WO2005030955A1 - Nk細胞に発現するタンパク質 - Google Patents

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Kouji Matsushima
Shinichi Hashimoto
Masayuki Tsuchiya
Yuichi Hirata
Kenji Yoshida
Kazuyuki Ojima
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a novel protein expressed in NK cells, DNA encoding the protein, and a method for producing the molecule and use thereof.
  • Cytotoxic T cells recognize and activate MHC (Major Histocompatibility Complex) class I molecules complexed with specific antigenic peptides, which are foreign substances, and are activated against target cells.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • NK natural killer cells often damage target cells that do not express MHC class I molecules. Expression of such MHC class I molecules is suppressed on the normal cell surface due to viral infection and canceration. NK cells exert a damaging activity against abnormal cells with reduced expression of MHC class I molecules, and play a central role in the elimination of virally infected and cancerated cells as innate immunity. It is considered.
  • NK cells have been found as cells having an activity of spontaneously damaging certain cancer cells (see Non-Patent Document 1). Also
  • Chediak-Higashi syndrome because of chromosomal abnormalities, it is said that the virus infection becomes uncontrollable by the age of 10 years old, resulting in malignant lymphoma-like lesions. Since NK cell activity is caused by a disease that dies due to illness, this role of NK cells in vivo is supported.
  • NK1.1 + CD3- which is a marker for NK cells
  • NKT cells which are the fourth lymphocytes that have both the natural immunity and acquired immunity, have the same T cell receptor and also retain the NK cell receptor at the same time. It is distributed in an extremely wide range of organs, especially the medulla, and the parenthesis cells are immune tolerant and autoimmune. The knowledge that it is involved in many diseases such as illness, hepatitis and infectious diseases has been revealed. Studies on mice that develop multiple sclerosis early showed that NKT cell power of immune cells contained in lymphocytes has some relationship to the onset of multiple sclerosis (see Non-Patent Document 3).
  • NKT-deficient mouse which is a major asthma symptom, showed the potential to prevent asthma by inactivating NKT cells (non-patent literature). 4).
  • NKT cells unlike NK cells, are stimulated by T cell receptors, or are activated by alpha-galatatosyl ceramide (a-G Cer), a glycolipid presented on CDld receptors on cells. The activation mechanism has been clarified (see Non-Patent Document 3).
  • a-G Cer alpha-galatatosyl ceramide
  • MHC class I molecules alpha-galatatosyl ceramide
  • KIR Killer Cell Inhibitory Receptor
  • a ligand substance effective for the activity of NKT cells has become apparent.
  • a small molecule ligand that specifically activates NK cells has not been identified.
  • Non-Patent Document 1 Trinchieri G., Adv Immunol. (1989), 47, 187-376
  • Non-Special Reference 2 Sungjin Kim, Koho nzuka, Hector L. Aguna, Irving L. Weissman, and Wayne M. Yokoyama, Proc. Natl. Acad. Sci. (2000), 97, 2731—2736
  • Non-Patent Document 3 Tsunari Harada ⁇ Katsuro Tani, Protein Nucleic Acid Enzyme (2002), 47, 2109-2116
  • Non-Patent Document 4 Akbari 0, Stock P, Meyer E, Kronenberg M, Sidobre S, Nakayama T, Taniguchi M , Grusby MJ, DeKruyff RH, Umetsu DT, Nat. Med. (2003), 9, 582-588 Disclosure of the Invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to isolate a receptor molecule that specifically activates or inactivates NK cells. More specifically, a novel receptor protein expressed in NK cells, DNA encoding the protein, and Another object is to provide a use of the molecule.
  • NK cells The activation mechanism of NK cells is based on the regulation of the positive signal cascade via phosphate tyrosine by protein tyrosine kinase and the negative signal cascade by dephosphorylation of signal transduction molecules subjected to phosphate tyrosine. It is suggested that it is done.
  • the inhibitory receptor of NK cells that recognizes molecules that drive this negative cascade corresponds to the KIR molecule family that has an immunoglobulin (Immuoglobulin, Ig) domain extracellularly in mice and extracellularly in mice. Details of the KIR molecule, including the MHC arotype it recognizes, are becoming clear.
  • KIR molecules have a polymorphism and are expressed in most cells. Recognizes molecules and transmits negative signals into cells.
  • some KIR molecules have a non-classical MHC class I molecule as a ligand, and the entire KIR molecule plays a central role in monitoring the self-derived abnormal cells in the innate immune system. It has been.
  • the cytoplasmic domain is called ITIM V / I XYXX L / V (V;
  • I Isoleucine
  • Y Tyrosine
  • L Leucine
  • X is any amino acid
  • SHP-1 which is a protein tyrosine dephosphorylating enzyme having an SH2 domain at this site, binds.
  • SHP-1 dephosphorylates the tyrosine phosphate protein (SLP-76 molecule is considered to be a promising candidate) essential for the activity of the positive signal cascade in NK cells. Inhibits NK cell activity.
  • NKIR Natural killer
  • NK cells due to the characteristics of the predicted amino acid sequence, this gene is expressed in NK cells and some T cells, and homologous to the Killer Cell Inhibitory Receptor (KIR), which has been identified as an inhibitory regulatory molecule in the cytotoxic activity of lymphocyte populations. It was suggested that it was a mouthful.
  • KIR Killer Cell Inhibitory Receptor
  • This NKIR gene is mapped to the first chromosome, whereas many KIR molecules are clustered on chromosome 19.
  • the present inventors conducted a feature analysis of this gene in order to pursue the possibility of application to drug discovery.
  • NK cells have antitumor and antiviral activities as described above, clinical applications include antitumor effects by inhibiting KIR function using an anti-agost antibody against KIR, and antiviral activity. The effect is considered.
  • antiviral diseases such as anti-hepatitis C using antiagost antibody are anti-cancer, anti-allergic diseases using anti-anti-hepatitis, anti-asthma, Potential for use in anti-autoimmune diseases is expected.
  • the present invention relates to a novel protein expressed in NK cells, DNA encoding the protein, and production methods and uses thereof, more specifically,
  • a tamper comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein having the amino acid sequence ability described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, or 6
  • An immunosuppressant comprising an antigen against the protein according to [3] (or the antigen according to [12]) as an active ingredient,
  • a therapeutic agent for an allergic disease or autoimmune disease comprising as an active ingredient an antigen to the protein according to [3] (or the agonist according to [12]),
  • An immunopotentiator comprising, as an active ingredient, an antagonist to the protein according to [3] (or the agonist according to [13]),
  • an antitumor or antiviral agent comprising an antagonist to the protein according to [3] (or the agonist according to [13]) as an active ingredient
  • the present invention relates to the following method.
  • a method of suppressing immune function comprising a step of administering an agonist to the protein of the present invention to a subject (patient or the like).
  • a method for treating an allergic disease or autoimmune disease comprising a step of administering an agonist to the protein of the present invention to a subject (patient or the like).
  • a method for enhancing immune function comprising a step of administering an antagonist to the protein of the present invention to a subject (patient or the like).
  • a method for treating (or preventing) cancer (tumor) or viral disease which comprises the step of administering an antagonist to the protein of the present invention to a subject (patient or the like).
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of SDS-PAGE electrophoresis analysis of NKIR fusion protein purified using a His trap column.
  • FIG. 2 is a photograph showing detection of NKIR protein by anti-NKIR polyclonal antibody.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of tissue expression analysis by RT-PCR.
  • A shows MTC panels I and II, and B shows Immune System and Blood Fraction.
  • Each lane is shown below.
  • FIG. 4 is a photograph showing detection of natural NKIR protein expressed by the NK-92 cell line using an anti-NKIR polyclonal antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing a flow cytometric analysis of an NK-92 cell line using an anti-NKIR polyclonal antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing a flow cytometric analysis for transient expression of NKIR gene in COS-7 strain.
  • FIG. 7 is a diagram showing alignment with a matching mouse chromosome sequence obtained by performing a blast search using human NKIR as a query.
  • FIG. 8 is a diagram showing alignment of human-mouse NKIR sequences.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of flow cytometry analysis of each transformed strain.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of ITIM activity using luciferase activity as an index.
  • FIG. 11-1 is a diagram showing the CD8 chimera structure of 3 clones selected in Example 16.
  • Fig. 11-2 shows the FACS analysis of these clones using anti-CD8 antibody, LT8 (Serotec) and goat anti-mouse IgG-FITC conjugated antibody (Coulter) used in Example 17. It is a figure which shows a result.
  • D CD8 chimeric clone (primary antibody) Yes
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of measuring ITIM functional activity by reporter assembly in Example 17.
  • LT8 anti-CD8 antibody (LT8)
  • CL crosslinker (rat anti-mouse IgGl antibody) BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present inventors cloned a gene specifically expressed in NK cells using PCR from a human spleen cDNA library. The resulting clone appears to be a splice noriant.
  • 5 'RACE was performed to identify the NKIR gene presumed to be the KIR member.
  • the base sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • NKIR gene when the full length cloning of the NKIR gene was performed again by 5 'and 3'RACE methods using total RNA prepared from the NK-92 strain, it had a 36-base signal-like sequence at the 5' end, A clone having a sequence extended by about 500 bases on the 3 ′ end side was obtained.
  • the base sequence of the clone is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the mouse NKIR sequence was cloned, and the obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the present invention provides a novel protein expressed in NK cells, and a DNA encoding the protein.
  • a preferred embodiment of the DNA of the present invention is the DNA described in any one of the following (a) to (d).
  • DNA having a base sequence ability described in any one of SEQ ID NO: 1, 3, or 5 and DNA that can be hybridized under stringent conditions (more preferably, SEQ ID NO: 1, 3, or 5)
  • the present invention relates to an NK cell expression protein identified by the present inventors (a protein having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 2, 4 or 6) (hereinafter referred to as "NKIR protein").
  • NKIR protein a protein having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 2, 4 or 6
  • a functionally equivalent protein Such proteins include, for example, mutants of these proteins, homologs of organisms other than humans and mice, and the like.
  • “functionally equivalent” means having the same biological or biochemical activity as the target protein NKIR protein.
  • activities include, for example, the activity of KIR, the inhibitory activity against the cytotoxic activity of NK cells, or the activation of cells, such as T cells or mast cells that are mediated by similar intracellular signal transduction.
  • a protein functionally equivalent to the protein can be prepared by appropriately introducing mutations into the sequence. Amino acid mutations can also occur in nature. Thus, regardless of whether it is artificial or naturally occurring, the amino acid sequence of the NKIR protein identified by the present inventors has an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated, and the function of the protein. Are also included in the proteins of the present invention. In such mutants, the number of amino acids to be mutated is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids).
  • the site for introducing a mutation is not particularly limited, but is preferably a site other than the motif or domain described below.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), amino acids having lunar aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms
  • Amino acids with side chains C, M
  • amino acids with side chains containing carboxylic acids and amides D, N, E, Q
  • amino groups with side chains containing bases R, K, ⁇
  • aromatic Examples include amino acids having a side chain (H, F, Y, W) (in parentheses all represent a single letter of amino acid).
  • Proteins in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of the NKIR protein include fusion proteins containing these proteins.
  • a fusion protein is a fusion of these proteins and other peptides or proteins, and is included in the present invention.
  • the method for preparing the fusion protein is to match the DNA encoding the NKIR protein (the protein having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 2, 4, or 6) with the DNA encoding another peptide or protein. Any method known to those skilled in the art can be used as long as they are linked and introduced into an expression vector and expressed in a host. Other peptides or proteins that are subjected to fusion with the protein of the present invention are not particularly limited.
  • peptides to be subjected to fusion with the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and six His (histidine) residues. 6 X His, 10 X His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen Known peptides such as fragments, lck tag, a-tubulin fragments, B-tag, and protein C fragments can be used.
  • FLAG Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • six His histidine residues. 6 X His, 10 X His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV
  • Another method well known to those skilled in the art for preparing a protein functionally equivalent to a certain protein is a hybridization technique (SambrookJ et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47— 9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). That is, a person skilled in the art can obtain homology from a DNA sample derived from the same or different species based on a DNA sequence encoding NKIR protein (SEQ ID NO: 1, 3, or 5) or a part thereof. It is usually possible to isolate high DNA and isolate a protein functionally equivalent to the DNA strength NKIR protein.
  • the present invention includes proteins that are functionally equivalent to NKIR proteins encoded by DNA that hybridizes with DNA encoding NKIR proteins.
  • proteins include human or mouse and other mammalian homologs (for example, proteins encoded by rats, rabbits, rabbits, monkeys, etc.).
  • Hybridization conditions for isolating a DNA encoding a protein functionally equivalent to the NKIR protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • conditions for high pre-dialysis include low stringency conditions. The low stringent conditions are, for example, 42 ° C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS in washing after hybridization, and preferably 50 ° C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS.
  • hybridization conditions include highly stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, the conditions of 65 ° C, 5 X SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher homology will be obtained more efficiently as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art will realize the same stringency by appropriately selecting these factors. It is possible.
  • PCR gene amplification technology
  • Primers are designed based on a part of the DNA sequence (SEQ ID NO: 1, 3, or 5) encoding the protein identified by the inventors, and the protein identified by the inventors is encoded. It is also possible to isolate a DNA fragment having high homology with the DNA sequence and obtain a protein functionally equivalent to the protein identified by the present inventors based on the DNA.
  • the protein of the invention may be in the form of a "mature" protein or may be part of a larger protein, such as a fusion protein.
  • the protein of the present invention may include a leader sequence, a pro sequence, a sequence useful for purification, such as multiple histidine residues, or an additional sequence that ensures stability during recombinant production. .
  • Proteins functionally equivalent to NKIR proteins encoded by DNA isolated by these hybridization techniques and gene amplification techniques are usually described in these proteins (SEQ ID NOs: 2, 4, or 6). And a high homology in the amino acid sequence.
  • the protein of the present invention includes a protein that is functionally equivalent to the NKIR protein and has high homology with the amino acid sequence of the protein. .
  • High homology is usually at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level. Point to. To determine protein homology, the algorithm described in the literature (Wilbur, WJ and Lipman, DJ Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730) may be used.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or a natural protein by methods known to those skilled in the art.
  • a DNA encoding the protein of the present invention for example, a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, or 5
  • a transformant obtained by introduction into a host cell is recovered and an extract is obtained, followed by chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or the like. It can be purified and prepared by subjecting to a tea chromatography or by combining a plurality of these columns.
  • the protein of the present invention when expressed in a host cell (eg, animal cell or E. coli) as a fusion protein with dartathione S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added.
  • the set that was expressed The replacement protein can be purified using a dartathione column or a nickel column. After purification of the fusion protein, the region other than the target protein of the fusion protein can be cleaved with thrombin or factor Xa as necessary.
  • the present invention also provides a fragment (partial peptide) of the protein of the present invention.
  • a fragment is a protein having an amino acid sequence that is not entirely the same as the entire force that is identical to a part of the amino acid sequence of the protein of the present invention.
  • the protein fragment of the present invention is usually a protein fragment that also has a sequence capacity of 8 amino acid residues or more, preferably 12 amino acid residues or more (for example, 15 amino acid residues or more). Suitable fragments include, for example, deletion of a series of residues including the amino terminus or a series of residues including the carboxyl terminus, or a series of residues including the amino terminus and a series of residues including the carboxyl terminus.
  • truncation polypeptides having amino acid sequences lacking duplicate residues.
  • fragments characterized by structural or functional properties such as fragments comprising sex regions, variable regions, surface-forming regions, substrate binding regions, and high antigenic index regions.
  • Other suitable fragments are biologically active fragments.
  • Biologically active fragments mediate the activity of the protein of the invention, including fragments with similar activity, fragments with enhanced activity, or fragments with reduced undesirable activity.
  • a fragment having an activity of binding a ligand and performing signal transduction into a cell can be mentioned.
  • Variants of the identified sequences and fragments also form part of the present invention. Preferred variants differ from the target by conservative amino acid substitution That is, one residue is replaced with another residue of similar nature. Typical such substitutions are between Ala, Val, Leu and lie, between Ser and Thr, between acidic residues Asp and Glu, between Asn and Gin, between basic residues Lys and Arg, or aromatic. Occurs between family residues Phe and Tyr
  • the protein fragment of the present invention is not particularly limited, but is preferably a fragment containing at least the motif or domain described below.
  • the above fragment is used, for example, for the production of an antibody against the protein of the present invention, the screening of a compound that becomes a ligand that binds to the protein of the present invention, and the screening of the antigen or antagonist of the protein of the present invention. Can be used.
  • the protein fragment (partial peptide) of the present invention can be produced by genetic engineering techniques, known peptide synthesis methods, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the protein fragment (partial peptide) may be synthesized by, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the "ligand” in the present invention means a molecule that binds to the protein of the present invention.
  • Ligands include natural and synthetic ligands.
  • Ant means a molecule that binds to and activates a protein of the invention.
  • antagost means a molecule that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is used for the in vivo and in vitro production of the protein of the present invention as described above, for example, due to abnormality of the gene encoding the protein of the present invention.
  • gene therapy for diseases that can be treated with the protein of the present invention, or gene diagnosis, and gene diagnosis can be considered.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is a cDNA synthesized from mRNA, a force that is genomic DNA, or a chemically synthesized DNA.
  • DNA having any base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing and expressing the protein of the present invention, and a portion of the DNA sequence of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1, 3, or 5) is used as a probe for hybridization. Seesho Can be prepared.
  • the cDNA library can be prepared by, for example, a method described in the literature (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold bpnng Haroor Laboratory Press (1989)) or using a commercially available DNA library. Also good.
  • RNA is prepared from cells expressing the protein of the present invention, cDNA is synthesized by reverse transcriptase, and then oligo DNA based on the DNA sequence of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1, 3, or 5) is synthesized. This is used as a primer, and a PCR reaction is performed to amplify the cDNA encoding the protein of the present invention.
  • the translation region encoded by the cDNA can be determined, and the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained.
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, or organs that express the protein of the present invention (for example, NK cells or tissues in which expression is observed in Examples described later). Isolation of mRNA can be performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method.
  • mRNA can be prepared directly using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis can also be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku). In addition, using the primers and the like described in this specification, the 5′-1Ampli FINDER RACE Kit (manufactured by Clontech) and the polymerase chain reaction (PCR) 5′-13 ⁇ 4 ⁇ 5 method 1 ” [0111] 11 & MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.
  • cDNA can be synthesized and amplified, and the desired DNA fragment is prepared from the resulting PCR product and ligated with vector DNA, and then a recombinant vector is prepared from this and introduced into E. coli and other colonies. Select the desired recombinant vector Prepare one.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a base sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al, Nucelic Acids Research ( 1981) 9, r43-74).
  • the DNA of the present invention can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and Z or stop codon (TAA, TGA, or TAG). It is done.
  • the DNA of the present invention is also a DNA that can be hybridized with the DNA having each nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 and that is functionally equivalent to the protein of the present invention.
  • the conditions in the hybridization can be appropriately selected by those skilled in the art, but specifically, the conditions described above can be used. Under these conditions, DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased.
  • the hybridizing DNA is preferably naturally derived DNA, such as cDNA or genomic DNA.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention is inserted.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or for expressing the protein of the present invention.
  • a vector of the present invention for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is prepared in large quantities by large-scale amplification with E. coli (for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue) and the like.
  • E. coli for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue
  • a drug resistance gene that has an “ori” to be amplified in E. coli, and that can be distinguished by any transformed E. coli genes (eg, ampicillin, tetracycline, kanamycin, kuram lamfecole) ) Is not particularly limited.
  • Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • an expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the protein of the present invention.
  • an expression vector for example, for the purpose of expression in E. coli
  • the host is E. coli such as JM109, DH5a, HB101, XLl-Blue, etc., it can be expressed efficiently in E. coli.
  • Promoters such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), the araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), Or having a T7 promoter is essential.
  • PGEX-5X-1 manufactured by Pharmacia
  • QIAexpress system Qiagen
  • pEGFP pEGFP
  • pET in this case, the host expresses T7 RNA polymerase.
  • BL21 is preferred,;) etc.
  • the vector also contains a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for protein secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out using, for example, the salt calcium method or the electroversion method.
  • vectors for producing the protein of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), P BacPAK8), plant-derived expression vectors (Eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia
  • Expression Kit J manufactured by Invitrogen
  • pNVll pNVll
  • SP-Q01 an expression vector derived from Bacillus subtilis
  • an expression vector derived from Bacillus subtilis eg, pPL608, pKTH50
  • promoters required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. are essential to select cells for transformation.
  • SV40 promoter Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108
  • MMLV-LTR promoter EF1 ⁇ promoter
  • EF1 ⁇ promoter EF1 ⁇ promoter
  • CMV promoter etc.
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell
  • the DHFR gene that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used.
  • MTX methotrexate
  • COS cells having a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome can be used to transform with a vector having SV40 replication origin (such as pcD).
  • a replication origin such as a poliovirus, adenovirus, or ushipapilloma virus (BPV) can also be used.
  • the expression vector is used as a selectable marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydro A folate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, by retrovirus method, ribosome method, cationic liposome method, adenovirus method, etc.
  • retrovirus method for example, by retrovirus method, ribosome method, cationic liposome method, adenovirus method, etc.
  • examples thereof include a method of introducing into a living body. This makes it possible to carry out gene therapy for diseases caused by mutations in the gene encoding the protein of the present invention.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (eg, pAdexlcw) and a retrovirus vector (eg, pZIPneo).
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to conventional methods (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration to a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for production and expression of the protein of the present invention.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • eukaryotic cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • Animal cells include mammalian cells such as CH0 (J. Exp.
  • CHO cells dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be preferably used. In animal cells, CHO cells are particularly preferred for the purpose of mass expression.
  • the vector is introduced into the host cell by, for example, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), the electoral position method, the lipofussion method, etc. It is possible.
  • Plant cells are known as, for example, a cell force S protein production system derived from Nicotiana tabacum, which may be cultured in callus.
  • a fungal cell a yeast, e.g., Saccharomyces (Saccharomyces) genus, for example, Saccharomyces 'selenides Pine (Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi, Column if, Fusupe Honoré 3 r Noresu (Aspergillus Bruno genus, for example, Asuperugirusu' two Gar (Aspergillus niger) is known.
  • Saccharomyces Saccharomyces genus
  • Saccharomyces 'selenides Pine Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi Column if, Fusupe Honoré 3 r Noresu (Aspergillus Bruno genus, for example, Asuperugirusu' two Gar (Aspergillus niger) is known
  • Bacterial cells include E. coli, such as JM109, DH5a, HB101, etc., and Bacillus subtilis is also known.
  • Proteins are obtained by transforming these cells with the target DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, with medium exchange, aeration, and agitation as necessary.
