JP5832559B2 - ｅｘｖｉｖｏにおける加速された抗体進化による抗ＦＮ１４モノクローナル抗体の生成 - Google Patents

ｅｘｖｉｖｏにおける加速された抗体進化による抗ＦＮ１４モノクローナル抗体の生成 Download PDF

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Description

配列表
本出願と関連する配列表は、紙原稿ではなく、テキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、９８００８７＿４０３ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約６８ＫＢであり、２０１２年３月９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
技術分野
本発明は一般に、抗ＦＮ１４抗体に関する。特に、本明細書で記載される抗ＦＮ１４抗体は、ＦＮ１４の発現と関連する多様ながんおよび炎症性疾患などの疾患の処置に有用である。
ＣＤ２５５およびＡｐｏ３Ｌとも呼ばれているＴＷＥＡＫタンパク質（遺伝子名：ＴＮＦＳＦ１２）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、エリスロポエチンプローブとハイブリダイズするＲＮＡについてのスクリーニングにおいて単離された（非特許文献１）。マウスペプチドとヒトペプチドとは、受容体結合ドメインにおける９３％のアミノ酸同一性を含め、非常に高い程度の保存を有する。細胞から効率的に分泌されることが示されているＴＷＥＡＫは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、リンパ節、胸腺、虫垂、および末梢血リンパ球を含め、多くの組織で豊富に発現する。
ＴＷＥＡＫは、多くの生物学的過程に関与している。例えば、ＩＦＮおよびＴＷＥＡＫで処理したＨＴ２９細胞は、アポトーシスを起こすことが示されるが、ＴＷＥＡＫがアポトーシスを誘導する能力は弱く、感受性であるのは少数の細胞型だけである（非特許文献１）。これに対し、ＴＷＥＡＫはまた、ＶＥＧＦに依存しない経路において、血管新生および内皮細胞の増殖を誘導することも示されている（非特許文献２）。星状細胞は、ＴＷＥＡＫにより特異的に結合および刺激される。ＴＷＥＡＫは、炎症を起こした脳に浸潤して、星状細胞の挙動に影響を与えうる。ＴＷＥＡＫに曝露された星状細胞は、高レベルのＩＬ−６およびＩＬ−８を分泌する他、ＩＣＡＭ−１の発現を上方制御する（非特許文献３）。
ＴＷＥＡＫＲおよびＣＤ２６６としても公知のＦＮ１４（遺伝子名：ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）は、ＮＦ−ｋＢ経路を含めた多数の細胞内のシグナル伝達経路と連関する誘導性のＴＷＥＡＫ受容体である。ＦＮ１４は、ＦＧＦ処理、ウシ血清処理、およびホルボールエステル処理により誘導され、心臓組織、腎臓組織、肺組織、皮膚組織、骨格筋組織、卵巣組織、および膵臓組織の他、肝細胞癌モジュールおよび他のがん細胞系では比較的高いレベルで発現し、正常な肝臓組織ではより低レベルで発現することが示されている。ＴＷＥＡＫ−ＦＮ１４シグナル伝達経路は、組織の修復において役割を果たし、がん、慢性自己免疫疾患、および急性虚血性脳卒中に関与していると考えられる（Ｗｉｎｋｌｅｓ， Ｊ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、７巻：４１１頁（２００８年））。
ＦＮ１４は、細胞の細胞外マトリックスへの接着を減殺し、血清により刺激される成長および遊走を低減する、増殖因子制御型の前初期応答遺伝子である（Ｍｅｉｇｈａｎ−Ｍａｎｔｈａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４巻：３３１６６〜３３１７６頁（１９９９年））。ＦＮ１４は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのうちで最小のメンバーである。このスーパーファミリーのタンパク質は、２つの亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）のうちの１つに属するＩ型膜貫通型タンパク質である。第１亜群のタンパク質は、アポトーシス経路を活性化させる細胞因子と相互作用するタンパク質のうちの細胞内部分にデスドメインモチーフを含有する（Ｐ．Ｗ． Ｄｅｍｐｓｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ、２００３年、１４巻：１９３〜２０９頁）。ＦＮ１４など、第２亜群のタンパク質は、デスドメインを欠くが、増殖機能、分化機能、および、ある特定の細胞型では、免疫制御機能を含めた多様な応答を制御するＴＮＦ受容体関連因子および他の細胞因子と相互作用するドメインを所有する（Ｂｒａｄｌｅｙ ＪＲおよびＰｏｂｅｒ ＪＳ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００１年、２０巻：６４８２〜９１頁）。ＦＮ１４は、高度に保存された５３アミノ酸の細胞外ドメイン（マウス配列とヒト配列との間で９２．４％の同一性）を有し、全ての腫瘍型ではないが多くの腫瘍型において過剰発現し、治療対象の標的となっている（Ｆｅｎｇ， Ｓ．Ｌ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１５６巻、１２５３〜１２６１頁（２０００年）；Ｈａｎ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６２巻、２８９０〜２８９６頁（２００２年）；Ｔｒａｎ Ｎ．Ｌ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１６２巻、１３１３〜１３２１頁（２００３年）；Ｗａｔｔｓ Ｇ．Ｓ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１２１巻、２１３２〜２１３９頁（２００７年）；Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６巻、７２５〜７３４頁（２００８年））。
Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９７年）２７２巻：３２４０１〜３２４１０頁 Ｌｙｎｃｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９９年）２７４巻：８４５５〜８４５９頁 Ｓａａｓら、ＧＬＩＡ（２０００年）３２巻：１０２〜１０７頁
ある特定の実施形態では、本開示に従い、（ａ）配列番号７９、９２、および９３のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；（ｂ）配列番号８６、３９、および９４のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片が提供される。
ある特定の実施形態では、（ａ）に従う重鎖可変領域のＶＨＣＤＲ２が、配列番号８２を含む。ある特定の実施形態では、（ａ）に従う重鎖可変領域が、配列番号８４を含む。ある特定の実施形態では、（ａ）に従う重鎖可変領域のＶＨＣＤＲ２が、配列番号８１を含む。ある特定の実施形態では、（ａ）に従う重鎖可変領域のＶＨＣＤＲ３が、配列番号８３を含む。ある特定の実施形態では、（ａ）に従う重鎖可変領域のＶＨＣＤＲ３が、配列番号７６を含む。ある特定の実施形態では、（ｂ）に従う軽鎖可変領域のＶＬＣＤＲ３が、配列番号４１を含む。ある特定の実施形態では、（ｂ）に従う軽鎖可変領域のＶＬＣＤＲ３が、配列番号３６を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む。
他のある特定の実施形態によれば、上記の単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。さらなるある特定の実施形態では、軽鎖可変領域が、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号９０に示されるアミノ酸を含む。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体が、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）から選択される。本発明の他のある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、および完全抗体から選択される。他のある特定の実施形態では、抗体が、薬物または毒素とコンジュゲートしている。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される単離抗体が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む。さらなるある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較して抗体がＡＤＣＣ活性を増強させているように、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている。
本発明の他のある特定の実施形態に従い、配列番号６７、６６、または６５に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片が提供される。さらなるある特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含み、抗体が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。他のある特定のさらなる実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含み、抗体が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。他のある特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、抗体が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。記載されたばかりの実施形態に関するある特定の実施形態では、抗体が、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーから選択される。他のある特定の実施形態では、抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、および完全抗体から選択される。他のある特定の実施形態では、抗体が、薬物または毒素とコンジュゲートしている。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される単離抗体が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較して抗体がＡＤＣＣ活性を増強させているように、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている。
また、本明細書で記載される本発明のある特定の実施形態に従い、配列番号２５、２４、または２３に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片も提供される。さらなるある特定の実施形態では、軽鎖可変領域が配列番号２５を含み、抗体が、配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。他のある特定のさらなる実施形態では、軽鎖可変領域が配列番号２４を含み、抗体が、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。他のある特定のさらなる実施形態では、軽鎖可変領域が配列番号２３を含み、抗体が、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。他のある特定のさらなる実施形態では、抗体が、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーから選択される。他のある特定のさらなる実施形態では、抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、および完全抗体から選択される。
ある特定の実施形態では、抗体が、薬物または毒素とコンジュゲートしている。ある特定の実施形態では、抗体が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む。さらなるある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較して抗体がＡＤＣＣ活性を増強させているように、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている。
本発明の別の実施形態に転じると、生理学的に許容される担体と、治療有効量の、上記の単離抗体またはその抗原結合断片とを含む、組成物が提供される。他のある特定の実施形態に従い、ＦＮ１４の発現と関連するがんを有する患者を処置するための方法であって、患者に生理学的に許容される担体と、治療有効量の、上記の単離抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を投与し、これにより、ＦＮ１４の発現と関連するがんを処置するステップを含む、方法が提供される。さらなるある特定の実施形態では、がんが、黒色腫、唾液腺癌（ｓａｌｉｖａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫から選択される。
他のある特定の実施形態では、ＦＮ１４の発現と関連するがんの転移の発生を防止するか、またはその発生の可能性を低減するための方法であって、生理学的に許容される担体と、治療有効量の、上記の単離抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を、がんを有する患者に投与し、これにより、ＦＮ１４の発現と関連するがんの転移の発生を防止するか、またはその発生の可能性を低減するステップを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、がんが、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫から選択される。
本開示に従うある特定の実施形態では、（ａ）配列番号７７、８１、および７６のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８６、３９、および４１のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号７９、８１、および７６のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８６、３９、および３６のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号７９、８１、および８３のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８６、３９、および４１のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｄ）配列番号７９、８２、および８４のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８６、３９、および４１のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片が提供される。
一実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７７、８１、および７６のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および４１のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７７、８１、および７６のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７７、８１、および７６のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７９、８１、および７６のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および３６のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および３６のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７９、８１、および７６に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７９、８１、および８３のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および４１のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および４１に示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７９、８１、および８３に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７９、８２、および８４のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および４１のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号８６、３９、および４１に示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の重鎖可変領域が、配列番号７９、８２、および８４に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される抗体が、ヒト化されている。この点で、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の軽鎖可変領域が、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体を、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、またはミニボディーなどであるがこれらに限定されない特定の形態で提供することができる。具体的な一実施形態では、本開示の抗体が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片である。ある特定の実施形態では、抗体が完全抗体である。ある特定の実施形態では、抗体が、薬物または毒素とコンジュゲートしている。この点で、本明細書において使用が想定される特定の一毒素はサポリンである。
別の実施形態では、本明細書で記載される抗体が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む。この点で、ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較して抗体がＡＤＣＣ活性を増強させているように、ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている。
別の実施形態に転じると、配列番号６５〜６８に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片が提供される。一実施形態では、本明細書で記載される抗体の重鎖可変領域が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、抗体が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、本明細書で記載される抗体の重鎖可変領域が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、抗体が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、本明細書で記載される抗体が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、抗体が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載される抗体が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、本開示の抗体が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、抗体が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含み、他のある特定の関連する実施形態では、軽鎖可変領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本開示の抗体が、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか、または軽鎖可変領域が、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本開示の抗体が、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーから選択される。さらなる実施形態では、抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片である。ある特定の実施形態では、抗体が完全抗体である。さらなるある特定の実施形態では、本開示の抗体が、サポリンなど、薬物または毒素とコンジュゲートしている。
別の実施形態では、配列番号２３〜２７に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片が提供される。一実施形態では、ヒトＦＮ１４に結合する抗体が、配列番号２３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
別の実施形態では、ヒトＦＮ１４に結合する抗体が、配列番号２４を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
別の実施形態では、ヒトＦＮ１４に結合する抗体が、配列番号２５を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
さらに別の実施形態では、ヒトＦＮ１４に結合する抗体が、配列番号２６を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
別の実施形態では、ヒトＦＮ１４に結合する抗体が、配列番号２７を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
他のある特定の実施形態に従い、本開示は、生理学的に許容される担体と、治療有効量の、本明細書で記載される、ＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片とを含む、組成物を提供する。
他の実施形態では、本開示は、ＦＮ１４の発現と関連するがんを有する患者を処置するための方法であって、患者に、生理学的に許容される担体と、治療有効量の、本明細書で記載される、ＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片とを含むこのような組成物を投与し、これにより、ＦＮ１４の発現と関連するがんを処置するステップを含む、方法を提供する。
別の実施形態では、ＦＮ１４の発現と関連するがんの転移の発生を防止するか、またはその発生の可能性を低減するための方法であって、がんを有する患者に、生理学的に許容される担体と、治療有効量の、本明細書で記載される、ＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を投与し、これにより、ＦＮ１４の発現と関連するがんの転移の発生を防止するか、またはその発生の可能性を低減するステップを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体により処置されうるがんには、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫のうちの１つまたは複数が含まれるがこれらに限定されない。
以下の詳細な説明および付属の図面を参照すれば、本明細書で記載される本発明のこれらの態様および実施形態ならびに他の態様および実施形態は明らかとなろう。本明細書で言及されており、かつ／または出願データシートで列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、各々が個別に組み込まれたと仮定した場合と同様に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。必要な場合は、多様な特許、出願、および、刊行物の概念を用いて、なおさらなる実施形態をもたらすために、本発明の態様および実施形態を改変することができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）配列番号７９、９２、および９３のそれぞれに示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号８６、３９、および９４のそれぞれに示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
上記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の上記ＶＨＣＤＲ２が、配列番号８２を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目３）
上記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の上記ＶＨＣＤＲ３が、配列番号８４を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目４）
上記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の上記ＶＨＣＤＲ２が、配列番号８１を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目５）
上記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の上記ＶＨＣＤＲ３が、配列番号８３を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目６）
上記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の上記ＶＨＣＤＲ３が、配列番号７６を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目７）
上記（ｂ）にしたがう軽鎖可変領域の上記ＶＬＣＤＲ３が、配列番号４１を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目８）
上記（ｂ）にしたがう軽鎖可変領域の上記ＶＬＣＤＲ３が、配列番号３６を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目９）
上記重鎖可変領域が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目１０）
上記軽鎖可変領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目１１）
上記重鎖可変領域が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目１２）
ヒト化されている、項目１に記載の単離抗体。
（項目１３）
上記軽鎖可変領域が、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
上記重鎖可変領域が、配列番号９０に示されるアミノ酸を含む、項目１２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１５）
単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーからなる群より選択される、項目１に記載の単離抗体。
（項目１６）
Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、および完全抗体からなる群より選択される、項目１に記載の単離抗体。
（項目１７）
薬物または毒素とコンジュゲートしている、項目１に記載の単離抗体。
（項目１８）
ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、項目１に記載の単離抗体。
（項目１９）
上記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較してＡＤＣＣ活性を増強させているように、上記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている、項目１８に記載の単離抗体。
（項目２０）
配列番号６７、６６、または６５に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目２１）
上記重鎖可変領域が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含み、上記抗体が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２２）
上記重鎖可変領域が、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含み、上記抗体が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２３）
上記重鎖可変領域が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、上記抗体が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２４）
単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーからなる群より選択される、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２５）
Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、および完全抗体からなる群より選択される、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２６）
薬物または毒素とコンジュゲートしている、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２７）
ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、項目２０に記載の単離抗体。
（項目２８）
上記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較してＡＤＣＣ活性を増強させているように、上記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている、項目２７に記載の単離抗体。
（項目２９）
配列番号２５、２４、または２３に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目３０）
上記軽鎖可変領域が配列番号２５を含み、上記抗体が、配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３１）
上記軽鎖可変領域が配列番号２４を含み、上記抗体が、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３２）
上記軽鎖可変領域が配列番号２３を含み、上記抗体が、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３３）
単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーからなる群より選択される、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３４）
Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、および完全抗体からなる群より選択される、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３５）
薬物または毒素とコンジュゲートしている、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３６）
ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、項目２９に記載の単離抗体。
（項目３７）
上記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較してＡＤＣＣ活性を増強させているように、上記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている、項目３６に記載の単離抗体。
（項目３８）
生理学的に許容される担体と、治療有効量の、項目１から３７のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片とを含む、組成物。
（項目３９）
ＦＮ１４の発現と関連するがんを有する患者を処置するための方法であって、上記患者に項目３８に記載の組成物を投与し、これにより、上記ＦＮ１４の発現と関連するがんを処置するステップを含む、方法。
（項目４０）
上記がんが、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫からなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ＦＮ１４の発現と関連するがんの転移の発生を防止するか、またはその発生の可能性を低減するための方法であって、項目３８に記載の組成物を、上記がんを有する患者に投与し、これにより、上記ＦＮ１４の発現と関連するがんの転移を防止するステップを含む、方法。
（項目４２）
上記がんが、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
