KR102027603B1

KR102027603B1 - 항-kdr 항체 및 사용 방법

Info

Publication number: KR102027603B1
Application number: KR1020147014458A
Authority: KR
Inventors: 야오후앙 케; 숨 와이 피에르 이; 용케 장; 구오-리앙 유; 웨이민 주
Original assignee: 아펙시젠, 인코포레이티드
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2019-10-01
Also published as: MX356412B; AU2012318246B2; AU2012318246A1; IL232383A0; WO2013067098A1; CA2854153A1; JP2014532706A; IL232383B; TWI571473B; EP2785742B1; HK1201537A1; MX2014005183A; TW201326211A; KR20140091028A; US20140377282A1; JP6117225B2; EP2785742A1; BR112014010774A2; US9441042B2; RU2014122184A

Abstract

본 발명은 항-KDR 모노클론 항체 및 관련 조성물을 제공하며, 이는 다양한 암, 류마티스 관절염, 당뇨 망막병성 및 비정상 VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 다른 질환의 치료를 위한 다양한 치료 방법 중 임의의 것에서 사용될 수 있다.

Description

항-KDR 항체 및 사용 방법{ANTI-KDR ANTIBODIES AND METHODS OF USE}

[본 명세서와 관련된 교차 참조]

본 출원은 2011년 11월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/554,758호 및 2012년 3월 12일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/609,581호의 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.

[서열목록에 대한 진술]

본 출원과 관련된 서열목록은 종이 복사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로서 포함된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은APEX_015_02WO_ST25.txt이다. 2012년 11월 1일에 작성된 본 텍스트 파일은 103 KB이고, EFS-Web을 통해 전자문서로 제출된다.

본 발명은 일반적으로 항-VEGF 수용체 2(VEGFR2; 키나제 삽입 도메인-함유 수용체, 또는 KDR로도 알려짐) 항체, 조성물, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 항체는 예를 들면, 노화-관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 및 허혈성 망막병증, 류마티스 관절염, 건선을 포함하는 다양한 장애와 신장 세포 암종, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 치료하고 억제하기 위한 방법에 있어서 유용하다.

VEGFR2/KDR는 일차적인 혈관신생 수용체이며, VEGF 이소형인 A, C, D 및 E와 결합하고, 내피 세포 분화 뿐만 아니라 VEGF의 미토겐성, 혈관신생성 및 침투성-강화 효과에 중요하다. 항-KDR 항체는 공지된 모든 VEGF 이소형이 VEGFR2/KDR에 결합하여 시그널링을 시작하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 종양은 더 많은 수의 VEGF를 분비하는 반면, 수용체의 수는 상대적으로 일정하게 유지되기 때문에, 수용체를 표적하는 것은 아주 높은 수준의 VEGF 이소형의 존재하에서 조차 완전하게 시그널링을 억제하는 확률을 증가시킨다.

혈관신생

존재하는 맥관구조로부터 새로운 혈관이 형성되는 것인, 혈관신생은 배아 발달, 난포 성장, 상처 치유와 같은 정상 생리학 이외에도 종양 성장 및 진행과 같은 병적 상태에 있어서 중요한 역할을 한다(1, 2).

원발성 종양의 성장 및 전이는 새로운 혈관의 형성에 의존적이다. 신혈관화(neovascularization)의 부재 시, 종양은 괴사 또는 아폽토시스적이되고/되거나 2-3 mm³ 이상의 크기로 성장하는데 실패한다(3). 종양 혈관신생은 내피 세포 활성화, 증식, 이주, 및 종양 세포와 주변의 간질에 의해 생산된 특이적 혈관신생 성장 인자에 의해 촉발되는 이미 존재하는 혈관으로부터의 조직 침습을 포함하는 몇몇 공정을 수반한다(1-4).

VEGF 및 VEGF 수용체

몇몇 성장 인자가 혈관신생의 가능한 조절자로서 확인되었다(5). 이들 인자들 중, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 이의 수용체는 종양 혈관 신생에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다(6-9).

VEGF는 강력한 혈관신생성, 미토겐성, 및 혈관 침투성-강화 활성을 갖는 동종이합체성 34-42 kDa 헤파린-결합 당단백질이다(10, 11). VEGF는 배아 발달 동안에는 맥관형성을 조절하고, 성체 일생 동안에는 혈관신생 과정을 조절한다(12, 13). VEGF 패밀리 멤버에는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 VEGF-E가 포함된다. VEGF는 VEGF 수용체(VEGFR)에 결합하고, VEGF 수용체를 통해 활성을 매개한다. VEGFR1(Flt-1), VEGFR2(Flk-1/KDR) 및 VEGFR3을 포함한 3개의 VEGFR이 존재한다(14-16).

혈관 형성에 있어서 VEGF 및 VEGF 수용체의 생리학적 중요성이 유전자 녹아웃(knockout) 실험에서 명확히 증명되었다(17-18). VEGFR1 티로신 키나제는 키나제 활성을 위해 필요한 모든 보존된 모티프를 나타낸다. 그러나, VEGF-A에 대응하는 VEGFR1 인산화의 수준은 낮다(37, 38). VEGFR-1의 기능은 잘 정의되어 있지 않은데, 이는 더미(dummy)/디코이 수용체(decoy receptor)로서 작용하여 VEGFR-2 결합으로부터 VEGF를 격리시키고 VEGFR-2 시그널링을 조절할 수 있다. VEGFR-3이 VEGF-C 및 VEGF-D에 대응하여 림프관생성(lymphangiogenesis)을 매개할 수 있음이 밝혀졌다. VEGFR2/KDR은 일차적인 혈관신생 수용체이고 VEGF 이소형 A, C, D 및 E와 결합하며, 내피 세포 분화 및 미토제네시스(mitogenesis)에 중요하다.

KDR 의 구조 및 생물학

VEGFR은 수용체 티로신 키나제이며 PDGF 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)와 동일한 수용체의 패밀리에 속한다. VEGFR2/KDR은 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 키나제 삽입에 의해 분열된 2개의 세포내 티로신 키나제 도메인 내에 7개 Ig-유사 루프로 구성되는 200 kDa 당단백질이다. 제2 및 제3의 Ig-유사 루프는 VEGF에 대해 고-친화성 리간드-결합 도메인인 반면, 제1 및 제4 Ig-유사 루프는 각각 리간드 결합 및 리간드 이합체화를 조절한다. VEGF는 VEGFR1에 대한 25 pM의 Kd와 비교할 때 75-250의 Kd로 KDR과 결합한다.

KDR은 혈관 내피 세포의 세포 표면 상에서 주로 발현된다. KDR은 또한 조혈 세포, 혈관 평활근 세포(VSMC), 및 일부 악성 세포의 세포 표면 상에서 발견된다.

KDR은 혈관신생 및 조혈작용 발달에 있어서 일차적인 수용체이고, VEGF의 미토겐성, 혈관신생성 및 침투성-강화 효과의 주요한 매개자이다. VEGFR2^-/-녹아웃 마우스는 결손된 혈도 형성 및 맥관형성과 함께 E8.5-9.5로 배아 치사율을 보였다(41). 생리학적으로, KDR에 VEGF의 결합은 내피 세포 활성화, 증식, 이주, 침습 및 생존을 유도한다. VEGF에의 결합 시, KDR 수용체는 이합체화되어, 키나제 도메인의 활성화 및 KDR 수용체 시그널링의 형질도입을 초래한다. 많은 다른 수용체 티로신 키나제와 같이, 혈관신생을 초래하는 주요 세포내 시그널링 경로는 MAPK 및 PI3 키나제 활성화를 포함한다.

항체 요법을 위한 분자 표적으로서의 KDR

VEGFR2A/VEGF 축은 종양 혈관신생에서 지배적인 경로이다. VEGF 및 KDR의 과발현이 인간 악성종양에서 침습 및 전이와 밀접히 관련되는 것으로 수많은 연구에서 밝혀졌다(6). VEGF 수용체는 방광 종양(21), 유방 종양(22, 23), 결장 종양(24, 25), 위장 종양(26), 신경아교종(12, 27), 신장 종양(28), 흑색종(29), 및 신경아세포종(30)을 포함하는 많은 인간 고형 종양에서 발생하는 혈관신생과 연루되어 있다.

종양 혈관신생에서 KDR의 중요한 역할은, 우성-음성 KDR 수용체의 발현이 무흉선 마우스에서 감소된 내피 세포 미토제네시스 및 피하 신경아교종 종양의 성장 억제를 유도하였음을 보여주는 연구에서 직접 증명되었다(31). 다른 연구는 중화 가용성 VEGF 수용체(34, 35)를 사용하는 것뿐 아니라 소 분자 티로신 키나제 억제제(TKI) 및 KDR-특이적 Ab를 포함하는 KDR 억제제를 사용하여 이러한 역할을 확인하였다.

종양 혈관신생에 있어서 KDR의 효과 외에도, KDR은 또한 백혈병 세포와 같은 일부 종양 세포에서 발견되고, 백혈병 성장을 촉진하는 자가분비 루프를 통해 직접적으로 종양형성을 매개할 수 있다(42, 43).

KDF 시그널링의 억제는 혈관신생을 감소시키고 종양 성장을 지연시킬 수 있다(35, 36). KDR을 표적하는 대다수의 재발 치료는 소-분자 티로신 키나제 억제제(TKI)이다. TKI는 ATP 또는 다른 기질의 티로신 키나제에의 결합을 방해하고, 키나제 촉매 활성을 파괴한다. 현재까지 개발된 (스니티닙과 같은) 모든 TKI는 KDR 키나제 도메인의 ATP 결합 부위에 가역적으로 결합한다.

VEGF는 다양한 유형의 종양에서 높은 수준으로 발현되고(12, 19), 새롭게 생긴 모세혈관은 VEGF-생산성 종양 세포 주위에 모여든다(12). VEGF 발현은 빠르게 성장하는 종양과 연계된 것들처럼, 저산소증 조건하에서 강하게 상향-조절된다(20). 아바스틴(Avastin)과 같은 항체에 의한 VEGF 중화는(33, 34) 암 또는 AMD와 같은 다른 혈관신생 질환을 억제하기 위해 임상적으로 승인된 요법이다. 그러나, VEGF 차단에 대한 내성이 화학요법과 병용되는 경우에서조차 발견되었다. 이 내성은 리모델링된 맥관구조 및 다른 혈관신생 인자의 증가된 발현과 관련될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에는 암 및 혈관신생과 관련된 다른 질환을 억제하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

TKI 및 항-KDRP 항체 둘 모두가 KDR-매개된 혈관신생을 억제할 수 있다 하더라도, 항체 접근은 TKI에 비해 장점을 갖는다. TKI와 대조적으로, 항-KDR 항체는 더 특이적인 KDR 표적제이다(즉, 항-KDR 항체는 다른 VEGF 수용체를 억제하지 않는다). 이러한 높은 특이성 때문에, 항-KDR 항체는 표적 이탈 효과(off-target effect) 및 덜 특이적인 TKI에 의해 야기된 독성을 제한하고/하거나 회피할 수 있다(44).

VEGF는 다양한 유형의 종양에서 높은 수준으로 발현되고(12, 19), 새롭게 생긴 모세혈관은 VEGF-생산성 종양 세포 주위에 모여든다(12). VEGF 발현은 빠르게 성장하는 종양과 연계된 것들처럼, 저산소증 조건하에서 강하게 상향-조절된다(20). 아바스틴과 같은 항체에 의한 VEGF를 중화하는 것은(33, 34) 암 또는 AMD와 같은 혈관신생 질환을 억제하기 위해 임상적으로 승인된 요법이다. 그러나, VEGF 차단에 대한 내성이 화학요법과 병용되는 경우에서조차 발견되었다. 이 저항성은 리모델링된 맥관구조 및 다른 혈관신생 인자의 증가된 발현과 관련될 수 있다.

단지 하나의 리간드(VEGF-A)와만 결합하는 아바스틴과는 달리, 항-KDR 항체는 모든 공지의 VEGF가 VEGFR2/KDR에 결합하는 것을 방지하는 것으로 예상된다. 항-KDR 항체는 단순히 VEGF-A를 차단하는 것 보다는 종양 혈관신생에 대해 더욱 강력한 억제 효과를 가질 수 있다. 항-KDR 항체를 이용한 요법이 아바스틴 내성의 경우에 효과적일 수 있다는 가능성이 있다. VEGF 보다 KDR을 표적하는 것의 잠재적인 이점은 하기 표 1에 요약하였다.

표.1 VEGF 보다 KDR을 표적하는 항체 요법의 이점

따라서, KDR을 표적하고 KDR 시그널링을 차단하는 항체는 더 높은 특이성 및 더욱 완전한 표적 억제를 가질 수 있으므로, 고형 및 액상 종양 모두에 광범위하게 적용될 수 있을 뿐 아니라, 아바스틴 내성을 극복할 잠재성을 가질 수 있다.

라무시루맙 ( Ramucirumab ) 개발에서 항- KDR 치료용 항체( IMC -1121B)

임클론 시스템/일라이 릴리(ImClone Systems/Eli Lilly)에서 개발 중인 라무시루맙은 인간 KDR에 결합하고(KD

50 pM) VEGF 결합을 차단하여, 혈관신생을 억제하는 온전한 인간 IgG1 mAb이다. 라무시루맙이 마우스 KDR과 교차 반응하지 않기 때문에, 대용 항-마우스 KDR 항체(DC-101)를 생성하여 POC 전임상 연구를 위해 사용하였다.

진행암(advanced cancer)을 가진 환자를 대상으로 하는 제I상 임상 시험에 있어서, 라무시루맙은 주당 용량 스케줄에서 잘 용인되었다. 기전-관련된 용량 제한 독성은 고혈압 및 심부정맥 혈전증이었다. KDR 티로신 키나제 억제제 요법에 수반된 전이성 신장 세포 암종을 가진 환자에서 단일요법으로서 제II상 시험으로부터의 데이터가 최근에 보고되었다(39). 진행성 질환을 갖거나 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib) 또는 양쪽 모두에 불능인 환자에게 라무시루맙 8 mg/kg을 격주로 IV 투여하였다. 종양 평가는 6주 마다 수행하였다. 총 40명의 환자가 등록하였고 39명이 처리되었다. 19명의 환자(49%)는 5개월 이상 동안 지속되는 안정한 질환을 가졌으며; 예비 중앙값 무진행 생존율은 6개월이었다. 흑색종에 다카르바진과의 병용, 전립선암 환자에서 미톡산트론/프레드니손과의 병용, NSCLC 환자에서 카르보플라틴/파클리탁셀(paclitaxel)과의 병용 및 결장직장암 환자에서 옥살리플라틴/폴린산/5-플루오로우라실과의 병용으로 더 많은 제II상 시험이 진행 중이다.

라무시루맙은 3개의 제III상 연구에서 유방암, 위암 또는 위식도 접합부 선암 및 간세포암종 환자에서 현재 평가중에 있다. 전이성 위 선암, 2차(second line) 전이성 결장직장암 및 2차 비-소 세포 폐암에서 라무시루맙을 파클리탁셀과 병용하거나 병용하지 않는 3개의 추가적인 제III상 연구가 진행중이다.

33 C3

아스트라제네카(AstraZeneca)에 의해 개발된 33C3은 XenoMouse™ 기술을 사용하여 생성된 완전 인간 항-KDR 항체이다. 33C3은 KDR의 Ig 도메인 4-7과 결합하고, 따라서 KDR에의 VEGF-A 결합에 아무런 영향을 미치지 않는다. 33C3은 리간드 결합 부위에서 상호작용하는 항체와 경쟁하지 않는다. 33C3은 KDR에 대해 고친화성을 가지며(KD<1nM), KDR의 VEGF-A 유도된 인산화를 억제한다. 시험관 내에서, 33C3은 2D 혈관신생 분석에서 관 길이 및 분지점의 개수 둘 모두와, 3D 분석에서 내피 관 형성을 강력히 억제한다. 생체 내에서, 33C3은 인간 내피 혈관신생 분석과 인간 피부 키메라 모델 둘 모두에서 혈관신생의 매우 효과적인 억제제이다(40). 33C3은 현재 개발의 초기 전임상 단계에 있다. 33C3은 마우스 KDR에 대한 교차 반응성의 부재로 인해, 생체내 종양 모델에서 시험되지 않았다.

TTAC -0001

파지 디스플레이에 의해 생성된 완전한 인간 항-KDR 항체인 TTAC-0001은 현재 파마앱신(PharmAbcine)에 의해 개발의 전임상 단계에 있다. 상기 항체는 다양한 암 마우스 모델에 대하여 강력한 항-혈관신생 효능을 보였다(45).

본 발명의 일 관점은 (i) 서열번호 3 또는 11에 개시된 VHCDR1 영역, 서열번호 4 또는 12에 개시된 VHCDR2, 및 서열번호 5에 개시된 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열번호 6에 개시된 VLCDR1 영역, 서열번호 7에 개시된 VLCDR2 영역, 및 서열번호 8에 개시된 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, KDR에 결합하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 상기 CDR 영역에서 최대 8개 아미노산 치환을 제외하고 (i) 및 (ii)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 항체의 변이체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항-KDR 항체는 인간 KDR에 결합하고, 마우스 또는 원숭이 KDR과 교차반응한다.

본 발명의 다른 관점은 KDR에 결합하고, (i) 도 11에 개시된 바와 같은 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 도 11에 개시된 바와 같은 VLCDR1, VLCDR2 영역 VLCDR3을 포함하는 상응하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, KDR에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 상기 CDR 영역에서 최대 8개 아미노산 치환을 제외하고 (i) 및 (ii)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 항체의 변이체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 17-42에 개시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 43-68에 개시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 다른 관점은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, KDR에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 단리된 항체는 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이러한 항체는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 또 다른 관점은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, KDR에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, KDR에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체는 인간화된다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR에 결합하는 인간화된 항체의 예시적인 VH 및 VL 영역은 서열번호 9 및 10에 개시된다.

본 발명에 기술된 항-KDR 항체의 다른 구현예에서, 항체는 단일쇄 항체, ScFv, 힌지 영역 결여 일가 항체, 미니바디, Fab, a Fab' 단편, F(ab')₂단편, 또는 전체 항체를 포함할 수 있다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 단리된 항체는 인간 IgG 불변 도메인을 포함한다. 이와 관련하여, IgG 불변 도메인은 IgG1 CH1 도메인, 예를 들어, 서열번호 16에 개시된 바와 같은 IgG1 CH1 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체는 IgG1 Fc 영역을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함한다.

본 발명의 다른 관점은 인간 KDR에 결합하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-KDR 항체와 경쟁하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명의 또 다른 관점은 5.3x10^-11M 이하의 KD 친화성과 같이 고 친화성으로 KDR과 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 항-KDR 항체의 친화성은 약 3.5, 4, 4.5, 5, 또는 5.5 X 10^-11M일 수 있다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체는 쥐KDR 또는 비-인간 영장류 KDR과 교차반응한다.

본 발명의 다른 관점은 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것으로, 여기서 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KDR에의 VEGF 결합 차단; KDR 시그널링 억제; 내피 세포 증식 억제; 종양 혈관신생 억제; 종양 세포 성장 억제; 또는 전술한 기능 중 임의의 하나 이상의 조합을 수행한다. 하나의 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KDR에의 VEGF 결합 차단; KDR 시그널링 억제; 내피 세포 증식 억제; 종양 혈관신생 억제; 종양 세포 성장 억제를 수행한다.

본 발명의 하나의 관점에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 종양 성장을 직접적으로 억제한다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-KDR 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이러한 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 관점은 생리학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 관점은 비정상 VEGF 또는 KDR 발현 또는 활성과 관련된 암을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 환자에게 생리학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하여, 이에 따라 비정상 VEGF 또는 KDR 발현 또는 활성과 관련된 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기술된 항체는 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포 암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 재발성 교모세포종, 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암의 치료를 위해 유용할 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 염증성 질환으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 환자에게 생리학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하여, 이에 따라 염증성 질환으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 관점은 류마티스 관절염을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 환자에게 생리학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하여, 이에 따라 류미티스 관절염을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 관점은 건선을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 환자에게 생리학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하여, 이에 따라 건선을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가적인 관점은 혈관신생 관련된 질환으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 환자에게 생리학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하여, 이에 따라 혈관신생 관련된 질환으로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 특정한 구현예에서, 환자는 노화 관련 황반 변성으로 고통받는다.

본 명세서에 기술된 항-KDR 항체는 KDR에 고 결합 친화성(53 pM) 및 선택성을 가진다. 본 명세서에 기술된 항체는 KDR과 VEGF의 상호작용을 차단하고, VEGF-유도된 KDR 인산화 및 내피 세포 증식을 억제한다. 특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체는 마우스 KDR과 교차-반응함으로써, 항체가 생체내 동물 모델에서 대용 항체 필요 없이 시험되는 것을 가능하게 한다. 본 명세서에 기술된 항체는 인간 종양 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제하는데 강력한 작용이 증명되었다. 교차-반응성 때문에, 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체는 PK, PD, 바이오마커 개발 측면에서, 비-인간 영장류 및 인간에서 시험하기 전에 전임상 마우스 모델에서 잠재적인 독성조차 생체내에서 완전히 평가되고 특성화될 수 있다.

