CN115667297A - 结合il6r的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种与人IL6R特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒、和药物组合物，以及使用该IL6R抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

Description

结合IL6R的抗体及其用途

相关申请和引用并入

本申请要求2020年5月18日提交的美国临时专利申请63/026,274的优先权。

在本文中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本文引用文件”)，在本文引用文件中引用或提及的所有文件，以及本文或任意本文引用并入文件中提及的任何制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本文，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入，如同各文件具体且个别地通过引用的方式并入。在本公开中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入，这些Genbank序列为本公开最早有效递交日的序列。

发明领域

本申请大体上涉及分离的单克隆抗体，特别是小鼠源、嵌合或人源化单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与人IL6R结合，具有高亲和力和功能性。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞以及方法。本申请还提供可以包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本申请的IL6R抗体或其抗原结合部位的诊断或治疗方法。

背景技术

白细胞介素-6(IL6)是一种多功能细胞因子，经由与两个跨膜蛋白，IL6R(又称为IL6Ra、gp80或CD126)和gp130的相互作用，在例如免疫和代谢中发挥作用(Kang，S et al.，(2019)Immunity50(4)：1007-1023)。

IL6R表达仅限于肝细胞、单核细胞和淋巴细胞，已发现有两种形式的IL6R参与IL6信号通路，即膜结合IL6R(mIL6R)和可溶性IL6R(sIL6R)。sIL6R由mIL6R经蛋白酶切割得到或者由选择性剪接的IL6R mRNA翻译而成(Riethmueller，S et al.，(2017)PlosBiology15(1)：e2000080；Lust，J.A et al.，(1992)Cytokine 4(2)：96-100)。两种IL6R形式的存在加上gp30的广泛表达，使得IL6可以在多种系统和器官中发挥活性。具体地，IL6与mIL6R以及膜结合gp130(mgp130)结合，引发经典的IL6信号通路，而在表达gp130而不表达IL6R的细胞上，IL6-sIL6-mgp130复合物的形成会激活IL6的反式信号传导。最近发现了IL6信号传导的第三种类型，为致病性辅助T细胞17细胞的启动所需，其中IL6与树突状细胞上mIL6R形成的复合物被递呈给表达mgp130的T细胞(Heinrich，P.C et al.，(2003)Biochem.J.374：1-20)。sIL6介导的信号级联反应可以由循环血液中存在的与IL6-sIL6R相互作用的水溶性gp130下调(Jostock，T et al.，(2001)Eur.J.Biochem 268(1)：160-167)。IL6信号传导主要激活两个下游通路，JAK和STAT3通路以及JAK-SHP2-MAP激酶通路(Kang，Set al.，(2019)同上)。

据报道，IL6使活化的B细胞分化成产生免疫球蛋白的细胞，驱使幼稚CD4⁺ T细胞变成产生炎症细胞因子IL17的Th17细胞系(Hirano，T et al.，(1986)Nature324(6092)：73-76；Bettelli，E et al.，(2006)Nature 441(7090)：235-238)。过度的IL6表达可以破坏免疫耐受性，导致炎症疾病。例如，在高IL6水平的心脏粘液瘤的患者中，观察到自免疫症状(Hirano，T et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(1)：228-231)。进一步发现IL6能够刺激肿瘤细胞增殖，与例如肾细胞癌、淋巴癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等癌症的较差预后相关(Lee，S.O et al.，(2007)Prostate67：764-773)。此外，IL6在骨稳态、组织再生、脂质代谢、血管生成等方面起作用。

靶向IL6信号通路已被用于治疗包括自免疫疾病在内的炎性疾病。例如，

托珠单抗，首个开发的抑制IL6与mIL6R和sIL6R结合的IL6R阻断剂，在全球100多个国家获得批准，用于类风湿性关节炎、全身性和多关节幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、Takayasu动脉炎、Castleman病和嵌合抗原受体T细胞并发的细胞因子释放综合征的治疗。在临床试验中，对托珠单抗在癌症和其他炎性疾病(例如系统性硬化症)中的潜在疗效进行了测试。据报道，对靶向IL6和/或IL6R的其他生物制品进行了疗效和安全性测试。始终需要具有改善疗效和安全性的抗体。

本申请中任何文件的引用或标识，并不是承认这些文件是本申请的现有技术。

发明内容

本申请提供分离的单克隆抗体，例如小鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其结合IL6R(例如人IL6R)，与现有技术IL6R抗体例如托珠单抗相比，具有相当的(如果不是更高的话)与人和/或猴IL6R的结合亲和力/能力、以及相当的(如果不是更高的话)对IL6-IL6R相互作用的阻断活性。

本申请的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括IL6和/或IL6R相关疾病(例如炎性疾病和癌症)的治疗。

因此，在一个方面，本申请涉及结合IL6R的分离的单克隆抗体(例如小鼠源、嵌合或人源化的抗体)或其抗原结合部分，其具有i)重链可变区，其可以包含VH CDR1区、VHCDR2区和VH CDR3区，其中该VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区可以分别包含与(1)SEQ IDNOs：1、4和11；(2)SEQ ID NOs：2、5和12；(3)SEQ ID NOs：2、6和13；(4)SEQ ID NOs：3、7和11；(5)SEQ ID NOs：2、8和13；(6)SEQ ID NOs：2、9和13；或(7)SEQ ID NOs：2、10和14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，其可以包含VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中该VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：15、18和22；(2)SEQ ID NOs：16、19和22；(3)SEQ ID NOs：15、20和22；(4)SEQ ID NOs：16、20和22；或(5)SEQ ID NOs：17、21和23具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3、以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、4、11、15、18和22；(2)SEQ ID NOs：2、5、12、16、19和22；(3)SEQ ID NOs：2、6、13、15、20和22；(4)SEQ ID NOs：3、7、11、16、20和22；(5)SEQ ID NOs：2、8、13、16、20和22；(6)SEQ ID NOs：2、9、13、15、20和22；或(7)SEQ ID NOs：2、10、14、17、21和23具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

重链可变区可以包含与SEQ ID NOs：24、25(X1＝I、X2＝K、X3＝A；X1＝M、X2＝T、X3＝V；或X1＝I、X2＝T、X3＝V)、26、27(X1＝K、X2＝L、X3＝R；X1＝K、X2＝M、X3＝V；或X1＝R、X2＝L、X3＝V)、28、29、30、31、32(X1＝N、X2＝L；或X1＝E、X2＝F)或33具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：24的氨基酸序列可由SEQ ID NOs：46或47的核苷酸序列编码。SEQ ID NO：27(X1＝R、X2＝L、X3＝V)的氨基酸序列可由SEQ ID NO：48的核苷酸序列编码。

轻链可变区可以包含与SEQ ID NOs：34、35(X1＝Y、X2＝M；或X1＝F、X2＝L)、36、37、38、39(X1＝Y、X2＝H、X3＝E；或X1＝S、X2＝R、X3＝G)或40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：34的氨基酸序列可由SEQ ID NOs：49或50的核苷酸序列编码。SEQ IDNO：35(X1＝Y、X2＝M)的氨基酸序列可由SEQ ID NO：51的核苷酸序列编码。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：24和34；(2)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝K、X3＝A)和35(X1＝Y、X2＝M)；(3)SEQ ID NOs：26和36；(4)SEQ ID NOs：27(X1＝K、X2＝L、X3＝R)和35(X1＝Y、X2＝M)；(5)SEQ ID NOs：27(X1＝K、X2＝M、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(6)SEQ ID NOs：25(X1＝M、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(7)SEQ IDNOs：27(X1＝R、X2＝L、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(8)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(9)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝K、X3＝A)和35(X1＝F、X2＝L)；(10)27(X1＝K、X2＝L、X3＝R)和35(X1＝F、X2＝L)；(11)27(X1＝K、X2＝M、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(12)SEQ ID NOs：25(X1＝M、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(13)27(X1＝R、X2＝L、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(14)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(15)SEQ ID NOs：28和37；(16)SEQ ID NOs：29和38；(17)SEQ ID NOs：30和39(X1＝Y、X2＝H、X3＝E)；(18)SEQ ID NOs：31和39(X1＝S、X2＝R、X3＝G)；(19)SEQ ID NOs：32(Xi＝N、X2＝L)和38；(20)SEQ ID NOs：32(X1＝E、X2＝F)和38；或(21)SEQ ID NOs：33和40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含通过二硫键连接的重链和轻链，重链可以包含重链可变区和重链恒定区，轻链可以包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的C端与重链恒定区的N端相连，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端相连，其中重链可变区和轻链可变区可以包含上述氨基酸序列，该抗体或其抗原结合部分与IL6R结合。重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO.：41所示氨基酸序列的人IgG1恒定区或其功能片段，轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO.：42所示氨基酸序列的人κ恒定区或其功能片段。重链恒定区也可以是人IgG4恒定区。轻链恒定区可以是人κ恒定区。SEQ ID NO：41和42的氨基酸序列可分别由SEQ ID NOs：52和53的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，本申请的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或者由两条重链和两条轻链组成，其中各重链可以包含上述重链恒定区、重链可变区或CDR序列，各轻链可以包含上述轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中抗体与IL6R结合。本申请的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型的。在其他实施方式中，本申请抗体或其抗原结合部位可以是单链可变片段(scFv)抗体、或抗体片段例如Fab或Fab′₂片段。

