いてｐＢＳＮＫＩＲ２２４及びｐＴＯＰＯＮＫＩＲ６２６のＢｓｔＰ１並びにＢｇｌＩＩ二重消化から生じたそれぞれ４ｋｂ及び０．４ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動により単離しＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した後ＬｉｇａＦＡＳＴ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製し、配列解析を行い、５’端に３６ｂｐ挿入が認められたクローン、ｐＢＳＮＫＩＲｆｕｌｌ６０５を以後の検討に使用した。

最後に、ｐＢＳＮＫＩＲ２２４並びにｐＢＳＮＫＩＲｆｕｌ６０５由来の１．４ｋｂ長ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入し、それぞれ発現ベクターｐＣＯＳＮＫＩＲ６１０及びｐＣＯＳＮＫＩＲｆｕｌｌ６１０を作成した。両プラスミドを供与ＤＮＡとしてＭＩＲＵＳ ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＰａｎＶｅｒａ）を用いたリポフェクション法にて製造者の指示に従いＣＯＳ−７細胞に形質導入を行い２日間培養した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離後１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて細胞を２回洗浄し、実施例３に記載された方法と同一の手順でフローサイトメトリー解析を行った。

結果、ＮＫ−９２より単離された５’端に３６塩基の挿入を有する配列を持つＮＫＩＲ発現プラスミドでトランスフェクションを行った場合でのみ、ＦＩＴＣ検出でシフトする細胞画分が認められたことから、３６塩基の挿入を有するクローンが分泌型として機能することが示された（図６）。

〔実施例５〕 マウスＮＫＩＲ配列のクローニング
ヒトＮＫＩＲアミノ酸配列をｑｕｅｒｙにしたマウスゲノム配列に対するｂｌａｓｔ検索（ｔｂｌａｓｔｎ）を行い、全長配列にわたってヒットする一番染色体領域を同定した（図７）。このマウス染色体領域はヒトＮＫＩＲがマップされるヒト染色体領域と染色体構造上もマッチする領域である。

予想翻訳領域に基づきプライマー（ｍＮＫＩＲｆ１（５’−ＣＴＣＡＧＴＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣ−３’／配列番号：３４）⇔ｍＮＫＩＲｒ１（５’−ＡＴＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧ−３’／配列番号：３５））を設計し、マウス脾臓ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ増幅を行い、遺伝子をクローニングした。その配列確認を行った結果、スプライシングを受けた転写物の存在を同定できた。

マウス脾臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型に５’−ＲＡＣＥ，３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲは以下の反応条件で行った。
１回目：鋳型：Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，２．５μｌ
プライマー：ＡＰ１（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’／配列番号：３６）⇔ｍＮＫＩＲｆ１ ｆｏｒ ３’ＲＡＣＥ
ＡＰ１⇔ｍＮＫＩＲｒ１ ｆｏｒ ５’ＲＡＣＥ
２回目：鋳型：１回目ＰＣＲ産物を３０倍希釈したもの，２．５μｌ
プライマー：ＡＰ２（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’／配列番号：３７）⇔ｍＮＫＩＲｆ３（５’−ＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣ−３’／配列番号：３８）ｆｏｒ ３’ＲＡＣＥ
ＡＰ２⇔ｍＮＫＩＲｒ３（５’−ＧＣＣＡＧＡＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧ−３’／配列番号：３９）ｆｏｒ ５’ＲＡＣＥ
１回目ＰＣＲ
反応条件：９４℃で１分
９４℃で１０秒、６８℃で３分、３５サイクル
２回目ＰＣＲ
反応条件：９４℃で１分
９４℃で１０秒、６８℃で３分、２０サイクル

ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて（バッファー、ｄＮＴＰｓ，ＭｇＣｌ_２は添付）製造者の指示に従い反応液を調製してＰＣＲを行った。２回目ＰＣＲのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅されたバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後、ｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入した。ＤＨ５αを形質転換し、得られたクローンよりプラスミドを調製して塩基配列を決定した。