본 발명은 KDR에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편, 특히 특정 에피토프 특이성 및 기능적 특성을 갖는 항체에 대한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예는 KDR에 결합하고, VEGF와의 KDR 결합을 차단하고, VEGF 유도된 하류 세포 시그널링 및 생물학적 효과를 억제할 수 있는 특정한 인간화된 항체 및 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 더욱 특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체는 약 5.3 X 10^-11M의 친화성으로 KDR에 특이적으로 결합하고 VEGF에의 KDR 결합을 차단한다.

추가적인 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체는 종양 성장을 직접적으로 억제한다. 이와 관련하여, 특정 종양은 KDR를 발현하고, 성장을 위한 자가분비 루프로서 VEGF-KDR 경로를 사용할 수 있다. 따라서, 특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체에 의해 매개된 항-종양 효과는 (i) 항-혈관신생 및/또는 (ii) 종양 성장의 직접적 억제를 포함할 수 있다.

본 발명의 구현예는 VEGF 또는 이의 비정상 발현과 관련된 질환 및 장애의 진단, 평가 및 치료를 위한 항-KDR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사용과 관련된다. 대상 항체는 여러질환 가운데서도, 류마티스 관절염, 당뇨병 및 허혈성 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 건선 및 사구체 비대증 관련 단백뇨, 및 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용된다.

본 발명의 실시는, 반대로 특정하게 나타내지 않는 한, 본 기술분야 내의 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 적용할 것이며, 이들 중 다수가 예시의 목적으로 하기에 기술된다. 이러한 기술은 문헌에서 온전히 설명된다. 예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al ., Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al . Molecular Cloning : A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning : A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)] 및 다른 참조문헌을 참고한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 한("a", "an") 및 그("the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 의미를 포함한다.

본 명세서 전체를 통해, 문맥이 다르게 요구하지 않는 한, 단어 "~들을 포함하다" 또는 "~를 포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서 내의 각각의 구현예는 명확히 다르게 언급되지 않는 한, 필요한 부분만 약간 수정하여 모든 다른 구현예로 적용될 것이다.

표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예컨대, 전기천공, 리포펙션)을 위해 사용될 수 있다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명서 또는 본 기술분야에 통상적으로 확립된 것 또는 본 명세서에 기술된 것에 따라서 수행될 수 있다. 이들 및 관련 기술 및 절차는 일반적으로 본 기술분야에 잘 알려진 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 본 명세서 전반에 인용되고 개시된 다양한 일반적이고 더욱 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 분자 생물학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련되어 사용된 명명법, 및 실험실 절차 및 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 통상적으로 사용된다. 표준 기술은 재조합 기술, 분자 생물학, 미생물학, 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형, 및 운반, 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 구현예는 KDR에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 기술된 항체는 예상외의 고 친화성으로 KDR에 특이적으로 결합하고, KDR에 결합하는 VEFG를 차단하고, VEGF 활성을 차단하며, VEGF의 비정상 발현 또는 활성과 관련된 질환의 치료를 위한 치료적 효용을 갖는다. 본 명세서에 기술된 항체는 또한 다양한 VEGF/KDR-매개된 생물학적 효과(예컨대, KDR의 인산화, 혈관신생, 내피 세포 증식, 및 당업자에게 공지된 다른 VEGF/KDR-매개된 효과)을 억제하기 위한 능력과 같은 유리한 특성을 갖는다. 본 명세서에 기술된 항체는 또한 KDR 수용체 내재화에 대한 효과를 가질 수 있다.

예시된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 서열은 서열번호 1-12 및 17-230에 개시된다.

본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 에피토프 인식 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 온전한 폴리클론 또는 모노클론 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일쇄(ScFv), 이의 합성 변이체, 천연적으로 발생하는 변이체, 요구되는 특이성의 항원-결합 단편과 함께 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 요구되는 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편(에피토프 인식 부위)를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함한다. 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디(Diabody)"(WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)가 또한 본 명세서에 포함된 항체의 특별한 형태이다. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(Minibody)가 또한 본 명세서에 포함된다(S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). 예컨대, 문헌 [Ward, E. S. et al ., Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]를 참고한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항원-결합 단편"은 관심의 항원, 특히 KDR에 결합하는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 하나의 CDR를 함유하는 폴리펩티드 단편을 나타낸다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기술된 항체의 항원-결합 단편은 KDR에 결합하는 항체로부터의 본 명세서에 개시된 VH 및 VL 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모든 CDR을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 KDR-특이적 항체의 항원-결합 단편은 KDR에 결합할 수 있다. 특정한 구현예에서, 항원-결합 단편을 포함하는 항원-결합 단편 또는 항체는 KDR에의 VEGF의 결합 및 차후의 시그널링 이벤트를 예방 또는 억제한다. 특정한 구현예에서, 항원-결합 단편은 인간 KDR에 특이적으로 결합하고/결합하거나 인간 KDR의 생물학적 활성을 억제 또는 조정한다.

용어 "항원"은 항체와 같은 선택적인 결합 인자에 의해 결합될 수 있고, 부가적으로 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 나타낸다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자, 바람직하게는 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 부위이다. 특정한 구현예에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 분류(grouping)를 포함하고, 특정한 구현예에서 특이적 3차원 구조 특징, 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 특정한 구현예에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식하는 경우 특이적으로 항원에 결합하는 것으로 여겨진다. 항체는 평형 해리 상수가 10^-7 또는 10^-8 M 이하인 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 평형 해리 상수는 10^-9M 이하 또는 10^-10M 이하일 수 있다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 및 이의 항원-결합 단편은, CDR에 대한 지지를 제공하며 서로에 대한 상대적인 CDR의 공간 관계를 정의하는 각각의 중쇄와 경쇄 프레임워크 영역(FR) 세트 사이에 삽입되는, 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR 세트"는 경쇄 또는 중쇄 V 영역의 3개의 고변이성(hypervariable) 영역을 나타낸다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서 비롯되는, 이들 영역은 각각 "CDR1," "CDR2," 및 "CDR3"로 나타낸다. 그러므로, 항원-결합 부위는 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 단일 CDR(예컨대, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩티드는 "분자 인식 단위"로 지칭된다. 다수의 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과의 광범위한 접촉을 형성하는 것을 증명하였고, 여기서 중쇄 CDR3과의 가장 광범위한 항원 접촉이 이루어진다. 따라서, 분자 인식 단위는 항원-결합 부위의 특이성에 일차적인 책임이 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "FR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDR을 만들어내는 4개의 플랭킹 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원과 접촉할 수 있다; 그러나, FR은 영역의 항원-결합 부위, 특히 CDR에 직접적으로 인접한 FR 잔기로의 접힘에 일차적인 책임이 있다. FR 내에서, 특정 아미노산 잔기 및 특정 구조적 형태는 매우 잘 보존된다. 이와 관련하여, 모든 V 영역 서열은 대략 90개 아미노산 잔기의 내부 다이설파이드 루프를 함유한다. V 영역이 결합-부위 내로 접히는 경우, CDR은 항원-결합 표면을 형성하는 돌출한 루프 모티프로서 표시된다. 일반적으로 명확한 CDR 아미노산 서열과 관계없이 - 특정 "정준" 구조 내로 CDR 루프의 접힌 형태에 영향을 미치는 FR의 보존된 구조적 영역이 있는 것으로 인식된다. 추가로, 특정 FR 잔기는 항체 경쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화하는 비공유적 도메인간의 접촉에 참여하는 것으로 알려져 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987], 및 현재 인터넷상에서 입수 가능한 이의 업데이트(immuno.bme.nwu.edu)를 참조하여 결정될 수 있다.

"모노클로날 항체"는 균질한 항체 집단을 나타내며, 여기서 모노클로날 항체는 에피토프의 선택적인 결합과 관련되는 아미노산(천연적으로 발생 및 비-천연적으로 발생함)으로 구성된다. 모노클로날 항체는 단일 에피토프에 대하여 지시되면서, 아주 특이적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 온전한 모노클로날 항체 및 전장 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 이의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일쇄(ScFv), 이의 변이체, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 및 에피토프에 결합하기 위해 요구되는 특이성 및 능력의 항원-결합 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 포함한다. 이는 항체의 근원 또는 이것이 (예컨대, 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현, 형질전환 동물 등에 의해) 만들어지는 방식에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 "항체"의 정의에서 상기 기술된 전체 면역글로불린 뿐만 아니라 단편 등을 포함한다.

단백질분해적 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여 몇몇의 단편을 산출하는데, 이들 중 두개(F(ab) 단편)의 각각은 온전한 항원-결합 부위를 포함하는 공유 헤테로이합체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 전달하여, 양쪽 항원-결합 부위를 포함하는 F(ab')₂ 단편을 포함하는 몇몇의 단편을 제공할 수 있다. 본 발명의 특정한 구현예에 따른 사용을 위한 Fv 단편은 IgM, 드물게는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 우선적인 단백질분해적 절단에 의해 생산될 수 있다. 그러나, Fv 단편은 더욱 통상적으로 본 기술분야에 알려진 재조합 기술을 사용하여 유래된다. Fv 단편은 천연 항체 분자의 많은 항원 인식 및 결합 능력을 유지하는 항원-결합 부위를 포함하는 비-공유 V_H::V_L 헤테로이합체를 포함한다. Inbar et al . (1972) Proc. Nat . Acad . Sci . USA 69:2659-2662; Hochman et al . (1976) Biochem 15:2706-2710; 및 Ehrlich et al . (1980) Biochem 19:4091-4096.

특정한 구현예에서, 단일쇄 Fv 또는 scFV 항체가 포함된다. 예를 들면, 카파 바디(Ill et al ., Prot . Eng. 10: 949-57 (1997); 미니바디(Martin et al ., EMBO J 13: 5305-9 (1994); 디아바디(Holliger et al ., PNAS 90: 6444-8 (1993); 또는 자누신(Janusin)(Traunecker et al ., EMBO J 10: 3655-59 (1991) 및 Traunecker et al ., Int . J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992)은 원하는 특이성을 갖는 항체의 선별에 관한 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학 기술을 사용해 제조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 리간드를 포함하는 이특이적 또는 키메라 항체가 만들어질 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 다양한 항체로부터의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함할 수 있는 반면, 제1 결합 도메인을 통해 KDR에 특이적으로 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있는, 이특이적 항체가 생성될 수 있다. 이들 항체는 재조합 분자 생물학 기술을 통해 생산될 수 있거나, 물리적으로 함께 컨쥬게이트될 수 있다.

단일쇄 Fv(sFv) 폴리펩티드는 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 V_H- 및 V_L-인코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현되는 공유적으로 연결된 V_H::V_L 헤테로이합체이다. Huston et al . (1988) Proc . Nat . Acad . Sci . USA 85(16):5879-5883. 천연적으로 응집된 - 그러나 화학적으로 분리된 - 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항체 V 영역으로부터 항원-결합 부위의 구조와 본질적으로 유사한 3차원 구조 내로 접힐 sFv 분자로 전환하기 위한 화학적 구조를 알아내기 위한 다수의 방법이 기술되었다. 예컨대, Huston 등의 미국특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호; 및 Ladner 등의 미국특허 제4,946,778호를 참고한다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체에 결합하는 KDR은 디아바디 형태이다. 디아바디는 폴리펩티드의 다합체(multimer)이며, 각각의 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하고, 상기 두개의 도메인은 (예컨대, 펩피드 링커에 의해) 연결되어 있지만, 항원 결합 부위를 형성하기 위해 서로 조합하지 못한다: 항원 결합 부위는 다합체 내의 하나의 폴리펩티드의 제1 도메인과 다합체 내의 다른 폴리펩티드의 제2 도메인의 조합에 의해 형성된다(WO94/13804).

항체의 dAb 단편은 VH 도메인으로 구성된다(Ward, E. S. et al ., Nature 341, 544-546 (1989)).

이특이적 항체가 사용될 경우에, 이들은 다양한 방식(Holliger, P. 및 Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), 예컨대 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이특이적 항체 또는 상기 언급된 이특이적 항체 단편 중 임의의 것일 수 있다. 디아바디 및 scFv는 항-유전자형 반응의 효과를 잠재적으로 감소시키는 가변 영역만을 사용하여 Fc 영역 없이 구성될 수 있다.

이특이적 전체 항체와 대조적으로, 이특이적 디아바디가 또한 특히 유용한데, 이는 이특이적 디아바디가 대장균에서 용이하게 구성되고 발현될 수 있기 때문이다. 적절한 결합 특이성의 디아바디(및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용해 용이하게 선별될 수 있다. 예를 들면, 항원 X에 대하여 지시된 특이성과 함께, 디아바디의 하나의 암(arm)이 불변으로 유지되면, 다른 암이 다양한 곳에서 라이브러리가 만들어질 수 있고, 적절한 특이성의 항체가 선별된다. 이특이적 전체 항체는 놉-인투-홀(knobs-into-hole) 공정에 의해 만들어질 수 있다(J. B. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체는 UniBody®의 형태로 제공될 수 있다. UniBody®는 제거된 힌지 영역을 갖는 IgG4 항체이다(GenMab Utrecht, The Netherlands 참조; 또한 예컨대 US20090226421 참조). 이 전매(proprietary) 항체 기술은 현재의 작은 항체 포맷보다 소기의 더 긴 치료용량범위(therapeutic window)를 갖는 안정한, 더 작은 항체 포맷을 만들어낸다. IgG4 항체는 불활성인 것으로 고려되므로, 면역 시스템과 상호작용하지 않는다. 완전한 인간 IgG4 항체는 항체의 힌지 영역을 제거하여 변형되어, 상응하는 온전한 IgG4(GenMab, Utrecht)에 비하여 뚜렷한 안정성 특성을 갖는 절반-분자 단편을 수득할 수 있다. IgG4 분자의 이등분은 동족의 항원(예컨대, 질환 표적)에 결합할 수 있는 UniBody® 상의 하나의 구역만을 남기므로, UniBody®은 표적 세포 상의 하나의 부위에만 일가적으로 결합한다. 특정 암 세포 표면 항원에 대해, 동일한 항원 특이성을 갖는 이가 항체를 사용하는 것으로 나타날 수 있기 때문에, 이 일가 결합은 암 세포가 자라도록 자극하지 않을 수 있고, 따라서 UniBody® 기술은 종래의 항체를 사용한 치료로 치료하기 어려울 수 있는 일부 유형의 암에 대한 치료 대안을 제공할 수 있다. 작은 크기의 UniBody®은 일부 형태의 암을 치료하는 경우 큰 장점이 있을 수 있으며, 더 큰 고형 종양에 걸쳐 분자의 분포를 더 고르게 하여 잠재적으로 효능을 향상시키는 것을 가능하도록 한다.

특정한 구현예에서, 본 발명의 항체는 나노바디의 형태를 취할 수 있다. 나노바디는 단일 유전자에 의해 인코딩되며, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예컨대, 대장균(예컨대, 미국특허 제6,765,087호 참조), 곰팡이(예를 들면, 아스페르길루 스(Aspergillus ) 또는 트리코르데마 ( Trichoderma )) 및 효모(예를 들면, 사카로미세스( Saccharomyces ), 클루이베르미세스 ( Kluyvermyces ), 한세눌라( Hansenula ) 또는 피키아( Pichia )(예컨대, 미국특허 제6,838,254호 참조)에서 효율적으로 생산된다. 생산 공정은 확장가능하며 다수-킬로그램 양의 나노바디가 생산되었다. 나노바디는 긴 저장 수명을 갖는 사용 준비된(ready-to-use) 용액으로 제형화될 수 있다. 나노클론 방법(예컨대, WO 06/079372 참조)는 자동화된 B-세포의 고-처리량 선별에 근거하여, 원하는 표적에 대하여 나노바디를 생성하기 위한 전매의 방법이다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-KDR 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된다. 이는 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조되는, 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 근거한 분자의 잔류 면역글로불린 구조를 갖는 키메라 분자를 나타낸다. 항원-결합 부위는 불변 도메인 상으로 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역 상으로 이식된 CDR만을 포함할 수 있다. 에피토프 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이는 인간 개인에게서 면역원으로서 불변 영역을 제거하지만, 외래 가변 영역에 대한 면역 반응의 가능성은 남겨둔다(LoBuglio, A. F. et al ., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224; Queen et al ., PNAS (1988) 86:10029-10033; Riechmann et al ., Nature (1988) 332:323-327). 본 명세서에 개시된 항-KDR 항체의 인간화를 위한 예시적인 방법은 미국특허 제7,462,697호에 기술된 방법을 포함한다. 본 발명의 특정한 구현예에 따른 예시적인 인간화된 항체는 서열번호 9, 10, 19 및 20에서 제공된 인간화된 서열을 포함한다.

다른 접근법은 인간-유래된 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 인간 형태와 가능한 가깝게 재형성하기 위해 또한 가변 영역을 변형시키는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역은 논의되고 있는 에피토프에 따라 달라지는 3개의 상보성-결정 영역(CDR)을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 소정의 종에서 상대적으로 보존되고 CDR에 대한 스캐폴딩(scaffoding)을 추정적으로 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)에 의해 플랭킹된 결합 능력을 결정한다. 비인간 항체가 특정 에프토프에 대하여 제조되는 경우, 가변 영역은 변형될 인간 항체 내에 존재하는 FR 상의 비인간 항체로부터 유래된 CDR 이식에 의해 "재형성된(reshaped)" 또는 "인간화된" 것일 수 있다. 다양한 항체에 대한 이 접근법의 적용은 문헌 [Sato, K., et al ., (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L., et al ., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M., et al ., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A., et al ., (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H., et al ., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R., et al ., (1991) Bio / Technology 9:266-271; Co, M. S., et al ., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P., et al ., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; 및 Co, M. S. et al ., (1992) J Immunol 148:1149-1154]에서 보고되었다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열(예를 들면, 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 구현예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체에 대해 변형되고, 또한 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 칭해지는 하나 이상의 CDR(하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯)을 가진다.

특정한 구현예에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체일 수 있다. 이와 관련하여, 키메라 항체는 상이한 항체의 이종 Fc 부분에 작동적으로 연결되거나, 다르게는 이에 융합된 항-KDR 항체의 항원-결합 단편으로 구성된다. 특정한 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 인간 기원의 것이다. 다른 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 IgA(하위부류 IgA1 및 IgA2를 포함), IgD, IgE, IgG(하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함), 및 IgM을 포함하는 모체 항체로부터의 상이한 Ig 부류 유래일 수 있다. 다른 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 하나 이상의 상이한 Ig 부류로부터의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성될 수 있다. 인간화된 항체에 관하여 상술된 바와 같이, 키메라 항체의 항-KDR 항원-결합 단편은 본 명세서에 기술된 항체의 단지 하나 이상의 CDR(예컨대, 본 명세서에 기술된 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)을 포함할 수 있거나, 전체 가변 도메인(VL, VH 또는 둘다)을 포함할 수 있다.

특정한 구현예에서, KDR-결합 항체는 본 명세서에 기술된 항체의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 이와 관련하여, 원하는 특이적 결합을 여전히 유지하면서, 항체의 VHCDR3만의 전이가 수행될 수 있음이 일부 사례에서 밝혀졌다(Barbas et al., PNAS (1995) 92: 2529-2533). 또한 문헌 [McLane et al ., PNAS (1995) 92:5214-5218, Barbas et al ., J. Am . Chem . Soc. (1994) 116:2161-2162]를 참고한다.

Marks 등(Bio / Technology, 1992, 10:779-783)은 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 기술하는데, 여기서 가변 도메인 구역의 5' 말단에 지시되거나 이에 인접한 공통 프라이머는 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 대한 공통 프라이머와 함께 사용되어 CDR3이 부재하는 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공한다. Marks 등은 어떻게 상기 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3와 결합될 수 있는지를 추가적으로 기술한다. 유사한 기술을 사용하면, 현재 기술된 항체의 CDR3-유래된 서열은 CDR3가 부재하는 VH 또는 VL의 레퍼토리와 섞일 수 있고, 섞인 완전 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 그 후, 레퍼토리는 적합한 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 선택될 수 있도록 WO92/01047의 파지 디스플레이와 같은 적합한 숙주 시스템에서 디스플레이될 수 있다. 레퍼토리는 적어도 약 10⁴개체 구성원 및 10의 몇승 보다 더 상승하는, 예를 들면 약 10⁶ 내지 10⁸ 또는 10¹⁰이상의 구성으로 구성된다. 유사한 혼합 또는 조합 기술은 또한 Stemmer 등의 문헌[Nature, 1994, 370:389-391]에 의해 개시되며, 그는 β-락타마제 유전자와 관련된 기술을 설명하지만, 접근법이 항체의 생성을 위해 사용될 수 있음을 관찰한다.