本申请还提供双特异性分子，其可以包含本申请抗体或其抗原结合部分，与具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)连接。本申请还提供免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物，其可以包含本申请抗体或其抗原结合部分，与治疗剂例如细胞毒素相连。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以作为嵌合抗原受体(CAR)的一部分。还提供免疫细胞，其可以包含抗原嵌合受体，例如T细胞和NK细胞。本申请的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒结合使用。

本申请还涉及编码本申请抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及可包含该核酸的表达载体、和可包含该表达载体的宿主细胞。还提供利用该宿主细胞制备本申请的IL6R抗体或其抗原结合部分的方法，其可以包括以下步骤：(i)在该宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。

还提供组合物，其可以包含本申请的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、溶瘤病毒、CAR、CAR-T细胞、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物还可以包含用于治疗特定疾病的治疗剂，例如抗炎性剂或抗癌剂。

在另一方面，本申请提供一种用于治疗与过度的IL6/IL6R信号传导相关的疾病的方法，其可以包括向受试者施用治疗有效量的本申请组合物。

该疾病可以是炎性疾病，例如自免疫疾病。炎性疾病包括，但不限于，类风湿性关节炎、全身性和多关节幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、Takayasu动脉炎、Castleman病、细胞因子释放综合征(例如，嵌合抗原受体T细胞并发性细胞因子释放综合征)、Schnitzler综合征和视神经脊髓炎。该方法还可以包括施用抗炎性剂，包括但不限于，CD3抗体、CD20抗体、CD22抗体、IL2R抗体、IL6抗体和IL17抗体。

该疾病可以是肿瘤或者癌症。肿瘤可以是实体瘤或者血液瘤，包括但不限于，非小细胞肺癌、和弥漫性大B细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，还可以施用至少一种其他的抗癌抗体，例如VISTA抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体、TIM3抗体、STAT3抗体、和/或ROR1抗体。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会是明晰的，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank条目、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

因而，本申请的目标是不在本申请中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本申请并不打算在本申请的范围内包含任何不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合EPC第53条(c)和EPC细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本申请同族或任何其他同族或任何第三方在先申请中涉及本申请人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。

应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；且术语例如“基本由...组成”或“基本由...构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如它们允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。

附图说明

以下以示例方式给出但不意在将本申请限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。

图1A-1D示出在捕获ELISA中小鼠源抗体1F7和1D4(A)、1A3、1B5和1G8(B)、3C2和1G1(C)、1H9和1H7(D)与人IL6R的结合力。

图2A-2C示出在间接ELISA中小鼠源抗体1H7、1F7、1B5和3C2(A)、1A3、1D4和1G8(B)、1H9和1G1(C)与猕猴IL6R的结合力。

图3A-3D示出在基于细胞的FACS结合检测中小鼠源抗体1F7和1D4(A)、1A3、1G8和1B5(B)、3C2和1G1(C)、1H9和1H7(D)与表达人IL6R的U266细胞的结合力。

图4A-4D示出在配体阻断ELISA中小鼠源抗体1F7和1D4(A)、1A3、1G8和1B5(B)、3C2和1G1(C)、1H9和1H7(D)对人IL6R-IL6结合的阻断力。

图5A-5D示出在对照基准物阻断ELISA中小鼠源抗体1F7和1D4(A)、1A3、1G8和1B5(B)、3C2和1G1(C)、1H9和1H7(D)对对照基准物-人IL6R结合的阻断力。

图6A-6E示出在基于细胞的功能检测中小鼠源抗体1F7和1G1(A)、1D4和1H9(B)、1A3和1B5(C)、1G8和1H7(D)、和3C2(E)对IL6介导的TF-1细胞增殖的抑制作用。

图7A-7B示出在捕获ELISA中嵌合抗体1B5和1H7(A)、和1H9(B)与人IL6R的结合力。

图8A-8B示出在配体阻断ELISA中嵌合抗体1B5和1H7(A)、和1H9(B)对人IL6R-IL6结合的阻断力。

图9A-9B示出在对照基准物阻断ELISA中嵌合抗体1B5和1H7(A)、和1H9(B)对对照基准物-人IL6R结合的阻断力。

图10示出在HEK293T-SIE-B4报告基因检测中嵌合抗体1H7、1B5、和1H9对IL6介导的荧光素酶活性的抑制作用。

图11示出在捕获ELISA中人源化抗体hu1H7-V5与人IL6R的结合力。

图12示出在间接ELISA中人源化抗体hu1H7-V5与猕猴IL6R的结合力。

图13示出在基于细胞的FACS结合检测中人源化抗体hu1H7-V5与表达人IL6R的U266细胞的结合力。

图14示出在配体阻断ELISA中人源化抗体hu1H7-V5对人IL6R-IL6结合的阻断力。

图15示出在对照基准物阻断ELISA中人源化抗体hu1H7-V5对对照基准物-人IL6R结合的阻断力。

图16示出在HEK293T-SIE-B4报告基因检测中人源化抗体hu1H7-V5对IL6介导的荧光素酶活性的抑制活性。

图17示出抗体hu1H7-V5的蛋白热迁移实验的结果。

具体实施方式

为确保更容易地理解本申请，首先定义一些术语。其他的定义贯穿具体描述而给出。

术语“IL6R”是指白细胞介素6受体，又称分化簇126(CD126)。术语“IL6R”可以包括变体、亚型、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人IL6R蛋白特异的抗体可以在某些情况下与来自人以外物种例如猴的IL6R蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人IL6R蛋白特异的抗体可以完全对人IL6R蛋白特异，而对其他物种或其他类型表现出无交叉反应性，或者可以与来自某些其他物种但不是所有其他物种的IL6R交叉反应。

术语“人IL6R”是指具有来自人的氨基酸序列的IL6R蛋白，例如Genbank登录号为NP_000556.1的人IL6R的氨基酸序列。术语“猕猴IL6R”是指具有来自猕猴的氨基酸序列的IL6R蛋白，例如具有Genbank登录号为NP_001036198.2的氨基酸序列。

本文所用的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片(即，“抗原结合部分”)或其单链。完整抗体是可以包含经二硫键而内部连接的两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。各重链可以由重链可变区(缩写成V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区可以由C_H1、C_H2和C_H3这三个结构域组成。各轻链可以由轻链可变区(本文中缩写成V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区可以由C_L这一个结构域组成。V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着更加保守的称为骨架区(FR)的区域。各V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)，的结合。

本文所用中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指抗体上保留有特异性结合抗原(例如IL6R蛋白)能力的一个或多个片段。已显示出，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，可以包含由铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂V_L和V_H结构域构成的Fv片段；(v)由V_H结构域构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，包含单个可变结构域的重链可变区和两个恒定结构域。此外，尽管Fv片段的两个结构域，V_L和V_H，由不同的基因编码，它们可以通过重组的方法经合成接头而连接，其中合成的接头使得它们可以制备为单个蛋白链，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science242：423-426；和Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段经与完整抗体相同的方式进行应用筛选。

本文所用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，分离出的与IL6R蛋白特异性结合的抗体，基本不含特异结合IL6R之外蛋白的抗体)。然而，分离出的与人IL6R蛋白特异性结合的抗体可以与其他抗原，例如其他物种的IL6R蛋白，有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组成”是指单分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组成表现出对于特定表位的单结合特异性和亲和力。

本文所用的术语“小鼠源抗体”意在包括骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，本文所用的术语“小鼠源抗体”不意在包括在小鼠骨架序列中植入得自另一哺乳动物物种种系的CDR序列的抗体。

术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而制备的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是含有某一物种的遗传物质以及另一物种遗传物质的抗体。

本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经修改成以增加与人中天然生成的抗体变体的相似度的抗体。

术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。

词组“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

如本文所用的，“特异结合人IL6R”的抗体是指与人IL6R蛋白(以及可能的来自一种或多种非人物种的IL6R蛋白)结合但基本不与非IL6R蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”，即以K_D值为5.0x10^-8M以下、更优选1.0x10^-8M以下、更优选7.0x10^-9M以下，结合人IL6R蛋白。

如本文所用的，术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即，以K_D为1x10^-6M以上、更优选1x10^-5M以上、更优选1x10^-4M以上、更优选1x10^-3M以上、更优选1x10^-2M以上，结合蛋白或细胞。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指抗体对于靶抗原的KD为1.0x10^-6M以下、更优选5.0x10^-8M以下、更优选1.0x10^-8M以下、甚至更优选3.0x10^-9M以下，甚至更优选1.0x10^{- 9}M以下。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和性”结合可以会变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和性”结合是指抗体的K_D为10^-6M以下、更优选10^-7M以下、甚至更优选10^-8M以下。

