ES2283592T3

ES2283592T3 - Gen y proteina relacionados con el carcinoma hepatocelular.

Info

Publication number: ES2283592T3
Application number: ES02765617T
Authority: ES
Inventors: Yusuke Nakamura; Yoichi Furukawa
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2001-09-25
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2022-09-25
Also published as: JP4353798B2; WO2003027143A2; DE60218710T2; CN1628179A; US7767392B2; JP2005511023A; CN1628179B; US20040235018A1; US8148080B2; US20100248240A1; AU2002329061A1; EP1430152A2; WO2003027143A3; ATE356223T1; DE60218710D1; US20120149762A1; EP1430152B1

Abstract

Un complejo de activación de la trascripción que comprende una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y al menos un co-activador de la misma.

Description

Gen y proteína relacionados con el carcinoma hepatocelular.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un campo de las ciencias biológicas, más específicamente al campo de la investigación contra el cáncer. En concreto, la presente invención se refiere a una nueva proteína, ZNFN3A1, involucrada en el mecanismo de proliferación de células de carcinoma hepatocelular. Las proteínas de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, como moléculas diana para el desarrollo de fármacos contra el cáncer de hígado.

Antecedentes de la técnica

El carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo y su incidencia va aumentando gradualmente en Japón y en los Estados Unidos (Akriviadis EA, y col., Br J Surg. 1998 Octubre; 85 (10): 1319-31). Aunque los avances médicos recientes han logrado un enorme progreso en la diagnosis, un gran número de pacientes con HCC todavía son diagnosticados en etapas avanzadas y la cura completa de la enfermedad en estos casos sigue siendo difícil. Adicionalmente, puesto que los pacientes con cirrosis hepática o con hepatitis crónica presentan un elevado riesgo de HCC, pueden desarrollar múltiples tumores de hígado, o nuevos tumores incluso después de la eliminación completa de los tumores iniciales. Por tanto, el desarrollo de estrategias preventivas y de fármacos quimioterapéuticos altamente eficaces constituye un asunto de acuciante preocupación.

Los avances recientes en biología molecular sugieren que en la hepatocarcinogénesis subyacen procesos multi-etapa, al igual que en la génesis y en la progresión de los tumores de colon. Estos procesos implican alteraciones cualitativas y cuantitativas de diversos productos génicos. En una serie de subconjuntos de HCCs se han observado alteraciones genéticas en genes supresores de tumor, incluyendo el TP53 y el AXIN1, y en oncogenes tales como c-myc, cyclinD1 y s-catenin (Tanaka S, y col., Cancer Res. 1993 Junio 15; 53 (12): 2884-7; Satoh S, y col., Nat Genet. 2000 Marzo; 24 (3): 245-50). Se ha observado que se produce una frecuente pérdida de heterocigosidad (LOH) en las regiones cromosomales 4q, 6q, 8p, 8q, 9p, 9q, 13q, 16p, 16q y 17p, en células tumorales hepáticas (Feitelson MA, y col., Oncogene 2002 Abril 11; 21 (16): 2593-604). Además de estos cambios genéticos, la expresión alterada de una serie de genes tales como TGF \alpha desempeña un papel en la hepatocarcinogénesis (Lee GH, y col., Cancer Res 1992 Octubre 1; 52 (19): 5162-70).

Resumen de la invención

Los presentes inventores analizaron previamente la expresión de genes de todo el genoma en carcinomas hepatocelulares, e identificaron una serie de genes que parecían estar involucrados en la hepatocarcinogénesis. También describimos genes asociados al tipo de virus de hepatitis de los pacientes, al grado histológicos de los tumores y al estado de su invasión de vasos (Okabe H, y col., Cancer Res. 2001 Marzo 1; 61 (5): 2129-37). Aunque se ha identificado la desactivación de algunos genes supresores de tumor, tales como p53 y p161NK4A, hasta ahora no se demostrado que ningún oncogén conocido se active de forma común en el carcinoma hepatocelular.

La presente invención proporciona un gen aislado, ZNFN3A1, que es sobreexpresado en carcinomas hepatocelulares, y una oncoproteína que ha sido identificada con un dominio de dedo de zinc y un dominio SET. Frecuentemente, la expresión del gen, ZNFN3A1, está regulada al alza en HCCs, y parece conferir actividad oncogénica a las células cancerosas a través de un complejo de polimerasa 11 de ARN transactivante, que, a su vez, potencia la trascripción de genes diana, incluyendo EGFR. Por tanto, el ZNFN3A1 sirve como nueva diana molecular para HCCs.

La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos del ZNFN3A1 ha sido publicada previamente en el documento WO 00/44900 (Young y col.). La SEQ ID NO: 66 del documento WO 00/44900 (Young y col.) describe una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína ZNFN3A1. Se han presentado secuencias de ácido nucleico relacionadas en dos bases de datos de secuencias en línea, disponibles en http://www.ebi.ac.uk, números de acceso de la base de datos:

AK024733 y AL557360.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un complejo de activación de transacción involucrado en el mecanismo de proliferación de células de carcinoma hepatocelular, así como métodos para usar el mismo en la diagnosis de carcinoma hepatocelular (HCC).

Los inventores se fijaron como objetivo el descubrimiento de nuevas dianas de fármacos para el tratamiento de HCC. En consecuencia, analizaron perfiles de expresión de HCCs usando un microconjunto de cADN de todo el genoma. En la presente memoria se presenta la identificación de un nuevo gen humano ZNFN3A1 cuya expresión está marcadamente elevada en una gran mayoría de los HCCs en comparación con los correspondientes tejidos de hígado no cancerosos. El cADN de ZNFN3A1 consiste en 1622 nucleótidos que contienen un marco de lectura abierto de 1284 nucleótidos que codifican una proteína putativa de 428 aminoácidos con una estructura de dedo de zinc. De forma interesante, la localización subcelular de la proteína ZNFN3A1 se ve alterada durante la progresión del ciclo celular o debido a la densidad de células cultivadas; se acumula en el núcleo cuando las células están en la fase S media o tardía o se cultivan con poca densidad, mientras que se localiza en el citoplasma y en el núcleo cuando están en otras fases o se cultivan con elevada densidad. Adicionalmente, el ZNFN3A1 se asocia directamente a helicasa de ARN KIAA0054, y forma un complejo con polimerasa 11 de ARN, que activa la transcripción de genes posteriores, incluyendo el receptor de factor de crecimiento epidermal (EGFR) a través de la unión directa del complejo con un elemento de "(C)CCCTCC(T)" en la región lateral 5'. Consecuentemente, la expresión exógena de ZNFN3A1 en células N1H3T3 confirió un crecimiento celular aumentado, mientras que la supresión de su expresión con S-oligonucleótidos antisentido dio como resultado una significativa inhibición del crecimiento de las células de hepatoma. Estos descubrimientos sugieren que el ZNFN3A1 proporciona actividades oncogénicas a las células cancerosas mediante la activación transcripcional de genes diana, incluyendo EGFR, a través de un complejo con helicasa de ARN y polimerasa 11 de ARN, y que la inhibición de la actividad del complejo podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de HCC.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a proteínas ZNFN3A1 involucradas en la proliferación celular y a los genes que las codifican. La proteína ZNFN3A1 incluye preferiblemente la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. El gen ZNFN3A1 incluye una secuencia de polinucleótidos como la descrita en la SEQ ID NO: 1. Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente:

Un complejo de activación de transcripción que incluye una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y al menos un co-activador de la misma. En una realización, el co-activador puede ser una helicasa de ARN y/o una polimerasa de ARN. La helicasa de ARN puede ser helicasa de ARN KIAA0054. La polimerasa de ARN puede ser polimerasa 11 de ARN. En una forma, el complejo incluye la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, helicasa de ARN y polimerasa 11 de ARN. El complejo de activación de la trascripción puede activar la trascripción de genes que incluyen el receptor de factor de crecimiento epidermal (EGFR) a través de una unión directa del complejo con un elemento de "(C)CCCTCC(T)" en la región lateral 5' del gen EGFR.

Un método para detectar un compuesto que inhibe la actividad de una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, que comprende cultivar células que expresan la proteína que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2, o un péptido parcial de la misma, en presencia de una muestra sujeto que contiene al menos un compuesto de ensayo; detectar la proliferación de la célula y seleccionar el compuesto de ensayo que inhibe la proliferación en comparación con la proliferación detectada en ausencia de la muestra sujeto.

Un método in vitro para detectar un compuesto candidato a agente anticancerígeno, en donde el método incluye poner en contacto la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, un co-activador de la misma, y un ADN que contiene la secuencia diana del polipéptido con compuestos candidatos en las condiciones adecuadas para la formación del complejo de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y el ADN, y seleccionar compuestos que inhiben la formación del complejo. La secuencia diana comprende una cualquiera de las siguientes secuencias (a) a (d) que rodean la región 5' de EGFR.

(a): una secuencia que se identifica entre -213-pb y -207-pb (cccctcc) de la región lateral 5' de EGFR;

(b): una secuencia que se identifica entre -106-pb y -100-pb (ccctcct) de la región lateral 5' de EGFR;

(c): una secuencia que se identifica entre -65-pb y -59-pb (ccctcct) de la región lateral 5' de EGFR;

(d): una secuencia que se identifica entre -46-pb y -40-pb (ccctcct) de la región lateral 5' de EGFR.

Un método in vitro para detectar un compuesto candidato a agente anticancerígeno, en donde el método incluye poner en contacto la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, un co-activador de la misma, y un gen informador con una región reguladora trascripcional reconocida por el complejo de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y un co-activador con compuestos candidatos en las condiciones adecuadas para la expresión del gen informador, y seleccionar compuestos que inhiben la expresión del gen informador.

Un método in vitro para la diagnosis de cáncer que incluye determinar un nivel de expresión de un gen ZNFN3A1 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 en una muestra biológica de un espécimen, comparar el nivel de expresión de dicho gen ZNFN3A1 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 con la de la muestra normal, y definir un nivel alto de expresión de dicho gen ZNFN3A1 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 en la muestra como presencia de cáncer. De forma adecuada el cáncer es un carcinoma hepatocelular.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1C muestran la expresión de A6681 y ZNFN3A1 en HCCs. La Figura 1A muestra las relaciones de expresión relativa de A6681 en 20 HCCs primarias examinadas mediante micro-conjunto de cADN. Su expresión se reguló significativamente al alza en once de los doce (91,7%) HCCs clínicos que pasaron a través del filtro de corte (las señales Cy3 y Cy5 superiores a 25.000). La Figura 1B representa fotografías que muestran la expresión de genes candidatos de HCC mostrados por tinción con bromuro de etidio de los productos RT-PCR (T, tejido tumoral; N, tejido normal). La expresión de GAPDH sirvió como control interno. La Figura 1C es una fotografía que muestra el análisis northern blot de tejido múltiple de A6681 en diversos tejidos humanos adultos.

La Figura 2A muestra la estructura de proteína y las construcciones de proteína predichas para el ZNFN3A1. Las estructuras de proteína de ZNFN3A1 se predijeron empleando la Herramienta de Investigación de Arquitectura Modular Simple (SMART). La Figura 2B muestra la homología entre las secuencias de aminoácidos predichas para ZNFN3A1 y para AK010447. El dominio zf-MYND [proteína de dedo de zinc (que contiene dominio MYND)] (A), y el dominio SET [(Su (var) 3-9, Potenciador-de-zeste, Trihorrax)] (B) presentaron un 94% y un 95% de identidad, respectivamente.

Las Figuras 3A-3R presentan fotografías que muestran la localización subcelular de ZNFN3A1 observada mediante inmunocitoquímica, concretamente mediante tinción inmunohistoquímica fluorescente. Las Figuras 3A-3C muestran células SNU475 transfectadas con ADN de plásmido diseñado para expresar ZNFN3A1 marcado con EGFP (pEGFP-ZNFN3A1). Micrografías fluorescentes de FITC (g, j, m, p), DAPI (h, k, n, q), combinación (l, l, o, r). Las Figuras 3D-3F muestran células SNU475 transfectadas con ADN de plásmido diseñado para expresar ZNFN3A1 marcado con FLAG (pFLAG-ZNFN3A1). Micrografías fluorescentes de anti-FLAG (d), DAPI (e), combinación (f). Las Figuras 3G-3R muestran la expresión endógena de ZNFN3A1 en células SNU475 (g-l) y en células SNU423 (m-r). Micrografías fluorescentes de anti-ZNFN3A1 (g, j, m, p), DAPI (h, k, n, q), combinación (i, l, o, r). Las células fueron inoculadas a baja concentración (1,25 x 10^{4} células/pocillo) (g-i, m-o) y a alta concentración (1,0 x 10^{5} células/pocillo) (j-l, p-r).

Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de la progresión del ciclo celular en la localización subcelular de
ZNFN3A1. La Figura 4A muestra el análisis FACS de células Huh7 sincronizadas mediante afidicolina. Las células fueron cultivadas fijadas en fase G_{1} mediante incubación con 7,5 \mug/mL de afidicolina durante 36 h, y fueron liberadas de G_{1} eliminando la afidicolina. Se realizó análisis FACS 0, 4, 8 y 12 h después. La Figura 4B representa fotografías que muestran la tinción inmunocitoquímica fluorescente de proteína ZNFN3A1 endógena en Huh7 sincronizadas mediante afidicolina.

Las Figuras 5A-5D muestran el efecto promotor del crecimiento de ZNFN3A1 en NIH3T3. La Figura 5A es una fotografía que muestra los resultados de un ensayo de formación de colonia de ZNFN3A1 en células NIH3T3, comparando la expresión de ZNFN3A1 en prueba, ZNFN3A1 antisentido-NIH3T3, y ZNFNN3A1 sentido-NIH3T3. La Figura 5B muestra el número de colonias contadas mediante densitometría eléctrica. Las colonias se contaron mediante densitometría eléctrica. Los números de colonias se presentan como el valor medio \pm DS de placas triplicadas. Un (*) denota una diferencia significativa (p < 0,05), determinada mediante el ensayo de Fisher protegido menos significativo. La Figura 5C presenta fotografías que muestran la inducción de crecimiento de células NIH3T3 mediante la expresión de ZNFN3A1 de forma estable. La expresión de mARN de ZNFN3A1 en células transfectantes estables (NIH3T3-ZNFN3A1) determinada mediante RT-PCR. La Figura 5D muestra la evolución con el tiempo del número de células medido mediante el método de tinción con azul de tripano.