図１。ＤＴＬａｃＯ細胞において加速されたクローンの多様化速度。図１Ａは、ＰｏｌｙＬａｃＯをΨＶアレイ内に挿入し、再配列して発現させたＩｇλ遺伝子座（上図）およびＩｇＨ遺伝子座（下図）の概略図である。矢印は、プロモーターを指し示す。図１Ｂは、３つの代表的なクローンＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタントについてのｓＩｇＭ喪失アッセイによるドットプロットである。各パネルに各培養物中のｓＩｇＭ−細胞の割合を示す。図１Ｃは、ｓＩｇＭ喪失アッセイについてのプロットの概要である。各ドットは、トランスフェクションの３週間後に解析した１つのクローントランスフェクタント中のｓＩｇＭ−細胞の百分率を表す。解析された細胞は、対照のＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λ ＧＦＰ−ＬａｃＩトランスフェクタント（ｎ＝２７）、ＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λ ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタント（ｎ＝１６）、およびＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタント（ｎ＝２０）であった。下方には、ＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λ ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタントおよびＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタントの、対照のＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λ ＧＦＰ−ＬａｃＩ細胞と比べた、ｓＩｇＭ−細胞の割合のメジアンおよびｓＩｇＭ喪失の増大倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）のメジアンを示す。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図２。ＤＴＬａｃＯ細胞から選択される高アフィニティーの抗ＦＮ１４ｍＡｂ。図２Ａは、逐次選択されたＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１集団の、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ）に対する結合プロファイルのヒストグラムである。示される逐次選択ラウンドにある集団の呼称をピークの上方に示す（Ｐ０〜Ｐ１７）。図２Ｂは、ＦＮ１４結合亜集団であるＦＳ２４の飽和結合反応速度を示すグラフである。図２Ｃは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、ＦＮ１４を発現させる黒色腫系列（Ａ３７５）およびＦＮ１４を発現させないＴ細胞白血病系列（Ｊｕｒｋａｔ）との飽和結合反応速度を示すグラフである。見かけのＫＤ＝０．２１ｎＭである。図２Ｄは、ｍＡｂであるＦＳ２４の、がん系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌；ＨＣＣ３８乳管癌；Ａ２５３唾液腺類表皮癌；Ａ３７５黒色腫；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病（ＦＮ１４を発現させない）との結合についてのヒストグラムである。ＦＳ２４結合は、塗りつぶしていない各曲線に示し、二次抗体単独は、塗りつぶした各曲線に示す。図２Ｅは、ｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照が標的とするＡ３７５黒色腫細胞によるＩＬ８分泌の誘導を示すグラフである。図２Ｆは、ｒｈＦＮ１４−Ｆｃへの結合により測定される、多重標的アレイにおけるパニングによるＦＮ１４結合剤の濃縮を示すドットプロットである。左パネルは、パニング前の多様な集団を示す図であり、右パネルは、パニングにより選択された集団を示す図である。図２Ｇは、２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞の、ＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］（上図）または非特異的ＤＴＬａｃＯ（下図）でスパイクしたＤＴＬａｃＯ集団との相互作用のドットプロットプロファイルを示す図である。相互作用する細胞の割合を、各プロット上方に百分率として示す。顕微鏡写真は、小型のＤＴＬａｃＯ細胞へと結合した大型の２９３Ｆ／ＦＮ１４標的細胞を例示する。 図３は、ＦＮ１４特異的抗体のＶＨ領域（図３Ａ）およびＶＬ領域（図３Ｂ）の配列アライメントを示す図である。ＣＤＲ領域は、下線を付すことにより示す。重鎖ＶＤＪ配列：配列番号６４に示されるＨＰ１ＶＤＪ；配列番号６５に示されるＦＳ１０；配列番号６８に示されるＰＳ４；配列番号６６に示されるＦＳ１７；配列番号６７に示されるＦＳ２４。軽鎖ＶＪ配列：配列番号２２に示されるＶＪＤＴ４０；配列番号２３に示されるＦＳ１０；配列番号２４に示されるＦＳ１７；配列番号２５に示されるＦＳ２４；配列番号２７に示されるＰＳ４Ａ；配列番号２６に示されるＰＳ４Ｂ。 図３は、ＦＮ１４特異的抗体のＶＨ領域（図３Ａ）およびＶＬ領域（図３Ｂ）の配列アライメントを示す図である。ＣＤＲ領域は、下線を付すことにより示す。重鎖ＶＤＪ配列：配列番号６４に示されるＨＰ１ＶＤＪ；配列番号６５に示されるＦＳ１０；配列番号６８に示されるＰＳ４；配列番号６６に示されるＦＳ１７；配列番号６７に示されるＦＳ２４。軽鎖ＶＪ配列：配列番号２２に示されるＶＪＤＴ４０；配列番号２３に示されるＦＳ１０；配列番号２４に示されるＦＳ１７；配列番号２５に示されるＦＳ２４；配列番号２７に示されるＰＳ４Ａ；配列番号２６に示されるＰＳ４Ｂ。 図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは、黒色腫細胞、乳がん細胞、および膵臓がん細胞それぞれの、ＦＳ２４ ＦＮ１４特異的抗体によるＡＤＣＣを介する殺滅を示す棒グラフである。 図５は、ＰＳ４およびヒト化ＰＳ４抗体Ｈ．１／Ｌ．９の結合アフィニティーを示すグラフである。 図６は、ヒト化ＰＳ４の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列アライメント（配列番号５６および５８）を、対応するニワトリ前駆体配列（配列番号２６および６８）、ならびにＣＤＲを破線として示したヒトＶλおよびＶＨの亜群ＩＩＩコンセンサス配列（配列番号８７および８８）と共に示す図である。配列の番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）に従う。ＣＤＲには下線を付す。アステリスクは、アライメントにおけるギャップを示す。ニワトリ残基がフレームワーク配列内で保持されるベニヤ帯域の位置を、二重下線で指し示す。ｈＰＳ４ＨおよびｈＰＳ４Ｌは、それぞれ、ＰＳ４ ＶＨおよびＰＳ４ ＶＬのヒト化形を示す。ＨＩＩＩ：ヒトＶＨ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列である。ＬＩＩＩ：ヒトＶλ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列である。 図７は、ＦＳ２４およびヒト化ＦＳ２４抗体であるｈＦＳ２４の結合アフィニティーを示すグラフである。 図８は、ヒト化ＦＳ２４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列アライメント（それぞれ、配列番号９０および９１）を、対応するニワトリ前駆体配列（配列番号６７および２５）、ならびにＣＤＲを破線として示したヒトＶλおよびＶＨの亜群ＩＩＩコンセンサス配列（配列番号８７および８８）と共に示す図である。配列の番号付けは、Ｋａｂａｔ、１９９１年、前出に従う。ＣＤＲには下線を付す。アステリスクは、アライメントにおけるギャップを示す。ニワトリ残基がフレームワーク配列内で保持されるベニヤ帯域の位置を、二重下線で指し示す。ｈＦＳ２４ＨおよびｈＦＳ２４Ｌは、それぞれ、ＦＳ２４ ＶＨおよびＦＳ２４ ＶＬのヒト化形を示す。ＨＩＩＩ：ヒトＶＨ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列である。ＬＩＩＩ：ヒトＶλ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列である。 図９は、多様ながん細胞系によるＦＳ２４抗体の時間依存的な内部移行（図９Ａ）およびＦＮ１４の相対発現レベル（図９Ｂ）を示す図である。 図９は、多様ながん細胞系によるＦＳ２４抗体の時間依存的な内部移行（図９Ａ）およびＦＮ１４の相対発現レベル（図９Ｂ）を示す図である。 図１０は、ＦＳ２４−毒素コンジュゲートが、がん細胞を死滅させたことを示す図である。図１０Ａは、濃度を増大させたＦＳ２４−サポリンコンジュゲートの存在下における、Ａ３７５黒色腫細胞の生存率の用量依存的な低下の一方で、サポリンとコンジュゲートしたアイソタイプ適合の無関係な抗体は、細胞生存率に影響を及ぼさなかったことを示す図である。図１０Ｂは、５００ｎＭのアイソタイプ対照−サポリンコンジュゲート（左パネル）またはＦＳ２４−サポリンコンジュゲート（右パネル）に曝露されたＡ３７５細胞の光学顕微鏡画像である。 図１１は、可変ＦＳ２４−毒素コンジュゲートを介する１２のがん細胞系の殺滅を示す図である。ＦＳ２４−サポリンまたはコンジュゲートされていないサポリンで処置した細胞の生存率の変化を示す。細胞系は、ＭｉａＰａＣａ２（図１１Ａ）、Ａ３７５（図１１Ｂ）、ＭＣＦ７（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図１１Ｄ）、ＣａＰａｎ２（図１１Ｅ）、ＳＫＯＶ−３（図１１Ｆ）、ＨＴ２９（図１１Ｇ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｈ）、ＰＣ３（図１１Ｉ）、ＨＴ１０８０（図１１Ｊ）、ＢｘＰＣ−３（図１１Ｋ）、およびＡｓＰＣ１（図１１Ｌ）であった。 図１１は、可変ＦＳ２４−毒素コンジュゲートを介する１２のがん細胞系の殺滅を示す図である。ＦＳ２４−サポリンまたはコンジュゲートされていないサポリンで処置した細胞の生存率の変化を示す。細胞系は、ＭｉａＰａＣａ２（図１１Ａ）、Ａ３７５（図１１Ｂ）、ＭＣＦ７（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図１１Ｄ）、ＣａＰａｎ２（図１１Ｅ）、ＳＫＯＶ−３（図１１Ｆ）、ＨＴ２９（図１１Ｇ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｈ）、ＰＣ３（図１１Ｉ）、ＨＴ１０８０（図１１Ｊ）、ＢｘＰＣ−３（図１１Ｋ）、およびＡｓＰＣ１（図１１Ｌ）であった。 図１１は、可変ＦＳ２４−毒素コンジュゲートを介する１２のがん細胞系の殺滅を示す図である。ＦＳ２４−サポリンまたはコンジュゲートされていないサポリンで処置した細胞の生存率の変化を示す。細胞系は、ＭｉａＰａＣａ２（図１１Ａ）、Ａ３７５（図１１Ｂ）、ＭＣＦ７（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図１１Ｄ）、ＣａＰａｎ２（図１１Ｅ）、ＳＫＯＶ−３（図１１Ｆ）、ＨＴ２９（図１１Ｇ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｈ）、ＰＣ３（図１１Ｉ）、ＨＴ１０８０（図１１Ｊ）、ＢｘＰＣ−３（図１１Ｋ）、およびＡｓＰＣ１（図１１Ｌ）であった。 図１１は、可変ＦＳ２４−毒素コンジュゲートを介する１２のがん細胞系の殺滅を示す図である。ＦＳ２４−サポリンまたはコンジュゲートされていないサポリンで処置した細胞の生存率の変化を示す。細胞系は、ＭｉａＰａＣａ２（図１１Ａ）、Ａ３７５（図１１Ｂ）、ＭＣＦ７（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図１１Ｄ）、ＣａＰａｎ２（図１１Ｅ）、ＳＫＯＶ−３（図１１Ｆ）、ＨＴ２９（図１１Ｇ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｈ）、ＰＣ３（図１１Ｉ）、ＨＴ１０８０（図１１Ｊ）、ＢｘＰＣ−３（図１１Ｋ）、およびＡｓＰＣ１（図１１Ｌ）であった。 図１１は、可変ＦＳ２４−毒素コンジュゲートを介する１２のがん細胞系の殺滅を示す図である。ＦＳ２４−サポリンまたはコンジュゲートされていないサポリンで処置した細胞の生存率の変化を示す。細胞系は、ＭｉａＰａＣａ２（図１１Ａ）、Ａ３７５（図１１Ｂ）、ＭＣＦ７（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図１１Ｄ）、ＣａＰａｎ２（図１１Ｅ）、ＳＫＯＶ−３（図１１Ｆ）、ＨＴ２９（図１１Ｇ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｈ）、ＰＣ３（図１１Ｉ）、ＨＴ１０８０（図１１Ｊ）、ＢｘＰＣ−３（図１１Ｋ）、およびＡｓＰＣ１（図１１Ｌ）であった。 図１１は、可変ＦＳ２４−毒素コンジュゲートを介する１２のがん細胞系の殺滅を示す図である。ＦＳ２４−サポリンまたはコンジュゲートされていないサポリンで処置した細胞の生存率の変化を示す。細胞系は、ＭｉａＰａＣａ２（図１１Ａ）、Ａ３７５（図１１Ｂ）、ＭＣＦ７（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図１１Ｄ）、ＣａＰａｎ２（図１１Ｅ）、ＳＫＯＶ−３（図１１Ｆ）、ＨＴ２９（図１１Ｇ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｈ）、ＰＣ３（図１１Ｉ）、ＨＴ１０８０（図１１Ｊ）、ＢｘＰＣ−３（図１１Ｋ）、およびＡｓＰＣ１（図１１Ｌ）であった。
配列表の簡単な説明
配列番号１：Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１ＶＨ（親ＤＴ４０集団）のアミノ酸配列
配列番号２：ＦＳ１０ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号３：ＦＳ１７ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号４：ＦＳ２４ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５：ＰＳ４ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６：ＨＰ１ＶＨをコードするポリヌクレオチド配列（親ＤＴ４０集団）
配列番号７：ＦＳ１０ ＶＨをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号８：ＦＳ１７ ＶＨをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号９：ＦＳ２４ ＶＨをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１０：ＰＳ４ ＶＨをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１１：ＶＨＣＤＲ１ Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１のアミノ酸配列
配列番号１２：ＶＨＣＤＲ２ Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＶＨＣＤＲ３ Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１、ＦＳ１０およびＰＳ４のアミノ酸配列
配列番号１４：ＰＳ４のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５：下流においてフレームワークを拡張したＰＳ４のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１６：ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７：下流においてフレームワークを拡張したＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１８：ＰＳ４、ＦＳ１０およびＦＳ１７のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１９：ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２０：ＦＳ１７のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１：ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２２：ＶＪ（ＶＬ）ＤＴ４０（親ＤＴ４０集団）のアミノ酸配列
配列番号２３：ＦＳ１０ ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２４：ＦＳ１７ ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２５：ＦＳ２４ ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２６：ＰＳ４Ｂ ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２７：ＰＳ４Ａ ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２８：ＶＪ（ＶＬ）ＤＴ４０（親ＤＴ４０集団）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号２９：ＦＳ１０ ＶＬをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号３０：ＦＳ１７ ＶＬをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号３１：ＦＳ２４ ＶＬをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号３２：ＰＳ４Ｂ ＶＬをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号３３：ＰＳ４Ａ ＶＬをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号３４：親ＤＴ４０のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３５：親ＤＴ４０のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３６：親ＤＴ４０およびＦＳ１０のＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３７：ＰＳ４Ａ、ＰＳ４Ｂ、ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３８：ＰＳ４Ａ、ＰＳ４Ｂ、ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４の上流フレームワークを伴うＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３９：ＰＳ４Ａ、ＰＳ４Ｂ、ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４０：上流においてフレームワークを伴う、ＰＳ４Ａ、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４１：ＰＳ４Ａ、ＰＳ４Ｂ、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４２：ヒトラムダ軽鎖定常領域を伴う、ヒト化ＰＳ４軽鎖の変化形Ｌ．９のアミノ酸配列
配列番号４３：ヒト化ＰＳ４軽鎖の変化形Ｌ．９（シグナル配列を含めた）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号４４：ヒト化ＰＳ４軽鎖の変化形Ｌ．１８のアミノ酸配列
配列番号４５：ヒト化ＰＳ４軽鎖の変化形Ｌ．１８（シグナル配列を含めた）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号４６：ヒトＩｇＧ１定常領域を伴う、ヒト化ＰＳ４重鎖の変化形Ｈ．１のアミノ酸配列
配列番号４７：ヒト化ＰＳ４重鎖の変化形Ｈ．１（シグナル配列を含めた）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号４８〜５０：例示的なリンカー配列
配列番号５１：ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号５２：ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のアミノ酸配列
配列番号５３：ヒトラムダ軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号５４：ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号５５：上流においてフレームワークを伴うＦＳ１０のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５６：ヒト化ＰＳ４軽鎖可変領域の変化形Ｌ．９のアミノ酸配列
配列番号５７：ＰＳ４ ＶＬ ＣＤＲを伴う、ヒトＶλ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号５８：ヒト化ＰＳ４重鎖可変領域の変化形Ｈ．１のアミノ酸配列
配列番号５９：ＰＳ４ ＶＨ ＣＤＲを伴う、ヒトＶＨ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号６０：ヒトラムダ軽鎖定常領域を伴う、ヒト化ＦＳ２４軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６１：配列番号６０に示される、ヒト化ＦＳ２４軽鎖配列をコードする核酸配列
配列番号６２：ヒトＩｇＧ１定常領域を伴う、ヒト化ＦＳ２４重鎖のアミノ酸配列
配列番号６３：配列番号６２に示される、ヒト化ＦＳ２４重鎖配列をコードする核酸配列
配列番号６４：１位にアミノ酸「Ａ」を付加した、Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１ＶＨ（親ＤＴ４０集団）のアミノ酸配列
配列番号６５：１位にアミノ酸「Ａ」を付加したＦＳ１０ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６６：１位にアミノ酸「Ａ」を付加したＦＳ１７ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６７：１位にアミノ酸「Ａ」を付加したＦＳ２４ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６８：１位にアミノ酸「Ａ」を付加したＰＳ４ ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６９：配列番号６４のＨＰ１ＶＨ（親ＤＴ４０集団）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号７０：配列番号６５のＦＳ１０ ＶＨのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号７１：配列番号６６のＦＳ１７ ＶＨのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号７２：配列番号６７のＦＳ２４ ＶＨのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号７３：配列番号６８のＰＳ４ ＶＨのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号７４：ＶＨＣＤＲ１ Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号７５：ＶＨＣＤＲ２ Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号７６：ＶＨＣＤＲ３ Ｐａｒｅｎｔａｌ ＤＴ４０ ＨＰ１、ＦＳ１０、およびＰＳ４（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号７７：ＰＳ４のＶＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号７８：下流においてフレームワークを拡張した、ＰＳ４のＶＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号７９：ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８０：下流においてフレームワークを拡張した、ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８１：ＰＳ４、ＦＳ１０、およびＦＳ１７のＶＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８２：ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８３：ＦＳ１７のＶＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８４：ＦＳ２４のＶＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８５：親ＤＴ４０のＶＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８６：ＰＳ４Ａ、ＰＳ４Ｂ、ＦＳ１０、ＦＳ１７、ＦＳ２４のＶＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる定義）のアミノ酸配列
配列番号８７：「Ｘ」により指し示されるＣＤＲのアミノ酸を伴う、ヒトＶλ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号８８：「Ｘ」により指し示されるＣＤＲのアミノ酸を伴う、ヒトＶＨ亜群ＩＩＩのコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号８９：ヒトＦＮ１４のアミノ酸配列
配列番号９０は、ヒト化ＦＳ２４重鎖可変領域のアミノ酸配列である
配列番号９１は、ヒト化ＦＳ２４軽鎖可変領域のアミノ酸配列である
配列番号９２は、ＦＳ１７（配列番号８１）、ＦＳ１０（配列番号８１）、およびＦＳ２４（配列番号８２）のＶＨＣＤＲ２領域（Ｋａｂａｔによる定義）について図３から抜き出したコンセンサス配列である
配列番号９３は、ＦＳ１７（配列番号８３）、ＦＳ１０（配列番号７６）、およびＦＳ２４（配列番号８４）のＶＨＣＤＲ３領域（Ｋａｂａｔによる定義）について図３から抜き出したコンセンサス配列である
配列番号９４は、ＦＳ１７（配列番号４１）、ＦＳ１０（配列番号３６）、およびＦＳ２４（配列番号４１）のＶＬＣＤＲ３領域（Ｋａｂａｔによる定義）について図３から抜き出したコンセンサス配列である。
詳細な説明
抗体およびその抗原結合断片
本発明の実施形態は、ＴＷＥＡＫ受容体であるＦＮ１４に結合する抗体に関する。特に、本明細書で記載される抗体は、予測外に高いアフィニティーでＦＮ１４に特異的に結合し、特異的な細胞毒性を媒介し、ＦＮ１４の異常な発現（特に、過剰発現）と関連する疾患の処置に治療的有用性を有する。ヒトＦＮ１４の例示的なアミノ酸配列を、配列番号８９に示す。例示的な抗体のアミノ酸配列、またはその抗原結合断片、もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号２〜５、１３〜２１、２３〜２７、３６〜４２、４４、４６、５５〜６０、６２、６５〜６８、７６〜８４、８６、および９０〜９１に示す。
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域（本明細書ではまた、可変ドメインとも称する）内に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられる通り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体または無傷のモノクローナル抗体だけでなく、また、これらの断片（ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、これらの合成改変体、天然に存在する改変体、必要とされる特異性を有する抗原結合断片を伴う抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性を有する抗原結合部位または抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む他の任意の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子も包含する。遺伝子融合により構築される「ダイアボディー」、多価断片、または多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ． Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年）も、本明細書で想定される特定の形態の抗体である。本明細書にはまた、ＣＨ３ドメインへと接合されたｓｃＦｖを含むミニボディーも包含される（Ｓ． Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年）。例えば、Ｗａｒｄ， Ｅ． Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁、１９８８年）；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ． Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年；Ｙ． Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４巻、１２３９〜１２４５頁、１９９６年；Ｓ． Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年を参照されたい。
本明細書で用いられる「抗原結合断片」という用語は、対象の抗原、特に、ＦＮ１４受容体に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。この点で、本明細書で記載される抗体の抗原結合断片は、ＦＮ１４に結合する抗体に由来する、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列の１、２、３、４、５、または６つ全てのＣＤＲを含みうる。本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の抗原結合断片は、ＦＮ１４への結合が可能である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片または抗原結合断片を含む抗体が、ＦＮ１４を発現させる標的細胞の殺滅を媒介する。さらなる実施形態では、抗原結合断片の結合が、ＦＮ１４リガンドのその受容体への結合を防止または阻害し、リガンドの受容体への結合から結果として生じる生物学的応答を遮断する。ある特定の実施形態では、抗原結合断片が、ヒトＦＮ１４に特異的に結合し、かつ／またはその生物学的活性を阻害もしくはモジュレートする。
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤による結合が可能であり、加えて、動物において、この抗原のエピトープへの結合が可能な抗体を産生するのに用いることが可能な分子または分子の部分を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有しうる。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を包含する。エピトープとは、抗体が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基に、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなど、分子の化学的に活性な表面の組み分けが含まれ、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有しうる。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。抗体は、平衡解離定数が≦１０−７または１０−８Ｍである場合に、抗原に特異的に結合するという。一部の実施形態では、平衡解離定数が≦１０−９Ｍの場合もあり、≦１０−１０Ｍの場合もある。
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片であって、これらのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）の各々が、無傷の抗原結合部位を包含する共有結合的ヘテロ二量体を含む、いくつかの断片をもたらす。酵素であるペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかの断片であって、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含めた、いくつかの断片をもたらすことが可能である。本発明のある特定の実施形態に従って用いられるＦｖ断片は、ＩｇＭの優先的なタンパク質分解的切断により産生させうるが、まれな場合には、ＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により産生させることもできる。しかし、Ｆｖ断片は、より一般的には、当技術分野において公知の組換え法を用いて誘導される。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大半を保持する抗原結合部位を含めた、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を包含する（Ｉｎｂａｒら（１９７２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、６９巻：２６５９〜２６６２頁；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５巻：２７０６〜２７１０頁；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９巻：４０９１〜４０９６頁）。
ある特定の実施形態では、単鎖Ｆｖ抗体またはｓｃＦＶ抗体が想定される。例えば、カッパボディー（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．、１０巻：９４９〜５７頁（１９９７年））；ミニボディー（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ、１３巻：５３０５〜９頁（１９９４年）；ダイアボディー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ、９０巻：６４４４〜８頁（１９９３年））；またはヤヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ、１０巻：３６５５〜５９頁（１９９１年）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．、７巻：５１〜５２頁（１９９２年））は、所望の特異性を有する抗体の選択について本出願の教示に従い、標準的な分子生物学法を用いて調製することができる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体が、異なる抗体に由来するＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を含みうるのに対し、１つの結合ドメインを介してＦＮ１４に特異的に結合し、第２の結合ドメインを介して第２の分子に特異的に結合する二重特異性抗体を生成させることができる。これらの抗体は、組換え分子生物学法を介して産生させることもでき、物理的に併せてコンジュゲートすることもできる。
