MX2012007489A - Miembros enlazadores para citomegalovirus. - Google Patents

Miembros enlazadores para citomegalovirus.

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Michael Mach
Luis Martin-Parras
Sonja Poetzsch
Nadja Spindler
Heinrich Sticht
Anna-Katharina Wiegers
Thomas Winkler
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Abstract

La invención se refiere a miembros enlazadores, en especial a moléculas de anticuerpos, que neutralizan los efectos biológicos del citomegalovirus humano (hCMV). Los miembros enlazadores son útiles para el tratamiento y la profilaxis de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV).

Description

MIEMBROS ENLAZADORES PARA C ITOM EG ALOVI RUS HUMANO Campo de la Invención Esta invención se refiere a miembros enlazadores, en especial moléculas de anticuerpos, que neutralizan los efectos biológicos del citomegalovirus humano (hCMV). Los miembros enlazadores son útiles para el tratamiento y la profilaxis de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV).
Antecedentes El citomegalovirus humano (hCMV) es un patógeno ampliamente distribuido que usualmente establece una persistencia asintomática de toda la vida en el 40 al 80 por ciento de la población humana dependiendo del origen geográfico y socioeconómico. Sin embargo, en los pacientes inmunocomprometidos, tales como los receptores de trasplantes y los individuos infectados por VIH, y también en los recién nacidos, la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) es una causa importante de patología y mortalidad, y presenta una carga económica significativa para los sistemas del cuidado de la salud.
El citomegalovirus humano (hCMV) es la infección más significativa que impacta sobre el resultado del trasplante de un órgano sólido (SOT), y del trasplante de células madre hematopoyéticas (SCT) (Razonable y Paya, 2003). Después del trasplante, se presenta una infección activa por el citomegalovirus humano (hCMV) en aproximadamente el 60 al 70 por ciento de los pacientes seropositivos para el citomegalovirus humano (hCMV) o de los pacientes seronegativos que reciben trasplantes de órganos a partir de un donante seropositivo (Razonable y Paya, ibid). Si no se toman medidas preventivas, el riesgo de desarrollar la enfermedad por el citomegalovirus humano (hCMV) es del 20 al 30 por ciento. Considerando el hecho de que se llevaron a cabo aproximadamente 26,000 SCTs alogénicas en todo el mundo en el 2008 (www.cibmtr.org), el éxito de esta terapia y la reducción de la patología y mortalidad después del trasplante tienen implicaciones financieras considerables., las complicaciones relacionadas con el citomegalovirus humano (hCMV) pueden dar como resultado costos adicionales de EUR 25,000 a 50,000 por paciente.
En adición, la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) en los pacientes de trasplante está asociada con ateroesclerosis relacionada con el trasplante y pérdida del injerto acelerada (Streblow y colaboradores, 2007).
Como se menciona anteriormente, el citomegalovirus humano (hCMV) es relevante como un patógeno perinatal. Cada año, aproximadamente el 1 por ciento de las mujeres susceptibles se seroconvierten durante el embarazo. Aproximadamente el 40 por ciento de éstas transmiten el citomegalovirus humano (hCMV) a sus hijos, dando como resultado 40,000 recién nacidos infectados anualmente en los EUA (Kenneson y Cannon, 2007). Del 10 al 20 por ciento de los niños infectados tienen síntomas agudos al nacer. De éstos, hasta el 20 por ciento mueren, y el resto típicamente tienen complicaciones moderadas a graves, incluyendo condiciones relacionadas con el sistema nervioso central (CNS), tales como ceguera, sordera, y retardo mental. Aparte de las consecuencias devastadoras para los pacientes afectados y para sus familias, los costos de cuidado de la salud para estos pacientes son significativos, en particular, si la infección perinatal da como resultado discapacidades graves y permanentes.
Hasta la fecha, hay cinco agentes antivirales aprobados para utilizarse en la infección por el citomegalovirus humano (hCMV): Ganciclovir/Valganciclovir, Cidofovir, Foscarnet y Fomivirsen. Todos los compuestos tienen el inconveniente de presentar efectos secundarios dependientes de la dosis y el desarrollo de cepas de virus resistentes (Schreiber y colaboradores, 2009). Ninguno de los fármacos tiene licencia para utilizarse en niños o en mujeres embarazadas. En adición, se utilizan preparaciones de inmunoglobulina intravenosas (IVIG), por ejemplo, CytoGam® (CSL Behring), y Cytotect® (Biotest) para la profilaxis y el tratamiento de los pacientes en riesgo de adquirir la infección por el citomegalovirus humano (hCMV). Sin embargo, es evidente la incertidumbre acerca de los beneficios de este tratamiento en la situación de trasplante (Sokos y colaboradores, 2002; Raanani y colaboradores, 2009). Se ha utilizado con éxito la transferencia adoptiva de células-T citotóxicas específicas del citomegalovirus humano (hCMV) en los pacientes de SCT hematopoyética (Moss y Rickinson, 2005), pero este tratamiento es extremadamente costoso, y estará limitado a unos cuantos centros de trasplantes que tengan la experiencia necesaria. Más aún, este tipo de tratamiento está restringido a los receptores de trasplantes que sean seropositivos para el citomegalovirus humano (hCMV). En contraste, se ha reportado que el IVIG es efectivo en el tratamiento y la prevención de la infección por citomegalovirus (CMV) congénita (Nigro y colaboradores, 2005). Sin embargo, el IVIG para el tratamiento de citomegalovirus humano (hCMV) se aisla y se purifica a partir de donantes seropositivos para el citomegalovirus humano (hCMV), los cual da como resultado titulaciones variables y, por consiguiente, una variación de lote a lote para los anticuerpos específicos para el citomegalovirus humano (hCMV) en estas preparaciones. En adición, los productos de fármaco derivados de la sangre humana siempre tienen el riesgo de la transmisión de los patógenos humanos. Como una consecuencia, se desea un producto de anticuerpo recombinante, que permita la neutralización eficiente del citomegalovirus humano (hCMV) para la profilaxis y el tratamiento de las enfermedades causadas por la infección por el citomegalovirus humano (hCMV).
Los objetivos para la terapia con anticuerpos de las infecciones por el citomegalovirus humano (hCMV) son proteínas expresadas en la superficie del virión del citomegalovirus humano (hCMV). La composición del virión de la envoltura del citomegalovirus humano (hCMV) es muy compleja y, aunque se han identificado muchas proteínas estructurales que comprenden la envoltura, todavía no están completamente definidas. Durante el desarrollo de los anticuerpos para la terapia del citomegalovirus humano (hCMV), se han identificado determinantes antigénicos en los complejos de glicoproteína superficiales gp58/H6 (gB o gC-1), gp 47-52 (gC-ll; gM y gN) (Shimamura y colaboradores, 2006), y gp 86 (gH o gC-lll) (Urban y colaboradores, 1996). La mayoría de los anticuerpos neutralizantes identificados hasta la fecha se enlazan a la proteína gB, la cual ha demostrado que contiene la mayoría de los epítopos neutralizantes (Britt y colaboradores, 1990). El complejo gB se sintetiza como un precursor de 130 kD, el cual se disocia en dos moléculas covalentemente enlazadas, denominadas como gp58 y g p 116. El fragmento N-terminal (gpll6) contiene un epítopo neutralizante lineal, denominado como dominio antigénico-2 (AD-2) de 20 aminoácidos (aminoácidos 67-86), el cual no requiere del complemento para tener la actividad biológica mediada por el anticuerpo (Meyer y colaboradores, 1990). La fracción gp58 de gB lleva el dominio neutralizante AD-1, el cual comprende 74 aminoácidos (aminoácidos 557-630), y más probablemente representa un epítopo conformacional (Ohlin y colaboradores, 1993; Wagner y colaboradores, 1992).
El advenimiento de los anticuerpos monoclonales inicialmente dio lugar a la identificación de una variedad de anticuerpos monoclonales de ratón neutralizantes contra el citomegalovirus humano (hCMV). Sin embargo, los anticuerpos monoclonales de ratón son inadecuados para utilizarse en la terapia humana debido a que estas proteínas son reconocidas por el sistema inmunológico humano como extrañas y, en consecuencia, se eliminan después de un período de tiempo muy corto, lo cual da como resultado una eficacia clínica baja o ninguna eficacia clínica. Se han desarrollado anticuerpos quiméricos contra las proteínas del citomegalovirus humano (hCMV), y la Patente Europea Número EP664834B (Harris y colaboradores) describe un anticuerpo quimérico dirigido hacia la glicoproteína de 86 kD del citomegalovirus humano (hCMV) denominada como gH; sin embargo, estos anticuerpos no han tenido éxito en los establecimientos clínicos.
Las tecnologías que utilizan heteromielomas para la generación de hibridomas se han utilizado para generar una variedad de anticuerpos monoclonales humanos que reconocen diferentes glicoproteínas del citomegalovirus humano (hCMV), las cuales se encuentran ambas en la envoltura viral. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US5,043,281 (Masuho y colaboradores) describe un anticuerpo monoclonal humano neutralizante que reconoce una proteína del antígeno de citomegalovirus (CMV) que tiene un peso molecular de entre 130,000 y 55,000. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US5,750,106 (Ostberg) describe un anticuerpo monoclonal humano para el citomegalovirus, denominado como SDZ MSL 109, el cual reconoce la glicoproteína gH, así como una línea celular de hibridoma para la producción de este anticuerpo. Uno de los anticuerpos monoclonales humanos neutralizantes del virus, SDZ MSL-109, se ha evaluado en los estudios clínicos en Fase l/ll para la retinitis inducida por el citomegalovirus humano (hCMV) en los pacientes inmunocomprometidos, pero debido a la falta de eficacia, no se continuaron los estudios clínicos (Borucki y colaboradores, 2004; Hamilton y colaboradores, 1997; Boeckh y colaboradores, 2001). Una explicación plausible para el fracaso de estos estudios es la variabilidad antigénica del citomegalovirus humano (hCMV). El citomegalovirus humano (hCMV) es único entre los virus de herpes humano, en que es una variable antigénica, y la mayoría de los anticuerpos monoclonales humanos, que reaccionan con los antígenos de envoltura, muestran una capacidad de neutralización específica de la cepa. Esto es especialmente cierto para los anticuerpos monoclonales humanos específicos de gH, como el SDZ MSL-109. Este obstáculo solamente se puede superar mediante el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los epítopos que se encuentran sobre el citomegalovirus humano (hCMV) que estén conservados entre los diferentes aislados.
En el pasado, el progreso en el aislamiento de los anticuerpos monoclonales neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) fue lento, debido al hecho de que no había rastreos de anticuerpos de alta producción para determinar su capacidad neutralizante disponibles. En adición, con frecuencia se ha utilizado el método de inmortalización del virus de Epstein Barr (EBV) para generar células-B inmortalizadas que produzcan un anticuerpo de interés, durante un número de años. Esta técnica ha tenido éxito para la generación de células secretoras de anticuerpos a partir de diferentes fuentes de células-B humanas, tales como la sangre periférica de sujetos sanos utilizando la selección específica del antígeno (Casali y colaboradores, 1986), los ganglios linfáticos, el bazo, o la sangre periférica de los pacientes (Yamaguchi y colaboradores, 1987; Posner y colaboradores, 1991; Raff y colaboradores, 1988; Steenbakkers y colaboradores 1993 y 1994). Esta técnica se utilizó para la inmortalización de las células mononucleares de sangre periférica aisladas a partir de donantes de sangre seropositivos para el citomegalovirus (CMV), y el aislamiento subsiguiente de tres anticuerpos: ITC52, ITC63b e ITC88 (WO 93/021952 A1). ITC52 e ITC63b son reactivos con el epítopo conformacional AD-1 del citomegalovirus (CMV), que consiste en la secuencia de aminoácidos 557-630 de gp58 de CMV, y el ITC88 es reactivo contra AD-2, el cual comprende la secuencia de aminoácidos 67-86 (AD-2) de gp116 de CMV (Publicación Internacional Número WO 93/021952 A1).
Se han publicado mejoras sobre el método de transformación de EBV por Lanzavecchia (Publicación Internacional Número WO 04/076677 A2), y Funaro y colaboradores (Publicación Internacional Número WO 07/068758 A1), y estos métodos se han utilizado para la generación de anticuerpos para el citomegalovirus humano (hCMV). La Publicación Internacional Número WO 08/084410 A2 (Lanzavecchia y Macagno) describe anticuerpos producidos a partir de las líneas celulares de EBV 1F11, 2F4, 5A2 y 9A11 que neutralizan la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de las células endoteliales, las células epiteliales, las células retínales y las células dendríticas, y se dirigen hacia un epítopo conformacional formado por gpUL130 y gpUL131A. Sin embargo, los anticuerpos a partir de estas líneas de EBV no tienen ninguna capacidad neutralizante del citomegalovirus humano (hCMV) detectable, si se utilizan fibroblastos como las células objetivo para la infección. La Publicación Internacional Número WO 08/084410 A2 también menciona las líneas de EBV 10C6, 5 F 1 , 6B4 y 7H3, que producen anticuerpos que neutralizan la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de los fibroblastos y de las células endoteliales en concentraciones inhibidoras medias-máximas (IC50) en el intervalo de entre 0.3 y 2.0 microgramos/mililitro. Se describe que los anticuerpos producidos a partir de estas líneas de EBV se enlazan a un epítopo funcional de gB. Sin embargo, aunque se han deducido las secuencias de cadena pesada y ligera de los anticuerpos a partir de algunas de las líneas celulares de EBV mencionadas anteriormente, estos datos no se han confirmado para los anticuerpos recombinantemente expresados y purificados codificados para las secuencias publicadas. Una solicitud de patente más reciente de Lanzavecchia y Macagno (Publicación Internacional Número WO 10/007463 A1) describe el anticuerpo 6G4, el cual se enlaza a un epítopo determinado por una combinación de las proteínas UL128, UL130 y UL131A, y el cual neutraliza la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de las células endoteliales, retínales y dendríticas. Adicionalmente, la Publicación Internacional Número WO 10/007533 A1 (Lanzavecchia y Macagno) describe anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) que se enlazan a un epítopo en la proteína UL128 de hCMV, un epítopo formado por las proteínas gH, gl_, UL128 y UL130, un epítopo formado por las proteínas UL128, UL130 y UL131A, o un epítopo formado por las proteínas UL130 y UL131A.
La Publicación Internacional Número WO 08/071806 A1 (Funaro y colaboradores) describe el anticuerpo 26A1, el cual se enlaza a, y neutraliza, el citomegalovirus humano (hCMV), pero no muestra un enlace significativo a cualquiera de los antígenos gB o gH cuando se prueba mediante un ELISA. Se reporta que una concentración inhibidora media-máxima (IC50) del anticuerpo 26A1 está en el intervalo de 1 microgramo/mililitro tanto para los fibroblastos primarios como para las células endoteliales, y por consiguiente, en un intervalo que ha sido alcanzado por los anticuerpos descritos en la técnica anterior. Una solicitud de patente adicional por Funaro y colaboradores, describe el anticuerpo 1F7, el cual reconoce gH (Publicación Internacional Número WO 09/003975 A1). De una manera similar al anticuerpo 26A1, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 08/071806 A1, se reporta que la concentración inhibidora media-máxima (IC50) del anticuerpo 1F7 está en el intervalo de 1 microgramo/mililitro tanto para los fibroblastos primarios como para las células endoteliales, y por consiguiente, en un intervalo que ha sido alcanzado por los anticuerpos descritos en la técnica anterior. Todavía otra solicitud de patente por Funaro y colaboradores (Publicación Internacional Número WO 09/024445 A1) describe los anticuerpos 8C10, 37B7, 8A11 y 10B7, los cuales reconocen ya sea el dominio AD-2 de gB (clones 8C10, 8A11, 10B7), o bien una proteína no relacionada con gB o gH (clon 37B7). Como en las solicitudes de patente de Funaro y colaboradores (Publicaciones Internacionales Números WO 08/ 071806 A1 y WO 09/003975 A1), los anticuerpos descritos en la Publicación Internacional Número WO 09/024445 A1 también exhiben una concentración inhibidora media-máxima (IC50) en el intervalo de 1 microgramo/mililitro tanto para los fibroblastos primarios como para las células endoteliales (10B7, 8A11, 37B7) o más alta, a aproximadamente 10 microgramos/mililitro (8C10), y por consiguiente, en el intervalo de los anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) anteriormente publicados.
Las solicitudes de patente recientes adicionales describen anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) con características similares. Por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 09/114560 A2 (Olsen) describe los clones de anticuerpos 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 3G7, 4P12, 5P9, 9C16, los cuales se enlazan todos al epítopo AD-2 de gB, y exhiben una concentración inhibidora media-máxima (IC50) de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de los fibroblastos, en el intervalo de 1 microgramo/mililitro. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US20090004198 (Nakajima y colaboradores) da a conocer un anticuerpo de alta afinidad para el dominio AD-1 de gB, con una afinidad de enlace aparente en pM, y una actividad neutralizante del citomegalovirus humano (hCMV) del 80 por ciento en los fibroblastos, si se utiliza en concentraciones de 1 microgramo/ mililitro y más altas (10 microgramos/mililitro y 100 microgramos/ mililitro). Dos solicitudes recientes, las Publicaciones Internacionales Números WO 10/114105 A1 y WO 10/114106 A1, ambas de Evec Inc., describen anticuerpos que se enlazan al AD-2 y un epitopo discontinuo en AD-1, respectivamente.
Como se da a conocer en la presente invención, hemos desarrollado anticuerpos humanos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV), que se enlazan con una alta afinidad a la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV). En adición, estos anticuerpos exhiben una alta potencia similar (IC50s por debajo de 0.5 microgramos/mililitro) en la neutralización del citomegalovirus humano (hCMV), utilizando una amplia gama de tipos de células susceptibles al citomegalovirus humano (hCMV) (fibroblastos, células endoteliales, epiteliales y dendríticas), y una alta potencia, no solamente sobre la cepa de laboratorio AD-169, sino que también sobre todos los aislados clínicos probados hasta ahora. En adición, los anticuerpos que se dan a conocer en la presente, reconocen y definen un novedoso epitopo neutralizante de la proteína gB que no se ha descrito anteriormente. Debido a su alta afinidad y potencia, y a sus novedosas características de enlace de epitopo determinadas mediante los estudios funcionales, como se describen en la presente, los miembros enlazadores de la invención son en particular adecuados para utilizarse en el tratamiento terapéutico, la profilaxis y/o el diagnóstico de las infecciones por el citomegalovirus humano (hCMV) en los pacientes humanos. Los miembros enlazadores son útiles para el tratamiento de diversos trastornos asociados con la infección por citomegalovirus (CMV), como se describe con detalle en cualquier otra parte de la presente.
Breve Descripción de la Invención En la presente se describen varios anticuerpos humanos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) y específicos de gB altamente potentes, los cuales también reconocen un epltopo neutralizante del citomegalovirus humano (hCMV) completamente nuevo y, por consiguiente, actúan mediante un principio terapéutico diferente en comparación con todos los demás anticuerpos específicos para el citomegalovirus humano (hCMV) conocidos. Su descubrimiento y caracterización funcional se da a conocer adicionalmente más adelante. Como se describe con mayor detalle en los Ejemplos, se han identificado 50 anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) completamente humanos. Se han aislado a partir de sangre periférica humana transformada con células-B derivadas de EBV, derivadas a partir de donantes infectados por el citomegalovirus humano (hCMV). Las secuencias de región determinante de complementariedad (CDR) de los anticuerpos 1 a 50 son como se detallan en las Tablas 19 y 20. Las combinaciones de dominio VH y dominio VL para un panel de anticuerpos 1 a 46 son como se detallan en la Tabla 7. Todas las secuencias referidas en las Tablas 7 y 19 también se muestran en el listado de secuencias adjunto que forma parte de la presente divulgación.
Como se describe con mayor detalle más adelante, se ha demostrado que los miembros enlazadores de acuerdo con la invención neutralizan la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de las células objetivo en concentraciones terapéuticamente relevantes, es decir, con IC5o por debajo de 1 microgramo/mililitro. Los miembros enlazadores más activos neutralizan el citomegalovirus humano (hCMV) incluso en IC50s por debajo de 0.5 microgramos/mililitro. También se ha observado una capacidad neutralizante con diferentes aislados clínicos (por ejemplo, Towne y Altu; Tabla 16), que representan diferentes genotipos de gB. Los miembros enlazadores de la invención pueden neutralizar una o más actividades del citomegalovirus humano (hCMV). Por ejemplo, la actividad biológica inhibida puede ser la prevención de la infección de los fibroblastos, las células endoteliales, las células epiteliales, las células retínales y/o las células dendríticas. La prevención de la infección de los fibroblastos se ha demostrado en un ensayo de neutralización in vitro que utiliza una cepa recombinante del citomegalovirus humano (hCMV), AD169, que expresa la luciferasa del gen reportero. Después de la infección con esta cepa de citomegalovirus humano (hCMV) genéticamente modificada, las células objetivo llegan a ser positivas para la expresión de la enzima luciferasa, la cual se puede detectar mediante una conversión del sustrato apropiada en un luminómetro convencional. Se demostró que los miembros enlazadores descritos en esta invención neutralizan la infección de la cepa AD169 del citomegalovirus humano (hCMV) cuando se incuba primero con la cepa del virus recombinante positiva para luciferasa, y luego se siembra sobre monocapas de fibroblastos primarios de prepucio humano (HFFs). En seguida de una incubación adicional, se detectó la luminiscencia utilizando un luminómetro y las unidades de luz relativas (RLU) detectadas. Entonces se calculó el porcentaje de neutralización, en donde la titulación neutralizante se indica como la concentración del miembro enlazador (microgramos/mililitro) que da una reducción del 50 por ciento o del 100 por ciento de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de las células objetivo. Los miembros enlazadores pueden dar una reducción del 50 por ciento de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) en concentraciones de 0.1 a 5.0 microgramos/mililitro, de preferencia de 0.1 a 2.0 microgramos/mililitro, más preferiblemente de 0.3 a 1.3 microgramos/mililitro, o más preferiblemente de 0.1 a 0.6 microgramos/mililitro. Se ha demostrado que los miembros enlazadores dan como resultado una reducción del 50 por ciento de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) en concentraciones terapéuticamente relevantes de 0.1, 0.5, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.5 ó 2.0 microgramos/mililitro.
Otros métodos que se pueden utilizar para determinar la neutralización de la infectividad del citomegalovirus humano (hCMV) incluyen ELISA, FACS, Western blot, inmunoprecipitación, e inspección visual basada en la formación y el recuento de placas.
Se demostró que los miembros enlazadores descritos en la presente neutralizan el citomegalovirus humano (hCMV) no solamente en los fibroblastos, sino que, con una eficacia similar, también en las células endoteliales, epiteliales y dendríticas (como se muestra en un ensayo que utiliza fibroblastos primarios de prepucio, Ejemplo 4, y en un ensayo que utiliza células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), células epiteliales de pigmento retinal ARPE-19 humanas, y células dendríticas primarias, como se muestra en el Ejemplo 7).
La invención da a conocer miembros enlazadores de alta afinidad para el citomegalovirus humano (hCMV) y específicos para la proteína gB de hCMV. Los miembros enlazadores de la invención se pueden enlazar a la proteína gB de hCMV con una KD de no más de 50nM, por ejemplo, de no más de 25nM, 15nM, 10nM, 5nM, 3nM, 1.5nM, 1nM, 0.5nM, 0.1nM, 75pM ó 57pM. De preferencia, el miembro enlazador tiene una KD de 1nM o menos, de preferencia de menos de 0.5nM, de preferencia de menos de 0.1nM, y de una manera muy preferible de menos de 75pM. La KD se puede determinar mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, Biacore®. Las mediciones de afinidad Biacore® se describen en la presente en el Ejemplo 5.
Como se describe en cualquier otra parte de la presente, la resonancia de plasmón superficial involucra pasar un analito en fase de fluido sobre un ligando unido a un soporte sólido, y determinar los índices de asociación (ka), y los índices de disociación (kd) entre el analito y el ligando. La resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, se puede llevar a cabo pasando un miembro enlazador en fase de fluido sobre la proteína gB unida a un soporte. Los datos de la resonancia de plasmón superficial se pueden ajustar a un modelo de datos de analito monovalente. La afinidad se puede expresar como la constante de disociación, KD, la cual se calcula a partir de la proporción de las constantes de índice de disociación y de asociación kd/ka, como se determinan mediante la resonancia de plasmón superficial, utilizando un modelo de datos de analito monovalente.
Se muestra que los miembros enlazadores descritos en la presente se enlazan a una región específica de la proteína gB de hCMV. Los epítopos conocidos de la proteína gB de hCMV están dentro del dominio antigénico 1 (AD-1; entre los aminoácidos 552-635) y/o dentro del dominio antigénico 2 (AD-2; entre los aminoácidos 67-86) de la cepa AD169 de gB, SEQ ID No: 239. En la presente invención describimos miembros enlazadores que se enlazan a dos nuevos dominios antigénicos la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV), dominio antigénico 4 (AD-4; una región discontinua entre los aminoácidos 121-132 y 344-438 de la cepa AD169 de gB; SEQ ID No: 239), y dominio antigénico 5 (AD-5; entre los aminoácidos 133 a 343 de la cepa AD169 de gB; SEQ ID No: 239). En los experimentos iniciales, se investigó la capacidad de seis de los miembros enlazadores descritos en la presente, los anticuerpos monoclonales recombinantes Ab-04, Ab-11, Ab-14, Ab-19, Ab-28 y Ab-42, para enlazarse a regiones específicas de la proteína gB de hCMV. En particular, primero se investigó la especificidad de enlace de epítopo de estos seis miembros enlazadores en un ensayo de competición Biacore® con una selección de anticuerpos anti-hCMV conocidos en la materia, que se enlazan ya sea con el epítopo AD-1 o bien con el epítopo AD-2 de la proteína gB. Debido a que los miembros enlazadores de la presente invención se enlazaron específicamente a la proteína gB con una alta afinidad, pero no pudieron competir por el enlace de gB con los anticuerpos específicos de AD-1 y AD-2, quedó claro que los miembros enlazadores de la presente invención reconocen un novedoso epítopo neutralizante de la proteína gB. Se obtuvo un apoyo adicional para este hallazgo mediante la expresión de una versión truncada de la proteína gB, la cual comprende los residuos de aminoácidos 100 a 447 (gB cepa AD169; SEQ ID No: 239), la cual, después de su expresión en células COS, fue reconocida por los miembros enlazadores de la invención.