Las Figuras 6A-6E muestran el efecto supresor del crecimiento de S-oligonucleótidos antisentido diseñados para suprimir ZNFN3A1. La Figura 6A muestra la construcción de oligonucleótidos sentido (Se) o antisentido (As) diseñados para suprimir ZNFN3A1. La Figura 6B presenta fotografías que muestran la expresión de ZNFN3A1 en células SNU475 tratadas con oligonucleótidos sentido (Se) o antisentido (As) durante 24 h y examinadas mediante RT-PCR y análisis de western blot usando anticuerpos anti-ZNFN3A1. La Figura 6C presenta fotografías que muestran los resultados de un ensayo de formación de colonias usando oligonucleótidos sentido o antisentido contra mARN de ZNFN3A1 en células Huh7, Alexander, SNU423 y SNU475. Los oligonucleótidos antisentido (As) suprimieron el crecimiento. La Figura 6D muestra los resultados de un ensayo MIT, que determina la viabilidad celular, 72 horas después del tratamiento con oligonucleótidos sentido o antisentido en células Huh7, Alexander, SNU423 y SNU475. La Figura 6E muestra los resultados de análisis FACS, que determinan el ciclo celular, de células Huh7 72 horas después del tratamiento con oligonucleótidos sentido (Se) o antisentido (As).

Las Figuras 7A-7C muestran la interacción entre ZNFN3A1 y Helicasa de ARN KIAA0054. En la Figura 7A, se representan el dominio conservado de KIAA0054 y las regiones para la unión de ZNFN3A1. La Figura 7B presenta fotografías que muestran los resultados de un experimento de dos híbridos de levadura, en donde se co-transfectan pAS2-1 que contienen ZNFN3A1 en la cepa de levadura AH109 con vectores de librería que contienen dos longitudes diferentes de KIAA0054. Los resultados muestran la confirmación de unión entre ZNFN3A1 y KIAA0054 en la cepa de levadura AH109. La Figura 7C presenta fotografías que muestran la confirmación de unión entre ZNFN3A1 y KIAA0054 en células de mamífero. Los lisatos de células HeLa fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti-FLAG o anti-HA. Los inmunoprecipitados fueron analizados mediante inmunotinción con anticuerpos anti-HA o anti-FLAG. A modo de control el lisato fue analizado directamente mediante inmunotinción.

La Figura 8 presenta fotografías que demuestran que la interacción de ZNFN3A1 con KIAA0054 está mediada por el dominio SET y por la región C-terminal de KIAA0054. Se analizaron las construcciones de eliminación de ZNFN3A1 para determinar su capacidad para interaccionar con la región C-terminal de KIAA0054 en el sistema de dos híbridos.

La Figura 9 presenta fotografías que demuestran que la helicasa de ARN KIAA0054 se asocia con ZNFN3A1 y con polimerasa II de ARN in vivo. Se prepararon extractos celulares a partir de células HeLa transfectadas con 8 \mug del vector de expresión pFLAG-CMV-ZNFN3A1 (Completo) y del pCMV-HA-KIAA0054 (longitud completa). Los extractos fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti-polimerasa II de ARN, con anticuerpos anti-HA o con anticuerpos anti-FLAG. Se analizaron los inmunoprecipitados mediante inmunotinción con anticuerpos anti-polimerasa II de ARN, anticuerpos anti-HA o anticuerpos anti-FLAG. El lisato se analizó directamente mediante inmunotinción a modo de control.

Las Figuras 10A y 10B demuestran que los genes candidatos posteriores son regulados por ZNFN3A1. La Figura 10A muestra la secuencia de oligonucleótidos aislada mediante reacciones de unión y amplificación con proteínas de fusión GST que contienen la longitud completa de ZNFN3A1. Se muestran las secuencias del núcleo que contienen la región de nucleótidos aleatoria. La Figura 10B presenta fotografías que muestran el análisis de trascripción inversa de tránscritos extendidos de diversos genes en transformante estable COS7 que expresaron ZNFN3A1 exógenamente.

La Figura 11 (A) es la presentación esquemática de diversos plásmidos informadores que contienen elementos putativos de unión a ZNFN3A1 en la región lateral 5' del EGFR. Las posiciones de nucleótidos relativas a la posición de inicio de la trascripción putativa se indican mediante números con un más o con un menos. (B) Ensayo del promotor EGFR en células SNU475 usando los plásmidos informadores indicados. Barras, DS., * denota una diferencia significativa (p < 0,05) determinada mediante un ensayo de Fisher protegido menos significativo.

La Figura 12 es una ilustración del complejo formado entre ZNFN3A1, helicasa de ARN y polimerasa II de ARN para regular la trascripción del gen.

Descripción detallada de la invención

Las palabras "un", "uno/a" y "el/la" tal como se usan en la presente memoria significan "al menos uno", a no ser que se indique lo contrario.

La presente solicitud identifica un nuevo gen humano ZNFN3A1 cuya expresión es marcadamente elevada en HCCs en comparación con los correspondientes tejidos de hígado no cancerosos. El cADN de ZNFN3A1 consiste en 1622 nucleótidos que contienen un marco de lectura abierto de 1284 nucleótidos como el presentado en la SEQ ID NO: 1. El marco de lectura abierto codifica una proteína putativa de 428 aminoácidos con una estructura de dedo de zinc. Dicha proteína ha sido denominada ZNFN3A1 (proteína dedo de zinc, subfamilia 3A (que contiene MYND), 1) por un comité de nomenclatura. Adicionalmente, ZNFN3A1 se asocia directamente con helicasa de ARN KIAA0054, y forma un complejo con polimerasa II de ARN, que activa la trascripción de genes posteriores, incluyendo el receptor de factor de crecimiento epidermal (EGFR) a través de una unión directa del complejo con un elemento de "(C)CCCTCC(T)" en la región lateral 5' del gen EGFR. Consecuentemente, la expresión exógena de ZNFN3A1 en células NIH3T3 confirió un crecimiento celular acelerado, mientras que la supresión de su expresión con S-oligonucleótidos antisentido dio como resultado una significativa inhibición del crecimiento de las células de hepatoma. Estos descubrimientos sugieren que el ZNFN3A1 proporciona actividades oncogénicas a las células cancerosas mediante la activación trascripcional de genes diana que incluyen el EGFR a través de un complejo con helicasa de ARN y polimerasa II de ARN, y que la inhibición de la actividad del complejo podría suponer una estrategia prometedora para el tratamiento de HCC.

La presente invención abarca el nuevo gen humano ZNFN3A1, incluyendo una secuencia de polinucleótidos como la descrita en la SEQ ID NO: 1, así como los elementos degenerados y mutantes del mismo, hasta el punto de que codifican una proteína ZNFN3A1, incluyendo la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2, o su equivalente funcional. Los ejemplos de proteínas funcionalmente equivalentes a ZNFN3A1 incluyen, por ejemplo, las proteínas homólogas de otros organismos que correspondan a la proteína ZNFN3A1 humana, así como mutantes de las proteínas ZNFN3A1 humanas.

En la presente invención, el término "funcionalmente equivalente" significa que la proteína sujeto presenta la actividad de promocionar la proliferación celular igual que las proteínas ZNFN3A1, y de conferir actividad oncogénica a células cancerosas mediante la formación de un complejo transactivante con una helicasa de ARN o con una polimerasa de ARN, o con ambas, que, a su vez, potencia la trascripción de genes diana, tal como EGFR. El hecho de que la proteína sujeto presente actividad de proliferación celular o no puede determinarse introduciendo el ADN que codifica la proteína sujeto en una célula, tal como NIH3T3, expresando la proteína y detectando la promoción de la proliferación de las células o el aumento de la actividad de formación de colonias. La capacidad de una proteína sujeto para formar un complejo con una polimerasa de ARN o con una helicasa de ARN, o con ambas, se puede determinar mediante co-inmunoprecipitación, tal como la descrita en los Ejemplos presentados a continuación. Asimismo, el potenciamiento de la trascripción de EGFR puede determinarse usando plásmidos informadores tales como los descritos en los Ejemplos presentados a continuación.

Los métodos para preparar proteínas funcionalmente equivalentes a una proteína dada son bien conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen métodos conocidos para la introducción de mutaciones en la proteína. Por ejemplo, el especialista en la técnica puede preparar proteínas funcionalmente equivalentes a la proteína humana ZNFN3A1 mediante la introducción de una mutación apropiada en la secuencia de aminoácidos de la proteína ZNFN3A1 mediante mutagénesis dirigida a una posición (Hashimoto-Gotoh, T. y col. (1995), Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., y Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. y col. (1984), Nucleic Acid Res. 12, 9441-9456; Kramer W., y Fritz HJ. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766). Las mutaciones de aminoácidos también pueden producirse de forma natural. La proteína de la presente invención incluye aquellas proteínas que presentan las secuencias de aminoácidos de la proteína ZNFN3A1 humana en la que uno o más aminoácidos son mutados, siempre que las proteínas mutadas resultantes sean funcionalmente equivalentes a la proteína ZNFN3A1 humana. El número de aminoácidos que debe mutarse en dicho mutante generalmente es de 10 o menos aminoácidos, preferiblemente de 6 o menos aminoácidos, y más preferiblemente de 3 o menos aminoácidos.

Las proteínas mutadas o modificadas, las proteínas que presentan secuencias de aminoácidos modificadas mediante eliminación, adición y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido de una determinada secuencia de aminoácidos, retienen su actividad biológica original (Mark, D. F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. y col., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).

El residuo de aminoácidos que va a ser mutado es mutado preferiblemente en un aminoácido diferente en el que las propiedades de la cadena lateral del aminoácidos se conservan (un proceso conocido como sustitución de aminoácido conservativa). Los ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos son aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), y cadenas laterales que tienen en común los siguientes grupos funcionales o características: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y una amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un aromático (H, F, Y, W). Nota: las letras en paréntesis indican los códigos de una letra de aminoácidos.

Un ejemplo de una proteína en la que se añaden uno o más residuos de aminoácido a la secuencia de aminoácidos de la proteína humana ZNFN3A1 (SEQ ID NO: 2) es una proteína de fusión que contiene la proteína humana ZNFN3A1. Las proteínas de fusión son fusiones de la proteína humana ZNFN3A1 y otros péptidos o proteínas, y están incluidas en la presente invención. Las proteínas de fusión pueden fabricarse mediante técnicas bien conocidas por los especialistas, tales como la unión de ADN que codifica la proteína humana ZNFN3A1 de la invención con ADN que codifica otros péptidos o proteínas, de tal modo que las estructuras coincidan, mediante la inserción del ADN de fusión en un vector de expresión y expresándolo en un hospedante. No hay restricción en cuanto a los péptidos o proteínas fusionadas a la proteína de la presente invención.

Los péptidos conocidos que pueden usarse como péptidos que se fusionan con la proteína de la presente invención incluyen, por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. y col., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis que contiene seis residuos His (histidina), 10xHis, aglutinina de la gripe (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSP-GP, fragmento p18HIV, etiqueta T7, etiqueta HSV, etiqueta E, fragmento de antígeno sV40T, etiqueta lck, fragmento de \alpha-tubulina, etiqueta B, fragmento de proteína C, y otros similares. Los ejemplos de proteínas que pueden fusionarse a una proteína de la invención incluyen GST (glutationa-S-transferasa), aglutinina de la gripe (HA), región constante de inmunoglobulina, \beta-galactosidasa, MBP (proteína de unión a maltosa), y otros similares.

Las proteínas de fusión se pueden preparar fusionando ADN disponible comercialmente, codificando los péptidos o proteínas de fusión discutidos antes, con el ADN que codifica la proteína de la presente invención, y expresando el ADN fusionado preparado.

Un método alternativo conocido en la técnica para aislar proteínas funcionalmente equivalentes es, por ejemplo, el método que usa una técnica de hibridación (Sambrook, J. y col., Molecular Cloning 2ª ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). El especialista en la técnica puede aislar fácilmente un ADN que presenta una alta homología con el total, o con una parte, de la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 1) que codifica la proteína humana ZNFN3A1, y aislar proteínas funcionalmente equivalentes a la proteína humana ZNFN3A1 a partir del ADN aislado. Las proteínas de la presente invención incluyen aquellas que están codificadas por ADN que se hibrida con el total o con una parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína humana ZNFN3A1, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína humana ZNFN3A1. Dichas proteínas incluyen homólogos de mamífero que corresponden a la proteína derivada de humano o de ratón (por ejemplo, una proteína codificada por un gen de mono, rata, conejo y bovino). Al aislar un cADN altamente homólogo al ADN que codifica la proteína ZNFN3A1 humana de animales, es particularmente preferible usar tejidos procedentes de ovarios o de testículos.

La condición de hibridación para aislar un ADN que codifique una proteína funcionalmente equivalente a la proteína ZNFN3A1 humana puede ser seleccionada de forma rutinaria por un especialista en la técnica. Por ejemplo, la hibridación se puede llevar a cabo realizando un a prehibridación a 68ºC durante 30 minutos o más usando "tampón Rapid-hyb" (Amersham LIFE SCIENCE), añadiendo una sonda marcada, y calentando a 68°C durante 1 hora o más. La siguiente etapa de lavado se puede llevar a cabo, por ejemplo, en condiciones poco severas. Condiciones poco severas significan, por ejemplo, 42°C, 2 x SSC, SDS al 0,1%, o preferiblemente 50°C, 2 x SSC, SDS al 0,1%. Más preferiblemente, se usan condiciones muy severas. Condiciones muy severas son, por ejemplo, lavar 3 veces en 2 x SSC, SDS al 0,1% a 37°C durante 20 minutos, y lavar dos veces en 1 x SSC, SDS al 0,1% a 50°C durante 20 minutos. Sin embargo, varios factores tales como la temperatura y la concentración salina pueden influir en la severidad de la hibridación, y el especialista en la técnica puede seleccionar adecuadamente los factores necesarios para alcanzar la severidad requerida.

En lugar de la hibridación, se puede utilizar un método de amplificación de genes, por ejemplo, el método de reacción en cadena de polimerasa (PCR), para aislar un ADN que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la proteína ZNFN3A1 humana, usando un cebador sintetizado basado en la información de secuencia del ADN (SEQ ID NO: 1) que codifica la proteína ZNFN3A1 humana.

Las proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína humana ZNFN3A1 codificadas por el ADN aislado mediante las anteriores técnicas de hibridación o de amplificación de genes, normalmente presentan una elevada homología con la secuencia de aminoácidos de la proteína ZNFN3A1 humana. "Elevada homología" se refiere normalmente a una homología del 40% o superior, preferiblemente del 60% o superior, más preferiblemente del 80% o superior, e incluso más preferiblemente del 95% o superior. La homología de una proteína se puede determinar mediante el siguiente algoritmo de "Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730".

Una proteína de la presente invención puede presentar variaciones en la secuencia de aminoácidos, en el peso molecular, en el punto isoeléctrico, en la presencia o ausencia de cadenas de azúcares, dependiendo de la célula o del hospedante usado para producirla o del método de purificación utilizado. Sin embargo, mientras mantenga una función equivalente a la de la proteína humana ZNFN3A1 (SEQ ID NO: 2) de la presente invención, se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Las proteínas de la presente invención se pueden preparar como proteínas recombinantes o como proteínas naturales, mediante métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Una proteína recombinante se puede preparar insertando un ADN, que codifica la proteína de la presente invención (por ejemplo, el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1), en un vector de expresión apropiado, introduciendo el vector en una célula hospedante apropiada, obteniendo el extracto, y purificando la proteína sometiendo al extracto a cromatografía, filtración en gel o cromatografía de afinidad utilizando una columna a la cual se fijan anticuerpos contra la proteína de la presente invención, o mediante la combinación de más de una de las anteriores columnas.