その結果、２６８アミノ酸からなる膜タンパク質と予想された。得られたクローンの塩基配列を配列番号：５として、また該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６として配列表中に示す。ヒト−マウス配列の比較（図８）では、マウス配列はヒトの配列と比べ、Ｎ末端、Ｃ末端ともに切り詰めた構造をもっているが、ひとつのＮ型糖鎖付加部位、ひとつのＩＴＩＭモチーフ、膜貫通ドメイン、二つのＩｇ様ドメインを相当する領域に保持していた。

Ｐｒｏｓｉｔｅ，Ｐｆａｍ，Ｐｓｏｒｔ等によるモチーフ検索の結果より、以下のような配列上の特徴を検出した。
Ｎ型糖鎖付加部位（Ｎ［＾Ｐ］［ＳＴ］［＾Ｐ］） １８０：ＮＹＳＣ，１８８：ＮＩＳＲ
ＩＴＩＭモチーフ（Ｙｘｘ［ＶＬ］）２５９：ＹＡＮＶ
Ｉｇ様ドメイン ３３−８９，１２８−１８５
膜貫通ドメイン ２２１−２３７

〔実施例６〕 ２ＫＩＲ３ＤＬのクローニング
ＩＴＩＭ活性の検出アッセイ系はＴ細胞を受容細胞として用いたＮＦＡＴカスケード制御下のルシフェラーゼ活性を測定する方法を改変して実施した（Ｆｒｙ ＡＭ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ，Ｗｅｉｓｓ Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９９６），１８４，２９５−３００）。

ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを用いて既知のＫＩＲ遺伝子である２ＫＩＲ３ＤＬをクローニングした。以下の反応条件でＰＣＲを行った。
鋳型：Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｅｅｎ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
プライマー：ｐ５８ＫＩＲ０１（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧ−３’／配列番号：４０）⇔ｐ５８ＫＩＲ０２（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＧＧＡＡ−３’／配列番号：４１）
反応条件：９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分、３０サイクル
７２℃で５分

ＨＦ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動にて１ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。精製産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて形質転換株よりプラスミドを調製しＰＣＲエラーのない配列を有するクローン（ｐＴＯＰＯ５８ＫＩＲ３０３）を選択し更なる検討に用いた。

〔実施例７〕 インフレームフュージョンの構築
上記実施例６で得られた２ＫＩＲＤＬ３の細胞外ドメインとＮＫＩＲの細胞質内ＩＴＩＭモチーフとのインフレームフュージョンを以下の手順で構築した。

まず以下の反応条件でフュージョンＰＣＲを行った。
１回目ＰＣＲ Ａ
鋳型：ｐＴＯＰＯ５８ＫＩＲ３０３
プライマー：ｐ５８ＫＩＲ０１⇔ｐ５８ＮＫＩＲ０４（５’−ＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡ−３’／配列番号：４２）
１回目ＰＣＲ Ｂ
鋳型：ｐＢＳＮＫＩＲ２２４
プライマー：ｐ５８ＫＩＲ０３（５’−ＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴ−３’／配列番号：４３）⇔Ｔ３＋（５’−ＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣ−３’／配列番号：４４）
反応条件は共に下記記載の条件で行った。
９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で４５秒、３０サイクル
７２℃で２分

ＨＦ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動にてＰＣＲ Ａより０．８ｋｂ長の断片、ＰＣＲ Ｂより０．４ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。精製産物５０μｌの内それぞれ１０μｌを下記に示す２回目ＰＣＲの鋳型として用いた。
鋳型：上記反応産物各１０μｌ
反応条件は下記記載の条件で行った。
９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒、１５サイクル

反応後、反応液50μlに最終濃度1μMの下記に記すプライマーを添加した。
プライマー：p58KIR01 ⇔ T3+
反応条件：94℃で30秒
94℃で15 秒、55℃で30 秒、72で2 分、35サイクル
72℃で4 分

アガロースゲル電気泳動にて１．２ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて形質転換株よりプラスミドを調製しＰＣＲエラーのない配列を有するクローン（ｐＢＳＫＩＲ５８ＮＫＩＲ３１４）を選択し更なる検討に用いた。