En seguida de la generación de un modelo molecular de gB del citomegalovirus humano (hCMV) (cepa AD169; SEQ ID No: 239), se identificaron los dominios de proteína expuestos superficialmente, y se predijo una secuencia de aminoácidos discontinua entre los residuos de aminoácidos 121-132 y 344-438 como un probable epítopo, al cual se podrían enlazar los miembros enlazadores de la invención. Cuando se expresó este epítopo predicho como los aminoácidos 116 a 132 y 344 a 440 (gB cepa AD169; SEQ ID No: 239), los cuales se acoplaron mediante un enlazador de aminoácidos sintético, se encontró que esta proteína recombinante era específicamente reconocida por los miembros enlazadores Ab-11, Ab-14 o Ab-28 de la invención. Este nuevo epítopo se ha denominado como AD-4. Por consiguiente, los miembros enlazadores de la invención no se enlazan a la región AD-1 de la proteína gB de hCMV. También, los miembros enlazadores de la invención no se enlazan a la región AD-2 de la proteína gB de hCMV. En contraste, los miembros enlazadores Ab-01 a Ab-46 de la invención se enlazan a un nuevo epítopo conformacional denominado como AD-4 (también denominado como el Dominio II (Dom II)), entre los residuos de aminoácidos 100 a 447, y de preferencia entre los residuos de aminoácidos 121 a 438. Más preferiblemente, los miembros enlazadores de la invención se enlazan a los estiramientos de aminoácidos discontinuos 116-132 y 344-440 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID No: 239), y de una manera muy preferible, a los estiramientos 121-132 y 344-438 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID No: 239). En este aspecto, se tiene que entender, de acuerdo con la invención, que el epítopo discontinuo generado por los estiramientos de aminoácidos 121-132 y 344-438 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID No: 239) constituye el mismo epítopo que el epítopo discontinuo generado por los estiramientos de aminoácidos 116-132 y 344-440 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID No: 239).
Debido a que los Anticuerpos Ab-01 a Ab-46 tienen todos regiones determinantes de complementariedad (CDRs) estructuralmente relacionadas (en particular HCDR3 de una longitud idéntica y una secuencia relacionada), y a que se derivan a partir de un solo donante, estas moléculas de anticuerpos son más probablemente mutantes somáticos de un clon reactivo con gB original y, por consiguiente, se espera que se enlacen al mismo epítopo o a un epítopo muy similar traslapado sobre la proteína gB de hCMV. De conformidad con lo anterior, también se espera que los resultados de caracterización del epítopo obtenidos con los anticuerpos recombinantes Ab-11, Ab-14 o Ab-28 sean representativos para todos los anticuerpos Ab-01 a Ab-46 que se dan a conocer en la presente. La presente invención, por consiguiente, se refiere a un miembro enlazador, de preferencia a un anticuerpo, que se enlaza a un epítopo conformacional de la proteína gB reconocido por los anticuerpos Ab-11, Ab-14 o Ab-28, y también a un miembro enlazador que compite con cualquiera de los anticuerpos Ab-11, Ab-14 o Ab-28 para enlazarse a un epítopo conformacional de la proteína gB reconocido por estos anticuerpos.
Por consiguiente, en una primera modalidad, un miembro enlazador de la invención se puede enlazar a la proteína gB de hCMV en una región que comprende los aminoácidos 116 a 132 o los aminoácidos 121 a 132, como se predice a partir del modelo estructural (Ejemplo 9). Un miembro enlazador de la invención también se puede enlazar a la proteína gB de hCMV en una región que comprende los aminoácidos 344 a 440 o los aminoácidos 344 a 438, como se predice a partir del modelo estructural (Ejemplo 9). Opcionalmente, un miembro enlazador se puede enlazar a los residuos de flanqueo o a los residuos estructuralmente vecinos en la secuencia de aminoácidos de gB de hCMV, en adición a enlazarse a los aminoácidos 116 a 132 y/o a los aminoácidos 344 a 440. De acuerdo con la convención, la numeración de residuos corresponde a la cepa AD169 de gB del hCMV (SEQ ID No: 239).
En los experimentos adicionales, también se investigó la capacidad de cuatro de los miembros enlazadores descritos en la presente, los anticuerpos monoclonales recombinantes Ab-47, Ab-48, Ab-49, Ab-50, para enlazarse a regiones específicas de la proteína gB de hCMV. En particular, primero se investigó la especificidad de enlace de epítopo de estos cuatro miembros enlazadores en un ensayo de competición ELISA (Ejemplo 8.3), y luego utilizando un ELISA de captura (Ejemplo 10.2). Quedó claro que estos cuatro miembros enlazadores reconocen un epítopo neutralizante de la proteína gB novedoso adicional.
En seguida de la generación de un modelo molecular de gB del citomegalovirus humano (hCMV) (cepa AD169; SEQ ID No: 239), se identificaron los dominios de proteína expuestos superficialmente, y se predijo una secuencia de aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 133 y 343 como un probable epítopo, al cual se podrían enlazar los miembros enlazadores de la invención. Este epítopo predicho se subdividió y se expresó como dos subdominios: Subdominio 1 (aminoácidos 133-144 y 251-343), y Subdominio 2 (aminoácidos 140 a 255) (gB cepa AD169; SEQ ID No: 239). Cuando se probaron en un ELISA de captura, el Subdominio 1 fue reconocido por los miembros enlazadores Ab-47, Ab-49 o Ab-50 de la invención. La región de aminoácidos 134 a 344 del nuevo epítopo (gB cepa AD169; SEQ ID No: 239) se ha denominado como AD-5. Por consiguiente, los miembros enlazadores Ab-47, Ab-48, Ab-49 o Ab-50 de la invención no se enlazan a la región AD-1 de la proteína gB de hC V. También, los miembros enlazadores de la invención no se enlazan a la región AD-2 de la proteína gB de hCMV. En contraste, los miembros enlazadores Ab-47 a Ab-50 de la invención se enlazan a un nuevo epítopo conformacional denominado como AD-5 (también denominado como Dominio I (Dom I)), entre los residuos de aminoácidos 133 a 343 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID No: 239).
La presente invención, por consiguiente, se refiere a un miembro enlazador, de preferencia a un anticuerpo, que se enlaza a un epítopo de la proteína gB reconocido por los anticuerpos Ab-47, Ab-48, Ab-49 o Ab-50, y también a un miembro enlazador que compite con cualquiera de estos cuatro anticuerpos para enlazarse a un epítopo conformacional de la proteína gB reconocido por estos anticuerpos.
Por consiguiente, en una segunda modalidad, un miembro enlazador de la invención se puede enlazar a la proteína gB de hCMV en una región que comprende los aminoácidos 133 a 343, como se predice a partir del modelo estructural (Ejemplo 9). Opcionalmente, un miembro enlazador se puede enlazar a los residuos de flanqueo o a los residuos estructuralmente vecinos en la secuencia de aminoácidos de gB de hCMV, en adición a enlazarse a los aminoácidos 133 a 343. De acuerdo con la convención, la numeración de residuos corresponde a la cepa AD169 de gB del hCMV (SEQ ID No: 239).
Un miembro enlazador de la invención puede comprender una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo con una secuencia de aminoácidos completamente humana. El miembro enlazador normalmente comprende un dominio de anticuerpo VH y/o Vu. Los dominios VH y VL de los miembros enlazadores también se dan a conocer como parte de la invención. Cada uno de los dominios VH y VL comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRs), y regiones de estructura (FRs). Un dominio de anticuerpo VH comprende tres regiones HCDR, designadas como HCDR1, HCDR2, y HCDR3. Un dominio de anticuerpo VL comprende tres regiones LCDR, designadas como LCDR1, LCDR2, y LCDR3. Una estructura de dominio VH o VL comprende cuatro regiones de estructura, FWR1, FWR2, FWR3 y FWR4, intercaladas con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en la siguiente estructura: FWR1 -CDR1 - FWR2 - CDR2 - FWR3 - CDR3 - FWR4.
Los ejemplos de los dominios de anticuerpos VH y VL y de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de acuerdo con la presente invención son como se enlistan en el listado de secuencias adjunto, el cual forma parte de la presente divulgación. Otras regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se dan a conocer más adelante y en la Tabla 19. Todas las secuencias VH y VL, las secuencias CDR, los conjuntos de CDRs, y los conjuntos de HCDRs, y los conjuntos de LCDRs, que se dan a conocer en la presente, representan aspectos y modalidades de la invención. Como se describe en la presente, un 'conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs)' comprende las CDR1, CDR2 y CDR3. Por consiguiente, un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena ligera se refiere una LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se informe de otra manera, un 'conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs)' incluye HCDRs y LCDRs.
Típicamente, los miembros enlazadores de la invención son anticuerpos monoclonales.
Un miembro enlazador de la invención puede comprender un sitio de enlace de antígeno dentro de una molécula no de anticuerpo, normalmente proporcionado por una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs), por ejemplo, un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en un andamiaje de proteína que no es de anticuerpo, como se discute adicionalmente más adelante.
Los miembros enlazadores Ab-01 a Ab-46, de acuerdo con la invención, se aislaron inicialmente a partir de un donante infectado por el citomegalovirus humano (hCMV), y se aislaron a partir de las líneas de células-B inmortalizadas por EBV, referidas como SM1, SM3, SM4, SM5, SM6, SM7, SM9, SM10 ó SM11. A partir de estas nueve líneas celulares, se pudieron identificar 37 secuencias de codificación VH diferentes y 62 secuencias de codificación VL diferentes de los anticuerpos humanos (Tabla 6). La combinación de todas las secuencias de codificación VH y VL identificadas a partir de cada línea celular como cadenas de IgH e IgL, se pueden generar teóricamente 295 anticuerpos diferentes. De éstos, se han identificado 46 anticuerpos recombinantes diferentes, los cuales fueron neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) en un ensayo de rastreo biológico de primera línea utilizando la expresión de luciferasa, la cepa de laboratorio del citomegalovirus humano (hCMV) AD-169, y los fibroblastos primarios de prepucio humano. Se encontró que seis de estos anticuerpos recombinantes neutralizan el citomegalovirus humano (hCMV) con una alta potencia (IC50s por debajo de 1 microgramo/mililitro), y se enlazan a la proteína gB con una alta afinidad de KD de 15nM o menos (Tablas 13 y 15 más adelante).
La estructuras y localizaciones de los dominios variables del miembro enlazador se pueden determinar haciendo referencia a Kabat y colaboradores (1991), y a las actualizaciones del mismo. En la presente se describe un panel de miembros enlazadores, cada uno de los cuales comprende el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs), como se especifican en las Tablas 19 y 20, en donde la HCDR1 tiene los residuos de Kabat 31-35; la HCDR2 tiene los residuos de Kabat 50-65; la HCDR3 tiene los residuos de Kabat 95-102. La LCDR1 tiene los residuos de Kabat 24-34; la LCDR2 tiene los residuos de Kabat 50-56, y la LCDR3 tiene los residuos de Kabat 89-97. La numeración de Kabat se determinó utilizando el sitio web: http://www. bioinf.org. uk/ abs/abnum/ Un miembro enlazador de una primera modalidad de la invención puede comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) como se describen en la presente, por ejemplo, una CDR3, y opcionalmente también una CDR1 y CDR2 para formar un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La región determinante de complementariedad (CDR) o el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) puede ser una región determinante de complementariedad (CDR) o un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46, o puede ser una variante de las mismas como se describe en la presente.
Un miembro enlazador puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46 con una o más mutaciones de aminoácidos dentro del conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L dadas a conocer. Las mutaciones de aminoácidos son sustituciones, supresiones o inserciones de un aminoácido. Con base en los Ejemplos proporcionados y en las secuencias dadas a conocer, puede haber, por ejemplo, hasta 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, dentro del conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L. Adicionalmente, puede haber hasta 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mutaciones en HCDR3, y/o puede haber hasta 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mutaciones en HCDR2, y/o puede haber hasta 3, 2 ó 1 mutaciones en HCDR1, y/o puede haber hasta 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mutaciones en LCDR3, y/o puede haber 1 mutación en LCDR2 y/o LCRD1. La mutación puede ser una sustitución, o las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L opcionalmente pueden contener una inserción o supresión de un aminoácido comparándose con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L dadas a conocer.
Las sustituciones, inserciones o supresiones se pueden hacer en cualquier punto de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), por ejemplo, en HCDR1, las sustituciones pueden ser de cualquiera de los residuos de Kabat 31 a 35, por ejemplo, cualquiera de los residuos de Kabat 31, 32, 34 y/o 35, en HCDR2, las sustituciones pueden ser de cualquiera de los residuos de Kabat 50 a 65, por ejemplo, cualquiera de los residuos de Kabat 50, 53, 54, 58, 60, y/o 64, y en HCDR3, las sustituciones pueden ser de cualquiera de los residuos de Kabat 99 a 102, por ejemplo, cualquiera de los residuos de Kabat 99 a 100C, 100E, 100F y/o 100K a 102. Por ejemplo, en LCDR1, una sustitución puede ser de cualquiera de los residuos de Kabat 24 a 34, por ejemplo, los residuos de Kabat 26 ó 27, en LCDR2 las sustituciones pueden ser de cualquiera de los residuos de Kabat 50 a 56, por ejemplo, el residuo de Kabat 56, y en LCDR3, las sustituciones pueden ser de cualquiera de los residuos de Kabat 89 a 97, por ejemplo, cualquiera de los residuos de Kabat 89, y puede haber una inserción en la posición 95B. Se pueden encontrar los detalles de las mutaciones de aminoácidos específicas comparándose con la secuencia del anticuerpo Ab-28 en las Tablas 20a y 20b para las HCDRs y LCDRs, respectivamente, por ejemplo, las sustituciones o inserciones de aminoácidos.
Por ejemplo, la presente invención proporciona un miembro enlazador aislado para el citomegalovirus humano (hCMV), el cual comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) tiene 22 o menos alteraciones de aminoácidos a partir de un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en donde: HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 3; HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 4; HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 5; LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 93; LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 94; y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 95 Por ejemplo, un miembro enlazador o dominio VH de acuerdo con la invención puede comprender la HCDR1 del anticuerpo Ab-28 con una o más de las siguientes mutaciones: El residuo de Kabat Asp 31 reemplazado por Gly; El residuo de Kabat His 32 reemplazado por Phe o Tyr; El residuo de Kabat Met 34 reemplazado por lie o Leu; y El residuo de Kabat Val 35 reemplazado por Asn.
Un miembro enlazador o dominio VH de acuerdo con la invención puede comprender la HCDR2 del anticuerpo Ab-28 con una o más de las siguientes mutaciones: El residuo de Kabat Trp 50 reemplazado por Ser o Cys; El residuo de Kabat Gln 53 reemplazado por Asn o His; El residuo de Kabat Ser 54 reemplazado por Thr; El residuo de Kabat Gly 58 reemplazado por Lys, Asn o His; El residuo de Kabat Gly 60 reemplazado por Ala; y El residuo de Kabat Gln 64 reemplazado por Arg.
Un miembro enlazador o dominio VH de acuerdo con la invención puede comprender la HCDR3 del anticuerpo Ab-28 con una o más de las siguientes mutaciones: El residuo de Kabat Thr 99 reemplazado por Ala; El residuo de Kabat Val 100 reemplazado por Met; El residuo de Kabat Ser 100A reemplazado por Thr; El residuo de Kabat Asn 100B reemplazado por Thr; El residuo de Kabat Ser 100C reemplazado por Phe; El residuo de Kabat Leu 100E reemplazado por Met o Ala; El residuo de Kabat Ser 100F reemplazado por Gly; El residuo de Kabat His 100K reemplazado por Tyr; El residuo de Kabat Asn 100L reemplazado por Ser o Asp; El residuo de Kabat Arg 100M reemplazado por Val El residuo de Kabat Leu 100N reemplazado por Met; El residuo de Kabat Asp 101 reemplazado por Gly; y El residuo de Kabat Ala 102 reemplazado por Val miembro enlazador o dominio VL de acuerdo con invención puede comprender la LCDR1 del anticuerpo Ab-28, en donde el residuo de Kabat Ser 26 es reemplazado por Asn, o el residuo de Kabat Ser 27 es reemplazado por Arg.
Un miembro enlazador o dominio Vu de acuerdo con la invención puede comprender la LCDR2 del anticuerpo Ab-28, en donde el residuo de Kabat Ser 56 es reemplazado por Pro.
Un miembro enlazador o dominio VL de acuerdo con la invención puede comprender la LCDR3 del anticuerpo Ab-28 con una o más de las siguientes mutaciones: El residuo de Kabat Gly 89 reemplazado por Ala; El residuo de Kabat Pro 91 reemplazado por Trp; El residuo de Kabat Arg 93 reemplazado por Ser; El residuo de Kabat Ser 94 reemplazado por Asp; El residuo de Kabat Ser 95a reemplazado por Gly o Ala; Ala insertado al residuo de Kabat 95b; El residuo de Kabat Val 96 reemplazado por Tyr; y El residuo de Kabat lie 97 reemplazado por Val.
Por consiguiente, un miembro enlazador de la invención puede comprender una LCDR3 en donde el residuo de Kabat 95b es Ala, o en donde el residuo de Kabat 95b está ausente.
La invención proporciona miembros enlazadores, los cuales comprenden una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46, y/o una LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 de cualquiera de los anticuerpos 1 a 46, por ejemplo, un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46 mostrados en la Tabla 19 ó 20.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 8; HCDR2 es la SEQ ID No: 9; HCDR3 es la SEQ ID No: 10; LCDR1 es la SEQ ID No: 98; LCDR2 es la SEQ ID No: 99; y LCDR3 es la SEQ ID No: 100, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-02.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 13; HCDR2 es la SEQ ID No: 14; HCDR3 es la SEQ ID No: 15; LCDR1 es la SEQ ID No: 103; LCDR2 es la SEQ ID No: 104; y LCDR3 es la SEQ ID No: 105, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-04.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 18; HCDR2 es la SEQ ID No: 19; HCDR3 es la SEQ ID No: 20; LCDR1 es la SEQ ID No: 108; LCDR2 es la SEQ ID No: 109; y LCDR3 es la SEQ ID No: 110, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-11.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 23; HCDR2 es la SEQ ID No: 24; HCDR3 es la SEQ ID No: 25; LCDR1 es la SEQ ID No: 113; LCDR2 es la SEQ ID No: 114; y LCDR3 es la SEQ ID No: 115, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-14.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 3; HCDR2 es la SEQ ID No: 4; HCDR3 es la SEQ ID No: 5; LCDR1 es la SEQ ID No: 93; LCDR2 es la SEQ ID No: 94; y LCDR3 es la SEQ ID No: 95, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-28.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 28; HCDR2 es la SEQ ID No: 29; HCDR3 es la SEQ ID No: 30; LCDR1 es la SEQ ID No: 108; LCDR2 es la SEQ ID No: 109; y LCDR3 es la SEQ ID No: 110, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-42.
El miembro enlazador puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de VH de uno de estos anticuerpos. Opcionalmente también puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de VL de uno de estos anticuerpos, y las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de VL pueden ser a partir del mismo o de un anticuerpo diferente de aquél de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de VH.
La invención también proporciona un dominio VH, el cual comprende un conjunto de HCDRs de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46, y/o un dominio Vu, el cual comprende un conjunto de LCDRs de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46.
Típicamente, un dominio VH se empareja con un dominio VL para proporcionar un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo, aunque, como se discute adicionalmente más adelante, se puede utilizar u n dom in io VH o VL solo para enlaza rse al antígeno. El dominio VH del anticuerpo Ab-28 se puede emparejar con el dominio VL del anticuerpo Ab-28, de tal manera que se forma un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo , el cual comprende ambos dominios VH y VL del anticuerpo Ab-28. Se proporcionan modalidades análogas para los otros dominios VH y VL que se dan a conocer en la presente. En otras modalidades, el VH del anticuerpo Ab-28 se empareja con u n dominio VL diferente del VL del a nticuerpo. La promiscuidad de cadenas ligeras está bien establecida en este campo (Kang y colaboradores, 1 991 ) . N uevamente, la invención proporciona modalidades análogas para los otros dominios VH y VL que se dan a conocer en la presente.
Por consig uiente, u na cadena de Ig H que contenga VH de cualquiera de los anticuerpos 1 a 46 se puede empa rejar con la cadena de IgL q ue contenga VL de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-46 para generar u n miembro enlazador específico de gB.
Un miembro enlazador puede comprender u na molécula de anticuerpo q ue tenga una o más reg iones determinantes de complementariedad (C D s) , por ejemplo, un conjunto de regiones determi nantes de complementariedad (C DRs) , dentro de una estructu ra de anticuerpo. Las regiones de estructu ra pueden ser de las secuencias del segmento genético de la l ínea germinal humana . Las secuencias del segmento genético de la l ínea germinal h umana son conocidas por los expertos en este campo, y se pueden accesar, por ejemplo, a partir de la compilación de VBase o de la base de datos en línea IMGT (http://imgt.cines.fr).
Un miembro enlazador de la invención puede ser una molécula de anticuerpo humano aislada que tenga un dominio VH, el cual comprenda un conjunto de HCDRs en una estructura de la línea germinal humana, por ejemplo, IGHV1-2. Por consiguiente, las regiones de estructura FWR1, FWR2 y/o FWR3 del dominio VH pueden comprender regiones de estructura del segmento genético de la línea germinal humana IGHV1-2. FWR4 puede comprender una región de estructura de los segmentos J de la línea germinal humana seleccionados a partir de, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 188 a 191. La secuencia de aminoácidos de VH FWR1 puede ser la SEQ ID No: 181. La secuencia de aminoácidos de VH FWR2 puede ser la SEQ ID No: 182. La secuencia de aminoácidos de VH FWR3 puede ser la SEQ ID No: 183 ó 184.
Una molécula de anticuerpo o un dominio VH de la invención puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena pesada: FWR1 SEQ ID No: 181; FWR2 SEQ ID No: 182; FWR3 SEQ ID No: 183 ó 184; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena pesada con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede incluir un dominio VH que sea codificado por una secuencia de ácido nucleico que sea cuando menos el 80 por ciento homologa a la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2, de preferencia, la secuencia de ácido nucleico es cuando menos el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2. El dominio VH de un anticuerpo de la invención puede ser cuando menos el 80 por ciento homólogo a la secuencia de aminoácidos del dominio VH codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2. De preferencia, la secuencia de aminoácidos del dominio VH es cuando menos el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homólogo a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homólogo a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2.
Normalmente el miembro enlazador también tiene un dominio VL, el cual comprende un conjunto de LCDRs, por ejemplo, en una estructura de la línea germinal humana, por ejemplo, IGLV1-51. Por consiguiente, las regiones de estructura del dominio VL pueden comprender las regiones de estructura FWR1, FWR2 y/o FWR3 del segmento genético de la línea germinal humana IGLV1-51. FWR4 puede comprender una región de estructura del segmento J de la línea germinal humana IGLJ2 (SEQ ID No: 193). La secuencia de aminoácidos de VL FWR1 puede ser la SEQ ID No: 185. La secuencia de aminoácidos de VL FWR2 puede ser la SEQ ID No: 186. La secuencia de aminoácidos de VL FWR3 puede ser la SEQ ID No: 187.
Una molécula de anticuerpo o un dominio VL de la invención puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena ligera: FWR1 SEQ ID No: 185; FWR2 SEQ ID No: 186; FWR3 SEQ ID No: 187; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena ligera con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede incluir un dominio VL que sea codificado por una secuencia de ácido nucleico que sea cuando menos el 80 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGLV1-51. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico es cuando menos el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGLV1-51, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGLV1-51. El dominio VL de un anticuerpo de la invención puede ser cuando menos el 80 por ciento homólogo a la secuencia de aminoácidos del dominio VL codificado por la secuencia genética de la línea germinal IGLV1-51. De preferencia, la secuencia de aminoácidos del dominio VL es cuando menos el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGLV1-51, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGLV1-51.
Por ejemplo, una molécula de anticuerpo de la invención puede comprender un conjunto de regiones de estructura de cadena pesada y ligera, en donde la FWR1 de cadena pesada es la SEQ ID No: 181; la FWR2 de cadena pesada es la SEQ ID No: 182; la FWR3 de cadena pesada es la SEQ ID No: 183; la FWR1 de cadena ligera es la SEQ ID No: 185; la FWR2 de cadena ligera es la SEQ ID No: 186; la FWR3 de cadena ligera es la SEQ ID No: 187; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena pesada y ligera con 10 o menos, por ejemplo, cinco o menos, alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones.
