CN114829392A - 结合rankl的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种与人RANKL特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子、表达载体、宿主细胞和表达该抗体或其抗原结合部分的方法。本申请还提供使用该RANKL抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

Description

结合RANKL的抗体及其用途

相关申请和引用并入

本申请要求2019年12月13日提交的美国临时专利申请US 62/947,541的优先权。

上述申请、在上述申请中引用或在其审查过程中引用的全部文件(“申请引用文件”)，在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件具体且个别地通过引用的方式并入。在本申请中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请，这些Genbank序列为本申请最早有效递交日的序列。

技术领域

本申请大体上涉及分离的单克隆抗体，特别是小鼠、嵌合或人源化单克隆抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力和功能性与人RANKL结合。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及表达该抗体或其抗原结合部分的方法。本申请还提供包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子和药物组合物，以及使用本申请RANKL抗体或其抗原结合部位的诊断或治疗方法。

背景技术

核因子κ-B受体活化因子配体(RANKL)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员，又称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)。其在多种组织和器官，包括骨髓、胸腺和淋巴结中，以膜结合或可溶性蛋白的形式表达，在骨代谢和免疫系统发育和功能中起重要作用(LaceyD.L.et al.，(2012)Nat.Rev.Drug Discov.11(5)：401-419；Ahem E.et al.，(2018)Nat.Rev.Clin Oncol.15(11)：676-693)。

RANKL及其受体RANK参与免疫系统的多种生理过程。例如，它们是淋巴结器官生成、和胸腺中T细胞发育调节所必需的。活化T细胞产生的RANKL与树突状细胞上的RANK相互作用，增加抗原递呈树突状细胞和抗原特异T细胞的数量和持久性，增强记忆型T细胞的应答(Rao S.et al.，(2018)Trends Cell Biol.28(3)：213-223)。

RANKL也是在绝经后骨质疏松症、多发性骨髓瘤和骨转移癌中造成病理性骨质损失的关键调节因子。当与髓系细胞上的RANK结合时，RANKL促进破骨细胞发生并在某些情况下例如雌激素缺失时造成骨质疏松。RANKL抑制剂已经被开发并批准用于治疗或缓解这种骨质破坏。RANKL的另外两个受体，骨保护素(OPG)和LGR4，与RANK竞争结合RANKL，并负调节骨质吸收(Rao S.et al.，引用如上)。

一种RANKL抑制剂是

地诺单抗，结合RANKL的全人IgG2单克隆抗体，其已被批准用于骨质疏松和癌症骨相关事件(SRE)的治疗。令人惊讶的是，在骨转移癌的治疗中，这种抗体展现了与骨骼无关的抗肿瘤活性。在以NSCLC患者为对象的随机III期临床试验中，接受地诺单抗治疗的患者与施用双膦酸盐唑来膦酸的患者相比，显著改善了总体生存，但没有显著更优的SRE延缓(Scagliotti G.V.et al.，(2012)J.Thorac Oncol.，7(12)：1823-1829)。抗肿瘤效果很可能是由于阻断了肿瘤微环境(TME)中RANKL/RANK信号通路而引起的，因为RANKL与TME中多种免疫细胞类型表达的RNAK的相互作用可能抑制抗肿瘤免疫性(Ahem E.et al.，引用如上)。

地诺单抗还在肿瘤治疗中展现出与免疫检查点抑制剂的协同作用，尤其是在具有低RANKL表达基础的肿瘤中。免疫检查点抑制会造成TME中T细胞上RANKL的上调，这些T细胞的抗肿瘤活性会在RANKL与表达在其他细胞上的RANK结合后而受到抑制。在一些小鼠癌症模型中，同时抑制PD-l和RANKL，或按序地抑制PD-1、再抑制RANKL，引起更佳的肿瘤生长抑制(Ahern E.et al.，(2018)Oncoimmunology 7(6)：e1431088)。

尽管地诺单抗具有正向的收益风险比以及良好的治疗效果，但观察到不良反应，例如疼痛、贫血、腹泻以及皮肤问题，在某些案例中观察到严重的感染。因此，需要更多另外的更有效安全包括抗体在内的RANKL结合部位。

对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。

发明内容

本申请提供一种分离的单克隆抗体，例如小鼠源、人源、嵌合的或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其结合RANKL(例如，人RANKL和猴RANKL)，与现有技术RANKL抗体例如

地诺单抗相比，具有相当的(若不是更高的话)RANKL结合亲和力/能力和/或RANK-RANKL相互作用的阻断力。

本申请的抗体或其抗原结合部分可以用于许多应用中，包括RANKL蛋白的检测以及RANKL相关疾病例如骨质流失和癌症的治疗和预防。

因此，在一个方面，本申请涉及一种结合RANKL的分离的单克隆抗体(例如小鼠源、嵌合的或人源化的抗体)或其抗原结合部分，其具有i)重链可变区，其可以包含VH-CDR1区、VH-CDR2区和VH-CDR3区，其中该VH-CDR1区、VH-CDR2区和VH-CDR3区可以分别包含与(1)SEQID NOs：1、5和10；(2)SEQ ID NOs：2、6和11；(3)SEQ ID NOs：2、7和11；(4)SEQ ID NOs：3、8和12；或(5)SEQ ID NOs：4、9和13具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，其可以包含VL-CDR1区、VL-CDR2区和VL-CDR3区，其中该VL-CDR1区、VL-CDR2区和VL-CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：14、18和21；(2)SEQ ID NOs：15、19和22；(3)SEQ IDNOs：16、18和23；或(4)SEQ ID NOs：17、20和24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区，其可以包含VH-CDR1区、VH-CDR2区和VH-CDR3区，以及轻链可变区，其可以包含VL-CDR1区、VL-CDR2区和VL-CDR3区，其中VH-CDR1区、VH-CDR2区、VH-CDR3区、VL-CDR1区、VL-CDR2区和VL-CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、5、10、14、18和21；(2)SEQ ID NOs：2、6、11、15、19和22；(3)SEQ ID NOs：2、7、11、15、19和22；(4)SEQ ID NOs：3、8、12、16、18和23；或(5)SEQ ID NOs：4、9、13、17、20和24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与SEQ ID NOs：25、26(X1＝A、X2＝R、X3＝T；X1＝S、X2＝K、X3＝K；或X1＝A、X2＝K、X3＝K)、27(X1＝P、X2＝Q；或X1＝S、X2＝K)、28或29具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：25的氨基酸序列可由SEQID NO：44的核苷酸序列编码。

本申请抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与SEQ ID NOs：30、31(X1＝A、X2＝I；或X1＝S、X2＝L)、32、33或34具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：30的氨基酸序列可由SEQ ID NO：45的核苷酸序列编码。

在某些实施方式中，本申请分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其分别包含(1)SEQ ID NOs：25和30；(2)SEQ ID NOs：26(X1＝A、X2＝R、X3＝T；X1＝S、X2＝K、X3＝K；或X1＝A、X2＝K、X3＝K)和31(X1＝A、X2＝I)；(3)SEQ ID NOs：26(X1＝A、X2＝R、X3＝T；X1＝S、X2＝K、X3＝K；或X1＝A、X2＝K、X3＝K)和31(X1＝S、X2＝L)；(4)SEQ ID NOs：27(X1＝P、X2＝Q；或X1＝S、X2＝K)和32；(5)SEQ ID NOs：28和33；或(6)SEQID NOs：29和34所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本申请分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链和轻链，重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的C端与重链恒定区的N端相连，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端相连，其中重链可变区和轻链可变区可以包含上述氨基酸序列。重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的人IgG2恒定区、或具有例如SEQ ID NO：36所示氨基酸序列的人IgG4恒定区，轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的人κ恒定区。SEQ ID NOs：35、36和37的氨基酸序列可分别由SEQ ID NOs：46、47和48的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，本申请的抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链组成，其中各重链包含上述重链恒定区、重链可变区或CDR序列，各轻链包含上述轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中该抗体与RANKL结合。本申请的抗体可以是全人抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型，或者改造成具有弱FcR结合能力和弱/无ADCC/CDC活性的IgGl亚型。在其他实施方式中，本申请抗体可以是单链可变片段(scFv)抗体、或抗体片段例如Fab或Fab′2片段。