  • a system for producing proteins in vivo for example, production using animals
  • Examples include production systems using plants and plants.
  • the target DNA is introduced into these animals or plants to produce and recover proteins in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mammals When animals are used, there are production systems using mammals and insects. Examples of mammals that can be used include goats, pigs, hidges, mice, and bushes (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). In addition, when a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat ⁇ -casein.
  • a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
  • the target protein can be obtained from the milk produced by the Transgenic Goat born or the offspring.
  • hormones may be used as appropriate in Transgenic Jack! ⁇ (Ebert, KM et al., Bio / Technology ( 1994) 12, 699-702).
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus inserted with DNA encoding the target protein (Susumu, M. et al., Nature ( 1985) 315, 592-594).
  • tobacco when plants are used, for example, tobacco can be used.
  • a DNA encoding a target protein is inserted into a plant expression vector, for example, pMON 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium can be infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, to obtain the desired polypeptide from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al "Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the protein of the present invention thus obtained can be isolated from inside or outside the host cell (eg, medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the present invention provides a method for producing the protein of the present invention, comprising the steps of culturing the host cell of the present invention and recovering the produced protein from the host cell or a culture supernatant thereof. To do.
  • Separation and purification of the protein is not limited in any way as long as the separation and purification methods used in normal protein purification are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. In combination, proteins can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc.
  • the peptide can be arbitrarily modified or the peptide can be partially removed.
  • the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endobeptidase, protein kinase, darcosidase and the like.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention includes a monoclonal antibody as well as a polyclonal antibody without particular limitation. Also included are antisera obtained by immunizing animals such as rabbits with the protein of the present invention, all classes of polyclonal and monoclonal antibodies, human antibodies and humanized antibodies by genetic recombination.
  • the protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a human, mouse or rat, particularly a human-derived protein. Is preferred. Human-derived proteins can be obtained using the gene sequences or amino acid sequences disclosed herein.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein. Protein parts Examples of peptides include amino group (N) terminal fragments and carboxy (C) terminal fragments of proteins.
  • the “antibody” described in the present specification means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • a gene encoding the protein of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the host cell described herein is transformed with the vector.
  • the fragment may be obtained by a known method and used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing the protein, lysates thereof, or chemically synthesized proteins of the present invention may be used as the sensitizing antigen. It is preferable that a short peptide is combined with a carrier protein such as mocyanin, ushi serum albumin, ovalbumin, or the like to kihor limpet as an antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but it is generally preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Rodents, Rabbits, and primates are used.
  • rodent animals examples include mice, rats, and hamsters.
  • Usagi is an example of an animal of the order Usagi.
  • monkeys are used as primate animals.
  • monkeys with narrow nose old world monkeys
  • rival cynomolgus monkeys monkeys, baboons, chimpanzees and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline to an appropriate amount and suspended, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, it is administered to mammals.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is administered several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used at the time of sensitizing antigen immunization. Immunization is carried out in this manner, and it is confirmed by a conventional method that the desired antibody level increases in the serum.
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • This blood force also separates serum by a known method.
  • a polyclonal antibody Serum containing a polyclonal antibody may be used, and if necessary, a fraction containing this serum power polyclonal antibody may be further isolated and used.
  • a column coupled with the protein of the present invention a fraction that recognizes only the protein of the present invention is obtained, and this fraction is further obtained using a protein G column or protein G column.
  • Immunoglobulin G or M can be prepared by purification
  • immune cells are taken out of the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells are particularly preferable as immune cells used for cell fusion.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a myeloma cell of a mammal, more preferably a myeloma cell that has acquired the characteristics for selecting fused cells by a drug.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can carry out according to etc.
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof. And sensitized lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, such as U266, to obtain a hyperidoma that produces a desired human antibody having a binding activity to a protein (JP-A-2006-133). Sho 63-17688).
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was used for, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G strength. It can be prepared by purification with ram, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with the protein of the present invention, or the like.
  • the antibody of the present invention can be used for purification and detection of the protein of the present invention, and can also be a candidate for the antigen or antagonist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody or a human antibody is preferable because it reduces immunogenicity.
  • a hyperidoma obtained by immunizing a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes with a protein, protein-expressing cell or lysate thereof as an antigen to obtain antibody-producing cells and fusing them with myeloma cells can be used to obtain human antibodies against proteins (see International Publication Nos. WO92-03918, W093-2227, WO94-02602, W094-25585, W096-33735 and WO96-34096).
  • Monoclonal antibodies obtained in this way can also be obtained as recombinant antibodies produced using genetic recombination techniques (eg, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • a thread-reversible antibody is produced by cloning the DNA encoding it into an immune cell such as a hyperidoma or a sensitized lymphocyte producing an antibody, incorporating it into an appropriate vector, and introducing it into a host.
  • the present invention encompasses this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be a modified antibody fragment as long as it binds to the protein of the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked with an appropriate linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • a modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” of the present invention includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody of the present invention is a CDR or non-human antibody-derived CDR complementation determining region having a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody using a known technique) It can also be obtained as a humanized antibody having a FR (framework region) derived from a human antibody and a constant region force.
  • FR framework region
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies used in the present invention may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated by selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. Can be purified
  • the antibody concentration obtained above can be measured by measuring absorbance or enzyme-linked immunosorbent assay (Enzyme-linked
  • ELISA immunosorbent assay
  • Examples of columns used in the affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • a protein A column Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) and the like can be mentioned.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al "Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the antigen binding activity of the antibody of the present invention for example, absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (tuJA), EIA (enzyme immunoassay) RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method can be used.
  • tuJA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method for example, absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (tuJA), EIA (enzyme immunoassay) RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method.
  • tuJA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method for example, absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (tuJA), EIA (enzyme immunoassay) RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method.
  • ELISA the protein
  • a secondary antibody that recognizes an antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase is added, the plate is incubated, washed, and then an enzyme substrate such as tropenyl phosphate is added to measure the absorbance. Binding activity can be evaluated.
  • a protein fragment such as a fragment having its C-terminal force may be used as the protein.
  • BIAcore Pharmacia
  • the antibody of the present invention is brought into contact with a sample expected to contain the protein of the present invention contained in the sample, and the immunocomplex of the antibody and the protein is contacted.
  • the method for detecting or measuring a protein of the present invention comprising detecting or measuring the protein can be carried out. Since the protein detection or measurement method of the present invention can specifically detect or measure the protein, it is useful for various experiments using the protein of the present invention.
  • the present invention also has a chain length of at least 15 nucleotides complementary to the DNA of the present invention (for example, the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, or 5) or its complementary strand.
  • a chain length of at least 15 nucleotides complementary to the DNA of the present invention for example, the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, or 5
  • the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, or 5
  • complementary strand refers to the other strand of one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs.
  • “complementary” is not limited to the case where the sequence is completely complementary in at least 15 contiguous nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and further preferably 95. If there is at least% homology on the base sequence. Algorithms for determining homology are described herein. You can use something.
  • nucleic acids For such nucleic acids, probes and primers used for detection and amplification of the DNA encoding the protein of the present invention, probes and primers for detecting the expression of the DNA, and the expression of the protein of the present invention are controlled. Nucleotides or nucleotide derivatives (for example, antisense oligonucleotides or ribozymes, or DNAs encoding these). Such nucleic acids can also be used for the production of DNA chips.
  • the 3 'region can be complementary, and a restriction enzyme recognition sequence, a tag, or the like can be added to the 5' side.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the protein of the present invention or abnormal activity (function) of the protein of the present invention.
  • One embodiment thereof is a test agent comprising a DNA encoding the above-described protein of the present invention or a DNA containing an expression control region thereof, and a DNA having a chain length of at least 15 nucleotides.
  • the DNA is used as a probe for detecting the gene encoding the protein of the present invention or its expression control region, and the gene encoding the protein of the present invention or its expression control region. It can be used as a primer for amplification.
  • the DNA of the present invention can be prepared by, for example, a commercially available DNA synthesizer.
  • the probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the DNA of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled.
  • a labeling method a T4 polynucleotide kinase is used to label the 5 ′ end of DNA by phosphatizing with 32 P, and a DNA polymerase such as talenoenzyme is used to randomly generate a hexamer oligo.
  • a DNA polymerase such as talenoenzyme is used to randomly generate a hexamer oligo.
  • examples thereof include a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P using a nucleotide or the like, a fluorescent dye, or piotin (such as a random prime method).
  • test agent of the present invention is a test agent containing an antibody that binds to the protein of the present invention described later.
  • the antibody is used for detecting the protein of the present invention in the test method of the present invention.
  • the form of the antibody is not limited as long as the protein of the present invention can be detected.
  • Antibodies for testing include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • the antibody may be labeled if necessary.
  • sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, protein stabilizer (BSA or Gelatin and the like), preservatives and the like may be mixed as necessary.
  • the receptor protein of the present invention is useful for identification of its ligand, agonist, or antagonist.
  • the present invention provides a method for identifying (screening) a ligand, an antigen, and an antagonist of the protein using the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention or a cell expressing / expressing the protein is contacted with a candidate compound (test sample), and then V Then, it is detected (binding activity is evaluated) whether the candidate compound binds to the protein of the present invention or a cell expressing the protein. A compound having binding activity is then selected as the ligand.
  • the protein of the present invention used in the identification (screening) method of the present invention may be a recombinant protein or a naturally derived protein. It may also be a partial peptide. Moreover, the form expressed on the cell surface or the form as a membrane fraction may be sufficient.
  • Candidate compounds are not particularly limited, for example, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, purified or crude proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthesis A low molecular compound and a natural compound are mentioned.
  • the protein of the present invention to be contacted with the candidate compound is expressed on the cell membrane, for example, as a purified protein, as a soluble protein, in a form bound to a carrier, or as a fusion protein with another protein. Or as a membrane fraction, the candidate compound (test sample) can be contacted.
  • a method for screening for example, a protein that binds to the protein of the present invention
  • many methods known to those skilled in the art can be used.
  • Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, it can be performed as follows.
  • a gene encoding the protein of the present invention is inserted into a vector for expressing a foreign gene such as pSV2neo, pcDNA I, or pCD8, and the gene is expressed in animal cells or the like.
  • the promoter used for expression is SV40 early promoter (Rigby In Williamson, ea., Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, London, p.83-141 (1982), EF-1 a promoter (Kim et al.
  • CAG promoter Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)
  • RSV LTR promoter Cullen Methods in Enzymology 152, p.684-704 (1987), SR a promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p. 3365— 3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1, p. 385-394 (1982)), Adenovirus late promoter
  • HSV TK promoter and other commonly used promoters are not particularly limited.
  • a monoclonal antibody recognition site epitopus or C-terminus of the protein of the present invention
  • the specificity of the monoclonal antibody is recognized as a fusion protein having a monoclonal antibody recognition site.
  • Inventive proteins can be expressed.
  • a commercially available Epitoboo antibody system can be used (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).
  • Vectors capable of expressing fusion proteins with j8-galatatosidase, maltose binding protein, dartathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP), etc. via multicloning sites are commercially available.
  • an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant.
  • This immune complex consists of the protein of the present invention, a protein capable of binding to the protein, and an antibody.
  • immunoprecipitation can also be performed using an antibody against the protein of the present invention.
  • the antibody against the protein of the present invention can be obtained by, for example, introducing a gene encoding the protein of the present invention into an appropriate E. coli expression vector and expressing it in E. coli, purifying the expressed protein, and using the purified rabbit, mouse, rat, It can be prepared by immunizing a goat or chicken. It can also be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of the protein of the present invention.
  • the immune complex can be precipitated using Protein A Sepharose or Protein G Sepharose.
  • the protein of the present invention is prepared, for example, as a fusion protein with an epitope such as GST, a protein that specifically binds to these epitopes such as dartathione-Sepharose 4B is used.
  • an immune complex can be formed.
  • SDS-PAGE is generally used for the analysis of immunoprecipitated proteins.
  • a gel with an appropriate concentration it is possible to analyze proteins that are bound by the molecular weight of the protein.
  • the protein bound to the protein of the present invention is difficult to detect by ordinary protein staining methods such as Coomassie staining or silver staining, and therefore 35 S-, which is a radioisotope.
  • Detect cells by culturing cells in a culture solution containing methionine or 35 S-cysteine, labeling the proteins in the cells, and detecting them. Can be improved.
  • the protein of interest can be purified directly from SDS-polyacrylamide gel and its sequence determined.
  • the West Western blotting method (Skolnik, EY et al. Cell (1991) 65, 83-90 ) Can be used. That is, a cDNA library using a phage vector (eg gtl l, ZAP) from a cell, tissue or organ (eg, NK cell) expected to express a protein that binds to the protein of the present invention.
  • the protein produced, expressed on LB-fagarose and immobilized on the filter is immobilized, purified and labeled with the protein of the present invention and the filter to express the protein bound to the protein of the present invention.
  • the method for labeling the protein of the present invention include a method using the binding property of piotin and avidin, and specifically binding to the protein of the present invention or a peptide or polypeptide fused to the protein of the present invention (eg GST).
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is fused with the SRF DNA binding region or GAL4 DNA binding region and expressed in yeast cells to express the protein that binds to the protein of the present invention.
  • Create a cDNA library that expresses in a form that fuses with the VP16 or GAL4 transcriptional activation region from cells that are expected to invade, and introduces it into the yeast cells. Clone ability also isolates library-derived cDNA (when a protein that binds to the protein of the present invention is expressed in yeast cells, the binding of the two activates the reporter gene, Positive clones can be confirmed).
  • a protein encoded by the cDNA can be obtained. This makes it possible to prepare a protein that binds to the protein of the present invention or a gene thereof.
  • reporter genes used in the 2-hybrid system include the HIS3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, and PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) gene. Not. Screening by the two-hybrid method is performed by using mammalian cells in addition to yeast.
  • Candidate compounds that bind to the protein of the present invention can also be screened using affinity chromatography.
  • the protein of the present invention is immobilized on a carrier of a powerful ram, and a candidate compound that is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention is applied thereto.
  • candidate compounds in this case include cell extracts and cell lysates. After applying the candidate compound, the column can be washed to prepare a protein bound to the protein of the present invention.
  • the obtained protein is analyzed for its amino acid sequence, an oligo DNA is synthesized based on the amino acid sequence, and a cDNA library is screened using the DNA as a probe to obtain DNA encoding the protein. be able to.
  • a nanosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can also be used as a means for detecting or measuring a combined candidate compound.
  • the biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon observes the interaction between the protein of the present invention and the candidate compound in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein and without labeling.
  • BIAcore Pharmacia
  • ligands that can be identified by the method of the present invention described above are also included in the present invention.
  • a cell expressing the protein of the present invention is contacted with a candidate compound, and then the candidate compound is contacted. Detects whether or not it is capable of generating a signal that is an indicator of the activity of the protein of the present invention
  • a candidate compound is allowed to act on the receptor protein of the present invention, and whether or not the candidate compound is an agonist using the presence or absence of a signal generated by the protein of the present invention in response to agonist stimulation as an index. It is a method of determination.
  • the present inventors have found that immunosuppression is induced by a signal generated by the receptor protein of the present invention. Therefore, the presence or absence of the signal of the present invention can be detected, for example, by measuring the presence or absence of induction of immunosuppressive action.
  • Human-type model mice Hiramatsu H, Nishikomon R, Heke T, Ito
  • human immune system by transplanting human hematopoietic stem cells into immune-deficient mice M, Kobayashi K, Katamura K and Nakahata T, Blood (2003), 102, 873-880
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • One example is a study by conducting EAE assessment (quantification of hind limb paralysis, urinary incontinence and weight loss) in mice to which a substance is administered.
  • the candidate compound is determined to be an agonist.
  • an agent that can be identified by the above method is also included in the present invention.
  • the present invention also provides an immunosuppressive agent comprising an agonist for the protein of the present invention as an active ingredient.
  • the immunosuppressive agent of the present invention is expected to be effective for treating, for example, allergic diseases (eg, allergic asthma) and autoimmune diseases. Therefore, the present invention provides a therapeutic agent for an allergic disease or autoimmune disease comprising an agonist for the protein of the present invention as an active ingredient.
  • a cell expressing a protein of the present invention is contacted with a candidate compound, and then detected in the absence of the candidate compound. Compared to the case, it is detected whether or not the signal serving as an index of the activity of the protein of the present invention decreases.
  • the signal generated by the receptor protein of the present invention is reduced (suppressed), for example, it is considered that an immunopotentiating action (for example, antiviral activity, antitumor activity, etc.) is caused. Therefore, the decrease in the signal of the present invention is, for example, an immunopotentiating action. It can be measured by detecting the rise.
  • an immunopotentiating action for example, antiviral activity, antitumor activity, etc.
  • the candidate compound is an antagonist.
  • An antagonist that can be identified by the above method is also included in the present invention.
  • the present invention also provides an immunopotentiator comprising an antagonist for the protein of the present invention as an active ingredient.
  • the immunopotentiator of the present invention is expected to be effective as, for example, an antitumor agent or an antiviral agent. Therefore, the present invention provides an antitumor agent and an antiviral agent containing an antagonist for the protein of the present invention as an active ingredient.
  • a method for isolating a compound that binds to the protein of the present invention such as an agonist or an antagonist
  • a synthetic compound, natural product bank for example, a synthetic compound, natural product bank
  • a method of screening a molecule that binds to the protein of the present invention by allowing a random phage peptide display library to act, or a screening method using high-throughput by combinatorial chemistry technology (Wrighton NC; Farrell FX; Shi hang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy L3 ⁇ 4; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458—64, Verdine GL., The combinatorial Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pi 1-13, Hogan JC Jr., Directed comDinatorial chemistry.
  • the present invention also provides a kit for use in the identification (screening) method.
  • the kit includes a protein of the present invention or a cell expressing the protein of the present invention.
  • the kit may contain compounds that are candidates for ligands, agonists, or antagonists of the NKIR protein.
  • the protein of the present invention or a compound that can be isolated by the identification (screening) method of the present invention, and the above-mentioned agent of the present invention can be used in human mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, When used as a medicine for innu, hidge, pig, ushi, monkey, baboon, chimpanzee, etc., in addition to administering the protein or isolated compound itself directly to the patient, it is formulated by a known pharmaceutical method. It is also possible to administer.
  • tablets, capsules, elixirs, and microcapsules with sugar coating as necessary, orally, or aseptic solutions or suspensions with water or other pharmaceutically acceptable liquids can be used parenterally in the form of injections.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative It is conceivable to formulate the drug by combining it in an appropriate combination with a drug, a binder, etc. in the unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin and alginic acid.
  • swelling agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, akamono oil or cherry are used.
  • the dispensing unit form is a capsule, the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solutions for injection examples include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-manntol, and sodium chloride.
  • solubilizers such as alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50 may be used in combination.
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffering agent such as phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent such as hydrochloric acid pro-in, a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol, or an acid proofing agent may be blended.
  • the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule.
  • Administration to patients is known to those skilled in the art, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally. It can be done by a method.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be coded by DNA, it may be possible to incorporate the DNA into a gene therapy vector and perform gene therapy.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method. For example, in the form of an injection, it is usually for an adult (with a body weight of 60 kg). Is considered to be about 100 to 20 mg per day.
  • the dose of the compound that binds to the protein of the present invention and the compound that modulates the activity of the protein of the present invention varies depending on the symptom, but in general, when administered orally (with a body weight of 60 kg) Is considered to be about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, and administration method.
  • target organ usually in adults (weight 60 kg)
  • an amount converted per 60 kg body weight or an amount converted per body surface area can be administered.
  • SA2 (5-TTGGATCCACTGAAGGACCCACAGAAAGAGTTGA-3′ ⁇ SEQ ID NO: 8)) was designed, and the gene was cloned from a human spleen cDNA library using PCR.
  • the base sequence of the obtained clone is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The detailed procedure is shown below.
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (buffer and dNTP mixture attached). A band of about 1.5 kb was cut out by agarose gel electrophoresis. After purification with QlAquick Gel Extraction Kit, it was inserted into pGEM T-Easy Vector to create pGEMTE_NKl. The nucleotide sequence was confirmed using Primer-SA1-7, T7, SP6.
  • SA4 5 -GCCACCTCACACCAGTAAAG-3 '/ SEQ ID NO: 10
  • ⁇ 7 promoter primer 5'-ATTATGCTGAGTGATATCCC-3'- SEQ ID NO: 14
  • SP6 promoter primer 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3 '/ SEQ ID NO: 15
  • pGEMTE-NK1 was cleaved with EcoRI and BamHI, and a band of about 1.5 kb was excised by agarose gel electrophoresis. After purification with QlAquick Gel Extraction Kit, pCOSl
  • SAS1 (5-GGGAATTCATGTTGCCATCTTTAGTTCC-3'Z SEQ ID NO: 16)
  • SAS2 (5'- AAGGATCCACTCCTCTCTCTGGAGAC -3 '/ SEQ ID NO: 17) Reaction conditions: 94 ° C for 2 minutes
  • PCR was performed using KOD plus (TOYOBO) (buffer, dNTPs, and MgSO attached).
  • Hmp sigl (5 AAGAATTCCACCATGGCTGGACCTGCCAC— 3 'Z SEQ ID NO: 20)
  • NKl-sig2 (Issue: 21)
  • PCR was performed using KOD plus (TOYOBO) (buffer, dNTPs, MgSO attached)
  • reaction system C The PCR product of reaction system C was purified with QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN), cleaved with EcoRI and BamHI, and a band of about 0.9 kb was excised by agarose gel electrophoresis.
  • pCH02-SGNKl-FLAG was prepared by inserting it into the EcoR ⁇ BamHI site of pCH02-FLAG.
  • the nucleotide sequence was confirmed using Primer-NKl-sigl, NKl-sig2, SAS2, S3, S4, S5, EF1a, and polyA.
  • RNA- Bee_RNA ISOLATION REAGENT TeKTest
  • SMART RACE cDNA Amplification Kit CLONTECH
  • NUP Nested Universal Primer A
  • the PCR product of the second PCR was subjected to agarose gel electrophoresis, and an approximately 650 bp band was excised.
  • N-type sugar chain-attached cocoon site (NfP] [ST] rP]) 60: NQTL, 245: NHSA, 268: NYSC
  • NKIR gene an inhibitory receptor (KIR) member that recognizes classical MHC class I belonging to the FcR superfamily as a ligand. Since this gene has the characteristic of being specifically expressed in NK cells, it is called NKIR gene below.
  • NKfosion (5'— CTCGGATCCTTGCCATCTTTAGTTCCCTGTGTT -3 'Z SEQ ID NO: 26)
  • PCR was performed using KOD plus (TOYOBO) (buffer, dNTPs, and MgSO attached).