Los miembros enlazadores Ab-47 a Ab-50, de acuerdo con la invención, se aislaron inicialmente a partir de tres donantes infectados por el citomegalovirus humano (hCMV) y se aislaron a partir de líneas de células-B inmortalizadas con EBV, referidas como SM10, SM12, 2C2 o 1G2. A partir de estas cuatro líneas celulares, se pudieron identificar cuatro secuencias de codificación VH diferentes y cinco secuencias de codificación VL diferentes de los anticuerpos humanos (Tabla 12). La combinación de todas las secuencias de codificación VH y VL a partir de cada línea celular como cadenas de IgH e IgL puede generar teóricamente 20 anticuerpos diferentes. De éstos, se han identificado cuatro anticuerpos recombinantes diferentes, los cuales fueron neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) en un ensayo de rastreo biológico de primera línea utilizando expresión de luciferasa, la cepa de laboratorio AD-169 del citomegalovirus humano (hCMV), y fibroblastos primarios de prepucio humano. Se encontró que todos estos anticuerpos recombinantes neutralizan el citomegalovirus humano (hCMV) con una alta potencia (IC50s por debajo de 0.6 microgramos/mililitro; Tabla 14 más adelante).
Las estructuras y localizaciones de los dominios variables del miembro enlazador se pueden determinar haciendo referencia a Kabat y colaboradores (1991), y a las actualizaciones del mismo. En la presente se describen los miembros enlazadores Ab-46, Ab-47, Ab-48 y Ab-50, cada uno de los cuales comprende el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) como se especifican en la Tabla 19, en donde las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se identificaron by el sistema de numeración de Kabat (Kabat y Wu, 1991), y se determinaron utilizando el sitio web: http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/ .
Un miembro enlazador de una segunda modalidad de la invención puede comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) como se describen en la presente, por ejemplo, una CDR3, y opcionalmente también una CDR1 y CDR2 para formar un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La región determinante de complementariedad (CDR) o el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) puede ser una región determinante de complementariedad (CDR) o un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50, o puede ser una variante de las mismas, como se describe en la presente.
Un miembro enlazador puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L de cualquiera de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50 con una o más mutaciones de aminoácidos dentro del conjunto que se da a conocer de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L. Las mutaciones de aminoácidos son sustituciones, supresiones o inserciones de un aminoácido. Basándose en los Ejemplos proporcionados y las secuencias que se dan a conocer, puede haber, por ejemplo, hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mutaciones dentro del conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L. La mutación puede ser una sustitución, o las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L pueden contener opcionalmente una inserción o supresión de un aminoácido, comparándose con el conjunto que se da a conocer de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) H y/o L. Se pueden hacer sustituciones, inserciones o supresiones en cualquier punto en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs).
La invención proporciona miembros enlazadores que comprenden una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50, y/o una LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 de cualquiera de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50, por ejemplo, un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50 mostrados en la Tabla 19.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 243; HCDR2 es la SEQ ID No: 244; HCDR3 es la SEQ ID No: 245; LCDR1 es la SEQ ID No: 263; LCDR2 es la SEQ ID No: 264; y LCDR3 es la SEQ ID No: 265, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-47.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un , conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 248; HCDR2 es la SEQ ID No: 249; HCDR3 es la SEQ ID No: 250; LCDR1 es la SEQ ID No: 268; LCDR2 es la SEQ ID No: 269; y LCDR3 es la SEQ ID No: 270, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-48.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 253; HCDR2 es la SEQ ID No: 254; HCDR3 es la SEQ ID No: 255; LCDR1 es la SEQ ID No: 273; LCDR2 es la SEQ ID No: 274; y LCDR3 es la SEQ ID No: 275, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-49.
Por ejemplo, un miembro enlazador de la invención puede comprender un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 258; HCDR2 es la SEQ ID No: 259; HCDR3 es la SEQ ID No: 260; LCDR1 es la SEQ ID No: 278; LCDR2 es la SEQ ID No: 279; y LCDR3 es la SEQ ID No: 280, que representan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo Ab-50.
Un miembro enlazador de la invención puede ser una molécula de anticuerpo humano aislada que tiene un dominio VH, el cual comprende un conjunto de HCDRs en una estructura de la línea germinal humana, por ejemplo, IGHV4-39 o IGHV4-59. Por consiguiente, las regiones de estructura FWR1, FWR2 y/o FWR3 del dominio VH pueden comprender las regiones de estructura del segmento genético de la línea germinal humana IGHV4-39 o IGHV4-59. FWR4 puede comprender una región de estructura de los segmentos J de la línea germinal humana seleccionados a partir de cualquiera de los seis segmentos J de cadena pesada (véase Ravetch y colaboradores, 1981).
La secuencia de aminoácidos del dominio VH de Ab-47 o Ab-50 puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena pesada de IGHV4-39: FWR1 SEQ ID No: 281, FWR2 SEQ ID No: 282; FWR3 SEQ ID No: 283; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena pesada con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 11 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH de Ab-48 o Ab-48 puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena pesada de IGHV4-59: FWR1 SEQ ID No: 284, FWR2 SEQ ID No: 285; FWR3 SEQ ID No: 286; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena pesada con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede incluir un dominio VH que sea codificado por una secuencia de ácido nucleico que sea cuando menos el 75 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGHV4-39 o IGHV4-59, de preferencia, la secuencia de ácido nucleico es cuando menos el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGHV4-39 o IGHV4-59, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGHV4-39 o IGHV4-59. El dominio VH de un anticuerpo de la invención puede ser cuando menos el 75 por ciento homólogo a la secuencia de aminoácidos del dominio VH codificado por la secuencia genética de la línea germinal IGHV4-39 o IGHV4-59. De preferencia, la secuencia de aminoácidos del dominio VH es cuando menos el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGHV4-39 o IGHV4-59, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGHV1-2.
Un miembro enlazador de la invención también puede comprender un dominio VL, el cual comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena ligera kappa en una estructura de la línea germinal humana, por ejemplo, IGKV2D-28 o IGKV1D-33. Por consiguiente, las regiones de estructura del dominio VL FWR1, FWR2 y/o FWR3 pueden comprender las regiones de estructura del segmento genético de la línea germinal humana IGKV2D-28 o IGKV1D-33. FWR4 puede comprender una región de estructura de los segmentos J de la línea germinal humana seleccionados a partir de cualquiera de los cinco segmentos J kappa (véase Hieter y colaboradores, 1982).
La secuencia de aminoácidos del dominio VL de Ab-47 o Ab-48 puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena ligera kappa de IGKV2D-28: FWR1 SEQ ID No: 287, FWR2 SEQ ID No: 288; FWR3 SEQ ID No: 289; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena ligera con 1 ó 2 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL de Ab-49 puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena ligera de IGKV1D-33: FWR1 SEQ ID No: 290, FWR2 SEQ ID No: 291; FWR3 SEQ ID No: 292; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena ligera con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
Un miembro enlazador de la invención también puede comprender un dominio VL, el cual comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena ligera lambda en una estructura de la línea germinal humana, por ejemplo, IGLV1-47. Por consiguiente, las regiones de estructura del dominio VL FWR1, FWR2 y/o FWR3 pueden comprender las regiones de estructura del segmento genético de la línea germinal humana IGLV1-47. FWR4 puede comprender una región de estructura de los segmentos J de la línea germinal humana seleccionados a partir de cualquiera de los cuatro segmentos J lambda (véase Udey y Blomberg 1987; Vasicek y Leder, 1990).
La secuencia de aminoácidos del dominio VL de Ab-50 puede comprender el siguiente conjunto de regiones de estructura de cadena ligera lambda de IGLV1-47: FWR1 SEQ ID No: 293, FWR2 SEQ ID No: 294; FWR3 SEQ ID No: 295; o puede comprender el conjunto mencionado de regiones de estructura de cadena ligera con 1 ó 2 alteraciones de aminoácidos, tales como una sustitución, una inserción, o una supresión.
Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede incluir un dominio VL que sea codificado por una secuencia de ácido nucleico que sea cuando menos el 90 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGKV2D-28, IGKV1D-33 ó IGLV1-47. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico es cuando menos el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGKV2D-28, IGKV1D-33 ó IGLV1-47, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homóloga a la secuencia genética de la línea germinal IGKV2D-28, IGKV1D-33 ó IGLV1-47. El dominio VL de un anticuerpo de la invención puede ser cuando menos el 90 por ciento homólogo a la secuencia de aminoácidos del dominio VL codificado por la secuencia genética de la línea germinal IGKV2D-28, IGKV1D-33 ó IGLV1-47. De preferencia, la secuencia de aminoácidos del dominio VL es cuando menos el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGKV2D-28, IGKV1D-33 ó IGLV1-47, y de una manera muy preferible, es cuando menos el 98 por ciento o el 99 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de la línea germinal IGKV2D-28, IGKV1D-33 ó IGLV1-47.
Un miembro enlazador de la invención puede ser uno que compita para enlazarse al citomegalovirus humano (hCMV) con cualquier miembro enlazador que (i) se enlace al citomegalovirus humano (hCMV), y (i¡) comprenda un miembro enlazador, dominio VH y/o VL, CDR, por ejemplo, HCDR3, y/o conjunto de CDRs que se dan a conocer en la presente.
La competición entre los miembros enlazadores se puede ensayar in vitro, por ejemplo, utilizando ensayos de enlace, como ELISA, resonancia de plasmón superficial, y/o marcando una molécula reportera específica para un miembro enlazador, la cual se pueda detectar en la presencia de uno o más miembros enlazadores no marcados diferentes, para hacer posible la identificación de los miembros enlazadores que se enlacen con el mismo epítopo o con un epítopo traslapado. Estos métodos son fácilmente conocidos por un experto ordinario en este campo, y se describen con mayor detalle en la presente (véanse los Ejemplos). Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un miembro enlazador que comprende un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo que compite con una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH y/o VL, CDR, por ejemplo, HCDR3, ó conjunto de CDRs de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, para enlazarse al citomegalovirus humano (hCMV).
En algunos aspectos adicionales, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro enlazador, el cual comprende un dominio VH y/o VL de acuerdo con la presente invención, y métodos para la preparación de un miembro enlazador, el cual comprende un dominio VH y/o un dom in io VL de la invención , codificado por el ácido nucleico mencionado bajo condiciones q ue provoquen la producción de este miembro en lazador, el cual comprende el domi nio VH y/o el dominio VL, y recuperarlo.
Otro aspecto de la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados q ue codifican cualquiera de las secuencias VH CDR o VL CDR que se dan a conocer en la presente.
Un aspecto adicional proporciona una célula huésped que contiene o q ue está transfectada con el ácido nucleico de la invención .
Otros aspectos de la presente invención describen composiciones que contienen los miembros enlazadores de la invención , y su uso en los métodos para enlazar, inhibir y/o neutralizar la infección por el citomegalovirus h umano (hC V) , incluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo huma no o an imal med iante terapia.
Los miembros enlazadores de acuerdo con la invención se pueden utilizar en un método de tratamiento o de diag nóstico, tal como un método para el tratamiento (el cual puede incluir el tratamiento profiláctico) de u na enfermedad o trastorno en el cuerpo humano o animal (por ejemplo, en un paciente humano) , el cual comprende administrar a dicho cuerpo humano o an imal, una cantidad efectiva de un miembro en lazador de la invención , o una combinación de varios miembros enlazadores de la invención . Las condiciones q ue se pueden trata r de acuerdo con la presente invención incluyen cualquiera en donde tenga una función el citomegalovirus humano (hCMV), como se discute con detalle en cualquier otra parte de la presente.
Estos y otros aspectos de la invención se describen con mayor detalle más adelante.
Terminología Es conveniente señalar aquí que 'y/o' cuando se utiliza en la presente, debe tomarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por ejemplo, ? y/o B' se debe tomar como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B, y (iii) A y B, justamente como si se estipulara cada conjunto individualmente en la presente. hCMV La secuencia de aminoácidos de longitud completa del citomegalovirus humano (hCMV) tiene el Número de Acceso de GenBank X17403 (genoma completo de la cepa AD169 del citomegalovirus humano), y comprende una secuencia de 229,354 pares de bases (Chee y colaboradores, 1990; Bankier y colaboradores, 1991). gB El complejo gB es un complejo de glicoproteína superficial de la envoltura del virión del citomegalovirus (CMV). Hay un número de cepas diferentes de la proteína gB: gB cepa AD169 - SwissProt Acc. No. P06473 (SEQ ID No: 239) gB cepa Towne - SwissProt Acc. No. P13201 (SEQ ID No: 240) Los dominios neutralizantes de gB conocidos incluyen el dominio antigénico-1 (AD-1; aminoácidos 552-635 de la SEQ ID NO: 239 [AD169]), y el dominio antigénico-2 (AD-2; aminoácidos 67-86 de la SEQ ID NO: 239 [AD169]). También existe un dominio antigénico adicional, AD-3 (aminoácidos 783-906 de la SEQ ID NO: 239 [AD169]). Este dominio se localiza intraviralmente y no es el objetivo de los anticuerpos neutralizantes.
Miembro enlazador Esto describe un miembro de un par de moléculas que se enlazan una con la otra. Los miembros de un par de enlace se pueden derivar naturalmente, o se pueden producir de una manera sintética total o parcialmente. Un miembro de un par de enlace puede ser un polipéptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, compuesto de bajo peso molecular, un oligonucleótido, un oligopéptido, interferencia de ARN (ARNi; véase Milhavet y colaboradores, 2003), anti-sentido (véase Opalinska y Gewirtz, 2003), una proteína recombinante, un anticuerpo, o fragmentos de los mismos, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos.
Los inhibidores anti-sentido o de ARNi para utilizarse en la presente invención pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos capaces de modular la expresión genética, por ejemplo, capaces de sub-regular la expresión de una secuencia que codifique una proteína gB de hCMV. Estas moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas anti-sentido, ácido nucleico de interferencia corto (siNA), ARN de doble cadena (dsARN), micro-ARN, ARN de horquilla corto (shARN), moléculas sensoras de ácido nucleico, alozimas, moléculas enzimáticas de ácidos nucleicos, y oligonucleótidos triplex, y cualquier otra molécula de ácido nucleico que se pueda utilizar para mediar la interferencia del ARN 'ARNi' o el silenciamiento genético de una manera específica de la secuencia.
Un miembro del par de moléculas puede tener un área sobre su superficie, o una cavidad, la cual se enlaza a, y por consiguiente es complementaria para, una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Los ejemplos de los tipos de pares de enlace son antígeno-anticuerpo, receptor-ligando, y enzima-sustrato.
Un miembro enlazador normalmente comprende una molécula que tiene un sitio de enlace. Por ejemplo, un miembro enlazador puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína que no sea anticuerpo, que comprende un sitio de enlace. Se puede proporcionar un sitio de enlace por medio de la configuración de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sobre las regiones de estructura del anticuerpo y/o sobre los andamiajes de proteína que no son anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B, etc. (Haan y Maggos 2004; Koide y colaboradores, 1998; Nygren y colaboradores, 1997), o mediante la selección aleatoria o la mutación de los residuos de aminoácidos de un ciclo dentro de un andamiaje de proteína para conferir especificidad de enlace para un objetivo deseado. Los andamiajes para diseñar los sitios de enlace novedosos en las proteínas, han sido revisados con detalle por Nygren y colaboradores, ibid. Los andamiajes de proteínas para los miméticos de anticuerpos se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/034784 A1 (Lipovsek), en donde se describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene cuando menos un ciclo de selección aleatoria. Un andamiaje adecuado para injertar una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs), por ejemplo, un conjunto de HCDRs, puede ser proporcionado por cualquier miembro de dominio de la súper-familia de genes de ¡nmunoglobulina. El andamiaje puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamiaje de una proteína que no sea anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de enlace de antígeno en una molécula de andamiaje que es más pequeña y/o más fácil de elaborar que cuando menos algunas moléculas de anticuerpos. El tamaño pequeño de un miembro enlazador puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad para entrar en las células, para penetrar profundamente en los tejidos, o alcanzar los objetivos dentro de otras estructuras, o para enlazarse dentro de las cavidades de proteína del antígeno objetivo. El uso de sitios de enlace de antígeno en los andamiajes de proteína que no es anticuerpo, se revisa en Wess, 2004. Son típicas las proteínas que tienen una estructura base estable y uno o más ciclos variables, en donde las secuencias de aminoácidos del ciclo o de los ciclos se mutan específicamente o de una manera aleatoria, para crear un sitio de enlace de antígeno que se enlaza al objetivo. Estas proteínas incluyen los dominios de enlace de IgG de la proteína A a partir de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina, lipocalinas, así como gamma-cristalina y otros andamiajes Affili nMR (Scil Proteins).
Los ejemplos de otros planteamientos incluyen 'Microcuerpos' sintéticos basados en ciclótidos - pequeñas proteínas que tienen enlaces de disulfuro ¡ntra-moleculares, Microproteins (VersabodiesMR, Amunix), y proteínas de repetición de anquirina (DARPins, Molecular Partners).
En adición a las secuencias de anticuerpos y/o a un sitio de enlace de antígeno, un miembro enlazador de acuerdo con la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, que formen un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional en adición a la capacidad para enlazarse al antígeno. Los miembros enlazadores de la invención pueden llevar una marca detectable, o se pueden conjugar con una toxina o con una fracción o enzima de dirección (por ejemplo, por medio de un enlace o un enlazador de peptidilo). Por ejemplo, un miembro enlazador puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio de enzima), así como un sitio de enlace de antígeno, en donde el sitio de enlace de antígeno se enlaza al antígeno y, por consiguiente, dirige el sitio catalítico hacia el antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, mediante disociación.
Aunque, como se observó, las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) pueden ser llevadas por andamiajes que no sean anticuerpos, la estructura para llevar una región determinante de complementariedad (CDR) o un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la invención será en términos generales una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porción sustancial de la misma, en donde la región determinante de complementariedad (CDR) o el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se localiza en una ubicación correspondiente a la región determinante de complementariedad (CDR) o al conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de los dominios variables de anticuerpos VH y VL que se presentan naturalmente codificados por los genes de inmunoglobulina reconfigurados. Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar haciendo referencia a Kabat y Wu, (1991), y a las actualizaciones del mismo. Hay un número de recursos académicos y comerciales en línea para pedir esta base de datos. Por ejemplo, véase Martin, 1996 y el recurso en línea asociado, actualmente en la dirección web de http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.
Región CDR o CDR, pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, como son definidas por Kabat y colaboradores, ibid. Un anticuerpo típicamente contiene 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada, denominadas como HCDR1, HCDR2, y HCDR3, y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena ligera, denominadas como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. El término CDR o CDRs se utiliza en la presente con el objeto de indicar una de estas regiones o varias, o inclusive todas estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables del enlace por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítopo que reconoce.
Entre las seis secuencias CDR, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene la mayor variabilidad de tamaño, es decir, la mayor diversidad, esencialmente debido al mecanismo conocido en la materia como reconfiguración V(D)J de los segmentos genéticos V, D y J del locus genético de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal. La HCDR3 puede ser tan corta como de dos aminoácidos, o tan larga como de 26 aminoácidos, o puede tener cualquier longitud entre estos dos extremos. La longitud de la CDR también puede variar de acuerdo con la longitud que pueda ser acomodada por la estructura subyacente particular. Funcionalmente, la HCDR3 puede tener una función importante en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal y colaboradores, 1974; Amit y colaboradores, 1986; Chotia y colaboradores, 1987, 1989; Catón y colaboradores, 1990; Sharon 1990a, Sharon 1990b, Kabat y colaboradores, 1991).
En los miembros enlazadores Ab-01 a Ab-46 de la presente invención, como se indica en las Tablas 20a y b, la HCDR1 puede ser de 5 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 31-35. La HCDR2 puede ser de 17 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 50-65. La HCDR3 puede ser de 22 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 95-102. La LCDR1 puede ser de 13 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 24-34. La LCDR2 puede ser de 7 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 50-56. La LCDR3 puede ser de 10 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 89-97.
En los miembros enlazadores Ab-47 a Ab-50 de la presente invención, la HCDR1 puede ser de 7 o 5 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 31-37 o 31-35, respectivamente. La HCDR2 puede ser de 16 aminoácidos de largo, y la HCDR3 puede ser de 10, 15, 17 o 22 aminoácidos de largo. La LCDR1 puede ser de 11 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 24-34; o de 13 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 23-35; o de 16 aminoácidos de largo, consistentes en los residuos de Kabat 24-39. La LCDR2 puede ser de 7 aminoácidos de largo, y la LCDR3 puede ser de 9 aminoácidos de largo.
Molécula de anticuerpo Esto describe una inmunoglobulina producida ya sea naturalmente, o parcial o totalmente de una manera sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo. Se debe entender en la presente que la invención no se relaciona con los anticuerpos en su forma natural, es decir, no están en su medio ambiente natural, pero que han sido capaces de aislarse o de obtenerse mediante purificación a partir de fuentes naturales, o de otra manera se han obtenido mediante recombinación genética, o mediante síntesis química, y que entonces pueden contener aminoácidos no naturales. Los fragmentos de anticuerpos que comprenden un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fab' -SH, scFv, Fv, dAb y Fd. Se han diseñado otras diferentes moléculas de anticuerpos que incluyen uno o más sitios de enlace de antígeno del anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, y también anticuerpos biespecíficos y triespecíficos. Las moléculas de anticuerpos y los métodos para su construcción y uso se describen en Hollinger y Hudson (2005).
Es posible tomar los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos, y emplear las técnicas de la tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se enlacen al antígeno objetivo. Estas técnicas pueden involucrar la introducción de ADN que codifique la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), de un anticuerpo para las regiones constantes, o las regiones constantes más las regiones de estructura, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, las Patentes Europeas Números EP0184187A (Kudo y colaboradores) o EP0239400A (Winter). Un hibridoma u otra célula que produzca un anticuerpo se puede someter a mutación genética o a otros cambios, lo cual puede o no alterar la especificidad de enlace de los anticuerpos producidos.
Debido a que los anticuerpos se pueden modificar en un número de formas, el término 'molécula de anticuerpo' se debe interpretar para cubrir cualquier miembro enlazador o sustancia que tenga un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo con la especificidad requerida y/o que se enlace al antígeno. Por consiguiente, este término cubre los anticuerpos biespecificos o triespecíficos, asi como los fragmentos de anticuerpos y sus derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por consiguiente, se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo, o su equivalente, fusionado con otro polipéptido (por ejemplo, derivado a partir de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de los anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patentes Europeas Números EP0120694A (Boss y colaboradores) y EP0125023A (Cabilly y colaboradores).
Otras técnicas disponibles en la técnica del diseño de anticuerpos han hecho posible aislar los anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, se pueden hacer hibridomas humanos, como es descrito por Kontermann y Dubel (2001). La exhibición de fagos, otra técnica establecida para la generación de miembros enlazadores se ha descrito con detalle en muchas publicaciones, tales como Kontermann y Dubel, ibid y en la Publicación Internacional Número WO 92/01047 A1 (McCafferty y colaboradores).
Se pueden utilizar ratones transgénicos en donde se inactiven los genes de anticuerpos de ratón, y sean funcionalmente reemplazados con genes de anticuerpos humanos, mientras que se dejen intactos otros componentes del sistema inmunológico del ratón, para aislar los anticuerpos humanos (Méndez y colaboradores, 1997). De una manera alternativa, se puede emplear el método descrito por Grawbajo y Melchers (Publicación Internacional Número WO 03/068819 A1), para generar linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados para la producción de anticuerpos heterólogos o de proteínas de enlace. Se pueden producir anticuerpos humanizados empleando las técnicas conocidas en la materia, tales como aquéllas que se dan a conocer, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 91/09967 A1 (Adair y colaboradores). Además, la Publicación Internacional Número WO 04/006955 A1 (Foote) describe métodos para humanizar anticuerpos, basándose en la selección de las secuencias de estructura de región variable a partir de genes de anticuerpos humanos, mediante la comparación de los tipos de estructura de CDR canónica para las secuencias de CDR de la región variable de un anticuerpo no humano para los tipos de estructura de CDR canónica para las CDRs correspondientes a partir de una biblioteca de secuencias de anticuerpos humanos, por ejemplo, los segmentos genéticos de anticuerpos de la línea germinal. Las regiones variables de anticuerpos humanos que tienen tipos de estructura de CDR canónica similares a las CDRs no humanas, forman un subconjunto de secuencias de anticuerpos humanos miembros a partir de las cuales se seleccionan las secuencias de estructura humanas. Los miembros del subconjunto se pueden clasificar adicionalmente por similitudes de aminoácidos entre las secuencias de CDR humanas y no humanas. En el método de la Publicación Internacional Número WO 04/006955 A1 ibid, las secuencias humanas de clasificación superior se seleccionan para proporcionar las secuencias de estructura para construir un anticuerpo quimérico que reemplace funcionalmente a las secuencias de CDR humanas con las contrapartes de CDR no humanas, utilizando las estructuras humanas miembros del subconjunto seleccionadas, proporcionando de esta manera un anticuerpo humanizado de una alta afinidad y una baja inmunogenicidad, sin la necesidad de comparar las secuencias de estructura entre los anticuerpos no humanos y humanos. También se dan a conocer anticuerpos quiméricos hechos de acuerdo con el método.
Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo entero pueden llevar a cabo la función de los antígenos de enlace. Los ejemplos de los fragmentos de enlace son: (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward y colaboradores, 1989; McCafferty y colaboradores, 1990; Holt y colaboradores, 2003), el cual consiste en un dominio V H o un dominio VL; (v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) las moléculas Fv de una sola cadena (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL se enlazan mediante un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de enlace de antígeno (Bird y colaboradores, 1998; Huston y colaboradores 1988); (viii) los dímeros Fv de una sola cadena biespecíficos (Publicación Internacional Número WO 93/011161 A1 (Whitlow y colaboradores)), y (ix) los 'diacuerpos', que son fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión genética (Holliger y colaboradores, 1993, y Publicación Internacional Número WO 94/13804 A1). Fv, scFv o las moléculas de diacuerpo, se pueden estabilizar mediante la incorporación de puentes de disulfuro que enlacen a los dominios VH y VL (Reiter y colaboradores, 1996). También se pueden hacer minicuerpos, los cuales comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu y colaboradores; 1996). Otros ejemplos de los fragmentos de enlace son Fab', el cual difiere de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el término carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas a partir de la región de articulación del anticuerpo, y Fab' -SH, el cual es un fragmento Fab' en donde los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo ti o I libre. También se han descrito moléculas de anticuerpos que contienen solamente dos CDRs enlazadas por una región de estructura (Qui y colaboradores, 2007). La CDR3 a partir del dominio VH O Vl se enlazó al ciclo de CDR1 o CDR2 del otro dominio con el enlace a través del término C de la CDR1 o CDR2 seleccionada, con el término N de la CDR3, por medio de una región de estructura.