次に１μｇのｐＣＸＮＤ３並びにｐＢＳＫＩＲ５８ＮＫＩＲ３１４を各々２０ｕｎｉｔｓのＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩにて３７℃、１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ生じた７．８ｋｂ及び１．２ｋｂの断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した後、４０μｌの溶出液の内それぞれ１μｌをＬｉｇａＦＡＳＴ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし、大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。生じたアンピシリン耐性株をピックアップしｐ５８ＫＩＲ０１そしてｐ５８ＮＫＩＲ１０プライマーを各々０．５μＭずつ用いてコロニーＰＣＲを行った。この際ＰＣＲポリメラーゼとしてＰｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、反応条件は９４℃で５分の変性の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒の反応を３５サイクル行った。生じた反応産物の１／５量をアガロースゲル電気泳動に供して１．３ｋｂ長のＰＣＲ断片が観察されたクローンｐＣＸＮＤ３ＫＩＲ５８ＮＫＩＲ３１３を以後の検討に用いた。

〔実施例８〕 安定形質導入株取得
上記実施例７で得られたｐＣＸＮＤ３ＫＩＲ５８ＮＫＩＲ３１３を供与ＤＮＡとして用いて、Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ株から安定形質導入株候補株であるＣｈｉｍｅｒａＡ１０株を取得した。取得手順を以下に記す。

ｐＣＸＮＤ３ＫＩＲ５８ＮＫＩＲ３１３を供与ＤＮＡ、Ｊｕｒｋａｔ株を受容細胞に用いてエレクトロポレーション法による形質導入を行った。２０μｇの供与ＤＮＡは予め２０ｕｎｉｔｓのＰｖｕＩＩ（Ｔａｋａｒａ）にて３７℃で１時間消化し、クロロホルムフェノール処理に続いてエタノール沈殿した後２０μｌの滅菌水に溶解した。受容細胞としては１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて継代したＪｕｒｋａｔ細胞をＰｏｔａｓｓｉｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（Ｋ−ＰＢＳ）にて洗浄後１０^７細胞／ｍｌ Ｋ−ＰＢＳの細胞懸濁液０．８ｍｌを調製した。エレクトロポレーションにはＧｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用しパルス条件は０．３ｋＶ、９５０μＦＤで行った。パルス負荷後４８ｍｌの継代培地に懸濁し選択圧のない条件で終夜培養した後、最終濃度４００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択圧をかけ、安定形質導入株候補株であるＣｈｉｍｅｒａＡ１０株を取得した。一次抗体としてＧＬ１８３モノクローナル抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及び二次抗体としてＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いる以外は、実施例３に記載された方法と同様の手順でフローサイトメトリー解析を行った。

その結果、ＦＩＴＣ染色された細胞画分が認められ、ＣｈｉｍｅｒａＡ１０株において上記融合タンパク質が発現していることが示された（図９）。

〔実施例９〕 二重形質導入株の作成
上記実施例８で得られたＣｈｉｍｅｒａＡ１０株を受容細胞にして、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＲ３２４を形質導入して、二重形質導入株を取得した。ｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＲ３２４は以下のようにして構築した。

Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に含まれるルシフェラーゼレポーター遺伝子ｐＮＦＡＴ−ＴＡ−Ｌｕｃ２．５μｇを２０ｕｎｉｔｓのＡｃｃＩ（Ｔａｋａｒａ）で、またｄａｍ−株であるＳＣＳ−１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）より調製した５μｇのｐＣＯＳＩＩＺＥＯを２０ｕｎｉｔｓのＣｌａＩ（Ｔａｋａｒａ）にて３７℃で１時間消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。それぞれ５ｋｂ、２．２ｋｂ長の消化断片をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ｐＮＦＡＴ−ＴＡ−Ｌｕｃ由来の断片はＣａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ処理を３７℃にて３０分行った後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。両断片をＬｉｇａＦＡＳＴ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製しＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ二重消化により制限チェックし、４．１５ｋｂ及び３．１５ｋｂ長の消化断片が観察されたクローンを正向き挿入クローンｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＦ３２４として、また５．１５ｋｂ及び２．１５ｋｂ長の消化断片が観察されたクローンを逆向き挿入クローンｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＲ３２４として以後の検討に用いた。

そのｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＲ３２４を供与ＤＮＡ、ｃｈｉｍｅｒａＡ１０株を受容細胞に用いて、エレクトロポレーション法による形質導入を行った。２０μｇの供与ＤＮＡは予め２０ｕｎｉｔｓのＰｖｕＩＩ（Ｔａｋａｒａ）にて３７℃で１時間消化した後、クロロホルムフェノール処理に続いてエタノール沈殿した後に２０μｌの滅菌水に溶解した。受容細胞としては１０％ＦＢＳ及び４００μｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて継代したｃｈｉｍｅｒａＡ１０細胞をＰｏｔａｓｓｉｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（Ｋ−ＰＢＳ）にて洗浄後１０^７細胞／ｍｌ Ｋ−ＰＢＳの細胞懸濁液０．８ｍｌを調製した。エレクトロポレーションにはＧｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、パルス条件は０．３ｋＶ、９５０μＦＤで行った。パルス負荷後４８ｍｌの４００μｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ含有継代培地に懸濁し選択圧のない条件で終夜培養後に、最終濃度１００μｇ／ｍｌのｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択圧をかけ、安定形質導入株候補株を取得した。得られたＺｅｏｃｉｎ耐性株よりゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製した。最終溶出液０．４ｍｌの内、５μｌを鋳型に用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲポリメラーゼとしてＰｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑ、プライマーにはＬｕｃ０１（５’−ＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧ−３’／配列番号：４５）とＬｕｃ０２（５’−ＣＧＴＴＣＧＣＧＧＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡ−３’／配列番号：４６）を用い、反応条件は９４℃で５分の変性の後、９４℃で１５秒，５５℃で３０秒，７２℃で４５秒の反応を２５サイクル行った後に、７２℃で５分の伸長反応を加えた。アガロースゲル電気泳動にて０．５ｋｂ長のＰＣＲ断片を生じるクローンを選択し、ルシフェラーゼ活性検出による最終スクリーニングを行った。

ルシフェラーゼアッセイはｃｈｉｍｅｒａＡ１０細胞株より得られたｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＲ３２４の安定形質導入候補株を６．７ｘ１０^４細胞／ｍｌの濃度で４００μｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ及び１００μｇ／ｍｌ ｚｅｏｃｉｎ含有継代培地に懸濁後、抗ヒトＣＤ３コーティングマイクロプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）そして通常のイムノマイクロプレート中に７５μｌ／ｗｅｌｌで播種し実施した。３７℃にて２０時間培養後、同量（７５μｌ）のＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し１０分静置した後に化学発光をルミノメーターＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）にて各ウエルあたり５秒間測定した。
抗ヒトＣＤ３コーティングマイクロプレート培養下でのみ強い化学発光を示す株ｃｈｉｍｅｒａＡ１０ＺＥＯＲ１２株を安定形質導入株として選択した。また本株に対して上記の方法と同一の手順でフローサイトメトリー解析を行った。

その結果、ＣｈｉｍｅｒａＡ１０株において発現していた融合タンパク質発現を保持していることを示した（図９）。

〔実施例１１〕ＮＫＩＲ由来のＩＴＩＭ活性測定
ｃｈｉｍｅｒａＡ１０ＺＥＯＲ１２株を用いてＮＫＩＲ由来のＩＴＩＭモチーフの機能評価を行った。方法を以下に示す。

ｃｈｉｍｅｒａＡ１０ＺＥＯＲ１２株を４００μｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ及び１００μｇ／ｍｌ ｚｅｏｃｉｎ含有継代培地に５ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、抗ヒトＣＤ３コーティングマイクロプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に各ウエルあたり１００μｌずつ播種した。３７℃にて６時間培養後、終濃度１μｇ／ｍｌのＧＬ１８３抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し３７℃にて終夜培養を行った。次に４００μｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ及び１００μｇ／ｍｌ ｚｅｏｃｉｎ含有継代培地にて２回洗浄後、ラット由来抗マウスＩｇＧ抗体をそれぞれ０、２、１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する培地１００μｌに洗浄細胞を懸濁後実施例１０に記載の方法と同様の手順にてルシフェラーゼ活性を測定した。