本申请的抗体或其抗原结合部分与现有技术RANKL抗体例如

地诺单抗比，具有相当的(若不是更高的话)人RANKL和猴RANKL结合亲和力/能力以及RANK-RANKL相互作用阻断力。

本申请还提供一种包含本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，其与具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)连接。

本申请还涉及编码本申请抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体、和包含该表达载体的宿主细胞。本申请还提供利用含有表达载体的宿主细胞制备RANKL抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。

本申请还提供组合物，其包含抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

在另一个方面，本申请提供一种用于治疗与RANKL表达增多相关的疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，该方法包括施用本申请的双特异性分子、核酸分子、表达载体或宿主细胞。

该疾病可以是骨质流失或肿瘤。

骨质流失可以是骨转移癌中发生的骨质破坏、多发性骨髓瘤中发生的骨质流失、激素治疗或绝经后骨质疏松症中的骨质流失。

肿瘤可以是乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤和/或骨转移癌。

在某些实施方式中，还施用至少一种其他的抗骨质流失的药物，例如二膦酸盐类，例如二膦酸盐(唑来膦酸)。

在某些实施方式中，可以进一步施用至少一种其他的抗肿瘤抗体，例如免疫检查点抑制剂，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG3抗体、和/或CTLA-4抗体。本申请的抗体可以是例如小鼠源、人源、嵌合的或人源化的抗体。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

另外，本申请的目标是不在本申请中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本申请并不打算在本申请的范围内包含任何不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合EPC第53条(c)和细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本申请同族或任何其他同族或任何第三方在先申请中涉及本申请人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。

应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；而术语例如“基本由...组成”或“基本由...构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。

附图说明

以下以示例方式给出详细的描述，但不意在将本申请限制于所述具体实施方式中，可以结合附图更好地进行理解。

图1A和1B示出在捕获ELISA中小鼠源抗体B1A8和B3D8(A)、D1E3、D1A1和B4H5(B)与人RANKL的结合力。

图2A和2B示出在竞争ELISA中小鼠源抗体B1A8和B3D8(A)、D1E3、D1A1和B4H5(B)阻断人RANKL-RANK结合的能力。

图3A和3B示出在竞争ELISA测试中小鼠源抗体B1A8和B3D8(A)、D1E3、D1A1和B4H5(B)阻断对照基准物与人RANKL结合的能力。

图4A至4D示出在基于细胞的功能检测中小鼠源抗体B1A8(A)、B3D8和D1A1(B)、D1E3(C)和B4H5(D)阻断人RANKL与细胞表面RANK结合的能力。

图5A至5D示出在捕获ELISA中嵌合抗体B1A8(A)、B3D8(B)、D1E3(C)和D1A1(D)与人RANKL的结合能力。

图6示出在竞争ELISA中嵌合抗体B1A8、B3D8、D1E3和D1A1阻断人RANKL-RANK结合的能力。

图7示出在竞争ELISA中嵌合抗体B1A8、B3D8、D1E3和D1A1阻断对照基准物-人RANKL结合的能力。

图8示出在捕获ELISA中人源化抗体huD1A1-V2和huD1A1-V5与人RANKL的结合力。

图9示出在竞争ELISA中人源化抗体huD1A1-V2和huD1A1-V5阻断人RANKL-RANK结合的能力。

图10示出人源化抗体huD1A1-V2和huD1A1-V5阻断对照基准物-人RANKL结合的能力。

图11A至11C示出在基于细胞的功能检测中人源化抗体huD1A1-V2和huD1A1-V5(A&C)以及小鼠源和嵌合D1A1抗体(B)阻断人RANKL与细胞表面RANK结合的能力。

图12A至12B示出人源化抗体huD1A1-V2(A)和huD1A1-V5(B)的蛋白热迁移实验的结果。

具体实施方式

为确保更好地理解本申请，首先定义一些术语。其他定义贯穿详细描述而列出。

术语“RANKL”是指核因子κ-B受体活化因子配体，或肿瘤坏死因子配体超家族成员11。术语“RANKL”包含变体、同种型、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人RANKL蛋白特异的抗体可能在某些情况下与来自人以外物种(例如猴)的RANKL蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人RANKL蛋白特异的抗体可能完全对人RANKL蛋白特异，而对其他物种或其他类型不表现出交叉反应性，或者可能与来自某些其他物种但不是所有其他物种的RANKL交叉反应。

术语“人RANKL”是指具有来自人的氨基酸序列的RANKL蛋白，例如Genbank登录号为NP_003692.1的人RANKL的氨基酸序列。术语“猴或恒河猴RANKL”和“小鼠RANKL”分别是指猴和小鼠的RANKL序列，例如Genbank登录号分别为XP_001092669.1(猕猴)和NP_035743.2的氨基酸序列的那些。

本文所用的术语“抗体”是指通过至少一个抗原结合位点，识别和特异性结合靶标，例如RANKL，的免疫球蛋白分子，其中抗原结合位点通常位于免疫球蛋白分子的可变区内。本文所用的术语包含完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链Fv(scFv)抗体、重链抗体(HCAb)、轻链抗体(LCAb)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白、以及任何其他含抗原结合位点的改性免疫球蛋白分子(例如：双可变结构域免疫球蛋白分子)，只要抗体表现出所需的生物活性即可。抗体也包括，但不限于，小鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体。抗体可以是五种主要免疫球蛋白类型中的任意种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或它们的亚类(同种型)(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，取决于其分别称为α、δ、ε、γ和μ重链恒定区的特点。不同种类的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构象。抗体可以是裸露的或与其他分子结合，其他分子包括，但不限于，毒素和放射性同位素。除非另有明确说明，本文使用的术语“抗体”包括完整抗体的“抗原结合部分”。IgG是可以包含经二硫键而内部连接的两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链可以由重链可变区(缩写成VH)和重链恒定区组成。重链恒定区可以由CH1、CH2和CH3这三个结构域组成。每条轻链可以由轻链可变区(缩写成VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区可以由CL这一个结构域组成。VH和VL可以进一步细分为高变区，又称互补决定区(CDR)，其间穿插着更加保守的称为骨架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(Clq)，的结合。

本文所用中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指抗体上保留有特异性结合抗原(例如RANKL蛋白)能力的一个或多个片段。已显示出，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，可以包含由铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)由VH结构域构成的dAb片段(Ward etal.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，包含单个可变结构域的重链可变区和两个恒定结构域。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组的方法经合成接头而连接，其中合成的接头使得它们可以制备为单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段经与完整抗体相同的方式进行筛选，以进行应用。

本文所用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，分离出的与RANKL蛋白特异性结合的抗体，基本不含特异结合RANKL之外蛋白的抗体)。然而，分离出的与人RANKL蛋白特异性结合的抗体可能与其他抗原，例如其他物种的RANKL蛋白，有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群中得到的抗体，即，包含该群的个体抗体是相同的，除少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗体是高度特异性的，靶向单一抗原位点。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优势还在于其是通过杂交瘤培养合成的，没有被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”是指该抗体从基本均一的抗体群中获得的特征，不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明的要使用的单克隆抗体可以通过多种技术制成，包括例如杂交瘤方法。

本文所用的术语“小鼠源抗体”意在包括骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，本文所用的术语“小鼠源抗体”不意在包括在小鼠骨架序列中植入得自另一哺乳动物物种种系的CDR序列的抗体。