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドとは、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であって、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨ−コード遺伝子およびＶＬ−コード遺伝子を含めた遺伝子融合体から発現するヘテロ二量体である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻（１６号）：５８７９〜５８８３頁）。天然では凝集した（しかし、化学的には分離される）軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を、抗体のＶ領域から、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造へとフォールドするｓＦｖ分子へと転換するために、化学構造を識別する多数の方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらによる米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらによる米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ， Ｅ． Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年））。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体（例えば、ＦＮ１４特異的抗体）は、ダイアボディーの形態である。ダイアボディーとは、各ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含むポリペプチドの多量体であって、２つのドメインが連結されている（例えば、ペプチドリンカーによって）が、互いと会合して抗原結合部位を形成することは可能でなく、抗原結合部位が、多量体内の一方のポリペプチドの第１のドメインの、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合により形成される多量体である（ＷＯ９４／１３８０４）。
二重特異性抗体を用いる場合、これらは、多様なやり方（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４巻、４４６〜４４９頁（１９９３年））で製造しうる、例えば、化学的に調製されるか、またはハイブリッド体であるハイブリドーマから調製される、従来の二重特異性抗体の場合もあり、上記で言及した二重特異性抗体断片のうちのいずれかの場合もある。ダイアボディーおよびｓｃＦｖは、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減する可変領域だけを用いて、Ｆｃ領域なしに構築することができる。
二重特異性完全抗体と対比される二重特異性ダイアボディーはまた、それらを容易に構築し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させうるため、特に有用でもありうる。適切な結合特異性を有するダイアボディー（および抗体断片など、他の多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて、ライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディーの一方のアームを、例えば、抗原Ｘを指向する特異性により定常に保つ場合、他方のアームを変化させて適切な特異性を有する抗体を選択するライブラリーを作製することができる。二重特異性完全抗体は、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作により作製することができる（Ｊ． Ｂ． Ｂ． Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９巻、６１６〜６２１頁、１９９６年）。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体を、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供することができる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）とは、ヒンジ領域を除去したＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照されたい；また、例えば、ＵＳ２００９０２２６４２１も参照されたい）。この所有権のある抗体技術は、現行の低分子抗体フォーマットより治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）が長いと予測される、安定的なより低分子の抗体フォーマットを創出する。ＩｇＧ４抗体は、不活性であり、したがって、免疫系とは相互作用しないと考えられる。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を消失させて、対応する無傷のＩｇＧ４と比べて顕著な安定性特性を有する半分子断片を得ることにより改変することができる（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）。ＩｇＧ４分子を二等分することにより、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）には、コグネイト抗原（例えば、疾患の標的）に結合しうる１つのエリアだけが残され、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞における１つの部位だけに一価結合する。ある特定のがん細胞の表面抗原では、この一価結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を用いるときに見られうるようながん細胞の成長を刺激しえず、よって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来の抗体による処置に対して不応性でありうる一部の種類のがんのための処置の選択肢をもたらしうる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、普通のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズである。このようにサイズが小さいことは、より大型の充実性腫瘍にわたる分子のより良好な分布を可能とし、潜在的に有効性を増大させるので、一部の形態のがんを処置する場合に大きな有益性でありうる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ナノボディーの形態をとりうる。ナノボディーは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼ全ての原核生物宿主および真核生物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたい）、かび（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＰｉｃｈｉａ属（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたい））において効率的に産生される。産生工程は拡大可能であり、数キログラム分量のナノボディーが産生されている。ナノボディーは、保管寿命の長い、すぐに使用可能な溶液として処方することができる。Ｎａｎｏクローン法（例えば、ＷＯ０６／０７９３７２を参照されたい）とは、Ｂ細胞の自動式ハイスループット選択に基づき、所望の標的に対するナノボディーを生成させる所有権のある方法である。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体およびそれらの抗原結合断片は、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いと比べたＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のセットの間にそれぞれ置かれる、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのセットを包含する。本明細書で用いられる「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のうちの３つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域を、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称する。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを包含する。本明細書では、単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを「分子的認識単位」と称する。多数の抗原−抗体複合体の結晶学的解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触であって、抗原との最も広範な接触が重鎖ＣＤＲ３との接触である、抗原との接触を形成することが裏付けられている。したがって、分子的認識単位は、抗原結合部位の特異性の主要な一因をなす。
本明細書で用いられる「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを枠付ける４つの隣接アミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合した抗原に接触しうるが、ＦＲ、特に、ＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、Ｖ領域を抗原結合部位へとフォールドさせる主要な一因をなす。ＦＲ内では、ある特定のアミノ残基およびある特定の構造的特徴が極めて高度に保存される。この点で、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部のジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へとフォールドすると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして提示される。一般に、ＣＤＲループがある特定の「カノニカル」構造（ＣＤＲの正確なアミノ酸配列にかかわらず）へとフォールドする形状に影響を与える、ＦＲの保存された構造領域が存在することが認知されている。さらに、ある特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化させる非共有結合的なドメイン間接触に関与することも公知である。
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、４版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８７年、および現在ではインターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で入手可能なその改定版を参照することにより決定することができる。
「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団をいい、ここで、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関係するアミノ酸（天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸）で構成される。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープを指向する。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、また、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、それらの改変体、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープに結合する能力を有する抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む他の任意の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子も包含する。抗体の供給源または抗体が作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定することは意図しない。この用語は、完全な免疫グロブリンの他、「抗体」の定義下における上記の断片なども包含する。
「ヒト化」抗体とは、一般に組換え法を用いて調製され、抗原結合部位がヒト以外の種に由来する免疫グロブリンに由来し、残りの免疫グロブリン分子の構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づくキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインへと融合させた完全可変領域を含む場合もあり、可変領域における適切なフレームワーク領域へと移植したＣＤＲだけを含む場合もある。エピトープ結合部位は、野生型の場合もあり、１つまたは複数のアミノ酸置換により修飾される場合もある。このことは、ヒト個体における免疫原としての定常領域は消失させるが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ， Ａ． Ｆ．ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６巻：４２２０〜４２２４頁；Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８年）、８６巻：１００２９〜１００３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）、３３２巻：３２３〜３２７頁）。本発明のある特定の実施形態に従う例示的ヒト化抗体は、配列番号４２〜４７および６０〜６３に提供されるヒト化配列を含む。
別の手法は、ヒト由来の定常領域をもたらすことだけでなく、また、それらをヒト形態に可能な限り酷似させて作り変えるように、可変領域の修飾にも同様に焦点を絞る。重鎖および軽鎖両方の可変領域は、問題のエピトープに応じて変化し、結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、所与の種において比較的保存されてＣＤＲの足場をもたらすと推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に挟まれるＣＤＲを含有することが公知である。特定のエピトープに対する非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変されるヒト抗体に存在するＦＲに移植することにより、可変領域を「作り変える」または「ヒト化する」場合がある。この手法の多様な抗体への適用は、Ｓａｔｏ， Ｋ．ら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５３巻：８５１〜８５６頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， Ｍ．ら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４巻：７７３〜３７８３頁；Ｍａｅｄａ， Ｈ．ら（１９９１年）、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２巻：１２４〜１３４頁；Ｇｏｒｍａｎ， Ｓ． Ｄ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁；Ｔｅｍｐｅｓｔ， Ｐ． Ｒ．ら（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：２６６〜２７１頁；Ｃｏ， Ｍ． Ｓ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８巻：２８６９〜２８７３頁；Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．ら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜４２８９頁；およびＣｏ， Ｍ． Ｓ．ら（１９９２年）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８巻：１１４９〜１１５４頁により報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体に由来する６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）であって、元の抗体に対して変化させたＣＤＲ、また、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれるＣＤＲを有する。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体でありうる。この点で、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結するか、または他の形で融合させた抗ＦＮ１４抗体の抗原結合断片で構成される。ある特定の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ヒト起源である。他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含めた）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めた）、およびＩｇＭを含めた親抗体とは異なるＩｇクラスに由来しうる。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスのうちの１つまたは複数に由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインで構成されうる。ヒト化抗体について上記で言及した通り、キメラ抗体の抗ＦＮ１４抗原結合断片は、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１つまたは複数（例えば、本明細書で記載される抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）だけを含む場合もあり、可変領域（ＶＬ、ＶＨ、またはこれらの両方）の全体を含む場合もある。
ある特定の実施形態では、ＦＮ１４結合抗体は、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む。この点で、場合によっては、所望の特異的結合をなお保持しながら、抗体のＶＨＣＤＲ３だけを移動させうることが示されている（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、９２巻：２５２９〜２５３３頁）。また、ＭｃＬａｎｅら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、９２巻：５２１４〜５２１８頁、Ｂａｒｂａｓら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（１９９４年）、１１６巻：２１６１〜２１６２頁も参照されたい。
Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻：７７９〜７８３頁）は、抗体可変領域のレパートリーを作製する方法であって、可変領域の５’端を指向するかまたはこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変領域のレパートリーを提供する方法について記載している。Ｍａｒｋｓらは、どのようにしてこのレパートリーを、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせうるかについてもさらに記載している。類似の技法を用いて、本明細書で記載されている抗体のＣＤＲ３に由来する配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリーと共にシャッフルし、シャッフルされた完全ＶＨドメインまたは完全ＶＬドメインを、コグネイトＶＬドメインまたはコグネイトＶＨドメインと組み合わせて、ＦＮ１４に結合する抗体またはその抗原結合断片をもたらすことができる。次いで、適した抗体またはそれらの抗原結合断片を選択しうるように、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステムなど、適した宿主システムにおいてレパートリーを提示することができる。レパートリーは、少なくとも約１０４の個別のメンバーから、これを数桁上回る、例えば、約１０６〜１０８または１０１０以上のメンバーまでからなりうる。また、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、３７０巻：３８９〜３９１頁）は、類似のシャッフリング法またはコンビナトリアル法も開示しており、この技法を、β−ラクタマーゼ遺伝子との関連で記載しているが、この手法を抗体の生成に用いうることを観察している。
さらなる代替法は、１つまたは複数の選択されたＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子に対するランダム変異誘発であって、可変領域の全体において変異を発生させる変異誘発を用いて、本明細書で記載される本発明の実施形態の１つまたは複数のＣＤＲに由来する配列を保有する新規のＶＨ領域またはＶＬ領域を生成させることである。このような技法は、エラープローンＰＣＲを用いたＧｒａｍら（１９９２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁）により記載されている。用いうる別の方法は、変異誘発をＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域へと方向付けることである。このような技法は、Ｂａｒｂａｓら（１９９４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１巻：３８０９〜３８１３頁）およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２６３巻：５５１〜５６７頁）により開示されている。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体の特異的ＶＨおよび／または特異的ＶＬを用いて、相補的な可変領域のライブラリーをスクリーニングして、ＦＮ１４に対するアフィニティーの増大など、所望の特性を伴う抗体を同定することができる。このような方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）、１５０巻：８８０〜８８７頁；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）、３５２巻：６２４〜６２８頁に記載されている。
また、他の方法を用いてＣＤＲを混合および適合させて、ＦＮ１４への結合などの所望の結合活性を有する抗体を同定することもできる。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２〜２６０頁は、マウスＶＬと、ＣＤＲ３およびＦＲ４をマウスＶＨから保持したヒトＶＨライブラリーとを用いるスクリーニング工程について記載している。抗体を得た後、ＶＨをヒトＶＬライブラリーに対してスクリーニングして、抗原に結合する抗体を得た。Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２０００年）、２９６巻：８３３〜８４９頁は、マウス重鎖の全体とヒト軽鎖ライブラリーとを用いるスクリーニング工程について記載している。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３を保持したヒトＶＨライブラリーと組み合わせた。抗原に結合することが可能な抗体を得た。Ｒａｄｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９８年）、９５巻：８９１０〜８９１５頁は、上記のＢｅｉｂｏｅｒらの工程と同様の工程について記載している。
当技術分野では、記載したばかりのこれらの技法が、それら自体としては、そのようなものとして公知である。しかし、当業者は、当技術分野の日常的な方法を用いて、本明細書で記載される本発明のいくつかの実施形態に従い、抗体またはそれらの抗原結合断片を得るのに、このような技法を用いることが可能である。
本明細書ではまた、ＦＮ１４抗原に特異的な抗体または抗原結合ドメインを得る方法であって、本明細書で示されるＶＨドメインのアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、または挿入することにより、このＶＨドメインのアミノ酸配列改変体であるＶＨドメインをもたらし、場合によっては、このようにしてもたらされたＶＨドメインを、１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わせ、ＶＨドメインまたは１つもしくは複数のＶＨ／ＶＬの組合せを調べて、ＦＮ１４の特異的結合メンバー、またはＦＮ１４に特異的であり、場合によって、１つもしくは複数の好ましい特性、好ましくは、ＦＮ１４を発現させる細胞に対する細胞傷害を媒介する能力も伴う抗体の抗原結合ドメインを同定するステップを含む、方法も開示される。前記ＶＬドメインは、本明細書で実質的に示されるアミノ酸配列を有しうる。本明細書で開示されるＶＬドメインの１つまたは複数の配列改変体を、１つまたは複数のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法も使用することができる。
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」か、またはこれに「優先的に結合する」（本明細書では互換的に用いられる）エピトープとは、当技術分野において十分に理解された用語であり、当技術分野ではまた、このような特異的な結合または優先的な結合を決定する方法も周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、他の細胞または物質との場合より高頻度で、迅速に、長い持続期間にわたり、かつ／または大きなアフィニティーで反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈示するという。抗体は、それが、他の物質に結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続期間にわたり結合する場合、標的に「特異的に結合する」か、またはこれに「優先的に結合する」。例えば、ＦＮ１４エピトープに特異的または優先的に結合する抗体とは、１つのＦＮ１４エピトープに、他のＦＮ１４エピトープまたはＦＮ１４以外のエピトープに結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続期間にわたり結合する抗体である。また、この定義を読み取ることにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合もあり、結合しない場合もあることも理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を要求するわけではない（排他的結合を包含しうるが）。一般に、結合に対する言及は、優先的結合を意味するが、必ずしもそうであるわけではない。
免疫的結合とは一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的である抗原との間で、例えば、例示として述べるものであり、限定として述べるものではないが、静電引力もしくは静電斥力、イオン性引力もしくはイオン性斥力、親水性引力もしくは親水性斥力、および／または疎水性引力もしくは疎水性斥力、立体的な強制力（ｓｔｅｒｉｃ ｆｏｒｃｅ）、水素結合、ファンデルワールス力、ならびに他の相互作用の結果として生じる種類の非共有結合的相互作用を指す。免疫的結合による相互作用の強度またはアフィニティーは、この相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、より低値のＫｄがより大きなアフィニティーを表す。選択したポリペプチドの免疫的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。このような一方法は、抗原結合部位／抗原の複合体形成および解離の速度を測定するステップを伴い、この速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、およびいずれの方向の速度にも等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。こうして、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）のいずれも、濃度ならびに実際の会合速度および解離速度を計算することにより決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、アフィニティーと関連しない全てのパラメータの解消を可能とし、したがって、解離定数Ｋｄと等しい。一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻：４３９〜４７３頁を参照されたい。
免疫的に活性であるかまたは「免疫的活性を維持する」エピトープに言及する場合の「免疫的に活性な」という用語は、抗体（例えば、抗ＦＮ１４抗体）が、異なる条件下で、例えば、エピトープを還元条件および変性条件にかけた後でエピトープに結合する能力を指す。
本出願のある特定の好ましい実施形態に従う抗体またはその抗原結合断片は、本明細書で記載される任意の抗体であって、（ｉ）抗原に特異的に結合し、かつ、（ｉｉ）本明細書で開示されるＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインを含むか、または本明細書で開示されるＶＨ ＣＤＲ３、もしくはこれらのうちのいずれかの改変体を含む抗体と、ＦＮ１４への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片でありうる。結合メンバー間の競合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、かつ／または特定のレポーター分子であって、他のタグ付けされない結合メンバー（複数可）の存在下において検出され、同じエピトープもしくは重複エピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能としうるレポーター分子を１つの結合メンバーへとタグ付けすることにより、簡単にアッセイすることができる。
したがって、本明細書では、ＰＳ４（ＡまたはＢ）、ＦＳ１７、またはＦＳ２４など、本明細書で記載される、ＦＮ１４に結合する抗体と、ＦＮ１４への結合について競合するヒト抗体の抗原結合部位を含む特異的な抗体またはその抗原結合断片が提供される。
免疫グロブリンの定常領域は、可変領域よりも配列多様性が少なく、重要な生化学イベントを誘発する多数の天然のタンパク質への結合を担う。ヒトでは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を包含する）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を包含する）、およびＩｇＭを含めた、抗体の５つの異なるクラスが存在する。Ｖ領域にも微妙な差違が存在しうるが、これらの抗体クラスの間の識別特徴はそれらの定常領域である。
抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称する一連の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、ＩｇのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびにＣＨ２へと通じるＮ末端のヒンジを含む。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞性アームとの間のコミュニケーションを媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、１２巻：１８１〜２２０頁；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９巻：２７５〜２９０頁）。ヒトでは、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含めたＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含めた）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含めた）、およびＦｃγＲＩＩｃを含めたＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含めた）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含めた）を含めたＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ、８２巻：５７〜６５頁）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内の一部のシグナル伝達イベントを媒介しうる細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞を含めた多様な免疫細胞において発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、これらのエフェクター細胞は、抗原が結合した部位へと動員され、この結果として典型的に、細胞内ではシグナル伝達イベントがもたらされ、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞の活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性の攻撃など、その後の重要な免疫応答がもたらされる。
細胞傷害エフェクター機能および食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的とする細胞を破壊する強力な機構である。ＦｃγＲを発現させる非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と称する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、１２巻：１８１〜２２０頁；Ｇｈｅｔｉｅら、２０００年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８巻：７３９〜７６６頁；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９巻：２７５〜２９０頁）。ＦｃγＲを発現させる非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応を、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）と称する。全てのＦｃγＲは、Ｆｃ上の同じ領域である、Ｃｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端および上流のヒンジに結合する。この相互作用は、構造的に十分特徴付けられており（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２００１年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３０９巻：７３７〜７４９頁）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃのいくつかの構造が解明されている（ｐｄｂ受託コード：１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻：２６７〜２７３頁）（ｐｄｂ受託コード：１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖら、２００１年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６巻：１６４６９〜１６４７７頁）。