También cuando la proteína de la presente invención es expresada en células hospedantes (por ejemplo, células animales y E. coli) como una proteína de fusión con proteína de glutationa-S-transferasa o como una proteína recombinante complementada con múltiples histidinas, la proteína recombinante expresada se puede purificar usando una columna de glutationa o una columna de níquel.

Tras purificar la proteína de fusión, también es posible excluir las regiones que no sean la proteína objetivo cortando con trombina o con factor Xa, según se requiera.

Se puede aislar una proteína natural empleando métodos conocidos por el especialista en la técnica, por ejemplo, poniendo en contacto la columna de afinidad, en la que se han fijado anticuerpos que se unen a la proteína ZNFN3A1 descritos más adelante, con el extracto de tejidos o células que expresa la proteína de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. La presente invención también abarca péptidos parciales de la proteína de la presente invención. El péptido parcial tiene una secuencia de aminoácidos específica de la proteína de la presente invención y consiste en al menos 7 aminoácidos, preferiblemente 8 aminoácidos o más, y más preferiblemente 9 aminoácidos o más. El péptido parcial puede usarse, por ejemplo, para preparar anticuerpos contra la proteína de la presente invención, para buscar un compuesto que se una a la proteína de la presente invención, y para buscar aceleradores o inhibidores de la proteína de la presente invención.

Un péptido parcial de la invención se puede producir mediante ingeniería genética, empleando métodos conocidos de síntesis de péptidos, o mediante la digestión de la proteína de la invención con una peptidasa apropiada. Para la síntesis de péptidos, por ejemplo, se puede usar síntesis en fase sólida o síntesis en fase líquida.

La proteína ZNFN3A1 aislada incluye una proteína putativa de 428 aminoácidos con una estructura de dedo de zinc codificada por el marco de lectura abierto de la secuencia de polinucleótidos de ZNFN3A1. El dominio de dedo de zinc (MYND) se posiciona en los codones 49-87 y el dominio SET (Su 3-9, Potenciador-de-zeste, Trihorrax) se posiciona en los codones 117-246. Tal como se discute en detalle más adelante, la región de unión de ZNFN3A1 reside en el dominio SET. Por tanto, el péptido parcial de ZNFN3A1 incluye preferiblemente el dominio SET.

Además, la presente invención proporciona ADN que codifica las proteínas de la presente invención. El ADN de la presente invención se puede usar para la producción in vivo o in vitro de la proteína de la presente invención tal como se ha descrito antes, o puede aplicarse a terapia génica para enfermedades atribuidas a anormalidades genéticas en el gen que codifica la proteína de la presente invención. Se puede usar cualquier forma del ADN de la presente invención, de longitud suficiente para que codifique la proteína de la presente invención. Específicamente, se puede usar cADN sintetizado a partir de mARN, ADN genómico y ADN sintetizado químicamente. El ADN de la presente invención incluye un ADN que comprende unas secuencias de nucleótidos dadas así como sus secuencias degeneradas, de longitud suficiente para que el ADN resultante codifique una proteína de la presente invención.

El ADN de la presente invención se puede preparar empleando métodos conocidos por el especialista en la técnica. Por ejemplo, el ADN de la presente invención se puede preparar mediante: la preparación de una librería de cADN a partir de células que expresan la proteína de la presente invención, y llevando a cabo la hibridación usando una secuencia parcial del ADN de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) a modo de sonda. Se puede preparar una librería de cADN, por ejemplo, mediante el método descrito en Sambrook J. y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); de forma alternativa, se pueden usar librerías de cADN disponibles comercialmente. También se puede preparar una librería de cADN mediante: la extracción de ARNs de células que expresan la proteína de la presente invención, sintetizando oligo ADNs basados en la secuencia del ADN de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), llevando a cabo PCR mediante el uso de oligos como cebadores, y amplificando cADNs que codifican la proteína de la presente invención.

Además, mediante el secuenciamiento de los nucleótidos del cADN obtenido se puede determinar de forma rutinaria la región de traducción codificada por el cADN, y la secuencia de aminoácidos de la proteína de la presente invención puede obtenerse fácilmente. Además, escrutando la librería de ADN genómico usando el cADN obtenido como sonda, se puede aislar el ADN genómico.

Más específicamente, se pueden preparar primero mARNs a partir de una célula, tejido u órgano (por ejemplo, ovario, testículo, placenta, etc.) en el cual se expresa la proteína de la invención. Para aislar mARNs se pueden usar métodos conocidos; por ejemplo, el ARN total se puede preparar mediante ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin J. M. y col. Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)) ó mediante el método AGPC (Chomczynski P. y Sacchi N., Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)). Adicionalmente, el mARN se puede purificar a partir del ARN total usando el Kit de Purificación de mARN (Pharmacia), y de forma alternativa dicho mARN se puede purificar directamente mediante el Kit de Purificación de mARN QuickPrep (Pharmacia).

El mARN obtenido se usa para sintetizar cADN usando transcriptasa inversa. Se puede sintetizar cADN usando un kit disponible comercialmente, tal como el kit de síntesis de cADN "AMV Reverse Transcriptase First-strand cADN Síntesis Kit" (Seikagaku Kogyo). De forma alternativa, se puede sintetizar y amplificar cADN siguiendo el método 5'-RACE (Forman M. A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky A. y col., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932 (1989)), que usa un cebador y dicho kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech), y reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Se prepara un fragmento de ADN a partir de los productos de PCR y se liga a un ADN vector. Los vectores recombinantes se usan para transformar E. coli y preparar así un vector recombinante deseado a partir de una colonia seleccionada. Se puede verificar la secuencia de nucleótidos del ADN deseado empleando métodos convencionales, tales como la terminación de cadena de didesoxinucleótido.

La secuencia de nucleótidos de un ADN de la invención se puede diseñar para ser expresada de forma más eficaz teniendo en cuenta la frecuencia del uso del codón en el hospedante que se va a usar para la expresión (Grantham R. y col., Nucleic Acids Res. 9: 43-74 (1981)). El ADN de la presente invención se puede alterar mediante un kit disponible comercialmente o mediante un método convencional. Por ejemplo, el ADN se puede alterar mediante digestión con enzimas de restricción, inserción de un oligonucleótido sintético o un fragmento de ADN apropiado, adición de un ligando, o inserción del codón de inicio (ATG) y/o del codón de parada (TAA, TGA o TAG).

Específicamente, el ADN de la presente invención abarca el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de dedo de zinc, posicionado en los codones 49-87 de la SEQ ID NO: 2, y el dominio SET, posicionado en los codones 117-246 de la SEQ ID NO: 2.

Además, la presente invención proporciona un ADN que se hibrida en condiciones severas con un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos como la SEQ ID NO: 1, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la proteína de la invención descrita anteriormente. El especialista en la técnica puede elegir apropiadamente las condiciones severas. Por ejemplo, se pueden usar condiciones poco severas. Más preferiblemente, se pueden usar condiciones muy severas. Dichas condiciones son las mismas descritas anteriormente. El ADN que se hibrida es preferiblemente un cADN o un ADN cromosomal.

La presente invención también proporciona un vector en el cual se inserta el ADN de la presente invención. Un vector de la presente invención es útil para mantener un ADN de la presente invención en una célula hospedante, o para expresar la proteína de la presente invención.

Cuando la célula hospedante es E. coli y el vector se amplifica y produce en grandes cantidades en E. coli (por ejemplo, JM109, DH5\alpha, HB101 o XL1Blue), el vector debería tener "ori" para amplificar en E. coli y un gen marcador para seleccionar el E. coli transformado (por ejemplo, un gen resistente a fármacos seleccionado mediante un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, u otros similares). Por ejemplo, se pueden usar los vectores de la serie M13, los vectores de la serie pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc. Además, también se pueden usar pGEM-T, pDIRECT y pT7 para subclonar y extraer cADN así como los vectores descritos anteriormente. Cuando se usa un vector para producir la proteína de la presente invención, un vector de expresión es especialmente útil. Por ejemplo, un vector de expresión que va a ser expresado en E. coli debería tener las anteriores características para ser amplificado en E. coli. Cuando se usa E. coli como célula hospedante, tal como JM109, DH5\alpha, HB101 o XL1 Blue, el vector debería tener un promotor, por ejemplo un promotor lacZ (Ward y col., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J (1992) 6, 2422-2427), un promotor araB (Better y col., Science (1988) 240, 1041-1043), o un promotor T7 o similar, que pueda expresar eficazmente el gen deseado en E. coli. A este respecto, se puede usar pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP y pET (en este caso, el hospedante es preferiblemente BL21, que expresa polimerasa T7 de ARN), por ejemplo, en lugar de los anteriores
vectores.

Adicionalmente, el vector también puede contener una secuencia señal para la secreción de polipéptidos. Un ejemplo de secuencia señal que dirige la proteína que se va a segregar al periplasmo de la E. coli es la secuencia señal pelB (Lei, S. P. y col., J. Bacterial. (1987) 169, 4379). Los medios para introducir los vectores en las células hospedantes diana incluyen, por ejemplo, el método del cloruro de calcio y el método de electroporación.

Además de la E. coli, por ejemplo, para la producción de la proteína de la presente invención se pueden usar vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen) y pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), vectores de expresión derivados de células de insectos (por ejemplo, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo pMH1, pMH2), vectores de expresión derivados de virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw), vectores de expresión derivados de retrovirus (por ejemplo, pZlpneo), vectores de expresión derivado de levaduras (por ejemplo, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01), y vectores de expresión derivados de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608, pKTH50).

Con el fin de expresar el vector en células de animales, tales como células CHO, COS ó NIH3T3, el vector debería tener un promotor necesario para la expresión en dichas células, por ejemplo, el promotor SV40 (Mulligan y col., Nature (1979) 277, 108), el promotor MMLV-LTR, el promotor EF1\alpha (Mizushima y col., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), el promotor CMV, y otros similares, y preferiblemente un gen marcador para la selección de transformantes (por ejemplo, un gen resistente a fármacos seleccionado por un fármaco (por ejemplo, neomicina, G418)). Los ejemplos de vectores conocidos con estas características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

Adicionalmente, se pueden usar métodos para expresar un gen de forma estable y, al mismo tiempo, amplificar el número de copias del gen en las células. Por ejemplo, se puede introducir un vector que comprende el gen complementario DHFR (por ejemplo pCHO I) en células CHO en las que se elimina la ruta de síntesis de ácidos nucleicos, y a continuación se amplifica con metotrexato (MTX). Además, en caso de expresión temporal de un gen, se puede usar el método en el que un vector que comprende un origen de réplica de SV40 (pcD, etc.) se transforma en células COS que comprenden gen que expresa antígeno T de SV40 en el cromosoma.

Se puede aislar una proteína de la presente invención obtenida como se ha indicado antes a partir del interior o del exterior (por ejemplo, el medio) de células hospedantes, y se puede purificar como una proteína homogénea sustancialmente pura. El término "sustancialmente pura" tal como se usa en la presente memoria en referencia a un polipéptido dado significa que el polipéptido está sustancialmente libre de otras macromoléculas biológicas. El polipéptido sustancialmente puro es puro en al menos un 75% (por ejemplo, al menos un 80, 85, 95 ó 99%) en peso seco. La pureza se puede medir mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo empleando cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis mediante HPLC. El método de aislamiento y purificación de la proteína no está limitado a un método concreto; de hecho, se puede usar cualquier método
estándar.

Por ejemplo, para aislar y purificar la proteína se pueden seleccionar y combinar de forma apropiada a la cromatografía en columna, la filtración, la ultrafiltración, la precipitación de sales, la precipitación de disolventes, la extracción con disolventes, la destilación, la inmunoprecipitación, la electroforesis de gel de poliacrilamida, la electroforesis de punto isoeléctrico, la diálisis y la recristalización.

Los ejemplos de cromatografía incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrófoba, la filtración en gel, la cromatografía de fase inversa, la cromatografía de adsorción, y otras (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografías se pueden llevar a cabo mediante cromatografía de líquidos, tal como HPLC y FPLC. Por tanto, la presente invención proporciona proteínas altamente purificadas preparadas mediante alguno de los anteriores métodos.

Una proteína de la presente invención puede modificarse o eliminarse parcialmente de forma opcional tratándola con una enzima de modificación de proteína apropiada antes o después de la purificación. Las enzimas de modificación de proteínas útiles incluyen, aunque sin limitación, tripsina, quimotripsina, lisilendopeptidasa, proteína quinasa, glucosidasa y otras similares.

La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la proteína de la invención. El anticuerpo de la invención se puede usar en cualquier forma, tal como anticuerpos monoclonales o policlonales, e incluye antisuero obtenido mediante inmunización de un animal tal como un conejo con la proteína de la invención, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos humanos, y anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación genética.

Una proteína de la invención usada como antígeno para obtener un anticuerpo puede derivarse de cualquier especie animal, pero preferiblemente deriva de un mamífero tal como un humano, un ratón o una rata, más preferiblemente de un humano. Se puede obtener una proteína derivada de humano a partir de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos descritas en la presente memoria.

De acuerdo con la presente invención, la proteína que se va a usar como antígeno de inmunización puede ser una proteína completa o un péptido parcial de la proteína. Un péptido parcial puede comprender, por ejemplo, el fragmento amino (N)-terminal o carboxi (C)-terminal de una proteína de la presente invención. En la presente memoria se define un anticuerpo como una proteína que reacciona con una proteína de longitud completa de la presente invención, o con un fragmento de proteína de la presente invención.

Un gen que codifica una proteína de la invención o su fragmento puede insertarse en un vector de expresión conocido, que a continuación es usado para transformar una célula hospedante tal como se ha descrito en la presente memoria. La proteína deseada o su fragmento se pueden recuperar del interior o del exterior de células hospedantes empleando cualquier método estándar, y posteriormente puede ser usada como antígeno. De forma alternativa, se puede usar como antígeno células enteras que expresen la proteína o sus lisatos, o una proteína sintetizada químicamente.

Se puede inmunizar cualquier animal mamífero con el antígeno, pero preferiblemente se tiene en cuenta la compatibilidad con las células originales usadas para la fusión celular. En general, se usan animales de los géneros Rodentia, Lagomorpha o Primates.

Los animales del género Rodentia incluyen, por ejemplo, el ratón, la rata y el hamster. Los animales del género Lagomorpha incluyen, por ejemplo, el conejo. Los animales del género Primates incluyen, por ejemplo, un mono de Catarrhini (mono del viejo mundo) tal como el Macaca fascicularis, el mono Rhesus, el mandril sagrado y chimpancés.