本文所用术语“Kassoc”或“K_a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“K_D”是指从K_d与K_a的比(即K_d/K_a)获得的解离常数，表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法确定抗体的K_D值。用于确定抗体K_D的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如BiacoreTM系统。

术语“EC₅₀”，也称为半最大效应浓度，是指在特定暴露时间后引起在基线和最高值之间的中间值反应的抗体浓度。

术语“IC₅₀”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体而言，抑制50％特定生物学或生化功能的抗体浓度。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本申请抗体的用量。治疗有效量在所治疗疾病的背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际有效量。

本申请的多个方面在以下小节中作进一步详细描述。

本申请的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的IL6R抗体例如托珠单抗相当的(若不是更佳的话)结合亲和力/能力，与人IL6R特异性结合。

本申请的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的IL6R抗体例如托珠单抗相当或更高的活性阻断IL6-IL6R结合以及IL6-IL6R-gp130复合物的产生。

本申请的抗体是小鼠源、嵌合和人源化的单克隆抗体。

本申请的抗体在以下以及之后实施例中进行结构和化学表征的单克隆单体。抗体的重/轻链可变区的氨基酸序列ID编号总结于以下表1，一些抗体享有相同的V_H或V_L。抗体的重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的人IgG1重链恒定区，抗体的轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的人κ恒定区。本申请的抗体也可以包含人IgG4重链恒定区和人κ轻链恒定区。

表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR已由Kabat编号体系确定。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列经其他体系例如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号体系/方法确定。

本申请详细的重链或轻链CDR序列如表2所示，除1H9外，其CDR序列与其他差异较大。可以看出，这7个抗体包含完全相同的轻链CDR3，十分相似的重链CDR1、CDR2、CDR3和轻链CDR1、CDR2。

结合人IL6R的其他IL6R抗体的V_H和V_L序列(或CDR序列)可以与本公开的IL6R抗体的V_H和V_L序列(或CDR序列)“混合和匹配”。优选地，当V_H和V_L链(或这些链中的CDR)混合并匹配时，来自特定V_H/V_L配对的V_H序列被结构上相似的V_H序列代替。同样地，优选来自特定V_H/V_L配对的V_L序列经结构类似的V_L序列替换。

因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以包括：

(a)包含上述表1中所列氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含上述表1中所列氨基酸序列的轻链可变区、或另一IL6R抗体的V_L，其中该抗体特异性结合人IL6R。

在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以包括：

(a)列于上述表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及

(b)列于上述表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一IL6R抗体的CDR，其中该抗体特异结合人IL6R。

在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括IL6R抗体的重链可变CDR2区，结合有其他结合人IL6R抗体的CDR区，例如，不同IL6R抗体的重链可变区CDR1和/或CDR3、和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。

另外，如本领域所公知的，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对同源抗原的结合特异性，且基于相同的CDR3序列，可预见能产生具有相同结合特异性的多个抗体。参见例如Klimka et al.，British J.of Cancer83(2)：252-260(2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)以及Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)。也可参见美国专利6,951,646；6,914,128；6,090,38；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一个都通过引用的方式整体并入本文。

因而，在另一个实施方式中，本申请的抗体包含IL6R抗体重链可变区的CDR2，至少地IL6R抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一IL6R抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够与人IL6R特异性结合。优选这些抗体(a)竞争结合IL6R；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请IL6R抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含IL6R抗体轻链可变区的CDR2、或另一IL6R抗体轻链可变区的CDR2，其中该抗体能够与人IL6R特异性结合。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包含IL6R抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，或另一IL6R抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，其中该抗体能够与人IL6R特异性结合。

在另一个实施方式中，本申请的抗体包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链和/或轻链可变区序列，其与本申请的IL6R抗体的可变区相比，区别在于具有一个或多个保守修饰。如本领域所理解的，可以进行一些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell etal.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6和Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

因而，在一个实施方式中，抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和/或具有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：

(a)重链可变区CDR1序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或

(b)重链可变区CDR2序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或

(c)重链可变区CDR3序列包含如上表1所列的序列，及其保守修改；和/或

(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和

(e)该抗体特异结合人IL6R。

本申请的抗体或其抗原结合部分具有以下一个或多个上述的功能特点，例如与人IL6R的高结合亲和力、以及对IL6R-IL6结合的阻断活性。

在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、人源化或嵌合抗体。

本文所用的术语“保守的序列修饰”是指不会显著影响或改变含有这类氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。已定义出领域内具有相似侧链的氨基酸残基组。这些组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改造后的抗体可以使用本文所述的功能检测测试其保留下来的功能(即上述的功能)。

本申请的抗体可以用具备本申请IL6R抗体的一个或多个V_H/V_L序列的抗体为起始原料，制备成修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V_H和/或V_L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰。此外以及可选地，抗体可以通过修饰恒定区的残基来进行工程改造，以例如改变抗体的效应功能。

在某些实施方式中，CDR植入可以用来工程改造抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，在个体抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，可以通过构建包含有将来自特定天然抗体的CDR序列植入到具有不同特性的不同抗体的骨架序列中的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(参见例如Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad。又可参见U.S.A.86：10029-10033；美国专利5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的VH和VL CDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。

这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库获得(可得自www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，也可以在Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836获得；上述文件各自的内容通过引用的方式明确并入本文。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7HuMAb小鼠中的重链种系序列可得自所附的Genbank登录号1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12HuMAb小鼠的重链种系序列可得自Genbank登录号1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)&3-23(AJ406678)。

通过使用本领域公知的称为空格BLAST的序列相似性搜索方法(Altschul etal.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与汇编蛋白序列数据库进行比较。

用于本申请抗体的优选骨架序列，是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。V_H CDR1、CDR2和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到与种系序列相比包含一个或多个突变的骨架区中。例如，发现了，在一些情况下，为保持或增强抗体的抗原结合能力，在骨架区中突变残基是有益的(参见例如美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类的可变区修饰是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入(本领域所知的)保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常对CDR区的改变不多于一个、两个、三个、四个或五个残基。

因而，在另一实施方式中，本申请提供分离的IL6R单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其包含：(a)V_H CDR1区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_L CDR1区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_L CDR2区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_L CDR3区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。

本申请的基因改造抗体包括，例如为提高抗体特性，在V_H和/或V_L的骨架残基中做出基因修饰的抗体。通常而言，做出这些骨架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于已得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过比较抗体骨架序列和得到抗体的种系序列而识别出来。

另一类的骨架修饰涉及对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

此外，或者作为对骨架或CDR区内修饰的另一种选择，本申请的抗体可以基因修饰成包含Fc区内的修饰，通常是为改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，可以对本申请的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学基团)，或者修饰成改变其糖基化，同样是为改变抗体的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，C_H1铰链区经修饰，改变，例如增加或减少，铰链区半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中作进一步描述。改变C_H1铰链区中的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。

在另一个实施方式中，抗体的Fc铰链区经突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C_H2-C_H3结构域连接区，从而相较于与天然Fc-铰链结构域的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，该抗体具有削弱的SpA结合。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

在另一实施方式中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

另外地或者可选地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。经证实，这些改变的糖基化形式增加抗体的ADCC活性。这样的糖基化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而完成。糖基化系统改变的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。使用两种替换载体靶向破坏CHO/DG44细胞的FUT8基因，制备Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnukiet al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了具有功能破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，从而通过降低或消除α-1，6键相关酶，在该细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的向结合抗体Fc区的N-乙酰氨基葡萄糖中添加岩藻糖的活性，或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开文本WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其向Asn(297)-连接糖添加岩藻糖的能力降低，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如在PCT公开文本WO06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。在植物体系中制备抗体的方法在对应Alston&Bird LLP律师记录号040989/314911的2006年8月11日提交的美国专利申请中有过记载。可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

包含在本申请中的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的活性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与活性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。蛋白聚乙二醇化的方法在领域内已知，且可以应用于本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。

本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同类别。

例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起抗体的免疫原性增高，或由于抗原结合的改变引起抗体的pK变化(Marshall etal(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选不包含可变区糖基化的IL6R抗体。这可以通过选择在可变区不包含糖基化基序的抗体或者通过使糖基化区域内的残基发生突变来实现。

在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在N-G或D-G序列处，引起异天冬氨酸残基的生成，其向多肽链引入链接并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。

各抗体将具有独特的等电点(pI)，其基本落在6-9.5的pH范围内。IgGl抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选pI值落在正常范围内的IL6R抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。

在另一方面，本申请提供编码本申请抗体重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解液中或处于部分纯化或基本纯化的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或者其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈处于基本纯化的状态”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可以包含或可以不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，下文会进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，可以从基因库中回收编码这类抗体的核酸。

优选的本申请核酸分子包括编码IL6R单克隆抗体的V_H和V_L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V_H和V_L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段与编码另一蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在上下文中使用术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而使这两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框内。