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なるアフィニティーを有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の場合より実質的に良好に、ＦｃγＲ受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ、８２巻：５７〜６５頁）。全てのＦｃγＲは、ＩｇＧ Ｆｃの同じ領域に結合するが、アフィニティーが異なる：高アフィニティーで結合するＦｃγＲＩのＩｇＧ１に対するＫｄが１０−８Ｍ−１であるのに対し、低アフィニティーの受容体であるＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは一般に、それぞれ、１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外ドメインとＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインとは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内のシグナル伝達ドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａが、免疫複合体によりトリガーされる活性化の正の制御因子であり、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内のドメインを有することを特徴とするのに対し、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。したがって、前者を活性化受容体と称し、ＦｃγＲＩＩｂを、阻害性受容体と称する。異なる免疫細胞ではまた、受容体の発現パターンおよび発現レベルも異なる。複雑性のさらに別のレベルは、ヒトプロテオームにおける多数のＦｃγＲ多型の存在である。臨床的な重要性を伴う特に関与性の多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプに対する場合より大きなアフィニティーでＶ１５８アロタイプに結合する。このアフィニティーの差違、ならびに、おそらくはＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対するその効果は、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））の有効性の重大な決定因子であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプを伴う患者は、リツキシマブ処置に対する応答が良好であるが、低アフィニティーのＦ１５８アロタイプを伴う患者の応答は良好でない（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：７５４〜７５８頁）。ヒトのうちの約１０〜２０％はＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合性であり、４５％はＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合性であり、ヒトのうちの３５〜４５％はＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合性である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ、９４巻：４２２０〜４２３２頁；Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：７５４〜７５８頁）。したがって、ヒトのうちの８０〜９０％は応答が良好ではない、すなわち、少なくとも１つのＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子を有する。
Ｆｃ領域はまた、補体カスケードの活性化にも関係する。古典的な補体経路では、Ｃ１が、そのＣ１ｑサブユニットにより、抗原（複数可）と複合体を形成したＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ断片に結合する。本発明のある特定の実施形態では、Ｆｃ領域に対する修飾が、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の補体系を活性化する能力を変化させる（増強または減殺する）修飾を含む（例えば、米国特許第７，７４０，８４７号を参照されたい）。補体の活性化を評価するためには、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁（１９９６年）を参照されたい）。例えば、多様な濃度の（Ｆｃ）改変体ポリペプチドおよびヒト補体を、緩衝液で希釈することができる。（Ｆｃ）改変体抗体、希釈したヒト補体、および抗原（ＦＮ１４）を発現させる細胞の混合物を、平底の組織培養用９６ウェルプレートに添加し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間にわたりインキュベートさせて、補体媒介性細胞溶解を促進することができる。次いで、５０マイクロリットルのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウェルに添加し、３７℃で一晩にわたりインキュベートすることができる。吸光度は、励起を５３０ｎｍとし、発光を５９０ｎｍとする９６ウェル蛍光測定器を用いて測定することができる。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表すことができる。試料濃度は、標準曲線から算出することができ、改変体でない抗体と比較した活性パーセントを、対象の改変体抗体について報告することができる。
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣの増強、または特定のＦｃγＲに対する結合アフィニティーの増強などの機能的特性を変化させた、修飾Ｆｃ領域を有する抗ＦＮ１４抗体を提供する。Ｆｃ領域の例示的な修飾には、例えば、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６７巻：８８８２頁において記載される修飾が含まれる。本明細書で想定される他の修飾Ｆｃ領域は、例えば、発行された米国特許第７，３１７，０９１号；同第７，６５７，３８０号；同第７，６６２，９２５号；同第６，５３８，１２４号；同第６，５２８，６２４号；同第７，２９７，７７５号；同第７，３６４，７３１号；米国出願公開第ＵＳ２００９０９２５９９号；同第ＵＳ２００８０１３１４３５号；同第ＵＳ２００８０１３８３４４号；および国際出願公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号；同第ＷＯ２００４／０６３３５１号；同第ＷＯ２００６／０８８４９４号；同第ＷＯ２００７／０２４２４９号において記載されている。
抗ＦＮ１４抗体の所望の機能的特性は、ＡＤＣＣアッセイ（実施例の節を参照されたい）、ＡＤＣＰアッセイ、アフィニティー／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合的阻害アッセイ）、細胞傷害性アッセイ、細胞生存度アッセイ（例えば、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ、ヨウ化プロピジウムなどの色素排除を用いるアッセイ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルまたはｉｎ ｖｉｖｏモデル（例えば、細胞増殖および／またはコロニー形成アッセイ、アンカー形成依存性増殖アッセイ、標準的なヒト腫瘍異種移植モデル）を用いるがん細胞および／または腫瘍の成長阻害が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の多様な方法を用いて評価することができる（例えば、Ｃｕｌｐ ＰＡら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１６巻（２号）：４９７〜５０８頁を参照されたい）。他のアッセイでは、本明細書で記載される抗体が、細胞増殖、分化、およびある特定の細胞型では、免疫制御機能など、通常のＦＮ１４を介する応答（Ｂｒａｄｌｅｙ ＪＲおよびＰｏｂｅｒ ＪＳ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００１年、２０巻：６４８２〜９１頁）を遮断する能力を調べることができる。このようなアッセイは、当業者に公知の十分に確立されたプロトコール（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． Ｉｎｃ． ＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ編、Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ、２００１年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）を参照されたい）を用いて実施することもでき、市販のキットを用いて実施することもできる。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸、例えば、ＣＤＲまたはＶＨドメインもしくはＶＬドメインをコードする核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。これらの実施形態および関連する実施形態は、本明細書で記載されるＦＮ１４に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを包含しうる。本明細書で用いられる「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、もしくは合成起源、またはこれらの一部の組合せであるポリヌクレオチドであって、その起源により、（１）その単離ポリヌクレオチドが天然において見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していないか、（２）天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されているか、または（３）天然でより長大な配列の一部としては生じないポリヌクレオチドを意味するものとする。
「作動可能に連結された」という用語は、この用語が適用される構成要素が、適した条件下でそれらがそれらの固有の機能を果たすことを可能とする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、タンパク質コード配列の発現を、制御配列の転写活性と適合可能な条件下で達成するように、タンパク質コード配列にライゲーションされる。
本明細書で用いられる「制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるかまたは作動可能に連結されるコード配列の発現、プロセシング、または細胞内局在化に影響を及ぼしうるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存しうる。具体的な実施形態では、原核生物の転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を包含しうる。他の具体的な実施形態では、真核生物の転写制御配列は、転写因子、転写エンハンサー配列、転写終結配列、およびポリアデニル化配列の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーターを包含しうる。ある特定の実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を包含しうる。
本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドの場合もあり、デオキシリボヌクレオチドの場合もあり、ヌクレオチドのいずれかの種類の修飾形態の場合もある。前記修飾には、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、およびホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。「ポリヌクレオチド」という用語は、特に、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。「修飾ヌクレオチド」という用語は、糖基などが修飾または置換されたヌクレオチドを包含する。「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホルアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を包含する。例えば、それらの開示が任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、８７〜１０８頁（Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻：５４３頁を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能とする検出可能な標識を包含しうる。
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞へと導入するのに用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すのに用いられる。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適し、挿入された異種核酸配列の発現を誘導し、かつ／または制御する核酸配列を含有するベクターを指す。発現には、転写、翻訳、および、イントロンが存在する場合は、ＲＮＡスプライシングなどの過程が含まれるがこれらに限定されない。
当業者が理解する通り、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現させる、またはこれらを発現させるように適合させる場合もある、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミドによりコードされる配列、ならびにより小型の作出された遺伝子セグメントを包含しうる。このようなセグメントは、天然で単離される場合もあり、当業者が合成的に改変する場合もある。
これもまた当業者が認知する通り、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）の場合もあり、二本鎖の場合もあり、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）分子の場合もあり、ＲＮＡ分子の場合もある。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に一対一で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を包含しうる。本開示に従うポリヌクレオチドには、さらなるコード配列または非コード配列を存在させることもできるが存在させなくともよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結することもできるが連結しなくともよい。ポリヌクレオチドは、天然配列を含む場合もあり、このような配列の改変体または誘導体をコードする配列を含む場合もある。
したがって、これらの実施形態および関連する実施形態によれば、配列番号６〜１０、２８〜３３、４３、４５、４７、５１、５３、６１、６３、および６９〜７３のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号６〜１０、２８〜３３、４３、４５、４７、５１、５３、６１、６３、および６９〜７３のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号６〜１０、２８〜３３、４３、４５、４７、５１、５３、６１、６３、および６９〜７３のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体の一部または全部を含むポリヌクレオチドが提供される。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書の別の個所で記載される通り、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列が、ＦＮ１４に結合する抗体またはそれらの抗原結合断片をコードする。
他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチド改変体が、本明細書の配列番号６〜１０、２８〜３３、４３、４５、４７、５１、５３、６１、６３、および６９〜７３で開示される配列に対して実質的な同一性を有することが可能であり、例えば、本明細書で記載される方法（例えば、以下で記載される、標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用い、本明細書で開示される配列など、基準のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む改変体でありうる。当業者は、これらの値を適切に調整して、コドンの縮重性、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置決定などを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定しうることを認識するであろう。
ポリヌクレオチド改変体は、好ましくは、改変体のポリヌクレオチドによりコードされる抗体の結合アフィニティーが、本明細書で具体的に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体と比べて実質的に減殺されないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有することが典型的である。
他のある特定の関連する実施形態では、ポリヌクレオチド断片が、本明細書で開示される配列のうちの１つまたは複数と同一であるかまたは相補的な、多様な長さの配列の連続的なストレッチを含むか、または本質的にこれらからなることが可能である。例えば、本明細書で開示される配列のうちの１つまたは複数のうちの少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００以上の連続ヌクレオチド、ならびにこれらの間の全ての中間の長さを含むか、または本質的にこれらからなるポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」とは、２００〜５００；５００〜１，０００などを通した全ての整数を含め、５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など、引例値の間の任意の長さを意味することが容易に理解される。本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列は、一方または両方の末端において、天然配列において見出されないさらなるヌクレオチドにより伸長させることができる。このさらなる配列は、開示される配列のいずれかの末端または開示される配列の両方の末端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドからなる可能性がある。
別の実施形態では、中程度〜高度なストリンジェンシーの条件下で、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列、またはその断片、もしくはその相補的配列にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドが提供される。分子生物学の技術分野では、ハイブリダイゼーション法が周知である。例示を目的として述べると、本明細書で提供されるポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを調べるのに適する中程度にストリンジェントな条件には、５倍濃度のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液中の前洗浄；５０℃〜６０℃、５倍濃度のＳＳＣ中、一晩にわたるハイブリダイジングの後；０．１％のＳＤＳを含有する２倍濃度のＳＳＣ、０．５倍濃度のＳＳＣ、および０．２倍濃度のＳＳＣの各々による、６５℃で２０分間ずつ２回にわたる洗浄が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを実施する温度を変化させることなどにより容易に操作しうることを理解するであろう。例えば、別の実施形態では、適した高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、ハイブリダイゼーション温度を、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃へと上昇させることを例外として、上記の条件が含まれる。
ある特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド改変体、断片、およびハイブリダイズする配列が、ＦＮ１４に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチドが、特に本明細書で示される抗体配列の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％でＦＮ１４に結合する抗体またはその抗原結合断片もしくはＣＤＲをコードする。さらなる実施形態では、このようなポリヌクレオチドが、本明細書で示される抗体より大きなアフィニティーでＦＮ１４に結合する、例えば、特に本明細書で示される抗体配列の、定量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、または１１０％で結合する、抗体またはその抗原結合断片もしくはＣＤＲをコードする。
代表的なポリペプチド（例えば、本明細書で提供される改変体のＦＮ１４特異的抗体、例えば、本明細書で提供される抗原結合断片を有する抗体タンパク質）の三次元構造の決定は、選択された天然または非天然のアミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入を、このようにして導かれる構造的改変体が本明細書で開示される分子種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で事実上モデル化しうるように、日常的な方法を介して行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４年、Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ．、３巻：２３７８頁；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻：１８６８〜１８７１頁（２００５年）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：６３８頁（２００５年）；Ｄｉｅｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０３巻：１２４４頁（２００６年）；Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：１７６頁（２００７年）；Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：２５９頁（２００７年）；Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１０１４〜１０１８頁（２０１０年）を参照されたい。本明細書で提供されるＦＮ１４特異的抗体およびそれらの抗原結合ドメインの合理的なデザインなど、これらの実施形態および関連する実施形態のために用いうるコンピュータアルゴリズムの一部のさらなる非限定的な例には、生体高分子系の高性能シミュレーションのためにデザインされた並列分子動力学コードであるＮＡＭＤ、ならびに３Ｄ画像およびビルトインスクリプト記述を用いて生体高分子系を表示、動画表示、および解析するための分子画像化プログラムであるＶＭＤが含まれる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６巻：１７８１〜１８０２頁、２００５年；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、「ＶＭＤ − Ｖｉｓｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ」、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｒａｐｈｉｃｓ、１９９６年、１４巻、３３〜３８頁を参照されたい；また、ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／におけるＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイトも参照されたい）。当技術分野では、他の多くのコンピュータプログラムが公知であり、当業者に利用可能であり、エネルギーを最小化したコンフォメーションの空間充填モデル（ファンデルワールス半径）から原子の寸法を決定することを可能とする：異なる化学基に対する高アフィニティー領域を決定し、これにより、結合を増強しようとするＧＲＩＤ、数学的アライメントを計算するモンテカルロ探索、およびＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３年）、Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．、４巻：１８７〜２１７頁）、ならびに力の場の計算および解析を評価するＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１年）、Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．、１０６巻：７６５頁）（また、Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１年）、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６１巻：Ｃ３７６〜３８６頁；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１年）、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｅｌｇ．、４６巻：４９〜５４頁；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８巻：６４０〜６４４頁；Ｂｕｒｂａｍら（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻：９９〜１１１頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５年）、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、６１巻：１８５〜１９０頁；およびＫｉｎｉら（１９９１年）、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｄｙｎ．、９巻：４７５〜４８８頁も参照されたい）。また、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製などの、多様で適切な計算用コンピュータプログラムも市販されている。
本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたはそれらの断片は、コード配列それ自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなど、他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、その結果、その全体の長さが大幅に変化しうる。したがって、ほぼ任意の長さの核酸断片であって、全長が調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける使用により限定されることが好ましい核酸断片を用いうることが想定される。例えば、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含めた）である例示的なポリヌクレオチドセグメントは、有用であると想定される。
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、下記の通りに対応が最大となるようにアライメントしたときに、２つの配列におけるヌクレオチド配列が同じであれば、２つの配列を「同一である」という。２つの配列の間の比較は、典型的に、配列を比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）にわたり比較して、局所的な配列類似性の領域を同定および比較することにより実施される。本明細書で用いられる「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続的な位置のセグメントであって、配列を、同数の連続的な位置を有する基準配列と、これら２つの配列を最適にアライメントした後で比較しうるセグメントを指す。
比較のための最適の配列アライメントは、バイオインフォーマティックスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムでデフォルトのパラメータを用いて実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアライメントスキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．（１９７８年）、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、５巻、補遺３巻、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁（１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ， Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８８年）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ． Ｔｈｅｏｒ、１１巻：１０５頁（１９７１年）；Ｓａｎｔｏｕ， Ｎ． Ｎｅｓ， Ｍ．、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．、４巻：４０６〜４２５頁（１９８７年）；Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ， Ｒ．Ｒ．、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ − ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３年）；Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．， Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８０巻：７２６〜７３０頁（１９８３年）。
代替的に、比較のための最適の配列アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ． ＡＰＬ． Ｍａｔｈ、２巻：４８２頁（１９８１年）による局所的な同一性アルゴリズムを介して実行することもでき、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁（１９７０年）による同一性アライメントのアルゴリズムを介して実行することもでき、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁（１９８８年）による類似性の検索法を介して実行することもでき、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装により実行することもでき、目視により実行することもできる。
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適するアルゴリズムの好ましい一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）において記載されている。例えば、本明細書で記載されるパラメータによりＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０を用いて、２つ以上のポリヌクレオチド間における配列同一性のパーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開されている。例示的な一例では、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（マッチする残基対に対するリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを計算することができる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から分量Ｘだけ低下する場合；１つもしくは複数の負のスコアをもたらす残基アライメントが累積するために、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）によるアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
ある特定の実施形態では、「配列同一性の百分率」は、最適にアライメントした２つの配列を、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって比較することにより決定し、ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列の最適のアライメントのための基準配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、両方の配列で同一な核酸塩基が生じてマッチした位置数をもたらす位置数を決定し、マッチした位置数を基準配列における位置の総数（すなわち、ウインドウのサイズ）で除し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率をもたらすことにより計算する。