术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而制备的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是含有某一物种的遗传物质以及另一物种遗传物质的抗体。

本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经修改成以增加与人中天然生成的抗体变体的相似度的抗体。

术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。

词组“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

如本文所用的，“特异结合人RANKL”的抗体是指与人RANKL蛋白(以及可能的来自一种或多种非人物种的RANKL蛋白)结合但基本不与非RANKL蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”，即以K_D值为5.0x10^-8M以下、更优选1.0x10^-8M以下、更优选3.0x 10^-9M以下，结合人RANKL蛋白。

如本文所用的，术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即，以K_D为1x 10^-6M以上、更优选1x 10^-5M以上、更优选1x 10^-4M以上、更优选1x 10^-3M以上、更优选1x 10^-2M以上，结合蛋白或细胞。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指抗体对于靶抗原的K_D为1.0x 10^-6M以下、更优选5.0x 10^-8M以下、更优选1.0x 10^-8M以下、更优选3.0x 10^-9M以下、更优选1.0x 10^-9M以下。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和性”结合可能会变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和性”结合是指抗体的K_D为10^-6M以下、更优选10^-7M以下、甚至更优选10^-8M以下。

本文所用术语“K_assoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“K_dis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”是指从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)获得的解离常数，表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法确定抗体的K_D值。用于确定抗体K_D的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如Biacore^TM系统。

术语“EC₅₀”，也称为半最大效应浓度，是指在特定暴露时间后引起在基线和最高值之间的中间值反应的抗体浓度。

术语“IC₅₀”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体而言，抑制50％特定生物学或生化功能的抗体浓度。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本申请抗体的用量。治疗有效量在所治疗疾病的背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际有效量。

本申请的多个方面在以下小节中作进一步详细描述。

RANKL抗体具有更高的人RANKL结合亲和力以及更好的对RANKL-RANK相互作用的 阻断活性

本申请的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的RANKL抗体例如

地诺单抗相当的(若不是更佳的话)结合亲和力/能力，与人RANKL特异性结合。

本申请的抗体或其抗原结合部分具有与现有技术RANKL抗体

地诺单抗相当的(若不是更高的话)对于RANK-RANKL相互作用的阻断活性。

本申请优选的抗体是人源化单克隆抗体。另外或可选地，抗体可以是例如嵌合的单克隆抗体。

单克隆RANKL抗体

本申请的抗体或其抗原结合部分在以下以及实施例中进行结构和化学表征。抗体的重/轻链可变区的氨基酸序列ID编号总结于以下表1，一些抗体享有相同的V_H或V_L。抗体的重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的人IgG2重链恒定区，或具有如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的人IgG4重链恒定区，抗体的轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的人κ恒定区。这些抗体也可以根据需要包含小鼠重链/轻链恒定区。

表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR经Kabat编号体系确定。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列经其他体系例如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号体系/方法确定。

结合人RANKL的其他RANKL抗体的V_H和V_L序列(或CDR序列)可以与本公开的RANKL抗体的V_H和V_L序列“混合和匹配”。优选地，当V_H和V_L链(或这些链中的CDR)混合并匹配时，来自特定V_H/V_L配对的VH序列被结构上相似的V_H序列代替。同样地，优选来自特定V_H/V_L配对的V_L序列经结构类似的V_L序列替换。

因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：

(a)包含表1中所列氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含表1中所列氨基酸序列的轻链可变区、或另一RANKL抗体的V_L，其中该抗体特异性结合人RANKL。

在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：

(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及

(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一RANKL抗体的CDR，其中该抗体特异结合人RANKL。

在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括RANKL抗体的重链可变CDR2区，结合有其他结合人RANKL抗体的CDR区，例如，不同RANKL抗体的重链可变区CDR1和/或CDR3、和/或轻链可变区CDR1、CDR2和或CDR3。

另外，如本领域所公知的，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对同源抗原的结合特异性，且基于相同的CDR3序列，可预见能产生具有相同结合特异性的多个抗体。参见例如Klimka et al.，British J.ofCancer83(2)：252-260(2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.，J.Biochem (Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)以及Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)。也可参见美国专利6,951,646；6,914,128；6,090,38；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一个都通过引用的方式整体并入本文。

因而，在另一个实施方式中，本申请的抗体包含RANKL抗体重链可变区的CDR2，至少地RANKL抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一RANKL抗体重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够与人RANKL特异性结合。优选这些抗体(a)竞争结合RANKL；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请RANKL抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含RANKL抗体轻链可变区的CDR2、或另一RANKL抗体轻链可变区的CDR2，其中该抗体能够与人RANKL特异性结合。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包含RANKL抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，或另一RANKL抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，其中该抗体能够与人RANKL特异性结合。

保守修改

在另一个实施方式中，本申请的抗体包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链和/或轻链可变区序列，其与本申请的RANKL抗体的可变区相比，区别在于具有一个或多个保守修饰。如本领域所理解的，可以进行一些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell etal.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6和Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

因而，在一个实施方式中，抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和/或具有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：

(a)重链可变区CDR1序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或

(b)重链可变区CDR2序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或

(c)重链可变区CDR3序列包含如上表1所列的序列，及其保守修改；和/或

(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和

(e)该抗体特异结合人RANKL。

本申请的抗体具有以下一个或多个上述的功能特点，例如与人RANKL的高结合亲和力、以及诱导减弱的或消除的对于表达RANKL的细胞的ADCC或CDC的能力。

在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、人源化或嵌合抗体。

本文所用的术语“保守的序列修饰”是指不会显著影响或改变含有这类氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。已定义出领域内具有相似侧链的氨基酸残基组。这些组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改造后的抗体可以使用本文所述的功能检测测试其保留下来的功能(即上述的功能)。

工程化改造和修饰的抗体

本申请的抗体可以用具备本申请RANKL抗体的一个或多个V_H/V_L序列的抗体为起始原料，制备成修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V_H和/或V_L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰。此外以及可选地，抗体可以通过修饰恒定区的残基来进行工程改造，以例如改变抗体的效应功能。

在某些实施方式中，CDR植入可以用来工程改造抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，在个体抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，可以通过构建包含有将来自特定天然抗体的CDR序列植入到具有不同特性的不同抗体的骨架序列中的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(参见例如Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad。又可参见U.S.A.86：10029-10033；美国专利5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的V_H和V_L CDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。

这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库获得(可得自www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，也可以在Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836获得；上述文件各自的内容通过引用的方式明确并入本文。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列可得自所附的Genbank登录号1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hcol2 HuMAb小鼠的重链种系序列可得自Genbank登录号1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)&3-23(AJ406678)。

通过使用本领域公知的称为空格BLAST的序列相似性搜索方法(Altschul etal.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与汇编蛋白序列数据库进行比较。

用于本申请抗体的优选骨架序列，是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。V_H CDR1、CDR2和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到与种系序列相比包含一个或多个突变的骨架区中。例如，发现了，在一些情况下，为保持或增强抗体的抗原结合能力，在骨架区中突变残基是有益的(参见例如美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类的可变区修饰是将V_H和/或V_L CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入(本领域所知的)保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常对CDR区的改变不多于一个、两个、三个、四个或五个残基。

此外，在另一实施方式中，本申请提供分离的RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其包含：(a)V_H CDR1区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_HCDR3区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_L CDR1区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_L CDR2区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_L CDR3区，其包含本申请的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。

本申请的基因改造抗体包括，例如为提高抗体特性，在V_H和/或V_L的骨架残基中做出基因修饰的抗体。通常而言，做出这些骨架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于已得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过比较抗体骨架序列和得到抗体的种系序列而识别出来。