추가적인 대안은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성하기 위해 하나 이상의 선별된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이를 사용하여 본 명세서에 기술된 발명 구현예의 하나 이상의 CDR-유래된 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성하는 것이다. 이러한 기술은 Gram 등의 문헌 [1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580]에 의해 기술되며, 오류 유발(error-prone) PCR을 사용하였다. 사용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 유도 돌연변이이다. 이러한 기술은 Barbas 등의 문헌[1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813] 및 Schier 등의 문헌 [1996, J. Mol. Biol. 263:551-567]에 기술된다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체의 특이적 VH 및/또는 VL은 KDR에 대한 증가된 친화성과 같은, 바람직한 특성을 갖는 항체를 규명하기 위한 상보성 가변 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, Portolano 등의 문헌 [J. Immunol. (1993) 150:880-887; Clarkson et al ., Nature (1991) 352:624-628]에 기술된다.

다른 방법이 또한 CDR을 조합하고 짜맞추어 KDR에 결합하는 것과 같은 원하는 결합 활성을 갖는 항체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 문헌[Klimka et al ., British Journal of Cancer (2000) 83: 252-260]은 마우스 VH로부터 유지된 CDR3 및 FR4를 갖는 마우스 VL 및 인간 VH 라이브러리를 사용하는 스크리닝 공정을 기술한다. 항체를 수득한 후, VH를 인간 VL 라이브러리에 대하여 스크리닝하여 항원에 결합된 항체를 수득하였다. Beiboer 등의 문헌 [J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849]은 전체 마우스 중쇄 및 인간 경쇄 라이브러리를 사용하는 스크리닝 공정을 기술한다. 항체를 수득한 후, 하나의 VL은 유지된 마우스의 CDR을 갖는 인간 VH 라이브러리와 조합되었다. 항원이 결합할 수 있는 항체가 수득되었다. Rader 등의 문헌 [PNAS (1998) 95:8910-8915]은 상기 Beiboer 등의 문헌과 유사한 공정을 기술한다.

이들 좀전에 기술된 기술은 그들 자체로 본 기술분야에 알려진 것이다. 그러나, 숙련가는 본 기술 분야에 통상적 방법론을 사용하는, 본 명세서에 기술된 본 발명의 몇몇 구현예에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수득하기 위해 이러한 기술을 사용할 수 있을 것이다.

KDR 항원에 대해 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 수득하기 방법이 또한 본 명세서에 개시되는데, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 VH 도메인의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 삽입하는 방식으로 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 선택적으로 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 KDR에 대해 특이적인 결합 구성원 및 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 확인하고 선택적으로 하나 이상의 원하는 특성을 갖는 지를 확인하기 위해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 시험하는 단계를 포함한다. VL 도메인은 실질적으로 본 명세서에서 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유사한 방법이 적용될 수 있는데, 여기서 본 명세서에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체는 하나 이상의 VH 도메인과 조합된다.

(본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는) 항체 또는 폴리펩티드에 "특이적으로 결합하는" 또는 "우선적으로 결합하는" 에피토프는 본 기술분야에 잘 알려진 용어이며, 이러한 특이적이거나 우선적인 결합을 측정하기 위한 방법은 또한 본 기술분야에 또한 잘 알려져 있다. 분자가 대안적인 세포 또는 물질과 반응 또는 연합하는 것에 비해 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화성으로, 더 자주, 더 빠르게 특정 세포 또는 물질과 반응 또는 연합하는 경우, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적인 결합"을 나타내는 것으로 여겨진다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것에 비해 더 큰 친화성, 결합력으로, 더욱 용이하게, 및/또는 더 긴 기간으로 결합하는 경우, 항체는 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들면, KDR 에피토프에 특이적이거나 우선적으로 결합하는 항체는 다른 KDR 에피토프 또는 비-KDR 에피토프에 결합하는 것에 비해, 더 큰 친화성, 결합력으로, 더욱 용이하게, 및/또는 더 긴 기간으로 하나의 KDR 에피토프에 결합하는 항체이다. 예를 들면, 제1 표적에 특이적이거나 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적이거나 우선적으로 결합할 수도 그렇지 않을 수도 있음이 이 정의를 숙지함으로써 또한 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적인 결합"은 (독점적인 결합이 포함된다고 하더라도) 독점적인 결합이 필수적으로 요구되는 것은 아니다. 일반적으로, 그러나 필수적이지는 않게, 결합에 대한 참조는 우선적인 결합을 의미한다.

일반적으로 면역학적 결합은 면역학적 분자와 면역글로불린에 대해 특이적인 항원 사이에서 발생하는 비공유적인 유형의 상호작용, 예를 들면, 예시를 위한 것으로 제한됨이 없이, 정전기, 이온, 친수성 및/또는 소수성 인력 또는 척력, 입체적 힘, 수소 결합, 반 데르 발스 힘 및 다른 상호작용의 결과로서 나타낸다. 면역글로불린 결합 상호작용의 강도, 또는 친화성은 상호작용의 해리상수 (K_d)로 표현될 수 있으며, 여기서 더 작은 K_d는 더 큰 친화성을 나타낸다. 선별된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 본 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 하나의 이런 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하며, 여기서 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성 및 양 방향에서 속도에 동일하게 영향을 미치는 기하학적 매개변수에 의존한다. 따라서, "온 속도 상수(on rate constant)" (K_on) 및 "오프 속도 상수(off rate constant)"(K_off) 둘 모두는 농도 및 결합 및 해리의 실제 속도를 계산함으로써 결정될 수 있다. K_off /K_on의 비는 친화성과 관련되지 않는 모든 매개변수의 취소를 가능하게 하고, 따라서 해리 상수 K_d와 동일하다. 일반적으로 문헌 [Davies et al . (1990) Annual Rev . Biochem . 59:439-473]를 참고한다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체는 약 100, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 또는 199 피코몰의 친화성을 가지며, 일부 구현예에서, 항체는 KDR에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 가질 수 있다.

에피토프와 관련하여 용어 "면역학적으로 활성인" 또는 "면역학적으로 활성이 남아있는"은 다양한 조건 하에서, 예를 들면 에피토프가 환원 및 변성 조건을 위해 적용된 후에 에피토프에 결합하기 위한 항체(예컨대, 항-KDR 항체)의 능력을 나타낸다.

본 명세서의 특정의 바람직한 구현예에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) 항원에 특이적으로 결합하고 (ii) 본 명세서에 개시된 VH 및/또는 VL을 포함하거나, 본 명세서에 개시된 VHCDR3, 또는 이들의 임이의 변이체를 포함하는 것 모두는 본 명세서에 기술된 임의의 항체와 KDR에의 결합에 대해 경쟁하는 것일 수 있다. 항체 사이에 경쟁은 동일한 에피토프 또는 중복된 에피토프를 결합하는 특이적 항체를 확인할 수 있도록, 예를 들면 ELISA 및/또는 다른 비표지 항체의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 항체에 특이적 리포터 분자를 표지함으로써, 시험관내에서 용이하게 분석될 수 있다. 따라서, KDR에 결합하는 본 명세서에 기술된 항체와 경쟁하는 인간 항체 항원-결합 부위를 포함하는 특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본 명세서에 제공된다.

이와 관련하여, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "~와 경쟁하다", "결합을 억제하다" 및 "결합을 차단하다"(예컨대, KDR에의 VEGF 결합의 억제/차단을 지칭 또는 KDR에의 항-KDR 항체의 결합의 억제/차단을 지칭)는 상호교환적으로 사용되며 부분 및 완전한 억제/차단 둘 모두를 포함한다. KDR에의 VEGF 결합의 억제/차단은 바람직하게는 억제 또는 차단 없이 VEGF가 KDR에 결합하는 경우가 발생하는 세포 시그널링의 정상 수준 또는 유형을 감소 또는 변경시킨다. 억제 및 차단은 또한 항-KDR 항체와 접촉하지 않은 리간드와 비교할 때 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-KDR 항체와 접촉하는 경우, KDR에의 VEGF의 결합의 임의의 측정가능한 감소, 예컨대, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%로 KDR에의 VEGF의 차단을 포함하는 것으로 의도된다.

면역글로불린의 불변 영역은 가변 영역에 비해 더 낮은 서열 다양성을 보이며, 중요한 생화학적 이벤트를 이끌어내기 위한 다수의 천연 단백질 결합에 책임이 있다. 인간에는 IgA(하위부류 IgA1 및 IgA2를 포함함), IgD, IgE, IgG(하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함함) 및 IgM을 포함하는 항체의 5개의 상이한 부류가 있다. 미묘한 차이가 V 영역 사이에 존재한다고 하더라도,이들 항체 부류 사이에 구별되는 양상은 이들의 불변 영역이다.

항체의 Fc 영역은 다수의 Fc 수용체 및 리간드와 상호작용하여, 작용기 기능으로서 언급되는 일련의 중요한 기능적 능력을 부여한다. IgG의 경우, Fc 영역은 Ig 도메인 CH2와 CH3 및 CH2로 유도되는 N-말단 힌지를 포함한다. IgG 부류에 대한 Fc 수용체의 중요한 패밀리는 Fc 감마 수용체이다(FcγR). 이들 수용체는 항체와 면역 시스템의 세포 암(arm) 사이에 의사소통을 매개한다(Raghavan et al ., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al ., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). 인간에서, 이 단백질 패밀리는 이소형 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 이소형 FcγRIIa(동종이형 H131 및 R131을 포함함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 이소형 FcγRIIIa(동종이형 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(동종이형 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)을 포함하는 FcγRIII(CD16)를 포함한다(Jefferis et al ., 2002, Immunol Lett 82:57-65). 이들 수용체는 전형적으로 Fc에 결합을 매개하는 세포외 도메인, 막 스패닝 영역 및 세포 내의 일부 시그널링 이벤트를 매개할 수 있는 세포내 도메인을 가진다. 이들 수용체는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상세포, 호산구, 비만세포, 혈소판, B 세포, 대형 과립 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체의 형성은 결합된 항원의 부위로 이들 작용기 세포를 모집하여, 전형적으로 세포 내의 시그널링 이벤트 및 B 세포 활성화, 세포내이입, 포식작용 및 세포독성 공격과 같은 중요한 후속적인 면역 반응을 초래한다.

세포독성 및 포식성 작용기 기능을 매개하기 위한 능력은 표적 세포를 파괴하는 항체에 의한 잠재적인 기전이다. FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개된 반응은 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)으로 지칭된다(Raghavan et al ., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al ., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al ., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 포식작용을 야기하는 세포-매개된 반응은 항체 의존적 세포-매개 포식작용(ADCC)으로 지칭된다(ADCP). 모든 FcγR은 Cg2(CH2) 도메인 및 선행하는 힌지의 N-말단 끝에서 Fc 상의 동일한 영역에 결합한다. 이 상호작용의 특징은 구조적으로 잘 분석되어 있으며(Sondermann et al ., 2001, J Mol Biol 309:737-749), 인간 FcγRIIIb의 세포외 도메인에 결합된 인간 Fc의 몇몇 구조는 규명되었다(pdb 등록 코드 1E4K)(Sondermann et al ., 2000, Nature 406:267-273.) (pdb 등록 코드 1IIS 및 1IIX)(Radaev et al ., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477.)

상이한 IgG 하위부류는 FcγR에 대해 상이한 친화성을 가지며, IgG1 및 IgG3은 전형적으로 IgG2 및 IgG4 보다 수용체에 실질적으로 더 잘 결합한다(Jefferis et al ., 2002, Immunol Lett 82:57-65). 모든 FcγR은 IgG Fc 상의 동일한 영역에 결합하지만, 친화성은 상이하다: 높은 친화성 결합체 FcγRI는 IgG1에 대해 10^-8 M의 Kd를 갖는 반면, 낮은 친화성 수용체 FcγRII 및 FcγRIII은 일반적으로 각각 10^-6 및 10^-5로 결합한다. FcγRIIIa 및 FcγRIIIb의 세포외 도메인은 96% 동일하지만, FcγRIIIb는 세포내 시그널링 도메인을 갖지 않는다. 추가로, FcγRI, FcγRIIa/c 및 FcγRIIIa는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 세포내 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 복합체-촉발된 활성화의 양성 조절자이며, FcγRIIb는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 가지기 때문에 억제성이다. 따라서 전자는 활성화 수용체로서 지칭되고, FcγRIIb는 억제성 수용체로서 지칭된다. 수용체는 또한 상이한 면역 세포 상에서 발현 패턴 및 수준이 상이하다. 그러나, 복합도의 다른 수준은 인간 프로테옴에서 다수의 FcγR 다형태의 존재이다. 임상적인 유의성을 갖는 특히 관련있는 다형태는 V158/F158 FcγRIIIa이다. 인간 IgG1은 F158 동종이형 보다 V158 동종이형에 더 큰 친화성으로 결합한다. 친화성, 및 아마도 ADCC 및/또는 ADCP에 대한 이의 효과에 있어서의 이러한 차이는 항-CD20 항체 리툭시맙(IDEC 제약 회사의 상표 등록된 Rituxan®)의 효능의 유의미한 결정인자인 것으로 나타났다. V158 동종이형을 갖는 환자는 리툭시맙 치료에 호의적으로 반응하지만; 낮은 친화성 F158 동종이형을 갖는 환자는 저조하게 반응한다(Cartron et al ., 2002, Blood 99:754-758). 대략 10-20%의 인간이 V158/V158 동형접합성이며, 45%는 V158/F158 이형접합성이고, 35-45%의 인간은 F158/F158 동형접합성이다(Lehrnbecher et al ., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al ., 2002, Blood 99:754-758). 따라서, 80-90%의 인간은 저조한 반응자이고, 즉 이들은 F158 FcγRIIIa의 적어도 하나의 대립유전자를 갖는다.

Fc 영역은 또한 보체 연쇄반응의 활성화와 관련된다. 종래의 보체 경로에서, C1은 IgG 또는 IgM의 Fc 단편에 이의 C1q 하부단위와 결합하고, 이는 항원(들)과 복합체를 형성하였다. 본 발명의 특정한 구현예에서, Fc 영역의 변형은 본 명세서에 기술된 바와 같은 보체 시스템을 활성화시키기 위한 KDR-특이적 항체의 능력을 변화(증강 또는 감소)시키는 변형을 포함한다.(예컨대, 미국특허 제7,740,847호 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, 보체-의존적 세포독성(CDC) 분석을 수행할 수 있다(예컨대, Gazzano-Santoro et al ., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) 참조).

따라서 특정한 구현예에서, 본 발명은 감소된 또는 증강된 CDC, ADCC, 또는 ADCP 활성 또는 특이적 FcγR에 대한 증강된 결합 친화성 또는 증가된 혈청 반감기와 같은 변화된 기능적 특성을 갖는 변형된 Fc 영역을 갖는 항-KDR 항체를 제공한다. 본 명세서에 포함되는 다른 변형된 Fc 영역은 예를 들면, 미국특허 제7,317,091호; 제7,657,380호; 제7,662,925호; 제6,538,124호; 제6,528,624호; 제7,297,775호; 제7,364,731호; 미국 공개공보 US2009092599; US20080131435; US20080138344; 및 국제 공개공보 WO2006/105338; WO2004/063351; WO2006/088494; WO2007/024249에 기술된다.plications WO2006/105338; WO2004/063351 ; WO2006/088494; WO2007/024249.

따라서, 특정한 구현예에서, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 특정한 구현예에서, 융합은 힌지, C_H2, 및 C_H3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(C_H1)을 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 경우, 면역글로불린 중쇄 융합 및 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 개별 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 세포 내로 공동-형질감염된다. 구성에서 사용되는 3개의 폴리펩티드 쇄의 비균등한 비가 원하는 비특이적 항체의 최대 수율을 제공하는 경우, 이는 구현예에서 3개의 폴리펩티드의 공동 비를 조정하는데 더 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율로 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 초래하는 경우 또는 비율이 원하는 쇄 조합의 수율에 대해 어떠한 유의미한 영향도 미치지 않는 경우, 두개 또는 세개 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 세포 내로 삽입하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체(및 이의 항원-결합 단편 및 변이체)는 또한 에피토프 태그 또는 표지를 포함하도록, 예컨대, 정제 또는 진단적 적용에서의 사용을 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,208,020호 또는 유럽특허 EP 0 425 235 B1, 및 문헌 [Chari et al ., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에 개시된 것들을 포함하는, 항체 컨쥬게이트를 만들기 위한 본 기술분야에 알려진 많은 연결기가 있다. 연결기는 상기 정의된 특허에 개시된 바와 같은, 다이설파이드기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광 불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함하며, 다이설파이드기 및 티오에테르기가 바람직하다.

다른 고려된 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR-특이적 항체는 컨쥬게이트로서 본 명세서에 지칭된 다른 치료 화합물에 컨쥬게이트되거나 작동적으로 연결될 수 있다. 컨쥬게이트는 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인, 항-신생혈관제, 티로신 키나제 억제제, 톡신, 방사성 동위원소 또는 다른 치료적 유효제일 수 있다. 화학요법제, 사이토카인, 항-신생혈관제, 티로신 키나제 억제제 및 다른 치료제는 상기에 기술되었고, 이들 전술된 치료제 모두는 항체 컨쥬게이트로서 그 용도를 찾을 수 있다.

대안적인 구현예에서, 항체는 이로 제한되는 것은 아니지만, 이의 단편 및/또는 변이체를 포함하는, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 톡신 및 효소적으로 활성인 톡신을 포함하는, 톡신에 컨쥬게이트되거나 작동적으로 연결된다. 소분자 톡신은 이들로 제한되는 것은 아니지만, 사포린(Kuroda K, et al ., The Prostate 70:1286-1294 (2010); Lip, WL. et al ., 2007 Molecular Pharmaceutics 4:241-251; Quadros EV., et al ., 2010 Mol Cancer Ther; 9(11); 3033-40; Polito L., et al . 2009 British Journal of Haematology, 147, 710-718), 칼리키아미신, 메이탄신(미국특허 제5,208,020호), 트리코텐, 및 CC1065를 포함한다. 톡신은 이들로 제한되는 것은 아니지만, RNase, 젤로닌, 엔다이인, 리신, 아브린, 디프테리아 톡신, 콜레라 톡신, 젤로닌, 슈도모나스 엑소톡신(PE40), 쉬겔라 톡신, 기저 괴저균 톡신 및 자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein)을 포함한다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이트된다. 메이탄시노이드는 튜불린 중합화를 억제함으로써 작용하는 체세포분열(mitototic) 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테너스 세라타(미국특허 제3,896,111호)로부터 처음 분리되었다. 그 후에, 특정 미생물이 또한 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르(미국특허 제4,151,042호)와 같은 메이탄시노이드를 생산하는 것이 밝혀졌다. 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는 예를 들면, 미국특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 개시된다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역컨쥬게이트 및 이의 치료적 사용은 예를 들면, 미국특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 유럽특허 EP 0 425 235 B1에 개시된다. 문헌 [Liu et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]은 인간 결장직장암에 대하여 지시된 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1으로 표시된 메이탄시노이드를 포함하는 면역컨쥬게이트를 기술한다. 상기 컨쥬게이트는 배양된 대장암 세포에 대해 세포독성이 높은 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 보였다.

항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의미하게 감소시키지 않으면서 메이탄시노이드 분자에 항체를 화학적으로 연결하여 제조된다. 한 분자의 톡신/항체만으로도 항체 자체(naked antibody)의 사용보다 세포독성이 증강될 것으로 예상됨에도 불구하고, 항체 분자당 컨쥬게이트된 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 가용성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 세포독성을 증강시키는 효능을 보였다. 메이탄시노이드는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 공지 기술에 의해 합성되거나 천연 근원으로부터 분리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들면 미국특허 제5,208,020호 및 본원의 상기에 나타낸 다른 특허출원 및 비특허 문헌에 개시된다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀 및 다양한 메이탄시놀 에스테르와 같은, 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 부분이 변형된 메이탄시놀 유사체이다.

관심의 다른 컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리키마이신 분자에 컨쥬게이트된 항체를 포함한다. 항체의 칼리키아미신 패밀리는 피코몰 이하의 농도에서 절단되는 이중나선 DNA를 생성할 수 있다. 칼리키아미신의 구조적 유사체가 또한 사용될 수 있다(Hinman et al ., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al ., 1998, Cancer Research 58:2925-2928)(미국특허 제5,714,586호; 미국특허 제5,712,374호; 미국특허 제5,264,586호; 미국특허 제5,773,001호). 아우리스타틴 E(AE) 및 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)와 같은 돌라스타틴 10 유사체는 현재 개시된 항체, 또는 이의 변이체에 대한 컨쥬게이트로서 용도를 찾을 수 있다(Doronina et al ., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco et al ., 2003 Blood 102(4):1458-65). 유용한 효소적으로 활성인 톡신은 이들로 제한되는 것은 아니지만, 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 톡신의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 엑소톡신 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii ) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국 자리공 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 큐르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis ) 억제제, 젤로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecene)을 포함한다. 예를 들면, PCT WO 93/21232를 참고한다. 본 발명은 추가적인 구현예를 포함하는데, 여기서 컨쥬게이트 또는 융합은 본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR-특이적 항체와 핵산분해 활성을 가진 화합물, 예를 들면 데옥시리보뉴클레아제(DNase)와 같은 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 사이에 형성된다.