Un anticuerpo de dominio (dAb) es un pequeño fragmento de enlace de antígeno monomérico de un anticuerpo, es decir, la región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo (Holt y colaboradores, 2003). Los dAbs VH se presentan naturalmente en los camélidos (por ejemplo, camello, llama), y se pueden producir mediante la inmunización de un camélido con un antígeno objetivo, el aislamiento de las células-B específicas del antígeno, y la clonación directa de los genes del dAb a partir de las células-B individuales; sin embargo, los dAbs también se pueden producir en un cultivo celular. Un miembro enlazador de la presente invención puede ser un dAb que comprende un dominio VH o Vu sustancialmente como se estipula en la presente, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sustancialmente como se estipulan en la presente.
Los fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden obtener empezando a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, mediante métodos tales como digestión mediante enzimas, por ejemplo, pepsina o papaína y/o mediante la disociación de los puentes de disulfuro mediante reducción química. De otra manera, los fragmentos de anticuerpos comprendidos en la presente invención se pueden obtener mediante las técnicas de recombinación genética bien conocidas por la persona experta en la materia, o de otra manera mediante síntesis de péptidos, o mediante síntesis y expresión de ácidos nucleicos.
Los fragmentos funcionales de anticuerpos de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya vida media sea aumentada mediante una modificación química, en especial mediante PEGilación, o mediante su incorporación en un liposoma, por ejemplo.
Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales, en donde se combinan dos regiones variables diferentes en la misma molécula (Holliger y Bohlen, 1999). Por consiguiente, un anticuerpo biespecífico puede tener dos especificidades de enlace diferentes codificadas por las regiones variables y, por consiguiente, se enlazan a dos epítopos diferentes sobre los antígenos objetivo individuales o múltiples. Su uso se ha demostrado tanto en el campo del diagnóstico como en el campo de la terapia, a partir de su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para dirigirse a varias moléculas sobre la superficie de las células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden armar con mecanismos citotóxicos adicionales, tales como radioisótopos, toxinas bacterianas, citoquinas inflamatorias, productos quimioterapéuticos, o pro-fárm acos. C uando se van a utilizar anticuerpos biespecíficos , éstos pueden se r los anticuerpos biespecíficos conve ncionales , los cuales se puede n elabora r en una variedad de form as (H olliger y Winte r, 1 993) . Los ejem plos de los a nticuerpos biespecíficos incluyen aq uéllos de la tecnolog ía BiTE® (M icromet, I nc. ) , en donde se pueden utilizar los dominios de enlace de dos anticuerpos con diferente especificidad , y se pueden enlazar directamente por medio de péptidos flexibles cortos. Ésta combina dos anticuerpos sobre una sola cadena de polipéptido corta . Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una región Fe, utilizando solamente dominios variables, que reducen potencialmente los efectos de la reacción anti-id iotípica .
Los anticuerpos biespecíficos se pueden constru ir como la IgG entera , como cuadroma (fragmento de enlace de antígeno de especificidad doble (Fab) más Fcy) , como F(ab')2 biespecífico, como Fab'PEG , como Fab heterodimérico, como diacuerpos, o como scFv biespecífico o heterodimérico (revisado en Kufer y colaboradores, 2004) . Además, dos anticuerpos biespecíficos se pueden enlazar empleando los métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes. Los diacuerpos biespecíficos, opuestamente a los anticuerpos enteros biespecíficos , también pueden ser particularmente útiles debido a q ue se pueden construir y expresar fácilmente en E. coli.
El trabajo reciente sobre los anticuerpos multi-específicos ha conducido al desarrollo de mezclas de a nticuerpos, en donde se producen de tres a cinco anticuerpos recombinantes monoclonales humanos mediante una sola célula clonal. Los anticuerpos componentes comparten la misma región variable de cadena ligera de inmunoglobulina para asegurar que todos los sitios de enlace asociados con las especies de anticuerpos en la mezcla sean funcionales., (OligoclonicsMR; Merus Biopharmaceuticals BV; Publicación Internacional Número WO 04/106375 A1). Los anticuerpos componentes pueden comprender diferentes formatos, tales como IgG entera o fragmentos Fab, o mezclas de tanto la inmunoglobulina de longitud completa como los fragmentos de los anticuerpos. Los anticuerpos componentes se seleccionan por tener actividades biológicas superiores, tales como una mayor potencia en la neutralización del virus, una mejor neutralización y remoción de citoquinas y quimiocinas, una mejor aniquilación y prevención de escape de las células tumorales, y una mayor amplitud de la protección viral.
Hay diferentes métodos disponibles en este campo para obtener anticuerpos contra el citomegalovirus humano (hCMV). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, en especial de origen humano, los cuales se pueden obtener de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos por la persona experta en la materia. En general, para la preparación de los anticuerpos monoclonales o de sus fragmentos funcionales, en especial de origen de murino, es posible referirse a las técnicas que se describen en particular en el manual 'Antibodies' (Harlow y Lañe, 1988), o a la técnica de preparación a partir de hibridomas, como es descrito por Kohler y Milstein, 1975.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener, por ejemplo, a partir de las células-B de un animal o humano inmunizado contra el citomegalovirus humano (hCMV), o uno de sus fragmentos, por ejemplo, gB, que contenga el epítopo reconocido por estos anticuerpos monoclonales. Los fragmentos y péptidos o polipéptidos adecuados que los comprenden se describen en la presente, y se pueden utilizar para inmunizar a los animales para generar anticuerpos contra el citomegalovirus humano (hCMV). El citomegalovirus humano (hCMV), o uno de sus fragmentos, se puede producir de acuerdo con los métodos de procesamiento usuales, mediante recombinación genética, empezando con una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifique para el citomegalovirus humano (hCMV) o el fragmento del mismo, y/o mediante síntesis de péptidos, empezando a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica del citomegalovirus humano (hCMV) y/o el fragmento del mismo.
Los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, se pueden purificar en una columna de afinidad sobre la cual se haya inmovilizado previamente la proteína del citomegalovirus humano (hCMV) o una de sus proteínas componentes que contenga el epítopo reconocido por estos anticuerpos monoclonales. De una manera más particular, los anticuerpos monoclonales se pueden purificar mediante cromatografía sobre proteína A y/o G, seguida o no seguida por cromatografía de intercambio de iones con el objetivo de eliminar los contaminantes de proteína residuales, así como el ADN y el LPS, por sí mismos, seguida o no seguida por cromatografía de exclusión sobre gel Sepharose, con el objeto de eliminar los aglomerados potenciales debidos a la presencia de dímeros o de otros multímeros. Se puede emplear cualquiera de estas técnicas de una manera simultánea o sucesivamente.
Sitio de enlace de antígeno Esto describe la parte de una molécula que se enlaza a, y es complementaria para, todo o parte del antígeno objetivo. En una molécula de anticuerpo, ésta es referida como el sitio de enlace de antígeno del anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que se enlaza a, y es complementaria para, todo o parte del antígeno objetivo. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo solamente se puede enlazar a una parte particular del antígeno, cuya parte se denomina como un epítopo. Un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo puede ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpo. Un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL), y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH).
Un sitio de enlace de antígeno se puede diseñar en una región de una molécula de anticuerpo separada de la localización natural de las regiones determinantes de complementariedad, por ejemplo, en una región de estructura de un dominio VH o VL, o en un dominio constante de anticuerpo, por ejemplo, pero no limitándose a, CH1 y/o CH3. Un sitio de enlace de antígeno diseñado en una región estructural puede ser adicional a, o en lugar de, un sitio de enlace de antígeno formado por los conjuntos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un dominio VH y VL. Cuando están presentes múltiples sitios de enlace de antígeno en una molécula de anticuerpo, se pueden enlazar al mismo dominio antigénico sobre el citomegalovirus humano (hCMV), por ejemplo, aumentando de esta manera la valencia del miembro enlazador, e incrementando por lo mismo su avidez. De una manera alternativa, se pueden enlazar múltiples sitios de enlace de antígeno a diferentes antígenos sobre el citomegalovirus humano (hCMV) y/o uno o más antígenos diferentes, y esto se puede utilizar para agregar funciones efectoras, prolongar la vida media, o mejorar el suministro in vivo de la molécula de anticuerpo.
Aislados Esto se refiere al estado en donde los miembros enlazadores de la invención, o el ácido nucleico que codifica tales miembros enlazadores, estarán generalmente de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, los miembros enlazadores, los dominios VH y/o VL, y las moléculas de ácidos nucleicos codificantes y los vectores de acuerdo con la presente invención, se pueden proporcionar aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su medio ambiente natural, en una forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso del ácido nucleico, libre o sustancialmente libre del ácido nucleico o de los genes de origen diferente de la secuencia que codifique un polipéptido con la función requerida. Los miembros aislados y el ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres del material con el que estén asociados naturalmente, tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentren en su medio ambiente natural, o en el medio ambiente en donde se preparen (por ejemplo, cultivo celular), cuando esta preparación sea mediante la tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y el ácido nucleico se pueden formular con diluyentes o adyuvantes, y todavía, para propósitos prácticos, se pueden aislar -, por ejemplo, los miembros normalmente se mezclarán con gelatina o con otros vehículos si se utilizan para recubrir las placas de microtitulación para utilizarse en los inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilicen en diagnóstico o terapia. Los miembros enlazadores se pueden glicosilar, ya sea naturalmente o bien mediante los sistemas de células eucarióticas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NSO), o pueden no ser glicosilados, si, por ejemplo, son producidos mediante la expresión en una célula procariótica.
Las preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpos anti-hCMV también forman parte de la invención. Por ejemplo, estas preparaciones pueden ser las mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carezcan de la Usina C-terminal, con diferentes grados de glicosilación y/o con aminoácidos derivados, tal como la ciclación de un ácido glutámico N-terminal para formar un residuo de ácido piroglutámico.
Como se utiliza en la presente, la frase 'sustancialmente como se estipula' se refiere a que las características de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) relevantes del dominio VH O Vl de los miembros enlazadores descritos en la presente, serán ya sea idénticas o bien altamente similares a las regiones especificadas de las que se estipula la secuencia en la presente. Como se describe en la presente, la frase 'altamente similar' con respecto a las regiones especificadas de uno o más dominios variables, se contempla que se pueden hacer de 1 a aproximadamente 5, por ejemplo, de 1 a 4, incluyendo de 1 a 3, o 1, 2, 3 ó 4, sustituciones de aminoácidos en la región determinante de complementariedad (CDR) y/o en el dominio VH o VL.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Esta Figura muestra un panorama esquemático de la proteína gB (cepa AD169; SEQ ID No: 239), que indica la localización de los dominios antigénicos conocidos AD-1, AD-2 y AD-3 (Ohlin y colaboradores, 1993; Wagner y colaboradores, 1992). Hay un sitio de disociación en el aminoácido 460 y un enlace de disulfuro que enlaza las dos fracciones entre sí, como se indica mediante los paréntesis. Señal: secuencia de señal (aminoácidos 1-22), TM: dominio transmembrana (aminoácidos 751-771).
Figura 2. Esta Figura muestra el enriquecimiento de células-B de memoria específicas de gB mediante selección de células activada por fluorescencia de preparación (FACS). Con el objeto de aislar las células-B de memoria positivas para IgG específicas de gB, las células-B enriquecidas en ACS anti-CD20 (MACS = selección de células activada magnéticamente) se tiñeron con los siguientes anticuerpos: a. CD19 anti-humano (marcador de células-B); b. CD27 anti-humano (marcador de células-B de memoria); c. IgG antihumano. Adicionalmente, las células-B se incubaron con una glicoproteína B recombinante marcada con un tinte fluorescente. Las células-B reactivas con CD19+/CD27+/lgG+/gB+ se seleccionaron sobre células alimentadoras irradiadas, y se establecieron las líneas celulares productoras de anticuerpos, como se describe en el Ejemplo 1.
Figura 3. Arquitectura del dominio de gB del citomegalovirus humano (hCMV). Las regiones que representan los dominios individuales se exhiben en diferentes sombras, y se dan los números de los residuos de partida. Los paréntesis indican los enlaces de disulfuro. Señal: secuencia de señal, TM: dominio transmembrana.
Figuras 4a y 4b. ELISA de competición entre los anticuerpos anti-hCMV y el Ab-50. La Figura 4a muestra el Ab-50 en la competición con los anticuerpos Ab-47, Ab-48, Ab-49 y C23 (anticuerpo de control específico de gB). Se observa la competición para enlazarse a la proteína gB para Ab-50 contra Ab-47 y Ab-49, pero no para Ab-48 (o el anticuerpo de control C23). La Figura 4b muestra Ab-50 en la competición con los anticuerpos ITC52, ITC88, 89-104 y 89-109. No se observa competición por el enlace entre Ab- 50 y cualquiera de estos anticuerpos probados. La línea de rayas a través de la parte superior de las gráficas 4a y 4b indica el Ab-50 en una concentración de 0.5 nanogramos/pozo.
Figura 5. Titulaciones de anticuerpos en sueros humanos contra gB y fragmentos de gB. Se analizaron ochenta sueros aleatoriamente seleccionados a partir de los individuos seropositivos para el citomegalovirus humano (hCMV) en un ELISA para determinar la reactividad contra la gB recombinante y los dominios antigénicos 1 (AD-1), 2 (AD-2), 4 (AD-4/Dom II), y 5 (AD-5/Dom I). La línea horizontal representa el corte para los antígenos individuales.
Figura 6. Esta Figura muestra la correlación entre la titulación de anticuerpos contra las diferentes regiones antigénicas (como se mide mediante ELISA), y la titulación de neutralización del. r: coeficiente de correlación de rangos de Spearman.
Figuras 7a y 7b. Especificidad y capacidad de neutralización de los anticuerpos policlonales anti-AD-4 de afinidad purificada.
Figura 7a) Las placas ELISA se recubrieron con gB, AD-1, AD-2 y AD-4, respectivamente, y se probaron con diferentes anticuerpos. E3: fracción de IgG de afinidad purificada; Pre: reserva de suero antes de la purificación de afinidad; Post: reserva de suero después de la purificación de afinidad; C23: anticuerpo monoclonal específico de AD-2 humano; 89-104: anticuerpo monoclonal específico anti-AD-1; anti-GST: anticuerpo monoclonal de murino específico para GST.
Figura 7b) Ensayo de neutralización utilizando la reserva de suero, el anticuerpo monoclonal humano C23, y la fracción de IgG específica de AD-4 de afinidad purificada (E3).
Figura 8. Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos de AD-4 y proteínas mutantes. La secuencia de aminoácidos de AD- 4, como se utiliza para la expresión en células de mamífero, se muestra en la pista superior. Los residuos que se intercambiaron a alanina se indican en las pistas A-Q. Las líneas de rayas indican la identidad con la secuencia de tipo silvestre.
Figuras 9a y 9b. Reconocimiento de AD-4 y las proteínas mutantes de AD-4 mediante los anticuerpos monoclonales humanos (Ab-28, Ab-11, Ab-14), y la IgG de afinidad purificada a partir de los donantes seropositivos para el citomegalovirus humano (hCMV).
Las placas ELISA se recubrieron con las proteínas de fusión AD-4 indicadas, y se utilizaron para analizar el enlace de los anticuerpos monoclonales humanos (Ab-28, Ab-11, Ab-14; Figura 9a) o la fracción de IgG de afinidad purificada (E3; Figura 9b). Se utilizó un anticuerpo anti-GST para controlar la eficiencia del recubrimiento de los antígenos.
Figura 10. Reconocimiento de los mutantes de AD-4 por parte de los sueros humanos. El panel de sueros (80 muestras) se probó en un ELISA contra las proteínas de fusión de GST que contenían AD-4 o los péptidos mutantes AD-4G (K378K379), AD-4H (Q380E381), AD-4E (E359D362), AD-4I (N383S385), y AD-4L (N405T406), respectivamente. Para cada suero, se calculó una proporción entre el valor OD más alto y más bajo, y se gráfico como las veces de diferencia. La línea punteada representa la diferencia promedio de todas las muestras de suero.
Figura 11. Esta Figura muestra los resultados de un ELISA de captura que determina el reconocimiento por el anticuerpo de los dominios y subdominios antigénicos de la proteína gB. Las células 293T se transfectaron con Control (pcUL132SigHA), AD-4 + AD-5, Subdominio 1 de AD-5 (AD-5-S1) o Subdominio 2 de AD-5 (AD-5-S2). Se utilizaron los anticuerpos Ab-47 a Ab-50 para la detección. Los resultados se detectaron mediante inmunofluorescencia indirecta.
Figura 12. Ensayo de neutralización competitivo con el anticuerpo neutralizante Ab-28 y diferentes sueros humanos.
Los datos del lado izquierdo de la gráfica representan triplicados de diferentes sueros positivos para el citomegalovirus humano (hCMV) y sueros negativos para el citomegalovirus humano (hCMV) (sobre el eje-x) aplicados en una concentración constante alrededor de su actividad neutralizante del 50 por ciento. Las curvas sobre el lado derecho de la gráfica representan una combinación del Ab-28 titulado con los sueros positivos para hCMV o los sueros negativos para hCMV agregados en una concentración constante idéntica a la concentración representada por los datos del lado izquierdo del diagrama. Todas las curvas reflejan la concentración de IgG del Ab-28 solo sin agregar la concentración de IgG constante de los sueros. Todas las muestras se analizaron por triplicado. Leyenda: • concentración constante de suero negativo para hCMV; * concentración constante de suero positivo para hCMV; ¦ concentración constante de Intratec ; O Ab-28 titulado con una concentración constante de suero negativo para hCMV; V Ab-28 titulado con una concentración constante de suero positivo para hCMV; ? Ab-28 titulado con una concentración constante de Intratec; O Ab-28 titulado solo.
Figura 13. Ensayo posterior a la adsorción con Ab-02, Ab-04 y Ab-28.
El virus de citomegalovirus humano (hCMV) se dejó adsorber pero no penetrar en los fibroblastos de prepucio humano durante 1 hora a 4°C, y entonces se agregaron los anticuerpos Ab-02, Ab-04 o Ab-28, y se dejaron incubar durante un período de cualquiera de 30, 80 ó 120 minutos a 4°C. Se llevaron a cabo diluciones en serie a 1:2 a partir de 150 a 5 microgramos/mililitro para cada anticuerpo por triplicado. Se utilizó C23 (anticuerpo específico de AD-2) como un anticuerpo de control para la inhibición de la penetración del virus en las células. El eje-x muestra la concentración de IgG (microgramos/ mililitro), y el eje-y muestra el porcentaje de neutralización. Leyenda: • período de incubación de 30 minutos; ¦ período de incubación de 80 minutos; período de incubación de 120 minutos.
Figura 14. Ensayo de neutralización competitivo representativo entre los anticuerpos específicos de AD-1 y AD-2 y Ab-28.
Como se muestra en las Figuras 12a y 12b, ITC52 (un anticuerpo específico de AD-1) o ITC88 (un anticuerpo específico de AD-2) se titularon en ausencia (·) o en la presencia (¦) de Ab-28, respectivamente. El Ab-28 se agregó al anticuerpo titulado en una concentración constante de 0.5 microgramos/mililitro (A). La Figura 12c muestra el ITC52 titulado en ausencia (·) o en la presencia (¦) del ITC88, el cual se agregó al anticuerpo titulado en una concentración constante de 3 microgramos/mililitro Todos los resultados representan el análisis por triplicado.
Figura 15. Ensayo de neutralización competitivo entre los anticuerpos específicos para AD-4 y AD-5.
Para este ensayo, se utilizaron un anticuerpo específico de AD-4 (Dom II) representativo (Ab-28), y dos anticuerpos específicos de AD-5 (Dom I) representativos (Ab-49 y Ab-50). El eje-x muestra la concentración de IgG (microgramos/mililitro), y el eje-y muestra el porcentaje de neutralización. Leyenda: · anticuerpo AD-5 (Ab-49 o Ab-50) solo; A anticuerpo AD-4 solo; ¦ anticuerpos AD-5 y AD-4 mezclados. La concentración inicial de la mezcla fue de 3 microgramos/mililitro, debido a que se aplicaron 1.5 microgramos/ mililitro de cada anticuerpo en el primer pozo.
Descripción Detallada de la Invención Como se observa anteriormente, un miembro enlazador de acuerdo con la presente invención modula y puede neutralizar una actividad biológica del citomegalovirus humano (hCMV). A una alta potencia, el miembro enlazador se puede obtener directamente a partir de un rastreo inicial, por ejemplo, un ensayo biológico de neutralización del citomegalovirus humano (hCMV). Los ensayos y las potencias se describen con mayor detalle en cualquier otra parte de la presente.
La transformación del Virus de Epstein-Barr (EBV) es un método confiable para inmortalizar las células de mamífero, y se han desarrollado numerosos protocolos de transformación de EBV (Rosen y colaboradores, 1977; Steinitz y colaboradores, 1977; Steinitz y colaboradores, 1980; Kozbor y Roder, 1981; Lundgren y colaboradores, 1983; Rosen y colaboradores, 1983; Steinitz y colaboradores, 1984; Lanzavecchia, 1985; Bernasconi y colaboradores, 2002; Jung y colaboradores, 2002; Traggiai y colaboradores, 2004). La técnica se utiliza con mayor frecuencia para obtener líneas celulares a partir de linfocitos humanos que sirven como una fuente permanente para el aislamiento del ADN y de la proteína, y han encontrado un uso ampliamente extendido en los estudios clínicos como el método principal para generar una fuente permanente de ADN del paciente para la genotipificación. EBV es un virus de Herpes, y su genoma consiste en un ADN lineal de doble cadena de 172 kb, el cual se ha secuenciado completamente. La biología molecular y la patogénesis del EBV se estudian extensamente, y se conocen las funciones de muchos genes de células huésped y EBV cruciales en la patogénesis. EBV infecta solamente a ciertas células epiteliales de mamífero y a los linfocitos-B. In vitro, EBV inmortaliza las células-B mediante la activación de un número de genes reguladores del ciclo celular, así como de los genes específicos de células-B, incluyendo los genes de inmunoglobulina. Entonces se pueden seleccionar los clones en crecimiento que secreten los anticuerpos específicos para el análisis.
Entonces se pueden clonar los anticuerpos de interés, y se puede determinar su secuencia mediante los métodos convencionales.
Un dominio variable de anticuerpo VH con la secuencia de aminoácidos del miembro enlazador seleccionado mencionado, se puede proporcionar en una forma aislada, así como un miembro enlazador que comprenda ese dominio VH.
La capacidad para enlazarse al citomegalovirus humano (hCMV) se puede probar adicionalmente, y también la capacidad para competir con, por ejemplo, cualquier molécula de anticuerpo de Ab-01 a Ab-50 de la presente invención (por ejemplo, en el formato scFv y/o en el formato IgG, por ejemplo, IgGi), para enlazarse al citomegalovirus humano (hCMV). La capacidad para neutralizar el citomegalovirus humano (hCMV) se puede probar como se discute adicionalmente en cualquier otra parte de la presente.
La afinidad de enlace y la potencia de neutralización de diferentes miembros enlazadores se puede comparar bajo las condiciones apropiadas.
Las variantes de los dominios VH y VL y las CDRs de la presente invención, incluyendo aquéllas para las cuales se estipulan las secuencias de aminoácidos en la presente, y las cuales se pueden emplear en los miembros enlazadores de la invención, se pueden obtener por medio de los métodos de alteración o mutación de secuencias y rastreo de los miembros enlazadores de antígeno con las características deseadas. Los ejemplos de las características deseadas incluyen, pero no se limitan a: Aumento de la afinidad de enlace por el antígeno en relación con los anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno.
Aumento en la neutralización de la actividad de un antígeno en relación con los anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno, si se conoce la actividad.
Capacidad competitiva especificada con un anticuerpo o ligando conocido para el antígeno en una proporción molar específica.
· Capacidad para inmunoprecipitar el complejo.
Capacidad para enlazarse a un epítopo especificado, tal como un epítopo lineal, por ejemplo, utilizando péptidos rastreados en la conformación lineal y/o limitada, o el epítopo conformacional formado por residuos no continuos.
* Capacidad para modular una nueva actividad biológica del citomegalovirus humano (hCMV), o una molécula corriente abajo. Estos métodos también se proporcionan en la presente.
Un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo compuesto de un dominio VH y un dominio VL típicamente está formado por seis ciclos de polipéptido: tres a partir del dominio variable de cadena ligera (VL), y tres a partir del dominio variable de cadena pesada (VH). El análisis de los anticuerpos de estructura atómica conocida ha elucidado las relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de los sitios de combinación del anticuerpo. Estas relaciones implican que, excepto por la tercera región (ciclo en los dominios VH, los ciclos del sitio de enlace tienen una de un pequeño número de conformaciones de la cadena principal o estructuras canónicas. Se ha demostrado que la estructura canónica formada en un ciclo particular es determinada por su tamaño y por la presencia de ciertos residuos en los sitios clave, tanto en el ciclo como en las regiones de estructura (Chotia y colaboradores, 1992; Al-Lazikani y colaboradores, 1997).