编码V_H区的分离DNA可以通过可操作地连接编码V_H的DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H区的DNA可以可操作地与仅编码重链C_H1恒定区的另一DNA分子连接。

编码V_L区的分离DNA可以通过可操作地连接编码V_L的DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为创建scFv基因，编码V_H和V_L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头的另一片段连接，从而V_H和V_L序列可以表达成一个连续的单链蛋白，其中V_L和V_H区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature348：552-554)。

可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的本领域所公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术制备本申请的单克隆抗体(mAb)。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合的或人源化的抗体是本领域公知的。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，上述文件的内容通过引用的方式特定地整体并入本文。

本申请的抗体还可以使用例如本领域所公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将通过标准分子生物技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到一个或多个表达载体中，从而使基因可操作地与转录和翻译调控序列相连接。在此背景下，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，从而使载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。

术语“调控序列”意在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。选择与使用的表达宿主细胞兼容的表达载体和表达控制序列。

抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，通过将可变区插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来构建任意抗体同种型的全长抗体基因，从而V_H部分与载体中的C_H部分可操作地连接，V_L部分与载体中的C_L部分可操作地连接。此外或者另外地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，进而信号肽在框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如，在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常而言，可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素、或甲氨喋呤的抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨喋呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”意在包括多种将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的常用技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，在真核细胞中表达抗体是最优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞，因为这些真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌出适当折叠且有免疫活性的抗体。

优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起使用的dhfr-CHO细胞，dhfr-CHO细胞在Urlaub andChasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中有过描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以在宿主细胞中表达抗体的时间，或优选将抗体分泌在宿主细胞生长的培养液中，来制备抗体。使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。

另一方面，本公开涉及双特异性分子，其可以包含一个或多个本申请抗体，与至少一个其他功能性分子例如另一个肽或蛋白(例如，另一抗体或受体的配体)相连，以生成与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用的，“双特异性分子”包括有三种或更多种特异性的分子。

在实施方式中，除Fc结合特异性和IL6R结合特异性外，双特异性分子还具有第三种特异性。第三种特异性可以是抗增强因子(EF)，例如与细胞毒性有关的表面蛋白结合，进而增加对靶细胞的免疫应答的分子。例如，抗增强因子可以与细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4或ICAM-1)或其他免疫细胞结合，增强对靶细胞的免疫应答。

双特异性分子可以以多种不同形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两条结合臂且各臂具有不同特异性，而非具有两条相同特异性的结合臂外。在另一个极端的是，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学方法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)，以及其中引用的文献。

另一方面，本发明提供诊断方法、组合物和试剂盒。在实施方式中，本发明的抗体用于确定细胞或组织中IL6Rα的存在和表达。在实施方式中，诊断可提示预后和/或指导治疗和/或跟踪治疗。例如，IL6信号通路已经靶向于炎性疾病的治疗，包括自免疫疾病和/或IL6/IL6R相关肿瘤或癌症。在实施方式中，本发明的抗体用于诊断试剂盒或方法，以确定预后和对自免疫疾病和/或IL6/IL6R相关肿瘤或癌症的适当治疗与随访。

本申请的抗体可以与治疗剂结合，形成例如抗体-药物偶联物(ADC)的免疫偶联物。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过可切割的接头结合，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以按照美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中的描述进行制备。

溶瘤病毒优先侵染并杀灭癌细胞。本申请的抗体可以与溶瘤病毒一起使用。或者，编码本申请抗体的溶瘤病毒可以引入到人体中。

本文还提供包含IL6R scFv的嵌合抗原受体(CAR)，该IL6R scFv包含本文所述的CDR和重/轻链可变区。

IL6R CAR可以包含(a)可包含IL6R scFv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。

CAR可以在胞外抗原结合域的N-端含有指导新生受体进入内质网的信号肽、以及在胞外抗原结合域的N-端的使受体更容易结合的铰链肽。CAR优选地在胞内信号传导结构域包含主要胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。主要使用的和最有效的主要胞内信号传导域是包含ITAM的CD3-ζ胞质结构域，其磷酸化会引起T细胞活化。共刺激信号传导结构域可以衍生自共刺激蛋白，例如CD28、CD137和OX40。

CAR还可以添加增强T细胞扩增、持久性和抗肿瘤活性的因子，例如细胞因子、和共刺激配体。

还提供基因修饰的免疫效应细胞，其可以包含本文提供的CAR。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞、或胚胎干细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞。

在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其可以包含与药学上可接受的载体配制在一起的本申请的一种或多种抗体(或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)。当组合物中含有多于一种的抗体(或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)时，抗体(或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)可以单独给药。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的活性成分，例如另一抗体或药物，例如抗肿瘤药物或抗炎性剂。

药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。在Gennaro，ed.，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中，对合适赋形剂的选择和使用有所讲解，其公开内容通过引用的方式并入本文。

优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。基于给药途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其免受酸和其他可能使其失活的自然条件的影响。本文所用的术语“肠道外给药”是指非肠内和非局部外用的给药给药方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外的途径给药，例如外用、表皮或粘膜给药，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。

药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构中。

可以与载体材料一起制备成单剂量型的有效成分的量将随着治疗主体和特定给药方式而变，且通常是产生疗效的组合物的量。基本而言，以百分比计，该量是与药学上可接受载体组合在一起的约0.01％-约99％，优选为约0.1％-约70％，最优选为约1％-约30％的有效成分。

调整给药方案以提供最佳的所需的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，为方便施用和剂量均匀，配置剂量单位型的肠道外组合物。本文所用的剂量单位型是指物理上不连续的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与所需药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的给药频率降低。

对于组合物的给药，剂量范围可以为约0.0001-100mg/kg。

“治疗有效剂量”的本申请IL6R抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物，优选地引起疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期频率和持久度的增加、或预防疾病折磨造成的损伤或残疾。例如，对于荷瘤受试者的治疗，与未接受治疗的受试者相比，优选“治疗有效剂量”对肿瘤生长的抑制至少为约20％、更优选为至少约40％，甚至更优选为至少约60％，更优选至少为约80％。治疗有效量的治疗抗体可以在受试者中减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者通常为人，或者可以是其他哺乳动物。

药物组合物可以是控释剂型，包括植入体、经皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems.J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

在某些实施方式中，可以配制本申请的单克隆抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体，以确保在体内的合适分布。例如，为确保本申请的治疗抗体可以穿越血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

可以包含本申请的抗体或其抗原结合部位、或双特异性分子、CAR-T细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物的药物组合物具有多种体外和体内用途，涉及例如具有过度IL6信号通路的炎性疾病的治疗。

鉴于本申请的IL6R抗体的阻断IL6与IL6R结合的能力，本申请提供用于治疗IL6/IL6R相关炎性疾病例如自免疫疾病和Castleman病的方法，其可以包括向受试者施用本申请的药物组合物。炎性疾病包括，但不限于，类风湿性关节炎、全身性和多关节幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、Takayasu动脉炎、Castleman病、嵌合抗原受体T细胞并发性细胞因子释放综合征、细胞因子释放综合征、Schnitzler综合征和视神经脊髓炎。

在一方面，本申请提供联合疗法，其中本申请的药物组合物与对改善IL6/IL6R相关炎性疾病有效的一种或多种其他药物联合施用。这类药物可以是CD3抗体、CD20抗体、CD22抗体、IL2R抗体、IL6抗体和IL17抗体。在某些实施方式中，受试者是人。

本文讨论的治疗剂的联合可以作为在药学上可接受载体中的单一组合物同步给药，或者作为在各药物处于药学上可接受载体中的单独组合物同步给药。在另一个实施方式中，治疗剂的联用可以按序施用。

此外，如果多于一剂的联合疗法需按序施用，按序给药的顺序可以在每个给药时间点颠倒或者保持相同的顺序，按序给药可以与同步给药相结合，或者任意组合。

尽管已经对本申请及其优势进行了详细的阐述，应当理解的是，可以在不脱离在所附权利要求中限定的本发明宗旨和范围的情况下，在本文中做出多种改变、替换和变动。

本申请在以下实施例中进一步阐明，实施例不应当解读为进一步的限制。所有图片和本申请中引用的参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用的方式明确地全部并入本文。