대안적인 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항체는 방사성 동위원소에 컨쥬게이트되거나 이에 작동적으로 연결되어 방사성컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성컨쥬게이트 항체의 생산을 위해 입수가능하다. 예로는 이들로 제한되는 것은 아니지만, ⁹⁰Y, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At, 및 ²¹²Bi를 포함한다.

특정한 다른 구현예에서 본 명세서에 기술된 항체는 사이토톡신(예컨대, 세포증식 억제제 또는 살세포작용제), 치료제 또는 방사성 요소(예컨대, 알파-방사체, 감마-방사체, 등)과 같은 치료적 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 사이토톡신 또는 세포독성제는 세포에 대해 해로운 임의의 제제를 포함한다. 예는 파클리탁셀/파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라친 디온, 미토산트론, 미스라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 하나의 바람직한 예시적인 사이토톡신은 사포린(San Diego, CA의 Advanced Targeting Systems로부터 입수됨)이다. 치료제는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오그아닌, 사아타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에판 클로람부실, 멜팔란, 카르머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토신 C, 및 시스디클로로디아민 플라티늄(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전 명칭 다우모마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전 명칭 악티노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신, 및 안트라마이신(AMC), 및 항-유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.

게다가, 특정한 구현예에서 KDR-특이적 항체(이의 항원-결합 단편과 같은 본 명세서에서 제공된 바와 같은 이의 기능적 단편을 포함함)는 방사성금속 이온을 컨쥬게이트시키기에 유용한 방사성 물질 또는 거대환식 킬레이트화제와 같은 치료적 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 특정한 구현예에서, 거대환식 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착할 수 있는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 본 기술 분야에 공지되어 있고 문헌 [Denardo et al ., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al ., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; 및 Zimmerman et al ., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50]에 기술된다.

또 다른 구현예에서, 항체는, 항체-수용체 컨쥬게이트가 환자에게 투여되고, 이어서 소거제를 사용해 순환으로부터 비결합 컨쥬게이트를 제거한 후, 세포독성제(예컨대, 방사성뉴클레오티드)에 컨쥬게이트되는 "리간드"(예컨대, 아비딘)가 투여되는, 종양 사전-표적화에서 활용하기 위해 (스트렙타비딘과 같은) "수용체"에 컨쥬게이트될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 항체는 항체 의존적 효소 매개된 전구약물 요법(ADEPT)을 사용하기 위해 효소에 컨쥬게이트되거나 작동적으로 연결된다. ADEPT는 전구약물(예컨대, 펩티딜 화학요법제, PCT WO 81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환하는 전구약물-활성화 효소에 항체를 컨쥬게이트시키거나 이에 작동적으로 연결함으로써 사용될 수 있다. 예를 들면, PCT WO 88/07378 및 미국특허 제4,975,278호를 참고한다. ADEPT에 대해 유용한 면역컨쥬게이트의 효소 성분은 효소를 이의 더 활성적인, 세포독성 형태로 전환시키기 위한 방식으로 전구약물 상에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 이들 방법 및 관련 구현예에 유용한 효소는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물(free drug)로 전환하는데 유용한 알칼라인 포스파타제; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오사이토신을 항암 약물, 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 사이토신 디아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 세라티아 프로테아제, 서몰리신(thermolysin), 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신(카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환하는데 유용한 알라닐 D-카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 -갈락토시다제 및 뉴라미미다제와 같은 탄수화물-절단 효소; b--락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 베타-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 그들의 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함한다. 대안적으로, 본 기술분야에 "항체효소(abzymes)"로 또한 알려진 효소 활성을 갖는 항체는 전구약물을 유리 활성 약물로 전환하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Massey, 1987, Nature 328: 457-458]를 참고한다). 항체-항체효소 컨쥬게이트는 항체효소를 종양 세포 집단으로 운반하기 위해 제조될 수 있다.

면역컨쥬게이트는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능 유도체(예컨대, 디메틸 에디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타르엘데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 만들어질 수 있다. 특정 커플링제는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)(Carlsson et al ., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)를 포함하며 다이설파이드 결합을 위해 제공된다. 링커는 하나 이상의 절단가능 성분의 방출을 촉진하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커가 사용될 수 있다(Cancer Research 52: 127-131 (1992); 미국특허 제5,208,020호).

본 발명의 항체(및 폴리펩티드)의 다른 변형이 또한 본 명세서에 포함된다. 예를 들면, 항체는 다양한 비단백질성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 항체는 또한 콜로이달 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀전 내에서 예를 들면, 액적형성 기술 또는 계면 중합화(예를 들면, 각각 하이드로메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트)마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에 포함될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 "담체"는 적용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 비독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 흔히 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노오스, 또는 덱스트란을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 폴리소르베이트 20(TWEEN^TM) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제, 및 폴록사머(PLURONICS^TM) 등을 포함한다.

항-KDR 항체의 바람직한 기능적 특성은 당업자에게 공지된 다양한 방법인 친화성/결합 분석(예를 들면, 표면 플라즈몬 공명, 경쟁적 억제 분석); 세포독성 분석, 세포 생존율 분석, VEGF에 대한 세포 증식 또는 분화 분석(예컨대, 인산화 분석), 시험관내 또는 생체내 모델을 사용하는 암 세포 및/또는 종양 성장 억제를 이용하여 평가될 수 있다. 다른 분석은 KDR의 인산화, 혈관신생, 및 내피 세포 증식과 같은 정상 VEGF/KDR-매개된 반응, 그러나 이에 제한되지 않는 반응을 억제하기 위한 본 명세서에 기술된 항체의 능력을 시험할 수 있다. 본 명세서에 기술된 항체는 또한 KDR 수용체 내재화, 시험관내 및 생체내 효능 등에 대한 효과에 대해 시험될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 본 명세서의 항체는 적절한 동물 모델을 사용해 생체내에서 시험될 수 있다. 본 명세서에 기술된 항체는 이들의 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험관내 또는 생체내에서 시험될 수 있다. 이런 분석은 당업자에게 알려진 잘-확립된 프로토콜(예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY; Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY]를 참조); 또는 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

특정한 구현예에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인에 대해 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 이들 및 관련 구현예는 본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR을 결합하는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이들의 일부 조합을 의미할 것이며, 그의 기원으로 인해 단리된 폴리뉴클레오티드는 (1) 천연에서 발견되는 단리된 뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일 부분이 연관되지 않고, (2) 천연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 부분으로서 천연에서 발생하지 않는다.

용어 "작동적으로 연결된"은 용어가 적용되는 성분이 적합한 조건 하에서 그의 내재 기능을 수행하는 것을 가능하게 하는 상호관계를 의미한다. 예를 들면, 단백질 코딩 서열의 발현이 조절 서열의 전사적 활성과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되도록 단백질 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 전사 조절 서열은 이에 결찰된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "조절 서열"은 코딩 서열에 라이게이션되거나 작동적으로 연결되는 코딩 서열의 발현, 처리공정 또는 세포내 국소화에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 좌우될 수 있다. 특별한 구현예에서, 원핵생물에 대한 전사 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 다른 특별한 구현예에서, 원핵생물에 대한 전사 조절 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열, 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터를 포함한다. 특정한 구현예에서, "조절 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 나타낸 바와 같은 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 중합체를 의미한다. 특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이들 중 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모유리딘과 같은 염기 변형, 아라비노시드 및 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스호르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.

용어 "천연적으로 발생하는 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트, 등을 포함한다. 예컨대 문헌 [LaPlanche et al ., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al ., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al ., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al ., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al ., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., 미국특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543]을 참조하며, 그 기술내용은 임의의 목적을 위해 참조로서 본 명세서에 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 이의 하이브리드화를 가능하게 하기 위한 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 코딩 정보를 숙주 세포로 이동하는데 사용되는 임의의 분자(예컨대, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 나타내기 위해 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질 전환을 위해 적합한 벡터를 나타내며, 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시 및/또는 조절하는 핵산 서열을 포함한다. 발현은 이들로 제한되는 것은 아니지만, 전사, 번역과 같은 처리공정, 및 인트론이 존재하는 경우 RNA 스플라이싱을 포함한다.

당업자에 의해 이해될 것과 같이, 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열, 엑스트라-게놈 서열 및 플라스미드-인코딩된 서열 및, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 등을 발현하거나 이들을 발현하도록 조정될 수 있는 더 작게 가공된 유전자 분절을 포함할 수 있다. 이러한 분절은 당업자에 의해 천연적으로 단리되거나 합성적으로 변형될 수 있다.

또한 숙련된 기술자에게 인식될 것과 같이, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자와 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니며, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 폴리뉴클레오티드는 천연 서열을 포함할 수 있거나 그런 서열의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 이들 및 관련 구현예에 따른 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부 및 그런 폴리뉴클레오티드의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

다른 관련 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적 동일성을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 방법(예컨대, 하기 기술된 바와 같은 표준 매개변수를 사용한 BLAST 분석)을 사용하여 본 명세서에 기술된 항체를 인코딩하는 서열과 같은 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교된, 적어도 70% 서열 동일성,바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 당업자는 코돈 변성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 결정 등을 고려하여 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 상응하는 단백질의 동일성을 결정하기 위해 이들 값이 적절하게 조정될 수 있음을 인식할 것이다.

전형적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 항체의 결합 친화성은 본 명세서서 특이적으로 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 항체에 비례하여 실질적으로 감소되지 않는다.

특정한 다른 관련 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 서열과 동일하거나 이에 상보적인 서열의 다양한 길이의 인접 스트레치를 포함할 수 있거나 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열의 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 그들 사이의 모든 중간 길이를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이 문맥에서, "중간 길이"는 200-500; 500-1,000 등 사이의 모든 정수를 포함하는 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등과 같은 제시된 값 사이의 임의의 길이를 의미하는 것으로 용이하게 이해될 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 서열에서 발견되지 않는 추가적인 뉴클레오티드에 의해 한쪽 또는 양쪽 말단에서 연장될 수 있다. 이 추가 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 말단 중 한쪽 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 양 말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

다른 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이들의 단편, 또는 이의 상보적 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 중도 내지 높은 엄중 조건 하에서 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 혼성화 기술은 분자 생물학 기술분야에 잘 알려져 있다. 예시의 목적으로, 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 시험을 위해 적합한 중도로 엄중한 조건은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중에 예비세척; 5X SSC 50℃-60℃에서 밤새 혼성화; 그 후, 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 20분 동안 65℃에서 2회 세척을 포함한다. 당업자는 혼성화의 엄중도는 혼성화 용액의 염 함량 및/또는 혼성화가 수행되는 온도를 조절하는 것과 같은 방법으로 용이하게 조작될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 다른 구현예에서, 적절하게 고도로 엄중한 혼성화 조건은 혼성화 온도가 높아지는 것, 예컨대 60℃-65℃ 또는 65℃-70℃을 제외하고는 상기 기술된 것들을 포함한다.

특정한 구현예에서, 상기 기술된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 폴리뉴클레오티드 변이체, 단편 및 혼성화 서열은 KDR, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 항체를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 및 특정한 구현예에서, 적어도 약 90%로 본 명세서에 특이적으로 개시된 항체 서열 뿐만 아니라 KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CDR을 인코딩한다. 추가적인 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 항체보다 더 큰 친화성, 예를 들면 정량적으로 적어도 약 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 또는 110%로 KDR에 결합하는, 본 명세서에 특이적으로 개시된 항체 서열 뿐만 아니라 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CDR을 인코딩한다.

본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 선택된 천연 또는 비-천연 아미노산으로 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가, 결실 또는 삽입이 유래된 구조적 변이체가 본 명세서에 개시된 종의 공간-충전 특성을 유지하는지 여부를 결정할 목적으로 가상으로 모형화될 수 있도록 대표적인 폴리펩티드(예컨대, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변이체 KDR-특이적 항체, 예를 들면 본 명세서에 제공된 바와 같은 항원-결합 단편을 갖는 항체 단백질)의 3차원 구조의 결정이 통상적인 방법을 통해 이루어질 수 있다. 다양한 컴퓨터 프로그램은 예를 들면, 친화성이 유지되거나, 더 나은 친화성이 달성되는 항체 내에서 적절한 아미노산(또는 아미노산 서열을 인코딩하는 적절한 폴리뉴크레오티드) 치환을 결정하기 위해 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 단편은, 코딩 서열 자체의 길이와는 무관하게, 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클론닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 같은 다른 DNA 서열과 조합되어, 이들의 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 그러므로 의도되는 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 편이를 위해, 바람직하게는 제한되는 전체 길이와 함께, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 적용될 수 있음이 고려된다. 예를 들면, 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 길이 등(모든 중간 길이를 포함)의 전체 길이를 갖는 예시적인 폴리뉴클레오티드 분절이 유용할 것으로 고려된다.

폴리뉴클레오티드 서열을 비교하는 경우, 하기 기술된 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬하는 경우 두 서열 내의 뉴클레오티드의 서열이 동일하다면, 두 서열은 "동일"한 것으로 여겨진다. 두 서열 사이의 비교는 전형적으로 비교 용량 범위(comparison window)에 걸쳐 서열을 비교함으로써 수행되어, 서열 유사성의 국소 영역을 확인 및 비교할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "비교 용량 범위(comparison window)는 적어도 약 20 인접 위치, 보통 30 내지 약 75, 40 내지 약 50 인접 위치의 분절을 나타내며, 여기서 서열은 두 서열이 최적 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교될 수 있다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 매개변수를 사용하는, 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI) Lasergene 스위트(suite)에 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 하기의 참조에 기술된 몇몇 정렬 방식을 포함한다: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb . Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol . Biol . Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc . Natl. Acad ., Sci . USA 80:726-730 (1983).

대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith 및 Waterman의 국소 동일성 알고리즘(Add . APL . Math 2:482 (1981)), Needleman 및 Wunsch의 동일성 정렬 알고리즘(J. Mol . Biol. 48:443 (1970)), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법을 통한 조사(Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 2444 (1988)), 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터화된 실행, 또는 검사를 통해 수행될 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 바람직한 예는 각각 Altschul 등의 문헌 [Nucl . Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 Altschul 등의 문헌 [J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 예를 들면 본 명세서에 기술된 매개변수와 함께 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 하나의 예시적인 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드에 대하여 매개변수 M(부합하는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(부합하는 잔기의 위반 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산될 수 있다. 각 방향에서 단어 hit의 연장은 다음의 경우 중단된다: 누적 정렬 점수는 그의 최대 달성 값으로부터 양 X에 의해 떨어지며; 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 점수는 0 또는 그 이하로 가거나; 양 서열의 말단에 다다른다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열에 대한) BLASTN 프로그램 11의 단어 길이(W), 및 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 스코어 매트릭스(Henikoff 및 Henikoff의 문헌 [Proc. Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1989)]를 참고) 정렬, 50의 (B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.

특정한 구현예에서, "서열 동일성 퍼센트"는 적어도 20 위치의 비교 용량 범위에 걸친 2개의 최적 정렬된 서열에 의해 결정되며, 여기서 비교 용량 범위 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 20 퍼센트 이하, 보통 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기가 양 서열 내에서 발생하는 위치의 숫자를 결정하여 부합된 위치의 숫자를 수득하고, 부합된 위치의 수를 참조 서열(즉, 용량 범위 크기) 내의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 퍼센트를 수득함으로써 계산된다.

당업자는 유전적 코드의 퇴화의 결과로서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 많은 뉴클레오티드가 있음을 인식할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드의 일부는 KDR에 결합하는 항체를 인코딩하는 천연 또는 본래의 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 서열 동일성을 보유한다. 그렇다고 해도, 코돈 용도에서의 상이함에 기인하여 다양한 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 특별히 고려된다. 특정한 구현예에서, 포유동물 발현을 위해 코돈-최적화된 서열이 특이적으로 고려된다.

그러므로, 본 발명의 다른 구현예에서, 부위 특이적 돌연변이화와 같은 돌연변이화 접근이 본 명세서에 기술된 항체의 변이체 및/또는 유도체의 제조를 위해 적용될 수 있다. 이 접근을 통해서, 폴리뉴클레오티드 서열 내의 특이적 변형은 이들을 인코딩하는 기저(underlying) 폴리뉴클레오티드의 돌연변이화를 통해 만들어질 수 있다. 이들 기술은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 폴리뉴클레오티드 내로 도입시킴으로써, 예를 들면 하나 이상의 전술한 고려사항을 통합하는 서열 변이체를 제조 및 시험하기 위한 수월한 접근을 제공한다.

부위-특이적 돌연변이화는 횡단된 결실 접합부의 양 측면 상에 안정한 이중나선을 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복잡성의 프라이머 서열을 제공하도록 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 인코딩하는 특이적 올 통해 돌연변이체의 생산을 가능하게 한다. 돌연변이는 폴리뉴클레오티드 자체의 특성을 개선, 변경, 저하, 변형, 또는 달리 변화시키고/변화시키거나 인코딩된 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 일차 서열을 변경시키기 위해 선별된 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 적용될 수 있다.

특정한 구현예에서, 본 발명자들은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 친화성, 또는 특이적 Fc 영역의 기능, 또는 특이적 FcγR에 대한 Fc 영역의 친화성과 같은 인코딩되는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 변경하기 위해 본 명세서에 개시된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 돌연변이화를 고려한다. 부위-특이적 돌연변이화의 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드 둘 모두의 변이체를 생성하는데 널리 사용된다. 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이화는 DNA 분자의 특정한 부분을 변경하기 위해 종종 사용된다. 이러한 구현예에서, 전형적으로 길이가 약 14 내지 약 25 뉴클레오티드 등을 포함하는 프라이머는 변경되는 접합부의 양 측면 상에 약 5 내지 약 10 잔기와 함께 적용된다.

당업자에게 이해될 것과 같이, 부위-특이적 돌연변이화 기술은 종종 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두에 존재하는 파지 벡터를 적용하였다. 부위-특이적 돌연변이화에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파지는 용이하게 상업적으로 입수가능하며 이의 사용은 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있다. 이중 가닥 플라스미드는 또한 플라스미드로부터 파지로 관심 유전자를 이동시키는 단계를 제거한 부위 지시된 돌연변이화에 통상적으로 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 명세서에 따른 부위-지시된 돌연변이화는 우선 서열 내에 원하는 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단일 가닥 벡터를 수득하거나 이중 가닥 벡터의 2개의 가닥을 융해 분리시킴으로써 수행된다. 원하는 돌연변이된 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 합성적으로 제조된다. 그 후, 이 프라이머는 돌연변이 보유 가닥의 합성을 완성하기 위해 단일 가닥 벡터와 어닐링되고, 대장균 폴리머라제 I 클레노우(Klenow) 단편과 같은 DNA 중합화 효소로 적용된다. 따라서, 하나의 가닥은 본래의 비-돌연변형된 서열을 인코딩하고 두번째 나선은 원하는 돌연변이를 보유하는 이형이중나선이 형성된다. 그 후, 이형이중나선 벡터는 대장균 세포와 같은 세포는 적절하게 형질전환시키기 위해 사용되고, 돌연변이된 서열 배열을 보유하는 재조합 벡터를 포함하는 클론이 선별된다.

부위-지시된 돌연변이화를 사용하여 선별된 펩티드-인코딩 DNA 분절의 서열 변이체의 제조는 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단을 제공하고, 여기서 펩티드 및 이를 인코딩하는 DNA 서열의 서열 변이체가 수득될 수 있는 다른 방식이 존재하기 때문에 제한적인 의미를 갖는 것은 아니다. 예를 들면, 원하는 펩티드 서열을 인코딩하는 재조합 벡터는 하이드록실아민과 같은 돌연변이 유발제로 처리되어 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이러한 방법 및 프로토콜과 관련된 구체적인 예시는 문헌 [Maloy et 　 al ., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; 및 Maniatis et 　 al ., 1982]의 교시에서 찾을 수 있으며, 각각은 그러한 목적을 위해 본 명세서에 참조로서 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이화 절차"는 초기 농도에 비례하여 특이적 핵산 분자의 농도에서의 증가 또는 증폭과 같은 검출가능한 시그널의 농도에서의 증가를 초래하는 주형-의존적 과정 및 벡터-매개 증식을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이화 절차"는 프라이머 분자의 주형-의존적 신장을 포함하고 과정을 나타내는 것으로 의도된다. 용어 주형 의존적 과정은 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 나타내며, 여기서 핵산의 신규 합성된 가닥의 서열은 공지의 상보성 염기 짝짓기 법칙에 의해 지시된다(예를 들면, Watson, 1987를 참조). 전형적으로, 벡터 매개 방법론은 핵산 단편의 DNA 또는 RNA 벡터 내로의 도입, 벡터의 클론적 증폭, 및 증폭된 핵산 단편의 회복을 포함한다. 이러한 방법론의 예는 그의 전체가 본 명세서에 참조로서 구체적으로 포함된 미국특허 제4,237,224호에 제공된다.

폴리펩티드 변이체의 생산을 위한 다른 접근법에서는, 미국특허 제5,837,458호에 기술된 바와 같은 순환 서열 재조합이 적용될 수 있다. 이 접근에서, 재조합 및 스크리닝 또는 선별의 반복 사이클은 예를 들면, 증가된 결합 친화성을 갖는 개개의 폴리뉴클레오티드 변이체를 "진화"시키기 위해 수행된다. 특정한 구현예는 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태의 구조물을 제공한다.