另一类的骨架修饰涉及对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

此外，或者作为对骨架或CDR区内修饰的另一种选择，本申请的抗体可以基因修饰成包含Fc区内的修饰，通常是为改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，可以对本申请的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学基团)，或者修饰成改变其糖基化，同样是为改变抗体的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，C_H1铰链区经修饰，改变，例如增加或减少，铰链区半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中作进一步描述。改变C_H1铰链区中的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。

在另一个实施方式中，抗体的Fc铰链区经突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C_H2-C_H3结构域连接区，从而相较于与天然Fc-铰链结构域的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，该抗体具有削弱的SpA结合。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

在另一实施方式中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

另外地或者可选地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。经证实，这些改变的糖基化形式增加抗体的ADCC活性。这样的糖基化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而完成。糖基化系统改变的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。使用两种替换载体靶向破坏CHO/DG44细胞的FUT8基因，制备Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnukietal.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了具有功能破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，从而通过降低或消除α-1，6键相关酶，在该细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。EP1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的向结合抗体Fc区的N-乙酰氨基葡萄糖中添加岩藻糖的活性，或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCCCRL 1662)。PCT公开文本WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lecl3细胞，其向Asn(297)-连接糖添加岩藻糖的能力降低，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277∶26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如在PCT公开文本WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。在植物体系中制备抗体的方法在对应Alston&Bird LLP律师记录号040989/314911的2006年8月11日提交的美国专利申请中有过记载。PCT公开文本WO 99/54342记载了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体的ADCC活性增强(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

包含在本申请中的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的活性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与活性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C₁-C₁₀)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。蛋白聚乙二醇化的方法在领域内已知，且可以应用于本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。

抗体的物理特性

本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同类别。

例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起抗体的免疫原性增高，或由于抗原结合的改变引起抗体的pK变化(Marshall etal(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选不包含可变区糖基化的RANKL抗体。这可以通过选择在可变区不包含糖基化基序的抗体或者通过使糖基化区域内的残基发生突变来实现。

在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在N-G或D-G序列处，引起异天冬氨酸残基的生成，其向多肽链引入链接并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。

各抗体将具有独特的等电点(pI)，其基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选pI值落在正常范围内的RANKL抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。

编码本申请抗体的核酸分子

在另一方面，本申请提供编码本申请抗体重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解液中或处于部分纯化或基本纯化的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或者其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈处于基本纯化的状态”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可以包含或可以不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，下文会进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，可以从基因库中回收编码这类抗体的核酸。

优选的本申请核酸分子包括编码RANKL单克隆抗体的V_H和V_L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V_H和V_L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段与编码另一蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在上下文中使用术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而使这两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框内。

编码V_H区的分离DNA可以通过可操作地连接编码V_H的DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链C_H1恒定区的另一DNA分子连接。

编码V_L区的分离DNA可以通过可操作地连接编码V_L的DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为创建scFv基因，编码V_H和V_L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)₃的另一片段连接，从而VH和VL序列可以表达成一个连续的单链蛋白，其中V_L和V_H区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。

本申请单克隆抗体的制备

可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的本领域所公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术制备本申请的单克隆抗体(mAb)。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合的或人源化的抗体是本领域公知的。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，上述文件的内容通过引用的方式整体并入本文。

产生本申请单克隆抗体的转染瘤的生成

本申请的抗体还可以使用例如本领域所公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将通过标准分子生物技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到一个或多个表达载体中，从而使基因可操作地与转录和翻译调控序列相连接。在此背景下，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，从而使载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。

术语“调控序列”意在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。选择与使用的表达宿主细胞兼容的表达载体和表达控制序列。

抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，通过将可变区插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来构建任意抗体同种型的全长抗体基因，从而V_H部分与载体中的CH部分可操作地连接，V_L部分与载体中的C_L部分可操作地连接。此外或者另外地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，进而信号肽在框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如，在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常而言，可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素、或甲氨喋呤的抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨喋呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”意在包括多种将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的常用技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，在真核细胞中表达抗体是最优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞，因为这些真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌出适当折叠且有免疫活性的抗体。

优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起使用的dhfr-CHO细胞，dhfr-CHO细胞在Urlaub andChasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中有过描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以在宿主细胞中表达抗体的时间，或优选将抗体分泌在宿主细胞生长的培养液中，来制备抗体。使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。

双特异性分子

另一方面，本公开涉及双特异性分子，其包含一个或多个本申请抗体与至少一个其他功能性分子例如另一个肽或蛋白(例如，另一抗体或受体的配体)相连，以生成与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用的，“双特异性分子”包括有三种或更多种特异性的分子。

在某个实施方式中，除RANKL结合特异性外，双特异性分子还具有第三种特异性。第三种特异性可以针对另一免疫检查点分子，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4或LAG-3。

双特异性分子可以以多种不同形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两条结合臂且各臂具有不同特异性，而非具有两条相同特异性的结合臂外。在另一个极端的是，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)₂构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学方法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)，以及其中引用的文献。

药物组合物

在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体配制在一起的本申请的一种或多种抗体(或其抗原结合部分、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体)。当组合物中含有多于一种的抗体(或其抗原结合部分、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体)时，抗体(或其抗原结合部分、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体)可以单独给药。组合物可以选择性地包含一种或多种其他药物活性成分，例如另一抗体或药物，例如抗肿瘤药物。

药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。在Gennaro，ed.，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中，对合适赋形剂的选择和使用有所讲解，其公开内容通过引用的方式并入本文。

优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。基于给药途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其免受酸和其他可能使其失活的自然条件的影响。本文所用的术语“肠道外给药”是指非肠内和非局部外用的给药给药方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外的途径给药，例如外用、表皮或粘膜给药，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。

药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构中。

可以与载体材料一起制备成单剂量型的有效成分的量将随着治疗主体和特定给药方式而变，且通常是产生疗效的组合物的量。基本而言，以百分比计，该量是与药学上可接受载体组合在一起的约0.01％-约99％，优选为约0.1％-约70％，最优选为约1％-约30％的有效成分。

调整给药方案以提供最佳的所需的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，为方便施用和剂量均匀，配置剂量单位型的肠道外组合物。本文所用的剂量单位型是指物理上不连续的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与所需药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的给药频率降低。

对于组合物的给药，剂量范围可以为约0.0001-100mg/kg。示例性治疗方案需要每周给药一次。示范性治疗方案包括静脉给药。

“治疗有效剂量”的本申请抗RANKL抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体会，优选地引起疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期频率和持久度的增加、或预防疾病折磨造成的损伤或残疾。例如，对于荷瘤受试者的治疗，与未接受治疗的受试者相比，优选“治疗有效剂量”对肿瘤生长的抑制至少为约20％、更优选为至少约40％，甚至更优选为至少约60％，更优选至少为约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者通常为人，或者可以是其他哺乳动物。对于骨质流失的治疗，与未接受治疗的受试者相比，优选“治疗有效剂量”对骨质流失的抑制至少为约20％，更优选为至少约40％，甚至更优选为至少约60％。

药物组合物可以是控释剂型，包括植入体、经皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems.J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)，上述文献的公开内容通过引用的方式并入本文。

在某些实施方式中，可以配制本申请的单克隆抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体，以确保在体内的合适分布。例如，为确保本申请的治疗抗体可以穿越血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本申请的用途和方法

包含本申请的抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、表达这些的核酸分子或表达载体的组合物具有多种体外和体内用途，涉及例如RANKL相关疾病的治疗，例如骨质流失和癌症。

鉴于本申请的RANKL抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体的抑制骨质破坏的作用，本申请提供一种用于抑制受试者骨质流失的方法，包括向受试者施用本申请的药物组合物。骨质流失可以是骨转移癌、多发性骨髓瘤中发生的骨质破坏、或绝经后骨质疏松症。