その結果、ラット由来抗マウスＩｇＧ抗体でクロスリンクすることによりルシフェラーゼ活性を３例の平均で３３．３％阻害することが示され（図１０）、ＮＫＩＲ分子の細胞質内ドメインに見出されるＩＴＩＭモチーフがＩＴＩＭ活性を有することが示された。

〔実施例１２〕 ＣＤ８α鎖のクローニング
ＩＴＩＭ活性の機能アッセイ系は実施例６と同様、Ｔ細胞を受容細胞として用いたＮＦＡＴカスケード制御下のルシフェラーゼ活性を測定する方法を改変して実施した（Ｆｒｙ ＡＭ，Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ，Ｗｅｉｓｓ Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９９６），１８４，２９５−３００）。

ｒｅｓｔｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型にして既知のＣＤ８α鎖遺伝子をクローニングした。以下の反応条件でＰＣＲを行った。
プライマー：ＣＤ０１（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣ−３’／配列番号：４７）⇔ＣＤ０２（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＴＡＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＡ−３’／配列番号：４８）
反応条件：９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒、３０サイクル
７２℃で４分

ＧＣ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いてＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動にて０．７ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。精製産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて形質転換株よりプラスミドを調製しＰＣＲエラーのない配列を有するクローン（ｐＣＤ８ｆｕｌｌ０１１３）を選択し更なる検討に用いた。

〔実施例１３〕 ＣＤ８−ＮＫＩＲフュージョンタンパク質発現ベクターの構築
上記実施例１２で得られたＣＤ８α鎖の細胞外ドメインとＮＫＩＲの細胞質内ＩＴＩＭモチーフとのフュージョンタンパク質発現ベクターを以下の手順で構築した。

まず以下の反応条件でフュージョンＰＣＲを行った。
１回目ＰＣＲ Ａ
鋳型：ｐＣＤ８ｆｕｌｌ０１１３
プライマー：ＣＤ０３（５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣ−３’／配列番号：４９）⇔ＣＤＮＫＩＲ１２（５’−ＡＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡ−３’／配列番号：５０）
１回目ＰＣＲ Ｂ
鋳型：ｐＢＳＮＫＩＲ２２４
プライマー：ＣＤＮＫＩＲ１１（５’−ＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴ−３’）／配列番号：５１）⇔Ｔ３＋（配列番号：４４）
反応条件は共に下記記載の条件で行った。
９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分、３０サイクル
７２℃で４分

ＧＣ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いてＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動にてＰＣＲ Ａより０．５ｋｂ長の断片、ＰＣＲ Ｂより０．６ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。精製産物５０μｌの内それぞれ１０μｌを下記に示す２回目ＰＣＲの鋳型として用いた。
鋳型：上記ＰＣＲ Ａ及びＰＣＲ Ｂ反応産物各１０μｌ
反応条件は下記記載の条件で行った。
９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒、１５サイクル

反応後、反応液５０μｌに最終濃度１μＭの下記に記すプライマーを添加した。
プライマー：ＣＤ０３⇔Ｔ３＋
反応条件：９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２で３０秒、３５サイクル
７２℃で４分

アガロースゲル電気泳動にて１．１ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて形質転換株よりプラスミドを調製しＰＣＲエラーのない配列を有するクローン（ｐＴＯＰＯＣＤ８ＮＫＩＲｆｕｌｌ）を選択し更なる検討に用いた。

次に１μｇのｐＣＸＮＤ３並びにｐＴＯＰＯＣＤ８ＮＫＩＲｆｕｌｌを各々２０ｕｎｉｔｓのＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩにて３７℃、１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ生じた７．８ｋｂ及び１．１ｋｂの断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した後、４０μｌの溶出液の内それぞれ１μｌをＬｉｇａＦＡＳＴ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし、大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。生じたアンピシリン耐性株をピックアップし正しい１．１ｋｂ長の挿入が観察されたクローンｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＮＫＩＲｆｕｌｌを以後の検討に用いた。