많은 구현예에서, 대상 모노클론 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 내로 직접적으로 도입되고, 상기 세포는 인코딩된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션된다. 본 발명의 항체는 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 및 핵산 서열과 조합하여 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 폴리펩티드 서열은 그에 의해 개시된 특정 항체를 인코딩하는 적절한 핵산을 결정하는데 사용될 수 있다. 핵산 서열은 당업자에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 다양한 발현 시스템을 위해 특정 코돈 "선호도"를 반영하도록 최적화될 수 있다.

특정한 관련 구현예에 따르면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 구조물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 임의의 항체를 인코딩하는 핵산, CDR, VH 또는 VL 도메인, 또는 이들의 항원-결합 단편 및 인코딩된 생산물을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 생산물을 인코딩하고 핵산으로부터의 발현을 포함한다. 발현은 적절한 조건하에서 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후에, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제된 후, 원하는 바대로 사용될 수 있다.

본 명세서에 제공된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 인코딩 핵산 분자 및 벡터는 예컨대, 그들의 천연 환경으로부터 실질적으로 순수하거나 동종 형태이거나, 핵산의 경우에는, 원하는 기능을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 아닌 기원의 핵산 또는 유전자가 핵산이 없거나 실질적으로 없는 형태로 단리 및/또는 정제될 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고 전체 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 서열에 대한 참조는 지시된 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, 지시된 서열을 갖는 RNA 분자를 포함하며, 문맥이 다르게 요구하지 않는 한, 여기서 U는 T에 대해 치환된다.

여러가지 서로 다른 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 본 기술분야의 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 많은 다른 세포들을 포함한다. 통상의 바람직한 세균 숙주는 대장균이다.

대장균과 같은 원핵 세포에서 항체 및 항원-결합 단편의 발현은 본 기술 분야에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들면 문헌 [Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]를 참고한다. 배양에서 진핵 세포 내의 발현은 또한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산을 위한 옵션으로서 당업자가 입수가능하며, 예를 들면, 최신 보고서인 문헌 [M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al . (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560]을 참고한다.

적합한 벡터는 프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절하게는 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하여, 선택되거나 구성될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 파지, 적절하게는 또는 파지미드일 수 있다. 추가적인 설명을 위해, 예를 들면, 문헌 [ Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al ., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]를 참고한다. 예를 들면 핵산 구조물의 제조에서 핵산의 조작, 돌연변이화, 시퀀싱, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석을 위한 많은 알려진 방법 및 프로토콜은 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al . eds., John Wiley & Sons, 1992] 또는 이의 업데이트된 문헌들에서 상세히 기술된다.

용어 "숙주 세포"는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체를 인코딩하는 핵산 서열이 세포 내로 도입되거나, 이로 도입될 수 있고, 추가로 본 명세서에 기술된 임의의 항체를 인코딩하는 유전자와 같은 관심의 선별된 유전자를 발현할 수 있는 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 상기 용어는 선별된 유전자가 존재하는 한, 자손이 본래 모체와 형태 또는 유전적 구성(genetic make-up)이 동일한지 여부에 관계없이 모체 세포의 자손을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법이 또한 고려된다. 도입은 임의의 활용가능한 기술을 적용할 수 있다. 진핵 세포에 대해, 적합한 기술은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예컨대 백시니아 또는, 곤충 세포에 대해 배큘로바이러스를 이용한 형질도입을 포함할 수 있다. 세균성 세포에 대해, 적합한 기술은 박테리오파지를 사용하는 칼슘 클로라이드 형질전환, 전기천공 및 형질감염을 포함할 수 있다. 도입은 그 후에 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용한 후에 예컨대 유전자의 발현을 위한 조건하에 숙주 세포를 배양함으로써, 핵산으로부터 발현을 야기하거나 이를 허용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 핵산은 숙주 세포의 게놈(예컨대, 염색체) 내로 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라서, 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열의 혼입에 의해 촉진될 수 있다.

특정한 구현예에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR-특이적 항체와 같은 특정 폴리펩티드를 발현하기 위하여 발현 시스템 내에서 상기 언급된 바와 같은 구조물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 용어 "형질도입"은 보통 파지에 의해 하나의 세균으로부터 다른 세균으로의 유전자의 이동을 나타내기 위해 사용된다. "형질도입"은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵 세포 서열의 획득 및 이동을 나타낸다. 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외부 또는 외인성 DNA의 흡수를 나타내기 위해 사용되며, 세포는 외인성 DNA가 세포 막 내부로 도입되는 경우 "형질감염된" 것이다. 다수의 형질감염 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 본 명세서에 개시된다. 예컨대, 문헌 [Graham et al ., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al ., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al ., 1986, BASIC METHODS 1N MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; 및 Chu et al ., 1981, Gene 13:197]를 참고한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특성의 변화를 나타내며, 세포는 신규한 DNA를 함유하도록 변형되는 경우 형질전환된 것이다. 예를 들면, 세포는 세포가 자신의 천연 상태로부터 유전적으로 변형된 곳에서 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 이후에, DNA의 형질전환은 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합됨으로써 세포의 것들과 재조합될 수 있거나, 복제되지 않고 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. DNA가 세포의 분할과 함께 복제되는 경우 세포는 안정하게 형질전환된 것으로 고려된다. 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 연관되어 사용되는 경우, 용어 "천연적으로 발생하는" 또는 "천연"은 천연에서 발견되거나 인간에 의해서 조작되지 않은 물질을 나타낸다. 유사하게, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "비-천연적으로 발생하는" 또는 "비-천연"은 천연에서 발견되지 않거나, 인간에 의해 구조적으로 변형 또는 합성되지 않은 물질을 나타낸다.

용어 "폴리펩티드" "단백질" 및 "펩티드" 및 "당단백질"은 상호교환적으로 사용되며 임의의 특정 길이에 제한되지 않는 아미노산의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 미리스틸화(myristylation), 황산화, 당화, 인산화 및 시그널 서열의 추가 또는 결실과 같은 변형을 배제하지 않는다. 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 하나 이상의 아미노산 쇄를 의미하며, 여기서 각각의 쇄는 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산을 포함하고, 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 단백질의 서열을 가지면서 펩티드 결합에 의해 함께 비-공유 및/또는 공유적으로 연결된 복수의 쇄를 포함하는 것으로, 즉 단백질은 천연적으로-발생하는 세포 및 특이적으로 재조합되지 않은 세포, 또는 유전적으로-조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해서 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 하나 이상의 천연 아미노산 서열로부터의 결실, 이에 부가, 및 또는 이의 치환을 갖는 천연 단백질을 갖는 분자를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 본 발명의 KDR에 결합하는 항체, 또는 항-KDR 항체의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 이에 부가, 및/또는 이의 치환을 갖는 서열을 포함한다. 따라서, "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 하나("단량체"로 지칭됨) 또는 복수("다합체"로 지칭됨)의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다.

본 명세서에 지칭된 용어 "단리된 단백질"은 대상 단백질이 (1) 전형적으로 천연에서 발견될 것과는 적어도 일부 다른 단백질이 부재하고, (2) 동일한 근원, 예컨대 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 본질적으로 존재하지 않고, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고, (4) 천연에서 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질들의 적어도 약 50 퍼센트로부터 분리되고, (5) "단리된 단백질"이 천연에서 연관되어 있는 단백질의 부분과 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연관되어 있지 않고, (6) 천연에서는 연관되어 있지 않은 폴레펩티드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동적으로 연관되고, 또는 (7) 천연에서 발생하지 않는 것을 의미한다. 이러한 단리된 단백질은 합성 기원의 것일 수 있는 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 구현예에서, 단리된 단백질은 그의 사용(치료, 진단, 예방, 조사 등)을 방해할 수 있는 그의 천연 환경에서 발견될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다.

용어 "폴리펩티드 단편"은 단랑체 또는 다합체일 수 있는 폴리펩티드를 나타내며, 이는 천연적으로-발생하는 또는 재조합으로-생산된 폴리펩티드의 아미노-말단 결실, 카르복실 말단 결실, 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는다. 특정한 구현예에서, 폴리펩티드 단편은 적어도 5 내지 약 500 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450 아미노산 길이인 것으로 인식될 것이다. 특히 유용한 폴리펩티드 단편은 항원-결합 도메인 또는 항체의 단편을 포함하는 작용 도메인을 포함한다. 항-KDR 항체의 경우에, 유용한 단편은 이들로 제한되는 것은 아니지만, CDR 영역, 특히 중쇄 또는 경쇄의 CDR3 영역; 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역; 항체 쇄의 부분 또는 2개의 CDR을 포함하는 단지 이의 가변 영역; 등을 포함한다.

폴리펩티드는 공동-번역 또는 후-번역적으로 단백질의 전이를 지시하는, 단백질의 N-말단에 시그널(또는 리더) 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 고형 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 증강시키거나, 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 확인의 편의를 위해 링커 또는 다른 서열(예컨대, 폴리-His)에 인-프레임(in-frame) 융합되거나, 컨쥬게이트될 수 있

폴리펩티드 링커/스페이서 서열은 또한 원하는 경우 각각의 폴리펩티드가 2차 및/또는 4차 구조 내로 접힐 수 있도록 하기에 충분한 거리로 개별 다중 폴리펩티드 성분에 적용될 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 본 기술 분야에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 융합 단백질 내로 통합될 수 있다.

특정 펩티드 스페이서 서열은 예를 들면, (1)　유연한 신장된 형태를 채택하기 위한 이들의 능력; (2)　제1 및 제2 폴리펩티드 상에서 작용 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택하기 위한 이들의 불능; 및/또는 (3) 폴리펩티드 작용 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 부재에 근거하여 선택될 수 있다.

하나의 예시적인 구현예에서, 펩티드 스페이서 서열은 예를 들면, Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala와 같은 거의 중성의 아미노산이 또한 스페이서 서열에 포함될 수 있다.

스페이서로서 유용하게 적용될 수 있는 다른 아미노산 서열은 문헌 [Maratea et al ., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:8258 8262 (1986); 미국특허 제4,935,233호 및 미국특허 제4,751,180호]에 개시된 것들을 포함한다.

다른 예시적인 스페이서는 예를 들면, Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070) 및 Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(Bird et al., 1988, Science 242:423-426)를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 스페이서 서열은 작용 도메인을 분리하는데 사용될 수 있고 입체적 방해를 예방할 수 있는 제1 및 제2 폴리펩티드가 비-필수적 N-말단 아미노산 영역을 가지는 경우 요구되지 않는다. 2개의 코딩 서열은 임의의 스페이서 없이 직접적으로 융합되거나 예를 들면, 1 내지 3회 반복되는 펜타머 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser로 구성되는 유연한 폴리링커를 사용하여 융합될 수 있다. 이러한 스페이서는 VH와 VL 사이에 삽입되어 단일 쇄 항체(scFv)를 구성하는데 사용된다(Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5979-5883).

특정한 구현예에서, 펩티드 스페이서는 단일 쇄 항체의 가변 영역을 형성하는 2개의 베타-시트(beta-sheet) 사이에 알맞은 상호작용이 가능하도록 디자인된다.

특정의 예시적인 구현예에서, 펩티드 스페이서는 1 내지 5 아미노산 사이, 5 내지 10 아미노산 사이, 5 내지 25 아미노산 사이, 5 내지 50 아미노산 사이, 10 내지 25 아미노산 사이, 10 내지 50 아미노산 사이, 10 내지 100 아미노산 사이, 또는 임의의 사이의 범위의 아미노산이다.

다른 예시적인 구현예에서, 펩티드 스페이서는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 아미노산 길이를 포함한다.

본 명세서에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체, 또는 이의 쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 내로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이는 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 이로의 삽입 및/또는 이의 치환을 포함한다. 단, 최종 구조물이 원하는 특성(예컨대, KDR에 높은 친화성으로 결합)을 갖는 다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 항체를 달성하도록 만들어질 수 있다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 개수 또는 위치와 같은 항체의 번역후 과정을 변경시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 상기 기술된 임의의 변이 및 변형은 본 발명의 항체 내에 포함될 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 항체의 변이체를 제공한다. 특정한 구현예에서, 이러한 변이체 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CDR은 본 명세서에 특이적으로 개시된 항체 서열 뿐만 아니라 KDR에 적어도 약 50%, 적어도 약 70% 결합하고, 특정한 구현예에서, 적어도 약 90% 결합한다. 추가적인 구현예에서, 이러한 변이체 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CDR은 본 명세서에 특이적으로 개시된 항체 서열 뿐만 아니라 KDR에 본 명세서에 개시된 항체보다 더 큰 친화성, 예를 들면, 정량적으로 적어도 약 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 또는 110%로 결합한다.

특별한 구현예에서, 대상 항체는 a) 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체의 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 b) 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체의 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미 노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 9 및 10에 개시된다.

특별한 구현예에서, 항체는 a) i. 본 명세서에 기술된 선별된 항체의 중쇄 CDR1 영역에 대해 아미노산 서열이 동일한 CDR1 영역; ii. 상기 선별된 항체의 중쇄 CDR2 영역에 대해 아미노산 서열이 동일한 CDR2 영역; 및 iii. 상기 선별된 항체의 중쇄 CDR3 영역에 대해 아미노산 서열이 동일한 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) i. 상기 선별된 항체의 경쇄 CDR1 영역에 대해 아미노산 서열이 동일한 CDR1 영역; ii. 상기 선별된 항체의 경쇄 CDR2 영역에 대해 아미노산 서열이 동일한 CDR2 영역; 및 iii. 상기 선별된 항체의 경쇄 CDR3 영역에 대해 아미노산 서열이 동일한 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있으며; 여기서 항체는 선별된 표적(예컨대, KDR)에 특이적으로 결합한다. 추가적인 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 변이체 항체이며, 여기서 변이체는 VH 및 VL 영역의 CDR에서 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 제외하고는 선별된 항체에 대해 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 이와 관련하여, 선별된 항체의 CDR 영역에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 특정한 구현예에서, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산 치환이 존재할 수 있다. 치환은 VH 및/또는 VL 영역 중 어느 하나에서 CDR 내에 존재할 수 있다.(예컨대, 문헌 [Muller, 1998, Structure 6:1153-1167]을 참고한다).

선택된 천연 또는 비-천연 아미노산으로 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가, 결실 또는 삽입이 유래된 구조적 변이체가 본 명세서에 개시된 종의 공간-충전 특성을 유지하는지 여부를 결정할 목적으로 가상으로 모형화될 수 있도록 대표적인 폴리펩티드(예컨대, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변이체 KDR-특이적 항체, 예를 들면 본 명세서에 제공된 바와 같은 항원-결합 단편을 갖는 항체 단백질)의 3차원 구조의 결정이 통상적인 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Donate et al., 1994 Prot . Sci . 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc . Nat . Acad . Sci . USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al . Science 327:1014-1018 (2010)]을 참고한다. 이들 및 관련된 구현예, 예컨대, 본 명세서에 제공된 바와 같은 KDR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 도메인의 합리적인 디자인을 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 알고리즘의 추가적인 비-제한적인 예는 3-D 그래픽 및 빌트-인(built-in) 스크립팅(scripting)(Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champagne의 웹사이트 ks.uiuc.edu/Research/vmd/를 참고)을 사용하는 거대 생물분자 시스템을 디스플레이, 애니메이션화, 및 분석하기 위한 분자 시각화 프로그램인 VMD를 포함한다. 에너지-최소화된 형태의 공간-충전 모델(반 데르 발스 반경)로부터 원자적 차원의 결정을 가능하게 하는 많은 다른 컴퓨터 프로그램이 본 기술분야에 알려져 있으며, 숙련가에게 이용가능하다; 상이한 화학 기에 대하여 높은 친화성 영역을 결정하여, 이에 따라 결합의 증강을 추구하는 GRID, 수학적 정렬을 계산하는 Monte Carlo 검색, 및 힘의 장 계산, 및 분석(또한, 문헌 [Eisenfield et al. (1991) Am . J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm . Belg . 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ . Health Perspect . 61:185-190; 및 Kini et al. (1991) J. Biomol . Struct . Dyn . 9:475-488)]를 참고)을 평가하는 CHARMM(Brooks et al. (1983) J. Comput . Chem . 4:187-217) 및 AMBER(Weiner et al (1981) J. Comput . Chem. 106: 765). 다양한 적절한 컴퓨터화된 컴퓨터 프로그램이 또한 Schrodinger(Munich, Germany)로부터와 같이 상업적으로 이용가능하다.

발명의 다른 구현예에서, 항-KDR 항체 및 이의 인간화된 버전은 토끼 모노클로날 항체로부터 유래되고, 특히 RabMAb® 기술을 사용하여 생성된다. 이들 항체는 최소 서열 변형을 필요로 하여, 돌연변이 계통 가이드된(MLG) 인간화 기술(예컨대, 미국특허 제7,462,697호 참고)을 사용하는 인간화 후에 기능적 특성의 보유를 용이하게 하기 때문에, 유리하다. 따라서, 본 발명의 항-KDR 항체를 만들기 위한 예시적인 방법은 예를 들면, 미국특허 제5,675,063호 및 제7,429,487호에 기술된 RabMAb® 토끼 모노클로날 항체 기술을 포함한다. 이와 관련하여, 특정한 구현예에서, 항-KDR 항체는 토끼에서 생산된다. 특별한 구현예에서, 토끼 지라세포와 융합할 수 있는 토끼-유래 불멸 B-림프구는 항체를 생산하는 혼성화 세포를 생산하는데 사용된다. 불멸 B-림프구는 내인성 면역글로불린 중쇄를 검출가능하게 발현하지 않으며, 특정한 구현예에서, 변경된 면역글로불린 중쇄-인코딩 유전자를 포함할 수 있다.

조성물 및 사용 방법

본 발명은 KDR-특이적 항체, 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 및 다양한 치료 설정에서의 이러한 조성물의 투여를 제공한다.

순수한 형태 또는 적절한 약학 조성물로서 본 명세서에 기술된 KDR-특이적 항체의 투여는 유사한 효용을 제공하는 제제를 투여하는데 허용된 임의의 방식을 통해 수행될 수 있다. 약학 조성물은 항체 또는 항체-함유 조성물을 적절한 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제조할 수 있으며, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 마이크로스피어 및 에어로솔과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 가스 형태로서 제제 내로 제형화될 수 있다. 추가로, 다른 약학적 활성 성분(본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같은 다른 항암 제제를 포함) 및/또는 염, 완충제 및 안정화제와 같은 적절한 부형제는 조성물 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 투여는 경구, 비경구, 코, 정맥내, 피내, 피하 또는 국소를 포함하는 다양한 상이한 경로를 통해 달성될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 치료되거나 예방될 상태의 성질에 의존한다. 투여 후에 암의 진행 및/또는 전이가 감소, 억제, 예방 또는 지연되는 양이 효과적인 것으로 고려된다.

특정한 구현예에서, 투여되는 양은 생존가능한 종양의 양에 있어서 통계적으로 유의미한 감소, 예를 들면 종양 질량의 적어도 50% 감소, 또는 변경된(예컨대, 통계학적 유의성으로 감소된) 스캔 치수(dimension)에 의해 나타난 바와 같은 종양 퇴행을 초래하기에 충분하다. 다른 구현예에서, 투여되는 양은 다양한 종양성 질환, 염증성 질환, 및 혈관신생-관련된 질환 중 임의의 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 증상에 있어서, 임상적으로 관련된 감소를 초래하기에 충분하다. 따라서, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체의 치료적 유효량은 류마티스 관절염, 당뇨병 및 허혈성 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 건선 및 사구체 비대증 관련 단백뇨, 및 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 장애의 증상에 있어서 임상적으로 관련된 감소를 초래하기 위해 투여된다. 이러한 임상적으로 관련된 증상은 숙련된 임상의에게 공지이며, 치료될 질환 적응증에 따라 다양할 것이다.

치료의 정확한 투여량 및 기간은 치료될 질환의 함수이며, 공지의 시험 프로토콜을 사용하여 경험적으로 결정될 수 있거나 본 기술분야에 알려지고 이로부터 추론되는 모델 시스템 내에서 조성물을 시험하여 결정될 수 있다. 제어된 임상 시험이 또한 수행될 수 있다. 투여량은 또한 완화될 상태의 중증도에 따라 다양할 수 있다. 약학 조성물은 일반적으로 제형화되고 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하도록 투여된다. 투여되는 조성물은 1회, 또는 시간의 간격을 두고 투여되도록 다수의 더 적은 투여량으로 분배될 수 있다. 임의의 특별한 개체에 대해서는, 특이적 투여량 요법이 필요한 개인에 따라 시간에 걸쳐 조정될 수 있다.

KDR-특이적 항체-함유 조성물은 단독으로 투여되거나 방사선요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학 요법 등과 같은 다른 알려진 암 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 병용하여 투여될 수 있다.