Este estudio de relación de secuencia-estructura se puede utilizar para la predicción de los residuos en un anticuerpo de una secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus ciclos de CDR y, por consiguiente, para mantener la especificidad de enlace. En un planteamiento estructural, se puede crear un modelo de la molécula de anticuerpo (Chotia y colaboradores, 1986) utilizando cualquier paquete libremente disponible o comercial, tal como WAM (Whitelegg y Rees, 2000). Entonces se puede utilizar un paquete de software de visualización y análisis de proteínas, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View (Guex y Peitsch, 1997) para evaluar las posibles sustituciones en cada posición de la CDR. Esta información se puede utilizar entonces para hacer sustituciones que tengan la probabilidad de tener un efecto mínimo o benéfico sobre la actividad.
Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), los dominios de anticuerpo VH o VL, y los miembros enlazadores, están disponibles en términos generales en este campo. Las secuencias variantes se pueden hacer con sustituciones que pueden o no ser predichas para tener un efecto mínimo o benéfico sobre la actividad, y se pueden probar para determinar su capacidad para enlazarse y/o para neutralizar el citomegalovirus humano (hCMV) y/o para determinar cualquier otra propiedad deseada.
Las variantes de secuencia de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se dan a conocer específicamente en la presente, se pueden emplear de acuerdo con la presente invención, como se discute.
Un aspecto adicional de la invención es una molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene cuando menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VH de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50 mostrados en el listado de secuencias adjunto, y/o que comprende un dominio VL que tiene cuando menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VL de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50 mostrados en el listado de secuencias adjunto. Los algoritmos que se pueden utilizar para calcular el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos incluyen, por ejemplo, BLAST (Altschul y colaboradores, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, 1988), o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman, 1981), por ejemplo, empleando los parámetros por omisión. Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de las secuencias de aminoácidos (adición, supresión, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido).
Se pueden hacer alteraciones en una o más regiones de estructura y/o en una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Las alteraciones normalmente no dan como resultado una pérdida de función, de modo que un miembro enlazador que comprenda una secuencia de aminoácidos alterada de esta manera, puede conservar la capacidad para enlazarse a, y/o para neutralizar, el citomegalovirus humano (hCMV). Puede conservar la misma capacidad de enlace cuantitativo y/o neutralizante que un miembro enlazador en el que no se haga la alteración, por ejemplo, como se mide en un ensayo descrito en la presente. El miembro enlazador que comprende una secuencia de aminoácidos alterada de esta manera, puede tener una mayor capacidad para enlazarse a, y/o para neutralizar, la infectividad del citomegalovirus humano (hCMV).
La alteración puede comprender el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos con un aminoácido que no se presente naturalmente o no estándar, la modificación de uno o más residuos de aminoácidos en una forma que no se presente naturalmente o no estándar, o la inserción de uno o más aminoácidos que no se presenten naturalmente o no estándares en la secuencia. Los ejemplos de los números y localizaciones de las alteraciones en las secuencias de la invención se describen en cualquier otra parte de la presente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente incluyen los 20 L-aminoácidos 'estándares' identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos convencionales de una sola letra. Los aminoácidos no estándares incluyen cualquier otro residuo que se pueda incorporar en una estructura base de polipéptido, o que pueda resultar a partir de la modificación de un residuo de aminoácido existente. Los aminoácidos no estándares se pueden presentar naturalmente o pueden no presentarse naturalmente. En la materia se conocen varios aminoácidos no estándares que se presentan naturalmente, tales como 4-hidroxi-prolina, 5-hidroxi-lisina, 3-metil-histidina, N-acetil-serina (Voet y Voet, 2004). Estos residuos de aminoácidos que se derivan en su posición N-alfa solamente se localizarán en el término N de una secuencia de aminoácidos. Normalmente en la presente invención, un aminoácido es un L-aminoácido, pero puede ser un D-aminoácido. La alteración, por consiguiente, puede comprender la modificación de un L-aminoácido en, o su reemplazo con, un D-aminoácido. También se conocen las formas de aminoácidos metiladas, acetiladas y/o fosforiladas, y los aminoácidos de la presente invención se pueden someter a esa modificación.
Las secuencias de aminoácidos en los dominios de anticuerpos y los miembros enlazadores de la invención, pueden comprender los aminoácidos no naturales o no estándares descritos anteriormente. Los aminoácidos no estándares (por ejemplo, los D-aminoácidos) se pueden incorporar en una secuencia de aminoácidos durante la síntesis, o mediante la modificación o el reemplazo de los aminoácidos estándares 'originales' después de la síntesis de la secuencia de aminoácidos.
El uso de aminoácidos no estándares y/o que no se presentan naturalmente aumenta la diversidad estructural y funcional y, por consiguiente, puede incrementar el potencial para lograr las propiedades deseadas de enlace y neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) en un miembro enlazador de la invención. Adicionalmente, se ha demostrado que los D-aminoácidos y sus análogos tienen diferentes perfiles farmacocinéticos, comparándose con los L-aminoácidos estándares, debido a la degradación de los polipéptidos in vivo que tienen los L-aminoácidos después de su administración a un animal, por ejemplo, a un ser humano, significando que los D-aminoácidos son convenientes para algunas aplicaciones in vivo.
Las regiones VH o VL novedosas, portadoras de las secuencias derivadas de CDR de la invención, se pueden generar utilizando mutagénesis aleatoria de uno o más genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Esta técnica es descrita por Gram y colaboradores (1992), quienes utilizaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) susceptible a error. En algunas modalidades, se hacen una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de un dominio variable entero o en el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Otro método que se puede utilizar es dirigir la mutagénesis hacia las reg iones C D R de los genes VH o VL (Barbas y colaboradores , 1 994; Schier y colaboradores, 1 996) .
Todas las técn icas anteriormente descritas son conocidas como tales en este campo, y la persona experta pod rá utilizar estas técnicas para proporcionar los miembros enlazadores de la invención utilizando la metodolog ía de rutina en la materia.
Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para obtener un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo para el citomegalovirus humano (hC MV) , comprendiendo el método proporcionar, por medio de la adición , supresión , sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH estipulado en la presente , un domin io VH que sea una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH, opcionalmente combinar el dominio VH proporcionado de esta manera , con u no o más dominios VL, y probar el domi nio VH o la combinación o combinaciones de VH/VL, para identificar u n miembro enlazador o un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo para el citomegalovirus humano (hC MV), y opcionalmente con una o más propiedades deseadas, por ejemplo, la capacidad para neutralizar la actividad del citomegalovirus humano (hC MV) . El dominio VL mencionado puede tener u na secuencia de ami noácidos que sea sustancialmente como se estipula en la presente. Se puede emplear un método análogo , en donde se combinan una o más varia ntes de secuencia de u n dominio VL q ue se da a conocer en la presente , con uno o más dominios VH. Como se observa anteriormente, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) sustancialmente como se estipula en la presente, puede ser llevada como una región determinante de complementariedad (CDR) en un dominio variable de anticuerpo humano o en una porción sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 sustancialmente como se estipulan en la presente, representan modalidades de la presente invención, y cada una de las mismas puede ser llevada como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada humano, o en una porción sustancial del mismo.
Los dominios variables empleados en la invención se pueden obtener o derivar a partir de cualquier dominio variable humano de la linea germinal o reconfigurado, o pueden ser un dominio variable sintético basado en las secuencias en consenso o reales de los dominios variables humanos conocidos. Un dominio variable se puede derivar a partir de un anticuerpo no humano. Una secuencia de una región determinante de complementariedad (CDR) de la invención (por ejemplo, CDR3) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carezcan de una región determinante de complementariedad (CDR) (por ejemplo, CDR3), utilizando la tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks y colaboradores (1992) describen los métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpos, en donde se utilizan cebadores en consenso dirigidos hacia, o adyacentes a, el extremo 5' del área del dominio variable, en conjunto con cebadores en consenso para la tercera región de estructura de los genes VH humanos, con el fin de proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carezcan de una CDR3. arks y colaboradores, describen además la manera en que se puede combinar este repertorio con una CDR3 de un anticuerpo particular. Utilizando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención se pueden mezclar con los repertorios de los dominios VH o VL que carezcan de una CDR3, y los dominios VH o VL mezclados completos se pueden combinar con un dominio VL o VH cognado, para proporcionar los miembros enlazadores de la invención. El repertorio se puede exhibir entonces en un sistema huésped adecuado, tal como en un sistema de exhibición de fago, exhibición en levadura, exhibición bacteriana, exhibición en T7, exhibición viral, exhibición celular, exhibición en ribosoma, o exhibición covalente.
De una manera similar, una o más, o las tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se pueden injertar en un repertorio de dominios VH o VL, los cuales entonces se rastrean para determinar un miembro enlazador o miembros enlazadores para el citomegalovirus humano (hCMV).
Por ejemplo, se pueden emplear una o más de las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 ó conjunto de HCDRs de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, y/o se pueden emplear una o más de las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 ó conjunto de LCDRs de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50. De una manera similar, se pueden emplear otros dominios VH y VL, conjuntos de regiones determinantes de complementariedad (CDRs), y conjuntos de HCDRs y/o conjuntos de LCDRs que se dan a conocer en la presente.
Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender cuando menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de estructura interventoras. La porción también puede incluir cuando menos aproximadamente el 50 por ciento de cualquiera de, o de tanto la primera como la cuarta, regiones de estructura, en donde el 50 por ciento es el 50 por ciento C-terminal de la primera región de estructura, y el 50 por ciento N-terminal de la cuarta región de estructura. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquéllos que normalmente no están asociados con las regiones de dominio variable que se presentan naturalmente. Por ejemplo, la construcción de los miembros enlazadores de la presente invención hecha mediante técnicas de ADN recombinante, puede dar como resultado la introducción de los residuos N- o C-terminales codificados por los enlazadores introducidos con el objeto de facilitar la clonación u otros pasos de manipulación.
Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir los dominios variables de la invención con otras secuencias de proteínas, incluyendo las regiones constantes de anticuerpos, otros dominios variables o marcas detectables/ funcionales, como se discute con mayor detalle en cualquier otra parte de la presente.
Aunque en algunos aspectos de la invención, los miembros enlazadores comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de enlace individuales basados en cualquiera de las secuencias del dominio VH o VL, forman otros aspectos de la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, en especial los dominios VH, son capaces de enlazarse a los antígenos objetivo de una manera específica. En el caso de cualquiera de los dominios de enlace individuales, estos dominios se pueden utilizar para rastrear los dominios complementarios capaces de formar un miembro enlazador de dos dominios capaz de enlazarse al citomegalovirus humano (hCMV). Esto se puede lograr mediante los métodos de rastreo de exhibición de fagos, utilizando el denominado como planteamiento de combinación doble jerárquica, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO92/01047 (McCafferty y colaboradores), y en Marks y colaboradores, ¡bid.
Los miembros enlazadores de la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas, por ejemplo, las regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL se puede unir en su extremo C-terminal a los dominios constantes de cadena ligera del anticuerpo, incluyendo las cadenas C O CA humanas. De una manera similar, un miembro enlazador basado en un dominio VH se puede unir en su extremo C-terminal con toda o con una parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada a partir de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, de cualquiera de las subclases de isotipos, en particular Igd e lgG4. IgG! es conveniente debido a su función efectora y a su facilidad de elaboración. Cualquier variante sintética u otra variante de región constante que tenga estas propiedades y que estabilice las regiones variables, también puede ser útil en la presente invención.
Los miembros enlazadores de la invención también pueden comprender más de un par de dominios VH y VL, tal como un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, el cual forma un aspecto adicional de la invención. En el caso de un anticuerpo biespecífico, el cual tiene dos pares de dominios VH y VL, uno de los pares de dominios VH y VL puede ser a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, como se describe en la presente invención. El segundo par de dominios VH y VL puede ser igual que el primer par, o puede ser diferente. Por ejemplo, el par de dominios VH y VL se puede seleccionar a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, ó a partir de un anticuerpo diferente. En una modalidad preferida, un primer par de dominios VH y VL se selecciona a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, y el segundo par de dominios VH y VL también se selecciona a partir de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, pero es diferente del primer par de dominios, de tal manera que el anticuerpo biespecífico se enlaza al citomegalovirus humano (hCMV). Adicionalmente, un primer par de dominios VH y VL se selecciona a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, y el segundo par de dominios VH y Vu se selecciona a partir de un anticuerpo diferente. Por consiguiente, el anticuerpo biespecífico se puede enlazar al citomegalovirus humano (hCMV) y a un antígeno diferente o a un epítopo diferente sobre el citomegalovirus humano (hCMV). De preferencia, el anticuerpo biespecífico comprende un primer par de dominios VH y VL que se enlaza a AD-4 o AD-5 del citomegalovirus humano (hCMV) (es decir, un primer par de dominios VH y VL a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50), y un segundo par de dominios VH y VL seleccionado a partir de los anticuerpos de enlace del citomegalovirus humano (hCMV) descritos en los siguientes documentos de patente: US5,043,281 (Mashuho y colaboradores), US5,750,106 (Ostberg), WO93/021952 A1 (Borrebaeck y colaboradores), WO08/084410 A2, W010/007463 A1 y WO10/007533 A2 (Lanzavecchia y Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 y WO09/024445 A1 (Funaro y colaboradores), WO09/114560 A2 (Olsen), WO10/114105 A1 y WO10/114106 A1 (Takada y colaboradores).
Se pueden generar mezclas de anticuerpos, tales como las mezclas de los anticuerpos recombinantes monoclonales humanos conocidos en la materia como Oligoclonics R (Merus Biopharmaceutical BV; Publicación Internacional Número WO 04/106375) para utilizarse en la neutralización del citomegalovirus humano (hCMV). Estas mezclas pueden comprender miembros enlazadores derivados a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50. La mezcla de anticuerpos también puede comprender miembros enlazadores a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50 en combinación con un miembro enlazador para el citomegalovirus humano (hCMV) que reconozca un dominio antigénico diferente sobre la proteína gB, tal como AD-1 o AD-2, o que reconozca gH, o que reconozca las proteínas gpUL130, gpUL131A, gp128 etc. del citomegalovirus humano (hCMV). Por ejemplo, la mezcla de anticuerpos puede comprender un dominio VL a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, y un dominio VH seleccionado a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50 y/o un dominio VH seleccionado a partir de cualquiera de los anticuerpos de enlace del citomegalovirus humano (hCMV) descritos en los siguientes documentos de patente: US5,043,281 (Mashuho y colaboradores), US5,750,106 (Ostberg), WO93/021952 A1 (Borrebaeck y colaboradores), WO08/084410 A2, W010/007463 A1 y WO10/007533 A2 (Lanzavecchia y Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 y WO09/024445 A1 (Funaro y colaboradores), WO09/114560 A2 (Olsen), W010/114105 A1 y WO10/114106 A1 (Takada y colaboradores). En la alternativa, la mezcla de anticuerpos puede comprender un dominio VL seleccionado a partir de cualquiera de los anticuerpos de enlace del citomegalovirus humano (hCMV) descritos en los siguientes documentos de patente: US5,043,281 (Mashuho y colaboradores), US5,750,106 (Ostberg), WO93/021952 A1 (Borrebaeck y colaboradores), WO08/084410 A2, WO10/007463 A1 y WO10/007533 A2 (Lanzavecchia y Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 y WO09/024445 A1 (Funaro y colaboradores), WO09/114560 A2 (Olsen), W010/114105 A1 y WO10/114106 A1 (Takada y colaboradores), junto con un dominio VH seleccionado a partir de cualquiera de los anticuerpos de enlace del citomegalovirus humano (hCMV) descritos en la lista anteriormente mencionada, y/o un dominio VH seleccionado a partir de cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50.
Los miembros enlazadores de la presente invención también puede incluir anticuerpos o fragmentos que comprendan una región Fe modificada, en donde la región Fe modificada comprenda cuando menos una modificación de aminoácido en relación con una región Fe de tipo silvestre. La región Fe variante se puede diseñar, en relación con una molécula comparable que comprenda la región Fe de tipo silvestre, para enlazarse a los receptores de Fe con una mayor o menor afinidad. La región Fe se refiere a los polipéptidos que se presentan naturalmente o sintéticos homólogos al dominio C-terminal de IgG que se produce después de la digestión de la IgG con papaína. La Fe de IgG tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kD. Para los anticuerpos y/o fragmentos de la presente invención, se puede utilizar una región Fe entera, o solamente una porción que mejore la vida media.
La región Fe se puede mutar, si se desea, para inhibir su capacidad para fijar el complemento, y se puede enlazar al receptor de Fe con una alta afinidad. En la presente invención, los anticuerpos o fragmentos pueden ser provistos con una región Fe modificada, en donde se modifica una región Fe que se presente naturalmente para aumentar la vida media del anticuerpo o fragmento en un medio ambiente biológico, por ejemplo, la vida media en suero, o una vida media medida mediante un ensayo in vitro. Los métodos para alterar la forma original de una región Fe de una IgG también se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6,998,253 (Presta y Snedecor). Las funciones efectoras que se pueden alterar (por ejemplo, mejorar) haciendo modificaciones a la región Fe, ya sea mediante la modificación de los patrones de glicosilación, o bien mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos de la región Fe, incluyen, pero no se limitan a: un aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe, incluyendo un aumento de la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos, y un aumento de la lisis mediada por el complemento (por ejemplo, de las células infectadas por el citomegalovirus humano (hCMV)), un aumento del enlace del anticuerpo a los receptores de Fe, células aniquiladoras naturales (NK), macrófagos, monocitos, y/o células polimorfonucleares; un aumento de la maduración de las células dendríticas, y un aumento en el cebado de las células-T. Las modificaciones potenciales incluyen inserción, supresión o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos, incluyendo sustitución con alanina, una sustitución conservadora, una sustitución no conservadora, o el reemplazo con un residuo de aminoácido correspondiente en la misma posición a partir de una subclase de IgG diferente (por ejemplo, reemplazando un residuo de IgG-, con un residuo de lgG2 correspondiente en esa posición).
En otras modalidades, una variante de polipéptido Fe de la presente invención puede comprender una o más glicoformas diseñadas, es decir, una composición de carbohidrato que se une covalentemente a una molécula que comprende una región Fe. La región Fe de los anticuerpos de tipo IgG contiene un sitio de glicosilación N-enlazado conservado en el residuo Asn297 del dominio CH2. Se ha demostrado que la modificación del patrón de glicosilación de los oligosacáridos enlazados a este residuo puede aumentar las funciones efectoras mediadas por la región Fe en las interacciones con los receptores de Fe. Las glicoformas diseñadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, incluyendo, pero no limitándose a, mejorar o reducir la función efectora. Las glicoformas diseñadas se pueden generar mediante cualquier método conocido por un experto en este campo, por ejemplo, utilizando cepas de expresión diseñadas o variantes, mediante su co-expresión con una o más enzimas, por ejemplo, ß(1 ,4)-N-acetil-glucosaminil-transferasa III, mediante la expresión de una molécula que comprenda una región Fe en diferentes organismos o líneas celulares a partir de diferentes organismos, o mediante la modificación de los carbohidratos después de que se haya expresado ía molécula que comprenda la región Fe.
Los métodos para generar las glicoformas diseñadas son conocidos en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, aquéllos descritos en los documentos US6,602,684 (Umaña y colaboradores); US20030157108 (Presta y colaboradores); Umaña y colaboradores (1999); Davies y colaboradores (2001); Shields y colaboradores (2002); Shinkawa y colaboradores (2003); y en las patentes y solicitudes en relación con la tecnología PotelligentMR (Biowa, Inc. Princeton, NJ, EUA), y con la tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb R (GLYCART Biotechnology AG, Schlieren, CH).
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención abarca un miembro enlazador del citomegalovirus humano (hCMV), como se describe en cualquier otra parte de la presente, en donde este miembro enlazador comprende una región Fe o una región equivalente que comprende cuando menos una región CH2 de IgG, que se ha modificado para aumentar una o más funciones efectoras. En una modalidad, el miembro enlazador se modifica para alterar el patrón de glicosilación de los oligosacáridos N-enlazados en Asn 297, de tal manera que se incrementa la actividad de una o más funciones efectoras. En otra modalidad, el miembro enlazador se modifica para alterar la secuencia de aminoácidos de la región Fe, de tal manera que se incrementa la actividad de una o más funciones efectoras. Los métodos para medir la actividad de la función efectora y determinar si se incrementa o no, son bien conocidos en la materia.
Los miembros enlazadores de la invención se pueden marcar con una marca detectable o funcional. Por consiguiente, un miembro enlazador o una molécula de anticuerpo puede estar presente en la forma de un inmunoconjugado, como para obtener una señal detectable y/o cuantificable. Un inmunoconjugado puede comprender una molécula de anticuerpo de la invención, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, conjugado con una marca detectable o funcional. Una marca puede ser cualquier molécula que produzca, o que pueda ser inducida para producir, una señal, incluyendo, pero no limitándose a, fluorocromos, radiomarcas, enzimas, quimiluminiscedores o fotosensibilizadores. Por consiguiente, el enlace se puede detectar y/o medir mediante la detección de la fluorescencia o de la luminiscencia, de la radioactividad, de la actividad enzimática, o de la absorbencia de luz.
Las marcas adecuadas incluyen, a manera de ilustración y no de limitación, enzimas, tales como fosfatasa alcalina, deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato ('G6PDH'), alfa-D-galactosidasa, oxidasa de glucosa, glucosa-amilasa, anhidrasa carbónica, acetil-colinesterasa, lisozima, deshidrogenasa de malato, y peroxidasas, por ejemplo, peroxidasa de radícula roja; tintes; marcas fluorescentes o fluorocromos, tales como fluoresceína y sus derivados, compuestos de rodamina y sus derivados, proteína fluorescente verde/amarilla (G/YFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente azul (BFP), dansilo, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina; fluoróforos, tales como criptatos y quelatos de lantánidos, por ejemplo, Europio, etc. (Perkin Elmer and Cís Biointernational), marcas quimiluminiscentes o quimiluminiscedores, tales como isoluminol, luminol, y los dioxetanos; marcas bio-luminiscentes, tales como luciferasa y luciferina; sensibilizantes; coenzimas; sustratos de enzimas; radiomarcas, incluyendo, pero no limitándose a, bromo77, carbono14, cobalto57, flúor8, galio67, galio68, hidrógeno3 (tritio), indio 111 , indio113m, yodo123m, yodo125, yodo126, yodo131, yodo133, mercurio107, mercurio203, fósforo32, renio99m, renio101, renio105, rutenio95, rutenio97, ruteniol03, ruteniol05, escandio47, selenio75, azufre35, tecnecio99, tecnecio99m, teluriol 21 m, telurio122m, teluriol 25m, tulio 165, tuliol 67, tu lio 168 , itrio 199, y otras radiomarcas mencionadas en la presente; partículas, tales como partículas de látex o de carbono; solución de metal; cristalita; liposomas; células, etc., los cuales se pueden marcar adicionalmente con un tinté, un catalizador, u otro grupo detectable; moléculas, tales como biotina, digoxígenina o 5-bromo-desoxiuridina; fracciones de toxina, tales como, por ejemplo, una fracción de toxina seleccionada a partir de un grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE o un fragmento o mutante citotóxico de la misma), toxina de Difteria o un fragmento o mutante citotóxico de la misma, una toxina de botulinio A, B, C, D, E o F, ricina o un fragmento citotóxico de la misma, por ejemplo, ricina A, abrina o un fragmento citotóxico de la misma, saporina o un fragmento citotóxico de la misma, toxina antiviral de grana o un fragmento citotóxico de la misma, y briodina 1 o un fragmento citotóxico de la misma.
Las enzimas y coenzimas adecuadas se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US4,275,149 (Litman y colaboradores), y US4,318,980 (Boguslaski y colaboradores), y los fluorescedores y quimiluminiscedores adecuados se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US4,275,149, las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Las marcas incluyen además las fracciones químicas, tales como biotina, que se puede detectar por medio del enlace con una fracción detectadle cognada específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina marcada, o estreptavidina genéticamente diseñada, como estreptactina (IBA GmbH, Góttingen, DE). Las marcas detectables se pueden unir a los anticuerpos de la invención utilizando la química convencional conocida en la materia.
Los inmunoconjugados o sus fragmentos funcionales se pueden preparar mediante los métodos conocidos por la persona experta en este campo. Se pueden acoplar a las enzimas o a las marcas fluorescentes directamente o por medio del intermediario de un grupo espaciador o de un grupo de enlace, tal como un poli-aldehido, como glutaraldehído, ácido etilen-diamina-tetra-acético (EDTA), ácido dietilen-triamina-penta-acético (DPTA), o en la presencia de agentes de acoplamiento, tales como aquéllos mencionados anteriormente para los conjugados terapéutico. Los conjugados que contienen marcas de tipo de fluoresceína, se pueden preparar mediante la reacción con un isotiocianato.
Los métodos conocidos por la persona experta en la materia que existen para el acoplamiento de los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos, ya sea directamente o por medio de un agente quelante, tal como EDTA, DTPA, mencionados anteriormente, se pueden utilizar para los radio-elementos, los cuales se pueden utilizar en el diagnóstico. De la misma manera, es posible llevar a cabo el marcado con sodio125 mediante el método de cloramina T (Hunter y Greenwood, 1962), o de otra manera con tecnec¡o-99m (Tc-99m) mediante la técnica descrita en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US4,424,200 (Crockford y Rhodes), o se pueden unir por medio de DTPA, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US4,479,930 (Hnatowich), ambas de las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.
Existen numerosos métodos mediante los cuales la marca puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, mediante examinación visual, radiación electromagnética, calor, y reactivos químicos. La marca también se puede enlazar a otro miembro enlazador que se enlace al miembro enlazador de la invención, o a un soporte.
La marca puede producir directamente una señal, y por consiguiente, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo, fluorescedores, son capaces de absorber la luz ultravioleta y visible, en donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas, y las eleva hasta un estado de energía excitada. Esta energía absorbida se disipa entonces mediante la emisión de luz a una segunda longitud de onda. Esta emisión a la segunda longitud de onda también puede transferir energía a una molécula aceptora marcada, y la energía resultante se disipa desde la molécula aceptora mediante la emisión de luz, por ejemplo, mediante transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Otras marcas que producen directamente una señal incluyen los isótopos radioactivos y los tintes.