当業者は、遺伝子コードの縮重性の結果として、本明細書で記載される抗体をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを認識するであろう。これらのポリヌクレオチドのうちの一部は、ＦＮ１４に結合する抗体をコードする、本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列など、天然のポリヌクレオチド配列または元のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と最小限の配列同一性を保有する。にもかかわらず、本開示では、コドン使用の差違に起因して変化するポリヌクレオチドが明示的に想定される。ある特定の実施形態では、哺乳動物における発現のためにコドンを最適化した配列が、特に想定される。
したがって、本発明の別の実施形態では、本明細書で記載される抗体の改変体および／または誘導体を調製するために、部位特異的変異誘発などの変異誘発手法を使用することができる。この手法では、それらをコードする根底的なポリヌクレオチドの変異誘発を介して、ポリペプチド配列における特定の修飾を行うことができる。これらの技法は、配列改変体を調製して調べる簡便な手法、例えば、１つまたは複数のヌクレオチド配列の変更をポリヌクレオチド内に導入することにより、前出の検討事項のうちの１つまたは複数を組み込むことを提供する。
部位特異的変異誘発は、特異的なオリゴヌクレオチド配列であって、所望の変異を有するＤＮＡ配列をコードする他、横断される欠失接合部の両側において安定的な二重鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列の複雑性を有するプライマー配列をもたらすのに十分な数の隣接するヌクレオチドもコードするオリゴヌクレオチド配列の使用を介する変異体の産生を可能とする。選択したポリヌクレオチド配列における変異を使用して、ポリヌクレオチドそれ自体の特性を改善するか、変化させるか、低下させるか、修飾するか、もしくは他の形で変更することもでき、かつ／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、もしくは一次配列を変化させることもできる。
ある特定の実施形態では、本発明者らは、開示されるポリヌクレオチド配列の変異誘発であって、抗体もしくはその抗原結合断片の結合アフィニティー、または特定のＦｃ領域のＡＤＣＣ機能、またはＦｃ領域の特定のＦｃγＲに対するアフィニティーなど、コードされるポリペプチドの１つまたは複数の特性を変化させる変異誘発を想定する。当技術分野では、部位特異的変異誘発法が周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を創出するのに広く用いられている。例えば、部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子の特定の部分を変化させるのに用いられることが多い。このような実施形態では、典型的に約１４〜約２５ヌクレオチドくらいの長さを含むプライマーを使用し、配列接合部の両側において約５〜約１０残基を変化させる。
当業者により認識される通り、部位特異的変異誘発法では、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用することが多かった。部位指向的変異誘発において有用な典型的ベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージは、市販品の入手が容易であり、当業者にはそれらの使用が一般に周知である。二本鎖プラスミドはまた、対象の遺伝子をプラスミドからファージへと導入するステップを排除する部位指向的変異誘発でも日常的に使用されている。
一般に、本明細書に従う部位指向的変異誘発は、まず所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に包含する、一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの２つの鎖を溶融させて解離させることにより実施する。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成により調製する。次いで、変異保有鎖の合成を完結させるために、このプライマーを、一本鎖ベクターとアニールさせ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片などのＤＮＡ重合化酵素に供する。こうして、一方の鎖が元の非変異配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を保有するヘテロ二重鎖が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な細胞を形質転換し、変異配列の構成を保有する組換えベクターを包含するクローンを選択する。
部位指向的変異誘発を用いて選択されるペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列改変体を調製することにより、潜在的に有用な分子種を産生させる手段がもたらされるが、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を取得し得る他のやり方も存在するので、これは、限定的であることを意味するわけではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミンなどの変異原性剤で処理して、配列改変体を得ることができる。これらの方法およびプロトコールに関する特定の詳細は、各々がその目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｏｙら、１９９４年；Ｓｅｇａｌ、１９７６年；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１年；Ｋｕｂｙ、１９９４年；ならびにＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２年の教示において見出される。
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド指向的変異誘発手順」という用語は、増幅など、特定の核酸分子の濃度のその初期濃度と比べた上昇、または検出可能なシグナル濃度の上昇を結果としてもたらす、鋳型依存的工程およびベクターを介する増殖を指す。本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド指向的変異誘発手順」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を伴う工程を指すことを意図する。鋳型依存的工程という用語は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成であって、核酸の新たに合成される鎖の配列が、相補的な塩基対合についての周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７年を参照されたい）により規定される核酸合成を指す。典型的に、ベクターを介する方法は、核酸断片のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を伴う。このような方法の例は、参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第４，２３７，２２４号により提供されている。
ポリペプチド改変体を産生させるための別の手法では、米国特許第５，８３７，４５８号において記載される、再帰的配列組換えを用いることができる。この手法では、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復的サイクルを実施して、例えば、結合アフィニティーを増大させた個別のポリヌクレオチドの改変体を「進化」させる。また、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態における構築物も提供する。
ある特定の関連する実施形態に従い、本明細書で記載される１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞と；任意の抗体、ＣＤＲ、ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン、またはその抗原結合断片をコードする核酸と；コードされる産物を産生させる方法であって、それをコードする核酸からの発現を含む方法とが提供される。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより好都合に達成しうる。発現による産生の後、抗体またはその抗原結合断片は、任意の適した技法を用いて単離および／または精製し、次いで、所望の通りに用いることができる。
本明細書で提供される抗体またはそれらの抗原結合断片、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然の環境から、実質的に純粋または均一な形態で単離および／または精製することもでき、核酸の場合、所望の機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないかまたは実質的に含まずに単離および／または精製することもできる。核酸は、ＤＮＡを含む場合もあり、ＲＮＡを含む場合もあり、完全に合成する場合もあり、部分的に合成する場合もある。本明細書で示されるヌクレオチド配列に対する言及は、配列を指定したＤＮＡ分子を包含し、配列を指定したＲＮＡ分子を包含する（この場合、文脈により別段に要求されない限り、ＵをＴで置換する）。
多様な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングして発現させるための系が周知である。適した宿主細胞には、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系、およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるのに当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、および他の多くの細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
当技術分野では、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体および抗原結合断片の発現が十分に確立されている。総説には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。当業者にはまた、培養物中の真核細胞における発現も、抗体またはそれらの抗原結合断片を産生させるための選択肢として利用可能であり、近年の総説、例えば、Ｒｅｆ， Ｍ． Ｅ．（１９９３年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、４巻：５７３〜５７６頁；Ｔｒｉｌｌ， Ｊ． Ｊ．ら（１９９５年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、６巻：５５３〜５６０頁を参照されたい。
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含めた適切な調節配列を含有する適したベクターを選ぶまたは構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、ウイルス、例えば、ファージの場合もあり、ファージミドの場合もある。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析において核酸を操作するための多くの公知の技法およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年、またはこれに対するその後の改定版において詳細に記載されている。
「宿主細胞」という用語は、本明細書で記載される抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を導入されたか、または導入された可能性がある細胞、および本明細書で記載される任意の抗体をコードする遺伝子など、選択された対象の遺伝子をさらに発現させるか、またはこれを発現させることが可能な細胞を指すのに用いられる。この用語は、選択された遺伝子が存在する限りにおいて、後代が形態または遺伝子組成において元の親細胞と同一の場合であれ、そうでない場合であれ、親細胞の後代を包含する。したがってまた、このような核酸を宿主細胞へと導入するステップを含む方法も想定される。導入では、任意の利用可能な技法を使用しうる。真核細胞の場合、適した技法には、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、ワクシニア、または、昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適した技法には、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。導入後、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能とすることができる。一実施形態では、核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込む。組込みは、標準的な技法に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を包含することにより促進することができる。
ある特定の実施形態では、本発明はまた、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体など、特定のポリペプチドを発現させるために、上記で言明された構築物を発現系において用いるステップを含む方法も提供する。「形質導入」という用語は、１つの細菌から別の細菌への、通常はファージによる遺伝子の移入を指すのに用いられる。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移入も指す。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡ取込みを指すのに用いられ、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「トランスフェクト」されている。当技術分野では、多数のトランスフェクション法が周知であり、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ、１３巻：１９７頁を参照されたい。このような技法は、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を適した宿主細胞へと導入するのに用いることができる。
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、細胞の遺伝子特徴の変更を指し、新規のＤＮＡを含有するように改変されたとき、細胞は形質転換されている。例えば、その天然状態から遺伝子的に改変される場合、細胞は形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後において、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へと物理的に組み込まれることにより細胞のＤＮＡと組換わる場合もあり、複製されることなくエピソームエレメントとして一過性に維持される場合もあり、プラスミドとして独立に複製される場合もある。ＤＮＡが細胞分裂により複製される場合、細胞は安定的に形質転換されたと考えられる。核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生物学的物質との関連で用いられる場合の「天然に存在する」または「天然の」という用語は、天然において見出され、ヒトにより操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で用いられる「天然に存在しない」または「非天然の」とは、天然において見出されないか、またはヒトにより構造的に修飾されるかもしくは合成された物質を指す。
「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」、ならびに「糖タンパク質」という用語は、互換的に用いられ、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸鎖であって、各鎖が、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質が、天然タンパク質、すなわち、天然に存在する細胞、および、特に非組換え細胞により産生されたタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有する、ペプチド結合により非共有結合的および／または共有結合的に併せて連結された複数の鎖を含むことが可能であり、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、これらに対する付加、および／もしくはこれらに対する置換を有する分子を含みうるアミノ酸鎖を意味する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に本開示のＦＮ１４に結合する抗体、または抗ＦＮ１４抗体の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、これらに対する付加、および／もしくはこれらに対する置換を有する配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸鎖のうちの１つ（「単量体」と呼ばれる）を含む場合もあり、複数（「多量体」と呼ばれる）を含む場合もある。
本明細書で言及される「単離タンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には天然においてそれと共に見出される少なくとも数種の他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ供給源に由来する他のタンパク質、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種に由来する細胞を介して発現すること、（４）それが天然において会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質のうちの少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）「単離タンパク質」が天然において会合するタンパク質の部分と会合（共有結合的相互作用を介する場合もあり、非共有結合的相互作用を介する場合もある）していないこと、（６）それが天然において会合しないポリペプチドと作動可能に会合（共有結合的相互作用を介する場合もあり、非共有結合的相互作用を介する場合もある）していること、または（７）天然において発生しないことを意味する。このような単離タンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡによりコードされる場合もあり、合成起源の場合もあり、これらの任意の組合せの場合もある。ある特定の実施形態では、単離タンパク質が、その天然の環境において見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物であって、その使用（治療的使用、診断的使用、予防的使用、研究のための使用、または他の形の使用）に干渉するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
「ポリペプチド断片」という用語は、単量体の場合もあり、多量体の場合もあるポリペプチドであって、天然に存在するポリペプチドまたは組換えにより産生させたポリペプチドのアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失もしくは置換を有するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含みうる。ある特定の実施形態では、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることが認識される。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは抗原結合断片を含めた機能的ドメインを包含する。抗ＦＮ１４抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、特に、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変領域、抗体鎖の部分または２つのＣＤＲを含めたそのちょうどの可変領域などが含まれるがこれらに限定されない。
ＦＮ１４特異的抗体を生成させる方法
本発明のある特定の実施形態に従う抗体は、ＤＴ４０ニワトリＢ細胞リンパ腫系列に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ系を用いて生成させることができる。ＤＴ４０ニワトリＢ細胞リンパ腫系列は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける抗体進化のために用いられてきた（Ｃｕｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、１１２９〜１１３４頁（２００２年）；Ｓｅｏ， Ｈ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３巻、７３１〜７３５頁（２００５年））。ＤＴ４０細胞は、それぞれ、鋳型による変異および鋳型によらない変異を創出する、多様化の２つのはっきり異なる生理学的経路である、遺伝子転換および体細胞超変異を利用しうるので、膨大なＶ領域配列の潜在的多様性を駆使する（Ｍａｉｚｅｌｓ， Ｎ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、３９巻、２３〜４６頁（２００５年））。しかし実のところ、抗体進化のためのＤＴ４０細胞の有用性は、多様化が（他の形質転換されたＢ細胞系における場合と同様）生理学的速度の１％未満で生じるために、限定されている。多様化は、相同組換え経路を無効化することにより数倍加速化しうる（Ｃｕｍｂｅｒｓら、前出）が、このようにして操作された細胞は、効率的な遺伝子ターゲティングを実行する能力を失う。多様化はまた、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡで細胞を処理することによっても加速化しうる（Ｓｅｏら、前出）が、結果として得られる変異は、もっぱら鋳型による変異であり、潜在的な多様性は制限され、必要とされるアフィニティーまたは特異性を有する抗体を産生させることはできない。
ある特定の実施形態では、本明細書で抗体を生成させるのに用いられるＤＴ４０細胞を改変して、さらなる遺伝子改変能、または遺伝子転換および体細胞超変異の両方が変異誘発に寄与する可能性を犠牲にすることなしに、Ｉｇ遺伝子の多様化速度を加速化する。これは、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の多様化を、強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーター／リプレッサー制御ネットワークの制御下に置くことにより実現された。強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーターが約１００重合化した反復配列からなる多量体（ＰｏｌｙＬａｃＯ）を、相同遺伝子ターゲティングにより、再配列して発現させたＩｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の上流に挿入した（実施例１；図１ａを参照されたい）。次いで、ラクトースリプレッサーのオペレーターＤＮＡに対する高アフィニティー（ＫＤ＝１０−１４Ｍ）を利用して、ラクトースリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）に融合させた制御因子を、ＬａｃＯ制御エレメントへとテザーして、多様化を制御することができる。ＰｏｌｙＬａｃＯがＩｇλだけに組み込まれたＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞は、任意の操作前の親ＤＴ４０細胞と比べて、Ｉｇ遺伝子の多様化速度の５倍の増大を呈示した（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年））。多様化は、Ｉｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の両方を標的としたＰｏｌｙＬａｃＯを保有するように操作された細胞（「ＤＴＬａｃＯ」）においてさらに上昇した。本明細書の実施例において示される通り、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をＰｏｌｙＬａｃＯエレメントの標的とすることにより、多様化は、ＤＴ４０親細胞系と比べて２０倍を超えて加速化された。
一実施形態では、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方においてＰｏｌｙＬａｃＯを保有する、操作されたＤＴＬａｃＯ系列を、ｅｘ ｖｉｖｏにおける抗体発見の出発点として用いることができる。例えば、実施例において記載される通り、１０７〜１０１０個のＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１細胞による多様化集団から出発して、ＦＮ１４に結合する細胞を、ＦＮ１４を保有する固体のマトリックス（Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ）における選択ラウンドおよびＦＡＣＳにより濃縮した。当業者により認識される通り、他の選択方法（例えば、ＦＮ１４に対する抗体の結合特異性に基づく）もまた用いることができる。次いで、本明細書で記載される標準的な技法を用いて、所望の結合特徴を有する組換えキメラモノクローナル抗体を生成させる。
次いで、ある特定の実施形態（例えば、本明細書で記載される抗ＦＮ１４抗体の改変体を生成させるための実施形態；本明細書で記載される抗ＦＮ１４抗体の結合を遮断する抗体を生成させるための実施形態）では、パニングおよび細胞：標的細胞間結合が含まれるがこれらに限定されない多様なハイスループット手法のうちのいずれかを用いて、抗原特異的ＤＴＬａｃＯ細胞の選択について調べることができる。例えば、低い百分率でＦＮ１４特異的細胞を含有する多様なＤＴＬａｃＯ集団を、プラスチック製のマトリックスに結合させた、複数の可溶性抗原の標的アレイと共にインキュベートすることにより、パニングを実行することができる。パニングにより、ＦＮ１４特異的ＤＴＬａｃＯ細胞が著明に濃縮される。ＤＴＬａｃＯ：標的細胞による選択は、低百分率のＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ ＦＮ１４結合細胞または選択されていないＤＴＬａｃＯを含有した多様なＤＴＬａｃＯ集団を、対象の抗原を発現させる標的細胞、例えば、細胞表面において天然ＦＮ１４または組換えＦＮ１４を構成的または一過性に発現させるＦＮ１４発現細胞と共に共インキュベートし、次いで、フローサイトメトリーにより、標的細胞へと結合したＤＴＬａｃＯ細胞を定量化することにより実行することができる。ＤＴＬａｃＯの標的細胞との相互作用は、はるかに小型の遊離ＤＴＬａｃＯ細胞に由来するシグナルが前方散乱に基づき消失するドットプロット上のＣＦＳＥ陽性イベントとして明らかである。
ある特定の実施形態（例えば、本明細書で記載される抗ＦＮ１４抗体の結合を遮断する抗体を生成させるための実施形態）では、抗体を、ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３においてさらに記載されるのと同様に、特定のポリペプチドの多様性を生成させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を用いて調製することができる。特に、これらの適用は一般に、標的遺伝子の多様化の可逆的誘導を可能にする、本明細書の上記で記載したＤＴ４０細胞系など、改変Ｂ細胞に関する。例示的なＢ細胞はＤＴ４０ Ｂ細胞系であるが、ヒトＢ細胞を含めた他のＢ細胞の使用が想定される。ＤＴ４０とは、その培養中の重鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子および軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子を、構成的に変異させることが公知のニワトリＢ細胞系である。他のＢ細胞と同様、この構成的な変異誘発は、Ｉｇ遺伝子のＶ領域を変異の標的とし、したがって、発現する抗体分子のＣＤＲを変異の標的とする。ＤＴ４０細胞における構成的な変異誘発は、各機能的Ｖ領域の上流に位置する一連の非機能的Ｖ遺伝子セグメント（Ｖ偽遺伝子；ΨＶ）をドナー配列として用いる遺伝子転換を介して起こる。ΨＶ領域の欠失は、多様化機構の切換えであって、遺伝子転換から、ヒトＢ細胞において一般に観察される機構である体細胞超変異への切換えを引き起こすことが既に示されている。ＤＴ４０はまた、特定の遺伝子を修飾するか、欠失させるか、もしくは挿入した改変細胞、または特定の対象の遺伝子が内因性遺伝子を置き換えた改変細胞、特に、内因性の再配列されたＩｇ遺伝子を置き換えた改変細胞の創出を可能とする効率的な相同組換えを支援することも示されている。
ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３において記載される系は、これらの特性および他の特性を利用して、標的配列を多様化するためのプラットフォームを創出している。より具体的に述べると、その最も広範な形態において、これらの文献では、標的遺伝子の多様化の可逆的誘導を可能にする改変Ｂ細胞が記載されている。細胞は、対象の標的遺伝子に作動可能に連結した「シス制御エレメント」を包含するように改変する。細胞は、「テザー因子（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）」に融合させた「多様化因子」を包含するようにさらに改変する。テザー因子の機能は、シス制御エレメントに結合し、これにより、多様化因子を標的遺伝子の発現を制御する領域へともたらすことである。多様化因子の役割は、標的配列の多様化（変異）を加速化または制御することである。標的遺伝子をＩｇ遺伝子座へと挿入してからは、多様化因子−テザー因子融合タンパク質を用いることにより、変異をそのコード領域へと標的化し、制御する。一般に、シス制御エレメントは、テザー因子の、シス制御エレメントへの、配列特異的な形での結合を可能とし、遺伝子（対象の遺伝子）の発現または多様化を制御する領域に位置付けられる任意のＤＮＡ配列でありうる。シス制御エレメントには、２０塩基対のＬａｃＯ結合部位による約１００の反復配列を含む重合化ラクトースオペレーター（ＰｏｌｙＬａｃＯ）が含まれる。シス制御エレメントは、Ｉｇλ軽鎖遺伝子座およびＩｇＨ遺伝子座のΨＶ領域内に位置付けられる。テザー因子には、高アフィニティーでＬａｃＯに結合するＬａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）が含まれる。シス制御エレメントのこの挿入は、改変ＤＴ４０細胞系における通常の鋳型による変異誘発（遺伝子転換）過程には影響を及ぼさない。
ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３による系の誘導性の側面は、テザー因子（ＬａｃＩ）−多様化因子融合タンパク質の発現およびＬａｃＩのＬａｃＯからの放出を引き起こす低分子である、ＩＰＴＧの使用を介して生じる。１０μＭという少量のＩＰＴＧを伴う改変ＤＴ４０細胞の培養物は、ＬａｃＩのＰｏｌｙＬａｃＯからの放出を引き起こし、細胞の増殖には影響を及ぼさない。多くの異なる多様化因子が想定され、これらには、クロマチン構造、転写活性化因子、および他の遺伝子制御因子、デアミナーゼ、ＤＮＡの修復および複製に関係するタンパク質、レソルバーゼおよびヘリカーゼ、細胞周期制御因子、核膜孔複合体タンパク質、およびユビキチン化に関係するタンパク質に影響を及ぼす因子が含まれる。異なるテザー因子−多様化因子構築物には、以下が含まれる：１）ＬａｃＩ−ＨＰ１：ヘテロクロマチンタンパク質であるＨＰ１は、近傍遺伝子のクロマチン構造の閉鎖を促進する。したがって、ＬａｃＩが改変ＤＴ４０細胞内のＰｏｌｙＬａｃＯに結合すると、テザーされたＨＰ１タンパク質は、ドナーΨＶ配列の、クロマチン解放状態からクロマチン複製阻害状態への転移を引き起こした。これは、ΨＶ領域の欠失と機能的に同等であり、下流のＩｇ Ｖλ遺伝子座の鋳型による変異誘発から、この標的とされる領域の体細胞超変異への切換えも同様に結果としてもたらした。２）ＬａｃＩ−ＶＰ１６：ＶＰ１６とは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体を動員することにより機能する強力な転写活性化因子である。ＬａｃＩ−ＶＰ１６融合体のＰｏｌｙＬａｃＯ経路への結合は、許容性のクロマチン構造および遺伝子転換により標的とされるＶλ領域の変異誘発の増大を結果としてもたらした。３）ＬａｃＩ−Ｎｕｐ１５３：Ｎｕｐ１５３とは、核膜孔タンパク質であり、ＬａｃＩ−Ｎｕｐ１５３融合タンパク質は、改変ＤＴ４０細胞内のＩｇＨ遺伝子座を核膜孔へとテザーするように機能した。Ｉｇ遺伝子の多様化は、核外搬出シグナルを保持する活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）により媒介されて核周縁部で始まることが示されているので、ＬａｃＩ−Ｎｕｐ１５３融合タンパク質のＰｏｌｙＬａｃＯ経路への結合の効果は、核膜孔に対する遺伝子の近接性を増大させることにより多様化を加速化することであった。記載された実験は、クローンの多様化速度が５．７倍加速化されることを示す。４）Ｅ４７−ＬａｃＩ：Ｅ４７とは、Ｅ２Ａのアイソフォームであり、リンパ球発生の多くの側面に対する制御因子である。このタンパク質は、それがクラススイッチ組換えならびにＡＩＤ遺伝子の発現を制御する活性化マウスＢ細胞において誘導される。Ｅ２Ａ遺伝子の不活化は、Ｉｇλ遺伝子の多様化を損なう。同様に、Ｅ４７の異所性発現は、Ｉｇλ遺伝子の多様化を促進する。したがって、Ｅ４７−ＬａｃＩ融合タンパク質の、改変ＤＴ４０細胞内のＰｏｌｙＬａｃＯシス制御エレメントへの結合は、標的とされる下流の遺伝子の多様化の増大を結果としてもたらした。５）ＨＩＲＡ−ＬａｃＩ：ＨＩＲＡとは、ヒストンのシャペロンである。その機能の１つは、Ｈ３．３ヒストン改変体を含有するヌクレオソームを組み立てることである。ＰｏｌｙＬａｃＯ改変ＤＴ４０細胞におけるＨＩＲＡ−ＬａｃＩ融合タンパク質の発現は、多様化を１１倍に増大させた。この加速化は、鋳型による変異（遺伝子転換）レベルの上昇に起因することが示された。
ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３において記載される改変Ｂ細胞は、変異タンパク質を生成させるのに用いることができ、ある特定の実施形態では、例えば、本明細書で記載される抗体の、それらのコグネイト抗原への特異的結合を、競合的阻害を介して遮断する抗体など、抗ＦＮ１４抗体を生成させるのに用いることができる。