  • NKflag TAGTTCCCTGTGTT-3 '/ SEQ ID NO: 28
  • PCR was performed using KOD plus (TOYOBO) (buffer, dNTPs, MgSO attached)
  • E. coli BL2KDE3 was transformed with the thioredoxin fusion protein expression plasmid pET32a-NK-sol.
  • NKIR fusion protein was prepared at 0.2 mg / 0.5 ml, 0.5 ml of Freund's complete adjuvant (Betaton Dickinson) was inoculated intradermally (1 day, 4 days, 11 days). On day 19, 26 and 33, 0.05 mg of antigenic protein was intravenously injected. Sample blood was collected and it was confirmed that the antibody titer was increased. Blood was collected, and the antiserum was applied to a protein A affinity column to purify the antibody protein. The resulting polyclonal antibody is transient in COS-7 animal cells It was confirmed by the following Western blotting that it showed binding to NKIR expressed in
  • PCOS2-NK-FLAG was introduced into COS-7 cells. After culturing for 2 days, the cells are suspended by adding a lysate (10% glycerol, 50 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl, 5 mM NP-40, protease inhibitor complete), and the solubilized membrane protein component is suspended. The contained supernatant was obtained. Anti-FLAG M2 antibody resin was added to the solubilized fraction, and FLAG-NKIR was immunoprecipitated. The obtained sample was transferred to a PVDF membrane after SDS-PAGE and detected using an anti-NKIR polyclonal antibody.
  • a lysate 10% glycerol, 50 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl, 5 mM NP-40, protease inhibitor complete
  • a polyclonal antibody (4.1 mg / ml IgG) obtained from Usagi was used at a 1000-fold dilution
  • an HRP-labeled anti- Usagi antibody (Amersham Bioscience) was used at a 3000-fold dilution.
  • the ECL Western blotting detection system (Amersham Neoscience) was used for detection.
  • anti-FLAG M2 antibody (Sigma) was diluted 1000 times as a control
  • HRP-labeled anti-mouse antibody (Amersham Bioscience) was diluted 3000 times as a secondary antibody to confirm the presence of FLAG-NKIR protein. (Fig. 2).
  • a tissue expression profile was analyzed by PCR using a commercially available cDNA Pannel (Multiple Tissue cDNA (MTC) panel, Clontech Laboratories, Inc.) in a saddle shape.
  • MTC Multiple Tissue cDNA
  • PCR was performed under the following reaction conditions.
  • NKIR07 (5'- AGGTCAGAGTGCAGGCTCCTGTATC -3 '/ SEQ ID NO: 30)
  • NKIR08 (5 -TAGAACTGTCCTTTCTCCCCACGGT -3' / SEQ ID NO: 31)
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (buffer and dNTP mixture attached). The reaction was performed at 50 ⁇ 1, and 5 ⁇ 1 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the appearance of a 0.6 kb long band was confirmed.
  • the control reaction use the G3PDH primer supplied with the MTC panel as a primer. used.
  • the protein concentration of the cell lysate was determined by measuring with Dc Protein Assay Kit (BIO-RAD Laboratories) using PIERCE sushi serum albumin (Fraction V) as a control.
  • ECL + plus Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences) According to the manual method. However, ECL-Advance blocking agent (Amersham Biosciences) was used as a blocking reagent at a concentration of 2%.
  • ECL-Advance blocking agent As a primary antibody, the polyclonal antibody (4.1 mg / ml IgG) obtained from Usagi as described above was diluted 1000-fold, and as a secondary antibody, ⁇ .Usa Ig, horseradish peroxide linked whole antibody (Ronoku origin J (Amersham Biosciences) was used at a 3000-fold dilution to confirm the molecular species that crossed against the anti-NKIR polyclonal antibody.
  • anti-NKIR polyclonal antibody was added to a final concentration of 82 g / ml.
  • cells supplemented with the same concentration of rabbit purified IgG were also prepared. After standing on ice for 1 hour, the cells were collected by low speed centrifugation (300 X g, 5 min.), Washed with FACS buffer, and again collected by low speed centrifugation. Next, the cells collected in FACS buffer containing goat FITC conjugate anti-rabbit IgG antibody (Beckman Coulter) at a final concentration of 14 g / ml were suspended and allowed to stand on ice for 30 minutes.
  • the cells were collected by low-speed centrifugation, washed with FACS buffer, and then suspended in 500 ⁇ l FACS buffer for flow cytometry analysis (Beckman Coulter, EPICS). As a result, it was shown that this NKIR molecule was expressed on the cell surface (Fig. 5).
  • the entire NKIR gene was cloned again by the 3'-RACE method.
  • Total RNA was prepared from 5.4 ⁇ 10 7 NK-92 cells cultured by the method described in Example 3 using the RNeasy (QIAGEN) kit to obtain 377.7 / zg of total RNA. Using 1 ⁇ g of RNA prepared in this way as a cage, using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) 5'-RACE and 3'-RACE were performed. As gene-specific primers, NKIR08 was used for 5'-RACE and NKIR07 was used for 3'-RACE.
  • PCR was carried out using 0.2 ⁇ of 5-GAATTCACACACCCACAGGACCTGCA-3 ′ / SEQ ID NO: 32) and NKIR10 (5-GGATCCACTGAAGGACCCACAGAAAG-3′Z SEQ ID NO: 33) primers.
  • the PCR kit is HF polymerase kit (Clontech), and the reaction conditions are 94 ° C, 15 seconds + 55 after denaturation at 94 ° C for 30 seconds. C, 30 seconds + 72 ° C, 1 minute cycle 25 cycles, followed by extension reaction at 72 ° C for 5 minutes.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the resulting 1.5 kb fragment was removed from the QIAquick Gel Extraction kit.
  • a plasmid was prepared from the resulting ampicillin-resistant strain using the QIAprep miniprep kit (QIAGEN), a restriction check was performed by Pstl digestion, and a 1.3 kb digested fragment, PBSNKIR224, was used for further studies. Subsequently, the 4 kb and 0.4 kb fragments generated from BstPl and Bglll double digestion of pBSNKIR224 and pTOPONKIR626, respectively, were isolated by agarose gel electrophoresis, purified by QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and then used with LigaFAST Ligation kit (Promega). And ligated with E. coli strain DH5a. A plasmid was prepared from the resulting ampicillin resistant strain using QIAprep miniprep kit (QIAGEN), sequence analysis was performed, and clones with 36 bp inserted at the 5 'end were confirmed.
  • QIAprep miniprep kit QIAGEN
  • PBSNKIR1 11605 was used for further studies.
  • mNKIRrl (5'-ATACATTAGAACCACAGCCGCAATG-3' / SEQ ID NO: 35) was designed and PCR amplified from a mouse spleen cDNA library to clone the gene. As a result of sequence confirmation, the presence of the spliced transcript was identified.
  • 2nd Vertical type: 1st PCR product diluted 30-fold, 2.5 ⁇ 1
  • AP2 (5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC- 3 '/ SEQ ID NO: 37)
  • mNKIRf3 (5'- Ji 1 ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ Jiji Ding ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ -3' / SEQ ID NO: 38) 1 ⁇ 3 'RACE
  • TaKaRa LA Taq buffer, dNTPs, MgCl attached
  • a reaction solution was prepared according to the instructions and PCR was performed.
  • the PCR product of the second PCR was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplified band was excised. After purification with QIAquick Gel Extraction Kit, it was inserted into pGEM T-Easy Vector. Transform DH5 a and use Rasmid was prepared and the nucleotide sequence was determined.
  • N-type sugar chain anchor (NfP] [ST] rP]) 180: NYSC, 188: NISR
  • the Atsy system was implemented by modifying the method for measuring luciferase activity under the control of the NFAT cascade using T cells as recipient cells (Fry AM, Lanier LL,
  • 2KIR3DL a known KIR gene, was cloned using a human spleen cDNA library. PCR was performed under the following reaction conditions.
  • P58KIR01 (5'-GAATTCATGTCGCTCATGGTCGTCAG-3'Z SEQ ID NO: 40)
  • p58KIR02 (5'- GGATCCTCAGGGCTCAGCATTTGGAA-3 '/ SEQ ID NO: 41)
  • PCR was performed using HF polymerase (Clontech). A 1 kb fragment was separated by agarose gel electrophoresis and purified by QIAquick (QIAGEN). Purify the purified product with pCR2.1-TOPO And transformed into E. coli TOP10F '. A plasmid was prepared from the transformant using the QIAprep (QIAGEN) kit, and a clone (PTOPO58KIR303) having a PCR error free sequence was selected for further study.
  • PCR was performed using HF polymerase (Clontech). By agarose gel electrophoresis
  • a 0.8 kb fragment from PCR A and a 0.4 kb fragment from PCR B were separated and purified by QIAquick (QIAGEN). 10 1 of each of the purified products 50 1 was used as the second PCR form shown below.
  • a 1.2-kb fragment was separated by agarose gel electrophoresis and purified by QIAquick (QIAGEN). Escherichia coli TOP10F ′ was transformed by cloning into pCR2.1-TOPO.
  • a plasmid was prepared from the transformant using the QIAprep (QIAGEN) kit, and a clone (pBSKIR58NKIR314) having V and sequence without PCR error was selected and used for further study.
  • Premix ExTaq (Takara) was used as the PCR polymerase, and the reaction conditions were 94 ° C for 5 minutes denaturation, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 90 seconds. 35 cycles were performed.
  • a Jmerkat strain which is a T cell strain
  • a ChimeraAlO strain which is a stable transduction candidate strain
  • pCXND3KIR58NKIR313 was used as the donor DNA, and the Jurkat strain was used as the recipient cell for transduction by the electrovolution method.
  • 20 ⁇ g of the donated DNA was previously digested with 20 units of PvuII (Takara) at 37 ° C for 1 hour, followed by Kuroguchi formphenol treatment, ethanol precipitation, and then dissolved in 201 sterile water.
  • RPMI1640 medium containing 10% FBS as recipient cells After washing the Jurkat cells subcultured in (5) with Potassium-Based Phosphate buffered saline (K-PBS), 0.8 7 cell suspension of 10 7 cells I ml K-PBS was prepared.
  • K-PBS Potassium-Based Phosphate buffered saline
  • Gene Pulsar II (Bio-Rad) was used for the electoral position, and pulse conditions were 0.3 kV and 950 ⁇ FD. After loading with nose, suspend in 48 ml passage medium and incubate overnight under conditions without selective pressure, and then apply selective pressure with Geneticin (Invitrogen) at a final concentration of g / ml to obtain ChimeraAlO. Acquired shares.
  • a flow cytometric analysis was performed in the same manner as described in Example 3 except that GL183 monoclonal antibody (Beckman Coulter) was used as the primary antibody and FITC compound anti-rabbit IgG antibody (Beckman Coulter) was used as the secondary antibody. It was.
  • a luciferase reporter plasmid pNFATlucZEOR324 was transduced to obtain a double transduced strain.
  • pNFATlucZEOR324 was constructed as follows.
  • the fragment derived from pNFAT-TA-Luc was treated with Calf intestine alkaline phosphatase at 37 ° C for 30 minutes and then purified using QIAquick nucleotide removal kit (QIAGEN). Both fragments were ligated using LigaFAST Ligation kit (Promega) and transformed into E. coli strain DH5a.
  • a plasmid was prepared from the resulting ampicillin-resistant strain using the QIAprep miniprep kit (QIAGEN), restriction-checked by EcoRI and Sail double digestion, and clones in which digested fragments of 4.15 kb and 3.15 kb were observed were forward-inserted clones pNFATlucZEOF324 In addition, a clone in which digested fragments having a length of 5.15 kb and 2.15 kb were observed was used as a reverse insertion clone pNFATlucZEOR324 for further studies.
  • the pNFATlucZEOR324 was used as the donor DNA, and the chimeraAlO strain was used as the recipient cell, and transduction was performed by the electoporation method.
  • 20 ⁇ g of donated DNA was previously digested with 20 units of PvuII (Takara) for 1 hour at 37 ° C, followed by black mouth formphenol treatment! After ethanol precipitation, it was dissolved in 20 1 sterile water. .
  • Recipient cells were washed with Potassium-Based Phosphate buffered saline (K-PBS) and 10 7 cells I ml K-PBS cells after passage in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and 400 g / ml geneticin.
  • K-PBS Potassium-Based Phosphate buffered saline
  • a suspension of 0.8 ml was prepared.
  • Gene Pulsar II Bio-Rad
  • the Norse conditions were 0.3 kV and 950 ⁇ FD.
  • After pulse loading suspend in 48 ml of 400 ⁇ g / ml geneticin-containing passage medium and culture overnight under conditions without selective pressure, then apply selective pressure with zeocin (Invitrogen) at a final concentration of 100 g / ml for stable transduction. Acquired stock candidates.
  • Genomic DNA was prepared from the obtained Zeocin meta strain using DNeasy Tissue Kit (QIAGEN). PCR reaction was carried out using 51 ml of the final eluate of 0.4 ml as a bowl.
  • LucOl 5'- TTCATACAGAAGGCGTGGAG -3 '/ SEQ ID NO: 45
  • Luc02 5, -CGTTCGCGGGCGCAACTGCA-3'Z SEQ ID NO: 46
  • the reaction conditions were 94 ° C.
  • 25 cycles of reaction at 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 45 seconds were performed, followed by extension reaction at 72 ° C for 5 minutes.
  • a clone producing a PCR fragment of 0.5 kb in length was selected by agarose gel electrophoresis, and a final screening was performed by detecting luciferase activity.
  • Luciferase mediation Si is suspended in 400 g / ml geneticin and 100 g / ml zeocin-containing subculture medium at a concentration of Ahn shaped electrolyte introduction candidate strain 6.7 X 10 4 cells I ml of pNFATlucZEOR324 obtained from chimeraAlO cell line After turbidity, the cells were seeded at 75 ⁇ l / well in an anti-human CD3 coated microplate (Beckton Dickinson) and a normal immunomicroplate.
  • a strain chimeraA10ZEOR12 showing strong chemiluminescence only under the anti-human CD3-coated microplate culture was selected as a stable transducing strain. Further, flow cytometry analysis was performed on this strain in the same procedure as described above. [0205] As a result, it was expressed in the ChimeraAlO strain! / And retained the fusion protein expression! / It was shown that it can speak (Fig. 9).
  • the chimeraA10ZEOR12 strain was used to evaluate the function of the ITIM motif derived from NKIR. The method is shown below.
  • the chimeraA10ZEOR12 strain was suspended in a subculture medium containing 400 ⁇ g / ml geneticin and 100 ⁇ g / ml zeocin at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells I ml, and each well was placed on an anti-human CD3 coated microplate (Beckton Dickinson). 100 1 per seed. After culturing at 37 ° C for 6 hours, GL183 antibody (Beckman Coulter) at a final concentration of 1 ⁇ g / ml was added, followed by overnight culture at 37 ° C.
  • the functional assay for ITIM activity was performed in the same manner as in Example 6 by modifying the method for measuring luciferase activity under the control of the NFAT cascade using T cells as recipient cells (Fry AM, Lanier LL, Weiss A., J Exp Med. (1996), 184, 295-300).
  • PCR was performed using GC polymerase (Takara Shuzo). 0.7 by agarose gel electrophoresis A kb-long fragment was isolated and purified by QIAquick (QIAGEN). The purified product was cloned into pCR2.1-TOPO and transformed into E. coli TOP10F '. A plasmid was prepared from the transformant using the QIAprep (QIAGEN) kit V, and a clone (pCD81ull0113) having a sequence without a PCR error was selected for further study.
  • a fusion protein expression vector of the extracellular domain of CD8 a chain obtained in Example 12 above and the cytoplasmic ITIM motif of NKIR was constructed by the following procedure.
  • CD03 (5,-GAATTCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC-3, Z sequence number: 49) CDNKIR12 (5 '-
  • PCR was performed using GC polymerase (Takara Shuzo). PCR by agarose gel electrophoresis
  • a 0.5 kb fragment from A and a 0.6 kb fragment from PCR B were separated and purified by QIAquick (QIAGEN). Of the 50 ⁇ 1 purified products, 10 ⁇ 1 each was used as the second PCR round shape shown below.
  • a 1.1 kb fragment was separated by agarose gel electrophoresis and purified by QIAquick (QIAGEN). Escherichia coli TOP10F ′ was transformed by cloning into pCR2.1-TOPO.
  • a plasmid was prepared from the transformant using the QIAprep (QIAGEN) kit, and a clone (pTOPOCD8NKIRfoll) having V and sequence without PCR error was selected and used for further study.
  • a fusion protein expression vector of the extracellular domain of CD8 a chain obtained in Example 12 above and the ITIM motif in the cytoplasm of KIR was constructed by the following procedure. This construct is used as a positive control for the ITIM functional accessory.
  • CD03 SEQ ID NO: 49
  • CDKIR12 5,- 2
  • PCR was performed using GC polymerase (Takara Shuzo). PCR by agarose gel electrophoresis
  • a 0.5 kb fragment from A and a 0.4 kb fragment from PCR B were separated and purified by QIAquick (QIAGEN). Of the 50 ⁇ 1 purified products, 10 ⁇ 1 each was used as the second PCR round shape shown below.
  • a 0.9-kb fragment was separated by agarose gel electrophoresis and purified by QIAquick (QIAGEN). Escherichia coli TOP10F ′ was transformed by cloning into pCR2.1-TOPO.
  • Genomic DNA was prepared from the obtained Zeocin meta strain using DNeasy Tissue Kit (QIAGEN). PCR reaction was carried out using 51 ml of the final eluate of 0.4 ml as a bowl.
  • LucOl 5'- TTCATACAGAAGGCGTGGAG -3 '/ SEQ ID NO: 45
  • Luc02 5, -CGTTCGCGGGCGCAACTGCA-3'Z SEQ ID NO: 46
  • the reaction conditions were 94 ° C. After 5 minutes of denaturation at 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 45 seconds, followed by 5 minutes extension at 72 ° C .
  • a clone producing a PCR fragment of 0.5 kb in length was selected by agarose gel electrophoresis, and a final screening was performed by detecting luciferase activity.
  • Luciferase mediation Si after suspension in concentration 100 / zg / ml zeodn containing subculture medium 6.7 X 10 4 cells I ml stable form electrolyte introduction candidate strains of pNFATlucZEOF324 obtained from Jurkat cell line, anti-human It was carried out by seeding at 75 ⁇ 1 1 well in a CD3 coated microplate (Beckton Dickinson) and a normal immuno microplate.
  • Example 15 Using the Fl 1 strain obtained in Example 15 as a recipient cell, the CD8-NKIR fusion, pCXND3CD8NKIRfoll obtained in Example 13 and the CD8-KIR fusion, pCXND3CD8KIRfoll obtained in Example 14 were transduced. Double-transduced strains were obtained.
  • Electroporation and subsequent establishment procedures consisted of 100 / zg / ml zeocin, 10% (v / v) inactivated calf serum, and 1% (v / v) Penicilin and Streptomycin solution as passage media. This was carried out under the same conditions as in Example 9 except that the RPMI 1640 medium contained was used as a selective agent at a geneticin concentration of 700 g / ml.
  • the obtained clones derived from single colonies were subjected to FACS analysis using an anti-CD8-FITC antibody (Becton Dickinson), and 6-8 clones were selected for each of the expression clones.
  • NKIR # 16 and NKIR # 19 as transduction strains of PCXND3CD8NKIR1U11
  • KIR # 24 was selected as a transducing strain of pCXND3CD8KIRfoll.
  • the structure of these three clone CD8 chimeras is shown in Figure 11-1.
  • Figure 11-2 shows the results of FACS analysis of these clones using the anti-CD8 antibody, LT8 (Serotec) and goat anti-mouse IgG-FITC conjugate antibody (Coulter) used in Example 17. In all three CD8 chimeric clones, LT8-specific staining was observed.
  • luciferase reporter assay was performed to measure NKIR-derived ITIM activity. .
  • Host Fl 1 strain was passaged (100 ⁇ g / ml zeocin and 10% (v / v) inactivated calf serum And 1% (v / v) RPMI 1640 medium containing Penicilin and Streptomycin solution).
  • CD8 chimeric clones were grown in the above medium containing genetidn at a concentration of 700 g / ml. After suspending in 5.33 ⁇ 10 5 cells / ml in each growth medium, 37.5 ⁇ l each was dispensed into a flat bottom 96-well plate and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • anti-CD8 antibody As a primary antibody, anti-CD8 antibody (LT8, Serotec, MCA1226XZ) diluted in each growth medium to 6 ⁇ g / ml was added in an amount of 12.5 ⁇ 1 (final concentration 1.5 ⁇ g / ml).
  • the control group contained each growth medium without antibody.
  • 12.5 1 (final concentration) of rabbit anti-mouse IgGl antibody H143.225.8, Southern Biotech, 1145- 01
  • 1.2 g / ml was added.
  • Each growth medium without antibody was added to the control group. After culturing at 37 ° C.
  • the reporter results are shown in FIG. Atsey was conducted in triplicate, the average value was shown in a bar graph, and the SD value was written as an error bar. In comparison between 8 hours and 10 hours after ConA stimulation, the results at 10 hours showed more effective results. Describe in. The host F11 showed a nearly constant activity value regardless of the presence or absence of the LT8 antibody or crosslinker. In contrast, the activity of the CD8-KIR1 11 transduced CD8 chimeric clone KIR # 24, a positive control clone, was observed to be attenuated in the presence of LT8, and this activity attenuation was not affected by the crosslinker. And the assumed pattern.
  • CD8-NKIR11 11-transduced CD8 chimeric clones were observed to have decreased activity in the presence of LT8, and this decreased activity was not affected by cross-linking.
  • the degree of attenuation was 16.6% for CD-KIR transfectant # 24, which is a positive control, whereas CD-NKIR transfectant # 16 and # 19 were 21.2% and 30.2%, respectively. It was suggested that the sequence containing the cytoplasmic ITIM motif has an ITIM activity comparable to or higher than the cytoplasmic ITIM of known KIR2DL3 molecules.
  • the present invention provides a novel protein expressed in NK cells, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, a host cell containing the vector, and a method for producing the protein.
  • methods have been provided to identify compounds that bind to or modulate the activity of the protein.
  • the protein or DNA of the present invention or a compound that binds to or modulates the activity of the protein of the present invention is expected to be used for the development of new U, prophylactic or therapeutic drugs for diseases associated with the protein of the present invention.