Alternativamente, la marca puede necesitar otros componentes para producir una señal, y la señal en el sistema de producción entonces incluiría todos los componentes requeridos para producir una señal medible, la cual puede incluir sustratos, enzimas adicionales, coenzimas, potencíadores y sustancias que reaccionen con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, eliminadores, iones metálicos, y una sustancia de enlace específica necesaria para el enlace de las sustancias que generan señales. Una discusión detallada de los sistemas productores de señales adecuados se puede encontrar en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US5,185,243 (Ullman y colaboradores). La presente invención proporciona un método que comprende causar o permitir el enlace de un miembro enlazador de acuerdo con lo dispuesto en el presente documento, específico para el citomegalovirus humano (hCMV). Como se observa, este enlace puede tomar lugar in vivo, por ejemplo, después de la administración de un miembro enlazador, o de un ácido nucleico que codifique un miembro enlazador, o puede tomar lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, Western blot, cromatografía de afinidad, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, neutralización y ensayos bioquímicos o basados en células.
La presente invención también proporciona métodos para medir los niveles de antígeno directamente, mediante el empleo de un miembro enlazador de acuerdo con la invención, por ejemplo, en un sistema biosensor. Por ejemplo, la presente invención comprende un método de detección y/o de medición del enlace al citomegalovirus humano (hCMV), el cual comprende: (i) exponer el miembro enlazador al citomegalovirus humano (hCMV), y (ii) detectar el enlace de dicho miembro enlazador al citomegalovirus humano (hCMV), en donde se detecta el enlace utilizando cualquier método o marca detectable descritos en este documento. Este y cualquier otro método de detección de enlace descrito, puede ser interpretado directamente por la persona que lleve a cabo el método, por ejemplo, observando visualmente una marca detectable. Alternativamente, este método, o cualquier otro método de detección de enlace descrito, puede producir un reporte en la forma de una auto-radiografía, una fotografía, una impresión de computadora, un reporte de la citometría de flujo, un gráfico, un diagrama, un tubo de ensayo, o un recipiente o pozo que contenga el resultado, o cualquier otra representación visual o física de un resultado del método.
Se puede determinar la cantidad de enlace de un miembro enlazador al citomegalovirus humano (hCMV). La cuantifícación se puede relacionar con la cantidad de antígeno en una muestra de prueba, que puede ser de interés en el diagnóstico. La detección del enlace del citomegalovirus humano (hCMV), o la cuantificación del mismo, puede ser útil, por ejemplo, en los pacientes con las enfermedades o los trastornos mencionados en este documento, o con cualquier otra enfermedad o trastorno que involucre la expresión y/o la actividad aberrante del citomegalovirus humano (hCMV).
Un método de diagnóstico de la invención puede comprender: (i) la obtención de un tejido o muestra de líquido de un sujeto, (ii) exponer dicho tejido o la muestra de líquido a uno o más miembros enlazadores de la presente invención; y (iii) la detección del citomegalovirus humano (hCMV) enlazado en comparación con una muestra de control, en donde un aumento en la cantidad de enlace del citomegalovirus humano (hCMV) en comparación con el control, puede indicar la expresión y/o actividad del citomegalovirus humano (hCMV). Las muestras de tejido o líquido que se van a probar incluyen sangre, suero, saliva, orina, esputo, un material de biopsia o cualquier tejido que se sospeche que contiene el citomegalovirus humano (hCMV). Los sujetos que se prueben como positivos para el citomegalovirus humano (hCMV) también pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento divulgados posteriormente en este documento. Aquéllos especializados en la técnica son capaces de elegir un modo adecuado de determinación del enlace de los miembros enlazadores a un antígeno según sus preferencias y conocimientos generales, teniendo en cuenta los métodos que se dan a conocer en la presente.
La reactividad de los miembros enlazadores en una muestra puede determinarse por cualquier medio adecuado. Se puede usar un ensayo de enlace competitivo con antígeno radiactivo, por ejemplo, una marca de isótopo, tal como "Te, 14C, 131l, 125l, 3H, 32P o 35S, o con un antígeno no radiactivo, utilizando el antígeno o un análogo enlazado a una molécula reportera. La molécula reportera puede ser un tinte fluorocromo, fósforo o láser con características de absorción o emisión espectralmente aisladas. Los fluorocromos adecuados incluyen quelatos con fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red, y los lantánidos o criptatos. Los tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzidina.
Otros reporteros incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado, tal como gotas de látex coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes biológicamente o químicamente activos que puedan provocar directamente o indirectamente señales detectables para observarse visualmente, detectadas electrónicamente o registradas de otra manera. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalicen las reacciones que se desarrollen, o que cambien los colores o provoquen cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser molecularmente excitables, de tal manera que produzcan transiciones electrónicas entre los estados de energía en las emisiones o absorciones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas utilizadas conjuntamente con biosensores. Pueden emplearse la avidina/biotina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina o sistemas de detección de peroxidasa de rábano.
Las señales generadas por los conjugados individuales de miembro enlazador-reportero, se pueden utilizar para obtener datos relativos o absolutos cuantificables de los miembros enlazadores pertinentes que se enlacen en las muestras (normales y de prueba).
También se suministra un kit que comprende: un miembro enlazador de acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la presente invención. En el kit, el miembro enlazador puede marcarse para permitir su reactividad en una muestra que se puede determinar, por ejemplo, como se describe más adelante. Además, los miembros enlazadores pueden o no pueden fijarse a un soporte sólido. Los componentes de un kit son generalmente estériles y están en frascos sellados u otros recipientes. Los kits pueden ser empleados en el análisis de diagnóstico o en otros métodos para los que sean útiles los miembros enlazadores. Un kit puede contener instrucciones de uso de los componentes de un método, por ejemplo, un método de acuerdo con la presente invención. Se pueden incluir materiales auxiliares para ayudar a, o permitir realizar, tal método, dentro de un kit de la invención. Los materiales auxiliares incluyen un segundo miembro enlazador diferente, que se enlaza al primer miembro enlazador, y se conjuga con una marca detectable (por ejemplo, una marca fluorescente, isótopo radiactivo o enzima). Los kits basados en anticuerpos también pueden comprender gránulos para conducir la inmunoprecipitación. Cada componente de los kits está generalmente en su propio contenedor. Por consiguiente, estos kits incluyen generalmente distintos recipientes adecuados para cada miembro enlazador. Además, los kits podrán incluir instrucciones para realizar el análisis y los métodos de interpretación y análisis de los datos resultantes de la ejecución del ensayo.
La presente invención también proporciona el uso de un miembro enlazador como se menciona anteriormente, para medir los niveles de antígeno en un ensayo de competición, es decir un método para medir el nivel de antígeno en una muestra mediante el empleo de un miembro enlazador de acuerdo con lo dispuesto por la presente invención, en un ensayo de competición. Esto puede ser en donde no se requiera la separación física del antígeno enlazado del no enlazado. Una posibilidad es el enlace de una molécula reportera a los miembros enlazadores para que se produzca un cambio físico u óptico sobre el enlace. La molécula reportera puede generar directa o indirectamente las señales detectables, que pueden ser cuantificables. El enlace de las moléculas reporteras puede ser directa o indirectamente covalente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico, o no covalente. El enlace a través de un enlace peptídico puede ser el resultado de la expresión recombinante de un anticuerpo codificante de la fusión genética y la molécula reportera.
En diversos aspectos y modalidades, la presente invención se extiende a un miembro enlazador que compite por el enlace al citomegalovirus humano (hCMV) con cualquier miembro enlazador definido en la presente, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, por ejemplo, en formato de IgG. La competición entre los miembros enlazadores se puede ensayar in vitro, por ejemplo, marcando una molécula reportera específica para un miembro enlazador que pueda ser detectado en la presencia de otros miembros enlazadores no marcados, para permitir la identificación de los miembros enlazadores que unan el mismo epítopo o un epítopo superpuesto. La competición puede determinarse mediante, por ejemplo, ELISA, o por resonancia de plasmón superficial, en donde el citomegalovirus humano (hCMV) es inmovilizado en una fase sólida, y se agrega un primer miembro enlazador no marcado o no etiquetado, junto con uno o más miembros enlazadores no marcados o no etiquetados diferentes que se añaden a la fase sólida. La presencia de un miembro enlazador no marcado que compite con el miembro enlazador marcado se observa por una disminución en la señal emitida por el miembro enlazador marcado.
Por ejemplo, la presente invención incluye un método para identificar un compuesto de enlace del citomegalovirus humano (hCMV), el cual comprende: (i) inmovilizar la proteína gB a un soporte, (ii) poner en contacto con dicha gB inmovilizada, simultáneamente o de manera escalonada, con cuando menos un miembro enlazador marcado o etiquetado de acuerdo con la invención, y uno o más compuestos enlazadores de prueba no marcados o no etiquetados, y (iii) identificar un nuevo compuesto enlazador del citomegalovirus humano (hCMV), observando una disminución en la cantidad de la marca enlazada a partir del miembro enlazador marcado. Estos métodos pueden llevarse a cabo de una manera de alto rendimiento utilizando un formato de múltiples pozos o de matriz. Estos ensayos también pueden realizarse en solución. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US5,814,468 (Sliman y colaboradores), que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Como se describió anteriormente, la detección del enlace puede ser interpretada directamente por la persona que lleve a cabo el método, por ejemplo, observando visualmente una marca detectable, o una disminución en la presencia de la misma. Alternativamente, los métodos de enlace de la invención pueden producir un reporte en la forma de una auto-radiografía, una fotografía, una impresión de computadora, un reporte de la citometría de flujo, o cualquier otra representación visual o física de un resultado del método.
También se pueden utilizar ensayos de competición en la caracterización del epítopo. En una instancia, se puede utilizar la caracterización del epítopo para identificar el epítopo enlazado por un miembro enlazador del citomegalovirus humano (hCMV) que opcionalmente puede tener características de neutralización y/o modulación optimizadas. Este epítopo puede ser lineal o conformacional. Un epítopo conformacional puede comprender cuando menos dos diferentes dominios del citomegalovirus humano (hCMV), en donde dichos dominios están colocados en proximidad uno con el otro, cuando se pliegan las proteínas del citomegalovirus humano (hCMV) en su estructura terciaria o cuaternaria para formar un epítopo conformacional que sea reconocido por un inhibidor del citomegalovirus humano (hCMV), como un miembro enlazador del citomegalovirus humano (hCMV), en esta memoria descriptiva. En las pruebas de competición se puede emplear un fragmento peptídico del antígeno, especialmente un péptido que incluya o que se componga de un epítopo de interés. Puede utilizarse un péptido con la secuencia del epítopo más uno o más de los aminoácidos en los extremos. Los miembros enlazadores de acuerdo con la presente invención pueden ser tales que su enlace con el antígeno sea inhibido por un péptido con, o que se incluya en, la secuencia indicada.
La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un miembro enlazador de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN o ARN. En uno, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para una región determinante de complementariedad (CDR) o un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDR), o el dominio VH o el dominio VL, o el sitio de enlace de antígeno del anticuerpo, o la molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgGi, de la invención, de acuerdo con lo definido anteriormente.
La presente invención también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden cuando menos un poltnucleótido como se menciona anteriormente.
La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como se indican anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier región determinante de complementariedad (CDR) o un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDR), o el dominio VH o el dominio VL, o el sitio de enlace de antígeno del anticuerpo, o la molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG!, tal como se prevén, por sí mismos constituyen un aspecto de la presente invención, así como un método de producción del producto codificado, cuyo método comprenda la expresión a partir del ácido nucleico codificante. La expresión convenientemente podrá lograrse mediante el cultivo celular de dicho huésped recombinante que contenga el ácido nucleico, bajo las condiciones adecuadas. Después de la producción para la expresión de un miembro enlazador que comprende el dominio VH o VL como se da a conocer en la presente, el miembro enlazador puede ser aislado y purificado mediante cualquier técnica adecuada conocida en la materia y que se considere como apropiada.
El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender ADN o ARN, y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se estipula en la presente, abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada, en donde se sustituye U por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.
Un aspecto todavía adicional proporciona un método de producción de un miembro enlazador, el cual comprende el dominio variable VH o VL de la presente invención, en donde este método incluye causar la expresión del ácido nucleico codificante. Este método puede comprender el cultivo de las células huésped recombinantes bajo condiciones para la producción del dominio variable VH o VL de dicho anticuerpo.
Un método de producción puede comprender un paso de aislamiento y purificación del producto. Un método de producción puede comprender la formulación del producto en una composición, incluyendo cuando menos un componente adicional, como un excipiente farmacéuticamente activo.
Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células vegetales, hongos filamentosos, células de levadura y de insectos, y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en las células procariotas está bien establecida en la materia. Para una revisión, véase, por ejemplo, Pluckthun (1991). Un huésped bacteriano común es E. coli.
La expresión en las células eucariotas en el cultivo también está disponible para aquellos especializados en la técnica como una opción para la producción de un miembro enlazador (Chadd y Chamow, 2001; Yersen y Krummen, 2002; Larrick y Thomas, 2001). Las líneas celulares de mamífero en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñon (BHK) de hámster bebé, células de melanoma del ratón NSO, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñon de embrión humano (HEK), células de la retina embrionaria humana, y muchas otras.
Los vectores adecuados pueden ser elegidos o construidos para que contengan las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcadores, y otras secuencias según corresponda. Pueden ser vectores, plásmidos, fagémidos o vectores virales, por ejemplo, vectores retrovirales, como sea apropiado (Sambrook y Russell, 2001). Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de los ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en las células, y expresión genética, así como análisis de las proteínas, se describen detalladamente en Ausubel y colaboradores., (1999).
Otro aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico como se da a conocer en la presente. Dicha célula huésped puede mantenerse in vitro, y se puede propagar en un cultivo de tejido. Dicha célula huésped puede también mantenerse in vivo, por ejemplo, con el fin de producir miembros enlazadores en ascitis. In vivo, la presencia de la célula huésped puede permitir la expresión intracelular de los miembros enlazadores de la presente invención como 'intracuerpos' o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos se pueden utilizar para la terapia genética.
Un aspecto todavía adicional proporciona un método que comprende la introducción del ácido nucleico de la invención en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas, y transducción utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vacuna o, para las células de insectos, baculovirus o cualquier combinación de los mismos. La introducción de ácido nucleico en la célula huésped, en particular una célula eucariota, puede usar un sistema basado en virus o en plásmidos. El sistema de plásmido puede mantenerse episomalmente, o puede ser incorporado en el genoma de la célula huésped o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser ya sea mediante integración aleatoria o específica de una o más copias en uno o múltiples loci. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación, y transfección mediante bacteriófagos.
La introducción puede estar seguida por causar o permitir la expresión a partir de los ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante el cultivo de las células huésped bajo condiciones para la expresión de los miembros enlazadores. La purificación del producto expresado podrá lograrse mediante los métodos conocidos para un experto en la materia.
El ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede ser promovida mediante la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas convencionales.
La presente invención también proporciona un método que comprende utilizar una construcción como se indica anteriormente, en un sistema de expresión, con el objeto de expresar un miembro enlazador o polipéptido como se menciona anteriormente.
Existe evidencia de participación de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) en una variedad de trastornos, como se explica en cualquier otra parte de la presente. Los miembros enlazadores de la presente invención, por consiguiente, se pueden utilizar en un método de diagnóstico o en el tratamiento de un trastorno asociado con la infección por el citomegalovirus humano (hCMV). Dicho trastorno puede afectar a los pacientes inmunodeprimidos, tales como los receptores de aloinjertos y los individuos infectados por el VIH, y puede incluir, por ejemplo: fiebre, hepatitis, retinitis, neumonitis, mielosupresión , encefalopatía, poli-radiculopatía, inmunosupresión, rechazo/enfermedad del injerto contra el huésped, o ateroesclerosis. Un miembro enlazador de la presente invención también puede utilizarse para tratar la infección intrauterina en los neonatos. Con frecuencia, los neonatos nacen sin signos o síntomas de los trastornos mencionados anteriormente, pero sin tratamiento pueden desarrollar síntomas progresivos de disfunción y deterioro del sistema nervioso central (CNS), por ejemplo, pero no limitándose a, la pérdida de la audición, la pérdida de la visión, o retraso mental.
De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un método para tratar un trastorno relacionado con la infección por el citomegalovirus humano (hCMV), el cual comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad efectiva de uno o más miembros enlazadores de la presente invención solos o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento apropiado conocido en la materia o descrito en la presente.
La evidencia de participación de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) en ciertos trastornos se resume en otras partes de la presente. En adición, los datos presentados en este documento indican además que los miembros enlazadores de la invención se pueden utilizar para tratar dichos trastornos, incluyendo el tratamiento preventivo y la reducción de la gravedad de los trastornos. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un método para el tratamiento o la reducción de la gravedad de cuando menos uno de los síntomas de los trastornos mencionados en la presente, el cual comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad efectiva de uno o más miembros enlazadores de la presente invención solos o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento apropiado conocido en la técnica o descrito en la presente, de tal manera que se reduce la gravedad de cuando menos uno de los síntomas de los trastornos anteriores.
Por consiguiente, los miembros enlazadores de la presente invención son útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de las enfermedades o los trastornos relacionados con la infección y/o la actividad del citomegalovirus humano (hCMV), especialmente resultantes de una alta carga viral en un paciente. Un método de tratamiento puede comprender administrar una cantidad efectiva de un miembro enlazador de la invención a un paciente que lo necesite, en donde se reduce la infección y/o actividad aberrante del citomegalovirus humano (hCMV). Un método de tratamiento puede comprender: (i) identificar un paciente que demuestre niveles o actividad de infección por el citomegalovirus humano (hCMV), por ejemplo, empleando los métodos de diagnóstico descritos anteriormente, y (¡i) administrar una cantidad efectiva de un miembro enlazador de la invención al paciente, en donde se reduce la expresión o la actividad del citomegalovirus humano (hCMV). Una cantidad efectiva de acuerdo con la invención es una cantidad que disminuye la expresión o actividad del citomegalovirus humano (hCMV) con el fin de disminuir o mitigar la gravedad de cuando menos uno de los síntomas de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) o de la enfermedad o el trastorno particular que se vaya a tratar, pero no necesariamente cura la enfermedad o el trastorno.
La invención también proporciona un método para antagonízar cuando menos uno de los efectos de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV), el cual comprende poner en contacto con, o administrar, una cantidad efectiva de uno o más miembros enlazadores de la presente invención, de tal manera que se antagonice el cuando menos uno de los efectos de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV). De conformidad con lo anterior, otros aspectos de la invención proporcionan métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro enlazador previsto, composiciones farmacéuticas que comprenden dicho miembro enlazador, y el uso de este miembro enlazador en la elaboración de un medicamento para su administración, por ejemplo, en un método para la elaboración de un medicamento o de una composición farmacéutica que comprende formular el miembro enlazador con un excipiente farmacéuticamente activo. Un excipiente farmacéuticamente activo puede ser un compuesto o una combinación de compuestos introducidos en una composición farmacéutica, que no provoque reacciones secundarias y que permita, por ejemplo, la facilitación de la administración de los compuestos activos, un aumento en su tiempo de vida y/o en su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en la solución, o bien una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por la persona experta en la técnica como una función de la naturaleza y el modo de administración de los compuestos activos seleccionados.
Los miembros enlazadores de la presente invención normalmente serán administrados en la forma de una composición farmacéutica, la cual puede comprender cuando menos un componente además del miembro enlazador. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para el uso de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente farmacéuticamente activo, portador, regulador del pH, estabilizador u otros materiales bien conocidos por aquéllos especializados en la materia. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador o de otro material dependerá de la vía de administración, la cual puede ser oral, inhalada, intra-traqueal, tópica, intra-vesicular o mediante inyección, como se explica a continuación.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en una forma de tableta, cápsula, polvo, líquido o semi-sólido. Una tableta puede comprender un vehículo sólido, tal como gelatina, o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden generalmente un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral, o aceite sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, dextrosa, o solución de sacárido o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para inyección intravenosa o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa aceptable para uso parenteral que esté libre de pirógenos y que tenga estabilidad, isotonicidad y pH adecuados. Los expertos en la técnica pertinente serán capaces de preparar soluciones adecuadas, por ejemplo, utilizando vehículos isotónicos, tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactatada.
Se pueden emplear conservadores, estabilizantes, reguladores del pH, antioxidantes y otros aditivos como sean necesarios, incluyendo reguladores del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecil-dimetil-bencil-amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil-parabenos, tales como metil- o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3'-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como la albúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinil-pirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparaginas, histidina, arginina o Usina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, tales como glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como el EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteínas); o tensoactivos no iónicos, tales como TWE E N MR , PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG).
Los miembros enlazadores de la presente invención pueden formularse en formas sólidas, líquidas o semi-sólidas, dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y de la vía de suministro. Las formulaciones pueden incluir excipientes o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos, y agentes tensoactivos. Las formulaciones líquidas pueden incluir un amplio intervalo de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones sólidas se pueden producir mediante liofilización, secado por aspersión, o secado mediante la tecnología de fluidos supercríticos, por ejemplo. Las formulaciones de los miembros enlazadores dependerán de la vía de suministro pretendida. Un miembro enlazador puede prepararse con un vehículo que protegerá al miembro enlazador contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como etileno/acetato de vinilo, poli-anhídridos, poli-ácido glicólico, colágeno, poli-orto-ésteres y poli-ácido láctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son conocidos por los expertos en la materia (Robinson, 1978).
El tratamiento puede darse por vía oral o mediante inyección (es decir, por vía subcutánea, intra-articular, intravenosa, intraperitoneal, intra-arterial o intramuscular), mediante inhalación, intra-traqueal, por la vía intravesicular (instilación en la vejiga urinaria), o tópica (por ejemplo, intraocular, pentavalente, rectal, en heridas, sobre la piel). El tratamiento se puede administrar mediante infusión de impulsos, particularmente con dosis decrecientes del miembro enlazador. La vía de administración puede determinarse por las características fisicoquímicas del tratamiento, por consideraciones especiales para la enfermedad, o por el requerimiento de optimizar la eficacia o minimizar los efectos secundarios. Una vía de administración particular es intravenosa. Otra vía de administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención es por vía subcutánea. Se prevé que no el tratamiento no será restringido a su uso en la clínica. Por consiguiente, también es conveniente la inyección subcutánea utilizando un dispositivo sin aguja.
Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o en secuencia, dependiendo de la condición a tratar.
Un miembro enlazador de la invención puede utilizarse como parte de una terapia de combinación en conjunto con un componente medicinal adicional. Los tratamientos de combinación se pueden utilizar para proporcionar efectos sinérgicos significativos, particularmente la combinación de un miembro enlazador de la invención con uno o más anticuerpos, tales como los anticuerpos Ab-01 a Ab-50, como se dan a conocer en la presente, o cualquiera de los anticuerpos del citomegalovirus humano (hCMV) descritos en las siguientes publicaciones: US5, 043, 281 (Mashuho y colaboradores), US5, 750, 106 (Ostberg), WO93/021952 A1 (Borrebaeck y colaboradores), WO08/084410 A2W010/007463 A1 y A2 de WO10/007533 (Lanzavecchia y Macagno), WO08/071806 A1, WO09/003975 A1 y WO09/024445 A1 (Funaro y colaboradores), WO09/114560 A2 (Olsen), WO10/114105 A1 y WO10/114106 A1 (Takada y colaboradores), o cualquier otro fármaco. Un miembro enlazador de la invención puede ser administrado simultáneamente o en secuencia, o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las condiciones enlistadas en la presente.
Un miembro enlazador de la invención puede utilizarse como un quimiosensibilizador, mediante el cual se puede aumentar la eficacia terapéutica de los agentes antivirales y, por lo tanto, se puede proporcionar para su administración en combinación con uno o más agentes antivirales, simultáneamente o en secuencia.
Un miembro enlazador de acuerdo con la presente invención puede proporcionarse en combinación o en adición a uno o más de los siguientes agentes antivirales, por ejemplo, aciclovir, famciclovir, valganciclovir, ganciclovir, cidofovir, amantadina, rimantadina, ribavirina, zanamavir u oseltamavir.
Se puede utilizar un miembro enlazador de la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores, en la elaboración de un medicamento. El medicamento puede ser para su administración separada o combinada a un individuo y, de conformidad con lo anterior, puede comprender al miembro enlazador y al componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones separadas. Las preparaciones separadas se pueden utilizar para facilitar la administración separada y en secuencia o simultánea, y para permitir la administración de los componentes por diferentes vías, por ejemplo, la administración oral y parenteral.