ＦＮ１４機能のモジュレーター、アゴニスト、またはアンタゴニストである、本明細書で記載されるＦＮ１４結合抗体またはその抗原結合断片は、想定される実施形態内に明示的に包含される。これらのアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーターである抗体またはその抗原結合断片は、ＦＮ１４の抗原決定部位またはＦＮ１４のエピトープ断片もしくはエピトープ改変体のうちの１つまたは複数と相互作用する。
当業者により認識される通り、標準的な技術を含め、ＦＮ１４などの特定の抗原に結合する抗体を作製する多くの公知の方法が存在し、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい。一般に、本明細書で明示的に開示されるＦＮ１４結合抗体の、それらのコグネイト抗原への結合を特異的に遮断する抗体などの抗体は、本明細書で記載されるモノクローナル抗体の生成を含めた細胞培養法により産生させることもでき、組換え抗体の産生を可能とするための、抗体遺伝子の、適した細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションを介して産生させることもできる。ある特定の実施形態では、ポリペプチド抗原を含む免疫原（例えば、配列番号８９に示されるアミノ酸配列を含むヒトＦＮ１４タンパク質）を最初に、多種多様な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）のうちのいずれかへと注射する。このステップでは、ポリペプチドが、修飾を伴わない免疫原として働きうる。代替的に、特に、比較的短いポリペプチドでは場合によって、ポリペプチドを、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質へと接合すると、優れた免疫応答を誘発することができる。免疫原は、好ましくは１回または複数回の追加の免疫化を組み込む所定のスケジュールに従い動物宿主へと注射し、動物から定期的に採血する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、例えば、適した固体の支持体と共役させたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製することができる。
ある特定の実施形態では、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１〜５１９頁、１９７６年による技法、およびこれに対する変法を用いて、対象の抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。略述すると、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、対象のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生させることが可能な不死化細胞系の調製を伴う。このような細胞系は、例えば、上記の通りに免疫化した動物から得られる脾臓細胞から産生させることができる。次いで、例えば、骨髄腫細胞の融合パートナー、好ましくは免疫化した動物と同系の融合パートナーと融合させることにより脾臓細胞を不死化させる。多様な融合法を使用することができる。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞を、非イオン性洗浄剤と数分間にわたり組み合わせ、次いで、ハイブリッド細胞の成長は支援するが、骨髄腫細胞の成長は支援しない選択培地上に低密度で播種する。好ましい選択法では、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な期間の後、通常は約１〜２週間後、ハイブリッド体のコロニーを観察する。単一のコロニーを選択し、それらの培養上清をポリペプチドに対する結合活性について調べる。反応性および特異性の高いハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマコロニーを成長させる上清から単離することができる。加えて、マウスなど、適した脊椎動物宿主の腹腔へのハイブリドーマ細胞系の注射など、収量を増強する多様な技法も用いることができる。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から採取することができる。クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出など、従来の技法により夾雑物を抗体から除去することができる。精製工程、例えば、アフィニティークロマトグラフィーステップでは、ポリペプチドを用いることができる。
使用方法および医薬組成物
本明細書では、ＦＮ１４に結合する抗体を用いる処置方法が提供される。一実施形態では、本発明の抗体を、ＦＮ１４の不適切な発現を伴う疾患であって、本開示の文脈では、例えば、存在するタンパク質の量の変化（例えば、統計学的に有意な増大または減少）、もしくは変異体タンパク質の存在、またはこれらの両方に起因する、異常なＦＮ１４を特徴とする疾患および障害を包含することを意味する疾患を有する患者に投与する。過剰量は、ＦＮ１４の分子レベルにおける通常の検出可能な発現と比べた過剰発現、作用部位における通常の検出可能な出現と比べて長期にわたるかもしくは累積的な出現、または通常の検出可能な活性と比べた活性の増大（例えば、統計学的に有意な形での増大）が含まれるがこれらに限定されない任意の原因に起因しうる。ＦＮ１４のこのような過剰量は、ＦＮ１４の正常な発現、出現、または活性と比べて測定することができ、前記測定は、本明細書で記載される抗体の開発および／または臨床試験において重要な役割を果たしうる。
特に、本抗体は、ＦＮ１４の発現と関連する多様ながんの処置に有用である。例えば、本発明の一実施形態は、治療有効量の、本明細書で開示されるＦＮ１４特異的抗体をがん患者に投与することにより、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；腺癌および扁平上皮癌の両方）、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫が含まれるがこれらに限定されないがんを処置するための方法を提供する。投与後、統計学的に有意な形で（すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べて）がんを阻害するか、がんの発生の可能性を低減するか、がんの進行および／または転移を防止するかまたは遅延させる量を有効であると考える。
別の実施形態は、治療有効量（例えば、投与後、統計学的に有意な形で、すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べてがんを阻害するか、がんの発生の可能性を低減するか、がんの転移を防止するかまたは遅延させる量）の、本明細書で開示されるＦＮ１４特異的抗体をがん患者に投与することにより、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；腺癌および扁平上皮癌の両方）、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫が含まれるがこれらに限定されないがんの転移を防止するか、またはその発生の可能性を低減するための方法を提供する。
別の実施形態は、治療有効量の、本明細書で開示されるＦＮ１４特異的抗体をがん患者に投与することにより、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；腺癌および扁平上皮癌の両方）、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫が含まれるがこれらに限定されないがんを防止するか、またはその発生の可能性を低減するための方法を提供する。
別の実施形態は、ＦＮ１４の発現と関連する炎症または炎症性疾患を処置するか、その重症度を低減するか、その発生の可能性を低減するか、またはこれを防止するための方法を提供する（例えば、Ｈｏｔｔａら、２０１０ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＰＭＩＤ：２０９２７０４２を参照されたい）。例えば、本発明の一実施形態は、クローン病、大腸炎、皮膚炎、乾癬、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、関節炎、関節リウマチ、喘息、ならびにアテローム性動脈硬化および血管炎などの多様な心血管疾患が含まれるがこれらに限定されない炎症または炎症性疾患を処置するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、炎症性疾患が、関節リウマチ、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期性症候群、および慢性閉塞性肺障害からなる群より選択される。この点で、一実施形態は、治療有効量の、本明細書で開示されるＦＮ１４特異的抗体を、それを必要とする患者に投与することにより、炎症または炎症性疾患を処置するか、またはその発生の可能性を低減するか、その重症度を低減するか、またはこれを防止する方法を提供する。
想定されるある特定の実施形態では、本明細書で開示されるＦＮ１４特異的抗体が、患者に投与される唯一の治療的に活性な薬剤である。代替的に、他のある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体を、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、抗炎症剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、または他の治療剤が含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与する。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて存在させるのに適する。熟達した医療従事者は、本明細書で有用な他の治療剤の１つまたは複数の適切な用量を経験的に決定することができる。抗体は、１つまたは複数の他の治療レジメンと共に併用投与することができる。例えば、抗体は、化学療法、放射線療法、または化学療法および放射線療法の両方と共に患者に投与することができる。一実施形態では、抗体を、治療的利益をもたらすことが当技術分野で公知の１つまたは複数の他の抗体と共に投与することができる。
一実施形態では、本明細書で記載される抗体を化学療法剤と共に投与する。「化学療法剤」とは、がんの処置において有用な化合物を意味する。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェンメトラジン（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；チミジル酸シンターゼ阻害剤（Ｔｏｍｕｄｅｘなど）；セリコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））またはＭＫ−０９６６（ＶＩＯＸＸ（登録商標））などのｃｏｘ−２阻害剤；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるがこれらに限定されない。また、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤、４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体など、腫瘍に対するホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
化学療法剤または他の細胞傷害剤は、プロドラッグとして投与することができる。本明細書で用いられる「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してより細胞傷害性ではなく、酵素的に活性化するか、または活性のより大きな親形態へと転換することが可能な、薬学的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態を意味する。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、１９８６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ、１４巻：３７５〜３８２頁；およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ： Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（編）：２４７〜２６７頁、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９８５年を参照されたい。本明細書で想定されるある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体と共に用いうるプロドラッグに、活性のより大きな遊離細胞傷害性薬へと転換されうる、ホスフェートを含有するプロドラッグ、チオホスフェートを含有するプロドラッグ、スルフェートを含有するプロドラッグ、ペプチドを含有するプロドラッグ、Ｄ−アミノ酸で修飾されたプロドラッグ、グリコシル化されたプロドラッグ、ベータ−ラクタムを含有するプロドラッグ、場合によって置換されたフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または、場合によって置換されたフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシンプロドラッグ、および他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれうるがこれらに限定されない。本ＦＮ１４特異的抗体と共に用いられるプロドラッグ形態へと誘導体化しうる細胞傷害性薬の例には、前述の化学療法剤のうちのいずれかが含まれるがこれらに限定されない。
本ＦＮ１４特異的抗体は、他の治療レジメンと組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、抗体により処置される患者はまた、放射線療法も施されうる。放射線療法は、当技術分野で一般に使用され、当業者に公知のプロトコールに従い投与することができる。このような療法には、当技術分野で許容される放射性同位元素であるセシウム、イリジウム、ヨウ素、またはコバルトへの照射による曝露が含まれるがこれらに限定されない。放射線療法は、全身照射の場合もあり、肺、膀胱、または前立腺など、体内または体表における特定の部位または組織へと局所的に方向付ける場合もある。典型的に、放射線療法は、パルスで、約１〜２週間の期間にわたり投与する。しかし、放射線療法は、より長期間にわたり投与する場合もある。例えば、放射線療法は、頭頸部がんを有する患者に約６〜約７週間にわたり投与する場合もある。場合によって、放射線療法は、単回線量として投与する場合もあり、複数回の逐次線量として投与する場合もある。熟達した医療従事者は、本明細書で有用な放射線療法の１回または複数回の適切な線量を経験的に決定することができる。別の実施形態に従い、本ＦＮ１４特異的抗体および１つまたは複数の他の抗がん療法を使用して、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてがん細胞を処置することができる。このようなｅｘ ｖｉｖｏにおける処置は、骨髄移植において有用な場合があり、特に、自系骨髄移植において有用でありうることが想定される。例えば、がん細胞を含有する細胞または組織（複数可）の、抗体および上記の抗がん療法などの１つまたは複数の他の抗がん療法による処置を使用して、レシピエント患者における移植前のがん細胞を枯渇させるか、または実質的に枯渇させることができる。当然ながら、本明細書で記載される抗体を、手術などのさらに他の治療法と組み合わせて使用しうることが想定される。
代替的な実施形態では、本明細書で記載される抗体を、サイトカインと共に投与することができる。本明細書で用いられる「サイトカイン」とは、１つの細胞集団により放出されるタンパク質であって、別の細胞に対して細胞間メディエーターとして作用するタンパク質についての総称的な用語を意味する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび腫瘍壊死因子−ベータ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、およびインターフェロン−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で用いられるサイトカインという用語は、天然の供給源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物を包含する。
本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体を伴う投与には、他の多様な治療剤も用いることができる。一実施形態では、抗体を、抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または抗炎症薬には、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含めた）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンを含めた非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、免疫選択的抗炎症性誘導体（ｉｍＳＡＩＤＳ）（例えば、Ｂａｏ Ｆら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．、２００６年７月７日、１４０巻（３号）：１０１１〜２２頁；Ｍａｔｈｉｓｏｎ ＲＤら、ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年３月４日；４巻：３頁を参照されたい）、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、およびミコフェノール酸塩が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体を伴う投与には、他の多様な治療剤も用いることができる。一実施形態では、抗体を、抗血管新生剤と共に投与する。本明細書で用いられる「抗血管新生剤」とは、血管の発生を遮断するか、またはこれにある程度干渉する化合物を意味する。例えば、抗血管新生因子は、低分子またはタンパク質、例えば、血管新生の促進に関係する増殖因子もしくは増殖因子受容体に結合する抗体またはサイトカインでありうる。本明細書で好ましい抗血管新生因子は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。代替的な実施形態では、抗体を、適応免疫応答を誘導するかまたは増強する治療剤、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体と共に投与する。代替的な実施形態では、抗体をチロシンキナーゼ阻害剤と共に投与する。本明細書で用いられる「チロシンキナーゼ阻害剤」とは、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。このような阻害剤の例には、ＰＤ １５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ ５９３２６、ＣＧＰ ６０２６１、およびＣＧＰ ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジンである４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するトリホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；アンチセンス分子（例えば、ＥｒｂＢをコードする核酸に結合するアンチセンス分子）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ａ Ｇ）；Ｃ１−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）などのｐａｎ−ＥｒｂＢ阻害剤；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；メシル酸イマチニブ（ＳＴ１５７１、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ １６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｃ１−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；Ｓｅｍａｘｉｎｉｂ（Ｓｕｇｅｎ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＩＮＣ−１−Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；または以下の特許公開：米国特許第５，８０４，３９６号；ＰＣＴ ＷＯ９９／０９０１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎｉｍｉｄ）；ＰＣＴ ＷＯ９８／４３９６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；ＰＣＴ ＷＯ９７／３８９８３（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＰＣＴ ＷＯ９９／０６３７８（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＰＣＴ ＷＯ９９／０６３９６（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＰＣＴ ＷＯ９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９７８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９７（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標）、ＺＤ１８３９、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、およびＯＳＩ−７７４（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のうちのいずれかにおいて記載される阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。
想定される別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体を、本明細書ではコンジュゲートと称する、別の治療用化合物とコンジュゲートすることもでき、これに作動可能に連結することもできる。コンジュゲートは、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、毒素、放射性同位元素、または他の治療的に活性な薬剤でありうる。化学療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、および他の治療剤については上記で記載したが、これらの前述の治療剤の全てを、抗体コンジュゲートとして用いることができる。
代替的な実施形態では、抗体を、それらの断片および／または改変体を含めた、細菌起源、真菌起源、植物起源、または動物起源の低分子毒素および酵素的に活性な毒素が含まれるがこれらに限定されない毒素とコンジュゲートするか、またはこれに作動可能に連結する。低分子毒素には、サポリン（Ｋｕｒｏｄａ Ｋら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ、７０巻：１２８６〜１２９４頁（２０１０年）；Ｌｉｐ， ＷＬ．ら、２００７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、４巻：２４１〜２５１頁；Ｑｕａｄｒｏｓ ＥＶ．ら、２０１０年、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、９巻（１１号）；３０３３〜４０頁；Ｐｏｌｉｔｏ Ｌ．ら、２００９年、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１４７巻、７１０〜７１８頁）、カリケアマイシン、マイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５が含まれるがこれらに限定されない。毒素には、ＲＮアーゼ、ゲロニン、エンジイン、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素（ＰＥ４０）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。
ある特定の関連する実施形態では、抗体を、１つまたは複数のマイタンシン分子（例えば、抗体分子１つ当たり約１〜約１０のマイタンシン分子）とコンジュゲートする。例えば、マイタンシンを、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅへと転換することができ、これをＭａｙ−ＳＨ３へと還元して、修飾抗体と反応させ（Ｃｈａｒｉら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁）て、マイタンシノイド−抗体コンジュゲートを生成させることができる。別の対象のコンジュゲートは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度以下で二本鎖ＤＮＡの切断をもたらすことが可能である。また、カリケアマイシンの構造的類似体も用いることができる（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３巻：３３３６〜３３４２頁；Ｌｏｄｅら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８巻：２９２５〜２９２８頁）（米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）。アウリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）など、ドラスタチン１０の類似体も、本明細書で開示される抗体またはその改変体のコンジュゲートとして用いることができる（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、２００３年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１巻（７号）：７７８〜８４頁；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ、１０２巻（４号）：１４５８〜６５頁）。酵素的に活性な有用な毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉのタンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれるがこれらに限定されない。例えば、ＰＣＴ ＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。本開示は、コンジュゲートまたは融合体を、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体と、核酸分解活性を伴う化合物、例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）などのＤＮＡエンドヌクレアーゼとの間で形成させる実施形態もさらに想定する。
代替的な実施形態では、本明細書で開示される抗体は、放射性同位元素にコンジュゲートするかまたはこれに作動可能に連結して、放射性コンジュゲートを形成することができる。放射性コンジュゲート抗体を産生させるには、多様な放射性同位元素が利用可能である。例には、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが含まれるがこれらに限定されない。
他のある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体を、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤）、治療剤、または放射性元素（例えば、アルファ放射体、ガンマ放射体など）などの治療用部分とコンジュゲートすることができる。細胞毒または細胞傷害剤には、細胞に対して有害な任意の薬剤が含まれる。例には、パクリタキセル／パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または同族体が含まれる。１つの好ましい例となる細胞毒は、サポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）である。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ；シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらに限定されない。
さらに、ある特定の実施形態では、ＦＮ１４特異的抗体（本明細書で提供される抗原結合断片など、その機能的断片を含めた）を、放射性金属イオンをコンジュゲートするのに有用な放射性物質または大環状キレート化剤などの治療用部分とコンジュゲートすることができる。ある特定の実施形態では、大環状キレート化剤が、リンカー分子を介して抗体へと付着されうる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８年、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４巻：２４８３〜９０頁；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、１０巻：５５３号；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９年、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．、２６巻：９４３〜５０頁において記載されている。
さらに別の実施形態では、抗体を、腫瘍のプレターゲティングにおいて使用される「受容体」（ストレプトアビジンなど）であって、抗体−受容体コンジュゲートが患者に投与された後、清澄化剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて、結合しなかったコンジュゲートが循環から除去され、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が行われる受容体とコンジュゲートすることができる。代替的な実施形態では、抗体依存性酵素介在性プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を使用するために、抗体を、酵素とコンジュゲートするか、またはこれに作動可能に連結する。ＡＤＥＰＴは、抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル系化学療法剤；ＰＣＴ ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を、活性な抗がん薬へと転換するプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートすることにより用いることもでき、これに作動可能に連結することにより用いることもできる。例えば、ＰＣＴ ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、それを活性のより大きな細胞傷害性形態へと転換するようなやり方でプロドラッグに作用することが可能な任意の酵素が含まれる。これらの実施形態および関連する実施形態による方法において有用な酵素には、ホスフェートを含有するプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェートを含有するプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗がん薬である５−フルオロウラシルへと転換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含有するプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なセラチア菌プロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸の置換基を含有するプロドラッグを転換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｍｉｄａｓｅ）などの炭水化物切断酵素；α−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物へと転換するのに有用なベータ−ラクタマーゼ；およびそれらのアミン窒素において、それぞれ、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導体化された薬物を遊離薬物へと転換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるがこれらに限定されない。代替的に、当技術分野ではまた「アブザイム」としても公知の酵素活性を伴う抗体を用いて、プロドラッグを遊離の活性薬物へと転換することもできる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、３２８巻：４５７〜４５８頁を参照されたい）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、アブザイムを腫瘍細胞集団へと送達するために調製することができる。
また、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の他の修飾も想定される。例えば、抗体を、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの１つと連結することができる。別の実施形態では、抗体を、分化誘導剤または薬物、およびこれらの誘導体と共役させることができる。例となる薬物には、メトトレキサート、ならびにピリミジン類似体およびプリン類似体が含まれうるがこれらに限定されない。例となる分化誘導剤には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれうるがこれらに限定されない。
本発明のある特定の実施形態では、多様なリンカーを用いて、抗体コンジュゲートを生成させることができる。本明細書では、「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「テザー配列」、またはこれらの文法的同等物が、２つの分子を接続し、２つの分子を好ましい立体配置に置くように働くことが多い分子または分子群（単量体またはポリマーなど）を意味する。多数の戦略を用いて、分子を併せて共有結合的に連結することができる。これらには、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端とのポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介する結合、および化学架橋試薬を介する連結が含まれるがこれらに限定されない。