鉴于本申请的RANKL抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体的抗肿瘤活性，本申请提供一种用于抑制受试者的RANKL相关癌症的方法，包括向受试者施用本申请的药物组合物，从而抑制受试者的肿瘤生长。可以通过本申请的抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体治疗的肿瘤的非限制性实例，包括，但不仅限于，乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤和骨转移癌。

更通常来说，本申请的抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体，可以用于加强受试者的免疫应答。

联合治疗

在另一方面，本申请提供联合治疗方法，其中本申请的RANKL抗体或其抗原结合部位、双特异性分子、或表达这些的核酸分子或表达载体与一个或多个对抑制受试者中骨质流失或者肿瘤生长有效的其他药物联合施用。可以防止或抑制骨质流失的药物包括，但不限于，二膦酸盐类，例如二膦酸盐唑来膦酸。在某些实施方式中，受试者是人。

在一个实施方式中，本申请提供一种用于抑制受试者中肿瘤生长的方法，包括向受试者施用RANKL抗体(或其抗原结合部位、双特异性分子、表达这些的核酸分子或表达载体)与一个或多个其他抗体，例如VISTA抗体、LAG-3抗体、PD-L1抗体、和PD-1抗体、和/或CTLA-4抗体，特别是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，受试者是人。

RANKL信号通路激活阻断还可以与标准癌症治疗合用。例如，RANKL信号通路阻断可以与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断以及化疗方案相结合。例如化疗试剂可以与RANKL抗体一起施用，化疗剂可以是细胞毒试剂。例如，表阿霉素、奥沙利铂和5-FU可以给接受RANKL治疗的患者施用。

可选地，RANKL抗体与一个或多个其他抗体(例如，CTLA-4抗体和/或LAG-3抗体和/或PD-1抗体)的联合使用可以与免疫原剂例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽类和碳水化合物)以及转染有编码免疫刺激因子的基因的细胞(He et al.，(2004)J.Immunol.173：4919-28)进一步结合。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原肽，例如gp100肽，MAGE抗原，Trp-2，MART1和/或酪氨酸酶，或转染表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。

其他可以与RANKL抗体相结合的治疗方案包括，但不仅限于，施用白介素-2(IL-2)、放疗、手术治疗或激素抑制疗法。

本文讨论的治疗剂的联合使用可以作为在药学上可接受载体中的单一组合物同步给药，或者作为各药物处于药学上可接受载体中的单独组合物同步给药。根据另一个实施方式，治疗剂的合用可以是按序施用。

此外，如果多于一剂的联合疗法需按序施用，按序给药的顺序可以颠倒或者在每个给药时间点保持相同的顺序，按序给药可以与同步给药相结合，或者任意组合。

本申请通过以下实施例进一步阐明，实施例不应当解读为进一步限定。贯穿本申请引用的所有图片和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开专利申请，均通过引用的方式明确并入本文。

实施例

实施例1.使用杂交瘤技术生成小鼠源RANKL单克隆抗体

免疫

根据E Harlow，D.Lane，Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998中所述的方法免疫小鼠。C-端带人IgG1 Fc的内部制备重组人RANKL蛋白(氨基酸序列136-317，uniprot#O14788)作为免疫原，也用于抗血清效价的测定和分泌抗原特异性抗体的杂交瘤的筛选。

免疫剂量包含用于初次免疫和增强免疫的25μg人RANKL-Fc蛋白/小鼠/注射。为增加免疫应答，在初次免疫和增强免疫中分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma，St.Louis，Mo.，USA)。简而言之，如下制备佐剂-抗原混合物。首先，使用涡旋混合器，在小瓶中混合佐剂。将所需量的佐剂转移到高压灭菌的1.5mL微量离心管中。将抗原配制在PBS或盐水中，浓度为0.5-1.0mg/ml。然后将所计算量的抗原加到含有佐剂的微量离心管中，轻柔地涡旋2分钟，混合所得的溶液，以形成油包水的乳状液。之后将佐剂-抗原乳状液吸到适当的注射器中，进行动物注射。以50-100μl的体积，共注射25μg抗原。对各个动物进行免疫，之后基于抗血清效价进行3-4次加强。在细胞融合前，通过腹腔注射对具有较好效价的动物进行最后的加强。

杂交瘤融合和筛选

培养小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，ATCC#CRL-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。以无菌方式制备免疫小鼠脾细胞，并根据Kohler G，and Milstein C，″Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity，″Nature，256：495-497(1975)中提到的方法与骨髓瘤细胞融合。之后将融合的“杂交细胞”在DMEM/20％FCS/HAT培养基中于96孔板铺板。融合后的7-10天，在显微镜下观察存活的杂交瘤群落。在两周后，使用内部制备的重组人RANKL-Fc蛋白，对各孔的上清液进行基于ELISA的筛查。选出分泌与人RANKL-Fc蛋白结合的抗体的阳性杂交瘤群落，并转移到24孔板中。进一步测试这些杂交瘤群落阻断人RANKL与RANK结合的活性。通过有限稀释，对产生人RANKL高特异结合性和RANKL-RANK阻断活性的抗体的杂交瘤群落进行亚克隆，以确保细胞系的单克隆源性，之后纯化单克隆抗体。简单而言，使用5-10倍柱体积的PBS缓冲液冲洗蛋白A琼脂糖色谱柱(Bestchrom(Shanghai)Biosciences，Cat#AA0273)。使细胞上清液通过柱子，然后用PBS缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)的1.5ml管中。将含有免疫球蛋白的部分集中在一起，并于4℃在PBS中透析过夜。随后，如下所述对纯化的单克隆抗体进行体外功能活性表征。

实施例2.使用Octet生物膜层干涉技术对小鼠RANKL单克隆抗体的亲和力测定

使用Octet系统(ForteBio，Octet RED 96)，对实施例1中产生的纯化RANKL小鼠源单克隆抗体进行亲和力和结合动力学表征。

简而言之，将AHC/AMC生物传感器(抗人/抗小鼠IgG Fc捕获，ForteBio)在10mM甘氨酸(pH 1.5)中预浸泡3秒，之后浸入含流动缓冲液(含0.5％w/v BSA的PBST)的孔中3秒，上述浸泡和浸入步骤重复三次。之后将传感器浸入含有在HBS-EP⁺中的5.0μg/mL本申请RANKL抗体或对照基准物(地诺单抗，用氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：38和39的重链和轻链制备)的孔中100秒，之后浸入含有HBS-EP⁺的孔中5分钟。在另一个含有HBS-EP⁺的孔中180秒，做出新的基线。之后将传感器浸入含有梯度稀释的人RANKL-his蛋白(内部制备，SEQ IDNO：43，起始浓度40nM，2倍梯度稀释)的HBS-EP⁺溶液中100秒，然后浸入基线孔中10分钟。最后将传感器在10mM甘氨酸(pH 1.5)中预浸泡3秒，然后浸入含流动缓冲液的孔中3秒，上述浸泡和浸入步骤重复三次。用Octet评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1Langmuir结合模型中。确定Ka、Kd和KD值，并总结在以下表2中。