〔実施例１４〕 ＣＤ８−ＫＩＲフュージョンタンパク質発現ベクターの構築
上記実施例１２で得られたＣＤ８α鎖の細胞外ドメインとＫＩＲの細胞質内ＩＴＩＭモチーフとのフュージョンタンパク質発現ベクターを以下の手順で構築した。本コンストラクトはＩＴＩＭ機能アッセイのポジティブコントロールとして用いられる。

まず以下の反応条件でフュージョンＰＣＲを行った。
１回目ＰＣＲ Ａ
鋳型：ｐＣＤ８ｆｕｌｌ０１１３
プライマー：ＣＤ０３（配列番号：４９）⇔ＣＤＫＩＲ１２（５’−ＡＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡ−３’）／配列番号：５２）
１回目ＰＣＲ Ｂ
鋳型：ｐＢＳＫＩＲ３０６
プライマー：ＣＤＫＩＲ１１（５’−ＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＴ−３’）／配列番号：５３）⇔Ｔ３＋（配列番号：４４）
反応条件は共に下記記載の条件で行った。
９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分、３０サイクル
７２℃で４分

ＧＣ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いてＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動にてＰＣＲ Ａより０．５ｋｂ長の断片、ＰＣＲ Ｂより０．４ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。精製産物５０μｌの内それぞれ１０μｌを下記に示す２回目ＰＣＲの鋳型として用いた。
鋳型：上記ＰＣＲ Ａ及びＰＣＲ Ｂ反応産物各１０μｌ
反応条件は下記記載の条件で行った。
９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒、１５サイクル

反応後、反応液５０μｌに最終濃度１μＭの下記に記すプライマーを添加した。
プライマー：ＣＤ０３⇔Ｔ３＋
反応条件：９４℃で３０秒
９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、３５サイクル
７２℃で４分

アガロースゲル電気泳動にて０．９ｋｂ長の断片を分離後ＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）キットを用いて形質転換株よりプラスミドを調製しＰＣＲエラーのない配列を有するクローンの０．９ｋｂ長のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ挿入断片をｐＣＸＮＤ３のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩに挿入しｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＫＩＲｆｕｌｌを得て以後の検討に用いた。

〔実施例１５〕 ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター安定発現細胞株の樹立
実施例９で得られたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポータープラスミドであるｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＦ３２４を供与ＤＮＡに、そしてＪｕｒｋａｔ株を受容細胞に用いてエレクトロポレーション法による形質導入を行った。２０μｇの供与ＤＮＡは予め２０ｕｎｉｔｓのＰｖｕＩＩ（Ｔａｋａｒａ）にて３７℃で１時間消化した後、クロロホルムフェノール処理に続いてエタノール沈殿した後に２０μｌの滅菌水に溶解した。受容細胞としては１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて継代したＪｕｒｋａｔ細胞をＰｏｔａｓｓｉｕｍ−Ｂａｓｅｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（Ｋ−ＰＢＳ）にて洗浄後１０^７細胞／ｍｌ Ｋ−ＰＢＳの細胞懸濁液０．８ｍｌを調製した。エレクトロポレーションにはＧｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、パルス条件は０．３ｋＶ、９５０μＦＤで行った。パルス負荷後４８ｍｌの継代培地に懸濁し選択圧のない条件で終夜培養後に、最終濃度１００μｇ／ｍｌのｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択圧をかけ、安定形質導入株候補株を取得した。得られたＺｅｏｃｉｎ耐性株よりゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製した。最終溶出液０．４ｍｌの内、５μｌを鋳型に用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲポリメラーゼとしてＰｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑ、プライマーにはＬｕｃ０１（５’−ＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧ−３’／配列番号：４５）とＬｕｃ０２（５’−ＣＧＴＴＣＧＣＧＧＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡ−３’／配列番号：４６）を用い、反応条件は９４℃で５分の変性の後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で４５秒の反応を２５サイクル行った後に、７２℃で５分の伸長反応を加えた。アガロースゲル電気泳動にて０．５ｋｂ長のＰＣＲ断片を生じるクローンを選択し、ルシフェラーゼ活性検出による最終スクリーニングを行った。