このような一実施形態では、リンカーが、組換え法またはペプチド合成により生成させるペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続される特定の場合に適したリンカーの選択は、２つのポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが天然でオリゴマー化するのかどうか）、公知の場合は、接続されるＮ末端とＣ末端との距離、ならびに／またはタンパク質分解および酸化に対するリンカーの安定性が含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数の多様なパラメータに依存しうる。さらに、リンカーは、可撓性をもたらすアミノ酸残基を含有しうる。したがって、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒのうちの１つまたは複数を主に包含しうる。リンカーペプチドは、２つの分子を、所望の活性を保持するように、互いに対して適正なコンフォメーションをとるようなやり方で連結するのに適当な長さを有するべきである。この目的に適する長さには、少なくとも１アミノ酸残基であり、かつ、３０アミノ酸残基以下である長さが含まれる。リンカーは、約１〜３０アミノ酸の長さであることが好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０アミノ酸の長さのリンカーが好ましい。
リンカーペプチドに包含させるのに選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性にそれほど干渉しない特性を呈示しうることが望ましい。したがって、リンカーペプチド全体で、ポリペプチドの活性と不整合であるか、または内部フォールディングに干渉するか、単量体のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸残基であって、受容体の単量体ドメインの結合を大きく妨げるアミノ酸残基と結合または他の相互作用を形成する電荷を呈示すべきではない。有用なリンカーには、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４９）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０）を含めた［配列中、ｎは、少なくとも１つの整数である］）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、およびＳｈａｋｅｒカリウムチャネルのためのテザーなどの他の可撓性リンカー、ならびに当業者により認識される多種多様な他の可撓性リンカーが含まれる。
一部の実施形態では、グリシン−セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が、比較的構造化されておらず、したがって、構成要素間の中性のテザーとして働きうるので好ましい。第２に、セリンは親水性であり、したがって、球状のグリシン鎖となりうるポリマーを可溶化させることが可能である。第３に、同様な鎖が、単鎖抗体など、組換えタンパク質のサブユニットを接合するのに有効であることが示されている。適したリンカーはまた、２つのポリペプチド鎖の間のギャップを架橋しうる天然に存在するモチーフについての、公知の三次元構造のデータベースをスクリーニングすることによっても同定することができる。
好ましい実施形態では、リンカーが、ヒト患者に投与するときに免疫原性ではない。したがって、リンカーは、それらが低免疫原性であるか、または免疫原性が低いと考えられるように選ぶことができる。例えば、ヒトにおいて天然で存在するリンカーを選ぶことができる。好ましい実施形態では、リンカーが、抗体のヒンジ領域の配列、すなわち、抗体のＦａｂ領域とＦｃ領域とを連結する配列を有するが、代替的に、リンカーは、ヒンジ領域の一部を含む配列または抗体のヒンジ領域と実質的に同様な配列も有する。適したリンカーを得る別のやり方は、単純なリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４９）を、ランダム変異誘発を介して最適化することによるやり方である。代替的に、適したポリペプチドリンカーを規定したら、さらなるリンカーポリペプチドを創出して、連結されるドメインとより最適な形で相互作用するアミノ酸を選択することができる。
用いうる他の種類のリンカーには、人工のポリペプチドリンカーおよびインテインが含まれる。別の実施形態では、２つの分子を連結するようにジスルフィド結合をデザインする。別の実施形態では、リンカーが、化学架橋剤である。例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）が含まれるがこれらに限定されない多様な二官能性タンパク質の共役剤を用いることができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら、１９７１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８号において記載される通りに、リシン抗毒素を調製することができる。
化学リンカーは、同位元素のキレート化を可能にしうる。例えば、炭素１４標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体へとコンジュゲートするための例となるキレート化剤である（ＰＣＴ ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい）。リンカーは、切断可能であり、細胞における細胞傷害性薬の放出を容易とする。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁）を用いることができる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーが含まれるがこれらに限定されない多様な非タンパク質性ポリマーをリンカーとして用いることができる、すなわち、本明細書で開示される抗体を融合パートナーへと連結するのに用いる場合もあり、抗体を所望のコンジュゲート部分へと連結して免疫コンジュゲートを形成するのに用いる場合もある。
当業者には、ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方である多様な二官能性または多官能性試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログにおいて記載される試薬など）をリンカー基として使用しうることが明らかであろう。共役は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を介して行うことができる。このような方法について記載する参考文献には、例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらによる米国特許第４，６７１，９５８号など、多数の参考文献が存在する。治療剤が免疫コンジュゲートの抗体部分から遊離するとより強力となる場合は、細胞へと内部移行されている間、または内部移行時に切断可能となるリンカー基を用いることが望ましい。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。細胞内のこれらのリンカー基からの薬剤放出の機構には、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒによる米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性の結合に対する照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらによる米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらによる米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体を介する加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらによる米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらによる米国特許第４，５６９，７８９号）が含まれる。
２つ以上の薬剤を抗体と共役させることが所望されうる。一実施形態では、薬剤の複数の分子を、１つの抗体分子と共役させる。別の実施形態では、２つ以上の種類の薬剤を、１つの抗体と共役させることができる。具体的な実施形態にかかわらず、２つ以上の薬剤を伴う免疫コンジュゲートは、多様なやり方で調製することができる。例えば、２つ以上の薬剤を抗体分子へと直接共役させることもでき、複数の付着部位をもたらすリンカーを用いることもできる。代替的に、担体を用いることもできる。
担体は、直接またはリンカー基を介する共有結合の形成を含め、多様なやり方で薬剤を保有しうる。適した担体には、アルブミンなどのタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらによる米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチドおよびアミノデキストランなどの多糖（例えば、Ｓｈｉｈらによる米国特許第４，６９９，７８４号）が含まれる。担体はまた、非共有結合の形成またはリポソーム小胞内などのカプセル化によっても薬剤を保有しうる（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種による薬剤に特異的な担体には、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化化合物が含まれる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成について開示している。放射性核種のキレートは、金属または金属酸化物である放射性核種に結合させるためのドナー原子としての窒素原子および硫黄原子を含有するキレート化化合物が含まれるキレート化化合物から形成することができる。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらによる米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化化合物およびそれらの合成について開示している。
毒素または薬物などの治療剤は、抗体と直接的または間接的に（例えば、本明細書で開示されるリンカー基を介して）共役させる（例えば、共有結合形成させる）ことができる。例えば、一実施形態では、治療剤を、アビジン−ビオチン系または他の類似の系を介して間接的に共役させる。各々が他方と反応することが可能な置換基を所有する場合は、薬剤と抗体との直接的反応が可能である。例えば、一方におけるアミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、他方における無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と反応することができる場合もあり、良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる場合もある。
治療用部分を抗体とコンジュゲートする技法は周知であり、例えば、Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、１９８５年、２４３〜５６頁、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、１９８７年、６２３〜５３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、１９８５年、４７５〜５０６頁）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、１９８５年、３０３〜１６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、６２巻：１１９〜５８頁、１９８２年を参照されたい。
純粋形態または適切な医薬組成物中での、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の投与は、類似の有用性を供給するのに許容される薬剤の投与方式のうちのいずれかを介して実行することができる。医薬組成物は、抗体または抗体を含有する組成物（例えば、ＦＮ１４特異的抗体−サポリン抗毒素などの免疫コンジュゲート）を、生理学的に許容される適切な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることにより調製することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、およびエアゾール剤など、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと処方することができる。加えて、他の薬学的に活性な成分（本明細書の別の個所で記載される他の抗がん剤を含めた）、ならびに／または塩、緩衝剤、および安定化剤などの適した賦形剤を組成物内に存在させることもできるがそうしなくともよい。投与は、経口経路、非経口経路、経鼻経路、静脈内経路、皮内経路、皮下経路、または局所経路を含め、異なる多様な経路を介して達成することができる。好ましい投与方式は、処置または防止される状態の性質に依存する。投与後、がんを軽減するか、がんを阻害するか、がんの発生の可能性を低減するか、がんの進行および／または転移を防止するかまたは遅延させる量を有効であると考える。
ある特定の実施形態では、投与される量が、生存可能な腫瘍の量の統計学的に有意な減少、例えば、腫瘍塊の少なくとも５０％の減少または走査寸法の変化（例えば、統計学的に有意な減少）により示される腫瘍の退縮を結果としてもたらすのに十分である。処置の正確な投与量および持続期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを用いて経験的に決定することもでき、当技術分野で公知のモデル系において組成物を調べ、そこから外挿することにより決定することもできる。また、対照臨床検査も実施することができる。投与量はまた、緩和させる状態の重症度によって変わりうる。医薬組成物は一般に、望ましくない副作用を最小化しながら、治療的に有用な効果を発揮するように処方および投与する。組成物は、一度に投与することもでき、時間間隔を置いて投与される多数回のより小用量へと分割することもできる。任意の特定の対象には、特定の投与量レジメンを、個別の必要に従い、経時的に調整することができる。
ＦＮ１４特異的抗体を含有する組成物は、単独で投与することもでき、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学療法など、他の公知のがん処置と組み合わせて投与することもできる。組成物はまた、細菌感染、特に、細胞内の細菌感染を処置するのに用いられる抗生物質と組み合わせても投与することができる。
したがって、限定せずに述べると、これらの医薬組成物および類縁の医薬組成物を投与する典型的な経路には、経口経路、局所経路、経皮経路、吸入経路、非経口経路、舌下経路、口腔内経路、直腸内経路、膣内経路、および鼻内経路が含まれる。本明細書で用いられる非経口という用語には、皮下注射、静脈内注射法または静脈内注入法、筋肉内注射法または筋肉内注入法、胸骨内注射法または胸骨内注入法が含まれる。本発明のある特定の実施形態に従う医薬組成物は、組成物を患者へと投与したときに、その中に含有される活性成分が生体に利用可能になるように処方する。被験体または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投薬単位であって、例えば、錠剤が単一の投薬単位の場合もあり、エアゾール形態における本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体の容器が複数の投薬単位を保持する場合もある投薬単位の形態をとりうる。このような剤形を調製する実際の方法は当業者に公知であるか、または明らかであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい）。いずれにせよ、投与される組成物は、本明細書の教示に従う対象の疾患または状態を処置するための治療有効量の本開示の抗体を含有する。
医薬組成物は、固体形態の場合もあり、液体形態の場合もある。一実施形態では、組成物が、例えば、錠剤形態または粉末形態であるように、担体（複数可）は微粒子である。担体（複数可）は液体であることが可能であり、組成物は、例えば、経口油、注射液、または、例えば、吸入投与において有用なエアゾールでありうる。経口投与用に意図される場合、医薬組成物は、固体形態または液体形態であることが好ましく、半固体、半液体、懸濁液、およびゲル形態が、本明細書で固体または液体として考えられる形態内に包含される。
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を、散剤、顆粒剤、圧縮錠、丸剤、カプセル剤、チューインガム、ウェハーなどへと処方することができる。このような固体組成物は典型的に、１つまたは複数の不活性希釈剤または可食性担体を含有する。加えて、以下のうちの１つまたは複数を存在させることができる：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトース、またはデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの着香剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）；および着色剤。医薬組成物が、カプセル形態、例えば、ゼラチンカプセル剤の場合、それは、上記の種類の物質に加えて、ポリエチレングリコールまたは油などの液体担体を含有しうる。
医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤でありうる。２つの例として、液体は、経口投与用の場合もあり、注射による送達用の場合もある。経口投与用が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および香味増強剤のうちの１つまたは複数も含有する。注射により投与することが意図される組成物では、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、および等張剤のうちの１つまたは複数が包含されうる。
それらが溶液であれ、懸濁液であれ、他の同様の形態であれ、液体の医薬組成物は、以下のアジュバントのうちの１つまたは複数を包含しうる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、溶媒もしくは懸濁媒として働きうる合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数の用量バイアル内に封入することができる。生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
非経口投与用または経口投与用を意図される液体の医薬組成物は、適した投与量が得られるように、本明細書で開示されるＦＮ１４特異的抗体の量を含有するべきである。典型的に、この量は、組成物中に少なくとも０．０１％の抗体である。経口投与用が意図される場合、この量は、組成物重量の０．１〜約７０％であるように変わりうる。ある特定の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％の抗体を含有する。ある特定の実施形態では、非経口投薬単位が、希釈前の０．０１〜１０重量％の抗体を含有するように、本発明に従う医薬組成物および医薬調製物を調製する。
医薬組成物は、局所投与用を意図することもでき、この場合、担体は、溶液基剤、エマルジョン基剤、軟膏基剤、またはゲル基剤を含むことが適切でありうる。基剤は、例えば、以下のうちの１つまたは複数を含みうる：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定化剤。増粘剤は、局所投与用の医薬組成物中に存在させることができる。経皮投与用を意図する場合、組成物は、経皮パッチを包含する場合もあり、イオン導入デバイスを包含する場合もある。医薬組成物は、例えば、直腸内で溶融して薬物を放出する、坐剤の形態での直腸内投与を意図する場合もある。直腸内投与用の組成物は、適した非刺激性賦形剤としての油性基剤を含有しうる。限定せずに述べると、このような基剤には、ラノリン、ココアバター、およびポリエチレングリコールが含まれる。
医薬組成物は、固体または液体の投薬単位の物理的形態を改変する多様な物質を包含しうる。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を包含しうる。コーティングシェルを形成する物質は、典型的に不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶性のコーティング剤から選択することができる。代替的に、活性成分は、ゼラチンカプセル内に包み込むこともできる。固体形態または液体形態の医薬組成物は、本発明の抗体に結合し、これにより化合物の送達の一助となる薬剤を包含しうる。この能力において作用しうる適した薬剤には、他のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１つもしくは複数のタンパク質、またはリポソームが含まれる。医薬組成物は、本質的にエアゾールとして投与しうる投薬単位からなる場合がある。エアゾールという用語は、コロイド状のもの〜加圧パッケージからなる系の範囲にわたる多様な系を指し示すのに用いられる。送達は、液化ガスまたは圧縮ガスを介する場合もあり、活性成分を分注する適したポンプシステムを介する場合もある。活性成分（複数可）を送達するために、エアゾールは、単相系で送達することもでき、二相系で送達することもでき、三相系で送達することもできる。エアゾールの送達は、併せてキットを形成しうる、必要な容器、アクチベーター、バルブ、部分容器などを包含する。当業者は、必要以上の実験なしに、好ましいエアゾールを決定することができる。
医薬組成物は、製薬技術分野で周知の方法により調製することができる。例えば、注射により投与することを意図される医薬組成物は、溶液を形成するように、本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体、ならびに場合によって、塩、緩衝剤、および／または安定化剤のうちの１つまたは複数を含む組成物を、滅菌蒸留水と組み合わせることにより調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を容易にすることができる。界面活性剤とは、水性送達系における抗体の溶解または均一な懸濁を容易にするように、抗体組成物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
組成物は、使用される特定の化合物（例えば、ＦＮ１４特異的抗体）の活性；化合物作用の代謝安定性および長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食事；投与方式および投与期間；排泄速度；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに療法を受ける被験体を含めた多様な因子に依存して変わる治療有効量で投与することができる。一般に、治療的に有効な毎日の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、好ましくは、治療有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、３．５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、より好ましくは、治療有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．７５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）である。
本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体を含む組成物はまた、１つまたは複数の他の治療剤の投与と同時に投与することもでき、この前に投与することもでき、この後で投与することもできる。このような組合せ療法は、本発明の化合物および１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含有する単一の医薬投薬処方物の投与の他、本発明の抗体を含む組成物およびその固有の別個の医薬投薬処方物における各活性薬剤の投与も包含しうる。例えば、本明細書で記載される抗体および他の活性薬剤は、錠剤またはカプセル剤など、単一の経口投与組成物中で併せて患者に投与することもでき、各薬剤を別個の経口投薬処方物により投与することもできる。別個の投薬処方物を用いる場合、抗体および１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含む組成物は、本質的に同時に、すなわち、共時的に投与することもでき、別個に時間をずらして、すなわち、逐次的、かつ、任意の順序で投与することもでき、組合せ療法は、これら全てのレジメンを包含することが理解される。
本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体を含む組成物は、がんなど、本明細書で記載される疾患に罹患する個体に投与することができる。ヒト疾患を処置するためにｉｎ ｖｉｖｏで用いる場合は一般に、本明細書で記載される抗体を、投与前に医薬組成物へと組み込む。医薬組成物は、本明細書の別の個所で記載される通り、生理学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される抗体のうちの１つまたは複数を含む。医薬組成物を調製するには、有効量の１つまたは複数の化合物を、特定の投与方式に適することが当業者に公知である任意の医薬担体（複数可）または医薬賦形剤と混合する。医薬担体は、液体の場合もあり、半液体の場合もあり、固体の場合もある。非経口適用、皮内適用、皮下適用、または局所適用に用いられる溶液または懸濁液には、例えば、滅菌希釈剤（水など）、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗微生物剤（ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウムなど）；ならびにキレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩など）が含まれうる。静脈内投与する場合、適した担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が含まれる。
本明細書で記載されるＦＮ１４特異的抗体を含む組成物は、徐放処方物またはコーティングなど、体内からの急速な消失から抗体を保護する担体と共に調製することができる。このような担体には、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、ならびにエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のポリマーなどの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーなどであるがこれらに限定されない、制御放出処方物が含まれる。
本明細書の全体において、文脈により別段に要求されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言明された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含は含意するが、他の任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外は含意しないと理解される。
文脈により別段であることが明確に規定されない限り、本明細書で用いられる単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数態を包含する。したがって、例えば、「ある細胞」への言及は、単一の細胞の他、２つ以上の細胞も包含し、「ある薬剤」への言及は、１つの薬剤の他、２つの以上の薬剤も包含するなどである。
別段に明示的に言明されない限り、本明細書の各実施形態は、変更すべき部分を変更して、他の全ての実施形態にも適用されるものとする。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のための標準的な技法を用いることができる。酵素反応および精製技法は、製造元の仕様に従い実施することもでき、当技術分野において一般的に実現される通りに実施することもでき、本明細書で記載される通りに実施することもできる。これらの技法および手順ならびに関連する技法および手順は一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従い、本明細書全体で引用されて論じられる、多様な一般的参考文献およびより特定の参考文献において記載される通りに実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． Ｉｎｃ． ＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ編、２００１年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）；または他の関連のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ刊行物および他の同様の参考文献を参照されたい。特定の定義を提供しない限り、本明細書で記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学、ならびに創薬化学および製薬化学との関連で用いられる用語法ならびにこれらの実験室における手順および技法は、周知の手順および技法であり、当技術分野において一般的に用いられている。標準的な技法は、組換え技術、分子生物学法、微生物学法、化学合成、化学的分析、医薬の調製、処方、および送達、ならびに患者の処置に用いることができる。
（実施例１）
ｅｘ ｖｉｖｏにおける多様化系を用いるＦＮ１４特異的抗体の生成
ＤＴ４０ニワトリＢ細胞リンパ腫系列は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける抗体進化の有望な出発点であることが示されている（Ｃｕｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、１１２９〜１１３４頁（２００２年）；Ｓｅｏ， Ｈ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３巻、７３１〜７３５頁（２００５年））。ＤＴ４０細胞は、培養物中で頑健に増殖し、倍加時間が８〜１０時間であり（ヒトＢ細胞系の２０〜２４時間と比較して）、極めて効率的な相同遺伝子ターゲティングを支援する（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ， Ｊ．Ｍ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ、９巻、９２１〜９２７頁（１９９０年））。ＤＴ４０細胞は、それぞれ、鋳型による変異および鋳型によらない変異を創出する、多様化の２つのはっきり異なる生理学的経路である、遺伝子転換および体細胞超変異を利用しうるので、膨大なＶ領域配列の潜在的多様性を駆使する（Ｍａｉｚｅｌｓ， Ｎ．、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、３９巻、２３〜４６頁（２００５年））。しかし実のところ、抗体進化のためのＤＴ４０細胞の有用性は、多様化が（他の形質転換されたＢ細胞系における場合と同様）生理学的速度の１％未満で生じるために限定されている。多様化は、相同組換え経路を無効化することにより数倍加速化しうる（Ｃｕｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｊ．ら、前出）が、このようにして操作された細胞は、効率的な遺伝子ターゲティングを実行する能力を失っている。多様化はまた、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡで細胞を処置することによっても加速化しうる（Ｓｅｏら、前出）が、結果として得られる変異は、もっぱら鋳型による変異であり、潜在的な多様性は制限され、必要とされるアフィニティーまたは特異性を有する抗体を産生させることはできない。
この実施例では、ＤＴ４０細胞を操作して、さらなる遺伝子改変能、または遺伝子転換および体細胞超変異の両方が変異誘発に寄与する可能性を犠牲にすることなしに、Ｉｇ遺伝子の多様化速度を加速化した。これは、Ｉｇ遺伝子の多様化を、強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーター／リプレッサー制御ネットワークの制御下に置くことにより実現された。
強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーターが約１００重合化した反復配列からなる多量体（ＰｏｌｙＬａｃＯ）を、相同遺伝子ターゲティングにより、再配列して発現させたＩｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の上流に挿入した（図１Ａ）。次いで、ラクトースリプレッサーのオペレーターＤＮＡに対する高アフィニティー（ｋＤ＝１０−１４Ｍ）を利用して、ラクトースリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）に融合させた制御因子を、ＬａｃＯ制御エレメントへとテザーして、多様化を制御することができる。ＰｏｌｙＬａｃＯがＩｇλだけに組み込まれたＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞は、任意の操作前の親ＤＴ４０細胞と比べて、Ｉｇ遺伝子の多様化速度の５倍の増大を呈示した（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年））。多様化は、Ｉｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の両方を標的としたＰｏｌｙＬａｃＯを保有するように操作された細胞（「ＤＴＬａｃＯ」）においてさらに上昇することが予測された。これは、ＬａｃＩ−ＨＰ１制御因子によるトランスフェクションの３週間後にｓＩｇＭ−細胞の割合をアッセイすることにより操作された候補系列について確認され、これにより、多様化速度が、親ＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ ＬａｃＩ−ＨＰ１系列に特徴的な２．８％と比べて２．５〜９．２倍上昇したことが示された（例えば、図１Ｂ）。加速化は、個別のトランスフェクタントの変動アッセイにより、１つの系列について再確認された（図１Ｃ）。ｓＩｇＭ−細胞の百分率は、２．５％〜５２．５％の範囲であり、ＤＴＬａｃＯ細胞におけるメジアンは１３．０％であった（図１Ｃ）。このメジアンは、ＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタントにおける場合（２．８％）より４．７倍高く、ＤＴ４０親系列（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年））に匹敵する対照細胞（ＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ ＧＦＰ−ＬａｃＩ）における場合（０．６％）より２１．７倍高い。この変動アッセイでは累積ｓＩｇＭ喪失改変体を測定する（Ｌｕｒｉａ， Ｓ．Ｅ．およびＤｅｌｂｒｕｅｃｋ， Ｍ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２８巻、４９２〜５１１頁（１９４３年））ために予測される通り、一部の個別のクローンは、メジアンと大幅に異なる多様化速度を呈示した。したがって、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をＰｏｌｙＬａｃＯエレメントの標的とすることにより、多様化は、ＤＴ４０親細胞系と比べて２１．７倍に加速化された（図１Ｃ）。