实施例

实施例1.使用杂交瘤技术制备小鼠源IL6R单克隆抗体

免疫

根据E Harlow，D.Lane，Antibody：A Laboratory Manual，Cold SpringHarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998中所述的方法免疫小鼠。将重组人IL6Rα-his蛋白(Acro biosystems，Cat#ILR-H4223)作为免疫原，内部制备的人IL6R-Fc蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO：43)用于抗血清效价的测定和分泌抗原特异性抗体的杂交瘤的筛选。对于初次免疫，免疫剂量包含50μg人IL6Rα-his/小鼠/注射，对于增强免疫，为25μg人IL6Rα-his/小鼠/注射。为增加免疫应答，在初次免疫和增强免疫中分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma，St.Louis，Mo.，USA)。简而言之，将所需量的佐剂转移到高压灭菌的1.5mL微量离心管中。将抗原以浓度0.25-1.0mg/ml配制在PBS或盐水中。然后将计算量的抗原加到含有佐剂的微量离心管中，轻柔地涡旋2分钟以混合溶液，以形成油包水的乳状液。之后将佐剂-抗原混合物抽吸到合适的注射器中，进行动物注射。以100-200μl的体积，共注射50μg或25μg抗原。对各个动物进行免疫，之后基于抗血清效价进行2-3次加强。在细胞融合前，通过腹腔注射对具有较好效价的动物进行最后一次加强。

杂交瘤融合和筛选

培养小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，ATCC#CRL-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。以无菌方式制备免疫小鼠脾细胞，并根据E Harlow，D.Lane，Antibody：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998中提到的方法与骨髓瘤细胞融合。之后将融合的“杂交细胞”在DMEM/20％v/vFCS/HAT培养基中于96孔细胞板铺板。融合后7-10天，在显微镜下观察存活的杂交瘤群落。在两周后，使用人IL6R-Fc蛋白(内部制备，SEQ ID NO：43)，对各孔的上清液进行间接ELISA和捕获ELISA。选出分泌与人IL6R-Fc结合的抗体的阳性杂交瘤，并转移到24孔板中。进一步测试这些杂交瘤阻断IL6R-IL6结合的活性。通过有限稀释，对产生显示出人IL6R高特异性和高IL6-IL6R阻断活性的抗体的杂交瘤克隆进行亚克隆，以确保细胞系的单克隆源性，之后纯化单克隆抗体。简而言之，使用5-10倍柱体积的PBS缓冲液冲洗蛋白A琼脂糖色谱柱(bestchrom(Shanghai)Biosciences，Cat#AA0273)。使细胞上清液流经柱子，然后用PBS缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)的1.5ml管中。将含有免疫球蛋白的部分集中，并于4℃在PBS中透析过夜。随后，如下所示对纯化的单克隆抗体的功能活性进行体外表征。

实施例2.使用BIACORE表面等离子体共振对小鼠源IL6R单克隆抗体的结合亲和力 确定

用Biacore T200系统(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)对实施例1中生成的纯化IL6R小鼠源单克隆抗体(mAb)进行结合亲和力和动力学的表征。

简而言之，使用Biacore提供的标准胺偶联试剂盒(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)，将山羊抗小鼠IgG(GE healthcare，Cat#BR100838，小鼠抗体捕获试剂盒)经伯胺共价连接到CM5芯片(羧甲基右旋糖包被芯片，GE healthcare，#BR100530)，蛋白G芯片(GEhealthcare，Cat#29-1793-15)用于对照基准物的亲和力确定。生物传感器表面未反应的基团用乙醇胺封闭。然后使纯化的本申请IL6R抗体和IL6R抗体对照基准物(托珠单抗，在本文中又称对照基准物或

内部制备，重链和轻链氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：55和56)以2μg/ml的浓度分别流至芯片，流速为10μL/min。然后，将梯度稀释的重组人IL6R-his(内部制备，氨基酸序列为SEQ ID NO：44)或猕猴IL6R-his蛋白(内部制备，氨基酸序列为SEQ ID NO：45)，起始浓度为100nM，在HBS-EP+缓冲液(Biacore提供)中2倍梯度稀释，以30μL/min的流速流到芯片上。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用BIAcore评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1Langmuir结合模型中。确定K_D、K_a和K_d值，并总结在以下表3中。

表3.小鼠源IL6R单克隆抗体与人和猕猴IL6R结合的Biacore动力力

所有测试的本申请IL6R抗体，以比托珠单抗更高的结合亲和力，与人IL6R以及猕猴IL6R特异性结合。

实施例3.小鼠源IL6R单克隆抗体的结合活性

通过捕获ELISA、间接ELISA和流式细胞术(FACS)测试小鼠源IL6R抗体的结合活性。

3.1捕获ELISA

对于捕获ELISA，用2μg/ml亲和纯化F(ab′)₂片段特异山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.，Cat#115-005-072)的PBS溶液包被96微孔板，100μl/孔，37℃2小时。板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗，再于4℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭过夜。冲洗板4次，分别与100μl/孔梯度稀释的本申请小鼠源IL6R抗体、对照基准物和阴性对照hIgG(静脉注射用人免疫球蛋白(pH4)，华兰生物工程有限公司)(起始浓度为10000ng/ml，用含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST 5倍稀释)于37℃孵育40分钟，然后再次冲洗4次。含有捕获的IL6R抗体的板与生物素标记的人IL6R-Fc蛋白(内部制备，SEQ ID NO：43，39.5ng/ml，于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中，100μl/孔)，37℃孵育40分钟，冲洗4次，与链霉亲和素结合的HRP(1∶10000稀释于PBST，JacksonImmuno Research Laboratories，Inc，Cat#016-030-084，100μl/孔)，于37℃孵育40分钟。在终洗后，板与100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，Cat#TMB-S-002)孵育。在室温3-10分钟后用50μl/孔1M H₂SO₄中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。之后用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC₅₀值。

3.2间接ELISA

检测IL6R抗体与猕猴IL6R的交叉反应。简单来说，用100μl/孔2μg/ml猕猴IL6R-his蛋白(内部制备，氨基酸序列为SEQ ID NO：45)的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)包被96孔微孔板，37℃2小时。ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗，再于37℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭2小时。冲洗板4次，与100μl/孔梯度稀释的本申请IL6R抗体或对照(起始浓度为66.7nM，用含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST5倍梯度稀释)于37℃孵育40分钟。再冲洗ELISA板4次，与100μl/孔过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释于PBST缓冲液，Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.，Cat#115-035-071)于37℃孵育40分钟。在终洗后，板与100μl/孔TMB(InnoReagents)孵育。在室温3-10分钟后用50μl/孔1M H₂SO₄中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC₅₀值。

3.3基于细胞的结合FACS

经流式细胞术(FACS)检测小鼠源IL6R抗体与细胞表面表达的IL6R的结合活性。简而言之，从细胞培养瓶中收集人骨髓瘤细胞U266(

TIB-196^TM)，洗涤两次，在含2％v/v胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)(FACS缓冲液)中重悬。在96孔板中，每孔2×10⁵个U266细胞，在冰上，与100μl处于多种浓度的IL6R抗体或对照(起始浓度为40nM，3倍梯度稀释于FACS缓冲液)孵育40分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并加入100μL/孔R-藻红蛋白亲和纯化F(ab′)₂片段特异山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1000稀释于FACS缓冲液，JacksonImmunoresearch Laboratories，Inc.，Cat#115-116-146)。4℃避光孵育40分钟后，细胞洗3次并用FACS缓冲液重悬。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS设备进行荧光测定。采用Graphpad Prism软件进行数据分析，得出EC₅₀值。

结果总结于并示于图1A-1D、2A-2C和3A-3D。

从图1A-1D可以看出，本申请的IL6R抗体与人IL6R特异性结合，与托珠单抗相比，具有更高的Bmax(最大结合)和更低的EC₅₀，说明它们更有效率地与更多的IL6R结合。

如图2A-2C所示，对于抗体与猕猴IL6R的结合活性，与托珠单抗相比，Bmax更低且EC₅₀更高。

根据图3A-3D，与托珠单抗相比，本申请所有的抗体更有效率地与细胞表面人IL6R结合，尽管其Bmax更低。

实施例4.小鼠源IL6R抗体对IL6R-托珠单抗或IL6R-IL6结合的阻断活性

4.1配体阻断ELISA

在竞争ELISA检测中，测定本申请IL6R抗体阻断IL6-IL6R结合的能力。简而言之，用2μg/mL于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的人IL6蛋白(Sino biological Inc.，Cat#10395-HNAE)包被96孔微孔板，100μl/孔，37℃2小时。ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗一次，再用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)于4℃封闭过夜。

次日，将IL6R抗体或对照用生物素标记的人IL6R-Fc蛋白(内部制备，SEQ ID NO：43，39.5ng/ml，于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中)稀释，起始浓度为100nM，4倍梯度稀释，室温孵育40分钟。板洗涤四次后，将抗体/IL6R-Fc混合物加至人IL6包被的板中，100μl/孔，于37℃孵育40分钟。用清洗缓冲液洗板4次，加入100μl/孔链霉亲和素结合的HRP(1∶10000稀释于PBST缓冲液，Jackson Immuno Research Laboratories Inc.，Cat#016-030-084)，并于37℃孵育40分钟。用清洗缓冲液洗板。最后，加入TMB，用1M H₂SO₄中止反应。在酶标仪中对吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，之后用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值。