ルシフェラーゼアッセイはＪｕｒｋａｔ細胞株より得られたｐＮＦＡＴｌｕｃＺＥＯＦ３２４の安定形質導入候補株を６．７ｘ１０^４細胞／ｍｌの濃度で１００μｇ／ｍｌ ｚｅｏｃｉｎ含有継代培地に懸濁後、抗ヒトＣＤ３コーティングマイクロプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）そして通常のイムノマイクロプレート中に７５μｌ／ｗｅｌｌで播種し実施した。３７℃にて２０時間培養後、同量（７５μｌ）のＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し１０分静置した後に化学発光をルミノメーターＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）にて各ウエルあたり５秒間測定した。
抗ヒトＣＤ３コーティングマイクロプレート培養下でのみ強い化学発光を示すＦ１１株を安定形質導入株として選択した。

〔実施例１６〕 二重形質導入株の作成
上記実施例１５で得られたＦ１１株を受容細胞にして、上記実施例１３で得られたＣＤ８−ＮＫＩＲフュージョン、ｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＮＫＩＲｆｕｌｌ及び上記実施例１４で得られたＣＤ８−ＫＩＲフュージョン、ｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＫＩＲｆｕｌｌを形質導入して、二重形質導入株を取得した。

ｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＮＫＩＲｆｕｌｌそしてｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＫＩＲｆｕｌｌ各２０μｇを２０ｕｎｉｔｓのＰｖｕＩ（宝酒造）を用いて３７℃にて２時間消化したものを等量のフェノールクロロホルム（５０％（ｖ／ｖ）、ナカライテスク）にて精製し１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ナカライテスク）と２倍量のＥｔｈａｎｏｌ（ナカライテスク）を用いて沈殿後、風乾したサンプルを２０μｌの滅菌水に溶解したものを使用した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ及びそれに続く樹立の際の手順は継代培地としては１００μｇ／ｍｌ濃度のｚｅｏｃｉｎと１０％（ｖ／ｖ）非働化した仔牛血清及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を使用し、選択薬剤としてｇｅｎｅｔｉｃｉｎ７００μｇ／ｍｌ濃度で実施した以外は実施例９と同一の条件で実施した。得られた単コロニー由来の薬剤耐性クローンを抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＦＡＣＳ解析を行うことにより発現クローンを各々６〜８クローン選択した。

これら形質導入株について実施例１５に記載されたレポーター活性測定により、レポーター活性を保持したＣＤ８キメラクローンを最終的に３クローン（ｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＮＫＩＲｆｕｌｌの形質導入株としてＮＫＩＲ＃１６及びＮＫＩＲ＃１９、ｐＣＸＮＤ３ＣＤ８ＫＩＲｆｕｌｌの形質導入株としてＫＩＲ＃２４）を選択した。これら３クローンのＣＤ８キメラの構造を図１１−１に示す。図１１−２には実施例１７で使用する抗ＣＤ８抗体、ＬＴ８（Ｓｅｒｏｔｅｃ）とヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたこれらクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。ＣＤ８キメラクローンは３株ともＬＴ８特異的な染色が観察された。

〔実施例１７〕ＮＫＩＲ由来のＩＴＩＭ活性測定
実施例１６で得られた二重形質導入株ＮＫＩＲ＃１６、ＮＫＩＲ＃１９及びＫＩＲ＃２４とその宿主であるＦ１１株を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを実施しＮＫＩＲ由来のＩＴＩＭ活性測定を行った。