Los métodos para inmunizar animales con antígenos son conocidos en la técnica. Un método estándar para la inmunización de mamíferos es la inyección intraperitoneal o la inyección subcutánea de antígenos. Más específicamente, los antígenos se pueden diluir y suspender en una cantidad apropiada de disolución salina tamponada con fosfato (PBS), de disolución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígenos se puede mezclar con una cantidad apropiada de un adyuvante estándar, tal como el adyuvante de Freund completo, fabricado en emulsión, y a continuación se administra a los animales mamíferos. Preferiblemente, se continúa con varias administraciones de antígenos mezclados con una cantidad apropiada de adyuvante de Freund incompleto cada 4-21 días. También se puede usar un vehículo apropiado para la inmunización. Después de realizar una inmunización como la indicada, se examina el suero empleando un método estándar para ver si se ha producido un aumento en la cantidad de anticuerpos deseados.

Los anticuerpos policlonales contra las proteínas de la presente invención se pueden preparar recogiendo sangre de los mamíferos inmunizados, que ha sido examinada para determinar el aumento de anticuerpos deseados en el suero, y separando el suero de la sangre empleando cualquier método convencional. Los anticuerpos policlonales incluyen el suero que contiene a los anticuerpos policlonales, así como la fracción que contiene los anticuerpos policlonales se puede aislar del suero. Se puede preparar inmunoglobulina G o M a partir de la fracción que reconoce únicamente la proteína de la presente invención usando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada con la proteína de la presente invención, y purificando dicha fracción mediante el uso de una columna de proteína A o de proteína G.

Para preparar anticuerpos monoclonales, se recogen células inmunes del mamífero inmunizado con el antígeno, y se comprueba el aumento en el nivel de anticuerpos deseados en el suero como se ha descrito anteriormente, y se someten a fusión celular. Las células inmunes usadas para la fusión celular se obtienen preferiblemente a partir del bazo. Otras células originarias preferidas que se pueden fusionar con el inmunecito anterior incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamíferos, y más preferiblemente células de mieloma que tengan una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas mediante fármacos.

El inmunecito y las células de mieloma anteriores se pueden fusionar de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein y col. (Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Los hibridomas resultantes obtenidos mediante fusión celular se pueden seleccionar cultivándolos en un medio de selección estándar, tal como un medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidita). El cultivo celular se continúa típicamente en el medio HAT durante entre varios días y varias semanas, el tiempo suficiente para permitir que las demás células mueran, con la excepción del hibridoma deseado (células no fusionadas). A continuación, se lleva a cabo una dilución limitante estándar para realizar el escrutinio y clonar una célula de hibridoma que produzca el anticuerpo deseado.

Además del anterior método, en el que se inmuniza un animal no humano con un antígeno para preparar hibridoma, se pueden inmunizar linfocitos humanos como los infectados por el virus EB con una proteína, proteína que exprese células, o con sus lisatos in vitro. A continuación, los linfocitos inmunizados se fusionan con células de mieloma derivadas de humano que son capaces de dividirse indefinidamente, tal como U266, para dar lugar a un hibridoma que produzca un anticuerpo humano deseado que sea capaz de unirse a la proteína (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada Nº (JP-A) Sho 63-17688).

Los hibridomas obtenidos son transplantados posteriormente a la cavidad abdominal de un ratón y se extrae el líquido de ascitis. Los anticuerpos monoclonales obtenidos se pueden purificar mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato amónico, una columna de proteína A o de proteína G, cromatografía de intercambio iónico DEAE, o una columna de afinidad a la cual se acopla la proteína de la presente invención. El anticuerpo de la presente invención se puede usar no sólo para purificar y detectar la proteína de la presente invención, sino también como candidato para agonista y antagonista de la proteína de la presente invención. Adicionalmente, dicho anticuerpo se puede aplicar al tratamiento con anticuerpos de enfermedades relacionadas con la proteína de la presente invención. Cuando el anticuerpo obtenido se va a administrar al cuerpo humano (tratamiento con anticuerpos), es preferible un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

Por ejemplo, se pueden inmunizar animales transgénicos que tengan un repertorio de genes de anticuerpos humanos con un antígeno seleccionado de una proteína, proteína que exprese células, o de sus lisatos. A continuación, se recolectan células que producen anticuerpos en animales y se fusionan con células de mieloma para obtener hibridoma, a partir del cual se pueden preparar anticuerpos humanos contra la proteína (véanse los documentos WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO94-25585, WO96-33735 y WO96-34096).

De forma alternativa, una célula inmune, tal como un linfocito inmunizado, que produce anticuerpos, se puede inmortalizar mediante un encogen y se puede usar para preparar anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales obtenidos de este modo también se pueden preparar recombinantemente usando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K. y Larrick J.W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, a partir de una célula inmune se puede clonar un ADN que codifica un anticuerpo, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, insertado en un vector apropiado, e introducido en células hospedantes para preparar un anticuerpo recombinante. La presente invención también proporciona anticuerpos recombinantes preparados como se ha descrito anteriormente.

Además, un anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de un anticuerpo o de un anticuerpo modificado, siempre que se una a una o más de las proteínas de la invención. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab')_{2}, Fv o Fv de cadena sencilla (scFv), en donde los fragmentos Fv de las cadenas H y L están unidos mediante un ligando apropiado (Huston J. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-5883 (1988)). Más específicamente, se puede generar un fragmento de anticuerpo mediante el tratamiento de un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina. De forma alternativa, se puede construir un gen que codifica el fragmento de anticuerpo, se puede insertar en un vector de expresión y ser expresado en una célula hospedante apropiada (véase, por ejemplo, Co M.S. y col., J. Immunol. 152: 2968-2976 (1994); Better M. y Horwitz A. H., Methods Enzymol. 178: 476-496 (1989); Pluckthun A. y Skerra A., Methods Enzymol. 178: 497-515 (1989); Lamoyi E., Methods Enzymol. 121: 652-663 (1986); Rousseaux J. y col., Methods Enzymol. 121: 663-669 (1986); Bird R. E. y Walker B. W., Trends Biotechnol. 9: 132-137 (1991)).

Se puede modificar un anticuerpo mediante conjugación con una serie de moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). La presente invención proporciona dichos anticuerpos modificados. El anticuerpo modificado se puede obtener modificando químicamente un anticuerpo. Estos métodos de modificación son convencionales en el campo.

De forma alternativa, se puede obtener un anticuerpo de la presente invención en forma de anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de un anticuerpo no humano y la región constante derivada de un anticuerpo humano, o en forma de un anticuerpo humanizado, que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de un anticuerpo no humano, la región de trabajo de marco (FR) derivada de un anticuerpo humano, y la región constante. Dichos anticuerpos se pueden preparar usando tecnologías conocidas.

Los anticuerpos obtenidos según el método anterior se pueden purificar hasta alcanzar homogeneidad. Por ejemplo, la separación y purificación del anticuerpo se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos de separación y purificación usados para proteínas generales. Por ejemplo, el anticuerpo se puede separar y aislar mediante el uso combinado y seleccionado apropiadamente de cromatografías de columna, tales como cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, eliminación de sales, diálisis, electroforesis de gel de poliacrilamida SDS, enfoque isoeléctrico y otros (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), pero no se limitan a los ejemplos expuestos.

Se puede usar una columna de proteína A y una columna de proteína G como columna de afinidad. Los ejemplos de columnas de proteína A que pueden usarse incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sefarosa F.F. (Pharmacia).

Los ejemplos de cromatografía, con la excepción de la de afinidad, incluyen, por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrófoba, la filtración en gel, la cromatografía de fase inversa, la cromatografía de adsorción, y otras similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Los procedimientos cromatográficos se pueden llevar a cabo mediante cromatografía en fase líquida, tal como HPLC, FPLC.

Por ejemplo, se puede usar la medida de la absorbancia, el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), el inmunoensayo enzimático (EIA), el radioinmunoensayo (RIA), y/o la inmunofluorescencia, para medir la actividad de unión de antígeno del anticuerpo de la invención. En el análisis ELISA, el anticuerpo de la presente invención se inmoviliza en una placa, se aplica proteína de la invención sobre la placa, y a continuación se aplica una muestra que contiene un anticuerpo deseado, tal como un sobrenadante de cultivo de anticuerpo que produce células o anticuerpos purificados. A continuación, se aplica un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y que está marcado con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, y se incuba la placa. Entonces, después de lavar, se añade a la placa un sustrato enzimático, tal como fosfato de p-nitrofenilo, y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión de antígeno de la muestra. Se puede usar como proteína un fragmento de la proteína, tal como un fragmento C-terminal o N-terminal. Se puede usar BIAcore (Pharmacia)

\hbox{para evaluar  la actividad del anticuerpo de acuerdo con
la presente invención.}

Los anteriores métodos permiten la detección o medida de la proteína de la invención, mediante la exposición el anticuerpo de la invención a una muestra que se supone contiene la proteína de la invención, y detectando o midiendo el complejo inmune formado por el anticuerpo y la proteína.

Debido a que el método de detección o medida de la proteína de acuerdo con la invención puede detectar o medir específicamente una proteína, el método puede ser útil en una serie de experimentos en los que se usa la proteína.

La presente invención también proporciona un polinucleótido que se hibrida con el ADN que codifica proteína ZNFN3A1 humana (SEQ ID NO: 1) o la cadena complementaria de la misma, y que comprende al menos 15 nucleótidos. El polinucleótido de la presente invención preferiblemente es un polinucleótido que se hibrida específicamente con el ADN que codifica la proteína de la presente invención. El término "se hibrida específicamente" tal como se usa en la presente memoria, significa que no se produce una hibridación cruzada significativa con ADN que codifica otras proteínas, en las condiciones habituales de hibridación, preferiblemente en condiciones de hibridación severas. Dichos polinucleótidos incluyen sondas, cebadores, nucleótidos y derivados de nucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido y ribozimas), que se hibridan específicamente con ADN que codifica la proteína de la invención o su cadena complementaria. Además, dicho polinucleótido se puede utilizar en la preparación de un chip de ADN.

La presente invención incluye un oligonucleótido antisentido que se hibrida con cualquier posición de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. Este oligonucleótido antisentido preferiblemente está contra al menos 15 nucleótidos continuos de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. El anteriormente mencionado oligonucleótido antisentido, que contiene un codón de inicio en los anteriores al menos 15 nucleótidos continuos, es incluso más preferido.

Se pueden usar como oligonucleótidos antisentido los productos derivados o modificados de los oligonucleótidos antisentido. Ejemplos de dichos productos modificados incluyen las modificaciones de fosfonato de alquilo inferior tales como el tipo metilfosfonato o el tipo etilfosfonato, las modificaciones de fosforotioato y las modificaciones de fosforoamidato.

El término "oligonucleótidos antisentido" tal como se usa en la presente memoria significa, no solo aquellos en los que los nucleótidos correspondientes a los que constituyen una región especificada de un ADN o mARN son completamente complementarios, sino también los que presentan un desajuste de uno o más nucleótidos, siempre que el ADN o el mARN y el oligonucleótido antisentido puedan hibridarse específicamente con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1.

Dichos polinucleótidos están contenidos como los que tienen, en la "región de secuencia de al menos 15 nucleótidos contiguos", una homología de al menos un 70% o más, preferiblemente un 80% o más, más preferiblemente un 90% o más, incluso más preferiblemente un 95% o más. Para determinar la homología se puede usar el algoritmo establecido en la presente memoria. Dichos polinucleótidos son útiles como sondas para el aislamiento o la detección de ADN que codifica la proteína de la invención, tal como se ha establecido en el último ejemplo o como un cebador usado para amplificaciones.

Los derivados de oligonucleótidos antisentido de la presente invención actúan sobre las células produciendo la proteína de la invención mediante la unión del ADN o del mARN que codifica la proteína, inhibiendo su trascripción o traducción, promoviendo la degradación del mARN, e inhibiendo la expresión de la proteína de la invención, lo cual da como resultado la inhibición de la función proteica.

Un derivado de oligonucleótido antisentido de la presente invención se puede fabricar en una preparación externa, tal como un linimento o una cataplasma, mezclando con un material base adecuado que sea inactivo frente a los derivados.

Asimismo, según se necesite, los derivados se pueden formular en comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposomas, inyecciones, disoluciones, gotas para la nariz y agentes de secado por congelación añadiendo excipientes, agentes isotónicos, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, analgésicos, y otros similares. Todos ellos se pueden preparar siguiendo los métodos habituales.

El derivado de oligonucleótido antisentido se proporciona al paciente mediante la aplicación directa sobre la zona afectada o mediante inyección en un vaso sanguíneo, de tal modo que alcance la zona afectada. También se puede usar un medio creciente antisentido para aumentar la durabilidad y la permeabilidad de la membrana. Los ejemplos son, liposomas, poli-L-lisina, lípidos, colesterol, lipofectina, o derivados de los mismos.

La dosis del derivado de oligonucleótido antisentido de la presente invención se puede ajustar adecuadamente según la afección del paciente, y se puede usar en las cantidades deseadas. Por ejemplo, se puede administrar un intervalo de dosis entre 0,1 y 100 mg/kg, preferiblemente entre 0,1 y 50 mg/kg.

El oligonucleótido antisentido de la invención inhibe la expresión de la proteína de la invención y por ello es útil para suprimir la actividad biológica de la proteína de la invención. Asimismo, los inhibidores de expresión, que comprenden el oligonucleótido antisentido de la invención, son útiles en el sentido de que pueden inhibir la actividad biológica de la proteína de la invención.

Además, la presente invención proporciona un método de escrutinio para detectar un compuesto que se una a la proteína de la presente invención mediante el uso de la proteína de la presente invención. Este método de escrutinio comprende las etapas: (a) poner en contacto la proteína de la presente invención, o un péptido parcial de la misma, con una muestra sujeto, (b) detectar la actividad de unión entre la proteína de la presente invención, o el péptido parcial de la misma, y la muestra sujeto, y (c) seleccionar un compuesto que se une a la proteína de la presente invención, o al péptido parcial de la misma.

La proteína de la presente invención que se va a usar para el escrutinio puede ser una proteína recombinante o una proteína natural, o un péptido parcial de las mismas. Se puede usar cualquier muestra sujeto, por ejemplo, extractos celulares, sobrenadante de cultivo celular, productos de fermentación de microorganismos, extractos de organismos marinos, extractos vegetales, proteínas crudas o purificadas, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos macromoleculares sintéticos y compuestos naturales. La proteína de la presente invención que se va a poner en contacto con la muestra sujeto puede ser, por ejemplo, una proteína purificada, una proteína soluble, una forma ligada a un vehículo, o una proteína de fusión fusionada a otras proteínas.