4.2对照基准物阻断ELISA

在竞争ELISA检定中测定本申请IL6R抗体阻断对照基准物(托珠单抗)与人IL6R蛋白结合的能力。简而言之，将于PBS中的2μg/mL对照基准物包被于96孔微孔板，100μl/孔，37℃孵育2小时。ELISA板用清洗缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20，PBST)冲洗一次，再于4℃用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂牛奶的PBST)封闭过夜。

次日，将本申请IL6R抗体或对照用生物素标记的人IL6R-Fc蛋白(SEQ ID NO：43，13.6ng/ml于含2.5％w/v脱脂牛奶的PBST中)稀释，起始浓度为100nM，5倍梯度稀释，室温孵育40分钟。冲洗板4次后，将抗体/IL6R-Fc混合物加至对照基准物包被的平板中，100μl/孔。37℃孵育40分钟后，用洗涤缓冲液冲洗板4次。之后加入链霉亲和素结合的HRP，板于37℃孵育40分钟。用洗涤缓冲液终洗板后，加入TMB。用1M H₂SO₄中止反应，在酶标仪中对吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。用OD(450-630)值和抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值。

两组检测的结果如图4A-4D和5A-5D所示。

从图4A-4D可以看出，与托珠单抗相比，本申请所有IL6R抗体能够更有效率地阻断人IL6-人IL6R结合，IC₅₀更低。

图5A-5D示出，本申请所有IL6R抗体能够阻断IL6R-托珠单抗的结合，说明这些抗体很可能与托珠单抗结合在相同或相似的表位。

实施例5.小鼠源IL6R抗体的基于细胞的功能检测

进一步检测本申请所有IL6R抗体对IL6诱导的TF-1细胞增殖的抑制作用。

简而言之，将含有8×10³个处于对数增长期的TF-1细胞(人前骨髓细胞系，

CRL-2003)的100μL补充有10％v/v FBS(Gibco，Cat#10099-141)的RPMI1640培养液(Gibco，Cat#A10491-01)在96孔板上铺板。然后，向板中加入50μl梯度稀释的本申请IL6R抗体或对照(包括内部制备的CD22抗体作为阴性对照)(起始浓度为800nM，5倍梯度稀释于培养液)，37℃孵育30分钟。向板加入50μl人IL6蛋白(Sino biological，Cat#10395-HNAE，6.4ng/mL于培养液)，之后置于在5％CO₂孵育器中，37℃4天。板进行离心，移除上清液。然后，向板中加入Cell

发光法细胞活力检测试剂(Promega，Cat#G7572，50μl/孔)，25℃孵育10分钟。使用Tecan

200Pro仪器测试化学发光。用Graphpad Prism软件分析数据，得出IC₅₀值。

实验结果如图6A-6E所示。

可以看出，所有IL6R抗体能够抑制IL-6诱导的TF-1细胞生长，具有与托珠单抗相当或稍低的活性。

实施例6.嵌合抗体的制备和表征

对小鼠源IL6R mAb的重链和轻链可变区进行测序，序列ID号总结在表1中。

IL6R小鼠源mAb 1B5、1H9和1H7的重链和轻链可变区以在可读框内的形式分别克隆至人IgG1重链(SEQ ID NO.：41)和人κ轻链恒定区(SEQ ID NO.：42)，其中可变区的C端与各自恒定区的N端相连。

将各个包含编码与人IgG1重链恒定区相连的重链可变区的核苷酸的载体，和各个含有编码与人κ轻链恒定区相连的轻链可变区的核苷酸的载体，以1.1：1的轻：重链构建体比，瞬时转染到50ml含有1mg/mL PEI的293F悬浮细胞培养物中。

在摇瓶中6天后，收集细胞上清液，旋转离心使细胞成团，然后从上述细胞上清液中纯化出嵌合抗体。遵循上述实施例的操作流程(修改或不做修改)以及以下所述的操作规程，在捕获ELISA、竞争ELISA、BIAcore亲和力测试和基于细胞的报告基因检测中测试纯化的抗体。

对于报告基因检测，使用内部制备的HEK293T-SIE-B4细胞系，具有SIE(sis诱导元素)驱动的荧光素酶报告基因luc2P(Photinus pyralis)。制备HEK293T-SIE-B4细胞，根据lipofectamine 3000转染试剂(Thermo Fisher)的说明书，用pGL4.47[1uc2P/SIE/Hygro]载体(Promega，Cat#E404A)转染HEK293T细胞。简而言之，用含有2×10⁴个HEK293T-SIE-B4细胞的100μl补充有10％v/v FBS(Gibco，Cat#10099-141)和10％w/v丙酮酸钠(Gibco，Cat#1360-070)的DMEM培养液(Gibco，Cat#10566-016)在96孔板(Coming，Cat#3903)的各孔中铺板。之后，向板添加50μl梯度稀释的本申请嵌合IL6R抗体或对照(包括内部制备的CD22抗体作为阴性对照)(起始浓度为800nM，5倍梯度稀释于培养液)，37℃孵育30分钟。之后向板中加入50μl人IL6蛋白(Sino biological，Cat#10395-HNAE，4ng/mL于培养液)，后置于5％CO₂孵育器中，37℃24小时。板进行离心，每孔移除100μl上清液。加入荧光素酶检测试剂(50μL/孔，Promega，Cat#E6120)。在5分钟内，使用Tecan Infinit200Pro酶标仪对板进行分析。用Graphpad Prism软件分析数据，得出IC₅₀值。

对于捕获ELISA，使用亲和纯化F(ab′)₂片段特异山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-005-097)来替代亲和纯化F(ab′)₂片段特异山羊抗小鼠IgG，100μl/孔。

对于BIAcore，使用山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)，而非山羊抗小鼠IgG，与CM5芯片共价连接，托珠单抗使用CM5芯片而非蛋白G芯片。100nM浓度的重组人IL6R-his(氨基酸序列为SEQ ID NO：44)而非梯度稀释的重组人IL6R-his，以30μL/分钟的速度流经芯片。

结果如表4和图7A-7B、8A-8B、9A-9B和10所示。

数据显示，嵌合IL6R抗体有着与它们母本小鼠源mAb相似的人IL6R结合亲和力/能力以及相似的对IL6-IL6R相互作用的阻断活性，其在基于细胞的报告基因检测中，与托珠单抗相当(见图10)，且在其他检测中优于托珠单抗(见图7A-7B、8A-8B和9A-9B)。

表4.嵌合IL6R抗体对人IL6R的结合亲和力

实施例7.IL6R抗体1H7的人源化

将小鼠源IL6R抗体1H7进行人源化，并进一步表征。抗体的人源化使用确立的CDR移植技术进行，其在下文中详细描述。

为选择用于小鼠源抗体1H7的人源化的受体框架，将1H7的轻链和重链可变区序列在人免疫球蛋白基因数据库中进行比对搜索。选出同源性最高的人类种系，作为人源化的受体框架。将抗体重链/轻链可变区CDR插入到选中的框架中，对框架中的残基进一步回复突变，以获得更多候选的重链/轻链可变区。一共得到13个示例性人源化1H7抗体，即hu1H7-V1-hu1H7-V12以及hu1H7-V1-2，其重/轻链可变区序列ID号如表1所示。

将各个包含编码与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：41)相连的人源化重链可变区的核苷酸的载体，和各个包含编码与人κ轻链恒定区(SEQ ID NO：42)相连的人源化轻链可变区的核苷酸的载体，瞬时转染到50ml含有1mg/mL PEI的293F悬浮细胞培养物中，轻：重链构建体比为1.1∶1。

实施例8.示例性人源化抗体的表征

在摇瓶中培养6天后，收获含有人源化抗体的细胞上清液，根据加以修改的上述操作规程，直接进行BIAcore测试。具体地，将山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)而非山羊抗小鼠IgG与CM5芯片共价连接，托珠单抗使用CM5芯片而非蛋白G芯片。在HBS-EP+中制备嵌合抗体和托珠单抗，10μg/ml浓度，将含有人源化抗体的细胞上清液稀释10倍。确定K_a、K_d和K_D值，并总结在下表5中。

数据显示，示例性人源化抗体与嵌合抗体有着相似的人IL6R结合亲和力，高于托珠单抗。

表5.示例性人源化IL6R单克隆抗体与人IL6R结合的Biacore动力学

如上所述，纯化人源化抗体hu1H7-V5，并在Biacore、捕获ELISA、间接ELISA、基于细胞的结合FACS、竞争ELISA和基于细胞的报告基因检测中，按照上述实施例的操作规程(略作修改，如下所述)，进行测试。

对于捕获ELISA，使用2μg/ml山羊抗人IgG(亲和纯化山羊抗人IgG，F(ab′)₂片段特异，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，Cat#109-005-097)替代特异山羊抗小鼠IgG F(ab′)2片段，包被96孔微孔板，100μl/孔。

对于间接ELISA，使用过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异的F(ab′)₂片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，Cat#109-036-098)替代过氧化物酶亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗小鼠IgG，100μl/孔。