宿主Ｆ１１株を継代培地（１００μｇ／ｍｌ濃度のｚｅｏｃｉｎと１０％（ｖ／ｖ）非働化した仔牛血清及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液を含有するＲＰＭＩ１６４０培地）にて生育させた。ＣＤ８キメラクローンは７００μｇ／ｍｌ濃度のｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含有する上記培地で生育させた。それぞれの増殖培地にて５．３３ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁後、３７．５μｌずつをＦｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し３７℃にて１６時間培養した。一次抗体として６μｇ／ｍｌにそれぞれの増殖培地にて希釈した抗ＣＤ８抗体（ＬＴ８，Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＭＣＡ１２２６ＸＺ）を１２．５μｌ（終濃度１．５μｇ／ｍｌ）ずつ添加した。対照群には抗体を含まない各増殖培地を加えた。３７℃にて１時間培養後、クロスリンカーとして６μｇ／ｍｌにそれぞれの増殖培地にて希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｈ１４３．２２５．８，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１１４５−０１）を１２．５μｌ（終濃度１．２μｇ／ｍｌ）ずつ添加した。対照群には抗体を含まない各増殖培地を加えた。３７℃にて１時間培養後、２４０μｇ／ｍｌに各増殖培地にて希釈したＣｏｎＡ（ＳＩＧＭＡ）を１２．５μｌ（終濃度４０μｇ／ｍｌ）ずつ添加した。３７℃にて８時間及び１０時間培養後、等量（７５μｌ）のｌｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え室温にて１０分静置した後発光を実施例１５で記載されたように測定した。

レポーターアッセイの結果を図１２に示す。アッセイは全て三連にて実施し平均値を棒グラフ表示で示し、ＳＤ値をエラーバーとして記載した。ＣｏｎＡ刺激後８時間と１０時間との比較においては１０時間時点での結果がより効果の高い結果を示していたが、概ね同傾向を示していたことから、下記では１０時間後の結果について詳細に記述する。宿主のＦ１１については、ＬＴ８抗体或いはクロスリンカーの存在下、非存在下に関わらずほぼ一定の活性値を示した。これに対しポジティブコントロールクローンであるＣＤ８−ＫＩＲｆｕｌｌ形質導入ＣＤ８キメラクローンＫＩＲ＃２４の活性についてはＬＴ８存在下では活性の減弱化が観察され、本活性減弱化はクロスリンカーの影響は受けないといった想定されたパターンを示した。一方、ＣＤ８−ＮＫＩＲｆｕｌｌ形質導入ＣＤ８キメラクローンは２クローンともＬＴ８存在下では活性の減弱化が観察され、本活性減弱化はクロスリンカーの影響は受けなかった。また、減弱化の程度はポジティブコントロールであるＣＤ−ＫＩＲ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ＃２４が１６．６％なのに対してＣＤ−ＮＫＩＲ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ＃１６、＃１９はそれぞれ２１．２％、３０．２％であったことから、ＮＫＩＲ分子の細胞質内ＩＴＩＭモチーフを含む配列が既知のＫＩＲ２ＤＬ３分子の細胞質内ＩＴＩＭと同程度以上のＩＴＩＭ活性を有することが示唆された。

本発明により、ＮＫ細胞に発現する新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該タンパク質の製造方法が提供された。さらに、該タンパク質に結合する、あるいはその活性を調節する化合物を同定する方法が提供された。本発明のタンパク質やＤＮＡ、または本発明のタンパク質に結合もしくはその活性を調節する化合物は、本発明のタンパク質が関連する疾患の新しい予防薬や治療薬の開発への利用が期待される。

Claims (6)

1. 下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
   （ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
   （ｂ）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
   （ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１ないし１０のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ITIM活性を有し、分泌型として機能するタンパク質をコードするDNA
2. 請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
3. 請求項１に記載のDNAを含むベクター。
4. 請求項１に記載のDNA、または請求項３に記載のベクターを保持する宿主細胞。
5. 請求項４に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項２に記載のタンパク質の製造方法。
6. 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項２に記載のタンパク質に対するリガンドの同定方法。
   （ａ）請求項２に記載のタンパク質または請求項２に記載のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させる工程
   （ｂ）候補化合物が請求項２に記載のタンパク質または請求項２に記載のタンパク質を発現している細胞に結合するか否かを検出する工程

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