따라서 이들 및 관련 약학 조성물을 투여하는 전형적인 경로는, 제한없이, 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 볼, 직장, 및 비강내를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따른 약학 조성물은 환자에게 조성물 투여 시 생물학적으로 이용가능하도록 그 안에 활성 성분이 함유되게 제형화된다. 개체 또는 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여량 단위의 형태를 취할 수 있는데, 예를 들면, 정제는 단일 투여량 단위일 수 있고, 에어로솔 형태 내에 본 명세서에 기술된 KDR-특이적 항체의 용기는 복수의 투여량 단위를 수용할 수 있다. 이러한 투여량 형태를 실제로 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있거나 자명할 것이다; 예를 들면, 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)]을 참고한다. 모든 사례에서, 투여될 조성물은 본 명세서의 교시에 따른 관심의 질환 또는 상태를 치료하기 위해, 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다.

약학 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 하나의 구현예에서, 담체(들)은 입자성 물질일 수 있기 때문에, 조성물은 예를 들면 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)은 투여될 조성물과 함께 액체, 예를 들면, 경구 오일, 예를 들면 흡입성 투여에 유용한 주사가능한 액체, 또는 에어로솔일 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 약학 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이며, 여기서 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태가 고체 또는 액체로서 본 명세서에서 고려될 형태 내에 포함된다.

경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 약학 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼(wafer)와 같은 것들 내로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 추가로, 하나 이상의 하기의 것들이 존재할 수 있다: 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토오스 또는 덱스트린 같은 부형제, 알긴산, 소디움 알기네이트, 프리모겔, 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향과 같은 착향제; 및 착색제. 약학 조성물이 캡슐 형태, 예를 들면 젤라틴 캡슐 형태인 경우, 상기 유형의 물질 이외에, 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.

약학 조성물은 액체 형태, 예를 들면, 엘릭시르, 시럽, 에멀전 또는 현탁액일 수 있다. 액체는 2가지 예로서 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달용일 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 바람직한 조성물은 본 발명의 화합물 외에, 하나 이상의 감미제, 보존제, 염색/착색제 및 향 증강제를 함유한다. 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물에는, 하나 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제가 포함될 수 있다.

용액, 현탁액 또는 다른 종류의 형태이든지 아니든지간에, 액체 약학 조성물은 하나 이상의 하기의 애쥬번트를 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염수, 바람직하게는 생리적 식염수, 링거액, 등장성 소디움 클로라이드 용액과 같은 멸균 희석제, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드와 같은 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소디움 바이설파이드와 같은 항산화제; 에틸렌디아민아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 소디움 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 등장성을 조정하기 위한 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 시린지 또는 복합 용량 바이알 내에 동봉될 수 있다. 생리학적 식염수는 바람직한 애쥬번트이다. 주사가능한 약학 조성물은 바람직하게는 멸균된 것이다.

비경구 또는 경구 투여용으로 의도된 액체 약학 조성물은 적합한 투여량이 수득될 수 있도록 본 명세서에 개시된 바와 같은 KDR-특이적 항체의 양을 함유해야만 한다. 전형적으로, 이 양은 조성물 내에 적어도 0.01%의 항체이다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 이 양은 조성물의 중량의 0.1 내지 약 70% 사이로 다양할 수 있다. 특정한 경구 약학 조성물은 약 4% 내지 약 75% 사이의 항체를 함유한다. 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물 및 제제는 희석 전에 비경구 투여량 단위가 0.01 내지 10 중량%의 항체를 함유하도록 제조된다.

약학 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있는데, 이 경우에 담체는 용액, 에멀전, 연고 또는 겔 베이스(base)를 적절하게 포함할 수 있다. 예를 들면, 베이스는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 광유, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 미네랄 오일, 물 및 알코올과 같은 희석제, 및 에멀전화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여용 약학 조성물 내에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도된 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온 도입 장치를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 예를 들면 좌제의 형태로 직장 투여용으로 의도될 수 있는데, 이는 직장에서 융해하여 약물을 방출할 것이다. 직장 투여용 조성물은 적절한 비자극성 부형제로서 유질의 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스는, 제한 없이, 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

약학 조성물은 고체 또는 액체 투여량 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 외피를 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 외피를 형성하는 물질은 전형적으로 불활성이며, 예를 들면, 당, 쉘락 및 다른 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐 내에 감싸질 수 있다. 고체 또는 액체 형태 내의 약학 조성물은 본 발명의 항체에 결합하여, 화합물의 전달을 보조할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적절한 제제는 다른 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 하나 이상의 단백질 또는 리포솜을 포함한다. 약학 조성물은 에어로솔로서 투여될 수 있는 투여량 단위로 본질적으로 구성될 수 있다. 용어 에어로솔은 콜로이달 성질의 시스템부터 가압된 패키지로 구성되는 시스템에 이르는 다양한 시스템을 지칭하기 위해 사용된다. 전달은 액화되거나 압축된 가스에 의해 또는 활성 성분을 제공하는 적절한 펌프 시스템에 의해서 이루어질 수 있다. 에어로솔은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단일 상, 이중-상, 또는 삼중-상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로솔의 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는 필수 용기, 활성제, 밸브, 하부 용기 등을 포함한다. 당업자는 과도한 실험없이 바람직한 에어로솔을 결정할 수 있다.

약학 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사에 의해 투여되도록 의도된 약학 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR-특이적 항체 및 선택적으로 하나 이상의 염, 완충제, 및/또는 안정화제를 포함하는 조성물을 용액을 형성하기 위해 멸균한 증류수와 조합하여 제조될 수 있다. 계면활성제가 첨가되어 균질 용액 또는 현탁액의 형성을 촉진할 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 항체의 용해 또는 균질한 현탁을 촉진하기 위해 항체 조성물과 비-공유적으로 상호작용하는 화합물이다.

조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있으며, 이는 적용되는 특정 화합물(예컨대, KDR-특이적 항체)의 활성; 화합물의 대사적 안정성 및 작용 길이; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 방식 및 시간; 배설률, 약물 병용; 특정 장애 또는 상태의 중증도; 및 요법이 진행 중인 개체를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 치료적으로 유효한 1일 용량은 (70 kg 포유동물의 경우) 약 0.001 mg/kg(즉, 0.07 mg) 내지 약 100 mg/kg(즉, 7.0 g)이고; 바람직하게는 치료적으로 유효한 용량은 (70 kg 포유동물의 경우) 약 0.01 mg/kg(즉, 0.7 mg) 내지 약 50 mg/kg(즉, 3.5 g)이며; 더욱 바람직하게는 치료학적으로 유효한 용량은 (70 kg 포유동물의 경우) 약 1 mg/kg(즉, 70 mg) 내지 약 25 mg/kg(즉, 1.75 g)이다. 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 특정한 구현예에서, m² 당 mg(즉, mg/m²)으로서 표현된 용량을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 등가 mg/m² 용량으로서 임의의 주어진 종에서 mg/kg 용량을 표현하기 위해, 용량을 적절한 km 인자와 곱한다. 성인에 있어서, 100 mg/kg는 100 mg/kg x 37 kg/m² = 3700 mg/m²와 등가이다. 예를 들어, [FDA guidelines for Industry and Reviewers]를 참고하며; 또한 문헌[Freireich, EJ, et al. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, dog, monkey and man. Cancer Chemother Rep.1966;50(4):219-244]을 참고한다.

본 발명의 KDR-특이적 항체를 포함하는 조성물은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 이러한 병용 요법은 본 발명의 항체 및 그 자신의 개별 약학 투여량 제형 내의 각각의 활성제를 포함하는 조성물의 투여뿐만 아니라, 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 추가적인 활성제를 함유하는 단일 약학 투여량 제형의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 및 다른 활성제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여량 조성물 내에서 함께 환자에게 투여될 수 있거나, 각각의 제제는 개별 경구 투여량 제형 내에서 투여된다. 유사하게, 본 명세서에 기술된 항체 및 다른 활성제는 식염수 또는 다른 생리학적으로 허용가능한 용액과 같은 단일 비경구 투여량 조성물 내에서 함께 환자에게 투여될 수 있거나, 각각의 제제는 개별 비경구 투여량 제형 내에서 투여된다. 개별 투여량 제형이 사용되는 경우, 항체 및 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함하는 조성물은 본질적으로 함께, 즉 동시에(concurrently) 또는 분리되어 시차를 두고, 즉 연속적으로 임의의 순서로 투여될 수 있으며; 병용 요법은 모든 이들 요법을 포함하는 것으로 이해된다.

따라서, 특정한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항-KDR 항체 조성물을 하나 이상의 다른 치료제와의 병용 투여가 고려된다. 이러한 치료제는 염증성 질환(예컨대, 류마티스 관절염, 또는 다른 염증성 장애), 임의의 다양한 종양 질환, 및 혈관신생-매개된 질환(노화-관련 황반 변성과 같은 질환이지만, 이로 제한되지 않음)과 같은 본 명세서에 기술된 바와 같은 특정 질환 상태에 대한 표준 치료로서 당업계에서 수용될 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항-염증제, 화학치료제, 방사선치료제, 또는 다른 활성제 및 보조제를 포함한다.

특정한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항-KDR 항체는 임의의 개수의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예는 티오페파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN^TM)와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포페이트; 벤조도파, 카르보콘(carboquone), 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜아민; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 니트로젠 머스타드; 카르머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴과 같은 니트로스우레아; 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신, 아우트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 비노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사산물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모퍼, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론, 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로젠; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프로리닌산과 같은 폴산 보충물; 아세갈라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지콘; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈리움 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK.RTM.; 라족사민; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지콘; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀(TAXOL® Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스팔라틴 및 카르보플라틴과 같은 플라티늄 유사체; 빈블라스틴; 플라티늄; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴(DMFO); 타르그레틴^TM(bexarotene), 판레틴(alitretinoin)과 같은 레티논산 유도체; ONTAK^TM(denileukin diftitox); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기의 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 이 정의는 또한 예를 들어 타목시펜, 라록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항-에스르토겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프로리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로젠과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 제어하거나 억제하도록 작용하는 항-호르몬제; 및 상기의 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

다양한 다른 치료제가 본 명세서에 기술된 항-KDR 항체와 함께 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 항염제와 함께 투여된다. 항염제 또는 항염 약물은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론을 포함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노미드, 항-TNF-약제, 사이클로포스파미드 및 마이코페노레이트를 포함하는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDS)을 포함한다.

본 명세서에 기술된 KDR-특이적 항체를 포함하는 조성물은 류마티스 관절염, 당뇨병 및 허혈성 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 건선 및 사구체 비대증 관련 단백뇨, 및 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 본 명세서에 기술된 바와 같은 질환으로 고통받는 개인에게 투여될 수 있다. 인간 질환의 치료용 생체내 사용을 위해, 본 명세서에 기술된 항체는 일반적으로 투여 이전에 약학 조성물 내로 포함될 수 있다. 약학 조성물은 하나 이상의 본 명세서에 기술된 항체를 본 명세서 다른 곳에서 기술된 바와 같은 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합하여 포함한다. 약학 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 하나 이상의 화합물은 특정 방식의 투여에 적절할 당업자에게 알려진 임의의 담체(들) 또는 부형제와 혼합된다. 약학적 담체는 액체, 반-액체 또는 고체일 수 있다. 비경구, 피내, 피하 또는 국소 적용을 위해 사용된 용액 또는 현탁액은 예를 들면, (물과 같은) 멸균 희석제, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제(예컨대, 벤질 알코올 및 메틸 파라벤); 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 소디움 바이설파이드) 및 킬레이트화제(예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)); 완충제(예컨대, 아세테이트, 시트레이트 및 포스페이트)를 포함한다. 정맥내로 투여되는 경우, 적절한 담체는 생리 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS), 및 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액, 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물을 포함한다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 KDR-특이적 항체를 포함하는 조성물은 시간 방출 제형 또는 코팅과 같은 체내로부터 빠른 제거에 대하여 항체를 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 이런 담체는 이식 및 마이크로피막화된 전달 시스템, 및 생분해성, 생체적합성 중합체 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 폴리오르쏘에스테르, 폴리락트산 및 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 것들과 같은 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 조절된 방출 제형을 포함한다.

KDR에 결합하는 항체를 사용하는 치료 방법이 본 명세서에 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 KDR의 부적절한 발현과 관련된 질환을 갖는 환자에게 투여되며, 이는 본 발명의 문맥에서 예를 들면, 존재하는 단백질의 양, 또는 돌연변이된 단백질의 존재, 또는 둘 모두의 변경(예컨대, 통계적으로 유의미한 증가 또는 감소)에 기인하는 비정상적 KDR 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 및 장애를 포함하는 것을 의미한다. 과잉은 분자 수준에서의 과발현, 작용 부위에서의 연장되거나 축적된 출현, 또는 정상적으로 검출가능한 것에 비해 증가된(예컨대, 통계학적으로 유의미한 방식으로) KDR의 활성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 원인 때문일 수 있다. KDR의 이러한 과잉은 정상 발현, 출현, 또는 KDR 또는 KDR 시그널링 이벤트의 활성화에 비례하여 측정될 수 있으며, 상기 측정은 본 명세서에 기술된 항체의 발달 및/또는 임상적 시험에서 중요한 역할을 할 수 있다.

특히, 본 발명의 항체는 KDR의 발현과 관련된 다양한 암의 치료를 위해 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 구현예는 본 명세서에 개시된 KDR-특이적 항체의 치료적 유효량을 암 환자에게 투여하여, 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 암의 치료를 위한 방법을 제공한다. 투여 후에, 통계학적으로 유의미한 방식(즉, 당업자에게 알려질 바와 같은 적절한 대조군에 비해)에서 암의 진행 및/또는 전이를 억제, 예방 또는 지연시키는 양이 효과적인 것으로 고려된다.

다른 구현예는 본 명세서에 개시된 KDR-특이적 항체의 치료학적 유효량(예컨대, 투여 후에, 통계학적으로 유의미한 방식, 즉 당업자에게 알려질 바와 같은 적절한 대조군에 비해, 암의 진행 및/또는 전이를 억제, 예방 또는 지연시키는 양)을 암 환자에게 투여하여, 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 암의 전이를 예방하기 위한 방법을 제공한다.

다른 구현예는 본 발명에 개시된 KDR-특이적 항체의 치료학적 유효량을 암 환자에게 투여하여, 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하는 다양한 종양 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암을 예방하기 위한 방법을 제공한다.

다른 구현예는 본 명세서에 개시된 KDR-특이적 항체의 치료학적 유효량을 하나 이상의 다음 질환으로 고통받는 환자에게 투여하여, 다양한 종양 질환, 예를 들어 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 및 재발성 교모세포종, 백혈병 및 고형 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암, 및 류마티스 관절염, 당뇨병 및 허혈성 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 건선 및 사구체 비대증 관련 단백뇨를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 다른 장애의 치료, 전이의 억제 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 다양한 염증성 질환의 치료를 위해 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 구현예는 류마티스 관절염, 당뇨병, 통풍, 크리오피린-관련 주기적 증후군(cryopyrin-associated periodic syndrome), 만성 폐쇄성 폐 질환 및 죽상동맥경화증 및 혈관염과 같은 다양한 심혈관계 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 VEGF 또는 KDR 발현 및/또는 활성과 관련된 염증성 장애 를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 염증성 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 관절의 무균성 염증, 망막염, 열, 및 피부 병변의 발병을 특징으로 하는 염증성 증후군의 치료를 위해 유용하다. 염증성 질환은 크론병, 대장염, 피부염, 건선, 게실염, 간염, 과민성 대장 증후군(IBS), 홍반성 루푸스, 신장염, 파킨슨병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 및 죽상동맥경화증 및 혈관염과 같은 다양한 심혈관계 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 염증 또는 염증성 질환을 치료하거나, 중증도를 감소시키거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 항-KDR 항체는 결합된 항원의 구조, 예컨대 입체배좌 에피토프를 결정하는데 사용될 수 있는데, 이 구조는 이후에 예컨대 화학적 모델링 및 SAR 방법을 통해 이 구조를 가지거나 모사하는 화합물을 개발하는데사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는, 부분적으로는, KDR을 발현하는 세포 또는 조직의 존재를 검출하기 위한 진단적 적용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 KDR을 발현하는 세포 또는 조직의 검출과 같이 시료에서 KDR을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 인시츄 혼성화(ISH), 전조직 표본 인시츄 혼성화(WISH), 형광 DNA 인시츄 혼성화(FISH), 유동세포계수법, 효소 면역-분석(EIA), 및 효소 연관 면역-분석(ELISA)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 알려진 검출 방식으로 적용될 수 있다

ISH는 (인시츄) 세포 또는 조직의 일부분 또는 절편, 또는 조직이 충분히 작은 경우 전체 조직(전조직 표본 ISH)에 특이적 DNA 또는 RNA를 위치시키기 위해 표지된 상보성 DNA 또는 RNA 가닥(즉, 일차 결합제)를 사용하는 혼성화의 유형이다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 이것이 일차 결합제로서 항체를 사용하여 조직 절편에 단백질을 위치시키는 면역조직화학과 다르다는 것을 이해할 것이다. DNA ISH는 게놈 DNA 상에 사용되어 염색체의 구조를 결정할 수 있다. 예를 들면, 형광 DNA ISH(FISH)는 의학 진단에서 사용되어 염색체 통합성을 평가할 수 있다. RNA ISH(혼성화 조직화학)를 사용하여 조직 절편 또는 전조직 표본 내의 mRNA 및 다른 전사체를 측정하고 위치시킬 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 항체는 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있는 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된다. 이와 관련하여, 항체 "컨쥬게이트"는 검출가능한 표지에 공유적으로 연결된 항-KDR 항체를 나타낸다. 본 발명에서, DNA 프로브, RNA 프로브, 모노클로날 항체, 이들의 항원-결합 단편, 이들의 항체 유도체, 예컨대 단일쇄-가변-단편 항체 또는 에피토프 태깅된 항체는 모두 검출가능한 표지에 공유적으로 연결될 수 있다. "직접적 검출"에서는, 오로지 하나의 검출가능한 항체, 즉 일차 검출가능한 항체만이 사용된다. 따라서, 직접적 검출은 이차 항체(이차성 항체)의 첨가를 필요로 하지 않으면서, 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된 항체, 그 자체가 검출될 수 있음을 의미한다.

"검출가능한 표지"는 시료 내에 표지의 존재 및/또는 농도를 나타내는 검출가능한(예컨대, 시각적, 전자적 등) 시그널을 생산할 수 있는 분자 또는 물질이다. 항체에 컨쥬게이트되는 경우, 검출가능한 표지는 특이적 항체가 지시되는 표적을 위치화시키고/시키거나 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라서, 시료 내의 표적의 존재 및/또는 농도는 검출가능한 표적에 의해 생산되는 시그널을 검출하여 검출될 수 있다. 검출가능한 표지는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있고, 다양한 특이적-항체에 컨쥬게이트된 몇몇 다양한 검출가능한 표지가 하나 이상의 표적을 검출하기 위해 조합되어 사용될 수 있다.

직접적으로 검출될 수 있는 검출가능한 표지의 예는 형광 염료 및 방사성 물질 및 금속 입자를 포함한다. 대조적으로, 간접적 검출은 일차 항체의 적용 후에, 하나 이상의 추가적 항체, 즉 이차 항체의 적용이 요구된다. 따라서, 검출은 일차 검출가능 항체에 이차 항체 또는 결합제의 결합을 검출하여 수행된다. 이차 결합제 또는 항체의 추가가 필요한 일차 검출가능 결합제 또는 항체의 예는 효소적 검출가능 결합제 및 헵탄 검출가능 결합제 또는 항체를 포함한다.

일부 구현예에서, 검출가능한 표지는 (예컨대, ISH, WISH, 또는 FISH 공정에서) 제1 결합제를 포함하는 핵산 중합체에 컨쥬게이트된다. 다른 구현예에서, 검출가능한 표지는 (예컨대, IHC 처리공정에서) 제1 결합제를 포함하는 항체에 컨쥬게이트된다.

본 발명의 방법에서 사용되는 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 검출가능한 표지의 예는 형광 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 생물발광 표지, 중합체, 중합체 입자, 헵탄 및 염료를 포함하다.

형광 표지의 예는 5-(및 6)-카르복시플루오레세인, 5- 또는 6-카르복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-(및 6)-카르복사미드 헥사노산, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 Cy2, Cy3, 및 Cy5와 같은 염료, AMCA, PerCP를 포함하는 선택적으로 치환된 쿠마린, R-피코에리트린(RPE) 및 알로피코에리트린(APC)를 포함하는 피코빌리단백질, 텍사스 레드, 프린스톤 레드, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이들의 유사체, 및 R-피코에리트린 또는 알로피코에리트린의 컨쥬게이트, 코팅된 CdSe 나노미세결정과 같은 반도체 물질에 기반한 입자와 같은 무기 형광 표지를 포함한다.

중합체 입자 표지의 예는 폴리스티렌의 마이므로 입자 또는 라텍스 입자, 형광 염료와 함께 포매될 수 있는 PMMA 또는 실리카 또는 염료, 효소 또는 기질을 함유하는 중합체 미셀 또는 캡슐을 포함한다. .