对于BIAcore，将山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)而非山羊抗小鼠IgG，共价连接于CM5芯片，托珠单抗使用CM5芯片而非蛋白G芯片。

对于基于细胞的结合FACS，使用R-藻红素亲和纯化Fcγ片段特异山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，Cat#109-115-098)而非R-藻红素亲和纯化F(ab′)₂片段山羊抗小鼠IgG(H+L)，1∶1000稀释于FACS缓冲液，100μl/孔。

在热稳定性测试中，使用GloMelt^TM热迁移蛋白稳定性试剂盒(Biotium，Cat#33022-T)测定人源化抗体hu1H7-V5的Tm(熔融温度)。简而言之，使GloMelt^TM染料融化，达到室温。将装有染料的小瓶进行涡旋振荡和离心。然后，通过向95μLPBS中加入5μL200×染料，制备10×染料。加入2μL10×染料和10μg人源化抗体，PBS加至20μL总反应体积。简单地旋转含有染料和抗体的管子，并置于实时PCR热循环仪(Roche，LightCycler480II)中，其设置为具有表6参数的熔融曲线程序。

表6.熔融曲线程序参数

大概步骤	温度	升温速率	保持时间
				初始保持	25℃	NA	30s
熔融曲线	25-99℃	0.1℃/s	NA

结果如表7和图11-17所示。

根据数据，与托珠单抗相比，人源化抗体hu1H7-V5显示出更高的人IL6R结合亲和力/活性和更高的IL6R-IL6阻断力。特别地，在HEK293T-SIE-B4细胞报告基因检测中，抗体hu1H7-V5在抑制IL6介导的荧光素酶活性方面呈现出比托珠单抗更佳的生物活性。

表7.人源化抗体hu1H7-V5的结合亲和力

从表7中可以看出，人源化抗体hu1H7-V5显示出与嵌合抗体1H7相当的人和猕猴IL6R结合亲和力。换句话说，hu1H7-V5对人和猕猴IL6R的结合亲和力高于托珠单抗。

从图11可以看出，人源化抗体hu1H7-V5与人IL6R特异性结合，与托珠单抗相比，具有更高的Bmax(最大结合)和更低的EC₅₀，说明其更有效率地与更多的IL6R结合。

对于抗体对猕猴IL6R的结合活性，如图12所示，与托珠单抗相比，Bmax更高，EC₅₀更低。

根据图13，人源化抗体hu1H7-V5更有效率地与细胞表面人IL6R结合，与托珠单抗相比，具有更高的Bmax(最大结合)和更低的EC₅₀，说明其更有效率地与更多的IL6R结合。

图14示出，人源化抗体hu1H7-V5能够阻断IL6R-IL6结合，阻断活性高于托珠单抗。

根据图15，人源化抗体hu1H7-V5能够阻断人IL6R与托珠单抗结合，表明hu1H7-V5很可能结合在与托珠单抗相似的表位。

如图16所示，在基于细胞的报告基因检测中，人源化抗体hu1H7-V5的功能活性高于托珠单抗。

此外，如图17所示，根据熔融温度，人源化抗体hu1H7-V5在人体内很可能是稳定的。

尽管本申请已经结合一个或多个实施方式在以上进行了阐述，应当理解的是，本申请不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可选方案、修改和等同物。所有本文中引用的参考文献进一步通过引用的方式全文并入。

本申请中的序列总结如下。

***

已经在本申请的优选实施方式中进行了具体阐述，应当理解的是，由上述段落定义的本发明不限于在上述描述中列出的特定细节，可以在不脱离本发明宗旨和范围的情况下做出很多明显的变形。

序列表

<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司

<120> 结合IL6R的抗体及其用途

<130> 55532 00036

<150> US 63/026,274

<151> 2020-05-18

<160> 55

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源、嵌合和人源化1H7的VH CDR1

<400> 1

Asn Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1H7、小鼠源和嵌合1B5、小鼠源1A3、小鼠源1D4、

小鼠源1G1、小鼠源和嵌合1H9的VH CDR1

<400> 2

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源3C2的VH CDR1

<400> 3

Thr Tyr Trp Ile His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源、嵌合和人源化1H7的VH CDR2

<400> 4

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1F7的VH CDR2

<400> 5

Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1B5的VH CDR2

<400> 6

Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源3C2的VH CDR2

<400> 7

Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu His Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1A3的VH CDR2

<400> 8

Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Thr

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1D4和小鼠源1G1的VH CDR2

<400> 9

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asp Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VH CDR2

<400> 10

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Tyr Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源、嵌合和人源化1H7，以及小鼠源3C2的VH CDR3

<400> 11

Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1F7的VH CDR3

<400> 12

Leu Ser Ile His Tyr Val Phe Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1B5、小鼠源1A3、小鼠源1D4、以及

小鼠源1G1的VH CDR3

<400> 13

Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Tyr

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VH CDR3

<400> 14

Phe His Tyr Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源、嵌合和人源化1H7，小鼠源和嵌合1B5，

小鼠源1D4和小鼠源1G1的VL CDR1

<400> 15

Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His

1 5 10

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1F7、小鼠源3C2、和小鼠源1A3的VL CDR1

<400> 16

Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VL CDR1

<400> 17

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Val

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源、嵌合和人源化1H7的VL CDR2

<400> 18

Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1F7的VL CDR2

<400> 19

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1B5、小鼠源3C2、小鼠源1A3、

小鼠源1D4、和小鼠源1G1的VL CDR2

<400> 20

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VL CDR2

<400> 21

Pro Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源、嵌合和人源化1H7，小鼠源和嵌合1F7，小鼠源和嵌合1B5，

小鼠源3C2，小鼠源1A3，小鼠源1D4，和小鼠源1G1的VL CDR3

<400> 22

Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro Phe Thr

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VL CDR3

<400> 23

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H7的VH

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Leu Ser Ser

115

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V1、hu1H7-V4、hu1H7-V6、hu1H7-V7、

hu1H7-V10和hu1H7-V12的VH

<220>

<221> 其他特征

<222> (48)..(48)

<223> Xaa可以是Ile或Met

<220>

<221> 其他特征

<222> (74)..(74)

<223> Xaa可以是Lys或Thr

<220>

<221> 其他特征

<222> (79)..(79)

<223> Xaa可以是Ala或Val

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Xaa Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V1-2的VH

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V2、hu1H7-V3、hu1H7-V5、hu1H7-V8、

hu1H7-V9、和hu1H7-V11的VH

<220>

<221> 其他特征

<222> (67)..(67)

<223> Xaa可以是Lys或Arg

<220>

<221> 其他特征

<222> (70)..(70)

<223> Xaa可以是Leu或Met

<220>

<221> 其他特征

<222> (72)..(72)

<223> Xaa可以是Arg或Val

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ser Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1F7的VH

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Val Gln Leu Tyr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Ile His Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1B5的VH

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源3C2的VH

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu His Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1A3的VH

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys

85 90 95

Leu Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1D4和1G1的VH

<220>

<221> 其他特征

<222> (73)..(73)

<223> Xaa可以是Asn或Glu

<220>

<221> 其他特征

<222> (83)..(83)

<223> Xaa可以是Leu或Phe

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Val Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Xaa Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Xaa Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Thr His Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VH

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Tyr Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Phe His Tyr Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H7的VL

<400> 34

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Phe Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 35

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V1 - hu1H7-V12的VL

<220>

<221> 其他特征

<222> (72)..(72)

<223> Xaa可以是Tyr或Phe

<220>

<221> 其他特征

<222> (79)..(79)

<223> Xaa可以是Met或Leu

<400> 35

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ser Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Xaa Thr Leu Thr Ile Ser Arg Xaa Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V1-2的VL

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1F7的VL

<400> 37

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Phe Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Ser Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Val Thr Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1B5、小鼠源1D4、和小鼠源1G1的VL

<400> 38

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Phe Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源3C2和小鼠源1A3的VL

<220>

<221> 其他特征

<222> (50)..(50)

<223> Xaa可以是Tyr或Ser

<220>

<221> 其他特征

<222> (62)..(62)

<223> Xaa可以是His或Arg

<220>

<221> 其他特征

<222> (82)..(82)

<223> Xaa可以是Glu或Gly

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Xaa Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Xaa Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

65 70 75 80

Ala Xaa Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Gly Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源和嵌合1H9的VL

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Pro Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 41