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Abstract

　純化した免疫系細胞の発現頻度解析を行い、ナチュラルキラー（NK）細胞に特異的に発現するNKIR遺伝子を見出すことに成功した。NKIR遺伝子は、受容体をコードしており、該受容体を用いて、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストの同定が可能である。

Description

明 細 書
NK細胞に発現するタンパク質
技術分野
[0001] 本発明は、 NK細胞に発現する新規なタンパク質、および該タンパク質をコードする DNA、ならびに該分子の製造方法および用途に関する。
背景技術
[0002] 細胞障害性 T細胞は、異物である特異的抗原ペプチドと複合体を形成した MHC ( Major Histocompatibility Complex,主要組織適合遺伝子複合体）クラス I分子を認識 し活性化され、標的細胞に対して障害活性を発揮するのに対し、ナチュラルキラー（ NK)細胞は逆に MHCクラス I分子を発現していない標的細胞をよく障害する。正常細 胞表面上ではウィルス感染や癌化により、このような MHCクラス I分子の発現が抑制さ れる。 NK細胞はこうした MHCクラス I分子の発現が減少した異常細胞に対して障害活 性を発揮し、自然免疫としてウィルス感染並びに癌化した細胞の排除機構にぉ 、て 中心的役割を担っていると考えられている。実際、 NK細胞はある種の癌細胞を自発 的に障害する活性を有する細胞として見出された (非特許文献 1参照)。また
Chediak-Higashi症候群と呼ばれる（染色体異常のため、 10歳を過ぎる頃には増悪 期に入りウィルス感染が制御不能となり、悪性リンパ腫様病変をきたすとされ、 2— 3力 月の経過で汎血球減少症のため死亡する）疾患は、 NK細胞活性の欠損が原因であ ることから、 NK細胞の生体内におけるこうした役割が支持される。
[0003] 最近、 NK細胞のマーカーとされる NK1.1+CD3-を欠損したトランスジエニックマウス が作成され、その特徴を解析した結果、 NK細胞が、
1)癌細胞の転移と増殖の抑制において重要な役割を果たす、
2)細菌エンドトキシンに応答する Interferon(IFN) yの主要産生細胞である、ことが示 された (非特許文献 2参照)。
[0004] 一方、近年になり、同一の T細胞受容体を有し、 NK細胞受容体も同時に保持する 自然免疫と獲得免疫との性質を併せ持つ第 4のリンパ球である NKT細胞が肝臓、骨 髄を中心とした極めて広範な臓器に分布し、かっこの細胞が免疫寛容、自己免疫疾 患、肝炎、感染症といった多くの疾病に関与しているという知見が明らかにされてい る。多発性硬化症を早期に発病するマウスの研究から、リンパ球に含まれる免疫細胞 の NKT細胞力 多発性硬化症の発病に何らかの関連を有することが分かった (非特 許文献 3参照)。また、主要な喘息症状であるアレルギー性気道過反応力NKT欠損マ ウスでは示されな力つたことから、 NKT細胞を不活ィ匕して喘息を予防できる可能性が 示唆される (非特許文献 4参照)。この NKT細胞は、 NK細胞と異なり T細胞レセプター に対する刺激、或 ヽは榭上細胞上 CDldレセプターに提示される糖脂質であるアル ファガラタトシルセラミド（ a -G Cer)により活性ィ匕されるという活性化機構が明らかと なっている (非特許文献 3参照)。一方で、 NK細胞と同様に、 MHCクラス I分子の発現 が減少した細胞に対する障害活性を発揮することから、リンパ球集団の細胞障害活 性における阻害的調節分子として同定されている Killer Cell Inhibitory Receptor (以 下 KIR)と、ほぼ同様の機構で細胞障害活性を調節していると思われる。ところが既知 の KIRを発現して ヽな ヽ NKTサブセット群も知られており、活性ィ匕に対して負に働く阻 害型受容体およびシグナルカスケードについては不明な点が多ぐ更なる研究が必 要となっていた。
[0005] NKT細胞の活性ィ匕に効果的なリガンド物質は明ら力となって 、るが、 NK細胞を特 異的に活性ィ匕する低分子リガンドは同定されていない。
[0006] 非特許文献 1 :Trinchieri G., Adv Immunol. (1989), 47, 187-376
非特干文献 2： Sungjin Kim, Koho nzuka, Hector L. Aguna, Irving L. Weissman, and Wayne M. Yokoyama, Proc. Natl. Acad. Sci. (2000), 97, 2731—2736
非特許文献 3 :原田通成 ·谷ロ克，蛋白質 核酸 酵素（2002), 47, 2109-2116 非特許文献 4:Akbari 0, Stock P, Meyer E, Kronenberg M, Sidobre S, Nakayama T, Taniguchi M, Grusby MJ, DeKruyff RH, Umetsu DT, Nat. Med. (2003), 9, 582-588 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 NK細胞を特異 的に活性化または不活化する受容体分子を単離することにある。より詳しくは、 NK細 胞に発現する新規な受容体タンパク質、および該タンパク質をコードする DNA、およ び該分子の用途の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] NK細胞の活性化機構は、タンパク質チロシンキナーゼによるリン酸ィ匕を介した正の シグナルカスケードとリン酸ィ匕を受けたシグナル伝達分子の脱リン酸による負のシグ ナルカスケードの調節により行われていることが示唆されている。この負のカスケード を駆動するための分子を認識する NK細胞の阻害型受容体が、マウスでは細胞外に ヒトでは細胞外に免疫グロブリン (Immuoglobulin, Ig)ドメインを有する KIR分子ファミリ 一が相当する。 KIR分子については、それが認識する MHCァロタイプを含めた詳細 が明らかとなってきている。 NK細胞は MHCクラス I分子の発現が減少した細胞に対す る障害活性を発揮することから明らかなように、 KIR分子の多くが、多型を有し殆どの 細胞で発現する古典的 MHCクラス I分子を認識し負のシグナルを細胞内に伝達する 。一方で KIR分子の中には非古典的 MHCクラス I分子をリガンドとする分子種も有り、 KIR分子全体が自然免疫系にお 、て自己由来の異常細胞に対する監視機構の中心 的役割を果たすとされて 、る。
[0009] KIR分子中には Ly49同様、細胞質内ドメインに ITIMと呼ばれる V/I XYXX L/V(V;
ノ リン、 I；イソロイシン、 Y;チロシン、 L;ロイシン、 Xは任意のアミノ酸）モチーフを有す る機能性配列が存在しており、本 ITIMモチーフ中のチロシン残基がリン酸ィ匕されると 、本部位に SH2ドメインを有するタンパク質チロシン脱リン酸ィ匕酵素である SHP-1が結 合する。 NK細胞での正のシグナルカスケードの活性ィ匕に必須なチロシンリン酸ィ匕タ ンパク質 (SLP-76分子がその候補として有力視されている。）を SHP-1が脱リン酸する ことにより、 NK細胞の活性ィ匕を抑制している。
[0010] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、
http：〃 www.prevent.m.u-tokyo.ac.jpで公開されて 、る、純化した免疫系細胞（単球' マクロファージ、 T細胞、榭状細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球など）の Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)解析データ（Hashimoto S, Blood (2003), 101, 3509-3513)を参照した。解析データの中には、既知遺伝子配列の配列タグとして同 定されたものの他に、未知遺伝子由来と考えられるものが多数同定され、かつ、その なかに特徴的な発現プロファイルをもつものが同定された。
[0011] これらの中から、本発明者らは、ナチュラルキラー (NK)細胞に特異的に発現する NKIR遺伝子を見出すことに成功した。その予想アミノ酸配列の特徴から、本遺伝子 は NK細胞及び一部の T細胞に発現し、リンパ球集団の細胞障害活性における阻害 的調節分子として同定されている Killer Cell Inhibitory Receptor (以下 KIR)のホモ口 グであることが示唆された。本 NKIR遺伝子は、多くの KIR分子群が 19番染色体上にク ラスターをなしているのに対して、第一番染色体にマップされる。また本発明者らは、 創薬への応用の可能性を追求するために本遺伝子の特徴解析を行った。本発明の 遺伝子のスプライシングバリアントと考えられる配列は報告 (WO01Z49728号)されて おり、 NCBI Annotation Projectにおいてはゲノム配列からの予測により、そのスプライ シングノ リアントがアサインされている（LOC343413)ものの、その機能については全 く知られていない。また、本発明の遺伝子と完全に一致する配列は、これまでのところ 知られていない。
[0012] 前述のように NK細胞は抗腫瘍、抗ウィルス活性を有することから、臨床応用の可能 性としては、 KIRに対するアンタゴ-スト抗体を用いた KIRの機能抑制による抗腫瘍効 果、抗ウィルス効果が考えられる。また、 NKT細胞を標的とした場合、アンタゴ-スト 抗体を用いた抗 C型肝炎等の抗ウィルス性疾患ゃ抗癌、ある 、はァゴ-スト抗体を用 いた抗アレルギー性疾患、抗喘息、抗自己免疫疾患への用途に対する可能性が期 待される。
[0013] 本発明は、 NK細胞に発現する新規なタンパク質、該タンパク質をコードする DNA、 およびこれらの製造方法および用途に関し、より具体的には、
〔1〕 下記（a)—（d)のいずれかに記載の DNA、
(a)配列番号： 2、 4、または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質を コードする DNA
(b)配列番号： 1、 3、または 5のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含む DNA
(c)配列番号 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数 のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるタンパ ク質であって、配列番号 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタン パク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA
(d)配列番号： 1、 3、または 5のいずれかに記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DNA
〔2〕 配列番号： 2、 4、または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質の断片をコードする DNA、
〔3〕 〔1〕または〔2〕に記載の DNAによりコードされるタンパク質、
〔4〕 〔1〕または〔2〕に記載の DNAを含むベクター、
[5] 〔1〕もしくは〔2〕に記載の DNA、または〔4〕に記載のベクターを保持する宿主 細胞、
〔6〕 [5]に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生 させたタンパク質を回収する工程を含む、〔3〕に記載のタンパク質の製造方法、 〔7〕 〔3〕に記載のタンパク質に結合する抗体、
〔8〕 以下の（a)および (b)の工程を含む、〔3〕に記載のタンパク質に対するリガン ドの同定方法、
(a)〔3〕に記載のタンパク質または〔3〕に記載のタンパク質を発現している細胞と候 補化合物を接触させる工程
(b)候補化合物が〔3〕に記載のタンパク質または〔3〕に記載のタンパク質を発現して いる細胞に結合する力否かを検出する工程
〔9〕 以下の（a)および (b)の工程を含む、〔3〕に記載のタンパク質に対するァゴ- ストの同定方法、
(a)〔3〕に記載のタンパク質を発現している細胞と候補ィ匕合物を接触させる工程
(b)候補化合物が〔3〕に記載のタンパク質の活性ィ匕の指標となるシグナルを発生さ せるカゝ否かを検出する工程
〔10〕 以下の（a)および (b)の工程を含む、〔3〕に記載のタンパク質に対するアン タゴニストの同定方法、
(a)〔3〕に記載のタンパク質を発現している細胞と候補ィ匕合物を接触させる工程
(b)候補ィ匕合物の非存在下で検出した場合と比較して、〔3〕に記載のタンパク質の 活性ィ匕の指標となるシグナルが減少するカゝ否かを検出する工程
〔11〕 〔8〕に記載の方法によって同定され得る、〔3〕に記載のタンパク質に対する リガンド、
〔12〕 〔9〕に記載の方法により同定され得る、〔3〕に記載のタンパク質に対するァ ゴ-スト、
〔13〕 〔10〕に記載の方法により同定され得る、〔3〕に記載のタンパク質に対するァ ンタゴ二スト、
〔14〕 以下の（a)または (b)を少なくとも 1つ含む、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載 の方法に用いるためのキット、
(a)〔3〕に記載のタンパク質
(b) [5]に記載の宿主細胞
〔15〕 〔3〕に記載のタンパク質に対するァゴ-スト (または〔12〕に記載のァゴ-スト )を有効成分として含有する、免疫抑制剤、
〔16〕 〔3〕に記載のタンパク質に対するァゴ-スト (または〔12〕に記載のァゴ-スト )を有効成分として含有する、アレルギー性疾患または自己免疫疾患治療剤、
〔17〕 〔3〕に記載のタンパク質に対するアンタゴ-スト（または〔13〕に記載のァゴ- スト)を有効成分として含有する、免疫増強剤、
〔18〕 〔3〕に記載のタンパク質に対するアンタゴ-スト（または〔13〕に記載のァゴ- スト)を有効成分として含有する、抗腫瘍または抗ウィルス剤、
〔19〕 〔1〕または〔2〕に記載の DNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌク レオチドの鎖長を有する DNA、
〔20〕 〔19〕に記載の DNA、または〔7〕に記載の抗体を含む、〔3〕に記載のタンパ ク質をコードする遺伝子の発現の異常または活性の異常に関連した疾患の検査薬、 を提供するものである。
また本発明の別の態様においては、
(a)本発明のタンパク質の、該タンパク質のァゴ-ストもしくはアンタゴ-ストのスクリー ユングのための使用
(b)本発明のタンパク質に対するァゴニストの、免疫抑制剤の製造のための使用 (c)本発明のタンパク質に対するァゴ-ストの、アレルギー性疾患もしくは自己免疫疾 患治療剤の製造のための使用
(d)本発明のタンパク質に対するアンタゴ-ストの、免疫増強剤の製造のための使用
(e)本発明のタンパク質に対するアンタゴ-ストの、抗腫瘍剤もしくは抗ウィルス剤の 製造のための使用
を、提供するものである。
[0015] さらに本発明は、以下の方法に関する。
(a)対象者 (患者等)へ本発明のタンパク質に対するァゴニストを投与する工程を含 む、免疫機能を抑制させる方法。
(b)対象者 (患者等)へ本発明のタンパク質に対するァゴニストを投与する工程を含 む、アレルギー性疾患もしくは自己免疫疾患の治療方法 (ある!/、は予防方法)。
(c)対象者 (患者等)へ本発明のタンパク質に対するアンタゴニストを投与する工程を 含む、免疫機能を増強させる方法。
(d)対象者 (患者等)へ本発明のタンパク質に対するアンタゴ-ストを投与する工程を 含む、癌 (腫瘍)もしくはウィルス性疾患の治療方法 (あるいは予防方法)。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は、 Hisトラップカラムを用いて精製した NKIR融合タンパク質の SDS-PAGE 電気泳動による分析結果を示す写真である。
[図 2]図 2は、抗 NKIRポリクローナル抗体による NKIRタンパク質の検出を示す写真で ある。
[図 3]図 3は、 RT-PCRによる組織発現解析の結果を示す写真である。 Aは MTCパネ ル Iおよび IIについて、 Bは Immune Systemおよび Blood Fractionについて示す。以下 に各レーンについて示す。 A:レーン 1:心臓、レーン 2:脳、レーン 3:胎盤、レーン 4: 肺、レーン 5:肝臓、レーン 6:骨格筋、レーン 7:腎臓、レーン 8:脾臓、レーン 9:脾臓 、レーン 10:胸腺、レーン 11:前立腺、レーン 12:精巣、レーン 13:卵巣、レーン 14:小 腸、レーン 15:大腸、レーン 16:末梢血白血球 B:レーン 1:脾臓、レーン 2:リンパ節、 レーン 3:胸腺、レーン 4:末梢血白血球、レーン 5:扁桃、レーン 6:胎児肝臓、レーン 7:骨髄、レーン 8:単核細胞、レーン 9:休止 CD8+細胞、レーン 10:休止 CD4+細胞、 レーン 11 :休止 CD14+細胞、レーン 12 :休止 CD19+細胞、レーン 13 :活性化 CD19+細 胞、レーン 14:活性化単核細胞、レーン 15 :活性化 CD4+細胞、レーン 16 :活性ィ匕 CD8+細胞
[図 4]図 4は、 NK-92細胞株が発現する天然 NKIRタンパク質の抗 NKIRポリクローナル 抗体による検出を示す写真である。
[図 5]図 5は、 NK-92細胞株の抗 NKIRポリクローナル抗体によるフローサイトメトリー解 析を示す図である。
[図 6]図 6は、 COS-7株での NKIR遺伝子の一過性発現に対するフローサイトメトリー 解析を示す図である。
[図 7]図 7は、ヒト NKIRを queryに blast検索を行い、得られたマッチするマウス染色体 配列とのァライメントを示す図である。
[図 8]図 8は、ヒトーマウス NKIR配列のァライメントを示す図である。
[図 9]図 9は、各形質転換導入株のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフであ る。
[図 10]図 10は、ルシフェラーゼ活性を指標とした ITIM活性のアツセィ結果を示すダラ フである。
[図 1ト 1]図 11—1は、実施例 16にお 、て選択された 3クローンの CD8キメラ構造を示 す図である。
[図 11-2]図 11— 2は、実施例 17で使用する抗 CD8抗体、 LT8 (Serotec)とャギ抗マウ ス IgG- FITCコンジュゲート抗体（Coulter)を用いたこれらクローンの FACS解析の結 果を示す図である。 A:F11クローン、 LT8 (1次抗体）なし、 B : F11クローン、 LT8 (1次 抗体)あり、 C : CD8キメラクローン、 LT8 (1次抗体)なし、 D : CD8キメラクローン（1次抗 体)あり
[図 12]図 12は、実施例 17のレポーターアツセィによる ITIM機能活性測定の結果を示 す図である。 LT8 :抗 CD8抗体（LT8)、 CL :クロスリンカ一（ラット抗マウス IgGl抗体） 発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、ヒト脾臓 cDNAライブラリーより PCRを用いて NK細胞に特異的に発現 する遺伝子をクローユングした。得られたクローンには、スプライスノ リアントと思われ るクローンが複数含まれたため、本来の配列を得るため 5' RACEを行い、 KIRメンバ 一であることが推察される NKIR遺伝子を同定した。該遺伝子の塩基配列を配列番号 : 1に、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。さらに 、 NK-92株より調製した全 RNAを用いて、 5'並びに 3'RACE法により再度 NKIR遺伝子 の全長クロー-ングを行ったところ、 5'端に 36塩基のシグナル様配列を有し、 3'端側 におよそ 500塩基伸長した配列を有するクローンが得られた。該クローンの塩基配列 を配列番号： 3に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列 番号： 4に示す。さらにマウス NKIR配列のクロー-ングを行い、得られた塩基配列を 配列番号： 5に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番 号： 6に示す。
[0018] 本発明は、 NK細胞に発現する新規なタンパク質、および該タンパク質をコードする DNAを提供する。本発明の DNAの好まし 、態様としては、下記の（a)— (d)の 、ずれ かに記載の DNAである。
[0019] (a)配列番号： 2、 4、または 6の 、ずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質を コードする DNA
(b)配列番号： 1、 3、または 5のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含む DNA
(c)配列番号： 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複 数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるタン パク質であって、配列番号： 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA
(d)配列番号： 1、 3、または 5のいずれかに記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズする DNA (より好ましくは、配列番号： 1、 3、または 5の いずれかに記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズ する DNAであって、配列番号： 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からな るタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA)
[0020] 本発明は、本発明者らにより同定された NK細胞発現タンパク質 (配列番号： 2、 4ま たは 6に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質）（以下、「NKIRタンパク質」と記載す る場合あり）と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例え ば、これらタンパク質の変異体、ヒトおよびマウス以外の生物のホモログ等が含まれる 。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質力NKIRタンパク質と同様の生物 学的あるいは生化学的活性を有することを指す。このような活性としては、例えば、 KIRが有する活性、 NK細胞による細胞障害活性に対する抑制活性、或いは細胞の 活性化にお!、て同様の細胞内シグナル伝達が介在する T細胞或いはマスト細胞など の免疫系細胞を宿主として形質導入した KIR分子によるそれぞれの細胞種の活性ィ匕 シグナル伝達に対する抑制活性、等を挙げることができる。従って、対象となるタンパ ク質が本発明者らによって同定されたタンパク質と同等の生物学的あるいは生化学 的な活性を有しているカゝ否かは、例えば、形質導入などにより当該分子種を導入した 免疫系細胞の活性ィ匕シグナルに対する阻害活性を、細胞質内カルシウム濃度の測 定により検出する方法（Bruhns P, Marchetti P, Fridman WH, Vivier E, Daeron M., J Immunol. (1999), 162, 3168- 3175)、またはカルシ-ユーリンカスケード制御下にある NF-ATシス配列を有したレポーター遺伝子の発現を測定することにより検出する方 法（Fry AM, Lanier LL, Weiss A., J Exp Med. (1996), 184, 295-300)、或いは宿主と してマスト細胞を用いた場合には同様に Caカスケードの下流にあるセロトニンの放出 を3 Hラベルしたセロトニンの測定により検出する方法（Blery M, Delon J, Trautmann A, Cambiaggi A, Olcese L, Biassoni R, Moretta L, し navrier P, Moretta A, Daeron M, Vivier E.， J Biol Chem. (1997), 272, 8989-8996.)によって評価することが可能で ある。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られ た方法としては、例えば、タンパク質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げ られる。具体的には、当業者であれば、部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468—500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456 、 Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350—367、
Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488—492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)などを用いて、配列番号： 2、 4、または 6に記載のアミノ酸 配列に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質を 調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように 、人工的か自然に生じたものかを問わず、本発明者らにより同定された NKIRタンパク 質のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該 タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このよ うな変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 10アミノ酸以内（例えば、 5アミノ酸以内）であ ると考免られる。
[0022] また、変異導入部位は特に制限されな 、が、後述のモチーフもしくはドメイン以外 の部位であることが好まし 、。
[0023] 変異するアミノ酸残基にお!、ては、アミノ酸側鎖の性質が保存されて 、る別のアミノ 酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（ A、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水'性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、月旨 肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖 を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ離 (R、 K、 Η)、芳香族 含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる (括弧内はいずれもアミ ノ酸の一文字表記を表す)。
[0024] あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他 のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学 的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662—5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、 Wang, A. et al, Science 224, 1431-1433、
Dalbadie- McFarland, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409—6413 )
[0025] NKIRタンパク質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質に は、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタ ンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。 融合タンパク質を作製する方法は、 NKIRタンパク質 (配列番号： 2、 4、または 6に記 載のアミノ酸配列力 なるタンパク質）をコードする DNAと他のペプチド又はタンパク 質をコードする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入 し、宿主で発現させればよぐ当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の タンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定され ない。
[0026] 本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、 FLAG ( Hopp, T. P. et al.， BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210)、 6個の His (ヒスチジン）残 基からなる 6 X His, 10 X His,インフルエンザ凝集素（HA)、ヒト c-mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV- tag、 E- tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag, a -tubulinの断片、 B-tag、 Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用すること ができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例 えば、 GST (ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、ィム ノグロブリン定常領域、 ガラクトシダーゼ、 ΜΒΡ (マルトース結合タンパク質)等が 挙げられる。市販されて ヽるこれらペプチドまたはタンパク質をコードする DNAを本発 明のタンパク質をコードする DNAと融合させ、これにより調製された融合 DNAを発現 させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
[0027] また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製する当業者によく知られた 他の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（SambrookJ et al.， Molecular Cloning 2nd ed., 9.47—9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)を禾 lj用する方法 が挙げられる。即ち、当業者であれば、 NKIRタンパク質をコードする DNA配列（配列 番号： 1、 3、または 5)もしくはその一部を基に、同種または異種生物由来の DNA試 料から、これと相同性の高い DNAを単離して、該 DNA力 NKIRタンパク質と機能的に 同等なタンパク質を単離することも通常行いうることである。
[0028] 本発明には、 NKIRタンパク質をコードする DNAとハイブリダィズする DNAがコードし 、 NKIRタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。このようなタンパク質とし ては、例えば、ヒトあるいはマウスおよび他の哺乳動物のホモログ (例えば、ラット、ゥ サギ、ゥシ、サル、等がコードするタンパク質）が挙げられる。 [0029] NKIRタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離するためのハ イブリダィゼーシヨンの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイプリ ダイゼーシヨンの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ス トリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄において、例えば 42°C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件で ある。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、高ストリンジェントな条件が 挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば 65°C、 5 X SSC及び 0.1%SDSの条 件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効 率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシー に影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であれば これら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能であ る。
[0030] また、ハイブリダィゼーシヨンにかえて、遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4)を用いて、本発明者らにより同定されたタンパク質をコードする DNA配列（配 列番号： 1、 3、または 5)の一部を基にプライマーを設計し、本発明者らにより同定さ れたタンパク質をコードする DNA配列と相同性の高い DNA断片を単離し、該 DNAを 基に本発明者らにより同定されたタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることも 可能である。
[0031] 本発明のタンパク質は「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、 より大きいタンパク質の一部であってもよい。本発明のタンパク質には、リーダー配列 、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際 の安定性を確保する付加的配列などが含まれて 、てもよ 、。
[0032] これらハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAがコード する、 NKIRタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、これらタンパク質 (配列 番号： 2、 4、または 6に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質）とアミノ酸配列におい て高い相同性を有する。本発明のタンパク質には、 NKIRタンパク質と機能的に同等 であり、かつ該タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質も含まれる 。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも 50%以上の同一性、好 ましくは 75%以上の同一性、さらに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましくは 95 %以上の同一性を指す。タンパク質の相同性を決定するには、文献 (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)に記載のアルゴリ ズムにしたがえばよい。
[0033] アミノ酸配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、 BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215: 403-410, 1990)。 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は 例えば、 score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用 いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の 具体的な手法は公知である (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0034] 本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法に より、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかし ながら、得られたタンパク質は、本発明のタンパク質と機能的に同等である限り、本発 明に含まれる。
[0035] 本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、ま た天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、 例えば、本発明のタンパク質をコードする DNA (例えば、配列番号： 1、 3、または 5に 記載の塩基配列を有する DNA)を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な 宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相 、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体を力 ラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこ れらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
[0036] また、本発明のタンパク質をダルタチオン S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タ ンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主 細胞 (例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み 換えタンパク質はダルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することが できる。融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち、 目的のタンパ ク質以外の領域を、トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、除去することも可 能である。
[0037] 天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を 発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する 抗体が結合したァフィユティーカラムを作用させて精製することにより単離することが できる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよ 、。
[0038] 本発明は、また、本発明のタンパク質の断片 (部分ペプチド)を提供する。こうした断 片は全体的に前記本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である力 全部 とは同一でないアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明のタンパク質の断片 は、通常、 8アミノ酸残基以上、好ましくは 12アミノ酸残基以上 (例えば、 15アミノ酸残 基以上）の配列力もなるタンパク質の断片である。好適な断片としては、例えば、アミ ノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、また はァミノ末端を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む一連の残基の二連の残基 の欠失したアミノ酸配列を有するトランケーシヨン (truncation)ポリペプチドが含まれる 。また、 αヘリックスと αヘリックス形成領域、 j8シートと j8シート形成領域、ターンとタ ーン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、 a両親媒性領 域、 β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原 指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片 も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活 性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない 活性が減少した断片を含めて、本発明のタンパク質の活性を媒介するものである。例 えば、リガンドが結合して細胞内へシグナル伝達を行う活性を有する断片が挙げられ る。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。こ れらのタンパク質断片は、抗原活性を含めた本発明のタンパク質の生物学的または 生化学的活性を保持することが好ま ヽ。特定された配列および断片の変異型も本 発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの 、すなわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的 なこうした置換は、 Ala, Val, Leuと lieの間、 Serと Thrの間、酸性残基 Aspと Gluの間、 Asnと Ginの間、塩基性残基 Lysと Argの間、または芳香族残基 Pheと Tyrの間で起こる
[0039] 本発明の上記タンパク質断片は特に制限されないが、後述のモチーフもしくはドメ インを少なくとも含むような断片であることが好ましい。
[0040] 上記断片は、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク 質に結合するリガンドとなる化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質のァゴ- ストやアンタゴ-ストのスクリーニングに利用し得る。
[0041] 本発明のタンパク質断片（部分ペプチド）は、遺伝子工学的手法、公知のペプチド 合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なぺプチダーゼで切断することによって 製造することができる。タンパク質断片 (部分ペプチド)の合成は、例えば、固相合成 法、液相合成法のいずれによってもよい。
[0042] また、本発明における「リガンド」とは、本発明のタンパク質に結合する分子を意味 する。リガンドには天然リガンドおよび合成リガンドが含まれる。「ァゴ二スト」とは、本 発明のタンパク質に結合し、それを活性化する分子を意味する。一方「アンタゴ-スト 」とは、本発明のタンパク質の活性ィ匕を阻害する分子を意味する。
[0043] 本発明のタンパク質をコードする DNAは、上述したような本発明のタンパク質の in vivoや in vitroにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードす る遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治療可能な疾患の遺 伝子治療、あるいは遺伝子診断などへの応用も考えられる。本発明の DNAは、本発 明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、 mRNAから 合成された cDNAである力、ゲノム DNAである力、化学合成 DNAであるかなどを問わ ない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の 塩基配列を有する DNAが含まれる。