次いで、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方においてＰｏｌｙＬａｃＯを保有する、操作されたＤＴＬａｃＯ系列を、ｅｘ ｖｉｖｏにおける抗体発見の出発点として用いた。
細胞表面受容体であるＦＮ１４は、ＴＮＦ受容体ファミリーのうちの最小のメンバーであり、高度に保存された５３アミノ酸の細胞外ドメインを伴う（マウス配列とヒト配列との間の９２．４％の同一性）。ＦＮ１４は、全ての腫瘍型ではないが多くの腫瘍型において過剰発現し、治療対象の標的となっている（Ｆｅｎｇ， Ｓ．Ｌ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１５６巻、１２５３〜１２６１頁（２０００年）；Ｈａｎ， Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６２巻、２８９０〜２８９６頁（２００２年）；Ｔｒａｎ， Ｎ．Ｌ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１６２巻、１３１３〜１３２１頁（２００３年）；Ｗａｔｔｓ， Ｇ．Ｓ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１２１巻、２１３２〜２１３９頁（２００７年）；Ｗｉｌｌｉｓ， Ａ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６巻、７２５〜７３４頁（２００８年））。当技術分野では、ＦＮ１４のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が公知であり、ＧＥＮＢＡＮＫなどの公開データベースで入手可能である。ヒトＦＮ１４のアミノ酸配列は、配列番号８９で提供する。
１０９個のＤＴＬａｃＯ ＬａｃＩ−ＨＰ１細胞の多様化集団から出発して、ＦＮ１４への結合を、固体のマトリックス（Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ）における選択およびＦＡＣＳにより濃縮した。１７の一連の集団は、アフィニティーの増大を特徴とした（図２Ａ）。ＰＥＣｙ５で標識した可溶性抗原の、ＦＮ１４特異的ＤＴＬａｃＯ細胞への飽和結合反応速度についての解析は、集団ＦＳ１０およびＦＳ１７のそれぞれについて２５ｎＭおよび０．７ｎＭの見かけのアフィニティー値をもたらし（図示しない）、このＦＳ２４系統における最終集団について０．６７ｎＭの見かけのアフィニティー値をもたらした（図２Ｂ）。
２つのさらなる抗ＦＮ１４集団であるＰＳ４ＡおよびＰＳ４Ｂは、ＦＮ１４を含めた標的アレイにおいてＦＳ１０細胞をパニングすることにより得た（図２Ｆを参照されたい）。これらの２つの集団の他、ＦＳ１０、ＦＳ１７、およびＦＳ２４を表す組換えキメラモノクローナル抗体は、ニワトリＶＤＪエレメントおよびニワトリＶＪエレメント（図３を参照されたい）をヒトＩｇＧ１およびλ定常領域へと融合させることにより生成させた。ヒトＩｇＧ１およびλ定常領域のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５２および５４に示すが、これらはそれぞれ、配列番号５１および５３に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。これらのｍＡｂの見かけのアフィニティーは、ｍＡｂの、ＦＮ１４を発現させる細胞との飽和結合反応速度を測定することにより決定した（表１にまとめる）。ｍＡｂであるＦＳ２４は、ＦＮ１４を発現させない対照であるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に結合しなかったが、ＦＮ１４を発現させるＡ３７５黒色腫細胞には、ＤＴＬａｃＯ［ＦＳ２４］集団の可溶性ＦＮ１４に対するアフィニティー（０．４４ｎＭ；図２Ｂ）に匹敵する０．２１ｎＭのアフィニティーで結合した（図２Ｃ）。ｍＡｂであるＦＳ２４は、黒色腫、乳癌、および唾液腺癌を含む、ＦＮ１４を過剰発現させる腫瘍に由来する多数の細胞型の表面においてＦＮ１４を認識したが、対照であるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞上には結合しなかった（図２Ｄ）。ｍＡｂであるＦＳ２４はまた、細胞ベースのアッセイにおいて機能性も呈示した。ＦＳ２４は、Ａ３７５細胞によるＩＬ８分泌の刺激として明らかな弱いアゴニスト活性を呈示した（図２Ｅ）が、ＴＷＥＡＫと比較すると、アゴニスト活性はほぼ検出不能であった（図示しない）。ＦＳ２４はまた、Ａ３７５黒色腫細胞、ＨＣＣ３８乳癌細胞、およびＭｉａＰａＣａ−２膵臓がん細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も促進した（図４）。
この実施例では、以下の方法を用いた。
細胞の培養および遺伝子ターゲティング：別段に示さない限り、細胞系は、ＡＴＣＣから購入した。ＤＴ４０に由来する細胞系は、既に記載した通りに維持およびトランスフェクトし（Ｙａｂｕｋｉ， Ｍ．、Ｆｕｊｉｉ， Ｍ．Ｍ．、およびＭａｉｚｅｌｓ， Ｎ．、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、６巻、７３０〜７３６頁（２００５年））、他の細胞系は、元の供給源により指定される通りに維持およびトランスフェクトした。ＰｏｌｙＬａｃＯ制御エレメント（Ｒｏｂｉｎｅｔｔ， Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１３５巻、１６８５〜１７００頁（１９９６年））は、ラクトースオペレーター（ＬａｃＯ）の約１００の反復配列からなり、再配列して発現させた軽鎖対立遺伝子においてＰｏｌｙＬａｃＯを保有するようにあらかじめ操作されたＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞の、再配列して発現させた重鎖対立遺伝子を標的とした（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年）；Ｙａｂｕｋｉ， Ｍ．、Ｏｒｄｉｎａｒｉｏ， Ｅ．Ｃ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｗ．Ｊ．、Ｆｕｊｉｉ， Ｍ．Ｍ．、およびＭａｉｚｅｌｓ， Ｎ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８２巻、４０８〜４１５頁（２００９年）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｗ．Ｊ．、Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ， Ｄ．Ｗ．、およびＭａｉｚｅｌｓ， Ｎ．、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、３巻、ｅ４０７５頁（２００８年））。遺伝子ターゲティングは、ターゲティング構築物であるｐＰｏｌｙＬａｃＯ−ΨＶＨを用いて記載される通りに（Ｙａｂｕｋｉら、前出）実行した。この構築物を生成させるため、ΨＶＨアレイに由来する４ｋｂの断片をＤＴ４０のゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ部位へとクローニングし、ＰｏｌｙＬａｃＯおよびヒスチジノール耐性マーカーの断片をΨＶＨ断片へと挿入した。構築物は、制限解析および部分的配列決定により検証し、反復配列の安定性を維持するために、組換え欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＳｔｂｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖させた。ＤＴ４０ ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞のトランスフェクション後、サザンブロット法により安定なトランスフェクタントを選択およびスクリーニングした。Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現によりｌｏｘＰに挟まれた選択マーカーを欠失させ、ＬａｃＩ−ＨＰ１を安定的にトランスフェクトした細胞において加速化される多様化について調べた（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００７年、前出）。ＬａｃＩ−ＨＰ１またはＥ４７−ＬａｃＩを安定的に発現させるＤＴＬａｃＯ細胞（Ｙａｂｕｋｉら、前出）を、抗原特異的系統の選択に用いた。
多様化速度の定量化およびＶ領域配列解析：多様化速度は、多様化イベントのために細胞表面におけるＩｇＭの発現を喪失した細胞の割合を測定するｓＩｇＭ喪失アッセイを用いて定量化した（Ｙａｂｕｋｉ， Ｍ．、Ｆｕｊｉｉ， Ｍ．Ｍ．、およびＭａｉｚｅｌｓ， Ｎ．、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、６巻、７３０〜７３６頁（２００５年）；Ｓａｌｅ， Ｊ．Ｅ．、Ｃａｌａｎｄｒｉｎｉ， Ｄ．Ｍ．、Ｔａｋａｔａ， Ｍ．、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．、およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、９２１〜９２６頁（２００１年））。略述すると、約２０の独立のトランスフェクタントのパネルを３週間にわたり増殖させ、次いで、各パネルメンバーに由来する細胞（約１×１０６個）を、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）またはＳｐｅｃｔｒａｌ Ｒｅｄ（ＳＰＲＤ）をコンジュゲートした抗ニワトリＩｇＭ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で染色し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を伴うＦＡＣＳｃａｎにより解析した。蛍光強度がｓＩｇＭ＋ピークのメジアンの８分の１未満である細胞を、ｓＩｇＭ−とスコア付けした。単一細胞によるＰＣＲおよび配列解析を、記載される通り（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００７年、前出）に実施した。
抗原および抗原結合についての選択：初期選択は、多様化ＤＴＬａｃＯ集団を、抗原と複合体化させたビーズに結合させることにより実施し、その後、蛍光標識した可溶性抗原を用いるＦＡＣＳにより選択した（Ｃｕｍｂｅｒｓら、前出；およびＳｅｏら、前出）。ＦＮ１４を認識した細胞を選択するため、抗原は、ＤｙｎａｌプロテインＧ磁気ビーズに結合されるかまたはＰＥＣｙ５標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）で検出される、組換えヒトＦＮ１４−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＦＮ１４−Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とした。多重標的アレイによるパニングでは、培養物中で数週間にわたりさらに多様化させたＦＳ１０ ＦＮ１４結合集団のうちの１％未満を含有する集団を、プラスチック上でアレイ化されたｒｈＦＮ１４−Ｆｃを含めた複数の標的によるパニングに供した（図２Ｆを参照されたい）。
結合アッセイ、アフィニティーアッセイ、および機能性アッセイ：組換え抗体は、ＰＣＲで増幅したＶ領域を、２９３Ｆ細胞におけるヒトＩｇＧ１の発現を支援するベクターへとクローニングすることにより生成させた（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００７年、前出）。飽和結合反応速度は、ＦＮ１４特異的ＤＴＬａｃＯ細胞を、多様な濃度の蛍光標識した可溶性抗原で染色することにより、またはＦＮ１４でトランスフェクトした細胞または内因的にＦＮ１４を発現させるがん細胞系を、多様な濃度の組換えキメラ抗ＦＮ１４ ｍＡｂで染色することにより決定した。細胞表面におけるＦＮ１４結合をアッセイするため、細胞を１μｇ／ｍｌのキメラｍＡｂであるＦＳ２４または二次抗体単独で染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＩＬ８の分泌をアッセイするため、Ａ３７５黒色腫細胞を、示される濃度のｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照と共に２４時間にわたりインキュベートし、次いで、ＩＬ８ ＣＢＡ Ｆｌｅｘ蛍光ビーズアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、培地をＩＬ８の存在についてアッセイし、平均蛍光強度をバックグラウンドシグナルに対して正規化した。
（実施例２）
ＦＳ２４ ＦＮ１４特異的抗体はＡＤＣＣを介してがん細胞を死滅させる
さらなる実験は、ＦＳ２４ ＦＮ１４特異的抗体が、ＡＤＣＣを介してがん細胞を死滅させることを示した。ＡＤＣＣについてアッセイするため、図４で言及されるがん細胞を、示される濃度のｍＡｂであるＦＳ２４またはアイソタイプ対照抗体と共にインキュベートした後、全ヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的比を２５：１とする）と共にインキュベートし、がん細胞からのユーロピウムの放出（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を介して比溶解のパーセントを決定した。
図４において示される通り、ＦＮ１４特異的抗体であるＦＳ２４は、１ｕｇ／ｍｌの濃度で黒色腫細胞および膵臓がん細胞の６０％を超える溶解、および同じ濃度で乳がん細胞の５５％を超える溶解を示した。
（実施例３）
ＦＳ２４抗ＦＮ１４抗体およびＰＳ４抗ＦＮ１４抗体のヒト化
ＦＳ２４キメラ抗体およびＰＳ４キメラ抗体を、最初はマウス抗体のヒト化について記載され（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（１９８９年）１２月、８６巻（２４号）：１００２９〜３３頁）、近年ではＴｓｕｒｕｓｈｉｔａおよびＶａｓｑｕｅｚ（２００４年）ならびにＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００４年１２月、２９５巻（１〜２号）：９〜１９頁；ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｊ． Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８年）、１３巻：１６１９〜３３頁）により総説されているＣＤＲ移植手法を用いてヒト化した。
コンセンサスのヒトフレームワーク配列を、ＰＳ４のＶＨおよびＶＬの両方について選んだが、これらは、いずれの場合においても、対応するＰＳ４の可変領域配列に対する同一性レベルが最高の亜群コンセンサス配列であった。ＰＳ４のＶＨをヒト化するため、ヒト亜群ＩＩＩ ＶＨ配列のコンセンサス配列（Ｋａｂａｔ ＥＡら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１〜３２４２）を、アクセプターフレームワーク配列として選んだ。ＰＳ４のＶＬをヒト化するため、ヒト亜群ＩＩＩラムダ可変配列のコンセンサス配列（Ｋａｂａｔら、前出）を、アクセプターフレームワークとして選んだ。しかし、ＣＤＲのアクセプターフレームワークへの単純な移植は通常、リガンドに対するアフィニティーの低減を結果としてもたらし、フレームワーク配列内の１つまたは複数の残基を、元の抗体内のその位置において見出されるアミノ酸で置き換えることの所望性が示唆される。特に、抗原に接触するか、または近傍のＣＤＲ（「ベニヤ帯域」の残基）のコンフォメーションを変化させる可能性があるフレームワーク配列内の残基は、元の残基に戻してリガンドに対する完全なアフィニティーを保持することがしばしば有益でありうる（Ｆｏｏｔｅ， ＪおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｇ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９２年）、２２４巻：４８７〜９９頁）。したがって、ＰＳ４中のベニヤ帯域の残基を含む全ての残基を、元のＰＳ４抗体中に見出される残基と同一にした。したがって、ヒト化ＶＨの４９、６７、９３、および９４位の各々におけるヒト残基を、ＰＳ４中に見出される残基へと変更しながらまた、ヒト化ＶＬの４６、６６、６９、および７１位でも、ヒトからニワトリへの同様の置換えを行った（Ｋａｂａｔによる番号付けシステム；Ｋａｂａｔら、前出）（図６を参照されたい）。
驚くべきことに、上記の戦略（Ｈ．１／Ｌ．１）を用いて構築されるＰＳ４の第１のヒト化形は、ＦＮ１４に対するアフィニティーが、キメラＰＳ４抗体と比較してほぼ２ｌｏｇ低減された（表２）。この結果についての可能な説明として、ニワトリのラムダ軽鎖は、ヒトラムダ軽鎖の１位および２位において見出される２つのアミノ末端残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を逸失していることが注目された。さらに、哺乳動物抗体における軽鎖のＮ末端は、Ｌ−ＣＤＲ１に近接する。したがって、ヒト化ＶＬのＮ末端におけるさらなる２つの残基が、立体障害を介して抗原の結合に干渉しうることが可能であると考えられた。ヒト化軽鎖改変体であるＬ．９では、これらの２つのアミノ酸を欠失させた。改変体であるＬ．９で変更したのはまた、ヒト化軽鎖の新規のアミノ末端残基であり、グルタミン酸（ヒトコンセンサス配列に存在する）から、アラニン（ＰＳ４ ＶＬに存在する）へと変更した。図５および表２において示される通り、結果として得られるヒト化抗体（Ｈ．１／Ｌ．９）のアフィニティーは、元のキメラ抗体であるＰＳ４のアフィニティーと本質的に同等であった。Ｌ．９軽鎖改変体のＮ末端アミノ酸を、アラニン（ＰＳ４）からグルタミン酸（ヒト）へと変更したヒト化軽鎖のさらなる改変体を作製した（Ｌ．１８）が、この改変体のアフィニティーもまた、元のＰＳ４キメラ抗体のアフィニティーと極めて近似した。これらの結果とは対照的に、ニワトリ抗体のヒト化について記載する以前の２つの報告（Ｎｉｓｈｉｂｏｒｉ Ｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４３巻（２００６年）、６３４〜６４２頁；Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ Ｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００４年１２月、２９５巻（１〜２号）：９〜１９頁）は、ヒト化軽鎖のＮ末端に由来する残基の欠失を必要としなかった。ＮｉｓｈｉｂｏｒｉおよびＴｓｕｒｕｓｈｉｔａにより記載された抗体における軽鎖ＣＤＲ１が、抗原に接触せず、したがって、ヒト化軽鎖には存在するが元のニワトリ抗体に存在しない２つのさらなるＮ末端残基により影響を及ぼされない場合には、この差違が説明されるであろう。
図６および配列番号４２〜４７では、ＰＳ４抗体のヒト化配列が提供される。下記の表２にまとめる通り、ＰＳ４のＨ．１／Ｌ．９ヒト化形は、ＰＳ４キメラ親抗体とほぼ同等のＦＮ１４結合を維持した（また、図５も参照されたい）。
Ｈ．１のポリヌクレオチド配列（リーダー配列を含めた）は、配列番号４７に提供され、配列番号４６に提供されるアミノ酸配列をコードする。Ｌ．９のポリヌクレオチド配列は、配列番号４３に提供され（リーダー配列を含めて）、配列番号４２に提供されるアミノ酸配列をコードする。ヒト化ＰＳ４ ＶＬ．９のフレームワーク配列は、９４％ヒト配列であった。ヒト化ＰＳ４ ＶＨ．１のフレームワーク配列は、９５％ヒト配列であった（図６を参照されたい）。
第２の抗ＦＮ１４抗体であるＦＳ２４も、同じ戦略を用いてヒト化した。ＰＳ４の場合と同様、ヒト化ＦＳ２４ ＶＨのアクセプターフレームワーク配列は、ヒト亜群ＩＩＩのＶＨ配列のコンセンサス配列であった（Ｋａｂａｔ、前出）。ＦＳ２４のＶＬをヒト化するため、ヒト亜群ＩＩＩラムダ可変配列のコンセンサス配列（Ｋａｂａｔら、前出）を、アクセプターフレームワークとして選んだ。ＰＳ４の場合と同様、ヒト化ＦＳ２４ ＶＨ中のベニヤ帯域の残基である４９、６７、９３、および９４の各々におけるヒト残基を、ＦＳ２４中に見出される残基へと変更しながらまた、ヒト化ＦＳ２４ ＶＬの４６、４７、６６、６９、および７１位でも、ヒトからニワトリへの同様の置換えを行った（Ｋａｂａｔによる番号付けシステム；Ｋａｂａｔら、前出）。
下記の表３にまとめる通り、ＦＳ２４のヒト化形は、ＦＳ２４キメラ親抗体と本質的に同等のＦＮ１４結合を維持した（また、図７も参照されたい）。
ＦＳ２４抗体のヒト化配列を図８に示し、配列番号６０〜６３および９０〜９１に示す。ヒト化ＦＳ２４重鎖のポリヌクレオチド配列（リーダー配列を含めた）は、配列番号６３に提供され、配列番号６２に提供されるアミノ酸配列をコードする。ヒト化ＦＳ２４軽鎖のポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に提供され（リーダー配列を含めて）、コードされるアミノ酸配列は配列番号６０に提供される。ヒト化ＦＳ２４重鎖可変領域およびヒト化ＦＳ２４軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９０および９１に提供される。ヒト化ＦＳ２４ ＶＬのフレームワーク配列は、９５％ヒト配列であった。ヒト化ＦＳ２４ ＶＨのフレームワーク配列は、９５％ヒト配列であった（図８を参照されたい）。
（実施例４）
がん細胞への結合時におけるＦＳ２４の内部移行
抗体の結合により開始される細胞表面受容体の内部移行は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）媒介性細胞傷害の基盤である。ＦＮ１４特異的抗体であるＦＳ２４の内部移行を測定するため、この抗体を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とコンジュゲートした。コンジュゲートを、９６ウェルプレート内のがん細胞培養物の培地へと添加し、３７℃で数時間にわたりインキュベートした。特定の時点において、細胞を洗浄し、解離させた。次いで、細胞表面の蛍光を、Ａｎｔｉ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消光させた。最後に、フローサイトフルオロメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）により、蓄積されたＦＳ２４コンジュゲートを示す細胞内の蛍光を測定した。次いで、各時点の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、各細胞系についてプロットした（図９Ａ）。細胞系の表面におけるＦＮ１４の相対レベルを決定するため、細胞を、飽和濃度（２０μｇ／ｍｌ）のＦＳ２４またはアイソタイプ対照抗体と共にインキュベートした。フローサイトフルオロメトリーにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定し、相対レベルを［ＦＳ２４で染色した細胞のＭＦＩ］−［アイソタイプ対照のＭＦＩ］として表した（図９Ｂ）。
図９Ａにおいて示される通り、起源のはっきり異なる細胞が標識された抗体を内部移行する速度には、大幅な変動性が見られた。黒色腫系列であるＡ３７５、および膵臓がん系列であるＭｉａＰａＣａ２は、ＨＴ１０８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、またはＨＴ２９細胞より実質的に多くのＦＳ２４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を時間をわたって蓄積した。ＭＣＦ７は、中間量の抗体−コンジュゲートを内部移行した。内部移行速度は、必ずしもＦＮ１４の細胞表面レベルと相関しなかった。例えば、Ａ３７４細胞が、細胞表面において比較的高レベルのＦＮ１４を発現し（図９Ｂ）、また、高レベルの標識された抗体も内部移行した（図９Ａ）一方、ＭｉａＰａＣａ２細胞は、Ａ３７５細胞によって発現されたレベルの約３０％を発現させたに過ぎないが（図９Ｂ）、標識された抗体を同じ速度で内部に蓄積した（図９Ａ）。
（実施例５）
ＦＳ２４−毒素とコンジュゲートした抗体によるがん細胞の殺滅
リボソーム不活化タンパク質であるサポリン（分子量：３０ｋＤａ）は、内部移行する抗体により送達される場合、腫瘍細胞に対して毒性である（例えば、Ｆｌａｖｅｌｌ， Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、８３巻、１７５５〜１７６１頁（２０００年）；Ｙｉｐ， Ｗ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、４巻、２４１〜２５１頁（２００７年）；Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｔ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、６巻、２９９５〜３００８頁（２００７年）；Ｋｕｒｏｄａ， Ｋら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、７０巻、１２８６〜１２９４頁（２０１０年）を参照されたい）。ストレプトアビジンとサポリンとの化学コンジュゲート（ストレプトアビジン−ＺＡＰ）は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＦＳ２４−サポリンコンジュゲートは、以下の手順を介して生成させた：製造元の指示書に従い、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ− ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてＦＳ２４をビオチン化した。成分を１：１のモル比、室温で３０分間にわたりインキュベートすることにより、ストレプトアビジン−ＺＡＰを、ビオチン化されたＦＳ２４へと連結した。アイソタイプ対照は、無関係なキメラ抗体を、ストレプトアビジン−ＺＡＰへと同じ形で連結することにより調製した。
ＦＳ２４−サポリンの比毒性を調べるため、ＦＳ２４またはアイソタイプ対照によるコンジュゲートを、濃度を変えて、Ａ３７５黒色腫細胞に添加し、細胞生存率を決定した。略述すると、２５００個の細胞を、９６ウェルの組織培養プレートの各ウェルへと播種した。一晩にわたるインキュベーションの後、細胞を培養培地で２回洗浄した。その後、培養培地中０．００５〜５００ｎＭの範囲の濃度のＦＳ２４−サポリンまたはアイソタイプ対照−サポリンを３連のウェルへと添加し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間にわたりインキュベートした。細胞生存率を定量的に評価するため、生存細胞を解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により放出させ、トリパンブルー色素の存在下でカウントした。図１０に示す通り、ＦＳ２４−サポリンコンジュゲートは、ＩＣ５０を約１ｎＭとする用量依存的な形でＡ３７５黒色腫細胞を死滅させた。
ＦＳ２４によるＡＤＣ媒介性細胞死をさらに特徴付けるため、抗体−サポリンの直接的化学コンジュゲートを生成させた（ＦＳ２４−ＳＡＰ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＡＤＣ媒介性細胞傷害実験は、１２のがん細胞系（表４、図１１）およびＦＳ２４−ＳＡＰ（１μＭ〜１×１０−４ｎＭ）により上記の通りに準備した。７２時間にわたるインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により生存率を決定し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ；表４）によりＩＣ５０を計算した。
図１１において示される通り、ＦＳ２４−ＳＡＰの有効性は、内部移行と良好に相関した。例えば、ＭｉａＰａＣａ２細胞およびＡ３７５細胞では、内部移行およびＡＤＣ媒介性細胞傷害のいずれもが最大となった。ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、ＳＫＯＶ−３細胞、およびＣａＰａｎ２細胞についてはまた、低ナノモル濃度のＩＣ５０値も観察された。
上記の多様な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及されており、かつ／または出願データシートで列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。必要な場合は、多様な特許、出願、および、刊行物の概念を用いて、なおさらなる実施形態をもたらすために、実施形態の態様を改変することができる。
上記の詳細な説明に照らして、実施形態にこれらの変更および他の変更を施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語が、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲で開示される特定の実施形態へと限定するものとみなすべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される全範囲の同等物を伴う全ての可能な実施形態を包含するとみなすべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。

Claims (19)

  1. （ａ）配列番号７９に示されるＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、配列番号９２に示されるＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列であって、４位のＸａａは、ＡｓｐまたはＴｒｙである、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、および配列番号９３に示されるＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列であって、２位のＸａａは、ＡｌａまたはＧｌｙであり、４位のＸａａは、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、かつ５位のＸａａは、ＳｅｒまたはＧｌｙである、ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
    （ｂ）配列番号８６に示されるＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、配列番号３９に示されるＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、および配列番号９４に示されるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列であって、３位のＸａａは、ＡｌａまたはＩｌｅである、ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
    を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の前記ＶＨＣＤＲ２が、配列番号８１または配列番号８２を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  3. 前記（ａ）にしたがう重鎖可変領域の前記ＶＨＣＤＲ３が、配列番号７６、配列番号８３または配列番号８４のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離抗体。
  4. 前記（ｂ）にしたがう軽鎖可変領域の前記ＶＬＣＤＲ３が、配列番号４１を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  5. 前記（ｂ）にしたがう軽鎖可変領域の前記ＶＬＣＤＲ３が、配列番号３６を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  6. 前記重鎖可変領域が、配列番号６６または配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  7. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  8. ヒト化されている、請求項１に記載の単離抗体。
  9. 前記軽鎖可変領域が、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
  10. 前記重鎖可変領域が、配列番号９０に示されるアミノ酸を含む、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
  11. 単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーからなる群より選択される、請求項１に記載の単離抗体。
  12. Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、および完全抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の単離抗体。
  13. 薬物または毒素とコンジュゲートしている、請求項１に記載の単離抗体。
  14. ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体。
  15. 前記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されていない抗体と比較してＡＤＣＣ活性を増強させているように、前記ヒトＩｇＧのＦｃドメインが修飾されている、請求項１４に記載の単離抗体。
  16. 配列番号６７、６６、または６５に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域と、配列番号２５、２４、または２３に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＮ１４に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
  17. 生理学的に許容される担体と、治療有効量の、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片とを含む、組成物。
  18. 請求項１７に記載の組成物であって、ＦＮ１４の発現と関連するがんを有する患者を処置するためのものである、組成物。
  19. 前記がんが、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫からなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。
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