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 43

<211> 578

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IL6R Fc

<400> 43

Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu

1 5 10 15

Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu

20 25 30

Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala

35 40 45

Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu

50 55 60

Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala

65 70 75 80

Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu

85 90 95

Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val

100 105 110

Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val

115 120 125

Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu

130 135 140

Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala

145 150 155 160

Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala

165 170 175

Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys

180 185 190

Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val

195 200 205

Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser

210 215 220

Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala

225 230 235 240

Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His

245 250 255

His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln

260 265 270

Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser

275 280 285

Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala

290 295 300

Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp

305 310 315 320

Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro

325 330 335

Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp

340 345 350

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

355 360 365

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

370 375 380

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

385 390 395 400

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

405 410 415

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

420 425 430

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

435 440 445

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

450 455 460

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

465 470 475 480

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

485 490 495

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

500 505 510

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

515 520 525

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

530 535 540

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

545 550 555 560

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

565 570 575

Gly Lys

<210> 44

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IL6R-his

<400> 44

Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu

1 5 10 15

Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu

20 25 30

Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala

35 40 45

Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu

50 55 60

Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala

65 70 75 80

Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu

85 90 95

Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val

100 105 110

Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val

115 120 125

Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu

130 135 140

Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala

145 150 155 160

Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala

165 170 175

Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys

180 185 190

Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val

195 200 205

Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser

210 215 220

Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala

225 230 235 240

Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His

245 250 255

His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln

260 265 270

Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser

275 280 285

Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala

290 295 300

Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp

305 310 315 320

Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro

325 330 335

Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro His His His His His His

340 345 350

His His His His

355

<210> 45

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猕猴IL6R-his

<400> 45

Met Asn Ser Val Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Leu Pro

20 25 30

Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Ser Gln Pro Leu Thr

35 40 45

Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys His Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile

50 55 60

Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Arg Ser Asn Met Cys Glu Ser

65 70 75 80

Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala

85 90 95

Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Asp Thr Cys Leu

100 105 110

Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr

115 120 125

Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln

130 135 140

Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn

145 150 155 160

Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu

165 170 175

Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His

180 185 190

Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Leu Arg Gln Met His His His His His His His His His His

210 215 220

<210> 46

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1H7的VH

<400> 46

caggtccaac tgcagcagcc tgggactgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaactg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaaacagagg 120

cctggacaag gccttgactg gattggagag attaatccta ccaacggtcg tacaaactac 180

aatgagaatt tcaagagtaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gtagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagattgaat 300

actcactacg tttttgactc ctggggccaa ggcaccactc tcacactgtc ctca 354

<210> 47

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合1H7的VH

<400> 47

caagtgcagc tgcagcagcc cggcacagag ctggtgaaac ccggcgccag cgtgaagctg 60

agctgcaagg ccagcggcta taccttcacc aactactgga tgcactgggt gaagcagaga 120

cccggccaag gactggattg gatcggcgag atcaatccca ccaacggaag aaccaactac 180

aacgagaact tcaagtccaa ggccacactg accgtggaca agagcagcag cacagcctac 240

atgcagctga gctctctgac cagcgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagactgaac 300

acccactacg tgttcgacag ctggggccaa ggcaccacac tgacactgtc cagc 354

<210> 48

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V5、和hu1H7-V11的VH

<400> 48

caagtgcagc tggtgcaaag cggagccgag gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gagacaagcc 120

cccggccaag gactggagtg gatcggcgag atcaacccta ccaacggaag aaccaactac 180

aacgagaact tcaagtctag agtgacactg accgtggaca cctccacaag caccgtgtac 240

atggagctga gctctctgag atccgaggac accgccgtgt actactgcgc tagactgaac 300

acccactacg tgttcgacag ctggggccaa ggcacactgg tgaccgtgtc ctcc 354

<210> 49

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠源1H7的VL

<400> 49

gaaattgttc tcacccagtc tccaaccacc ttggctgcat ctcccgggga gaagatcact 60

ttcacctgca gtgtcagttc aagtataagt tccaattact tgcattggta tcagcagaag 120

ccaggattct cccctaaact cttgatttct aggacatcca ctctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatggag 240

gctgaagatg ttgccactta ctactgccag cagggtagtg gtataccatt cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaatt aaaa 324

<210> 50

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合1H7的VL

<400> 50

gagatcgtgc tgacccagag ccctacaaca ctggctgcca gccccggcga gaagatcacc 60

ttcacatgca gcgtgagcag cagcatcagc tccaattatc tgcactggta tcagcagaag 120

cccggcttca gccccaaact gctgatctct agaaccagca cactggcttc cggcgtgccc 180

gccagatttt ccggcagcgg aagcggcacc agctactctc tgaccattgg caccatggag 240

gccgaggatg tggccaccta ctactgccag caaggctccg gcattccctt caccttcggc 300

agcggcacca agctggagct gaag 324

<210> 51

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1H7-V1 - hu1H7-V6的VL

<400> 51

gagatcgtgc tgacccagag ccccggcaca ctgtctctga gccccggcga gagagccaca 60

ctgagctgca gcgtgagcag cagcatcagc agcaactatc tgcactggta tcagcagaag 120

cccggactga gccctagact gctgatctct agaacctcca cactggccag cggcatcccc 180

gccagattta gcggaagcgg aagcggcacc gagtacacac tgaccatctc tagaatgcag 240

agcgaggact tcgccgtgta ctactgccag caaggcagcg gaatcccctt caccttcggc 300

caaggcacca agctggagat caag 324

<210> 52

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链恒定区

<400> 52

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 53

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链恒定区

<400> 53

cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttga 324

<210> 54

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tocilizumab的重链

<400> 54

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 55

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tocilizumab的轻链

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (18)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与白细胞介素6受体亚基α(IL6R)结合，包含：

i)重链可变区，其包含VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中该VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、4和11；(2)SEQ ID NOs：2、5和12；(3)SEQ IDNOs：2、6和13；(4)SEQ ID NOs：3、7和11；(5)SEQ ID NOs：2、8和13；(6)SEQ ID NOs：2、9和13；或(7)SEQ ID NOs：2、10和14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或

ii)轻链可变区，其包含VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中该VL CDR1区、VLCDR2区和VL CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs：15、18和22；(2)SEQ ID NOs：16、19和22；(3)SEQ ID NOs：15、20和22；(4)SEQ ID NOs：16、20和22；或(5)SEQ ID NOs：17、21和23具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区包含与SEQ ID NOs：24、25(X1＝I、X2＝K、X3＝A；X1＝M、X2＝T、X3＝V；或X1＝I、X2＝T、X3＝V)、26、27(X1＝K、X2＝L、X3＝R；X1＝K、X2＝M、X3＝V；或X1＝R、X2＝L、X3＝V)、28、29、30、31、32(X1＝N、X2＝L；或X1＝E、X2＝F)或33具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该轻链可变区包含与SEQ ID NOs：34、35(X1＝Y、X2＝M；或X1＝F、X2＝L)、36、37、38、39(X1＝Y、X2＝H、X3＝E；或X1＝S、X2＝R、X3＝G)或40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区和该轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NOs：24和34；(2)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝K、X3＝A)和35(X1＝Y、X2＝M)；(3)SEQ ID NOs：26和36；(4)SEQ ID NOs：27(X1＝K、X2＝L、X3＝R)和35(X1＝Y、X2＝M)；(5)SEQ ID NOs：27(X1＝K、X2＝M、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(6)SEQID NOs：25(X1＝M、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(7)SEQ ID NOs：27(X1＝R、X2＝L、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(8)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝Y、X2＝M)；(9)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝K、X3＝A)和35(X1＝F、X2＝L)；(10)27(X1＝K、X2＝L、X3＝R)和35(X1＝F、X2＝L)；(11)27(X1＝K、X2＝M、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(12)SEQ IDNOs：25(X1＝M、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(13)27(X1＝R、X2＝L、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(14)SEQ ID NOs：25(X1＝I、X2＝T、X3＝V)和35(X1＝F、X2＝L)；(15)SEQ IDNOs：28和37；(16)SEQ ID NOs：29和38；(17)SEQ ID NOs：30和39(X1＝Y、X2＝H、X3＝E)；(18)SEQ ID NOs：31和39(X1＝S、X2＝R、X3＝G)；(19)SEQ ID NOs：32(X1＝N、X2＝L)和38；(20)SEQ ID NOs：32(X1＝E、X2＝F)和38；或(21)SEQ ID NOs：33和40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4同种型。

6.如权利要求4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，该重链恒定区包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，与重链可变区相连，该轻链恒定区包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，与轻链可变区相连。

7.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)结合人IL6R；(b)结合猴IL6R；和(c)阻断IL6-IL6R相互作用；和/或(d)抑制IL6-IL6R诱导的细胞信号通路。

8.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为小鼠源、嵌合或人源化抗体。

9.一种核苷酸，其编码权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的核苷酸。

11.一种宿主细胞，其包含权利要求10所述的载体。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求9所述的核苷酸、权利要求10所述的表达载体、或权利要求11所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

13.如权利要求12所述的药物组合物，还包含抗炎性剂或抗肿瘤剂。

14.一种用于治疗与过度的IL6/IL6R信号通路相关的疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求12或13所述的药物组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中该疾病为炎性疾病。

16.如权利要求15所述的方法，其中炎性疾病为类风湿性关节炎、全身性和多关节幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、Takayasu动脉炎、Castleman病、细胞因子释放综合征、Schnitzler综合征、或视神经脊髓炎。

17.如权利要求14所述的方法，其中该疾病为癌症。

18.如权利要求17所述的方法，其中癌症为非小细胞型肺癌、或弥漫性大B细胞淋巴瘤。

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