[0044] 本発明の DNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発 明のタンパク質を発現して ヽる細胞より cDNAライブラリーを作製し、本発明の DNA配 列（例えば、配列番号： 1、 3、または 5)の一部をプローブとしてハイブリダィゼーショ ンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、例えば、文献 (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning、 Cold bpnng Haroor Laboratory Press (1989))に己載の方法 により調製してもよぐあるいは市販の DNAライブラリーを用いてもよい。また、本発明 のタンパク質を発現している細胞より RNAを調製し、逆転写酵素により cDNAを合成後 、本発明の DNA配列（例えば、配列番号： 1、 3、または 5)に基づいてオリゴ DNAを合 成し、これをプライマーとして用いて PCR反応を行い、本発明のタンパク質をコードす る cDNAを増幅させること〖こより調製することち可會である。
[0045] また、得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域 を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム DNAを単離することができる。
[0046] 具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、 組織、臓器 (例えば、 NK細胞や後述の実施例において発現が認められた組織)から 、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァ-ジン超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294—5299)、 AGPC法
(Chomczynski, P. and Sacchi, N.， Anal. Biochem. (1987) 162, 156- 159)等により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia)等を使用して全 RNAから mRNAを 精製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)を用いることにより mRNAを直接調製することちでさる。
[0047] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて行 うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction； PCR)を用いた 5'-1¾\じ5法 1"011]11& M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002； Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)にしたがい、 cDNAの合成および増幅を行うことができる。得られた PCR 産物から目的とする DNA断片を調製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組 換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えべクタ 一を調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデォキシヌク レオチドチェインターミネーシヨン法により確認することができる。
[0048] また、本発明の DNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al, Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74)。また、本発明の DNAは、市販のキットや公知の方 法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成 オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの挿入、リンカ一の付加、開始コドン（ ATG)及び Z又は終止コドン (TAA、 TGA、又は TAG)の挿入等が挙げられる。
[0049] 本発明の DNAはまた、配列番号： 1、 3、または 5に示す各塩基配列力 なる DNAと ノ、イブリダィズする DNAであり、且つ上記本発明のタンパク質と機能的に同等なタン ノ ク質をコードする DNAを含む。ハイブリダィゼーシヨンにおける条件は当業者であ れば適宜選択することができるが、具体的には上記した条件を用いることができる。こ れらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有する DNAを得ることができる 。上記のハイブリダィズする DNAは、好ましくは天然由来の DNA、例えば cDNA又は ゲノム DNAである。
[0050] 本発明は、また、本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクタ 一としては、宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、本発明のタンパク質を 発現させるために有用である。
[0051] 本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大 腸菌（例えば、 JM109, DH5 a、 HB101、 XLlBlue)などで大量に増幅させ大量調製す るために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選 抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、ク 口ラムフエ-コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限は ない。ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript 、 pCR-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクロー-ング、切り出しを目的とし た場合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。 本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、 発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的 とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で 効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 544-546 ; FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043)、または T7プロモーターなどを持っていることが不可 欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他に PGEX-5X- 1 (フアルマシ ァ社製）、「QIAexpress system] (キアゲン社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿 主は T7 RNAポリメラーゼを発現して 、る BL21が好まし 、；)などが挙げられる。
[0052] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させ る場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用す ればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクトロボ レーシヨン法を用いて行うことができる。
[0053] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、 哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEFゝ pCDM8)、昆虫細胞由 来の発現ベクター (例えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」 (ギブコ BRL社製）、 PBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウイ ルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発 現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia
Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVl l、 SP- Q01)、枯草菌由来の発現べクタ 一（例えば、 pPL608、 pKTH50)が挙げられる。
[0054] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（ Mulliganら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモータ 一（Mizushimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持 つていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、 薬剤 (ネオマイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば さらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0055] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、
SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起 点を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点として は、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由 来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発 現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、 チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフエ ラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0056] 一方、動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、本発明の DNAを 適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法、カチォニックリ ポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。こ れにより、本発明のタンパク質コードする遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺 伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウィル スベクター（例えば pAdexlcw)やレトロウイルスベクター (例えば pZIPneo)などが挙げら れるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明の DNAの挿入などの一般的な 遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63)。 生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。
[0057] また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌や種々の 動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタ ンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造 のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系としては 、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。 [0058] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用い ることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、 COSゝ 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生 類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al.， Nature (1981) 291, 358-340)、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が知られている。 CHO細胞と しては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である dhfr- CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216- 4220)や CHO K— 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とす る場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リ ン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガ 一マンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ポレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方 法で行うことが可能である。
[0059] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 力 Sタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞とし ては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セレ ピンェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、 [列 ば、フスぺノレ3 rノレス (Aspergillusノ 属、例えば、ァスペルギルス '二ガー（Aspergillus niger)が知られている。
[0060] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E. coli)、例えば、 JM109, DH5 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知 られている。
[0061] これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、形質転換された細胞を in vitroで 培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができ る。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを 使用することができる。その際、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもで きるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6— 8であるのが好ましい。培養は 、通常、約 30— 40°Cで約 15— 200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌 を加える。
[0062] 一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする DNA を導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における 「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0063] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、例えば、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、ト ランスジ ニック動物を用いることができる。
[0064] 例えば、目的とする DNAを、ャギ βカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタン パク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子 を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容した ャギカ 生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタ ンパク質を得ることができる。トランスジエニックャギカゝら産生されるタンパク質を含む 乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよ!ヽ (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。
[0065] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的 のタンパク質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることに より、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594)。
[0066] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、目的とするタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチ アナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチド を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al" Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138)。
[0067] これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外 (培地など)か ら単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。
[0068] 本発明は、本発明の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産 生させたタンパク質を回収する工程を含む、本発明のタンパク質の製造方法を提供 する。
[0069] タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製 方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラ ム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリ アクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み 合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
[0070] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and
Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液ネ目クロマト グラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる 。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
[0071] なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させるこ とにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク 質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ 、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
[0072] 本発明は、また、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の 形態には、特に制限はなぐポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる 。また、ゥサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべて のクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組 み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
[0073] 抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物 種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ま しぐ特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示 される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
[0074] 本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であ つてもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分べ プチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基 (N)末端断片やカルボキシ (C)末端断 片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応す る抗体を意味する。
[0075] 本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に 挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内 外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として 用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に 合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キ 一ホールリンペットへモシァニン、ゥシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア タンパク質と適宜結合させて抗原とすることが好ま 、。
[0076] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的には、げっ 歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が使用される。
[0077] げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ゥサ ギ目の動物としては、例えば、ゥサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、 サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、力二クイ ザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
[0078] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。一般的方法とし ては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原 を PBS(Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに 対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合 し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに 適量混合した感作抗原を、 4一 21日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗 原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の 抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
[0079] ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所 望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取 り出す。この血液力も公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては 、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清力 ポリク ローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明 のタンパク質をカップリングさせたァフィユティーカラムを用いて、本発明のタンパク質 のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテイン Aある 、はプロテイン Gカラ ムを利用して精製することにより、免疫グロブリン Gあるいは Mを調製することができる
[0080] モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の 抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞 融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾 細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺 乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を 獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
[0081] 前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミ ルスティンらの方法 (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
[0082] 細胞融合により得られたハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養 液 (ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより 選択される。当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非 融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日一数週間継続して行う。次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリー- ングおよびクロー-ングを行う。
[0083] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、タンパク質発現細 胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエロー マ細胞、例えば U266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を 産生するハイプリドーマを得ることもできる（特開昭 63-17688号公報)。
[0084] 次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収 し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン G力 ラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたァフ ィ-ティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体 は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のァゴ- ストやアンタゴ-ストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する 疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（ 抗体治療)で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体 が好ましい。
[0085] 例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原となる タンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し 、これをミエローマ細胞と融合させたハイプリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗 体を取得することができる（国際公開番号 WO92-03918、 W093-2227, WO94-02602 、 W094-25585, W096-33735および WO96-34096参照）。
[0086] ハイプリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の 免疫細胞を癌遺伝子 (oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよ!ヽ。
[0087] このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生さ せた組換え型抗体として得ることができる（例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照)。糸且換え型抗体は 、それをコードする DNAをハイプリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫 細胞力 クローユングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生さ せる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
[0088] さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片ゃ抗 体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、 Fab、 F(ab')2、 Fv又は H鎖と L鎖 の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Huston, J. S. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)が挙げられる。具体的には、抗 体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させる力、又は、こ れら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当 な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M. S. et al.， J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976； Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497 - 515； Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663； Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663—669； Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。
[0089] 抗体修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を 使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このよ うな抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得るこ とができる。これらの方法はこの分野にぉ 、て既に確立されて 、る。
[0090] また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗 体由来の定常領域力もなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR湘補性決定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域)及び定常領域力もなるヒト型化抗体として 得ることができる。
[0091] 前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用さ れる抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用 すればよい。例えば、ァフィユティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、 フィルター、限外濾過、塩析、透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電 気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる
(Antibodies： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold bpnng Harbor Laboratory, 1988)力 これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃 度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法 (Enzyme-linked
immunosorbent assay ; ELISA)等により行うことができる。
[0092] ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテ イン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
[0093] ァフィユティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン 交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー 、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる (Strategies for Protein Purification and Characterization： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC 等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
[0094] また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測 定、酵素結合免役吸着検定法 (Enzyme- linked immunosorbent assay； tuJ A)、 EIA ( 酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる 。 ELISAを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を 添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製 抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する 二次抗体を添カ卩し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、 トロフエ ニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価する ことができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばその C末端力もなる断片を 使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、 BIAcore(Pharmacia製)を使用するこ とがでさる。
[0095] これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタン パク質が含まれると予想される試料とを接触させ、該抗体と該タンパク質との免疫複 合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を 実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特 異的に検出又は測定することができるため、本発明のタンパク質を用いた種々の実 験等に有用である。
[0096] 本発明はまた、本発明の DNA (例えば、配列番号： 1、 3、または 5に記載の塩基配 列からなる DNA)またはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有 する DNAを提供する。
[0097] ここで「相補鎖」とは、 A:T (ただし RNAの場合は U)、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖核 酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも 15個の連続 したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも 70%、好ま しくは少なくとも 80%、より好ましくは 90%、さらに好ましくは 95%以上の塩基配列上の相 同性を有すればょ 、。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載した ものを使用すればよい。
[0098] このような核酸には、本発明のタンパク質をコードする DNAの検出や増幅に用いる プローブやプライマー、該 DNAの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発 明のタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 (例え ば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザィム、またはこれらをコードする DNA等） が含まれる。また、このような核酸は、 DNAチップの作製に利用することもできる。
[0099] プライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認識配 列やタグなどを付加することができる。
[0100] 本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現の異常または本発 明のタンパク質の活性 (機能)の異常に関連した疾患の検査薬を提供する。
[0101] その一つの態様は、上記した本発明のタンパク質をコードする DNAまたはその発現 制御領域を含む DNAにノ、イブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNAを含む検査薬である。該 DNAは、上記本発明の検査方法において、本発明のタ ンパク質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を検出するためのプローブとし て、本発明のタンパク質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を増幅するた めのプライマーとして用いることができる。本発明の DNAは、例えば市販の DNA合成 機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの 二本鎖 DNA断片として作製することもできる。本発明の DNAをプローブとして用いる 場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、 T4ポリヌクレオ チドキナーゼを用いて、 DNAの 5'端を32 Pでリン酸ィ匕することにより標識する方法、およ びタレノウ酵素等の DNAポリメラーゼを用い、ランダムへキサマーオリゴヌクレオチド 等をプライマーとして32 P等のアイソトープ、蛍光色素、またはピオチン等によって標識 された基質塩基を取り込ませる方法 (ランダムプライム法等)を例示することができる。
[0102] 本発明の検査薬の他の一つの態様は、後述する本発明のタンパク質に結合する抗 体を含む検査薬である。該抗体は、上記の本発明の検査方法において、本発明のタ ンパク質を検出するために用いられる。抗体は、本発明のタンパク質を検出可能であ ればその形態に制限はない。検査のための抗体には、ポリクローナル抗体およびモ ノクローナル抗体が含まれる。抗体は必要に応じて標識されて 、てもよ 、。 [0103] 上記の検査薬においては、有効成分である DNAや抗体以外に、例えば、滅菌水、 生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
[0104] また、本発明の受容体タンパク質は、そのリガンド、ァゴ-スト、またはアンタゴ-スト の同定に有用である。本発明は、本発明のタンパク質を用いた、該タンパク質のリガ ンド、ァゴ-スト、アンタゴ-ストの同定 (スクリーニング)方法を提供する。
[0105] 本発明のリガンドの同定方法の好ましい態様においては、まず、本発明のタンパク 質または該タンパク質を発現して!/ヽる細胞と候補化合物 (被検試料)を接触させ、次 Vヽで候補化合物が本発明のタンパク質または該タンパク質を発現して ヽる細胞に結 合するか否かを検出 (結合活性を評価)する。次いで、結合活性を有する化合物をリ ガンドとして選択する。