Como método de escrutinio de proteínas, por ejemplo, que se unen a la proteína de la presente invención usando la proteína de la presente invención, se pueden usar múltiples métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Dicho escrutinio se puede realizar, por ejemplo, mediante un método de inmunoprecipitación, específicamente, de la siguiente manera. El gen que codifica la proteína de la presente invención se expresa en células animales y se inserta el gen en un vector de expresión para genes extraños, tal como pSV2neo, pcDNA I y pCD8. El promotor que se va a usar para la expresión puede ser cualquier promotor que se pueda usar de forma común e incluye, por ejemplo, el promotor temprano SV40 (Rugby en Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, Londres, pág. 83-141 (1982)), el promotor EF-1\alpha (Kim y col., Gene 91, pág. 217-223 (1990)), el promotor CAG (Niwa y col., Gene 108, pág. 193-200 (1991)), el promotor RSV LTR (Cullen Methods in Enzymology 152, pág. 684-704 (1987)), el promotor SR\alpha (Takebe y col., Mol. Cell. Biol., 8, pág. 466 (1988)), el promotor temprano inmediato CMV (Seed y Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, pág. 3365-3369 (1987)), el promotor tardío SV40 (Greysen y Fiers, J. Mol. Appl. Genet. 1, pág. 385-394 (1982)), el promotor tardío de Adenovirus (Kaufman y col., Mol. Cell. Biol. 9, pág. 946 (1989)), el promotor TK de HSV, y otros similares. La introducción del gen en células animales para expresar un gen extraño se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier método, por ejemplo, el método de electroporación (Chu G. y col., Nucl. Acids Res. 15, 1311-1326 (1987)), el método de fosfato cálcico (Chen, C., y Okayama, H., Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2752 (1987), el método de dextrano DEAE (Lobata, M.A. y col., Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984)), Sussman, D.J. y Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985)), el método de Lipofectina (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B.T. y col., Nature Genetics 5, 22-30 (1993): Rabindran, S.K. y col., Science 259, 230-234 (1993)), y otros similares. La proteína de la presente invención se puede expresar como una proteína de fusión que comprende una posición de reconocimiento (epítopo) de un anticuerpo monoclonal mediante la introducción del epítopo del anticuerpo monoclonal, cuya especificidad ha sido revelada, en el extremo N ó C de la proteína de la presente invención. Se puede usar un sistema anticuerpo-epítopo disponible comercialmente (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)). Los vectores que pueden expresar una proteína de fusión con, por ejemplo, \beta-galactosidasa, proteína de unión a maltosa, glutationa S-transferasa, proteína de fluorescencia verde (GFP), y otros, mediante el uso de sus múltiples posiciones de clonación, se encuentran disponibles comercialmente.

También se presenta una proteína de fusión preparada introduciendo únicamente epítopos pequeños que consisten en entre unos cuantos y una docena de aminoácidos, con el fin de no cambiar las propiedades de la proteína de la presente invención como consecuencia de la fusión. Se pueden usar epítopos tales como polihistidina (His-tag), agregado de gripe HA, c-myc humano, FLAG, glicoproteína de virus de estomatitis vesicular (VSV-GP), proteína gen 10 de T7 (T7-tag), glicoproteína de virus del herpes simple humano (HSV-tag), E-tag (un epítopo en fago monoclonal), y otros similares, y anticuerpos monoclonales que los reconozcan, como sistema epítopo-anticuerpo para escrutar proteínas que unan a la proteína de la presente invención (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).

En la inmunoprecipitación, se forma un complejo inmune añadiendo estos anticuerpos a lisato celular preparado usando un detergente apropiado. El complejo inmune consiste en la proteína de la presente invención, una proteína que tiene capacidad de unión con la proteína, y un anticuerpo. También se puede llevar a cabo la inmunoprecipitación usando anticuerpos contra la proteína de la presente invención, además de usando anticuerpos contra los anteriores epítopos. Se puede preparar un anticuerpo contra la proteína de la presente invención, por ejemplo, introduciendo un gen que codifica la proteína de la presente invención con un vector de expresión de E. coli apropiado, expresando el gen en E. coli, purificando la proteína expresada, e inmunizando conejos, ratones, ratas, cabras, aves de corral domésticas y otros similares contra la proteína. También se puede preparar el anticuerpo inmunizando a los anteriores animales contra un péptido parcial sintetizado de la proteína de la presente invención.

Se puede precipitar un complejo inmune, por ejemplo, mediante sefarosa de Proteína A o mediante sefarosa de Proteína G, si el anticuerpo es un anticuerpo IgG de ratón. Si la proteína de la presente invención se prepara en forma de proteína de fusión con un epítopo, tal como el GST, se puede formar un complejo inmune de la misma manera que en el uso del anticuerpo contra la proteína de la presente invención, usando una sustancia que se une específicamente a dichos epítopos, tal como glutationa-sefarosa 4B.

La inmunoprecipitación se puede llevar a cabo siguiendo, o de acuerdo con, por ejemplo, los métodos descritos en bibliografía (Harlow, E. y Lane, D.: Antibodies pág. 511-552, publicaciones del Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988)).

Habitualmente se usa SDS-PAGE para el análisis de proteína inmunoprecipitadas y la proteína ligada se puede analizar a través del peso molecular de la proteína usando geles con una concentración apropiada. Puesto que la proteína ligada a la proteína de la presente invención es difícil de detectar empleando un método de tinción común, tal como la tinción de Coomassie o la tinción de plata, se puede mejorar la sensibilidad de detección correspondiente a la proteína cultivando células en un medio de cultivo que contenga un isótopo radiactivo, ^{35}S-metionina ó ^{35}S-cisteína, marcando las proteínas en las células y detectando las proteínas. La proteína diana se puede purificar directamente a partir del gel de SDS-poliacrilamida y se puede determinar su secuencia, una vez que se ha revelado el peso molecular de una proteína.

Como método de aislamiento de proteínas se puede usar la unión a proteína de la presente invención usando la proteína, por ejemplo, se puede usar el análisis de West-Western blotting (Skolnik, E. Y. y col., Cell (1991) 65, 83-90). Específicamente, se puede obtener una proteína que se une a la proteína de la presente invención preparando una librería de cADN a partir de células, tejidos, órganos (por ejemplo, tejidos tales como ovario, testículo y placenta, o células cultivadas) que se espera expresen una proteína que se una a la proteína de la presente invención mediante el uso de un vector fago (por ejemplo, ZAP), expresando la proteína en LB-agarosa, fijando la proteína expresada en un filtro, haciendo reaccionar la proteína purificada y marcada de la presente invención con el filtro anterior, y detectando las placas que expresan proteínas unidas a la proteína de la presente invención según la marca usada. La proteína de la invención se puede marcar utilizando la unión entre biotina y avidita, o utilizando un anticuerpo que se una específicamente a la proteína de la presente invención, o a un péptido o polipéptido (por ejemplo, GST) que se fusiona a la proteína de la presente invención. Se pueden usar métodos que usen radioisótopos o fluorescencia, y otros similares.

Alternativamente, en otra realización del método de escrutinio de la presente invención, se puede usar un sistema de dos híbridos que utilice células ("MATCHMAKER Two-Hydrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene); las referencias "Dalton S. y Treisman R. (1992) Cell 68, 597-612", "Fields S. y Sternglanz R., Trends Genet. (1994) 10: 286-292").

En el sistema de dos híbridos, la proteína de la invención se fusiona a la región de unión de SRF o a la región de unión de GAL4, y se expresa en células de levadura. Se prepara una librería de cADN a partir de células que se espera expresen una proteína que se une a la proteína de la invención, de tal modo que la librería, cuando se expresa, se fusiona con la región de activación trascripcional VP16 o GAL4. A continuación se introduce la librería de cADN en las anteriores células de levadura y se aisla el cADN derivado de la librería de los clones positivos detectados (si una proteína que se une a la proteína de la invención se expresa en células de levadura, la unión de las dos activa un gen informador, haciendo detectables a los clones positivos). Se puede preparar una proteína codificada por el cADN introduciendo el cADN aislado anterior en E. coli y expresando la proteína.

Como gen informador, por ejemplo, se puede usar el gen Ade2, el gen lacZ, el gen CAT, el gen de luciferasa y otros similares, además del gen HIS3.

Se puede someter a escrutinio un compuesto que se una a la proteína de la presente invención usando cromatografía de afinidad. Por ejemplo, la proteína de la invención se puede inmovilizar en un vehículo de una columna de afinidad, y se aplica una muestra de ensayo, que contiene una proteína capaz de unirse a la proteína de la invención que se supone se va a expresar, a la columna. En la presente memoria, una muestra de ensayo puede ser, por ejemplo, extractos celulares, lisatos celulares, etc. Tras cargar la muestra de ensayo, la columna se lava y se pueden preparar las proteínas unidas a la proteína de la invención.

Se analiza la secuencia de aminoácidos de la proteína obtenida, se sintetiza un oligo ADN en base a la secuencia, y se escrutan librerías de cADN usando como sonda el oligo ADN para obtener un ADN que codifique la proteína.

Como medio de detección o cuantificación del compuesto ligado de la presente invención se puede usar un biosensor que usa el fenómeno de resonancia de plasmón superficial. Cuando se usa un sensor de este tipo, la interacción entre la proteína de la invención y el compuesto de ensayo puede observarse en tiempo real como una señal de resonancia de plasmón superficial, usando únicamente una pequeña cantidad de proteína y sin marcar (por ejemplo, BIAcore, Pharmacia). Por lo tanto, es posible evaluar la unión entre la proteína de la invención y un compuesto de ensayo usando un biosensor tal como el BIAcore.

Los métodos de escrutinio de moléculas que se unen cuando se expone la proteína de la presente invención a compuestos químicos sintéticos, o a bancos de sustancias naturales, o a una librería de péptidos fagos aleatorios, o los métodos de escrutinio usando técnicas químicas combinatorias o de alta capacidad (Wrighton Nc, Farrel FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barret RW, Jolliffe LK, Dower WJ; Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (ESTADOS UNIDOS) 26 de Julio de 1996, 273, pág. 458-64; Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (INGLATERRA) 7 de Noviembre de 1996, 384, pág. 11-13, Hogan JC Jr.; Directed combinatorial chemistry. Nature (INGLATERRA) 7 de Noviembre de 1996, 384, pág. 17-9) para aislar no sólo proteínas sino también compuestos químicos que se unen a la proteína de la presente invención (incluyendo agonistas y antagonistas) son bien conocidos por el especialista en la técnica.

Un compuesto aislado mediante escrutinio es un candidato a fármaco que promueve o inhibe la actividad de la proteína de la presente invención, para el tratamiento o prevención de enfermedades atribuidas a, por ejemplo, enfermedades de proliferación celular tales como el cáncer. Entre los compuestos obtenidos mediante el método de escrutinio de la presente invención se incluye un compuesto en el que una parte de la estructura del compuesto obtenido mediante el presente método de escrutinio que presenta actividad de unión a la proteína de la presente invención se transforma por adición, eliminación y/o sustitución.

Además, la presente invención proporciona un método para el escrutar un compuesto que promueve o inhibe la actividad de la proteína de la presente invención. Puesto que la proteína ZNFN3A1 de la presente invención tiene la actividad de promover la proliferación celular, un compuesto que promueve o inhibe dicha actividad de la proteína ZNFN3A1 de la presente invención se puede someter a escrutinio usando dicha actividad como índice.

Este método de escrutinio incluye las etapas de: (a) cultivar células que expresan proteína ZNFN3A1 en presencia de la muestra sujeto, (b) detectar la proliferación de las células, y (c) seleccionar un compuesto que promueve o inhibe la proliferación en comparación con la proliferación detectada en ausencia de la muestra sujeto. Los compuestos que inhiben la expresión y/o la actividad de ZNFN3A1 presentan utilidad como agentes anticancerígenos.

Se puede usar cualquier proteína ZNFN3A1 para el escrutinio, siempre que comprenda la actividad de inhibir la proliferación celular. Por ejemplo, se puede usar una proteína ZNFN3A1 y también se pueden usar proteínas funcionalmente equivalentes a dichas proteínas. Las proteínas ZNFN3A1 se pueden ser expresadas por las células endógena o exógenamente.

Se puede usar cualquier muestra sujeto, por ejemplo, extractos celulares, sobrenadante de cultivo celular, productos de fermentación de microorganismos, extractos de organismos marinos, extractos de plantas, proteínas purificadas o crudas, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos macromoleculares sintéticos, compuestos naturales. Como compuesto sujeto también se puede usar un compuesto obtenido mediante el anterior escrutinio de compuestos que se unen a la proteína de la presente invención.

El compuesto aislado mediante dicho escrutinio es un candidato para agonista o antagonista de la proteína de la presente invención. El término "agonista" se refiere a moléculas que activan la función de la proteína de la presente invención uniéndose a ella. Además, un compuesto aislado mediante dicho escrutinio es un candidato para compuesto que inhibe la interacción in vivo de la proteína de la presente invención con moléculas (incluyendo ADNs y
proteínas).

Se puede detectar la proliferación celular, por ejemplo, determinando la velocidad de proliferación celular, midiendo el ciclo celular y similares, así como midiendo la actividad de formación de colonias tal como se describe en los Ejemplos.

El compuesto aislado mediante el escrutinio es un candidato a fármaco que inhibe la actividad de la proteína de la presente invención, y se puede aplicar al tratamiento de enfermedades asociadas a la proteína de la presente invención, por ejemplo, cáncer, más particularmente carcinoma hepatocelular.

Además, entre los compuestos que se pueden obtener por el método de escrutinio de la presente invención también se incluye el compuesto en el que una parte de la estructura del compuesto que inhibe la actividad de proteínas ZNFN3A1 se transforma por adición, eliminación y/o sustitución.

Cuando se administra el compuesto aislado mediante el método de la invención como producto farmacéutico para humanos y otros mamíferos, tal como ratones, ratas, cobayas, conejos, pollos, gatos, perros, ovejas, cerdos, ganado, monos, mandriles, chimpancés, el compuesto aislado se puede administrar directamente o se puede formular en una forma de dosis usando métodos de preparación farmacéutica conocidos. Por ejemplo, según sea la necesidad, los fármacos se pueden administrar oralmente, como comprimidos recubiertos con azúcares, cápsulas, elixires y microcápsulas, o no oralmente, en forma de inyecciones de disoluciones o suspensiones esterilizadas con agua o con cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, los compuestos se pueden mezclar con vehículos o medios farmacológicamente aceptables, específicamente, agua esterilizada, disolución salina fisiológica, aceite vegetal, emulsificantes, agentes de suspensión, tensioactivos, estabilizantes, agentes aromatizantes, excipientes, vehículos, conservantes, ligantes y otros similares, en la forma de dosis unitaria requerida para la implementación de fármacos generalmente aceptada. La cantidad de ingredientes activos en estas preparaciones es la correspondiente a una dosis adecuada dentro del intervalo indicado adquirible.

Los ejemplos de aditivos que se pueden mezclar con comprimidos y cápsulas son ligantes tales como gelatina, almidón de maíz, goma de tragacanto y goma arábiga; excipientes tales como celulosa cristalina; agentes de hinchamiento tales como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico; lubricantes tales como estearato de magnesio; edulcorantes tales como sacarosa, lactosa o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite de Gaultheria adenothrix y cereza. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, también se puede incluir en los ingredientes anteriores un vehículo líquido, tal como un aceite. Las composiciones estériles para inyecciones se pueden formular siguiendo implementaciones de fármacos normales usando vehículos tales como el agua destilada usada en inyecciones.