금속 입자 표지의 예는 은 염색에 의해 전환될 수 있는 금 입자 및 코팅된 금 입자를 포함한다. 헵탄의 예는 DNP, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 비오틴 및 딕옥시제닌을 포함한다. 효소 표지의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 알칼라인 포스페이트(ALP 또는 AP), β-갈락토시다제(GAL), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, β-N-아세틸글루코사미미다제, β-글루쿠로니다제, 인버타제, 크산틴 산화효소, 초파리 루시퍼라제 및 글루코스 옥시다제(GO)를 포함한다. 호스래디쉬퍼옥시다제에 대해 통상적으로 사용되는 기질의 예는 3,3'-디아미노벤지딘(DAB), 니켈 증강제를 갖는 디아미노벤지딘, 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC), 벤지딘 디하이드로클로라이드(BDHC), 한커-예이츠 시약(Hanker-Yates reagent; HYR), 인도판 블루(IB), 테트라메틸벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(CN), .알파.-나프톨피로닌(.alpha.-NP), o-디아니시딘(OD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 2-(p-아이오도페닐)-3-p-니트로페닐-5-페닐 테트라졸리움 클로라이드(INT), 테트라니트로 블루 테트라졸리움(TNBT), 5-브로모-4-클로로-3-인도실-베타-D-갈락토시드/페로-페리시아니드(BCIG/FF)를 포함한다.

알칼라인 포스페이트에대해 통상적으로 사용되는 기질의 예는 나프톨-AS-B 1-포스페이트/패스트 레드 TR(NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR(NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/-패스트 레드 TR(NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR(NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/뉴 푸스친(NABP/NF), 브로모클로로인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸리움(BCIP/NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b--d-갈락토피라노시드(BCIG)를 포함한다.

발광 표지의 예는 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 1,2-디옥세탄 및 피리도피리다진을 포함한다. 전기화학발광 표지의 예는 루테늄 유도체를 포함한다. 방사성 표지의 예는 아이오다이드, 코발트, 셀레늄, 트리튬, 탄소, 황 및 인의 방사성 동위원소를 포함한다.

검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 항체 또는 관심의 생물학적 마커, 예컨대, 항체, 핵산 프로브 또는 중합체에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 분자에 연결될 수 있다. 더욱이, 당업자는 검출가능한 표지가 또한 제2, 및/또는 제3, 및/또는 제4, 및/또는 제5 결합제 또는 항체 등에 컨쥬게이트될 수 있음을 이해할 것이다. 게다가, 숙련된 기술자는 관심의 생물학적 마커를 특성화하는데 사용된 각각의 추가적인 결합제 또는 항체가 시그널 증폭 단계로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 생물학적 마커는 예컨대, 광 현미경법, 형광 현미경법, 전자 현미경법을 사용하여 시각적으로 검출될 수 있으며, 여기서 검출가능한 물질은 예를 들면, 염료, 콜로이드성 금 입자, 발광 시약이다. 생물학적 마커에 결합된 시각적으로 검출가능한 물질은 또한 분광광도계를 사용하여 검출될 수 있다. 검출가능한 물질이 방사성 동위원소인 경우에는 자기방사법에 의해 시각화될 수 있거나, 섬광계수기를 사용해 비-시각화될 수 있다. 예컨대, 문헌[Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.)]을 참고한다.

본 발명은 나아가 시료 내에서 KDR 또는 KDR을 발현하는 세포 또는 조직을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 포함한다. 특정한 구현예에서, 키트는 완충제, 효소, 표지, 기질, 비드 또는 본 발명의 항체가 부착되는 다른 표면 등과 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.

도 1 : VEGF에 결합하는 KDR을 차단하는 가장 강력한 항체에 대한 스크리닝 결과의 그래프를 보여준다.
도 2: KDR의 인산화를 억제하는 항체에 대한 스크리닝. (A) ELISA 분석에서 KDR 인산화의 억제; (B) 웨스턴 블럿에서 KDR 인산화의 억제. Ab9530은 에이비캠(Abcam)(Cambridge, MA, USA)사의 대조군 KDR 중화 항체이다.
도 3: APX004는 인간 및 마우스 KDR에 선택적으로 결합하지만, 다른 인간 VEGFR 패밀리 단백질 또는 VEGF에는 결합하지 않는다.
도 4: APX004는 2.6 nM의 IC50으로 VEGF에의 KDR의 결합을 강력하게 차단한다.
도 5: APX004는 VEGF에 의해 유도된 KDR 인산화를 억제하였다.
도 6: APX004는 용량-의존적 방식으로 HUVEC 증식을 억제한다.
도 7A 및 7B: APX004는 생체내 연구 종점(41일째)까지 아바스틴(69% 억제)에 비해 더 강력한 항-종양 활성(77% 억제)을 나타냈다.
도 8: APX004는 H460 종양 모델에서 2.5 mg/kg의 용량(p<O.01)에서 유의미한 항-종양 활성을 증명하였다.
도 9: APX004는 3 mg/kg에서 A375 종양 성장을 유의미하게 억제한다. 용적 = (너비)² x 길이/2. 부호 및 막대, 평균 + 표준 편차.
도 10: APX004는 5 mg/kg 및 10 mg/kg에서 H29 종양 성장을 유의미하게 억제한다. 종양 용적은 다음 식에 따라서 계산하였다: 용적 = (너비)² x 길이/2. 부호 및 막대, 평균 + 표준 편차.
도 11은 실시예 1에서 확인된 항-KDR 항체의 VH 및 VL 영역의 정렬이다. 도 11의 aa는 VH 영역의 아미노산 1-100을 보여준다. 도 11의 ab는 VH의 잔여 아미노산을 보여준다. 도 11의 ba은 VL 영역의 아미노산 1-70의 정렬을 보여준다. 도 11의 bb는 VL 영역의 잔여 아미노산의 정렬을 보여준다. 하기 항목 "서열의 간단한 설명" 및 표 3에 요약된 바와 같이, 정렬에서 나타낸 VH 영역에 대한 서열번호는 서열번호 1 및 17-42로 제공되고; 정렬에서 나타낸 VL 영역에 대한 서열번호는 서열번호 2 및 43-68로 제공된다. CDR은 밑줄쳐 있다.
[서열의 간단한 설명]
서열번호 1은 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VL 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VHCDR1 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VHCDR2 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VHCDR3 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VLCDR1 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VLCDR2 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VLCDR3 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VH 영역의 인간화된 서열의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 클론 36 토끼 항-KDR 항체의 VL 영역의 인간화된 서열의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 인간화된 클론 36 항-KDR 항체(APX004)의 VHCDR1 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 인간화된 클론 36 항-KDR 항체(APX004)의 VHCDR2 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 인간 CK 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 14는 인간 CK의 아미노산 서열이다.
서열번호 15는 인간 IgG1 CH1 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 16은 인간 IgG1 CH1 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 17-42는 표 3에 요약된 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론의 VH의 아미노산 서열이다.
서열번호 43-68은 표 3에 요약된 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론의 VL의 아미노산 서열이다.
서열번호 69-95는 도 11에서 나타낸 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론에 대한 VHCDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 96-122는 도 11에서 나타낸 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론에 대한 VHCDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 123-149는 도 11에서 나타낸 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론에 대한 VHCDR3의 아미노산 서열이다.
서열번호 150-176은 도 11에서 나타낸 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론에 대한 VLCDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 177-203은 도 11에서 나타낸 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론에 대한 VLCDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 204-230은 도 11에서 나타낸 바와 같은 토끼 항-KDR 항체 클론에 대한 VLCDR3의 아미노산 서열이다.

실시예

실시예 1

항-KDR 항체의 생산 및 인간화

항- KDR 항체 생성

뉴질랜드 흰색 토끼를 재조합 KDR-토끼 Fc 융합 단백질로 면역화하였다. 하이브리도마 생성을 위해 인간 KDR에 대한 특이적 결합의 가장 높은 혈청 역가를 갖는 토끼를 선택하였다. 총 230개 하이브리도마가 가용성 KDR-Fc에 결합에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 이들 230개 중, 100개의 클론이 KDR-형질감염체 293 세포의 사용을 통해 세포 표면 KDR에의 결합에 대해 양성인 것을 또한 확인하였다. 추가적인 기능 특성화를 위해 이중 양성(double positive) 하이브리도마를 선별하였다.

하이브리도마의 기능적 스크리닝

VEGF 에의 KDR 의 결합을 차단하는 기능적인 항체의 선별: 가용성 KDR과 세포 표면 KDR 둘 모두에 결합하는 이중 양성 항-KDR 항체(클론 100개)를 VEGF에의 KDR 결합을 억제하는 이들의 능력에 대해, 평가하였다. 항-KDR 클론 100개 중, 41개가 억제를 나타내는 것으로 확인되었고, 추가적인 특성화를 위해 재조합적으로 발현시키고, 정제하였다. VEGF에의 KDR 결합을 억제하였던 상위 10개의 항-KDR 항체의 효력을 하기 표 2에 요약하고, 도 1에서 나타낸다.

표 2: 항-KDR 항체의 IC50

KDR 인산화를 억제하는 항체에 대한 스크리닝: 리간드 수용체 결합 분석에 기반하여 선별한 상위 10개의 항-KDR 항체를 HUVEC 세포를 사용한 세포-기반 KDR 인산화 분석에서 추가 시험하였다. 배양된 HUVEC 세포를 20 ng/ml(최적 자극 용량)의 인간 VEGF(R&D System)를 첨가하기 전에 37℃에서 1시간 동안 5 μg/ml(상대적으로 포화된 용량)의 항-KDR 항체로 처리하였다. 수득한 세포 용해물을 단백질 농도에 의해 정량화하였다. KDR의 인산화는 포획 항체로서 토끼 항--KDR YK-5(비-기능적인 항-KDR 클론)를 사용하고, 검출 항체로서 마우스 항-포스포티로신, P-Tyr-100(Cell Signaling Technology)을 사용하는 인광체 ELISA 분석을 이용해 측정하였다. KDR 인산화를 억제하는 상위 6개 클론을 도 2에 나타낸다. 6개의 클론 중에, 클론 36은 VEGF-자극된 KDR 인산화의 가장 강한 억제를 나타냈다(도 2A). 클론 36의 인광체 ELISA 결과는 항-인광체-KDR Y996 폴리클론 항체(Epitomics, Burlingame, CA)를 사용하는 웨스턴 블럿(도 2B)에 의해 추가 확인하였다.

교차 종 항- KDR 항체에 대한 스크리닝: KDR이 오로지 숙주의 내피 세포 상에서 발현되는 생체내 동물 연구에서 KDR 차단 요법의 효능을 평가하기 위해, 상위 6개 항-KDR 항체를 마우스 KDR과의 교차 반응성에 대해 스크리닝하였다. 항체 #27, #36, #43, #68, #83은 인간 및 마우스 KDR 둘 모두와 교차-반응성인 것을 밝혀냈다(데이터 도시하지 않음). 하기 표 3은 다음과 같은 스크리닝에서 확인된 3개의 토끼 항체를 요약한다: 1) 클론 4, 6, 14, 27, 30, 36, 68, 69, 81 , 83, 91 및 95를 포함하는, KDR 인산화를 차단하고, 마우스 KDR과도 교차 반응하는 항-인간 KDR 항체; 2) 클론 5, 13, 15, 17, 23, 24, 25, 43, 71 , 77, 92 및 93을 포함하는, KDR 인산화를 차단하지만 마우스 KDR과 교차-반응하지 않는 항-인간 KDR 항체; 3) 클론 40, 42 및 50을 포함하는, 마우스 KDR과 교차-반응하지만 KDR 인산화를 차단하지 않는 항-인간 KDR 항체.

표 3: 항-KDR 토끼 항체 요약

도 11은 항-KDR 항체의 VH 및 VL 영역의 정렬을 보여준다. CDR은 밑줄쳐 있다. VHCDR1 아미노산 서열은 서열번호 69-95로 제공되고; VHCDR2 아미노산 서열은 서열번호 96-122로 제공되며; VHCDR3 아미노산 서열은 서열번호 123-149로 제공되고; VLCDR1 아미노산 서열은 서열번호 150-176로 제공되며; VLCDR2 아미노산 서열은 서열번호 177-203으로 제공되고; VLCDR3 아미노산 서열은 서열번호 204-230로 제공되어 있다.

인간 KDR의 항-인산화 및 마우스 KDR에 대한 교차 반응성의 효력을 기반으로 하여, 클론 36을 제1 후보자 항-KDR 항체로서 선택하였다.

재조합 항- KDR 항체 클론 36

클론 36으로부터의 토끼 IgG의 L 쇄의 DNA 단편 및 H 쇄의 가변 영역(VH)을 PCR로 증폭하였다. L 쇄 단편을 pTT5 벡터 내 Hind III 및 Not I 부위에 클로닝하고, VH 단편을 H 쇄 내장(built-in) pTT5 벡터 내 불변 영역 내 Hind III 및 Kpn I 부위에 클로닝하였다. 각각의 하이브리도마에 대해, L 또는 H 쇄의 DNA 클론 3개를 시퀀싱하고, 보존적 서열을 갖는 플라스미드를 동정하여, 재조합 발현을 위해 사용하였다. 재조합 항체를 발현하기 위해, L 및 H 쇄 플라스미드를 293-6E 세포(National Research Council Canada) 내로 공동-형질감염시켰다. 상청액을 5일 후에 수득하고, ELISA 분석을 사용해 정량하여 기능적 분석 전에 IgG 농도를 측정하였다.

인간화 디자인

돌연변이 계통 유도된(MLG) 인간화 기술을 사용하여 선도(lead) 클론 36을 인간화하였다. 첫째로, 클론 36의 중쇄(VH) 및 경쇄(VK) 가변 영역 서열을 인간 생식계열 VH 및 VK 데이터베이스에 대하여 블라스팅(blast)하였다. 가장 밀접한 인간 생식계열 서열을 인간화를 위한 주형으로서 확인하였다. 둘째로, CDR 접촉 또는 쇄간 접촉에 잠재적으로 관여되는 프레임워크(framework) 내에 토끼 잔기를 인간 및 토끼 항체로부터의 지식에 근거하여 확인하였다. 항체의 구조적 활성에 중요하지 않은 것으로 고려되는 잔기를 이전에 인간화된 토끼 항체로부터의 지식을 기반으로 하여 확인하였다.

인간화된 36(APX004)의 경쇄 및 중쇄 프레임워크는 인간 생식계열 서열과 93% 동일하였다. 프레임워크의 인간화에 추가하여, MLG 방법을 사용하여 인간 생식계열 서열과 47% 내지 58% 상동성의 중쇄 CDR1 및 CDR2 둘 모두를 추가적으로 인간화하였다. KDR에 대한 APX004의 결합 효력은 자신의 모체 토끼 모노클론 항체 36과 유사한 것으로 밝혀졌다(도 4 참고). 클론 36에 대한 인간화된 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 9 및 10에 개시되어 있다. 인간화된 클론 36의 VHCDR1 및 VHCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 11 및 12에 개시되어 있다. 인간화된 클론 36 항-KDR 항체(APX004)의 VHCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 5에 개시된 바와 같은 모체 VHCDR3과 동일하다. 인간화된 클론 36 항-KDR 항체(APX004)의 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 6-8에 개시된 바와 같은 토끼 모체 VLCDR 서열과 동일하다.

인간화된 클론(들)의 발현

클론 R-36의 인간화된 VK 및 VH를 인코딩하는 DNA를 MCLab(South San Francisco, CA, USA)에 의해 합성하였다. DNA 단편은 5' 말단에 시그널 펩티드와 Kozak 서열을 포함한다. 클론 36의 인간화된 버전을 발현하기 위해, 인간화된 VK 단편을 인간 CK 내장된 pTT5 벡터 내 Hind III 및 Nhe I 부위에 클로닝하였다. 인간화된 VH를 인간 IgG1 CH1 내장된 pTT5 벡터 내 Hind III 및 BsiW I 부위로 클로닝하였다. 인간 CK(각각 서열번호 13 및 14) 및 IgG1 CH1(각각 서열번호 15 및 16)의 DNA 및 아미노산 서열을 불변 영역을 위해 선택하였다. 클론 36의 인간화된 버전을 293-6E 세포 내에서 발현시키고, 단백질 A 컬럼으로 정제하고, PBS 완충액에 대한 투석 후, UV280로 정량화하였다.

실시예 2

APX004의 결합 선택성

APX004는 KDR(VEGFR2)에 대한 인간화된 IgG1 항체이다. APX004는 고 친화성(Kd = 5.3x10^-11M) 및 특이성으로 인간 KDR에 결합한다. APX004는 원숭이 및 마우스 KDR과 교차 반응한다. APX004는 VEGF에의 KDR 결합을 차단하고 KDR 인산화를 억제하여, KDR 하류 시그널링과 내피 세포 증식 및 혈관신생과 같은 생물학적 기능의 억제를 유도한다.

APX004의 결합 선택성을 VEGFR 패밀리 단백질에 대한 직접적 ELISA에 의해 평가하였다. 총 1 μg/ml의 인간 KDR, 마우스 KDR, 인간 VEGFR1, 인간 VEGFR3, 인간 OX40L 및 인간 VEGF의 토끼 Fc-융합 단백질을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 1 μg/ml의 APX004와 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 APX004는 염소 항-인간 HRP-컨쥬게이트된 IgG을 사용해 검출하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, APX004는 인간 및 마우스 KDR에는 선택적으로 결합하지만, 다른 인간 VEGFR 패밀리 단백질 또는 VEGF에는 선택적으로 결합하지 않는다. 따라서, APX004를 생체내 효능 및 PK 연구를 위한 마우스 종양 모델에서 시험할 수 있다. 원숭이 KDR이 세포외 도메인에서 인간 KDR과 99.9% 서열 동일성을 공유(비-리간드 결합 도메인에서 단지 보존적 아미노산만 상이함)하기 때문에, APX004는 원숭이 KDR을 인식할 수 있어야 한다.

실시예 3

APX004 는 VEGF 에 대한 KDR 의 결합을 차단한다

ELISA-기반 KDR-VEGF 결합 분석을 개발하여, VEGF에 대한 KDR의 결합 차단에서 APX004의 효력을 평가하는데 사용하였다. 총 2 μg/ml의 VEGF를 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 모체 토끼 항체 R-36 또는 IgG1 이소형 대조군 항체인 APX004를 VEGF-A 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기기 전에 5 μg/ml 재조합 인간 KDR로 사전-인큐베이션시켰다. 고정된 VEGF에 결합된 KDR을 마우스 항-KDR 모노클론 항체로 검출하고, 이어서 알칼리 포스페이트로 접합된 염소 항-마우스 IgG(Fisher Scientific/Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 첨가하였다. ELISA 플레이트를 p-니트로페닐 포스페이트 기질로 발색시키고, 흡광도 405 nm에서 기록하였다. 모든 실험을 3회 반복하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, APX004는 2.6 nM의 IC50으로 VEGF에의 KDR의 결합을 강력하게 차단한다. R-36의 인간화는 VEGF에의 KDR의 결합을 억제하기 위한 KDR의 효력에 영향을 미치지 않았다.

실시예 3

APX004 에 의한 KDR 인산화의 억제

VEGF-유도된 KDR 인산화에 대한 APX004의 억제 효과를 평가하기 위해, 5 nM의 인간 VEGF(R&D System)를 첨가하기 전에, 다양한 농도의 항체를 1시간 동안 배양된 HUVEC 세포와 함께 사전-인큐베이션시켰다. KDR 인산화를 웨스턴 블럿으로 검출하였다. 동량의 단백질을 함유하는 처리된 HUVEC로부터의 세포 용해물을 4-20% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고(resolve), 단백질을 PVDF 막(Millipore, Billerica, MA)으로 이동시켰다. 블럿은 항-인광체-KDR 항체, 총 KDR 항체 및 항-알파-튜블린 항체(Epitomics)로 순차적으로 탐침되었다. 다른 일차 항체로 재-탐침하기 전에 일차 항체를 글리신 완충액 중에 세척하여 벗겨내었다. 적절한 호스래디쉬 퍼옥시다제 이차 항체(Scientific/Pierce Biotechnology)로 블롯팅한 막을인큐베이션 한 후, 특이적 시그널을 ECL 시약(GE Healthcare Bio-Sciences)으로 발색시키고, 이어서 X-선 필름 상에서 가시화하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, APX004는 VEGF에 의해 유도된 KDR의 인산화를 억제하였다.

실시예 4

APX004 에 의한 HUVEC 증식의 억제

VEGF-유도된 HUVEC 증식에 대한 APX004의 억제 효과를 측정하기 위해, 다양한 농도의 APX004를 96-웰 플레이트에 4,000개 세포/웰인 HUVEC 배양물에 첨가하고, 15 ng/ml(최종 농도)의 VEGF를 첨가하기 전에, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 10% AlamarBlue®를 각각의 웰에 첨가하기 전에, HUVEC 세포를 72시간 동안 37℃에서 추가로 인큐베이션시켰다. 24시간 인큐베이션 후, HUVEC 세포 생존율을 530 nm에서 여기 및 590 nm에서 방출을 갖는 Wallac Victor V 1420 Multilabel HTS Counter(PerkinElmer)를 사용하여 형광 강도를 판독함으로써 측정하였다. 모든 분석은 3회 반복하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, APX004는 용량-의존적 방식으로 HUVEC 증식을 억제한다.