[0106] 本発明の同定 (スクリーニング)方法に用いられる本発明のタンパク質は組換えタン パク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また部分ペプチドであって もよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。 候補化合物としては特に制限はなぐ例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微 生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ぺプ チド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。候補ィ匕 合物を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、可溶 型タンパク質として、担体に結合させた形態として、他のタンパク質との融合タンパク 質として、細胞膜上に発現させた形態として、あるいは膜画分として候補ィ匕合物 (被 検試料）〖こ接触させることができる。
[0107] 本発明のタンパク質を用いて、例えば該タンパク質に結合するタンパク質をスクリー ユングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。この ようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以 下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、 pSV2neo, pcDNA I, pCD8などの外来遺伝子発現用のベクターへ挿入し、動物細胞等で該遺 伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては SV40 early promoter (Rigby In Williamson、ea.ノ, Genetic Engineering, Vol.3. Academic Press, London, p.83- 141(1982》, EF- 1 a promoter (Kimら Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193— 200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.684 - 704 (1987), SR a promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p.3365— 3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1, p.385- 394 (1982)), Adenovirus late promoter
(Kau&ian et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989)), HSV TK promoter等の一般的に 使用できるプロモーターであれば特に制限されない。
[0108] 動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクト口 ポレーシヨン法 (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987》、リン酸カルシ ゥム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、 DEAEデ キストラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985》、リポフエクチン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22—30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993》等の方法があるが、い ずれの方法であってもよ 、。
[0109] 特異性の明ら力となって 、るモノクローナル抗体の認識部位 (ェピトープ)を本発明 のタンパク質の N末または C末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位 を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。用いる ェピトーブー抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 13, 85-90 (1995))。マルチクローユングサイトを介して、 j8—ガラタトシダーゼ、マルト ース結合タンパク質、ダルタチオン S-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。
[0110] 融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化させな V、ようにするために数個から十数個のアミノ酸力もなる小さなェピトープ部分のみを導 入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（ His— tag)、インフノレェンザ凝集素 HA、ヒト c— myc、 FLAG, Vesicular stomatitisウィル ス糖タンパク質 (VSV-GP)、 T7 gene 10タンパク質（Τ7- tag)、ヒト単純へルぺスウィル ス糖タンパク質（HSV-tag)、 E-tag (モノクローナルファージ上のェピトープ）などのェ ピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタ ンパク質のスクリーニングのためのェピトーブー抗体系として利用できる（実験医学 13, 85-90 (1995》。
[0111] 免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細 胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明 のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体カゝらなる。上記ェピトー プに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を利用して免疫 沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明 のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内 で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをゥサギやマウス、ラット、ャギ、二 ヮトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のタンパク質 の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
[0112] 免疫複合体は、例えば、抗体がマウス IgG抗体であれば、 Protein A Sepharoseや Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、本発明のタンパク質を、 例えば、 GSTなどのェピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、ダルタチ オン- Sepharose 4Bなどのこれらェピトープに特異的に結合する物質を利用して、本 発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることがで きる。
[0113] 免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Harlow,E. and Lane, D.:
Antibodies, pp.511— 552, Cola Spring Harbor Laooratory puoiications, New York (1988) )記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
[0114] 免疫沈降されたタンパク質の解析には SDS-PAGEが一般的であり、適当な濃度の ゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合して 、たタンパク質を解析すること ができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、ク マシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難で あるので、放射性同位元素である35 S-メチォニンや35 S-システィンを含んだ培養液で 細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を 向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接 SDS-ポリアクリルアミ ドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。
[0115] また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単離する 方法としては、例えば、ウェストウェスタンブロッテイング法（Skolnik, E. Y. et al.Cell (1991) 65, 83-90)を用いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合す るタンパク質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器 (例えば、 NK細胞)より ファージベクター（え gtl l, ZAPなど）を用いた cDNAライブラリーを作製し、これを LB- ァガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識 した本発明のタンパク質と上記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合し たタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質 を標識する方法としては、ピオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタ ンパク質又は本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド (例えば GST など）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法 又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
[0116] また、本発明の上記同定 (スクリーニング)方法の他の態様としては、細胞を用いた 2—ハイブリッドシステム（Fields, S., and Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 286-292、 Dalton S, and Treisman R (1992)Characterization of SAP- 1, a protein recruited by serum response factor to the c— fos serum response element. Cell 68, 597—612、 「MATCHMARKER Two-Hybrid System] ,「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」，「MATCHMAKER One-Hybrid SystemJ (いずれもクロンテツ ク社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」 (ストラタジーン社製)）を用いて行う 方法が挙げられる。 2-ノヽイブリツドシステムにおいては、本発明のタンパク質またはそ の部分ペプチドを SRF DNA結合領域または GAL4 DNA結合領域と融合させて酵母 細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現して!/ヽること が予想される細胞より、 VP16または GAL4転写活性化領域と融合する形で発現する ような cDNAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性ク ローン力もライブラリー由来 cDNAを単離する（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結 合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、 陽性のクローンが確認できる)。単離した cDNAを大腸菌に導入して発現させることに より、該 cDNAがコードするタンパク質を得ることができる。これにより本発明のタンパク 質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することが可能である。 2-ハイプリ ッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、 HIS3遺伝子の 他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、 PAI-1 ( Plasminogen activator inhibitor typel)遺伝子等が挙げられるが、これらに制限され ない。 2ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って 行うことちでさる。
[0117] 本発明のタンパク質と結合する候補ィ匕合物のスクリーニングは、ァフィユティークロ マトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をァフィ-ティ 一力ラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現し ていることが予想される候補ィ匕合物を適用する。この場合の候補ィ匕合物としては、例 えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。候補化合物を適用した後、カラムを 洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。
[0118] 得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴ DNAを合成し 、該 DNAをプローブとして cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパ ク質をコードする DNAを得ることができる。
[0119] 本発明にお 、て、結合した候補ィ匕合物を検出又は測定する手段として表面プラズ モン共鳴現象を利用したノィォセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共 鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のタンパク質と候補ィ匕合物との間の相 互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなぐ表面プラズモン共鳴シグ ナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えば BIAcore、 Pharmacia製)。 従って、 BIAcore等のバイオセンサーを用いることにより本発明のタンパク質と候補ィ匕 合物との結合を評価することが可能である。
[0120] さらに、上記した本発明の方法によって同定され得るリガンドもまた、本発明に含ま れる。
[0121] 本発明のタンパク質に対するァゴ-ストの同定方法の好ましい態様においては、ま ず、本発明のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させ、候補化合物 が本発明のタンパク質の活性ィ匕の指標となるシグナルを発生する力否かを検出する
。即ち、本発明の受容体タンパク質に対し候補化合物を作用させ、本発明のタンパク 質がァゴニスト刺激に応答して発生するシグナルの有無を指標として、候補ィ匕合物 がァゴニストであるか否かを判定する方法である。
[0122] 本発明者らは、本発明の受容体タンパク質が発生するシグナルによって、免疫抑 制作用が誘起されることを見出した。従って、本発明の上記シグナルの有無の検出 は、例えば、免疫抑制作用の誘起の有無等を測定することによって行うことができる。 元来交叉性のないマウスとヒト間の免疫系を免疫能欠損マウス中にヒト造血幹細胞を 移植することによりヒト免疫系を再構築したヒト型モデルマウス（Hiramatsu H, Nishikomon R, Heke T, Ito M, Kobayashi K, Katamura K and Nakahata T, Blood (2003), 102, 873-880)を用いて実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)を誘導した後、ァゴ-スト候補物質を投与しか かるマウスに対する EAE評価 (後肢の麻痺、尿失禁及び体重減少の定量)を行うこと による研究例などが一例となりうる。上記方法においては、上記シグナルが検出され た場合に、候補ィ匕合物はァゴニストであるものと判定される。なお上記方法によって 同定され得るァゴ-ストもまた、本発明に含まれる。
[0123] また本発明は、本発明のタンパク質に対するァゴニストを有効成分として含有する、 免疫抑制剤を提供する。本発明の免疫抑制剤は、例えば、アレルギー性疾患 (例え ば、アレルギー性喘息等）、自己免疫疾患等の治療に有効であるものと期待される。 従って本発明は、本発明のタンパク質に対するァゴニストを有効成分として含有する 、アレルギー性疾患、または自己免疫疾患治療剤を提供する。
[0124] 本発明のタンパク質に対するアンタゴニストの同定方法の好ましい態様においては 、まず、本発明のタンパク質を発現している細胞と候補化合物を接触させ、次いで、 候補ィ匕合物の非存在下で検出した場合と比較して、本発明のタンパク質の活性ィ匕の 指標となるシグナルが減少するか否かを検出する。
[0125] 本発明の受容体タンパク質の発生するシグナルを減少（抑制）させること〖こより、例 えば、免疫増強作用（例えば、抗ウィルス活性、抗腫瘍活性等)が引き起こされるもの と考えられる。従って、本発明の上記シグナルの減少は、例えば、免疫増強作用の 上昇を検出することにより、測定することができる。 in vitroにおいては NK細胞による 標的細胞 (例えば、 K-562株などの NK感受性株）に対する細胞障害活性を力かるァ ンタゴ-スト候補物質の存在或いは非存在下で測定、比較することにより、また in vivoでは先に記したヒト免疫系を再構築したヒト型モデルマウスを用いてウィルス感染 ヒト細胞、或いはヒト癌組織を移植した後アンタゴ-スト候補物質を投与し、かかるマ ウスに対する移植ウィルス感染細胞或いは癌組織に対する細胞障害活性を評価す ることによる研究例などが一例となりうる。
[0126] 上記方法にぉ 、ては、上記シグナルの減少が検出された場合に、候補ィ匕合物はァ ンタゴ-ストであるものと判定される。なお上記方法によって同定され得るアンタゴ- ストもまた、本発明に含まれる。
[0127] また本発明は、本発明のタンパク質に対するアンタゴニストを有効成分として含有 する、免疫増強剤を提供する。本発明の免疫増強剤は、例えば、抗腫瘍剤、または 抗ウィルス剤として有効であるものと期待される。従って本発明は、本発明のタンパク 質に対するアンタゴニストを有効成分として含有する、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤を提 供する。
[0128] また、ァゴ-ストまたはアンタゴ-ストなどの本発明のタンパク質に結合する化合物 を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天 然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、 本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケ ミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法 (Wrighton NC; Farrell FX; し hang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy L¾;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458— 64、 Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pi 1—13、 Hogan JC Jr., Directed comDinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pi 7- 9)が当業者に公知である。
[0129] 本発明は、また、上記同定 (スクリーニング)方法に用いるためのキットを提供する。
該キットは、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を発現する細胞を含む。 該キットには、 NKIRタンパク質のリガンド、ァゴ-スト、あるいはアンタゴ-ストの候補と なる化合物が含まれて 、てもよ 、。
[0130] 本発明のタンパク質、または本発明の同定 (スクリーニング)方法により単離しうる化 合物、本発明の上記薬剤をヒトゃ哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ゥサギ 、 -ヮトリ、ネコ、ィヌ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として 使用する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以 外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤とし て経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容され る担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、 界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合 わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによ つて製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲 の適当な容量が得られるようにするものである。
[0131] 錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーン スターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦 形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシゥ ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモ ノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合 には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のた めの無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って 処方することができる。
[0132] 注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む 等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリウムが挙 げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコ ール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤 、例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO- 50と併用してもよい。 [0133] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸 ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジルアル コール、フエノール、酸ィ匕防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当 なアンプルに充填させる。
[0134] 患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔 内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行 いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であ れば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物が DNAによりコ ードされうるものであれば、該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を 行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変 動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
[0135] 本発明のタンパク質の投与量は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投 与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人 (体重 60kgとして）にお いては、 1日あたり約 100 gから 20mgであると考えられる。
[0136] 本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を調節する化 合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人 (体重 60kgとして）においては、 1日あたり約 0.1から 100mg、好ましくは約 1.0から 50mg、より 好ましくは約 1.0から 20mgであると考えられる。
[0137] 非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与 方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人 (体重 60kgとして）におい ては、通常、 1日当り約 0.01力 30mg、好ましくは約 0.1から 20mg、より好ましくは約 0.1 から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物 の場合も、体重 60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投 与することができる。
[0138] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例 [0139] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限 されるものではない。
[0140] 〔実施例 1〕 全長配列のクローニング
本発明者らは、 http：〃 www.prevent.m.u-tokyo.ac.jpで公開されて 、る免疫系細胞 の SAGE (SAGE: serial analysis of gene- expression)解析データ中に、 NK細胞に特異 的な未知遺伝子配列タグ (表 1)を見出し、該当するタグが公開公報 (WO0149728) AX191619中にあるのを見出した。表 1は、配列タグ（TGCCGCATAA)の NK細胞由 来ライブラリ一における選択的な出現を表す。
[0141] [表 1]
Figure imgf000040_0001
[0142] これに基づきコーディング領域全体を増幅するプライマー（SA1 (
5 -TTGAATTCACACACCCACAGGACCTGCAGCTGAA -3'/配列番号： 7) SA2 (5 -TTGGATCCACTGAAGGACCCACAGAAAGAGTTGA - 3'Ζ配列番号： 8) )を 設計し、ヒト脾臓 cDNAライブラリーより PCRを用いて遺伝子をクローユングした。得ら れたクローンの塩基配列を配列番号： 1に、該塩基配列によってコードされるタンパク 質のアミノ酸配列を配列番号: 2に示す。また詳細な手順を以下に示す。
[0143] (1) pGEMTE— NK1の作成
以下の反応条件で PCRを行った。
齡型： marathon-ready cDNA human spleen(CLONTEし ri)
プライマー： SA1 SA2
反応条件: 96°Cで 1分
96°Cで 30秒、 72°Cで 4分、 5サイクル
96°Cで 30秒、 70°Cで 4分、 5サイクル 96°Cで 20秒、 68°Cで 4分、 25サイクル
[0144] TaKaRa Ex Taqを用いて（バッファー， dNTP mixtureは添付） PCRを行った。ァガロ ースゲル電気泳動により約 1.5kbのバンドを切り出した。 QlAquick Gel Extraction Kit で精製した後、 pGEM T-Easy Vectorに挿入し pGEMTE_NKlを作成した。塩基配列 はプライマ一- SA1— 7、 T7、 SP6を用いて確認した。
SA3： 5'- ACCCTGAGATGTCAGACAAAG- 3'/配列番号： 9
SA4： 5 -GCCACCTCACACCAGTAAAG -3'/配列番号： 10
SA5： 5 -CCTCCGATCCTGTATTCCTTC -3'/配列番号： 11
SA6： 5'- TGGAGCTGTGGGTGGTATCTG- 3'/配列番号： 12
SA7： 5'- AGAACCTCAAAGAGGAGTGAA- 3'Ζ配列番号： 13
Τ7プロモータープライマー： 5'- ATTATGCTGAGTGATATCCC- 3'Ζ配列番号： 14 SP6プロモータープライマー： 5'- ATTTAGGTGACACTATAGAA- 3'/配列番号： 15
[0145] (2)pCOS_NKlの作成
pGEMTE- NK1を EcoRI、 BamHIで切断し、ァガロースゲル電気泳動により約 1.5kbの バンドを切り出した。 QlAquick Gel Extraction Kitで精製した後、 pCOSlの
EcoRI- BamHIサイトに挿入し pCOS- NKlを作成した。
[0146] (3)pCH02- NKl- FLAGの作成
以下の反応条件で PCRを行った。
铸型： pGEMTE- NK1
プライマー： SAS1 (5 -GGGAATTCATGTTGCCATCTTTAGTTCC - 3'Z配列番号 ： 16) SAS2 (5'- AAGGATCCACTCCTCTCTCTGGAGAC -3'/配列番号： 17) 反応条件: 94°Cで 2分
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 1分、 25サイクル
[0147] KOD plus (TOYOBO)を用いて（バッファー、 dNTPs, MgSOは添付） PCRを行った。
4
QlAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)で精製後、 EcoRI、 BamHIで切断しァガロ ースゲル電気泳動により約 lkbのバンドを切り出した。 QlAquick Gel Extraction Kitで 精製した後、 pCH02- FLAGの EcoRト BamHIサイトに挿入し、 pCH02- NKl- FLAGを 作成した。塩基配列はプライマ一- SAS1、 SAS2、 S3、 S4、 S5、 EF1 a、 polyAを用いて 確認した。
EF1 a : 5'- GCCTCAGACAGTGGTTCAAA- 3'/配列番号： 18
IgGl polyA5'- AGAACCATCACAGTCTCGCA- 3'Z配列番号： 19
[0148] (4)pCH02- SGNKl- FLAGの作成
以下の反応条件で PCRを行った。
A：铸型： pCOS2- SGhMPL- FLAG
プライマー： Hmpト sigl (5し AAGAATTCCACCATGGCTGGACCTGCCAC— 3' Z配列番号： 20) NKl-sig2 ( 号: 21)
B :铸型： pGEMTE- NK1
プライマー： NKl- sigl (5 -GCAGGAAGCCCAAGCCTGGCCAAACCCTGT -3' Z配列番号： 22) SAS2
C :铸型:反応系 Aと Bの産物を混合したもの
プライマー： Hmp卜 sigl SAS2
反応条件: 94°Cで 2分
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 1分、 25サイクル
[0149] KOD plus (TOYOBO)を用いて（バッファー、 dNTPs、 MgSOは添付） PCRを行った
4
。反応系 Cの PCR産物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)で精製後、 EcoRI 、 BamHIで切断しァガロースゲル電気泳動により約 0.9kbのバンドを切り出した。
QIAquick Gel Extraction Kitで精製した後、 pCH02- FLAGの EcoR卜 BamHIサイトに 挿入し pCH02- SGNKl- FLAGを作成した。塩基配列は Primer- NKl- sigl、 NKl- sig2 、 SAS2、 S3、 S4、 S5、 EF1 a、 polyAを用いて確認した。
[0150] 以上の (1)から (4)の工程により得られたクローンの塩基配列を決定したところ 429アミ ノ酸力 なる膜タンパク質と予想された。この配列を相模中研の配列 (WO01Z49728 号）と比較したところ、中央部分の配列は相模中研の配列と同じである力 N末は差 が認められ、タンパク質配列にも差があることが判明した。今回クローユングしたクロ ーンは C末端側は得られた全クローンで同一だった力 5'側はスプライスノ リアントら しきクローンも複数得られたため、本来の配列を確認するため以下のように 5'RACEを 行った。
[0151] NK細胞より RNA- Bee_RNA ISOLATION REAGENT(TeKTest)を用いて抽出した RNA(0.4 μ / μ 1,20 μ 1 in DEPC— DDW)1 μ gから SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH)を用いて cDNA(5，— RACE— Ready cDNA' 100 μ 1 in Tricine— EDTA Buffer)を合成し 5 '-RACE PCRを以下の反応条件で行った。
[0152] 1回目 铸型： 5'- RACE- Ready cDNA, 2.5 ^ 1
プライマー： lOxUniversal Primera A Mix (添付、 lxにて使用) SAS2
lOxUniversal Primer A Mix： (long, 0.4 μ M： 配列番号： 23)
(short, 2 μ Μ : 5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC- 3'Z配列番号： 24)
2回目 铸型： 1回目 PCR産物， 5 1
プライマー： Nested Universal Primer A (NUP) (
5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT- 3'Z配列番号： 25) SA4
反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 5秒、 72°Cで 3分、 5サイクル
94°Cで 5秒、 70°Cで 10秒、 72°Cで 3分、 5サイクル
94°Cで 5秒、 68°Cで 10秒、 72°Cで 3分、 30サイクル
72°Cで 7分
[0153] 2回目 PCRの PCR産物をァガロースゲル電気泳動し、約 650bpのバンドを切り出した
。 QIAquick Gel Extraction Kitで精製した後、 pGEM T- Easy Vectorに挿入した。塩 基配列を Primer-SA3、 4、 T7、 SP6、 NUPを用いて確認した。
[0154] その結果、配列を確認した 5クローン全てのコーディング配列が今回の塩基配列と 一致した（うち、 1クローンは 5'が短力つた)。従って、今回得たクローンが実際に発現 して 、る塩基配列であると考えられた。
[0155] Prosite、 Pfam、 Psort等によるモチーフ検索の結果より、以下のような配列上の特徴 を検出した。 N型糖鎖付カ卩部位 (NfP][ST]rP]) 60： NQTL , 245： NHSA, 268： NYSC
ITIMモチーフ（Yxx[VL]) 351:YANV, 366:YSW
Ig様ドメイン 27-80, 120-177, 216-273
膜貫通ドメイン 309 - 325
[0156] 今回単離された遺伝子は FcRスーパーファミリーに属する古典的 MHCクラス Iをリガ ンドとして認識する抑制性受容体 (KIR)メンバーであることが、上記の配列情報から 推察された。この遺伝子は NK細胞に特異的に発現する特徴を有することから、以下 では NKIR遺伝子と呼称する。
[0157] 〔実施例 2〕ゥサギポリクローナル抗体による NKIRタンパク質の検出
大腸菌発現系を構築し、 NKIR細胞外ドメインの融合タンパク質の発現精製を行つ た（図 1)。詳細な手順を以下に示す。
[0158] (l)NKIR融合タンパク質大腸菌発現プラスミド pET32a- NK- solの作製
以下の反応条件で PCRを行った。
铸型： pGEMTE- NK1
プライマー： NKfosion (5'— CTCGGATCCTTGCCATCTTTAGTTCCCTGTGTT -3 'Z配列番号： 26) NKr2 (
5 -GCTGTCGACTTAGTTGCTGGCGGGAGTGAACAAGAC -3'/配列番号： 27) 反応条件: 94°Cで 2分
94°Cで 20秒、 60°Cで 30秒、 68°Cで 2分、 25サイクル
[0159] KOD plus(TOYOBO)を用いて（バッファー、 dNTPs、 MgSOは添付） PCRを行った。
4
MicroSpin S-300 HRカラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製後、 BamHI、 Sailで 切断しァガロースゲル電気泳動により約 0.9 kbのバンドを切り出した。 MicroSpin S-300 HRカラムで精製した後、 pET- 32(a)(ノバジェン)の BamHI-Sallサイトに挿入し pET32a- NK- solを作製した。
[0160] (2)NKIRタンパク質動物細胞発現プラスミド pCOS2-NK-FLAGの作製
以下の反応条件で PCRを行った。
铸型： pGEMTE- NK1
プライマー： NKflag ( TAGTTCCCTGTGTT- 3'/配列番号： 28) NKrl (
5 -CGTGTCGACTCACTAGCAGAGAACCTCCTCACAGTC - 3'Z配列番号： 29) 反応条件: 94°Cで 2分
94°Cで 20秒、 60°Cで 30秒、 68°Cで 2分、 25サイクル
[0161] KOD plus (TOYOBO)を用いて（バッファー、 dNTPs、 MgSOは添付） PCRを行った
4
。 MicroSpin S- 300 HRカラム（アマシャムバイオサイエンス）で精製後、 EcoRI, Sailで 切断しァガロースゲル電気泳動により約 1.3 kbのバンドを切り出した。 MicroSpin S-300 HRカラムで精製した後、 pCOS2の EcoRI-Sallサイトに挿入し
pCOS2- NK- FLAGを作製した。
[0162] (3)NKIR融合タンパク質および NKIRゥサギポリクローナル抗体の調製
チォレドキシン融合タンパク質発現プラスミド pET32a-NK- solにより、大腸菌 BL2KDE3)の形質転換を行った。 50 g/mlアンピシリンを含む LB培地で終夜培養し た大腸菌懸濁液を終濃度 1%になるように 50 μ g/mlアンピシリンを含む LB培地へと拡 大伝播して 600nmでの吸光度が 0.4になるまで培養を行った後、終濃度 ImMになるよ うに IPTGを添加してタンパク質発現誘導を行った。 4.5時間培養を行った後遠心して 菌体沈殿物を回収、 PBSに懸濁した。超音波破砕機により菌体破砕後に遠心し上清 を捨て、沈殿画分を回収した。 7M尿素を含むリン酸緩衝液 (PBS)で可溶ィ匕した後、 0.45 μ mのフィルターろ過を行った。ろ液より HisTrapキット（アマシャムバイオサイェン ス）を用いて、 NKIR融合タンパク質を分離した。溶出液を 50mM Tris (pH 8.3)に対し て透析して可溶ィ匕した融合タンパク質サンプルを得た。期待通りの分子量の融合タ ンパク質が得られていることを SDS-PAGE後のクマシ一染色により確認した。
[0163] 得られた NKIR融合タンパク質を免疫原としてゥサギを免疫し、ポリクローナル抗体 を作製した。抗原タンパク質を 0.2mg/0.5mlに調製し、フロイント完全アジュバント（ベ タトンディッキンソン）を 0.5mlをカ卩ぇ lmlを皮内へ接種（1日、 4日、 11日）した。 19日、 26 日、 33日目に抗原タンパク質 0.05mgを静注した。試採血を行い、抗体価があがって いることを確認後、採血を行い、抗血清をプロテイン Aァフィユティーカラムに供し抗 体タンパク質を精製した。得られたポリクローナル抗体が COS-7動物細胞で一過的 に発現した NKIRへの結合性を示すことを、以下のウェスタンブロッテイングにより確認 した。
[0164] FuGENE6 (ロシュダイァグノテイクス）を用いて製造者の指示に従 、、
PCOS2-NK-FLAGを COS-7細胞へと導入した。 2日間培養した後、細胞を可溶化液 (10%グリセロール， 50mM Tris pH7.6, 150mM NaCl, 5mM NP-40,プロテアーゼ阻害 剤 complete)を加え懸濁した後に遠心し、可溶化膜タンパク質成分が含まれる上清を 得た。可溶化画分に抗 FLAG M2抗体レジンを添カ卩し、 FLAG-NKIRを免疫沈降した 。得られたサンプルを SDS-PAGE後に、 PVDF膜へと転写し、抗 NKIRポリクローナル 抗体を用いて検出した。 1次抗体としてゥサギより得られたポリクローナル抗体 (4.1 mg/ml IgG)を 1000倍希釈にて、 2次抗体として HRP標識抗ゥサギ抗体 (アマシャムバ ィォサイエンス）を 3000倍希釈にて使用した。検出には ECLウェスタンブロッテイング 検出システム（アマシャムノィォサイエンス）を用いた。また対照として抗 FLAG M2抗 体 (シグマ）を 1000倍希釈にて、 2次抗体として HRP標識抗マウス抗体 (アマシャムバ ィォサイエンス）を 3000倍希釈にて使用して FLAG- NKIRタンパク質の存在を確認し た（図 2)。
[0165] 〔実施例 3〕 組織発現解析及び NK細胞株における発現解析
巿販 cDNAパネノレ（Multiple Tissue cDNA (MTC) panel, Clontech Laboratories, Inc.)を铸型に用いて PCRにより組織発現プロファイルを解析した。
[0166] 以下の反応条件で PCRを行った。
型： MTC panel I, II, Human Immune system及び Human Blood Fraction
Clontech Laboratories, Inc.)