Como disoluciones acuosas para inyecciones se puede usar disolución salina fisiológica, glucosa, y otros líquidos isotónicos que incluyen adyuvantes, tales como d-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico. Se pueden usar en combinación con solubilizantes adecuados, tales como alcohol, específicamente etanol, polialcoholes tales como el propilénglicol y el polietilénglicol, tensioactivos no iónicos, tales como Polisorbato 80™ y HCO-50.

Se puede usar aceite de sésamo o aceite de semilla de soja como líquido oleaginoso, y puede usarse en combinación con benzoato de bencilo o alcohol bencílico como solubilizantes, y se puede formular con un tampón, tal como tampón de fosfato y tampón de acetato sódico; un analgésico, tal como hidrocloruro de procaína; un estabilizante, tal como alcohol bencílico, fenol; y un anti-oxidante. La inyección preparada se puede rellenar en una ampolla adecuada.

Se pueden usar métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica para administrar el compuesto farmacéutico inventivo a pacientes, por ejemplo como inyección intraarterial, intravenosa y percutánea, y también como administración intranasal, transbronquial, intramuscular u oral. La dosis y el método de administración varían de acuerdo con el peso corporal y la edad del paciente, y con el método de administración; sin embargo, el especialista en la técnica puede seleccionarlos de forma rutinaria. Si dicho compuesto es codificable mediante un ADN, el ADN se puede insertar en un vector para terapia génica, y el vector puede administrarse para llevar a cabo dicha terapia. La dosis y el método de administración varían de acuerdo con el peso corporal, la edad y los síntomas del paciente, pero el especialista en la técnica los puede seleccionar de forma rutinaria.

Por ejemplo, aunque existen algunas diferencias según los síntomas, la dosis de un compuesto que se une con la proteína de la presente invención y que regula su actividad es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg al día, preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50 mg al día, y más preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 20 mg al día, cuando se administra oralmente a un adulto normal (peso de 60 kg).

Cuando se administra parenteralmente, en la forma de una inyección a un adulto normal (peso de 60 kg), aunque existen algunas diferencias según sea el paciente, el órgano objetivo, los síntomas y el método de administración, conviene inyectar intravenosamente una dosis de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 30 mg al día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg al día, y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg al día. Asimismo, en el caso de otros animales, también es posible administrar una cantidad proporcional a los 60 kg de masa corporal.

Además, la presente invención proporciona un método para diagnosticar cáncer usando el gen ZNFN3A1 como marcador diagnóstico. Dicho método de diagnosis comprende las etapas de:

(a): determinar un nivel de expresión del gen ZNFN3A1 en una muestra biológica del espécimen;

(b): comparar el nivel de expresión del gen ZNFN3A1 con el de la muestra normal, y

(c): definir un nivel de expresión del gen ZNFN3A1 en la muestra como nivel a partir del cual existe cáncer.

Los niveles de expresión de gen ZNFN3A1 en un espécimen concreto se pueden estimar cuantificando el mARN correspondiente al gen ZNFN3A1, o codificado mediante proteína por el mismo. Los especialistas en la técnica conocen métodos de cuantificación para mARN. Por ejemplo, los niveles de mARNs correspondientes al gen ZNFN3A1 se pueden estimar mediante análisis Northern blot o mediante RT-PCR. Puesto que todas las secuencias de nucleótidos del gen ZNFN3A1 se muestran en la SEQ ID NO: 1, cualquier con conocimientos en la técnica puede diseñar las secuencias de nucleótidos para sondas o cebadores que cuantifiquen el gen ZNFN3A1.

También se puede analizar el nivel de expresión del gen ZNFN3A1 en base a la actividad o cantidad de proteína codificada por el gen ZNFN3A1. A continuación se muestra un método para determinar la cantidad de proteína ZNFN3A1. Por ejemplo, el método de inmunoensayo es útil para la determinación de la proteína en material biológico. Cualquier material biológico se puede usar para la determinación de la proteína o de su actividad. Por ejemplo, se analiza una muestra de sangre para estimar la proteína codificada mediante marcador de suero. Por otro lado, se puede seleccionar un método adecuado para la determinación de la actividad de proteína codificada por el gen ZNFN3A1 según la actividad de cada proteína que se analice.

Se estiman los niveles de expresión del gen ZNFN3A1 en un espécimen (muestra de ensayo) y se comparan con los de una muestra normal. Cuando dicha comparación muestra que el nivel de expresión del gen ZNFN3A1 es superior al de la muestra normal, se determina que el sujeto tiene un cáncer. Los niveles de expresión del gen ZNFN3A1 en los espécimenes de muestra normal y de muestra sujeto pueden determinarse al mismo tiempo. Alternativamente, los intervalos normales de niveles de expresión se pueden determinar mediante un método estadístico basado en los resultados obtenidos analizando el nivel de expresión del gen ZNFN3A1 en espécimenes seleccionados previamente de un grupo de control. Un resultado obtenido mediante el examen de la muestra de un sujeto se compara con el intervalo normal; cuando el resultado no se encuentra dentro del intervalo normal, se determina que el sujeto tiene un cáncer. En la presente invención, el cáncer que se diagnostica es preferiblemente un carcinoma hepatocelular.

En la presente invención, también se proporciona una agente diagnóstico para diagnosticar el carcinoma hepatocelular. El agente diagnóstico de la presente invención comprende un compuesto que se une al ADN o a la proteína de la presente invención. Preferiblemente, como dicho compuesto se puede usar el oligonucleótido que se hibrida con el polinucleótido de la presente invención, o los anticuerpos que se pueden unir a la proteína de la presente invención.

Los siguientes Ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para asistir al especialista en la técnica a la hora de realizar y usar la misma. Los ejemplos no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la invención.

Ejemplos El Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se ilustra con detalle en los siguientes Ejemplos, aunque no queda limitada a dichos Ejemplos.

Materiales y Métodos

Para aislar y caracterizar ZNFN3A1 se usó una serie de células hospedantes de mamífero, incluyendo la línea celular humana Huh7 y Alexander de hepatoma, la línea celular humana HeLa de cerviz y la línea celular de ratón NIH3T3 de fibroblasto, todas las cuales fueron obtenidas en la American Type Culture Collection (ATCC). También se usaron las líneas celulares humanas SNU423 y SNU475 de hepatoma y se obtuvieron del banco de líneas celulares de Corea. Todas las líneas celulares fueron cultivadas en monocapas y en medios apropiados: medio de Eagle modificado de Dulbecco para las Huh7, Alexander y NIH3T3; Medio Esencial Mínimo de Eagle para las HeLa; RPM1640 para las SNU423 y SNU475 complementado con un 10% de suero bovino fetal y un 1% de disolución antibiótica/antimicótico (Sigma), y se cultivaron a 37°C en aire que contiene un 5% de CO_{2}.

La clonación de ZNFN3A1 se realizó generalmente mediante PCR usando KOD-plus (TOYOBO). Para la expresión de E. coli, se clonó la región codificadora de ZNFN3A1 en la posición EcoR I-Knp I de pET21a.

Para la expresión celular en mamíferos, se clonó la región codificadora de ZNFN3A1 en la posición EcoR I-Kpn I de pcDNA3.1 (+) y (-) (Invitrogen), en la posición EcoR I-Kpn I de pFLAG y en la EcoR I-Kpn I de pEGFP (Clontech). La región codificadora de KIAA0054 se clonó en la posición EcoR I-Xho I de pCMV-HA (Clontech).

Se preparó el ARN en los siguientes experimentos extrayendo el ARN total con el kit Qiagen RNeasy (Qiagen) o con el reactivo Trizol (Life Technologies), según el protocolo del fabricante.

En el presente trabajo el ARN se amplificó mediante RT-PCR. Se trascribieron 10 \mug de ARN total inversamente para los cADNs de cadena sencilla usando cebador poli dT_{12,18} (Amersham Biosciences) con trascriptasa inversa Superscript II (Life Technologies). Cada cADN de cadena sencilla se diluyó para una posterior amplificación PCR. Se llevó a cabo RT-PCR estándar en un volumen de 20 \muL de tampón de PCR (TAKARA), y se amplificó durante 4 minutos a 94ºC para desnaturalizar, seguido de 20 ciclos (para GAPDH) o de 30 ciclos (para ZNFN3A1) de 30 s a 94°C, 30 s a 56°C, 30 s a 72°C, en el sistema Gene Amp PCR 9700 (Perkin-Elmer). La secuencia del cebador es como sigue, para GAPDH hacia delante; 5'-ACAA-CAAGCCTCAAGATCATCAG (SEQ ID NO: 4) e inversa; 5'-GGTC
CACCACTGACACGTTG (SEQ ID NO: 5), para ZNFN3A1 hacia delante; 5'-TTCCCGATATCAACATCTACCAG (SEQ ID NO: 6) e inversa; 5'-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT (SEQ ID NO: 7).

Para la detección de ZNFN3A1, se generó anticuerpo policlonal de conejo anti-ZNFN3A1. Se amplificó la secuencia completa de ZNFN3A1 mediante reacción PCR usando cADN de testículos como molde, y se clonó en pET21 a (Novagen). El vector clonado fue transfectado en células competentes BL21-CodonPlus® (Stratagene). Se indujo proteína ZNFN3A1 recombinante mediante IPTG 1,0 mM a 30°C durante 6 horas. Se purificó la proteína de fusión His-ZNFN3A1 usando Resina Pro Bond™ (Invitrogen). Se inmunizaron conejos diez veces con His-ZNFN3A1. La inmunotinción con este anticuerpo policlonal mostró una única banda de 50 kD de ZNFN3A1 marcado con FLAG, con una estructura idéntica a la detectada usando anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma) (datos no mostrados).

El efecto de ZNFN3A1 en la progresión del ciclo celular se determinó mediante citometría de flujo. Se colocó las células en placa con una densidad de 1 x 10^{5} células/100 mm de plato. Las células fueron tripsinizadas en un momento dado, recogidas en PBS y fijadas en etanol frío al 70%. Tras un tratamiento con ARNasa, las células fueron teñidas con yoduro de propidio (50 \mug/mL) en PBS. Se llevó a cabo la citometría de flujo en un FACScan Becton Dickinson y se analizó con software CellQuest y ModFit (Verita Software House). Se determinaron los porcentajes de núcleos en las fases G0/G1, S y G2/M del ciclo del ciclo celular, y cualquier población sub-G1, a partir de al menos 20.000 células sin puerta.

También se llevó a cabo inmunotinción e inmunohistoquímica en varios experimentos. Para la inmunotinción, las células fueron lavadas dos veces con PBS y cosechadas en tampón de lisis (NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, DTT 1 mM, y 1x Cóctel Inhibidor de Proteasa completo (Roche)). Después de que las células fueran homogeneizadas y centrifugadas a 10.000 x g durante 30 minutos, el sobrenadante fue estandarizado para determinar la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE al 10% e inmunoteñidas con anti-FLAG de ratón, polimerasa II anti-ARN de conejo, anticuerpo anti-HA de conejo y anticuerpo anti-ZNFN3A1 de conejo. IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP e IgG anti-conejo sirvieron como anticuerpo secundario para el Sistema de Detección ECL (Amersham Biosciences).

Para la inmunohistoquímica, se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica usando anticuerpo anti-ZNFN3A1. Varias secciones de tejido embebido en parafina fueron sometidas al sistema de inmunotinción de peroxidasa SAB-PO (Nichirei, Tokio, Japón) según el método recomendado por el fabricante. Los antígenos fueron recuperados de los tejidos desparafinados y rehidratados mediante el pretratamiento de las placas en tampón de citrato (pH 6) en un horno microondas durante 10 minutos a 700 W.

Ejemplo 1

Identificación de un nuevo gen frecuentemente regulado al alza en HCCs

Usando un microconjunto de cADN de amplitud genómica con 23040 genes, identificamos una secuencia etiqueta expresada (EST), que normalmente era regulada al alza en los HCCs positivos en hepatitis B y/o positivos en hepatitis C. De todos ellos, nos centramos en un gen, el A6681, correspondiente a una EST (Hs. 8109), ya que su expresión era significativamente regulada al alza en once de doce (91,7%) HCCs clínicos, en comparación con los correspondientes tejidos de hígado no cancerosos (Figura 1A). La elevada expresión del gen A6681 también se confirmó en otros 10 casos de HCC mediante RT-PCR (Figura 1B). La expresión relativa confirmada mediante RT-PCR semicuantitativa coincidió bastante bien con la confirmada mediante microconjunto de cADN.

Ejemplo 2A

Aislamiento y caracterización de un nuevo gen humano, ZNFN3A1

Se usaron ensayos northern blot multi-tejido de Clontech para hibridar un cADN de A6681 parcial marcado con ^{32}P con un tráscrito de aproximadamente 1,7 Kb de testículo y músculo esquelético, adquirido en Clontech. (Figura 1C). La sonda A6681 se preparó mediante RT-PCR usando un conjunto de cebadores, 5'-TTCCCGATATCAACATC
TACCAG-3' (SEQ ID NO: 6) y 5'-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3' (SEQ ID NO: 7). Se llevó a cabo una pre-hibridación, una hibridación y un lavado de acuerdo con las recomendaciones del suministrador. Las manchas fueron autorradiografiadas con monitores de intensificación a 80ºC durante 24 horas. El tráscrito de polinucleótido de aproximadamente 1,7 kb se denominó gen ZNFN3A1.

La secuencia de la región 5' del tráscrito se determinó mediante amplificación rápida 5' de extremos de cADN (5'RACE), que se llevó a cabo usando el kit de amplificación de cADN Maratón de Clontech de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la amplificación de la parte 5' del cADN de ZNFN3A1, se usó un cebador inverso específico de gen (5'-CTGCCAAGAAGTCGGAGTCTGGAG) (SEQ ID NO: 8). El molde de cADN se sintetizó a partir de mARN de testículo humano mediante RT-PCR. Los productos PCR se clonaron usando el kit de clonación TA de Invitrogen y se determinaron sus secuencias con un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 de Applied Biosystems. Como resultado, se montó una secuencia de 1622 nucleótidos y se obtuvo como se muestra y se describe en la SEQ ID NO: 1, que contenía un marco de lectura abierto de 1284 nucleótidos que codifican 428
aminoácidos.

Debido a que no se identificaron clones de EST que contienen la parte 5' del gen ZNFN3A1 en las bases de datos EST, se buscaron secuencias genómicas correspondientes al cADN de ZNFN3A1 en las bases de datos genómicas. En la comparación de secuencias genómicas se encontraron secuencias de cósmidos que fueron asignadas a la banda cromosomal 1q44, que también incluía el gen ZNFN3A1. Usando GENSCAN y Gene Recognition (GENSCAN del MIT (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) y GRAIL 2 del IMS (http://www.genome.ad.jp)) y el programa Assembly Internet Link (AutoAssembler 2.1) suministrado por ABI, se predijeron las secuencias de exón candidatas, y se llevó a cabo la conexión a exón.