表2.小鼠抗RANKL抗体结合亲和力测试

本申请的小鼠源RANKL抗体，包括B3D8、D1A1和B1A8，与人RANKL特异性结合，具有与对照基准物相当的结合亲和力，其中D1A1显示出最高的结合亲和力。

实施例3.小鼠抗RANKL单克隆抗体的结合活性

通过捕获ELISA确定小鼠RANKL抗体的结合活性。

简而言之，用PBS中的2.0μg/ml亲和纯化山羊抗小鼠IgG F(ab′)₂片段(JacksonImmuno Research，Cat#115-005-072，100μl/孔)包被96微孔板，4℃过夜。板用冲洗缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温20，PBST)冲洗一次，然后用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂奶粉的PBST)于37℃封闭2小时。再次洗板，用100μl/孔梯度稀释的RANKL抗体、对照基准物和阴性对照hIgG(静脉注射用人免疫球蛋白(pH 4)，华兰生物工程有限公司)(5倍梯度稀释于含2.5％脱脂奶粉的PBST，起始浓度为10000ng/ml)，于37℃孵育40分钟，然后洗涤4次。将含有捕获的RANKL抗体的板用生物素标记的人RANKL-Fc蛋白(内部制备，SEQ ID NO：40，22ng/mL于含2.5％脱脂奶粉的PBST，100μl/孔)37℃孵育40分钟，洗涤四次，与链霉亲和素结合的HRP(1∶10000稀释于PBST，Jackson Immuno Research，Cat#016-030-084，100μl/孔)37℃孵育40分钟。板终洗后，板与100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，Cat#TMB-S-002)室温孵育。在3-10分钟内用50μl/孔1M H₂SO₄中止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。用OD(450-630)值相对于抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC₅₀值。

结果如图1A和1B所示。结果表明，本申请的小鼠源RANKL抗体与人RANKL特异性结合。D1E3/B3D8/D1A1/B1A8/B4H5的最大吸光度与对照基准物相似或稍低，EC₅₀相似或稍高。特别地，D1E3和D1A1抗体显示出比对照基准物更低的EC₅₀值，说明它们更高效地与更多的人RANKL蛋白结合。

实施例4.小鼠RANKL抗体的竞争ELISA检测

4.1配体阻断ELISA

通过竞争性ELISA实验测定RANKL抗体阻断RANKL-RANK结合的能力。简而言之，用2.0μg/mL于PBS中的人RANK-Fc蛋白(内部制备，SEQ ID NO：41)包被96微孔板，100μl/孔，4℃孵育过夜。次日，板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％w/v吐温20，PBST)洗涤，再用含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，200μl/孔，于37℃孵育2小时。

本申请的RANKL抗体或对照，用生物素标记的人RANKL-Fc蛋白(内部制备，SEQ IDNO：40，14.67ng/mL于含2.5％w/v脱脂奶粉的PBST)5倍梯度稀释，起始浓度为20nM，并室温孵育40分钟。洗板后，抗体/RANKL-Fc混合物加入至RANK-Fc包被的板中，100μl/孔，于37℃孵育40分钟。用洗涤缓冲液洗板4次，加入100μl/孔链霉亲和素结合的HRP(1∶10000稀释于PBST缓冲液，Jackson Immuno Research Laboratories Inc.，Cat#016-030-084)，于37℃孵育40分钟。用清洗缓冲液再次洗板。最后，加入TMB，用1M H₂SO₄终止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长。用OD(450-630)值相对于抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值。

4.2对照基准物阻断ELISA

采用竞争ELISA检测测定RANKL抗体阻断对照基准物-人RANKL结合的能力。简而言之，将于PBS中的2μg/mL对照基准物地诺单抗包被于96孔微板，100μl/孔，于4℃孵育过夜。次日，用清洗缓冲液洗板，用200μl/孔含5％w/v脱脂奶粉的PBST 37℃封闭2小时。封闭时，用生物素标记的人RANKL-Fc蛋白(SEQ ID NO：40，17.6ng/mL，于含2.5％w/v脱脂奶粉的PBST中)稀释本申请的RANKL抗体或对照(起始浓度80.0nM，4倍梯度稀释)，室温孵育40分钟。洗涤板后，将抗体/RANKL-Fc-生物素混合物加入到对照基准物包被的板中，100μl/孔。37℃孵育40分钟后，板用洗涤缓冲液洗涤4次。然后向板中加入100μl过氧化物酶链霉亲和素(1∶5000稀释于PBST缓冲液，Jackson Immunoresearch，Cat#016-030-084)，37℃孵育40分钟。板用洗涤缓冲液再洗涤一次。最后，加入TMB，用1M H₂SO₄终止反应。在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于TMB，630nm作为参照波长，用OD(450-630)值对应于抗体浓度做图。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值。

两个竞争ELISA检测的结果如图2A-2B和3A-3B所示。

从图2A-2B可以看出，本申请的RANKL抗体能够阻断人RANK-人RANKL相互作用。与对照基准物相比，D1E3和D1A1抗体具有更低的IC₅₀值，说明它们更好的阻断活性。

图3A和3B示出，一些本申请的抗体能够阻断人RANKL-对照基准物相互作用，说明它们与对照基准物结合相同或相似的表位。B4H5抗体没有展示出阻断活性，其可能结合不同的表位。

实施例5.小鼠源RANKL抗体的基于细胞的功能检测

RAW264.7细胞(小鼠单核-巨噬白血病细胞)可经RANKL诱导分化破骨细胞，这类细胞可用于测试RANKL抗体抑制RANKL与细胞表面RANK结合的能力。

简而言之，从细胞培养瓶中收集处于对数生长期的RAW 264.7细胞(中国科学院细胞库，Cat#SCSP-5036)，在补充有10％FBS(Gibco#10091148)的α-MEM培养基中重悬。用含有2.0x 10³个RAW 264.7细胞的150μl培养基在96孔板上铺板，板在CO₂孵育器中于37℃孵育1小时。用补充有10％FBS的α-MEM培养基将重组人RANKL-his蛋白(R&D，Cat#6449-TEC-010)稀释为240ng/ml。在上述制备的含有RANKL-his蛋白的培养基中的连续稀释的抗体(最终浓度为16.67nM、6.67nM、2.67nM、1.33nM、0.67nM、0.33nM、0.17nM、0.067nM和0.0267nM)，加入到含有RAW 264.7细胞的板中，每孔50μl，在CO₂孵育器中于37℃孵育4天。孵育后，移除上清液，用50μl乙醇丙酮(50∶50，v/v)对96孔板中培养的细胞固定1分钟。板以300g离心3分钟，轻柔地移除上清液。将板在室温干燥10分钟，加入100μl pNPP显色液(Sigma，Cat#S0942-200TAB，用于破骨细胞染色)，于37℃孵育30分钟。孵育后，用50μl的0.5N NaOH终止反应，于405nm读取吸光度。用Graphpad Prism软件分析数据，得出IC₅₀值。

功能检测的结果如图4A-4D所示。

所有RANKL抗体均在一定程度上阻断RANKL与细胞表面RANK的结合。图4A和4C示出，B1A8和D1E3具有与对照基准物很接近的阻断力，尽管EC₅₀值稍高。

实施例6.嵌合抗体的制备和特征

对小鼠源RANKL单克隆抗体的重链和轻链可变区进行测序，序列ID号总结在表1中。

RANKL小鼠源单克隆抗体的重链和轻链可变区分别以在可读框内的形式克隆至人IgG2重链(SEQ ID NO：35)和人κ轻链恒定区(SEQ ID NO：37)，其中可变区的C端与各自恒定区的N端相连。

将包含编码与人IgG2重链恒定区相连的重链可变区的核苷酸的载体，和含有编码与人κ轻链恒定区相连的轻链可变区的核苷酸的载体，以轻/重链构建体比为1.1∶1瞬时转染到50ml含有1mg/mL PEI的293F悬浮细胞培养物中。

在摇瓶中6天后，收集细胞上清液，旋转离心使细胞成团，然后从上述细胞上清液中纯化出嵌合抗体。遵循上述实施例的操作流程，对纯化的抗体进行捕获ELISA、竞争ELISA实验以及Octet亲和力测试。