プライマー： NKIR07 (5'- AGGTCAGAGTGCAGGCTCCTGTATC -3'/配列番号： 30) ^NKIR08 (5 -TAGAACTGTCCTTTCTCCCCACGGT -3'/配列番号： 31) 反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 30秒、 65°Cで 2分、 35サイクル
[0167] TaKaRa Ex Taqを用いて（バッファー、 dNTP mixtureは添付） PCRを行った。反応は 50 μ 1で行い反応液 5 μ 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し 0.6 kb長バンドの出現を 確認した。コントロール反応には MTC panelに付属の G3PDH primerをプライマーに 使用した。
[0168] その結果、脾臓、白血球といった免疫系に特異的に発現していることが示された（ 図 3)。上記 MTCパネルの Blood Fraction及び Immune Systemのサブセットを用いて 解析対象を増やしたところ Blood Fractionでは単核球、 resting CD8+、また Immune Systemでは脾臓、白血球の他、リンパ節に限局した発現が確認された（図 3)。
[0169] 株化されたナチュラルキラー (NK)細胞株である、 ATCCより購入した NK-92株 (カタ ログ番号： CRL-2407)より調製した細胞溶解液を用いたウェスタンブロッテイング解析 を行った。
[0170] NK-92株を 10 ng/mlインターロイキン- 2 (SIGMA-ALDRICH)存在下、 NK-92継代 培地（12.5 %ゥシ胎仔血清（Invitrogen), 12.5 %ゥマ血清（Invitrogen), 2 mMグルタ ミン（Invitrogen), 0.1 mg/1ペニシリン (Invitrogen), 0.1 mg/1ストレプトマイシン (Invitrogen), 1 mMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen), 100 μ Μ 2-メルカプトエタノー ル（Invitrogen), 2 mM葉酸（SIGMA- ALDRICH)および 20 mMミオ-イノシトール (SIGMA- ALDRICH)含有 α - MEM培地（Invitrogen))にて培養し得られた 1 x 107 cells を 500 μ 1の ΝΡ40溶解バッファー（1 % ΝΡ40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl (pH8.0) )に懸濁し、氷上で 30分静置後 15000rpmのマイクロ遠心にて上静を分画し、細胞溶 解液としてウェスタンブロッテイング解析に用いた。
[0171] 細胞溶解液のタンパク質濃度を PIERCE製のゥシ血清アルブミン（Fraction V)をコ ントロールとして Dc Protein Assay Kit (BIO- RAD Laboratories)を用いて測定し決定 した。
[0172] ウェスタンブロッテイング解析の為の SDS-PAGEには PAG- Mini (4-20% gradient gel 、第一化学薬品株式会社)を用いて 10 μ g及び 20 μ gの NK-92株の細胞溶解液を供 した。ポジティブコントロールとしてポリクローナル抗体調製用にゥサギに免疫した際 に使用した免疫源を NP40溶解バッファ一にて 200倍に希釈した標品 1 μ 1を同時に供 した。電気泳動は 20mAの条件で行い、泳動後のゲルを SEMI-DRY TRANSFER CELL (BIO- RAD Laboratories)を用いて 20 voltsにて 45分の条件で PVDF膜（ Hybond-P, Amersham Biosciences)に転写した。ウェスタンブロッテイングは
ECL+plus Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences)を用 ヽてマ二 ュアルの方法に従い行った。但し、ブロッキング試薬には ECL-Advance blocking agent (Amersham Biosciences)を 2 %濃度で用いた。 1次抗体として前述のゥサギより 得られたポリクローナル抗体 (4.1 mg/ml IgG)を 1000倍希釈にて、また 2次抗体として 饥.ゥサ Ig, horseradish peroxide linked whole antibody (ロノく由来 J (Amersham Biosciences)を 3000倍希釈にて使用し、抗 NKIRポリクローナル抗体に対して交叉する 分子種を確認した。
[0173] その結果、大腸菌で発現した NKIR蛋白をゥサギに免疫して得られたポリクローナル 抗体に交叉するおよそ 60kDaの分子量を有するタンパク質が NK-92株で発現してい ることが示された（図 4)。
[0174] さらに、本 NKIR分子力 細胞表面に発現していることを確認するために、抗 NKIR ポリクローナル抗体を用いた NK- 92株のフローサイトメトリー解析を行った。
[0175] 5 X 105細胞を 100 μ 1の FACSバッファー (2.5 %ゥシ胎仔血清、 0.02 % NaN inリン酸
3 緩衝生理食塩水）に懸濁後、終濃度 82 g/mlになるように抗 NKIRポリクローナル抗 体を添加した。ネガティブコントロールとして同濃度のゥサギ精製 IgGを添加した細胞 も調製した。氷上 1時間静置後、低速遠心 (300 X g, 5 min.)にて細胞を回収し、 FACSバッファ一にて洗浄して再度低速遠心にて細胞を回収した。次にャギ由来 FITCコンジユゲート抗ゥサギ IgG抗体（Beckman Coulter)を終濃度 14 g/mlで含む FACSバッファ一にて回収した細胞を懸濁後、氷上にて 30分静置した。低速遠心での 細胞回収、並びに FACSバッファーによる洗浄を行った後 500 μ 1の FACSバッファーに 懸濁してフローサイトメトリー解析（Beckman Coulter, EPICS)を行った。結果、本 NKIR分子が細胞表面に発現して 、ることが示された（図 5)。
[0176] 〔実施例 4〕 NK-92株由来 cDNAを用いた RACE法による NKIR遺伝子の全長クロー ユング
NK-92株より調製した全 RNAを用いて 5し並びに 3'- RACE法により再度 NKIR遺伝 子の全長クロー-ングを行った。
[0177] 実施例 3に記載の方法で培養された 5.4 x 107の NK-92細胞より全 RNAを RNeasy( QIAGEN)キットを用いて調製し、 377.7 /z gの全 RNAを得た。このように調製した 1 μ g の RNAを铸型として、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)を使用して 5'- RACE並びに 3'- RACEを行った。遺伝子特異的なプライマーとして、 5'- RACEで は NKIR08を、 3'-RACEでは NKIR07を用いた。両反応共に 1次 PCR反応にておよそ 1.3 kb長の主要増幅産物が得られたため、本増幅断片をァガロースゲルより切り出し QIAquick (QIAGEN)キットを用いて精製後、 pCR2.1- TOPO (Invitrogen)へクロー- ングした。生じた TOP10F'由来の形質転換株各 8株を 2 mlの 0.1 mg/mlアンピシリンを 含む LB培地にて培養し、培養大腸菌よりプラスミドを QIAprepキット（QIAGEN)を用い て調製し配列を決定した。その結果、 5'_RACE反応からは、これまで確定していた配 列以外に 5'末端に 36塩基長!、挿入を有する cDNA配列が得られ、 pTOPONKIR626と して以後の検討に用いた。また、 3'-RACEからはおよそ 500塩基下流に伸長している cDNAクローン、 pTOPONKIR620が得られた。この塩基配列を配列番号： 3として、ま た該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号: 4として配 列表中に示す。該配列がヒトゲノム上 1番染色体の NKIR領域に確認された。
[0178] そこで、 5'端の 36塩基の挿入配列に着目して、実施例 1で割り当てた配列と新たに 単離した配列とをそれぞれ有する発現ベクターを、ベクター骨格として pCOSlを用い て構築し COS-7細胞に一過性発現させた。
[0179] pGEM-TE NK1を铸型にして NKIR09 (
5 -GAATTCACACACCCACAGGACCTGCA - 3'/配列番号： 32)及び NKIR10 ( 5 -GGATCCACTGAAGGACCCACAGAAAG - 3'Z配列番号： 33)プライマーを共 に 0.2 μ Μ用いて PCRを行った。 PCRキットは HF polymerase kit (Clontech)を用いて 行い、反応条件として 94°Cで 30秒の変性の後、 94°C、 15秒 + 55。C、 30秒 + 72 °C 、 1分のサイクルを 25サイクルの後、 72°Cで 5分の伸長反応を行った。反応液をァガロ ースゲル電気泳動に供し、生じた 1.5 kb断片を QIAquick Gel Extraction kit
(QIAGEN)を用いて精製した後 pCR2.1- TOPO (Invitrogen)へクロー-ングし大腸菌 株 TOP10F'を形質転換した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドを QIAprep miniprep kit (QIAGEN)を用いて調製し配列解析を行った。 PCRエラーのないクロー ン、 pTOPONKIR219を以後の検討に選択した。
[0180] 次に 5 μ gの pTOPONKIR219並びに 1.15 μ gの pBluescript IISK+ (Stratagene)を各 々 20unitsの EcoRI並びに BamHIにて 37°C、 1時間消化した後ァガロースゲル電気泳 動に供しそれぞれ生じた 1.5 kb及び 3.0 kbの断片を QIAquick Gel Extraction kit ( QIAGEN)を使用して精製した後 40 μ 1の溶出液の内それぞれ 1 μ 1を LigaFAST Ligation kit (Promega)を用いてライゲートし、大腸菌株 TOPI OF'を形質転換した。生 じたアンピシリン耐性株よりプラスミドを QIAprep miniprep kit (QIAGEN)を用いて調 製し、 Pstl消化により制限チェックし 1.3 kb長の消化断片が観察されたクローン、 PBSNKIR224を以後の検討に用いた。続、て pBSNKIR224及び pTOPONKIR626の BstPl並びに Bglll二重消化から生じたそれぞれ 4 kb及び 0.4 kb断片をァガロースゲ ル電気泳動により単離し QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)により精製した後 LigaFAST Ligation kit (Promega)を用いてライゲートし大腸菌株 DH5 aを形質転換 した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドを QIAprep miniprep kit (QIAGEN)を用 いて調製し、配列解析を行い、 5'端に 36 bp挿入が認められたクローン、
PBSNKIR1 11605を以後の検討に使用した。
[0181] 最後に、 pBSNKIR224並びに pBSNKIRlU1605由来の 1.4 kb長 EcoRI - Notl断片を pCOSlの EcoRI - Notlサイトに挿入し、それぞれ発現ベクター pCOSNKIR610及び PCOSNKIR1 11610を作成した。両プラスミドを供与 DNAとして MIRUS TransIT-LTl (PanVera)を用いたリボフヱクシヨン法にて製造者の指示に従 、COS_7細胞に形質導 入を行い 2日間培養した後、トリプシン/ EDTA溶液（Invitrogen)を用いて細胞を剥離 後 10 %ゥシ胎仔血清（Invitrogen)含有 DMEM培地（Invitrogen)にて細胞を 2回洗浄 し、実施例 3に記載された方法と同一の手順でフローサイトメトリー解析を行った。
[0182] 結果、 NK-92より単離された 5'端に 36塩基の挿入を有する配列を持つ NKIR発現プ ラスミドでトランスフエクシヨンを行った場合でのみ、 FITC検出でシフトする細胞画分 が認められたことから、 36塩基の挿入を有するクローンが分泌型として機能することが 示された（図 6)。
[0183] 〔実施例 5〕 マウス NKIR配列のクローニング
ヒト NKIRアミノ酸配列を queryにしたマウスゲノム配列に対する blast検索 (tblastn)を 行い、全長配列にわたってヒットする一番染色体領域を同定した（図 7)。このマウス 染色体領域はヒト NKIRがマップされるヒト染色体領域と染色体構造上もマッチする領 域である。 [0184] 予想翻訳領域に基づきプライマー（mNKIRfl (5'-
CTCAGTAAAGGCAGAGTGGAGTACC- 3'/配列番号： 34) mNKIRrl (5'- ATACATTAGAACCACAGCCGCAATG- 3'/配列番号： 35) )を設計し、マウス脾臓 cDNAライブラリーより PCR増幅を行い、遺伝子をクローユングした。その配列確認を 行った結果、スプライシングを受けた転写物の存在を同定できた。
[0185] マウス脾臓 Marathon- Ready cDNA 10 6。11)を铸型に5'-1¾^^^, 3'- RACE PCRは 以下の反応条件で行った。
1回目：铸型： Marathon Ready cDNA, 2.5 μ 1
プライマー：
API (5 -CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC -3'/配列番号： 36) mNKIRfl for 3' RACE
APl^mNKIRrl for 5'RACE
2回目：铸型： 1回目 PCR産物を 30倍希釈したもの， 2.5 ^ 1
プライマー：
AP2 (5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC- 3'/配列番号： 37) mNKIRf3 (5'- じ1^ 〇 〇丁1^^じじ丁丁〇〇丁丁〇1^1^-3'/配列番号：38) 1^ 3' RACE
AP2^mNKIRr3 (5'- GCCAGATAGTTAGCATGTTGCTCTTG- 3'/配列番号： 39) for 5' RACE
1回目 PCR
反応条件: 94°Cで 1分
94°Cで 10秒、 68°Cで 3分、 35サイクル
2回目 PCR
反応条件: 94°Cで 1分
94°Cで 10秒、 68°Cで 3分、 20サイクル
[0186] TaKaRa LA Taq (TAKARA)を用いて（バッファー、 dNTPs, MgClは添付）製造者の
2
指示に従い反応液を調製して PCRを行った。 2回目 PCRの PCR産物をァガロースゲル 電気泳動し、増幅されたバンドを切り出した。 QIAquick Gel Extraction Kitで精製した 後、 pGEM T-Easy Vectorに挿入した。 DH5 aを形質転換し、得られたクローンよりプ ラスミドを調製して塩基配列を決定した。
[0187] その結果、 268アミノ酸力もなる膜タンパク質と予想された。得られたクローンの塩基 配列を配列番号： 5として、また該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸 配列を配列番号： 6として配列表中に示す。ヒト-マウス配列の比較（図 8)では、マウス 配列はヒトの配列と比べ、 N末端、 C末端ともに切り詰めた構造をもっているが、ひとつ の N型糖鎖付加部位、ひとつの ITIMモチーフ、膜貫通ドメイン、二つの Ig様ドメインを 相当する領域に保持して ヽた。
[0188] Prosite, Pfam, Psort等によるモチーフ検索の結果より、以下のような配列上の特徴 を検出した。
N型糖鎖付カ卩部位 (NfP][ST]rP]) 180： NYSC, 188： NISR
ITIMモチーフ（Yxx[VL]) 259:YANV
Ig様ドメイン 33-89, 128-185
膜貫通ドメイン 221 - 237
[0189] 〔実施例 6〕 2KIR3DLのクローニング
ITIM活性の検出アツセィ系は T細胞を受容細胞として用いた NFATカスケード制御 下のルシフェラーゼ活性を測定する方法を改変して実施した（Fry AM, Lanier LL,
Weiss A" J Exp Med. (1996), 184, 295-300)。
[0190] ヒト脾臓 cDNAライブラリーを用いて既知の KIR遺伝子である 2KIR3DLをクロー-ング した。以下の反応条件で PCRを行った。
録型： Human Spleen Marathon-Ready cDNA (Clontech)
プライマー： P58KIR01 (5'- GAATTCATGTCGCTCATGGTCGTCAG - 3'Z配列番 号： 40) p58KIR02 (5'- GGATCCTCAGGGCTCAGCATTTGGAA -3'/配列番 号: 41)
反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 15秒、 52°Cで 30秒、 72°Cで 1分、 30サイクル
72°Cで 5分
[0191] HF polymerase(Clontech)を用いて PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて 1 kb長の断片を分離後 QIAquick(QIAGEN)にて精製した。精製産物を pCR2.1- TOPO にクロー-ングして大腸菌 TOP10F'を形質転換した。 QIAprep(QIAGEN)キットを用い て形質転 ·よりプラスミドを調製し PCRエラーのな ヽ配列を有するクローン（ PTOPO58KIR303)を選択し更なる検討に用いた。
[0192] 〔実施例 7〕 インフレームフュージョンの構築
上記実施例 6で得られた 2KIRDL3の細胞外ドメインと NKIRの細胞質内 ITIMモチー フとのインフレームフュージョンを以下の手順で構築した。
[0193] まず以下の反応条件でフュージョン PCRを行つた。
1回目 PCR A
铸型： PTOPO58KIR303
プライマー： P58KIR01 p58NKIR04 (5，-
2)
1回目 PCR B
铸型： PBSNKIR224
プライマー： P58KIR03 (5'-
3) T3+ (5，- GCAATTAACCCTCACTAAAGGGAAC - 3'Ζ配列番号： 44) 反応条件は共に下記記載の条件で行った。
94。Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 45秒、 30サイクル
72°Cで 2分
[0194] HF polymerase(Clontech)を用いて PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて
PCR Aより 0.8 kb長の断片、 PCR Bより 0.4 kb長の断片を分離後 QIAquick(QIAGEN) にて精製した。精製産物 50 1の内それぞれ 10 1を下記に示す 2回目 PCRの铸型と して用いた。
铸型:上記反応産物各 10 1
反応条件は下記記載の条件で行った。
94°Cで 30秒 94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 90秒、 15サイクル
[0195] 反応後、反応液 50 μ 1に最終濃度 1 μ Μの下記に記すテンプレートを添加した。
プライマー： P58KIR01 Τ3+
反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72で 2分、 35サイクル
72°Cで 4分
[0196] ァガロースゲル電気泳動にて 1.2 kb長の断片を分離後 QIAquick(QIAGEN)にて精 製した。 pCR2.1-TOPOにクローユングして大腸菌 TOP10F'を形質転換した。
QIAprep(QIAGEN)キットを用いて形質転^ ¾よりプラスミドを調製し PCRエラーのな V、配列を有するクローン (pBSKIR58NKIR314)を選択し更なる検討に用いた。
[0197] 次に 1 μ gの pCXND3並びに pBSKIR58NKIR314を各々 20 unitsの EcoRI並びに Notl にて 37°C、 1時間消化した後、ァガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ生じた 7.8 kb及び 1.2 kbの断片を QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)を使用して精製した後 、 40 μ 1の溶出液の内それぞれ 1 μ 1を LigaFAST Ligation kit (Promega)を用いてライ ゲートし、大腸菌株 DH5 aを形質転換した。生じたアンピシリン耐性株をピックアップ し P58KIR01そして p58NKIR10プライマーを各々 0.5 μ Μずつ用いてコロニー PCRを行 つた。この際 PCRポリメラーゼとして Premix ExTaq (Takara)を用い、反応条件は 94°C で 5分の変性の後、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 90秒の反応を 35サイクル行つ た。生じた反応産物の 1/5量をァガロースゲル電気泳動に供して 1.3 kb長の PCR断片 が観察されたクローン PCXND3KIR58NKIR313を以後の検討に用いた。
[0198] 〔実施例 8〕 安定形質導入株取得
上記実施例 7で得られた pCXND3KIR58NKIR313を供与 DNAとして用いて、 T細胞 株である Jurkat株カゝら安定形質導入株候補株である ChimeraAlO株を取得した。取得 手順を以下に記す。
[0199] pCXND3KIR58NKIR313を供与 DNA、 Jurkat株を受容細胞に用いてエレクトロボレ ーシヨン法による形質導入を行った。 20 μ gの供与 DNAは予め 20 unitsの PvuII (Takara)にて 37°Cで 1時間消化し、クロ口ホルムフエノール処理に続!、てエタノール沈 殿した後 20 1の滅菌水に溶解した。受容細胞としては 10%FBS含有 RPMI1640培地 にて ϋ代した Jurkat細胞を Potassium- Based Phosphate buffered saline (K- PBS)にて 洗浄後 107細胞 I ml K-PBSの細胞懸濁液 0.8 mlを調製した。エレクト口ポレーシヨン には Gene Pulsar II (Bio- Rad)を使用しパルス条件は 0.3 kV、 950 μ FDで行った。ノ ルス負荷後 48 mlの継代培地に懸濁し選択圧のない条件で終夜培養した後、最終濃 度 g/mlの Geneticin (Invitrogen)による選択圧をかけ、安定形質導入株候補株 である ChimeraAlO株を取得した。一次抗体として GL183モノクローナル抗体（ Beckman Coulter)及び二次抗体として FITCコンジユゲート抗ゥサギ IgG抗体（ Beckman Coulter)を用いる以外は、実施例 3に記載された方法と同様の手順でフロ 一サイトメトリー解析を行った。
[0200] その結果、 FITC染色された細胞画分が認められ、 ChimeraAlO株において上記融 合タンパク質が発現して 、ることが示された（図 9)。
[0201] 〔実施例 9〕 二重形質導入株の作成
上記実施例 8で得られた ChimeraAlO株を受容細胞にして、ルシフェラーゼレポータ 一プラスミド pNFATlucZEOR324を形質導入して、二重形質導入株を取得した。
pNFATlucZEOR324は以下のようにして構築した。
[0202] Mercury Pathway Profiling Luciferase system 2 (Clontech)に含まれるノレシフェラー ゼレポーター遺伝子 pNFAT- TA- Luc 2.5 μ gを 20 unitsの Accl (Takara)で、また dam- 株である SCS- 110株（Stratagene)より調製した 5 μ gの pCOSIIZEOを 20 unitsの Clal (Takara)にて 37°Cで 1時間消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。それぞれ 5 kb 、 2.2 kb長の消化断片を Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて精製し、