Ejemplo 2B

Aislamiento y caracterización de una nueva proteína humana. ZNFN3A1

Con la secuencia de 1622 nucleótidos que contenía un marco de lectura abierto que codificaba 428 aminoácidos, se identificó la proteína ZNFN3A1 usando una Herramienta de Investigación de Arquitectura Modular Simple (SMART) de EMBL (http://smart.embl-heidelberg.de). El SMART sugirió que la proteína ZNFN3A1 contenía un dominio zf-MYND (proteína de dedo de cinc (que contiene dominio MYND)) (codones 49-87) así como un dominio SET ((Su (var) 3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax)) (codones 117-246) (Figura 2A). La secuencia de aminoácidos de la proteína ZNFN3A1 compartía un 94% de identidad con la secuencia de aminoácidos del cADN de células ES de músculo Mus (Número de acceso de GenBank: AK010447) (Figura 2B) y el gen que codifica la proteína fue denominada "ZNFN3A1"/(proteína de dedo de cinc, subfamilia 3A (que contiene dominio MYND), 1) por el comité de nomenclatura.

Ejemplo 3

Localización Sub-celular de ZNFN3A1

La región codificadora completa correspondiente al ZNFN3A1 se clonó en un vector pEGFP-N1 y en un vector pFLAG-CMV-5a, y dichas construcciones fueron transfectadas en células SNU475 y fueron expresadas. La expresión de ZNFN3A1 marcada con EGFP y de ZNFN3A1 marcada con FLAG se confirmó mediante análisis western blot (datos no mostrados). Ambas, la proteína de fusión ZNFN3A1-EGFP y la proteína ZNFN3A1 marcada con FLAG, fueron detectadas homogéneamente en el citoplasma y en el núcleo mediante inmunocitoquímica fluorescente (Figura 3A-F). Se observó la localización sub-celular de la proteína ZNFN3A1 endógena usando anticuerpos específicos contra ZNFN3A1.

Cabe destacar que la localización subcelular de la proteína ZNFN3A1 se altera durante la progresión del ciclo celular, o debido a la densidad de células cultivadas. Llevando a cabo inmunocitoquímica sobre la proteína ZNFN3A1 endógena, se localizó una determinada cantidad de proteínas en el núcleo para el caso de un cultivo de baja concentración celular (Figura 3G-I y Figura 3M-O). Sin embargo, para el caso de un cultivo de alta concentración celular, la mayoría de la proteína ZNFN3A1 se localizó en el citoplasma (Figura 3J-L y Figura 3P-R). Estos resultados revelaron que la sub-localización de la ZNFN3A1 depende de la concentración celular. La ZNFN3A1 se acumula en el núcleo cuando las células se encuentran en la fase S media o tardía o cuando se cultivan en condiciones de baja concentración, mientras que la ZNFN3A1 se localiza en el citoplasma y en el núcleo cuando se encuentran en otras fases o cuando se cultivan en condiciones de alta densidad.

Se llevó a cabo inmunocitoquímica fijando células cultivadas sobre placas de cámara con PBS que contenía un 4% de paraformaldehído durante 15 minutos, a continuación se permeabilizó con PBS que contenía un 0,1% de Triton X-100 durante 2,5 minutos a temperatura ambiente. Se cubrió las células con BSA al 2% en PBS durante 24 horas a 4°C para bloquear la hibridación no específica, y a continuación se incubó en anticuerpo anti-FLAG de ratón con una dilución 1:2000 y en anticuerpo anti-ZNFN3A1 de conejo a 1:3000 para el primer anticuerpo.

Los anticuerpos eran IgG anti-ratón conjugados de sustrato fluorescente y segundo anticuerpo IgG anti-conejo (ICN/Cappel y Jackson Immuno Research). Se contabilizaron los núcleo teñidos con dihidrocloruro de 4',6'-diamidina-2'-fenilindol (DAPI). La imagen fluorescente se obtuvo con un microscopio ECLIPSE E800.

La localización de ZNFN3A1 puede ser dependiente del ciclo celular y por tanto se analizó el ciclo celular usando citometría de flujo a diferentes concentraciones celulares de células SNU475. Las células fueron colocadas en placa con una densidad de 1 x 10^{5} células/100 mm de plato. Las células fueron tripsinizadas en el momento dato, se recogieron en PBS y se fijaron en etanol frío al 70%. Tras un tratamiento con ARNasa, las células fueron teñidas con yoduro de propidio (50 \mug/mL) en PBS. Se llevó a cabo una citometría de flujo sobre un FACScan Becton Dickinson y se analizó con software CellQuest y ModFit (Verita Software House). Los porcentajes de núcleos en las fases G0/G1, S y G2/M del ciclo celular, y cualquier población sub-G1, se determinaron a partir de al menos 20.000 células sin
puerta.

Comparada con la concentración celular baja y con la concentración celular alta, la población de células en la fase G0/G1 aumentó en el caso de la concentración celular elevada, sin embargo la población de células en la fase S y G2/M disminuyó drásticamente. Para determinar el efecto del ciclo celular en la localización de ZNFN3A1 con más detalle, se sincronizaron células Huh7 usando afidicolina y se observó la localización sub-celular de ZNFN3A1 (Figura 4a, b). La mayoría de las células Huh7 se mantuvieron en la fase G0/G1 36 h después del tratamiento con afidicolina y la ZNFN3A1 se localizó en el citoplasma. Cuando se eliminó la afidicolina del medio de cultivo, el ciclo celular progresó y la proteína ZNFN3A1 se movió desde el citoplasma hasta el núcleo. Estos datos demostraron que la localización sub-celular de la proteína ZNFN3A1 estaba regulada por el estado del ciclo celular, y que la proteína ZNFN3A1 se desplazó hasta el núcleo en la condición proliferativa.

Ejemplo 4

Promoción del crecimiento de células NIH3T3 de línea celular de tejido normal mediante ZNFN3A1

Para analizar los efectos de la transferencia del gen ZNFN3A1 sobre el crecimiento de líneas celulares de hepatoma, se transfectaron células NIH3T3 de línea celular de tejido normal con un plásmido de expresión pcDNA3.1 que contenía ZNFN3A1 sentido y ZNFN3A1 antisentido.

Se transfectó células NIH3T3 mediante vectores pcDNA3.1 (Invitrogen) que contenían la secuencia de codificación completa de ZNFN3A1 usando el reactivo de transfección FuGENE 6 de acuerdo con las recomendaciones del suministrador. Se mantuvo las células en DMEM que contenía FBS al 10% y 0,9 mg/mL de geneticina, y se seleccionaron las colonias sencillas. La expresión de ZNFN3A1 constitutiva se determinó mediante RT-PCR.

De forma general, las células NIH3T3 no mostraron expresión endógena de mARN de ZNFN3A1. En la formación de la colonia, el vector de expresión de ZNFN3A1 sentido promovió la formación de la colonia en células NIH3T3 en comparación con los vectores de prueba y de ZNFN3A1 antisentido, que no presentaron crecimiento, como se muestra en las Figuras 5A y 5B.

Se llevaron a cabo ensayos de formación de colonia sobre las células dispuestas en placas con una densidad de 1 x 10^{5} células/100 mm de plato. Tras 24 horas, las células fueron transfectadas con el vector plásmido usando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche) y fueron cultivadas con la concentración de geneticina apropiada durante 2 semanas. Las células se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con disolución de Giemsa. Estos ensayos de formación de colonia fueron confirmados con tres experimentos independientes.

Para profundizar en la investigación de los efectos promotores del crecimiento del ZNFN3A1, se continuó examinando células transfectantes de NIH3T3 estables de ZNFN3A1. Las células transfectantes estables de ZNFN3A1 sentido expresaron mARN constitutivo de ZNFN3A1 (Figura 5C, 5D). La expresión se determinó mediante RT-PCR. Tal como se muestra en la Figura 5C, 5D, el clon que expresaba ZNFN3A1 mostró constantemente una elevada capacidad de crecimiento en comparación con ZNFN3A1 antisentido y con las células transfectantes de vector de control, lo que demuestra que el ZNFN3A1 desempeña un papel importante en la promoción del crecimiento de células de carcinoma hepatocelular.

Ejemplo 5

La expresión reducida de ZNFN3A1 mediante oligonucleótidos antisentido suprime el crecimiento de células de hepatoma

Para examinar si la supresión de ZNFN3A1 puede inducir un retardo en el crecimiento y/o la muerte celular en células de HCC, se sintetizaron varios S-oligonucleótidos antisentido para suprimir la expresión de ZNFN3A1. Se transfectaron S-oligonucleótidos sentido o antisentido de ZNFN3A1 que abarcaban el codón de inicio usando Reactivo LIPOFECTIN (GIBCO-BRL). Las secuencias de ODNs modificados con fosforotioato fueron las siguientes: S-oligonucleótidos antisentido; 5'-GCGGGAGGATGGAGCC (SEQ ID NO: 3).

Las células se cultivaron con los S-oligonucleótidos antisentido y sentido durante 24 horas, y se analizaron para determinar la expresión de ZNFN3A1 mediante RT-PCR y análisis de western blot usando anticuerpos anti-ZNFN3A1.

Las células transfectadas con S-oligonucleótidos antisentido, que abarcan el codón de inicio redujeron significativamente la expresión endógena de ZNFN3A1 en células SNU475 y Huh7, que expresan constitutivamente una cantidad abundante de ZNFN3A1 (Figura 6A, B). La transfección de S-oligonucleótidos antisentido también suprimió significativamente el número de células del tipo Huh7 y SNU475, medido mediante un ensayo de formación de colonias como el descrito previamente.

Se llevó a cabo un ensayo MTT colocando células en placas con una densidad de 5 x 10^{5} células/100 mm de plato. Al día siguiente, las células fueron transfectadas por triplicado con S-oligonucleótidos sentido o antisentido de ZNFN3A1. Tras 72 horas de cultivo, el medio se reemplazó con 10 mL de medio fresco que contenía 5 mg de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio en bromuro (MTT) (SIGMA). Tras otras 4 horas de incubación a 37ºC, las células fueron sometidas a lisis mediante la adición de 1 mL de HCl 0,01 N/SDS al 10%. Se cuantificó la reacción de color con un lector de placas ELISA a una longitud de onda de ensayo de 570 nm (referencia, 630 nm). Se representó la viabilidad celular mediante la absorbancia en comparación con el control.

También se observó una supresión del crecimiento celular a partir de la transfección de ZNFN3A1 antisentido en otras líneas celulares de HCC, incluyendo células de Alexander y células SNU423, las cuales también expresan constitutivamente una cantidad abundante de ZNFN3A1 en comparación con los S-oligonucleótidos de control, tal como se muestra en la Figura 6C, 6D. Los resultados del ensayo de formación de colonias se confirmaron mediante tres experimentos independientes. Además, la citometría de flujo demostró que la inhibición de la expresión de ZNFN3A1 redujo significativamente el número de células en la población de fase S y aumentó el número de la fase sub-G1 (Figura 6E). Estos resultados revelaron que la supresión de la expresión de ZNFN3A1 indujo la inhibición del crecimiento y la promoción de la apoptosis de HCC.

Ejemplo 6

Interacción de ZNFN3A1 con helicasa KIAA0054 de ARN

Para examinar el mecanismo oncogénico del ZNFN3A1, se buscaron proteínas que interaccionan con ZNFN3A1 usando el sistema de escrutinio de dos híbridos de levadura. El ensayo de dos híbridos de levadura se realizó con el MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 y el System 3 de Clontech, siguiendo los protocolos del fabricante. Se clonó la secuencia codificadora completa de ZNFN3A1 en la posición EcoR I de pAS2-1 como vector cebo. Para el escrutinio de librería, se clonó una librería de testículo humano en pACT2 (Clontech). Se colocaron en placa células de levadura AH109 co-transformadas simultáneamente (con vector cebo pAS2-1 y con una serie de vectores presa pACT2) en Medio mínimo SD (-Adel-Hisl-Leul-Trp), además de 25 mg/L de X-\alpha-Gal (Clontech) y 3-amino-1,2,4-trizol 25 mM (Sigma). El plásmido de librería se aisló a partir de colonias positivas, y se confirmó la secuencia y el marco.

Entre los clones identificados, la región C-terminal de la helicasa KIAA0054 de ARN interaccionó con ZNFN3A1 mediante una transformación simultánea usando pAS2.1-ZNFN3A1 y pACT2-KIAA0054 (Figura 7A, 7B). Las helicasas de ARN constituyen una familia de proteínas que se desenrollan en ARN de doble cadena usando trifosfatos de nucleósido como fuente de energía. Es evidente que las helicasas de ARN son un grupo ampliamente disperso de proteínas que se encuentran en virtualmente todos los procesos biológicos.

Para confirmar la interacción de ZNFN3A1 con KIAA0054, se preparó proteína ZNFN3A1 marcada con FLAG. Se transfectaron células HeLa con 8 \mug de ADN de pFLAG-CMV-ZNFN3A1 y de pCMV-HA-KIAA0054 por cada 10 cm de plato, y se recogieron después de otras 48 horas. Las células fueron lavadas una vez con tampón de fosfato sódico 10 mM una vez (pH 7,4) que contiene NaCl 150 mM (PBS) y se sometieron a lisis en tampón NET-N (NaCl 150 mM, NP-40 al 0,5%, Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, y 1 x Cóctel Inhibidor de Proteasa completo). En una reacción de inmunoprecipitación típica, se incubaron 300 \mug del extracto de lisato de células enteras HeLa con 1 \mug del anticuerpo deseado y 20 \muL de perlas de Sefarosa de proteína A o de proteína G (Zymed) a 4°C durante 1-2 h. Las perlas fueron lavadas cuatro veces en 1 mL de tampón NET-N. Las proteínas ligadas a las perlas se eluyeron mediante ebullición en tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se usaron para inmunotinción como se ha descrito anteriormente. El lisato se analizó directamente mediante inmunotinción con anticuerpos anti-FLAG y con anticuerpos anti-HA como control. La proteína ZNFN3A1 reveló su asociación a proteína KIAA0054 marcada con HA expresada en células de mamífero HeLa (Figura 7C).

Para identificar la región de ZNFN3A1 responsable de su interacción con KIAA0054, se llevó a cabo un ensayo de dos híbridos usando fragmentos de eliminación de ZNFN3A1. Los mutantes que carecían de los aminoácidos 1 a 250 ó 100 a 428 dieron negativo en la interacción con la región C-terminal de KIAA0054, mientras que un fragmento que contenía los aminoácidos 100 a 250 dio positivo (Figura 8). Esto indica que la región de unión de ZNFN3A1 reside en la región del dominio SET.