结果如表3、图5A-5D、图6和图7所示。

数据显示，嵌合D1A1抗体与其亲本小鼠源抗体以及对照基准物相比，具有相似的人RANKL结合亲和力/能力。

表3.嵌合抗体的结合亲和力

实施例7.小鼠源RANKL单克隆抗体D1A1的人源化

选择小鼠源RANKL抗体D1A1进行人源化和后续的研究。该小鼠抗体的人源化通过领域内成熟的CDR移植技术进行，如下文详细介绍的。

为给小鼠源抗体D1A1的人源化选择合适的受体框架，将小鼠D1A1的轻链和重链可变区序列与人免疫球蛋白基因数据库进行比对。选出与小鼠源D1A1同源性最高的人种系，作为人源化的受体框架。将小鼠源抗体重链/轻链可变区CDR插入到选中的框架中，对框架中的残基进一步突变以获得更多候选的重链/轻链可变区。一共得到6个示例性的人源化D1A1抗体(即huD1A1-V1至huD1A1-V6)，其重链/轻链可变区序列ID列于表1。

将包含编码与人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：36)相连的人源化D1A1重链可变区的核苷酸的载体，和包含编码与人κ轻链恒定区(SEQ ID NO：37)相连的人源化D1A1轻链可变区的核苷酸的载体，以轻/重链构建体比为60％：40％瞬时转染到50ml含有1mg/mLPEI的的293F悬浮细胞培养物中。

实施例8.人源化D1A1抗体的表征

摇瓶中6天后，收集含有人源化抗体的细胞上清液，遵循上述的操作步骤，通过Octet亲和力测试测定其与人RANKL的结合亲和力。嵌合抗体在测试时是在HBS-EP⁺中，浓度为5μg/ml。得出Ka、Kd和K_D值，并总结在表4中。

结果表明，所有的人源化D1A1抗体均具有与嵌合抗体相似的人RANKL结合亲和力。

表4.人源化D1A1 mAb的结合亲和力

如上所述纯化人源化抗体huD1A1-V2和huD1A1-V5，遵循上述实施例的操作步骤以及以下所述的，通过Biacore、结合捕获ELISA、蛋白热迁移实验、竞争ELISA以及基于细胞的功能检测，测试其与人以及猴RANKL的结合亲和力/能力以及其他功能活性。

用Biacore T200系统(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)对人源化抗体huD1A1-V2和huD1A1-V5进行亲和力和结合动力学表征。简而言之，使用Biacore提供的标准胺偶联试剂盒，将山羊抗人IgG(GE healthcare，Cat#BR100839，人抗体捕获试剂盒)经伯胺共价连接到CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被芯片，GE healthcare，Cat#BR10030)。生物传感器表面的未反应基团用乙醇胺阻断。然后使纯化的RANKL抗体以2.0μg/mL的浓度流经芯片，流速为10μL/min。然后使重组人RANKL-his(内部制备，SEQ ID NO：43)或猴RANKL-his蛋白(内部制备，SEQ ID NO：42)，起始浓度为80nM，2倍稀释于HBS-EP-缓冲液(Biacore提供)，以30μL/min的流速流经芯片。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用BIAcore评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1Langmuir结合模型中。确定K_D值，并总结在下表6中。

为确定人源化抗体的热稳定性，使用GloMelt^TM热迁移蛋白稳定性试剂盒(Biotium，Cat#33022-T)，通过蛋白热迁移法测定熔融温度(Tm)。简而言之，使GloMelt^TM染料融化至室温。将装有染料的小瓶进行涡旋振荡和离心。然后，通过向95μL PBS中加入5μL200x染料，制备10x染料。加入2μL 10x染料和10μg人源化抗体，加入PBS至20μL总反应体积。简单地旋转含有染料和抗体的管子，并置于实时PCR热循环仪(Roche，LightCycler 480II)中，将其设置为具有表5参数的熔融曲线程序。

表5.熔融曲线程序参数

大概步骤	温度	升温速率	保持时间
				初始保持	25℃	NA	30s
熔融曲线	25-99℃	0.1℃/s	NA

对于捕获ELISA，用2μg/ml山羊抗人IgG(亲和纯化山羊抗人IgG，F(ab′)₂片段特异，Jackson Immunoresearch，Cat#109-005-097)代替亲和纯化Fcγ片段特异的山羊抗小鼠IgG包被96孔微孔板，100μl/孔。

结果如表6、表10、图8-10、图11A-11C和图12A-12C所示。

表6.人源化mAb huD1A1-V2和huD1A1-V5的结合亲和力

数据显示，huD1A1-V2和huD1A1-V5示出与嵌合D1A1抗体相当的体外活性。尤其是在Biacore测试中，嵌合的和人源化的D1A1抗体显示出较高的、与地诺单抗相当的结合亲和力，并在ELISA中显示出相当的人RANKL结合能力。如图9和图11A-11C所示，huD1A1-V2和huD1A1-V5以与对照基准物相当的活性阻断了人RANKL与RANK的结合。

尽管本申请已经结合一个或多个实施例进行了阐述，应当理解的是，本申请不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可选方案、修改和等同物。所有本文中引用的参考文献均通过引用的方式全文并入。

本申请中的序列总结如下。

序列表

<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司

<120> 结合RANKL的抗体及其用途

<130> 55532 00056

<150> US 62/947,541

<151> 2019-12-13

<160> 48

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合以及人源化的D1A1的VH CDR1

<400> 1

Asn Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8的、小鼠和嵌合的B3D8VH CDR1

<400> 2

Arg Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VH CDR1

<400> 3

Arg Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VH CDR1

<400> 4

Ser Gly Tyr Ser Trp His

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合以及人源化的D1A1的VH CDR2

<400> 5

Gly Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8的VH CDR2

<400> 6

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B3D8的VH CDR2

<400> 7

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VH CDR2

<400> 8

Gly Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VH CDR2

<400> 9

Tyr Ile His Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合以及人源化的D1A1的VH CDR3

<400> 10

Arg Asp Tyr Gly Asp Val Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8、小鼠和嵌合的B3D8的VH CDR3

<400> 11

Arg Asn Phe Ile Thr Ser Ala Thr Asp Cys Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VH CDR3

<400> 12

Arg Asp Tyr Gly Asp Val Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VH CDR3

<400> 13

Ser Gly Pro Ser Thr Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合以及人源化的D1A1的VL CDR1

<400> 14

Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ser Ile Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8、小鼠和嵌合的B3D8的VL CDR1

<400> 15

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VL CDR1

<400> 16

Lys Ala Ser Gln Gly Val Arg Ile Ala Val Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VL CDR1

<400> 17

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala Val Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合以及人源化的D1A1、小鼠和嵌合的D1E3的VL CDR2

<400> 18

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8、小鼠和嵌合的B3D8的VL CDR2

<400> 19

Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VL CDR2

<400> 20

Trp Ala Ser Ile Arg Asp Thr

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合以及人源化的D1A1的VL CDR3

<400> 21

Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8、小鼠和嵌合的B3D8的VL CDR3

<400> 22

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VL CDR3

<400> 23

Gln Gln His His Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VL CDR3

<400> 24

Gln His Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 25

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1A1的VH

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Asp Val Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D1A1-V1 - huB1H2-V6的VH

<220>

<221> 其他特征

<222> (49)..(49)

<223> Xaa可以是Ala或Ser

<220>

<221> 其他特征

<222> (76)..(76)

<223> Xaa可以是Arg或Lys

<220>

<221> 其他特征

<222> (114)..(114)

<223> Xaa可以是Thr或Lys

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Xaa Gly Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Xaa Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Asp Val Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Xaa Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8、小鼠和嵌合的B3D8的VH

<220>

<221> 其他特征

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可以是Pro或Ser

<220>

<221> 其他特征

<222> (65)..(65)

<223> Xaa可以是Gln或Lys

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Xaa Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asn Phe Ile Thr Ser Ala Thr Asp Cys Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VH

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ile Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Asp Val Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VH

<400> 29

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Asp Tyr Ile His Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Pro Ser Thr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1A1的VL