pNFAT-TA- Luc由来の断片は Calf intestine alkaline phosphatase処理を 37°Cにて 30 分行った後に、 QIAquick nucleotide removal kit (QIAGEN)を用いて精製した。両断 片を LigaFAST Ligation kit (Promega)を用いてライゲートし大腸菌株 DH5 aを形質転 換した。生じたアンピシリン耐性株よりプラスミドを QIAprep miniprep kit (QIAGEN)を 用いて調製し EcoRI及び Sail二重消化により制限チェックし、 4.15 kb及び 3.15 kb長の 消化断片が観察されたクローンを正向き挿入クローン pNFATlucZEOF324として、ま た 5.15 kb及び 2.15 kb長の消化断片が観察されたクローンを逆向き挿入クローン pNFATlucZEOR324として以後の検討に用いた。 [0203] その pNFATlucZEOR324を供与 DNA、 chimeraAlO株を受容細胞に用いて、エレクト 口ポレーシヨン法による形質導入を行った。 20 μ gの供与 DNAは予め 20 unitsの PvuII (Takara)にて 37°Cで 1時間消化した後、クロ口ホルムフエノール処理に続!、てエタノー ル沈殿した後に 20 1の滅菌水に溶解した。受容細胞としては 10 %FBS及び 400 g/ml geneticin含有 RPMI 1640培地にて継代した chimeraAlO細胞を Potassium- Based Phosphate buffered saline (K- PBS)にて洗浄後 107細胞 I ml K-PBSの細胞懸濁液 0.8 mlを調製した。エレクト口ポレーシヨンには Gene Pulsar II (Bio- Rad)を使用し、ノ ルス条件は 0.3 kV、 950 μ FDで行った。パルス負荷後 48 mlの 400 μ g/ml geneticin含 有継代培地に懸濁し選択圧のない条件で終夜培養後に、最終濃度 100 g/mlの zeocin (Invitrogen)による選択圧をかけ、安定形質導入株候補株を取得した。得られ た Zeocin而性株よりゲノム DNAを DNeasy Tissue Kit (QIAGEN)を用いて調製した。最 終溶出液 0.4 mlの内、 5 1を铸型に用いて PCR反応を行った。 PCRポリメラーゼとして Premix ExTaqゝプライマーには LucOl (5'- TTCATACAGAAGGCGTGGAG -3'/配 列番号： 45)と Luc02 (5，- CGTTCGCGGGCGCAACTGCA - 3'Z配列番号： 46)を 用い、反応条件は 94°Cで 5分の変性の後、 94°Cで 15秒， 55°Cで 30秒， 72°Cで 45秒 の反応を 25サイクル行った後に、 72°Cで 5分の伸長反応を加えた。ァガロースゲル電 気泳動にて 0.5 kb長の PCR断片を生じるクローンを選択し、ルシフェラーゼ活性検出 による最終スクリーニングを行った。
[0204] ルシフェラーゼアツセィは chimeraAlO細胞株より得られた pNFATlucZEOR324の安 定形質導入候補株を 6.7 X 104細胞 I mlの濃度で 400 g/ml geneticin及び 100 g/ml zeocin含有継代培地に懸濁後、抗ヒト CD3コーティングマイクロプレート（ Beckton Dickinson)そして通常のィムノマイクロプレート中に 75 μ 1 / wellで播種し実 施した。 37°Cにて 20時間培養後、同量（75 1)の Dua卜 Glo Luciferase Buffer (Promega)を添カ卩し 10分静置した後に化学発光をルミノメーター MicroLumat LB96P (EG&G Berthold)にて各ゥエルあたり 5秒間測定した。
抗ヒト CD3コーティングマイクロプレート培養下でのみ強い化学発光を示す株 chimeraA10ZEOR12株を安定形質導入株として選択した。また本株に対して上記の 方法と同一の手順でフローサイトメトリー解析を行った。 [0205] その結果、 ChimeraAlO株にお!、て発現して!/、た融合タンパク質発現を保持して！/ヽ ることを示した（図 9)。
[0206] 〔実施例 11〕 NKIR由来の ITIM活性測定
chimeraA10ZEOR12株を用いて NKIR由来の ITIMモチーフの機能評価を行った。方 法を以下に示す。
[0207] chimeraA10ZEOR12株を 400 μ g/ml geneticin及び 100 μ g/ml zeocin含有継代培地 に 5 X 105細胞 I mlの濃度で懸濁し、抗ヒト CD3コーティングマイクロプレート（Beckton Dickinson)に各ゥエルあたり 100 1ずつ播種した。 37°Cにて 6時間培養後、終濃度 1 μ g/mlの GL183抗体（Beckman Coulter)を添カ卩し 37°Cにて終夜培養を行った。次に 400 g/ml geneticin及び 100 g/ml zeocin含有継代培地にて 2回洗浄後、ラット由来 抗マウス IgG抗体をそれぞれ 0、 2、 10 g/mlの濃度で含有する培地 100 1に洗浄細 胞を懸濁後実施例 10に記載の方法と同様の手順にてルシフェラーゼ活性を測定し た。
[0208] その結果、ラット由来抗マウス IgG抗体でクロスリンクすることによりルシフェラーゼ活 性を 3例の平均で 33.3 %阻害することが示され（図 10)、 NKIR分子の細胞質内ドメイン に見出される ITIMモチーフが ITIM活性を有することが示された。
[0209] 〔実施例 12〕 CD8 a鎖のクローユング
ITIM活性の機能アツセィ系は実施例 6と同様、 T細胞を受容細胞として用いた NFATカスケード制御下のルシフェラーゼ活性を測定する方法を改変して実施した（ Fry AM, Lanier LL, Weiss A., J Exp Med. (1996), 184, 295-300)。
[0210] resting CD8+ Marathon cDNA library (Clontech)を铸型にして既知の CD8 a鎖遺 伝子をクローユングした。以下の反応条件で PCRを行った。
プライマー： CD01 (5，- GAATTCATGGCCTTACCAGTGACCGC - 3，Z配列番号： 47) CD02 (5 ' - GGATCCTTAGACGTATCTCGCCGAAA -3 ' Z配列番号： 48) 反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 15秒、 50°Cで 30秒、 72°Cで 30秒、 30サイクル
72°Cで 4分
[0211] GC polymerase (宝酒造）を用いて PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて 0.7 kb長の断片を分離後 QIAquick (QIAGEN)にて精製した。精製産物を pCR2.1- TOPO にクロー-ングして大腸菌 TOP10F'を形質転換した。 QIAprep (QIAGEN)キットを用 V、て形質転赚よりプラスミドを調製し PCRエラーのな 、配列を有するクローン（ pCD81ull0113)を選択し更なる検討に用いた。
[0212] 〔実施例 13〕 CD8-NKIRフュージョンタンパク質発現ベクターの構築
上記実施例 12で得られた CD8 a鎖の細胞外ドメインと NKIRの細胞質内 ITIMモチ ーフとのフュージョンタンパク質発現ベクターを以下の手順で構築した。
[0213] まず以下の反応条件でフュージョン PCRを行つた。
1回目 PCR A
铸型： pCD8foll0113
プライマー： CD03 (5， - GAATTCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC - 3，Z配 列番号： 49) CDNKIR12 (5 ' -
50)
1回目 PCR B
铸型： PBSNKIR224
プライマー： CDNKIR11 (5 ' -
: 51) (配列番号： 44)
反応条件は共に下記記載の条件で行った。
94。Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分、 30サイクル
72°Cで 4分
[0214] GC polymerase (宝酒造）を用いて PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて PCR
Aより 0.5 kb長の断片、 PCR Bより 0.6 kb長の断片を分離後 QIAquick (QIAGEN)にて 精製した。精製産物 50 μ 1の内それぞれ 10 μ 1を下記に示す 2回目 PCRの铸型として 用いた。
铸型：上記 PCR Α及び PCR B反応産物各 10 μ 1 反応条件は下記記載の条件で行った。
94。Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 90秒、 15サイクル
[0215] 反応後、反応液 50 μ 1に最終濃度 1 μ Μの下記に記すプライマーを添加した。
プライマー： CD03 T3+
反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72で 30秒、 35サイクル
72°Cで 4分
[0216] ァガロースゲル電気泳動にて 1.1 kb長の断片を分離後 QIAquick (QIAGEN)にて精 製した。 pCR2.1-TOPOにクローユングして大腸菌 TOP10F'を形質転換した。
QIAprep (QIAGEN)キットを用いて形質転^ ¾よりプラスミドを調製し PCRエラーのな V、配列を有するクローン (pTOPOCD8NKIRfoll)を選択し更なる検討に用いた。
[0217] 次に 1 μ gの pCXND3並びに pTOPOCD8NKIRfollを各々 20 unitsの EcoRI並びに
Notlにて 37°C、 1時間消化した後、ァガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ生じた 7.8 kb及び 1.1 kbの断片を QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)を使用して精製し た後、 40 μ 1の溶出液の内それぞれ 1 μ 1を LigaFAST Ligation kit (Promega)を用いて ライゲートし、大腸菌株 DH5ひを形質転換した。生じたアンピシリン耐性株をピックァ ップし正しい 1.1 kb長の挿入が観察されたクローン pCXND3CD8NKIRfollを以後の検 討に用いた。
[0218] 〔実施例 14〕 CD8-KIRフュージョンタンパク質発現ベクターの構築
上記実施例 12で得られた CD8 a鎖の細胞外ドメインと KIRの細胞質内 ITIMモチー フとのフュージョンタンパク質発現ベクターを以下の手順で構築した。本コンストラクト は ITIM機能アツセィのポジティブコントロールとして用いられる。
[0219] まず以下の反応条件でフュージョン PCRを行つた。
1回目 PCR A
铸型： pCD8foll0113
プライマー： CD03 (配列番号： 49) CDKIR12 (5， - 2)
1回目 PCR B
铸型： PBSKIR306
プライマー： CDKIR11 (5，-
： 53) (配列番号： 44)
反応条件は共に下記記載の条件で行った。
94。Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分、 30サイクル
72°Cで 4分
[0220] GC polymerase (宝酒造）を用いて PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて PCR
Aより 0.5 kb長の断片、 PCR Bより 0.4 kb長の断片を分離後 QIAquick (QIAGEN)にて 精製した。精製産物 50 μ 1の内それぞれ 10 μ 1を下記に示す 2回目 PCRの铸型として 用いた。
铸型：上記 PCR Α及び PCR B反応産物各 10 μ 1
反応条件は下記記載の条件で行った。
94°Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 90秒、 15サイクル
[0221] 反応後、反応液 50 μ 1に最終濃度 1 μ Μの下記に記すプライマーを添加した。
プライマー： CD03
反応条件: 94°Cで 30秒
94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒、 35サイクル
72°Cで 4分
[0222] ァガロースゲル電気泳動にて 0.9 kb長の断片を分離後 QIAquick(QIAGEN)にて精 製した。 pCR2.1-TOPOにクローユングして大腸菌 TOP10F'を形質転換した。
QIAprep (QIAGEN)キットを用いて形質転^ ¾よりプラスミドを調製し PCRエラーのな V、配列を有するクローンの 0.9 kb長の EcoRI- Notl挿入断片を pCXND3の EcoRI- Notl に挿入し PCXND3CD8KIR1U11を得て以後の検討に用いた。 [0223] 〔実施例 15〕 NFAT-ルシフェラーゼレポーター安定発現細胞株の榭立 実施例 9で得られた Luciferaseレポータープラスミドである pNFATlucZEOF324を供 与 DNAに、そして Jurkat株を受容細胞に用いてエレクト口ポレーシヨン法による形質 導入を行った。 20 μ gの供与 DNAは予め 20 unitsの PvuII (Takara)にて 37°Cで 1時間 消化した後、クロ口ホルムフエノール処理に続いてエタノール沈殿した後に 20 1の滅 菌水に溶解した。受容細胞としては 10 %FBS含有 RPMI1640培地にて継代した Jurkat 細胞を Potassium- Based Phosphate buffered saline (K- PBS)にて洗浄後 107細胞 I ml K-PBSの細胞懸濁液 0.8 mlを調製した。エレクト口ポレーシヨンには Gene Pulsar II (Bio-Rad)を使用し、パルス条件は 0.3 kV、 950 μ FDで行った。パルス負荷後 48 ml の継代培地に懸濁し選択圧のない条件で終夜培養後に、最終濃度 100 /z g/mlの zeocin (lnvitrogen)による選択圧をかけ、安定形質導入株候補株を取得した。得られ た Zeocin而性株よりゲノム DNAを DNeasy Tissue Kit (QIAGEN)を用いて調製した。最 終溶出液 0.4 mlの内、 5 1を铸型に用いて PCR反応を行った。 PCRポリメラーゼとして Premix ExTaqゝプライマーには LucOl (5'- TTCATACAGAAGGCGTGGAG -3'/配 列番号： 45)と Luc02 (5，- CGTTCGCGGGCGCAACTGCA - 3'Z配列番号： 46)を 用い、反応条件は 94°Cで 5分の変性の後、 94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 45秒の 反応を 25サイクル行った後に、 72°Cで 5分の伸長反応をカ卩えた。ァガロースゲル電気 泳動にて 0.5 kb長の PCR断片を生じるクローンを選択し、ルシフェラーゼ活性検出に よる最終スクリーニングを行った。
[0224] ルシフェラーゼアツセィは Jurkat細胞株より得られた pNFATlucZEOF324の安定形 質導入候補株を 6.7 X 104細胞 I mlの濃度で 100 /z g/ml zeodn含有継代培地に懸濁 後、抗ヒト CD3コーティングマイクロプレート（Beckton Dickinson)そして通常のィムノ マイクロプレート中に 75 μ 1 1 wellで播種し実施した。 37°Cにて 20時間培養後、同量（ 75 μ 1)の Dua卜 Glo Luciferase Reagent (Promega)を添カ卩し 10分静置した後に化学発 光をルミノメーター MicroLumat LB96P(EG&G Berthold)にて各ゥエルあたり 5秒間測 し 7こ。
抗ヒト CD3コーティングマイクロプレート培養下でのみ強い化学発光を示す F11株を 安定形質導入株として選択した。 [0225] 〔実施例 16〕 二重形質導入株の作成
上記実施例 15で得られた Fl 1株を受容細胞にして、上記実施例 13で得られた CD8-NKIRフュージョン、 pCXND3CD8NKIRfoll及び上記実施例 14で得られた CD8-KIRフュージョン、 pCXND3CD8KIRfollを形質導入して、二重形質導入株を取 得した。
[0226] pCXND3CD8NKIRfollそして pCXND3CD8KIRfoll各 20 μ gを 20 unitsの Pvul (宝酒造 )を用いて 37°Cにて 2時間消化したものを等量のフエノールクロ口ホルム（50% (v/v)、 ナカライテスタ）にて精製し 1/10量の 3 M酢酸ナトリウム（ナカライテスタ）と 2倍量の Ethanol (ナカライテスタ）を用いて沈殿後、風乾したサンプルを 20 μ 1の滅菌水に溶解 したものを使用した。 Electroporation及びそれに続く樹立の際の手順は継代培地とし ては 100 /z g/ml濃度の zeocinと 10% (v/v)非働化した仔牛血清及び 1% (v/v) Penicilin 及び Streptomycin溶液を含有する RPMI 1640培地を使用し、選択薬剤として geneticin 700 g/ml濃度で実施した以外は実施例 9と同一の条件で実施した。得ら れた単コロニー由来の薬剤而す性クローンを抗 CD8- FITC抗体（Becton Dickinson)を 使用して FACS解析を行うことにより発現クローンを各々 6— 8クローン選択した。
[0227] これら形質導入株について実施例 15に記載されたレポーター活性測定により、レ ポーター活性を保持した CD8キメラクローンを最終的に 3クローン（
PCXND3CD8NKIR1U11の形質導入株として NKIR#16及び NKIR#19、
pCXND3CD8KIRfollの形質導入株として KIR#24)を選択した。これら 3クローンの CD8 キメラの構造を図 11—1に示す。図 11— 2には実施例 17で使用する抗 CD8抗体、 LT8 (Serotec)とャギ抗マウス IgG- FITCコンジュゲート抗体（Coulter)を用いたこれらクロ ーンの FACS解析の結果を示す。 CD8キメラクローンは 3株とも LT8特異的な染色が観 察された。
[0228] 〔実施例 17〕 NKIR由来の ITIM活性測定
実施例 16で得られた二重形質導入株 NKIR#16、 NKIR#19及び KIR#24とその宿主 である F11株を用いてルシフェラーゼレポーターアツセィを実施し NKIR由来の ITIM活 性測定を行った。
[0229] 宿主 Fl 1株を継代培地（100 μ g/ml濃度の zeocinと 10% (v/v)非働化した仔牛血清 及び 1% (v/v) Penicilin及び Streptomycin溶液を含有する RPMI 1640培地）にて生育さ せた。 CD8キメラクローンは 700 g/ml濃度の genetidnを含有する上記培地で生育さ せた。それぞれの増殖培地にて 5.33 X 105 cells/mlに懸濁後、 37.5 μ 1ずつを Flat bottom 96-well plateに分注し 37°Cにて 16時間培養した。一次抗体として 6 μ g/mlに それぞれの増殖培地にて希釈した抗 CD8抗体（LT8, Serotec, MCA1226XZ)を 12.5 μ 1 (終濃度 1.5 μ g/ml)ずつ添加した。対照群には抗体を含まな 、各増殖培地を加 えた。 37°Cにて 1時間培養後、クロスリンカ一として 6 g/mlにそれぞれの増殖培地に て希釈したゥサギ抗マウス IgGl抗体（H143.225.8, Southern Biotech, 1145- 01)を 12.5 1 (終濃度 1.2 g/ml)ずつ添加した。対照群には抗体を含まない各増殖培地を 加えた。 37°Cにて 1時間培養後、 240 g/mlに各増殖培地にて希釈した ConA( SIGMA)を 12.5 μ 1 (終濃度 40 μ g/ml)ずつ添カ卩した。 37°Cにて 8時間及び 10時間培 養後、等量（75 μ 1)の luciferase reagent (Promega)を加え室温にて 10分静置した後発 光を実施例 15で記載されたように測定した。
レポーターアツセィの結果を図 12に示す。アツセィは全て三連にて実施し平均値を 棒グラフ表示で示し、 SD値をエラーバーとして記載した。 ConA刺激後 8時間と 10時間 との比較においては 10時間時点での結果がより効果の高い結果を示していた力 概 ね同傾向を示していたことから、下記では 10時間後の結果について詳細に記述する 。宿主の F11については、 LT8抗体或いはクロスリンカ一の存在下、非存在下に関わ らずほぼ一定の活性値を示した。これに対しポジティブコントロールクローンである CD8-KIR1 11形質導入 CD8キメラクローン KIR#24の活性については LT8存在下では 活性の減弱化が観察され、本活性減弱化はクロスリンカ一の影響は受けな 、と 、つ た想定されたパターンを示した。一方、 CD8-NKIR1 11形質導入 CD8キメラクローンは 2クローンとも LT8存在下では活性の減弱化が観察され、本活性減弱化はクロスリンカ 一の影響は受けな力つた。また、減弱化の程度はポジティブコントロールである CD-KIR transfectant #24が 16.6%なのに対して CD- NKIR transfectant #16、 #19はそ れぞれ 21.2%、 30.2%であったことから、 NKIR分子の細胞質内 ITIMモチーフを含む配 列が既知の KIR2DL3分子の細胞質内 ITIMと同程度以上の ITIM活性を有することが 示唆された。 産業上の利用可能性
本発明により、 NK細胞に発現する新規なタンパク質、該タンパク質をコードする DNA、該 DNAを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該タンパク質の製造方 法が提供された。さら〖こ、該タンパク質に結合する、あるいはその活性を調節する化 合物を同定する方法が提供された。本発明のタンパク質や DNA、または本発明のタ ンパク質に結合もしくはその活性を調節する化合物は、本発明のタンパク質が関連 する疾患の新 U、予防薬や治療薬の開発への利用が期待される。

Claims

請求の範囲
[1] 下記（a)—（d)のいずれかに記載の DNA。
(a)配列番号： 2、 4、または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質を コードする DNA
(b)配列番号： 1、 3、または 5のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含む DNA
(c)配列番号： 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複 数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるタン パク質であって、配列番号： 2、 4または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA
(d)配列番号： 1、 3、または 5のいずれかに記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DNA
[2] 配列番号： 2、 4、または 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質の断 片をコードする DNA。
[3] 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質。
[4] 請求項 1または 2に記載の DNAを含むベクター。
[5] 請求項 1もしくは 2に記載の DNA、または請求項 4に記載のベクターを保持する宿 主細胞。
[6] 請求項 5に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生 させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質の製造方法。
[7] 請求項 3に記載のタンパク質に結合する抗体。
[8] 以下の（a)および (b)の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質に対するリガンド の同定方法。
(a)請求項 3に記載のタンパク質または請求項 3に記載のタンパク質を発現して！/、る 細胞と候補ィ匕合物を接触させる工程
(b)候補ィ匕合物が請求項 3に記載のタンパク質または請求項 3に記載のタンパク質を 発現している細胞に結合するか否かを検出する工程
[9] 以下の（a)および (b)の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質に対するァゴ- ストの同定方法。
(a)請求項 3に記載のタンパク質を発現している細胞と候補ィ匕合物を接触させる工程
(b)候補ィ匕合物が請求項 3に記載のタンパク質の活性ィ匕の指標となるシグナルを発 生させるカゝ否かを検出する工程
[10] 以下の（a)および (b)の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質に対するアンタ ゴニストの同定方法。
(a)請求項 3に記載のタンパク質を発現している細胞と候補ィ匕合物を接触させる工程
(b)候補ィ匕合物の非存在下で検出した場合と比較して、請求項 3に記載のタンパク 質の活性ィ匕の指標となるシグナルが減少するか否かを検出する工程
[11] 請求項 8に記載の方法によって同定され得る、請求項 3に記載のタンパク質に対す るリガンド。
[12] 請求項 9に記載の方法により同定され得る、請求項 3に記載のタンパク質に対する ァゴニスト。
[13] 請求項 10に記載の方法により同定され得る、請求項 3に記載のタンパク質に対す るアンタゴニスト。
[14] 以下の（a)または (b)を少なくとも 1つ含む、請求項 8から 10のいずれかに記載の方 法に用いるためのキット。
(a)請求項 3に記載のタンパク質
(b)請求項 5に記載の宿主細胞
[15] 請求項 3に記載のタンパク質に対するァゴニストを有効成分として含有する、免疫 抑制剤。
[16] 請求項 3に記載のタンパク質に対するァゴニストを有効成分として含有する、アレル ギー ¾疾患または自己免疫疾患治療剤。
[17] 請求項 3に記載のタンパク質に対するアンタゴニストを有効成分として含有する、免 疫増強剤。
[18] 請求項 3に記載のタンパク質に対するアンタゴ-ストを有効成分として含有する、抗 腫瘍または抗ウィルス剤。
[19] 請求項 1または 2に記載の DNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオ チドの鎖長を有する DNA。
請求項 19に記載の DNA、または請求項 7に記載の抗体を含む、請求項 3に記載の タンパク質をコードする遺伝子の発現の異常または活性の異常に関連した疾患の検 查薬。
PCT/JP2004/014207 2003-09-29 2004-09-29 Nk細胞に発現するタンパク質 WO2005030955A1 (ja)

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