Ejemplo 7

Interacción entre ZNFN3A1, helicasa de ARN y polimerasa II de ARN

La helicasa de ARN desempeña un papel crucial en la trascripción mediante unión a factor de trascripción y polimerasa II de ARN. Estos resultados revelaron que existe una posibilidad de que la proteína de dedo de cinc ZNFN3A1 regulara la trascripción a través de la asociación no sólo con helicasa KIAA0054 de ARN sino también con polimerasa II de ARN. La asociación entre ZNFN3A1, helicasa KIAA0054 de ARN y polimerasa II de ARN se evaluó mediante co-inmunoprecipitación (Figura 9). Se transfectaron células HeLa con 8 \mug de ADN de pFLAG-CMV-ZNFN3A1 y de pCMV-HA-KIAA0054 por cada 10 cm de plato, y se recogieron después de otras 48 horas. Las células se lavaron una vez con tampón de fosfato sódico 10 mM una vez (pH 7,4) que contiene NaCl 150 mM (PBS) y se sometieron a lisis en tampón NET-N (NaCl 150 mM, NP-40 al 0,5%, Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, y 1 x Cóctel Inhibidor de Proteasa completo). En una reacción de inmunoprecipitación típica, se incubaron 300 \mug de extracto de célula entera con 1 \mug de anticuerpos y 20 \muL de perlas de Sefarosa de proteína A o de proteína G (Zymed) a 4°C durante 1-2 horas. Las perlas se lavaron cuatro veces en 1 mL de tampón NET-N. Las proteínas ligadas a las perlas se eluyeron mediante ebullición en tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron usadas para inmunotinción como se ha descrito anteriormente.

Se detectó una asociación con polimerasa II de ARN endógeno usando anticuerpos anti-FLAG, anticuerpos anti-HA y anticuerpos anti-polimerasa II de ARN. Cuando se usa un anticuerpo anti-FLAG para la inmunoprecipitación y un anticuerpo anti-polimerasa II de ARN para la inmunotinción, se detectó una banda intensa específica de polimerasa II de ARN en el caso de que haya expresión conjunta de proteína FLAG-ZNFN3A1 y de proteína HA-KIAA0054, y se detectó marginalmente en el caso de que haya expresión únicamente de la proteína FLAG-ZNFN3A1. Por otro lado, cuando se usó anticuerpos anti-HA para la inmunoprecipitación y anti-polimerasa II de ARN para la inmunotinción, se detectó la banda específica de polimerasa de ARN con intensidad no sólo en el caso de las proteínas que expresan FLAG-ZNFN3A1 y HA-KIAA0054 conjuntamente, sino también en la proteína que expresa únicamente HA-KIAA0054. Además, la co-inmunoprecipitación se trabajó de forma reversible cambiando el anticuerpo para inmunoprecipitación y para inmunotinción. Los resultados fueron similares en el caso del uso del anticuerpo opuesto. Estos resultados demuestran que la helicasa de ARN KIAA0054 puede mediar en la formación de complejos entre la proteína ZNFN3A1 y la polimerasa II de ARN a través del contacto con cada proteína. De este modo, la regulación trascripcional mediante ZNFN3A1, helicasa de ARN KIAA0054 y polimerasa II de ARN puede desempeñar un papel importante en la promoción del crecimiento celular en la carcinogénesis hepatocelular. La Figura 12 es una ilustración del complejo formado entre la ZNFN3A1, la helicasa de ARN y la polimerasa II de ARN para regular la trascripción del gen.

Ejemplo 8

Unión específica de secuencia de la proteína ZNFN3A1

Se determinó una posición de unión de ADN de consenso para la ZNFN3A1 usando una construcción de oligonucleótido que contiene un núcleo de 20 nucleótidos aleatorios. Se buscaron las secuencias putativas de consenso que fueran capaces de asociarse a la proteína ZNFN3A1 in vitro por medio de selección de ADN usando oligonucleótidos aleatorios. Se preparó una proteína de fusión GST-ZNFN3A1 y se inmovilizó con Sefarosa 4B, y se seleccionaron ADNs de oligonucleótidos aleatorios de doble cadena que se asociaron a la proteína. Tras diez ciclos de selección y posterior amplificación, el ADN amplificado fue clonado en vector pCR (Clontech) y se secuenciaron 92 clones. Entre los 92 clones, 32 (el 34,8%) contenían una secuencia de consenso de 5'-CCCTCC-3', lo que supone una incidencia 102 veces mayor que la probabilidad calculada (Figura 10A). Para preparar proteína recombinante que exprese el dominio de dedo de cinc de ZNFN3A1, se amplificó un fragmento de cADN correspondiente a los codones de longitud completa de ZNFN3A1 mediante RT-PCR usando un conjunto de cebadores, 5'-CGGAATTCATGGAGCCGCTGAAGGTG
GAAAAG-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-CCGCTCGAGGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3' (SEQ ID NO: 10), que fue subclonado en una posición de clonación apropiada del plásmido pGEX-6P. Se preparó la proteína de fusión recombinante y se purificó mediante una columna de Sefarosa 46, tal como se ha descrito previamente. Los oligonucleótidos de secuencia "5'-GGGAGAATTCCGACACGCGT(N20)CTCGAGCGTCTACATGGATCCTCA-3'" (SEQ ID NO: 11) se usaron para la selección y amplificación tal como se ha descrito previamente.

Usando la Base de Datos de Promotores Eucarióticos (http://www.epd.isb-slb.ch/index.html), se buscaron genes candidatos de ZNFN3A1 y se seleccionaron cinco genes candidatos. Primero, el nivel de expresión de cada gen se determinó mediante RT-PCR semicuantitativo en transformante estable de COS7 que expresaba exógenamente ZNFN3A1 (Figura 10B). Estos resultados revelaron que la expresión de EGFR, c-myc y Bc12 fue regulada al alza por ZNFN3A1.

Se identificaron cuatro posiciones de unión putativas para la ZNFN3A1, cuya secuencia diana de consenso es 5'-(C)CCCTCC(T) ó (A)GGAGGG(G)-3', en la región vecina de EGFR, entre -213-pb y -207-pb (CBS1), entre -106-pb y -100-pb (CBS2), entre -65-pb y -59-pb (CBS3) y entre -46-pb y -40-pb (CBS4). Se preparó un plásmido (P1) informador natural que contenía CBS1, CBS2, CBS3 y CBS4, así como cuatro construcciones de eliminación del plásmido (P2, P3, P4 y P5) mediante la clonación de cada secuencia en las posiciones enzimáticas apropiadas del vector pGL3-Basic (Promega). Los plásmidos P1, P2, P3, P4 y P5 se construyeron mediante la amplificación de P1-F (5'-GGGG
TACCCAGTGCTGGGAACGCCCCTCTCG-3') (SEQ ID NO: 12), P2-F (5'-GGGGTACCCACTCCCGCCGGA
GACTAGGTCC-3') (SEQ ID NO: 13), 3-F (5'-GGGGTACCCTCGCATTCTCCTCCTCCTCTGC-3') (SEQ ID NO: 14), 4-F (5'-GGGGTACCTGGTCCCTCCTCCTCCCGCCCTG-3') (SEQ ID NO: 15) ó P5-F (5'-GGGGTACCTCCC
GCCCTGCCTCCCGCGCCTC-3') (SEQ ID NO: 16), con el mismo cebador inverso (P1-R; 5'-GAAGATCTAG GTGGCCTGTC GTCCGGTCTG G-3') (SEQ ID NO: 17). Se llevó a cabo mutagénesis dirigida a posición para ambas posiciones de unión putativas de ZNFNF3A1, sustituyendo CCCTCC por CATTCC usando el kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit, según las recomendaciones del suministrador (Stratagene).

Cada plásmido informador (2 \mug) se co-transfectó con 0,2 \mug de plásmido pRL-TK (Promega) usando Reactivo FuGENE6 (Boehringer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo ensayos de luciferasa usando un Sistema de Ensayo Informador de Luciferasa (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante.

Ejemplo 9

Regulación al alza de la actividad del promotor EGFR por ZNFN3A1

Puesto que se publicado que se produce un aumento en la expresión de EGFR en HCCs, nos hemos centrado en dicha molécula receptora y hemos evaluado si su promotor es regulado por las secuencias de unión a ZNFN3A1. Identificamos cuatro posibles estructuras de unión de ZNFN3A1 (CSB1, 2, 3 y 4) en su región lateral 5', y preparamos plásmidos informadores que contienen las cuatro estructuras (P1) así como varias formas de eliminación (P2, P3, P4 y P5). Cuando estos plásmidos informadores fueron transfectados en células SNU475, la actividad de P1 fue significativamente mayor que la de P2, P3, P4 ó P5. Puesto que la actividad de P4 era muy similar a la de P5, se sospecha que una región entre -261 y -50, que contiene CBS1, CBS2 y CBS3, podría estar asociada a la activación trascripcional de EGFR. Para describir el papel de estos dominios, construimos plásmidos informadores que contienen el mutante CBS1 (P1m1) y el mutante CBS2 (P1m2) o el mutante CBS3 (P1m3) en los que se cambiaron las estructuras candidatas de 5'-CCCTCC-3' por 5'-CATTCC-3' (Figura 11A). Los ensayos informadores revelaron que los fragmentos que contenían estructuras mutadas (P1m1, P1m2 y P1m3) activaron la trascripción de EGFR mucho más débilmente de lo que lo hizo el P1 (Figura 11B). Estos resultados implican que las tres estructuras de unión putativas de ZNFN3A1 están involucradas en la activación trascripcional de EGFR.

Aplicabilidad industrial

La expresión del nuevo gen humano ZNFN3A1 se ve drásticamente elevada en el carcinoma hepatocelular en comparación con tejidos de hígado no cancerosos. Por consiguiente, este gen puede servir como marcador de diagnosis de HCC y por tanto la proteína codificada por el mismo puede usarse en ensayos diagnósticos.

Los presentes inventores también han demostrado que la expresión de la nueva proteína ZNFN3A1 promueve el crecimiento celular, mientras que el crecimiento celular es suprimido por oligonucleótidos antisentido correspondientes a la ZNFN3A1. Estos descubrimientos sugieren que la ZNFN3A1 estimula la actividad oncogénica. Por tanto, esta nueva oncoproteína es una diana útil para el desarrollo de productos farmacéuticos anticancerígenos. Por ejemplo, los agentes que bloquean la expresión de ZNFN31 o que previenen su actividad pueden encontrar una utilidad terapéutica como agentes anticancerígenos, concretamente como agentes anticancerígenos para el tratamiento de HCC. Los ejemplos de dichos agentes incluyen oligonucleótidos antisentido y anticuerpos que reconocen a ZNFN3A1.

Adicionalmente, los presentes inventores han demostrado que la ZNFN3A1 se asocia directamente a una helicasa de ARN y forma un complejo con polimerasa II de ARN. Dicho complejo activa la trascripción de genes diana posteriores, incluyendo el EGFR, a través de la unión directa del complejo con un elemento "(C)CCCTCC(T)" de la región lateral 5'. Por tanto, los agentes que inhiben la actividad del complejo también pueden encontrar utilidad en el tratamiento y en la prevención de HCC.

<110> JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO ONCOTHERAPY SIENCE, INC..

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<120> Gen y proteína relacionados con el carcinoma hepatocelular

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<130> ONC-A0206P

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<150> US 60/324.261

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<151> 25-09-2001

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<150> US 60/391.666

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<151> 26-06-2002

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<150> CA

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<151> 23-08-2002

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<160> 17

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1622

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (96) .. (1382)

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<223>

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 428

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

6

7

8

9

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<210> 3

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<211> 16

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 3

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gcgggaggat ggagcc

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16

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<210> 4

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 4

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acaacagcct caagatcatc ag

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22

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<210> 5

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 5

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ggtccaccac tgacacgttg

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20

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<210> 6

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 6

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ttcccgatat caacatctac cag

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23

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<210> 7

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 7

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agtgtgtgac ctcaataagg cat

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23

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<210> 8

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 8

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ctgccaagaa gtcggagtct ggag

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24

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<210> 9

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 9

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cggaattcat ggagccgctg aaggtggaaa ag

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32

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<210> 10

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 10

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ccgctcgagg gatgctctga tgttggcgtc g

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31

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<210> 11

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<211> 64

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótidos sintetizados artificialmente

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<220>

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<221> características misceláneas

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<222> (21) .. (40)

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<223> "n" = A, G, C ó T

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<400> 11

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10

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<210> 12

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 12

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ggggtaccca gtgctgggaa cgcccctctc g

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31

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<210> 13

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 13

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ggggtaccca ctcccgccgg agactaggtc c

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31

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<210> 14

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 14

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ggggtaccct cgcattctcc tcctcctctg c

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31

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<210> 15

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 15

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ggggtacctg gtccctcctc ctcccgccct g

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31

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<210> 16

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 16

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ggggtacctc ccgccctgcc tcccgcgcct c

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31

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<210> 17

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 17

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gaagatctac gtggcctgtc gtccggtctg g

\hfill

31

Claims

1. Un complejo de activación de la trascripción que comprende una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y al menos un co-activador de la misma.

2. El complejo de la reivindicación 1, en donde el co-activador se selecciona del grupo que consiste en una helicasa de ARN, y una polimerasa II de ARN.

3. Un método de escrutinio de un compuesto que inhibe la actividad de una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, que comprende las etapas de:

(a): cultivar células que expresan la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, o un péptido parcial de la misma, en presencia de una muestra sujeto que contiene al menos un compuesto de ensayo;

(b): detectar la proliferación celular; y

(c): elegir el compuesto de ensayo que inhibe la proliferación en comparación con la proliferación detectada en ausencia de la muestra sujeto.

4. Un método in vitro de escrutinio de un compuesto con actividad anticancerígeno, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto una muestra sujeto, que contiene al menos un compuesto de ensayo, con una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, un co-activador de la misma y un ADN que contiene la secuencia diana de dicha proteína, en las condiciones adecuadas para permitir la formación del complejo de dicha proteína con el ADN; y

(b): seleccionar el compuesto de ensayo que inhibe la formación del complejo.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicha secuencia diana comprende una cualquiera de las siguientes secuencias (a) a (d) que rodean la región 5' del EGFR:

(a): una secuencia que se identifica entre -213-pb y -207-pb (cccctcc) de la región lateral 5' del EGFR;

(b): una secuencia que se identifica entre -106-pb y -100-pb (ccctcc) de la región lateral 5' del EGFR;

(c): una secuencia que se identifica entre -65-pb y -59-pb (ccctcc) de la región lateral 5' del EGFR;

(d): una secuencia que se identifica entre -46-pb y -40-pb (ccctcc) de la región lateral 5' del EGFR.

6. Un método in vitro para el escrutinio de un compuesto con actividad anticancerígeno, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto una muestra sujeto, que contiene al menos un compuesto de ensayo, con un complejo de activación de la trascripción que comprende una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, y al menos un co-activador de la misma y un gen informador con una región reguladora trascripcional reconocida por dicho complejo; y

(b): seleccionar el compuesto de ensayo que inhibe la expresión del gen informador.

7. Un método in vitro para diagnosticar cáncer, en donde dicho método comprende las etapas de:

(a): determinar el nivel de expresión de un gen ZNFN3A1 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 en una muestra biológica del espécimen;

(b): comparar el nivel de expresión de dicho gen ZNFN3A1 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 con el de una muestra normal, y

(c): definir un nivel de expresión elevado de dicho gen ZNFN3A1 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 en la muestra como presencia positiva cáncer.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el cáncer es carcinoma hepatocelular.