De acuerdo con la presente invención, la composiciones proporcionadas pueden administrarse a mamíferos. La administración normalmente se hace en una 'cantidad terapéuticamente efectiva', siendo ésta suficiente para mostrar el beneficio para un paciente. Estos beneficios pueden ser cuando menos una mejoría de cuando menos uno de los síntomas. La cantidad real administrada y la tasa y el curso del tiempo de administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que se esté tratando, del mamífero particular que esté siendo tratado, de la condición clínica de cada paciente, de la causa del trastorno, del sitio de suministro de la composición, del tipo de miembro enlazador, del método de administración, de la programación de la administración, y de otros factores conocidos por los médicos practicantes. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre dosificación, etc., es responsabilidad de los médicos generales y de otros doctores médicos, y puede depender de la gravedad de los síntomas o del progreso de una enfermedad a tratar. Las dosis apropiadas de los anticuerpos son bien conocidas en la técnica (Ledermann y colaboradores., 1991; Bagshawe y colaboradores., 1991). Se pueden utilizar las dosificaciones específicas indicadas en la presente o en Physician's Desk Reference (2009), como sean adecuadas para el tipo de medicamento que se esté administrando. Una cantidad terapéuticamente efectiva o una dosis adecuada de un miembro enlazador de la invención se puede determinar comparando su actividad in vitro y su actividad in vivo en un modelo animal. Los métodos para la extrapolación de las dosificaciones efectivas en ratones y en otros animales de prueba o en seres humanos son conocidos. La dosis exacta dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o tratamiento, del tamaño y ubicación de la zona a tratar, de la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo entero o fragmento), y de la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el intervalo de 100 microgramos a 1 gramo para aplicaciones sistémicas, y de 1 microgramo a 1 miligramo para aplicaciones tópicas. Se puede administrar una dosis de carga inicial más alta, seguida por una o más dosis más bajas. Normalmente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, por ejemplo, el isotipo de IgG^ Ésta es una dosis para un solo tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para niños, bebés y recién nacidos, y también se puede ajustar para otros formatos de anticuerpos en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, dos veces por semana, semanales o mensuales, a discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas por vía subcutánea, y cada cuatro a ocho semanas para administración intravenosa. El tratamiento puede ser periódico, y el período entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo, de aproximadamente tres semanas o más, de aproximadamente cuatro semanas o más, o de aproximadamente una vez al mes. El tratamiento puede darse antes y/o después de la cirugía de trasplante, y/o se puede administrar o aplicar directamente en el sitio anatómico del tratamiento quirúrgico.
Los miembros enlazadores del citomegalovirus humano (hCMV) de la invención pueden ofrecer ventajas en cuanto a los requerimientos de dosis y administración, en comparación con los anticuerpos para el citomegalovirus humano (hCMV) dados a conocer previamente en la materia, como se discutió anteriormente. Por ejemplo, si la dosis de un producto terapéutico anti-hCMV es más baja, puede haber ventajas significativas en que la dosis baja facilite las inyecciones subcutáneas, así como las inyecciones intravenosas. Es bien sabido por los entendidos en la materia, que la dosificación subcutánea puede estar limitada por la cantidad de miembros enlazadores, por ejemplo, la molécula de anticuerpo, requeridos por dosis. Esto es debido a que la inyección subcutánea está limitada por el volumen que puede ser inyectado en un sitio de la piel. Normalmente se utilizan volúmenes de inyección subcutánea de 1.2 mililitros o menos. Debido a que cada vez más difícil formular un miembro enlazador para inyección subcutánea en concentraciones superiores a 50 miligramos/mililitro, las dosis mayores de I00 miligramos por esta vía suelen requerir múltiples inyecciones y más molestias para el paciente. Por consiguiente, es conveniente una dosis más baja, por ejemplo, de un miembro enlazador de citomegalovirus humano (hCMV) más potente, debido a que amplía las vías de administración.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Clasificación FACS de las células-B de memoria específicas del citomegalovirus humano (hCMV) y la transformación EBV de las células-B de memoria positivas para IgG Después de que se obtuvo el consentimiento informado del donante, se recolectó sangre periférica (300 mililitros) a partir de los donantes sanos seropositivos para el citomegalovirus humano (hCMV), cuyo suero se había rastreado previamente para determinar las titulaciones altas de enlace de gB y la actividad neutralizante del citomegalovirus humano (hCMV) eficiente. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se purificaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll (Lymphoflot, Biotest, Dreieich, Alemania). Después del enriquecimiento de las células-B utilizando micro-gránulos de CD22 anti-humano (Mitenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), las células-B se marcaron con los siguientes reactivos: a. CD19-FITC anti-humano (Miltenyi Biotec, Alemania); b. CD27-PE anti-humano (BD Bioscience Pharmigen, Basilea, Suiza); c. IgG-bio anti-humano (Jackson Immuno-Research, West Grove, PA, EUA); d. estreptavidina, conjugado Alexa Fluor® 350 (Molecular Probes Inc, Eugene, OR, EUA), y e. glicoproteína B marcada con Cy5 (100 nanogramos por 1 x 106 células-B). Las células-B de memoria positivas para IgG, específicas de gB, se aislaron mediante la selección de las células que cumplieron con los siguientes cuatro criterios: FITC+/PE+/Alexa Fluor® 350+ y Cy5+ (Véase la Figura 2). De una manera alternativa, se marcaron las células B con los siguientes reactivos: a. CD19-PerCP anti-humano (Dianova, Hamburgo, Alemania); b. CD27-PE anti-humano (BD Bioscience Pharmigen, Basilea, Suiza); c. IgG-FITC anti-humano (Dianova, Hamburgo, Alemania); d. glicoproteína B marcada con Cy5 (100 nanogramos por 1 x 106 células-B). Estas células B de memoria específica de gB, positivas para IgG, se analizaron cada una utilizando FACSCalibur® (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) o se aislaron mediante la clasificación que satisficiera los criterios PerCP+/PE+/FITC+ y Cy5+.
Las células se clasificaron en una concentración de 5 ó 10 células/pozo, en microplacas de fondo plano de 96 pozos que contenían una capa confluyente de células alimentadoras irradiadas (fibroblastos de prepucio humano, HFFs), utilizando un clasificador de células MoFloMR (Cytomation, Freiburg, Alemania). Las células clasificadas crecieron en un medio completo RPMI-1640 complementado con glutamina 2 mlvl, penicilina 100 IU/mililitro, estreptomicina 100 microgramos/mililitro, 2-mercapto-etanol 50 µ?, y suero fetal de becerro al 10 por ciento (inactivado por calor) (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania) en la presencia de EBV que contenía el sobrenadante del cultivo celular (30 por ciento del sobrenadante de la linea celular B95-8 producida por EBV), y CpG ODN 2006 (2,5 microgramos/mililitro) como se describió anteriormente (Rosén y colaboradores, 1977; Steinitz y colaboradores, 1977; Bernasconi y colaboradores, 2002; Jung y colaboradores, 2002; Traggiai y colaboradores, 2004). Después de tres semanas, se seleccionaron los sobrenadantes del cultivo a partir de las líneas celulares generadas para determinar la especificidad de gB utilizando el análisis de inmunoabsorción enlazado a enzimas (ELISA). En breve, las placas ELISA (Nunc) se recubrieron con 0.5 microgramos/mililitro de glicoproteína B en regulador de carbonato, pH de 9.6, durante 16 horas a 4°C. Las placas recubiertas de gB se lavaron seis veces con suero regulado con fosfato (PBS) complementado con Tween al 0.05 por ciento (regulador de lavado de ELISA), y se bloquearon durante 2 horas con suero regulado con fosfato complementado con Tween al 0.05 por ciento y suero fetal de becerro al 2 por ciento (regulador de ELISA). Se incubaron 50 microlitros de sobrenadantes de cultivo por pozo durante 1 hora a temperatura ambiente y, después de otro paso de lavado, se reveló el enlace del anticuerpo utilizando anticuerpos secundarios específicos del fragmento Fcy acoplados con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, EUA). Después de un período de incubación de 1 hora, se removió el anticuerpo secundario no enlazado mediante el lavado, y se determinó la actividad enzimática utilizando 50 microlitros/pozo de o-fenil-diamina en una concentración de 0.04 miligramos/mililitro en regulador de fosfato-citrato 0.05 M (pH de 5.0), H202 al 0.05 por ciento. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió mediante la adición de 50 microlitros/pozo de H2S04 2M, y se midió la densidad óptica (OD) a 492 nanómetros con un fotómetro SPECTRAmaxMR 190 ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Se utilizó el Software Softmax Pro 3.0 (Molecular Devices, EUA) para el análisis.
Ejemplo 2: Ensayo de neutralización in vitro del citomegalovirus humano (hCMV) Se seleccionaron los sobrenadantes de cultivo específicos de gB para determinar la actividad neutralizante utilizando el citomegalovirus humano (hCMV) cepa AD169 recombinante (HB15-UL84prluc) que contenía un cásete de expresión del gen reportero de luciferasa en el genoma del citomegalovirus humano (hCMV), y lo cual da como resultado la expresión de la enzima de luciferasa después de la infección de las células objetivo (amablemente proporcionadas por el Prof. Dr. Thomas Stamminger, Institute of Clinical and Molecular Virology, University Hospital Erlangen, Alemania). La titulación infecciosa en los sobrenadantes virales se determinó mediante ensayos de TCID50 en células de fibroblastos primarios (cualquiera de HFF o células MRC-5) sobre placas de 96 pozos, como se describe en Mahy y Kangro (1996). Para el ensayo de neutralización basada en luciferasa, se incubaron volúmenes iguales del sobrenadante de cultivo específico de gB y sobrenadante de AD169ALuc titulado (300pfu) a 37°C durante 1 hora en 96 microplacas de fondo en U. Se transfirieron las mezclas de anticuerpo-virus en monocapas de HFF previamente sembradas. Después de una incubación adicional a 37°C durante 4 horas, las mezclas de anticuerpo-virus mezclas se remplazaron completamente del medio. Siguiendo la incubación durante otras 42 horas a 37°C, las células se lisaron con 100 microlitros de regulador de lisis Glo (Promega, Madison, Wl) por pozo. 30 microlitros de cada pozo lisado se puso dentro de una placa LIA de 96 pozos blanca (Greiner Bio-ona, Frickenhausen, Alemania). Por pozo, se agregaron 50 microlitros de regulador de ensayo (KH2P04 15 mM, glicil-glicina 25mM, MgS041 M, EGTA 0.5 M, ATP 5 mM, DTT 1 mM). Se llevó a cabo la inyección de 50 microlitros por pozo de solución de D-luciferina (P.J.K. Kleinbittersdorf, Alemania) (en glicil-glicina 25 mM, MgS041 M, EGTA 0.5 M, DTT 2 mM, y D-Luciferina 0.05 mM), y la detección de la quimiluminiscencia mediante un luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). Se utilizó el Software MicroWin2000 (Mikrotek Laborsysteme, Overath, Alemania) para el análisis. Las unidades de luz relativa (RLU) medidas mediante el luminómetro, se expresaron en porcentaje de neutralización utilizando el siguiente cálculo: %-neutralización = 100 x (V0 - Vn)/V0, en donde Vn representa las RLU en los pozos que contenían virus y anticuerpo, y V0 representa las RLU en los pozos que contenían virus solo. El primer rastreo reveló nueve sobrenadantes de cultivo específicos de gB que neutralizaron la inefectividad del hCMV, y un segundo rastreo reveló tres sobrenadantes de cultivo específicos de gB adicionales que neutralizaron la inefectividad del hCMV. Las nueve líneas de células-B de memoria inmortalizadas por EBV y los anticuerpos neutralizantes producidos por ellas, se denominaron como SM1, SM3, SM4, SM5, SM6, SM7, SM9, SM10 y SM11 (véase la Tabla 1 más adelante). Las tres líneas celulares B inmortalizadas por EBV adicionales y los anticuerpos neutralizantes producidos por ellas, se denominaron como SM12, 2C2 y 1G2 (véase la Tabla 1 más adelante).
Una titulación de neutralizante del 50 por ciento (IC50) se indica como la concentración de anticuerpo que da como resultado una reducción del 50 por ciento de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV). De una manera similar, una titulación de neutralizante del 90 por ciento (IC90) se indica como la concentración de anticuerpo que da como resultado una reducción del 90 por ciento de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV). Para calcular las actividades neutralizantes de los anticuerpos, se determinaron las concentraciones de IgG de los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Para este propósito, las placas ELISA se recubrieron con IgG anti-humano, el anticuerpo que atrapa específicamente el fragmento Fcy (Jackson ImmunoResearch, EUA). Las diluciones dobles en serie de los sobrenadantes de cultivo del anticuerpo SM en regulador de ELISA se compararon con el estándar de IgG policlonal de la concentración conocida (concentración de suministro de 11.1 miligramos/mililitro; Cat No: 009-000-003, Jackson ImmunoResearch, EUA). Las concentraciones de IgG de las muestras se calcularon utilizando el software de ELISA Softmax Pro 3.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Las actividades de neutralización en relación con la concentración de IgG de los sobrenadantes de cultivo de la línea celular de EBV se muestran en la siguiente Tabla 1: Tabla 1 : Propiedades de líneas de células-B de memoria inmortalizadas por EBV Habiendo determinado las concentraciones de IgG de los sobrenadantes de la línea de EBV, se llevó a cabo un ensayo de neutralización adicional para seis de los sobrenadantes de la línea celular; estos sobrenadantes mostra ron valores I C50 de entre 0.5 y 2.3 microgramos/mililitro (Tabla 2 ; véase más adelante) . El ensayo de neutralización se llevó a cabo como se describe en el párrafo anterior, con la modificación de q ue se prepararon las d iluciones dobles en serie de los sobrenadantes de anticuerpo , por triplicado, antes de la adición del virus.
Tabla 2 : Actividades neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) de los anticuerpos específicos de gB producidos med iante las líneas de células-B de memoria inmortalizadas por EBV Los resultados reflejan los valores promedio de los tres ensayos independientes. Las variaciones entre ensayos estuvo en el intervalo del 10 al 20 por ciento.
* Se utilizó ITC88 como un control positivo (Ohlin y colaboradores, 1993).
Las líneas de células-B de memoria inmortalizadas por EBV se granularon produciendo los anticuerpos neutralizantes y se congelaron a -80°C, hasta que se requirieron para el procesamiento adicional.
Ejemplo 3: Clonación de las regiones variables del anticuerpo a partir de las líneas celulares anti-hCMV de EBV En los Ejemplos 3.1 a 3.4 las regiones variables de los antianticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) a partir de nueve líneas de células-B humanas transformadas por EBV (SM1, 3-7, 9-11) se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) semi anidada y se clonaron en vectores pCDNA3 (Invitrogen) que contienen la región constante de inmunoglobulina apropiada. Estas construcciones subsiguientemente se utilizaron para transfectar las células CHO y los anticuerpos expresados se probaron utilizando tecnología de arreglos de suspensión y la resonancia de plasmón superficial (Biacore®, GE Healthcare)-(Ejemplo 5), y se neutralizaron los ensayos (Ejemplo 4), para las primeras proyecciones. En los Ejemplos 3.5-3.7, las regiones variables de anti-anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) a partir de cuatro lineas de células-B humanas transformadas por EBV (SM10, SM12, 2C2 y 1G2) se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada y se clonaron en vectores de expresión que contienen la región constante de inmunoglobulina apropiada de acuerdo con el método descrito en Tiller y colaboradores, 2008. Estas construcciones subsiguientemente se utilizaron para transfectar células HEK 293T y los anticuerpos expresados se probaron en ensayos de neutralización (Ejemplo 4) como parte de las proyecciones iniciales.
El término 'región variable' significa Genes reconfigurados VDJ para cadenas pesadas y genes reconfigurados VJ para cadenas ligeras. 3.1 La purificación de ARN y la síntesis de ADNc de la primera cadena Los gránulos de células congeladas de SM1 de líneas de células-B de memoria transformada por EBV, 3-7 y 9-11 se sometieron a total purificación de ARN con TRIZOL reactivo (Invitrogen). Los gránulos celulares se sacaron del congelador a -80°C y se lisaron inmediatamente con TRIZOL®. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se le agregaron 0.2 mililitros de cloroformo (Roth, Alemania) por 1 mililitro de TRIZOL® y los tubos se mezclaron gentilmente durante 1 minuto. Se incubaron los Usados durante 3 minutos sobre hielo y se centrifugaron a 14000rpm durante 15 minutos a 4°C. La fase superior acuosa se transfirió a un tubo fresco y se le agregaron 0.5 mililitros de isopropanol (Roth, Alemania) por 1 mililitro de TRIZOL®. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, los tubos se centrifugaron a 14000 revoluciones por minuto durante 10 minutos a 4°C. Se descartaron los sobrenadantes y los gránulos de ARN se lavaron con 1 mililitro de etanol al por ciento (Roth, Alemania). Los gránulos se secaron al aire durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, y se disolvieron mediante la adición de 30 a 50 microlitros de agua doblemente destilada libre de ARNsa (Fermentas Life Sciences), y mediante la incubación durante 10 minutos a 55°C. La concentración de ARN se midió mediante espectrofotometria UV y las muestras de ARN se almacenaron a -80°C. Se realizó la síntesis de ADNc de primera cadena utilizando un kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAidMR (Fermentas Life Sciences) siguiendo el manual de fabricación. 3.2 PCR semi-anidada Las regiones codificantes variables de anticuerpos humanos fueron amplificadas por PCR semi-anidada. La PCR semi-anidada se realizó mediante la ejecución de dos reacciones en cadena de la polimerasa (PCRs) sucesivas (los parámetros de PCR se muestran en la Tabla 3 a continuación), ambos con el mismo programa (TDNPCR1; Tabla 4a abajo), con diferentes cebadores 5' hacia adelante y la misma mezcla de cebadores 3' en reversa (Tabla 5 abajo; todos los iniciadores de segmento J juntos). Como una plantilla para la primera PCR se usó 1 microlitro de ADNc. Para la segunda PCR se usó 1 microlitro del producto de PCR de la primera PCR (sin diluir o diluida 1:10 - 1:100, según el rendimiento de ADN después de la primera PCR). El ADNc de todas las líneas de la EBV se amplificaron mediante combinaciones de todos los cebadores VH, VK y \ ?. Se utilizaron cinco diferentes cebadores hacia adelante en combinación con cinco cebadores en reversa para amplificar las regiones variables de cadena ligera kappa (Tabla 5a). Se utilizaron tres diferentes cebadores hacia adelante en combinación con 4 cebadores en reversa diferentes para amplificar las regiones variables de cadena ligera lambda (Tabla 5b). Se utilizaron seis cebadores hacia adelante diferentes en combinación con cuatro cebadores en reversa diferentes para amplificar las regiones variables de cadena pesada (Tabla 5c).
En todas las líneas de EBV se amplificaron más de una región variable de cadena pesada y ligera. Las regiones variables amplificadas se digirieron con Hind I i l/Eco47111 (cadenas pesadas y cadenas ligeras kappa) o con H i nd 11 l/Avrl I (cadenas ligeras lambda) y se clonaron en pCDNA3 (Invitrogen) que ya contenía las regiones codificantes constantes correspondientes para ?1, ? o ? humanas, tal como se describe en el Ejemplo 3.4.
Los productos resultantes de la PCR de longitud predichos fueron ligados finales contundentes en PCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) y tras el análisis de la secuencia, las regiones variables se sub-clonaron en pCDNA3 (Invitrogen) como se describe en Ejemplo 3.4. Sin embargo, para aumentar además el rendimiento de las regiones variables de cadena ligera de ? amplificado, se optimizaron las condiciones de PCR (FWUWPCR de programa de PCR, ver Tabla 4b a continuación).
Tabla 3: Parámetros de PCR Tabla 4: Programas de PCR a) TDNPCR1 FWUWPCR Tabla 5a: Cebadores para amplificar la región variable cadena ligera ? 1.+ 2. Cebadores en reversa de PCR (3') Mezcla "JK1-5" : 66-Je + 67-Je + 68-Je + 69-Je + 70-Je Nombre Número Secuencia SEQ ID Tabla 5b: Cebadores para amplificar la región variable cadena lambda ? Tabla 5c: Cebadores para amplificar la región variable cadena pesada 3.3 Vector de preparación de columna vertebral Las regiones variables amplificadas se clonaron en un vector de pCDNA3 (Invitrogen) que contenía las regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina apropiado. Para la clonación de regiones variables de cadena pesada de construcción pd1612-Je (pCDNA3-EGFP-CY) se digirió con Hindlll/Eco47lll (genera dos bandas de 6505bp y 727bp), se desfosforiló con CIP y el fragmento 6505bp se purificó con gel. Para la clonación de las regiones variables de cadena ligera lambda, la construcción pd1864-Je (VA2-Avrll(-) pCDNA3-2-4 se digirió con HindIII/Avrll (genera dos bandas de 5858bp y 394bp), se desfosforiló con CIP y el fragmento 5858bp se purificó con gel. Para la clonación de las regiones variables de cadena ligera kappa, la construcción pd703-Je (pCDNA3-ITC88 V ) se digirió con H ind 11 l/E co47111 (genera dos bandas de 6050 bp y 392 bp), se desfosforiló con CIP y la banda de 6050 bp se purificó con gel. 3.4 Preparación de inserción Los productos de PCR de las regiones variables de anticuerpo amplificado se purificaron con gel, se digirieron con Hindlll/Eco47lll (regiones de variable de cadena pesada y cadena ligera kappa) o con HindIII/Avrll (regiones variables de cadena ligera lambda) y entonces, se ligaron al marco en un vector pCDNA3 que contiene la región constante de inmunoglobulina apropiada utilizando ligasa de T4 de ADN según lo recomendado por el fabricante de la enzima. La ligadura de ADN se realizó durante la noche a 16°C. Como una excepción a este método, los productos de PCR de las regiones variables de anticuerpos VA1 de SM1 y SM4 VA1 VA2 SM9 primeramente se ligaron en los extremos romos en PCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) siguiendo el manual de usuario del kit de ligadura de extremo romo (Invitrogen). Después de analizar las secuencias de diversas mini-preparaciones, únicamente los clones que contienen secuencias VA de buena fe se digirieron con Hindlll/Avrll y las regiones variables fueron purificadas con gel y se sub-clonaron en el vector pCDNA3 adecuado (pd 1864-Je; ver más abajo). Se revistió 1 microlitro de cada ligadura electroporada en células DH10B (1900V/5 ms). Luego se revistieron 200 microlitros de las bacterias electroporadas en placas LB-agar + 100 microgramos/mililitro de ampicilina. De cada construcción, se recogieron aproximadamente 10 colonias, que crecieron durante la noche y se realizaron mini-preparaciones (cada colonia también se trató con placa de LB-agar + 100 microgramos/mililitro de ampicilina). Se realizó una digestión de control para identificar clones positivos con H ind II l/Eco47111 (H/E) para las construcciones con una cadena pesada o una cadena ligera kappa y con Hindlll/Avrll (H/A) para las construcciones con la cadena ligera lambda. Se analizaron los clones positivos en secuenciación de ADN con cebador 179-Je (secuencia: 5' AGA GAA CCC GCT TAC TG 3'; SEQ ID No: 196).
Como se mencionó anteriormente, una minoría de regiones variables se clonaron primero en una red troncal de vector de pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen). Después del análisis de la secuencia, los clones positivos se sub-clonaron en vectores de pCDNA3 como se describió anteriormente. Para la preparación de inserto, se digirieron Pd1887-Je (VA1_J pCR4Blunt-TOPO-SM9L7 # 2) y pd1888-Je (pCR4Blunt-TOPO-SM1 VI1_JI7 # 4) con Hindlll/Avrll. Las regiones variables (394 bp) fueron purificadas con el gel y se ligaron a pCDNA3. Se electroporó 1 microlitro de cada ligadura en células DH10B (1900V/5 ms). Se revistieron 250 microlitros de las bacterias electroporadas en placas de LB-agar + 100 microgramos/mililitro de ampicilina. Se recogieron cinco colonias de cada ligadura, se realizaron mini-preparaciones y se digirió el ADN con Hindlll/Avrll para identificar los clones positivos.
En la Tabla 6 a continuación, se presenta un compendio del número de regiones variables de cadena pesada (HC) de anticuerpos y regiones variables de cadena ligera (LC) clonadas a partir de células humanas de B transformadas por EBV. Los anticuerpos neutralizantes 46 (última columna) son el resultado de diferentes combinaciones de 18 cadenas pesadas únicas y 18 cadenas ligeras lambda únicas. Ninguna de las combinaciones de cadenas pesadas con cadenas ligeras kappa resulta en los anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV). Todas las cadenas pesadas (familia VH1; 151 aminoácidos, incluyendo la secuencia líder) se derivan de un gen V-línea germinal: IFN-1. Todas las cadenas ligeras lambda (familia VA1; 128 aminoácidos, incluyendo la secuencia líder) se derivan de un gen V-línea germinal: IGVA1-51. Estas regiones variables de los anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) están marcadas en negrita en la Tabla 6. Las cadenas ligeras y pesadas, derivadas de otros genes V-línea germinal también se recuperaron pero no tuvo como resultado la generación de anticuerpos neutralizantes. Ül Ül Ül Tabla 6: Compendio de anticuerpos anti-CMV clonados a partir de nueve líneas de EBV * Indica la cadena clonada a partir de 3 líneas SM diferentes.
La siguiente Tabla 7 da una visión general de todas las combinaciones de cadena ligera y pesada lambda que dan como resultado los anticuerpos neutralizantes. La Tabla 19, que se encuentra más adelante, resume los números de SEQ ID del listado de secuencias adjunto, para las cadenas ligeras y pesadas de CDRs de los anticuerpos neutralizantes que se muestran en la siguiente Tabla 7.
Tabla 7: Combinaciones de anticuerpos de cadena Pesada y Ligera 3.5 Purificación del ARN y síntesis de la primera cadena del ADNc La purificación del ARN de los gránulos de células congelados a partir de las líneas de células-B de memoria SM10, SM12, 2C2, 1G2 transformadas por EBV, se llevó a cabo utilizando el Mini Kit RNeasy® (Qiagen) de acuerdo con el manual del fabricante. La síntesis del ADNc se llevó a cabo utilizando el Kit de Síntesis de ADNc del Transcriptor de Alta Fidelidad (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 3.6 PCR anidada A partir del ADNc sintetizado en el Ejemplo 3.5 anterior, se amplificaron las regiones codificantes variables de anticuerpos humanos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada ejecutando dos reacciones en cadena de la polimerasa (PCRs) sucesivas (los parámetros de la PCR se muestran en la Tabla 8) empezando a partir de 1 a 2 microlitros de ADNc como plantilla. Ambas reacciones en cadena de la polimerasa (PCRs) se realizaron con el mismo programa (Tabla 9) con diferentes cebadores hacia adelante 5' y cebadores en reversa 3' (Tabla 10). Como una plantilla, para la primera ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se utilizaron 50 nanogramos de ADNc de plantilla y, para la segunda ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se utilizaron de 1 a 2 microlitros del producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (purificado mediante el Kit de Purificación de PCR QIAGEN) desde la primera ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADNc de todas las líneas de EBV se amplificó mediante las combinaciones de cebadores VH, V y VA para la primera ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se muestra en la Tabla 10a, y las combinaciones de cebadores VH, VK y VA para la segunda ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se muestra en la Tabla 10b. Para la segunda ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se seleccionó un cebador de 'ajuste óptimo' para la secuencia obtenida a partir de la primera ronda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Tabla 2, Tiller y colaboradores., ibíd.).