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu D1A1-V1 - hu D1A1-V6的VL

<220>

<221> 其他特征

<222> (43)..(43)

<223> Xaa可以是任何天然氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (83)..(83)

<223> Xaa可以是任何天然氨基酸

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Xaa Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的B1A8、小鼠和嵌合的B3D8的VL

<400> 32

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ile Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1E3的VL

<400> 33

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Arg Ile Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠B4H5的VL

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Asp Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln His Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体的重链恒定区

<400> 35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 36

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体的重链恒定区

<400> 36

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合的和人源化的抗体的轻链恒定区

<400> 37

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 38

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 地诺单抗的重链

<400> 38

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 39

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 地诺单抗的轻链

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 40

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人RANKL-Fc

<400> 40

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu

225 230 235 240

Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys

245 250 255

Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile

260 265 270

Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg

275 280 285

Gly Trp Gly Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile

290 295 300

Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg

305 310 315 320

His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met

325 330 335

Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu

340 345 350

Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His

355 360 365

Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu

370 375 380

Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln

385 390 395 400

Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp

405 410

<210> 41

<211> 415

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人RANK-Fc

<400> 41

Ile Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg

1 5 10 15

Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr

20 25 30

Thr Thr Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu

35 40 45

Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp

50 55 60

Thr Gly Lys Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro

65 70 75 80

Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser Gln Asp Cys Glu

85 90 95

Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln His

100 105 110

Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly

115 120 125

Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr

130 135 140

Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg Val Glu His His Gly Thr Glu Lys

145 150 155 160

Ser Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn

165 170 175

Glu Pro His Val Tyr Leu Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

180 185 190

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

195 200 205

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

210 215 220

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

225 230 235 240

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

245 250 255

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

260 265 270

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

275 280 285

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

290 295 300

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

305 310 315 320

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

325 330 335

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

340 345 350

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

355 360 365

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

370 375 380

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

385 390 395 400

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

405 410 415

<210> 42

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猴RANKL-his

<400> 42

Met His His His His His His His His His His Gly Ser Gln His Ile

1 5 10 15

Arg Ala Glu Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys

20 25 30

Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala

35 40 45

Thr Asp Ile Pro Thr Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr

50 55 60

His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly

65 70 75 80

Lys Leu Ile Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile

85 90 95

Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu

100 105 110

Gln Leu Met Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser

115 120 125

His Thr Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser

130 135 140

Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg

145 150 155 160

Ser Gly Glu Glu Ile Ser Val Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp

165 170 175

Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile

180 185 190

Asp

<210> 43

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人RANKL-his

<400> 43

Met His His His His His His His His His His Gly Ser Gln His Ile

1 5 10 15

Arg Ala Glu Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys

20 25 30

Arg Ser Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala

35 40 45

Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr

50 55 60

His Asp Arg Gly Trp Gly Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly

65 70 75 80

Lys Leu Ile Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile

85 90 95

Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu

100 105 110

Gln Leu Met Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser

115 120 125

His Thr Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser

130 135 140

Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg

145 150 155 160

Ser Gly Glu Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp

165 170 175

Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile

180 185 190

Asp

<210> 44

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1A1的VH

<400> 44

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagt ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttccgt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagga attagtagtg gtggtactta cacctactat 180

ccagacactg tgaagggacg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgttc 240

ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagaagggac 300

tatggtgatg tctacgaatg gtacttcgat gtctggggca cagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 45

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合的D1A1的VL

<400> 45

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgaga acttctattg cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaacctact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcaacaa cattatagtt ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 46

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体的重链恒定区

<400> 46

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctgag 60

agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960

tccctgtctc cgggtaaatg a 981

<210> 47

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体的重链恒定区

<400> 47

gccagcacaa agggcccttc cgtgtttccc ctggccccct gcagcaggag cacctctgag 60

tccaccgccg ccctgggctg tctggtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgagc 120

tggaattccg gcgccctgac atccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc 180

ggcctgtaca gcctgagctc cgtggtgaca gtgccttcct cctccctggg caccaagacc 240

tacacatgta atgtggatca caagcccagc aacacaaagg tggataagag agtggagtcc 300

aagtacggcc ctccttgccc tccctgtcct gccccagagt tcctgggcgg cccctctgtg 360

ttcctgttcc cccctaagcc caaggacaca ctgatgatct ccaggacccc tgaggtgacc 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag cccagagagg agcagtttaa ttccacatac 540

agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgtaaggtga gcaacaaggg cctgccttcc tccatcgaga agacaatcag caaggccaag 660

ggccagccta gggagcccca ggtgtacaca ctgcctccca gccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ctagcgacat cgccgtggag 780

tgggagtcca acggccagcc cgagaataac tacaagacaa caccccccgt gctggattcc 840

gatggcagct tctttctgta ctccaggctg accgtggata agagcaggtg gcaggagggc 900

aatgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 960

ctgtccctga gcctgggcaa gtga 984

<210> 48

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合的和人源化的抗体的轻链恒定区

<400> 48

cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttga 324

Claims (15)

1.一种与核因子κ-B受体活化因子配体(RANKL)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含VH-CDR1区、VH-CDR2区和VH-CDR3区，轻链可变区包含VL-CDR1区、VL-CDR2区和VL-CDR3区，其中VH-CDR1区、VH-CDR2区、VH-CDR3区、VL-CDR1区、VL-CDR2区和VL-CDR3区分别包含如(1)SEQ ID NOs：1、5、10、14、18和21；(2)SEQ ID NOs：2、6、11、15、19和22；(3)SEQ ID NOs：2、7、11、15、19和22；(4)SEQ IDNOs：3、8、12、16、18和23；或(5)SEQ ID NOs：4、9、13、17、20和24所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含SEQID NOs：25、26(X1＝A、X2＝R、X3＝T；X1＝S、X2＝K、X3＝K；或X1＝A、X2＝K、X3＝K)、27(X1＝P、X2＝Q；或X1＝S、X2＝K)、28或29所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中轻链可变区包含SEQID NOs：30、31(X1＝A、X2＝I；或X1＝S、X2＝L)、32、33或34所示的氨基酸序列。

4.如权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：25和30；(2)SEQ ID NOs：26(X1＝A、X2＝R、X3＝T；X1＝S、X2＝K、X3＝K；或X1＝A、X2＝K、X3＝K)和31(X1＝A、X2＝I)；(3)SEQ ID NOs：26(X1＝A、X2＝R、X3＝T；X1＝S、X2＝K、X3＝K；或X1＝A、X2＝K、X3＝K)和31(X1＝S、X2＝L)；(4)SEQ IDNOs：27(X1＝P、X2＝Q；或X1＝S、X2＝K)和32；(5)SEQ ID NOs：28和33；或(6)SEQ ID NOs：29和34所示的氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含与重链可变区相连的重链恒定区，以及与轻链可变区相连的轻链恒定区，其中重链恒定区包含SEQ ID NOs：35或36所示的氨基酸序列，轻链恒定区包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人或猴RANKL结合；和(b)阻断RANKL-RANK相互作用。

7.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为小鼠源、人源、嵌合的或人源化的抗体。

8.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4亚型。

9.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。

10.如权利要求9所述的药物组合物，还包含抗肿瘤剂或抗骨质流失剂。

11.权利要求9所述的药物组合物在制备一种治疗受试者中与RANKL表达升高相关的疾病的药物中的用途，包括向该受试者施用权利要求11所述的药物组合物。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述疾病为骨质流失。

13.如权利要求12所述的用途，其中骨质流失为激素治疗中发生的骨质流失、绝经后骨质疏松、骨转移癌中发生的骨质流失、或多发性骨髓瘤中发生的骨质流失。

14.如权利要求11所述的用途，其中所述疾病为肿瘤。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述肿瘤为乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤和/或骨转移癌。

Images