실시예 5

인간 폐암 H460 모델에서 종양 성장의 억제

라무시루맙에 비해 APX004의 이점 중 하나는 APX004가 마우스 KDR과 교차 반응한다는 점이다. 따라서, APX004를 마우스 내 인간 종양 이종이식 모델에서 직접적으로 평가할 수 있다. APX004의 생체내 항-혈관신생 및 항종양 효능은 다중 종양 이종이식 모델에서 나타냈다.

인간 H460 이종이식 모델에서 APX004의 생체내 효능을 평가하기 위해, 인간 NSCLC 세포주 H460을 암컷 BALB/c 누드 마우스의 등 측면 내로 피하 접종함으로써 인간 NSCLC 종양 H460(KDR 음성) 이종이식편을 확립하였다. 종양 크기가 22일 째에 200 mm³의 평균 용적에 다다랐을 때, 종양 함유 마우스를 지시된 바와 같이 3개의 처리 군으로 무작위화하였다(n=8-10). 그후, 무작위화된 군에 5 mg/kg/용량의 APX004 또는 아비스틴을 주 3회 총 8회 용량으로 ip(복강내) 주사하였다. 종양 용적 및 체중은 다음 식에 따라서 계산하였다: 용적 = (너비)² x 길이/2, 2 내지 3일 마다(도 7A). 항-CD34 mAb(x400)를 이용한 면역조직화학 염색의 현미경사진촬영을 수행하여, 미세맥관구조 밀도를 도시하였다(갈색)(도 7B).

APX004는 연구 종점(41일째)에서 아비스틴(69%)에 비해 더욱 강력한 항-종양 활성(77% 억제)을 나타냈다. APX004 처리는 종양 미세맥관구조의 감소를 초래하였다(CD34+ EC 염색). APX004는 유의미한 독성을 보이지 않았다(즉, 대조군과 비교해 체중에 어떠한 변화도 없었다).

실시예 6

인간 폐암 H460 모델에서 용량 반응 억제

인간 H460 이종이식 모델에서 APX004의 효과적인 용량을 결정하기 위해, 인간 NSCLC 세포주 H460을 암컷 BALB/c 누드 마우스의 등 측면 내로 피하 접종함으로써 인간 NSCLC 종양 H460 이종이식편을 확립하였다. 종양이 160 mm³의 평균 용적에 다다랐을 때, 종양 함유 마우스를 지시된 바와 같이 3개의 처리 군으로 무작위화하였다(n=8-10). APX004를 주 3회 총 8회 용량 동안 2.5 mg/kg 또는 0.6 mg/kg로 복강내 주사하였다. 종양 크기 및 체중을 2 내지 3일 마다 기록하였다. 종양 용적은 다음 식에 따라 계한하였다: 용적 = (너비)² x 길이/2. 도 8에서 나타낸 바와 같이, APX004는 H460 종양 모델에서 2.5 mg/kg의 용량으로 유의미한 항-종양 활성을 증명하였다(p<0.01). APX004는 유의미한 독성을 보이지 않았다(대조군과 비교해 체중에 어떠한 변화도 없었다).

실시예 7

인간 흑색종 A375 모델에서 종양 성장의 억제

인간 A375 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 APX004의 효과를 결정하기 위해, 인간 A375 세포를 암컷 ALB/c 누드 마우스의 등 측면 내로 피하 접종함으로써 인간 흑색종 종양 이종이식편을 확립하였다. 종양이 100 mm³의 평균 용적에 다다랐을 때, 종양 함유 마우스를 지시된 바와 같이 6개의 처리 군으로 무작위화하였다(n=8-10). 다양한 용량의 APX004 또는 3 mg/kg의 아비스틴을 3주 동안 주 2회 총 6회 용량으로 복강내 투여하였다. 종양 크기 및 체중을 3일 마다 기록하였다. 종양의 수직 치수(Perpendicular dimension)를 베르니어 스케일 캘리퍼스(Vernier scale caliper)를 사용하여 측정하였다. 종양 용적은 다음 식에 따라 계산하였다: 용적 = (너비)²x 길이/2. 부호와 막대, 평균 + 표준 편차. 도 9에서 나타낸 바와 같이, APX004는 3 mg/kg에서 A375 종양 성장을 유의미하게 억제한다. 이 용량에서, APX004는 아비스틴과 유사한 항-종양 활성을 나타낸다. 상기 데이터는 A375 모델이 VEGF-KDR 경로에 덜 의존적임을 제안하였다. 그러므로, 어떠한 명백한 용량-의존적인 항-종양 효과도 관찰되지 않았다.

실시예 8

인간 대장암 HT29 모델에서 종양 성장의 억제

인간 결장직장암 HT29 이종이식 모델에서 APX004의 용량 및 효능 관계를 결정하기 위해, 인간 HT29 세포를 암컷 BALB/c 누드 마우스의 등 측면 내로 피하 접종함으로써 인간 결장직장암 이종이식편을 확립하였다. 종양이 100 mm³의 평균 용적에 다다랐을 때, 종양 함유 마우스를 지시된 바와 같이 4개 처리군으로 무작위화하였다. 다양한 용량의 APX004를 3주 동안 주 3회 복강내 투여하였다. 종양 크기를 3주 마다 측정하였다. 종양의 수직 치수를 베르니어 스케일 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 용적은 다음 식에 따라 계산하였다: 용적 = (너비)²x 길이/2. 부호 및 막대, 평균 + 표준편차. 도 10에 나타낸 바와 같이, APX004는 5 mg/kg 및 10 mg/kg에서 HT29 종양 성장을 유의미하게 억제한다. APX004의 용량-의존적인 항-종양 활성을 이 종양 모델에서 관찰하였다.

요약하면, 상기 실시예에서 나타낸 바와 같이, APX004는 고 KDR 결합 친화성을 갖는 인간화된 IgG1 항체로서 혈관신생을 강력하게 억제한다. 인간화 과정 동안, 프레임워크와 CDR 둘 모두 인간화되어 잠재적 면역원성이 최대로 감소되었다.

APX004는 그의 리간드에의 KDR의 결합을 차단하고, VEGF-유도된 KDR 인산화 및 내피 세포 증식을 억제하는 중화항체이다. APX004가 마우스 KDR과 교차 반응하기 때문에, 대용 항체를 생성할 필요 없이, 인간 종양 이종이식편의 생체내 마우스 모델에서 APX004를 직접적으로 평가하는 것이 가능했다. APX004는 아비스틴과 유사한 항-종양 효과로 다중 인간 종양 이종이식편에서 종양-유도된 미세맥관구조 형성 및 종양 성장을 억제하였다. APX004는 생체내 종양 모델에서 라무시루맙의 대용 DC-101에 비해 더욱 강력한 것으로 보이는데, 상기 종양 모델에서는 종양 성장을 억제하기 위해 훨씬 높은 용량의 DC-101(>40 mg)이 요구되었다. TKI와 대조적으로, APX004는 (다른 VEGF 수용체는 억제하지 않는) 더욱 특이적인 KDR 표적제이다. 따라서, APX004는 더 적은 표적 이탈 부작용을 가질 것이다.

VEGF 패밀리 리간드 중 오로지 하나(단지 VEGF-A)에만 결합하는 아바스틴과 대조적으로, APX004는 모든 공지의 VEGF가 KDR에 결합하는 것을 잠재적으로 차단한다. 이는 단지 VEGF-A를 차단하는 것 보다 종양 혈관신생에 대해 더욱 강한 억제 효과를 가질 수 있으며, 또한 리간드 중복에 의해 야기된 역 아바스틴 내성에 기여할 수 있다. 따라서, APX004는 종양 환경에서 풍부한 VEGF 패밀리 리간드를 생산하는 종양을 갖는 환자의 치료를 개선하기 위한 잠재력을 가지며, 항-VEGF 요법에 대한 내성을 극복할 수 있다.

더불어, 상기 연구에서 사용된 종양 모델의 3분의 2(A375 및 HT-27)는 KDR을 발현하고, 성장을 위한 자가분비 루프로서 VEGF-KDR 경로를 사용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 항체에 의해 매개된 항-종양 효과는 적어도 2개의 작용 방식인 (i) 항-혈관 신생 및 (ii) 종양 성장의 직접적인 억제를 포함할 수 있다(46, 47).

참조 문헌:

상기 기술된 다양한 구현예는 추가적인 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 명세서 내에 언급되고/언급되거나 출원 데이터 시트 내에 열거된 미국 특허, 미국 특허출원 공개 공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비 특허 간행물은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 다른 추가적인 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 적용하는 것이 필요한 경우, 구현예의 관점은 변형될 수 있다.

이들 및 다양한 변화가 상술된 설명을 고려하여 구현예에 대해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기의 특허청구범위에서 사용된 용어는 명세서 및 특허청구범위 내에 개시된 특정한 구현예로 특허청구범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안되고, 그러한 특허청구범위에 부여된 것과 등가의 모든 범주와 더불어 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

<110> Apexigen, Inc. <120> ANTI-KDR ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> IPA140339-US <150> US 61/554,758 <151> 2011-11-02 <150> US 61/609,581 <151> 2012-03-12 <160> 230 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn 35 40 45 Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Ile Phe Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu 85 90 95 Lys Phe Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Arg Val Leu Trp Ala Gly Ser Val Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile Trp 115 120 125 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln 130 135 140 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr 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<213> Oryctolagus cuniculus <400> 27 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Met Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ala Leu Asn 35 40 45 Asp Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Met Ile Ala Ser Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu 85 90 95 Lys Phe Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Arg Val Leu Trp Pro Gly Tyr Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile Trp 115 120 125 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln 130 135 140 <210> 28 <211> 140 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 28 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn 35 40 45 Asn Tyr Ala Met Ser Trp 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<213> Oryctolagus cuniculus <400> 51 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Val Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro 20 25 30 Val Ser Gly Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Ser 85 90 95 Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser 100 105 110 Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Ser Thr Asp Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Glu Val Val Val Lys 130 <210> 52 <211> 132 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 52 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile His Ser Trp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 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cuniculus <400> 77 Ser Asn Ala Met Ser 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 78 Lys Asn Ala Ile Ser 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 79 Asp Phe Ala Met Ser 1 5 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 80 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 81 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 82 Ser Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 83 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 84 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 85 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 86 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 87 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 88 Asn Tyr Ala 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Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 106 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 106 Met Ile Ala Ser Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 107 Leu Ile Arg Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 108 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 108 Ile Ile Gly Ser Ser Gly Ser Ile Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 109 Phe Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 110 Ile Ile Ser Asn Ser Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Gly Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 111 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 111 Leu Ile Arg Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 112 Leu Ile Arg Ser Ser Gly Ala Ala Tyr Asp Ala Pro Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 113 Leu Ile Arg Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 114 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 114 Ile Ile Arg Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 115 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 115 Leu Ile Arg Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 116 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 117 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 117 Leu Ile Arg Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 118 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 118 Leu Ile Arg Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 119 Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 120 Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 121 Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 122 Ile Ile Arg Pro Gly Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 123 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 123 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 124 Thr Glu Asn Ser Tyr Phe Leu Tyr Phe Thr Ile 1 5 10 <210> 125 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 125 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 126 Asp Asp Ser Ala Arg Asn Trp Phe Tyr Phe Tyr Leu 1 5 10 <210> 127 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 127 Val Leu Trp Ala Gly Tyr Val Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 128 Ser Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Thr Leu 1 5 10 <210> 129 <211> 4 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 129 Pro Phe Asn Ile 1 <210> 130 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 130 Gly Asp Asp Asp Val Ser Asp Tyr Phe Tyr Tyr Phe Pro Ile 1 5 10 <210> 131 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 131 Gly Asp Asp Asp Val Ser Asp Tyr Phe Tyr Tyr Phe Pro Ile 1 5 10 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 132 Gly Thr Thr Ile Trp Ser Asp Tyr Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 133 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 133 Val Leu Trp Pro Gly Tyr Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 134 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 134 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 135 Val Leu Trp Ala Gly Ser Val Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 136 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 136 Asn Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Phe Leu His Tyr Phe Asn Ile 1 5 10 <210> 137 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 137 Ala Leu Trp Ala Gly Tyr Ile Ala Tyr Val Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 138 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 138 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 139 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 139 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 140 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 140 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 141 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 141 Val Leu Trp Pro Gly Ser Val Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 142 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 142 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 143 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 143 Val Leu Trp Ala Gly Ser Val Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 144 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 144 Val Leu Trp Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 145 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 145 Val Leu Trp Pro Gly Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 146 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 146 Gly Asp Asp Asp Val Ser Asp Tyr Phe Tyr Tyr Phe Pro Ile 1 5 10 <210> 147 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 147 Gly Asp Asp Asp Val Ser Asp Tyr Phe Tyr Tyr Phe Pro Ile 1 5 10 <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 148 Gly Asp Asp Asp Val Ser Asp Tyr Phe Tyr Tyr Phe Pro Ile 1 5 10 <210> 149 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 149 Val Leu Trp Ala Gly Asp Val Ala Tyr Ala Tyr His Asn Ile 1 5 10 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 150 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 151 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 152 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 153 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 153 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 154 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 154 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 155 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 156 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 156 Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Gly Asp Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 157 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 157 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 158 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 159 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 159 Gln Ala Ser Gln Ser Ile His Ser Trp Val Ser 1 5 10 <210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 160 Gln Thr Ser Glu Asp Ile Ala Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 161 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 162 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 162 Gln Ala Ser Glu Glu Leu Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 163 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 163 Gln Ala Ser Gln His Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 164 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 165 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 166 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 166 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 167 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 167 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Asp Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 168 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 168 Gln Ala Ser Glu Asp Leu Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 169 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 169 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 170 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 170 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 171 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 171 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 172 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 172 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Gly Gly Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 173 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 173 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 174 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 175 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 175 Gln Ala Ser Glu Glu Ile Ala Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 176 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 176 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 177 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 178 Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ser 1 5 <210> 179 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 179 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 180 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 181 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 182 Ser Ala Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 183 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 183 Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 184 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 184 Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 185 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 185 Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 186 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 186 Tyr Ala Ala Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 187 Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 188 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 188 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 189 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 190 Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 191 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 191 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 192 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 192 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 193 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 193 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 194 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 194 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 195 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 195 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 196 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 197 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 197 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 198 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 199 Ser Ala Ser Ser Leu Thr Ser 1 5 <210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 200 Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 201 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 201 Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 202 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 202 Ser Ala Ser Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 203 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 203 Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 204 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 204 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Thr Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 205 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 205 Gln Ser Tyr Phe Tyr Ser Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro 1 5 10 <210> 206 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 206 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 207 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 207 Gln Thr Asn Tyr Tyr Ser Ile Asn Gly Gly Glu Val Thr 1 5 10 <210> 208 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 208 Gln Asp Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 209 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 209 Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Ala Asp Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 210 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 210 Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser Ala Asp Cys Val Ala 1 5 10 <210> 211 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 211 Gln Ser Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Ser Thr Asp Ala Ala 1 5 10 <210> 212 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 212 Gln Ser Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Ser Thr Asp Ala Ala 1 5 10 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 213 Gln Gln Asp Phe Gly Gly Ser Asp Val Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 214 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 214 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 215 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 215 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Thr Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 216 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 216 Gln Tyr Thr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 217 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 217 Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Ser Asp Ser Thr Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 218 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 218 Gln Asp Ser Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 219 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 219 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 220 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 220 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 221 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 221 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 222 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 222 Gln Asp Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 223 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 223 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 224 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 224 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Asn Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 225 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 225 Gln Tyr Pro Tyr Tyr Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 226 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 226 Gln Tyr Ser Tyr Tyr Gly Phe Asn Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 227 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 227 Gln Ser Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Ser Thr Asp Ala Ala 1 5 10 <210> 228 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 228 Gln Ser Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Ser Thr Asp Ala Ala 1 5 10 <210> 229 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 229 Gln Tyr Thr Tyr Tyr Gly Phe Asn Tyr Val Gly Pro 1 5 10 <210> 230 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 230 Gln Ser Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Ser Thr Asp Ala Ala 1 5 10

Claims

(i) 서열번호 3 또는 11에 기재된 VHCDR1 영역, 서열번호 4 또는 12에 기재된 VHCDR2 영역, 및 서열번호 5에 기재된 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열번호 6에 기재된 VLCDR1 영역, 서열번호 7에 기재된 VLCDR2 영역, 및 서열번호 8에 기재된 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, KDR에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
중쇄 가변 영역이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
경쇄 가변 영역이 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
하기 (a) 내지 (z)로부터 선택된, 항체의 (i) VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (ii) VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 각각을 포함하고, KDR에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(a) 서열번호 69, 96, 및 123, 및 서열번호 150, 177, 및 204;
(b) 서열번호 70, 97, 및 124, 및 서열번호 151, 178, 및 205;
(c) 서열번호 71, 98, 및 125, 및 서열번호 152, 179, 및 206;
(d) 서열번호 72, 99, 및 126, 및 서열번호 153, 180, 및 207;
(e) 서열번호 73, 100, 및 127, 및 서열번호 154, 181, 및 208;
(f) 서열번호 74, 101, 및 128, 및 서열번호 155, 182, 및 209;
(g) 서열번호 75, 102, 및 129, 및 서열번호 156, 183, 및 210;
(h) 서열번호 76, 103, 및 130, 및 서열번호 157, 184, 및 211;
(i) 서열번호 77, 104, 및 131, 및 서열번호 158, 185, 및 212;
(j) 서열번호 78, 105, 및 132, 및 서열번호 159, 186, 및 213;
(k) 서열번호 79, 106, 및 133, 및 서열번호 160, 187, 및 214;
(l) 서열번호 80, 107, 및 134, 및 서열번호 161, 188, 및 215;
(m) 서열번호 82, 109, 및 136, 및 서열번호 163, 190, 및 217;
(n) 서열번호 83, 110, 및 137, 및 서열번호 164, 191, 및 218;
(o) 서열번호 84, 111, 및 138, 및 서열번호 165, 192, 및 219;
(p) 서열번호 85, 112, 및 139, 및 서열번호 166, 193, 및 220;
(q) 서열번호 86, 113, 및 140, 및 서열번호 167, 194, 및 221;
(r) 서열번호 87, 114, 및 141, 및 서열번호 168, 195, 및 222;
(s) 서열번호 88, 115, 및 142, 및 서열번호 169, 196, 및 223;
(t) 서열번호 89, 116, 및 143, 및 서열번호 170, 197, 및 224;
(u) 서열번호 90, 117, 및 144, 및 서열번호 171, 198, 및 225;
(v) 서열번호 91, 118, 및 145, 및 서열번호 172, 199, 및 226;
(w) 서열번호 92, 119, 및 146, 및 서열번호 173, 200, 및 227;
(x) 서열번호 93, 120, 및 147, 및 서열번호 174, 201, 및 228;
(y) 서열번호 94, 121, 및 148, 및 서열번호 175, 202, 및 229; 및
(z) 서열번호 95, 122, 및 149, 및 서열번호 176, 203, 및 230.
제4항에 있어서,
중쇄 가변 영역이 서열번호 17 내지 42에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제4항에 있어서,
경쇄 가변 영역이 서열번호 43 내지 68에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, KDR에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
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제1항에 있어서,
(a) 항체가 인간화되거나,
(b) VH 영역이 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역이 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(c) 항체가 단일쇄 항체, ScFv, 힌지 영역 결여 일가 항체, 및 미니바디로 구성된 군으로부터 선택되거나,
(d) 항체가 Fab 또는 Fab' 단편이거나,
(e) 항체가 F(ab')₂ 단편이거나,
(f) 항체가 전체 항체이거나, 또는
(g) 항체가 인간 IgG 불변 도메인을 포함하고, 상기 IgG 불변 도메인이 IgG1 CH1 도메인, IgG1 Fc 영역 또는 둘 다를 포함하는 것인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 5.3 x 10^-11 M 이하의 KD로 KDR에 결합하거나, 또는
(b) 종양 성장을 직접적으로 억제하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이
a. KDR에의 VEGF 결합 차단;
b. KDR 시그널링 억제;
c. 내피 세포 증식 억제;
d. 종양 혈관신생 억제;
e. 종양 세포 성장 억제; 또는
f. a 내지 e의 임의의 하나 이상의 조합을 수행하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 쥐 KDR 또는 비-인간 영장류 KDR과 교차반응하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제9항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제13항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제14항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
생리학적으로 허용가능한 담체 및 치료학적 유효량의 제1항 또는 제9항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는,
(a) 암의 치료,
(b) 염증성 질환을 앓고 있는 환자의 치료, 또는
(c) 혈관신생-매개된 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물.
제16항에 있어서, 비정상 VEGF 또는 KDR 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 것인, 조성물.
제17항에 있어서, 상기 암은 혈관육종, 신장 세포 암종, 위장암, 전이성 위 선암 또는 위-식도 접합부 선암, 유방암, 방광암, 간세포암종, 결장직장암, 전립선암, 비-소 세포 폐암, 신경아세포종, 난소암, 흑색종, 재발성 교모세포종, 및 백혈병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제16항에 있어서, 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염 또는 건선인 것인, 조성물.
제16항에 있어서, 상기 혈관신생-매개된 질환은 노화-관련 황반 변성인 것인, 조성물.
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