Tabla 8: Parámetros de PCR Sistema dNTPack de PCR de Alta Fidelidad Expand Regulador de Alta Fidelidad Expand 1x (con MgCI2 15mM) dNTPs de Alta Fidelidad ExpandMR 10mM/dNTP 20pmol de cada cebador 50ng de ADN de plantilla o 1-2µ? de ADNc Mezcla de Enzimas de Alta Fidelidad ExpandMR 2.6U Tabla 9: Programa de PCR Tabla 10a: Cebadores para la primera ronda de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Tabla 10b: Cebadores para la segunda ronda de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se subrayan los sitios de corte de enzimas de restricción 3.7 Clonación del vector de expresión Antes de la clonación, las alícuotas de las cadenas VH, VK y VA de segundos productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR de QUIAGEN según las instrucciones del fabricante y en secuencia con el cebador hacia adelante o en reversa respectivo (Tabla 10). Se analizaron las secuencias mediante IgBLAST (GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para identificar segmentos de línea germinal V (D) J con mayor identidad.
Las regiones variables amplificadas de las líneas de EBV fueron digeridas con africanas/Sall (cadena pesada ?1), africanas/BsiWI (cadena ligera ) o africanas/Xhol (cadena ligera ?) y clonadas en los vectores de expresión humanos I g ? 1 , Ig ? y IgA que contienen una secuencia del péptido señal Ig de gen murino (Número de adhesión de GenBank: DQ407610) y un sitio de clonación múltiples sobre la corriente de las regiones constantes de humanos, I g Y 1 , IgK o IgA. También está presente en el vector de expresión un promotor del citomegalovirus (CMV) humano para conducir un gen de resistencia a ampicilina para la selección y transcripción. Se realizó la ligadura en un volumen total de 20 microlitros con tipo 1U T4 DNA-ligasa (Invitrogen), 7.5 microlitros de digerido y purificado por medio del producto de PCR y 25 nanogramos del vector alineado. Las bacterias de E.coli DH10B (Invitrogen) competentes se transformaron en 42°C con 2 microlitros del producto de ligadura en placas de 96 pozos por electroporación o por transformación de choque térmico. Las colonias fueron examinadas mediante PCR usando el cebador hacia adelante 5' (5'-GCT TCG TTA GAA CGC GGC TAC-3 '; SEQ ID No: 315) y cebador en reversa 3' de IgG interno (5'-GTT CGG GGA AGT AGT CCT TGA C - 3'; No SEQ ID: 316), el cebador en reversa 3'C 494 (5' GTG CTG TCC TTG CTG TCC TGC T 3'; SEQ ID No: 317) o el cebador en reversa 3' de CA (5' CAC CAG TGT CGG CTT GTT CGG TTG 3'; No SEQ ID: 318), respectivamente. Los productos de PCR del tamaño esperado fueron secuenciados para confirmar la identidad con los productos PCR originales.
En la Tabla 11, a continuación, se presenta un resumen del número de las regiones variables de cadena pesada (HC) de anticuerpos y regiones variables de cadena ligera (LC) clonadas a partir de células humanas de B transformadas por EBV. Los cuatro anticuerpos neutralizantes (última columna) son el resultado de la combinación de 4 cadenas pesadas únicas y singulares lambda o cadenas ligeras kappa. Las cadenas pesadas se derivan de dos genes V-línea germinal: IGHV4-39 y IGHV4-59. Las cadenas ligeras kappa se derivan de dos genes V-línea germinal: IGKV2D-28 y 33 de la IGKV1D y la cadena ligera lambda se deriva del gen V-línea germinal: humanizada-47. La cadena ligera lambda derivada del gen V-línea germinal IGLV3-10 no tuvo como resultado el reconocimiento de antígenos cuando se combinó con una cadena pesada. Las combinaciones del anticuerpo neutralizante de cadenas ligera y pesada se describen en la Tabla 12 que se encuentra más adelante.
OI OI OI Tabla 11 : Compendio de anticuerpos anti-hCMV clonados a partir de cuatro líneas de EBV Tabla 12: Combinaciones de anticuerpo de cadena Pesada y Ligera La Tabla 19, mostrada más adelante, resume los números de la SEQ ID de la lista de secuencia de acompañamiento, para las cadenas ligeras y pesadas de CDRs de los anticuerpos neutralizantes que se muestra en la Tabla 12 anterior.
Ejemplo 4: Expresión v purificación de anticuerpos recombinantes La caracterización adicional de los anticuerpos anti-CMV clonados requiere su expresión y posterior purificación.
Cuarenta y seis de los anticuerpos recombinantes (Ab-01 a Ab- 46) se expresaron por transfección transitoria de células CHO (DS Z, Braunschweig, DE). Brevemente, las células se sembraron en placas de cultivo celular (diámetro de 10 centímetros; Greiner Bio-One, GmbH) con una densidad de 2.2 x 106 células cada plato en medio de SF-IMDM (Invitrogen) que contenía 2% de FCS (Sigma).
Después de 24 horas, se preparó la mezcla de transfección preparada por medio de la mezcla de 1 mililitro MEM (PAA Laboratories) con 6.45 microgramos de plásmidos de expresión de cadena pesada, 6.45 microgramos de vector de expresión de cadena ligera y 12.9 microlitros de reactivo de transfección de MATra (IBA GmbH, Góttingen, DE) por placa. Esta mezcla de transfección se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. El medio de las células sembradas se intercambió por 10 mililitros de MEM y la mezcla de transfección se añadió a las células gota a gota. Posteriormente, el plato del cultivo se incubó en una placa magnética (IBA GmbH) durante 15 minutos. El medio, luego, se aspiró y se le agregaron 10 mililitros de medio de SF-IMDM con 2% de FCS que contenían niveles ultra bajos de IgG bovina (Lonza) a las células. 24 horas más tarde, se renovó el medio. Después de dos días adicionales, se renovó el medio y el sobrenadante de anticuerpos recombinantes que contenía se cosechó por centrifugación a 244 gramos durante 5 minutos. El sobrenadante de cultivo de células se cosechó tres días más tarde, condicionado nuevamente por centrifugación y despejado, se combinaron los sobrenadantes que contenían anticuerpos.
Un dispositivo de ultrafiltracíón Vivacell 70 (MWCO 10kDa; Sartorius Stedim Biotech) se utilizó para concentrar el sobrenadante de cultivo de células acondicionado 100 veces por centrifugación a 1.000 gramos y 20°C durante 1 hora. Para la purificación de anticuerpos recombinantes, una columna de proteína A HP de trampa Spin (GE Healthcare) se equilibró con el regulador de enlace (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH de 7.5) y se cargaron a 300 microlitros del concentrado. La columna se selló con una tapa y se incubó en un mezclador más extremo a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la columna de centrifugado se centrifugó durante 1 minuto a 150g. Después de lavar la columna con 400 microlitros de regulador de enlace y centrifugación a 150g por 1 minuto, el proceso de carga se repitió otras tres veces hasta que todo el concentrado había sido cargado. Después del paso de la carga final, se lavó la columna cuatro veces mediante aplicación de 400 microlitros de regulador vinculante y posteriormente, centrifugación a 150g por 1 minuto. El anticuerpo recombinante unido se eluyó de la columna de giro dos veces añadiendo regulador de 200 microlitros de elución 100 mM glicina/HCI (pH 2.5) y centrifugación a 150g por 1 minuto. Los eluatos se neutralizaron inmediatamente con 30 microlitros de regulador de neutralización (Tris-HCIpH9.0 1 M). El regulador se intercambió mediante la carga de los eluatos combinados en una columna sobre Zeba. La columna Spin desalada (Pierce) se equilibró con PBS y posterior mediante centrifugación a 150g durante 2 minutos. Se almacenaron los anticuerpos recombinantes monoclonales en tubos de LoBind de proteína (Eppendorf) a 4°C hasta el procesamiento adicional para estudios de caracterización.
Los sobrenadantes del cultivo de anticuerpos producidos se analizaron para gB de reconocimiento por ELISA o Biacore, como se describe en los Ejemplos 1 y 5. Después se determinaron las concentraciones de IgG, tal como se describe en los Ejemplos 2 y 5, se analizaron los sobrenadantes de cultivo específico de gB para la actividad neutralizante, utilizando el ensayo de la luciferasa como se describe en el Ejemplo 2 (ensayo de luciferasa) utilizando células HFF de fibroblastos primarias. Se eligieron siete anticuerpos anti-CMV que mostraron actividades eficientes neutralizando el 50% para nuevos experimentos (ver Tabla 13 a continuación).
Tabla 13: Actividades neutralizantes de 50 por ciento de los anticuerpos monoclonales SM producidos por células CHO Los resultados reflejan los valores promedio de tres ensayos independientes. Las variaciones entre los ensayos fueron en el rango 10-20%. * Ohlin y colaboradores., (1993); a Cytotect (bioensayo) es una agrupación del citomegalovirus humano (hCMV) hiperinmune ig<3.
Para la expresión de los cuatro anticuerpos recombinantes Ab-47 a Ab-50, se siguió el método de acuerdo con Tiller y colaboradores, ibid. Dicho de una manera breve, las células HEK 293T (DSMZ, Braunschweig, DE) se cultivaron en matraces de 75cm2 (Greiner Bio-ona, GmbH) bajo condiciones convencionales en un medio de DMEM (GibcoBRL) complementado con FCS inactivado por calor al 10 por ciento (PAN Biotech GmbH), 350 microgramos/mililitro de L-glutamina (Merck), y 100 microgramos/mililitro de gentamicina (SERVA Electroforesis GmbH). Se llevaron a cabo las transfecciones transitorias de crecimiento exponencial de células 293T mediante precipitación de la confluencia celular CaP04 al 80 por ciento. Se mezclaron cantidades iguales (12.5-20 microgramos de cada una) de ADN de vector de expresión de cadena pesada y ligera correspondientemente en 1 mililitro agua estéril y se agregó por goteo CaCI2 2.5M a una concentración de 250mM. Se mezcló un volumen igual de regulador salino de HEPES dos veces con la solución de calcio-ADN en vórtex lento y se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto (temperatura ambiente 1 minuto + 1 minuto 37°C) para permitir la formación de precipitados. La mezcla de precipitación se distribuyó más tarde al plato de cultivo. Las células se lavaron con 10 mililitros de suero regulado con fosfato después de 6-8 horas y se cultivaron durante 6-7 días en 15 mililitros de DMEM antes de cosechar los sobrenadantes.
Los sobrenadantes cultivados se analizaron para el reconocimiento de gB mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 1. Después se determinaron las concentraciones de IgG, como se explica en el Ejemplo 2, se analizaron los sobrenadantes del cultivo específico de gB para neutralizar la actividad, utilizando el ensayo de luciferasa (como se describe en el Ejemplo 2) utilizando HFF de células de fibroblasto primario. Las actividades de neutralización del 50 por ciento de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células HEK-293T se muestran en la siguiente Tabla 14: Tabla 14: Actividades neutralizantes del 50 por ciento de los anticuerpos monoclonales producidos por células HEK-293T Los resultados reflejan los valores promedio de dos ensayos independientes.
*C23 es un anticuerpo específico de gB utilizado como control (T123; un tipo de donación a partir de Teijin Pharma Limited, Japón) Ejemplo 5: Caracterización de los anticuerpos anti-hCMV 5.1: Cuantificación de los anticuerpos de citomegalovirus humano (hCMV) utilizando tecnología de arreglos de la suspensión (Luminex®) Los sobrenadantes del cultivo celular que contienen IgG humano, se diluyeron en el regulador de ensayo (Roche, Cat# 1112589), y las diluciones se establecieron por duplicado en una placa de 96 medios pozos (Corning, Cat#3 884). Dicho de una manera breve, las muestras de 25 microlitros se incubaron en la oscuridad (20°C, 650rpm) durante 1 hora con 5 microlitros que contienen 1200 cuentas de Luminex-COOH cargadas por emparejamiento de amina con IgG-Fc específico anti-humana (Caltag, Cat#H10500). Se generaron las Curvas Estándares utilizando duplicados de 25 microlitros de una serie de dilución 1:3 (0.08 - 60 nanogramos/mililitro) de IgG humano ChromPure de toda la molécula (Jackson Immuno-Research, EUA Cat# 009-000-003). La detección se hizo mediante la adición de 30 microlitros de IgG-Fc específico anti-humano, marcado con R-PE (5 microgramos/mililitro; JIR Cat# 109-116-098), e incubación adicional durante 1 hora. Entonces se leyeron las placas y se analizaron en un instrumento Luminex 200 (Millipore) utilizando las siguientes posiciones: 100 cuentas, 50 microlitros del tamaño de muestra. 5.2: Cuantificación de proteína qB (hCMV) utilizando tecnología de arreglo de la suspensión Los sobrenadantes del cultivo celular que contienen gB (hCMV) se diluyeron en regulador de ensayo (Roche Cat# 1112589), y las diluciones se establecieron por triplicado en una placa de filtro de 96 pozos (Millipore Cat# MABVN 1250). Dicho de una manera breve, 25 microlitros de las muestras se incubaron en la oscuridad (20°C, 650rpm) durante 1.5 horas con 5 microlitros que contienen 1500 cuentas Luminex-COOH cargadas por emparejamiento de amina con el anticuerpo Vh3/65-V 1 /19 de hCMV-lgG anti-humano, un anticuerpo específico hCMV no neutralizado, pero de muy alta afinidad, previamente identificado en casa. Se generaron las curvas estándares utilizando triplicados de 25 microlitros de una serie de dilución de gB 1:3 (6-1458 nanogramos/mililitro). Se lavaron las placas dos veces (100 microlitros de suero regulado con fosfato por pozo) utilizando un recolector al vacío y para la detección de 50 microlitros del anticuerpo ITC52 se le agregó anti-hCMV-lgG biotinilado (5 microgramos/mililitro; generado en casa; Ohlin y colaboradores, 1993,), durante 1.5 horas adicionales. Después de dos pasos de lavado (con 100 microlitros de suero regulado con fosfato cada uno) con 50 microlitros, se agregaron 1.2 microgramos/mililitro de Neutravidina marcada con R-PE (Invitrogen, Cat# A2660), durante 30 minutos antes de leer las placas y de analizar utilizando el instrumento Luminex 200 (características: 100 cuentas, 40 microlitros por tamaño de muestra). 5.3: Biacore Se analizaron las interacciones de proteína-protelna mediante técnica de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento Biacore® T100 (Biacore, GE Healthcare, Munich) con software de control v 2.0.1 de Biacore® T100. Todas las interacciones se analizaron a 25°C en DPBS una vez con P20 (0.05 por ciento). Se ensayó cada interacción de enlace cuando menos dos veces. La proteína gB de hCMV se acopló al flujo celular de un chip sensor CM5 (matriz de dextrano carboximetilada, GE Healthcare) por medio del procedimiento de emparejamiento de amina estándar. La matriz de dextrano carboximetilada se activó con 1 -etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodi-imida (EDC) 0.4M, y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0.1 M de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Se activaron dos flujos celulares y la proteína gB se diluyó con acetato de sodio 10mM, pH 5.0, hasta 50 microgramos/mililitro y se inyectó a una velocidad de flujo de 5 microlitros/minuto hasta que se alcanzó un nivel apropiado de emparejamiento para los experimentos de enlace (5,000 unidades de resonancia) o para los experimentos cinéticos (2,000 unidades de resonancia). Se inactivaron los grupos no reactivos mediante la inyección dietanolamina-HCI 1M, pH 8.5. Se preparó un control de flujo celular de conformidad con lo anterior, con ovalbúmina (Imject, Pierce, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, lote JF124260) a un pH de 4.0. Antes de los experimentos de enlace, se lavaron a fondo los flujos celulares con regulador de corriente.
Para los análisis de enlace, se ajustaron los sobrenadantes del cultivo celular que contienen anticuerpos anti-gB específicos a 2.5 microgramos/mililitro de IgG mediante dilución en IgG de SF-IMDM ultra ligero al 2 por ciento, y se inyectaron durante 90 segundos en suero regulado con fosfato con albúmina de suero bovino al 0.02 por ciento y Tween 20 al 0.05 por ciento a 10 microlitros/minuto. Después de un tiempo de disociación de 90 segundos, se representó la estabilidad del enlace utilizando la Evaluación T100 del Software versión 2.0.1 de Biacore®.
Para el análisis cinético, se prepararon los fragmentos de Fab de los anticuerpos Ab-02, Ab-04, Ab-11, Ab-14, Ab-28, Ab-42 y ITC88, como control positivo, a partir de la proteína IgG humana purificada por A, utilizando papaína inmovilizada de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante (Pierce, Thermo Fisher Scientific). Los productos de disociación se confirmaron mediante SDS-PAGE con la detección del teñido con plata y mediante Fab/Fc de arreglo de gránulos Luminex®. Para los análisis cinéticos, se elevó la velocidad de flujo hasta 70 microlitros/minuto y se introdujeron tres curvas de blanco (concentraciones de cero) en cada proceso. La superficie se regeneró con glicina/HCI 10mM a un pH de 2.0. Se evaluaron las curvas de enlace utilizando el Software Biacore® T100 Evaluation versión 2.0.1 aplicando un modelo Langmuir 1:1 con ajuste global de Rmax.
Tabla 15: Compendio de índices de encendido y apagado, y KD calculada.
Basándose en tres mediciones sobre dos superficies de chip Biacore * Alcanza la limitación del método ** Basándose en dos mediciones sobre dos superficies de chip Biacore 5 La afinidad publicada (KD) para ITC88 sobre el antígeno pHM90-5 es de 2 nM (Ohlin y colaboradores, 1993) Ejemplo 6: Neutralización de diferentes genotipos de qB hCMV Se clasificaron las cepas de HCMV de laboratorio y aisladas clínicas en varios genotipos de gB (Chou y Dennison, 1991). Las actividades de los anticuerpos anti-hCMV neutralizados al 50 por ciento se determinaron utilizando genotipos de gB hC V diferentes adicionales, utilizando inmunofluorescencia indirecta como una lectura. Las cepas de virus Towne, AD169 y el Altu aislado clínico se clasificaron como el genotipo gB 1, el genotipo gB 2, y el genotipo gB 3, respectivamente. Se propagaron todas las cepas de virus en los fibroblastos de prepucio humano (HFFs) mediante procedimientos estándares y se determinaron las titulaciones de infectividad en los sobrenadantes virales mediante el método como se describe en Mahy y Kangro (1996). Un ensayo de inmunofluorescencia indirecta se llevó a cabo como se describe en Andreoni y colaboradores (1989). En breve, se incubaron diluciones en serie dos veces de seis anticuerpos monoclonales (Anticuerpos Ab-04, Ab-11, Ab-14, Ab-19, Ab-28 y Ab-42) con una cantidad de titulación del genotipo de gB hCMV respectivo (300 unidades formadoras de placas (pfu)) durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, se le agregaron mezclas de virus-anticuerpo al cultivo creciente de HFF para la confluencia en microplacas de 96 pozos. Se probaron todas las muestras por triplicado. Los sobrenadantes virales se removieron del HFFs, después de una incubación de 4 horas a 37°C y se reemplazaron del medio completamente. Después de otro periodo de incubación de 16 horas a 20 horas, las células se lavaron y se ajustaron con etanol. Las células infectadas se tiñeron utilizando el anticuerpo monoclonal p63-27, el cual es específico para la proteína temprana inmediata (IE) mayor, UL123, del citomegalovirus humano (hCMV) y los anticuerpos secundarios de IgG de anti-ratón conjugados por Cy3 (Jackson ImmunoResearch, EUA). Siguiendo el lavado extensivo, se contaron los núcleos IE positivos bajo un microscopio de fluorescencia y se calculó el porcentaje de neutralización como sigue: %-neutralización = 100 x (V0 - Vn)/V0, en donde Vn es el número de núcleos positivos de IE en los pozos que contienen virus y anticuerpo, y V0 es el número de núcleos positivos de IE en los pozos que se incubaron con virus solo. En general, se ajustó la dosis infecciosa para producir 1000 células infectadas por pozo. La Tabla 16 más adelante resume la actividad neutralizante del 50 por ciento de varios de los anticuerpos recombinantes sobre el citomegalovirus humano (hC V) representando diferentes genotipos de gB. Los anticuerpos monoclonales probados se encontraron para analizar los genotipos gB 1, 2 y 3 del citomegalovirus humano (hCMV) con una eficiencia comparable.
Tabla 16: Actividades neutralizantes del 50 por ciento de los anticuerpos monoclonales recombinantes contra 3 genotipos de gB de hCMV *(Ohlin y colaboradores, 1993) Ejemplo 7: Neutralización del citomegalovirus humano (hCMV) introducido en las células endoteliales, epiteliales y dend ríticas de los anticuerpos recombinantes Todos los ensayos de neutralización descritos en los ejemplos anteriores se llevaron a cabo utilizando fibroblastos como célu las objetivo. Para investigar si los anticuerpos recombinantes neutralizantes anteriormente identificados son capaces de neutralizar también la infección de las célu las endoteliales , epiteliales y dend ríticas , se utilizó u n aislado de H CMV endotelio- y epiteliotrópico TB40E (u na donación generosa proven iente del Dr.
Christian Sinzger, Instituto de Virología y Epidemiología Médica de Enfermedades Virales, Universidad de Tübingen, Alemania). Se propagó el TB40E en HFFs y se determinaron las titulaciones de la infectividad en sobrenadantes virales como es descrito por Mahy y Kangro (1996). Se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en un medio basal de células endoteliales EBM-2 complementado con el kit EGM-2MV (Lonza, Verviers, Bélgica), y se utilizaron para los experimentos en los pasajes 4-7. Se propagaron células epiteliales de pigmento de retina ARPE-19 humanas (ATCC CRL-2302) en un medio Eagle modificado por Dulbecco: Mezcla Nutriente F12, mezcla de 1:1, complementado con glutamina 2.5 mM, regulador Hepes 15 mM, HCI de piridoxina, 55 miligramos/litro de piruvato de sodio, suero de becerro fetal al 10 por ciento (inactivado por calor), 100 Unidades Internacionales/mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania). Las células dendríticas primarias (DC) se aislaron como sigue: Las células purificadas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes de sangre seronegativos para HCMV se incubaron en un medio RPMI-1640 complementado con 2mM de glutamina, 10 mM de regulador Hepes, 100 Unidades Internacionales / mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina en la presencia de suero autólogo (2 por ciento por volumen/ volumen, inactivado por calor) durante 2 horas a 37°C. Después del periodo de incubación, se removieron las células no adherentes mediante lavado con medio de cultivo de células y monocitos adherentes diferenciados en DCs después de la adición de IL-4 (25U/mililitro), y GM-CSF (800 U/m i I i I itro ) (CellGenix Technologie Transfer GmbH, Freiburg, Alemania) el día dos y cuatro después del aislamiento. En el día seis, se llevaron a cabo ensayos de neutralización mediante la incubación del anticuerpo y el virus durante 1 hora a 37"C como se describe anteriormente. La infección de DCs requirió una cantidad 500-veces mayor de partículas de virus. Las mezclas de anticuerpo-virus se agregaron a los DCs seguido por otro periodo de incubación de 12 horas. Después de la fijación y la permeabilización con Metanol enfriado en hielo, las células infectadas se tiñeron usando utilizando el anticuerpo monoclonal E13 (Morfosys AbD GmbH, Dusseldorf, Alemania), el cual es específico para la proteína mayor inmediata temprana (IE), UL123, del citomegalovirus humano (hCMV) y los anticuerpos secundarios IgG anti-ratón FITC-conjugados (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Se utilizó la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) como lector. Se usaron tanto el FlowJo 5.7.2. (Tree Star Inc. Ashland, OR), como el Graph Pad Prism 4 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA) para el análisis. Los resultados se resumen en las Tablas 17a y 17b.
Los ensayos de neutralización con células endoteliales y células epiteliales se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 6 utilizando una prueba de inmunofluorescencia indirecta como lector; sin embargo se hicieron las siguientes modificaciones a ese método: se incubaron HUVECs en EBM-2 complementado con EGM- 2M V-kit sin hFGF-B durante 1 hora a 37°C antes de la infección. Esto fue necesario para remover la heparina asociada a FGF, el cual mostró un efecto inhibidor sobre la infección. Adicionalmente, una cantidad 10 veces mayor de partículas virales (3000 unidades formadoras de placas (pfu)) se aplicó tanto para la infección de HUVECs como de ARPE.
Se observó que todos los anticuerpos probados neutralizan la infección de las células endoteliales, epiteliales y dendríticas con una eficiencia comparable con la neutralización de HFFs (véanse las Tablas 17a y 17b más adelante).
Tabla 17a: Comparación de las actividades de neutralización al 50 por ciento de los anticuerpos monoclonales probados en diferentes tipos de células (Ohlin y colaboradores, 1993) ° Se analizaron las células dendríticas de seis diferentes donantes seronegativos de HCMV. Se muestran las concentraciones más baja y más alta de IgG para la neutralización al 50 por ciento. n.d.: no determinado Tabla 17b: Comparación de las actividades de neutralización al 50 por ciento de los anticuerpos monoclonales probados en diferentes tipos de células *C23 anticuerpo de control; n.d.: no determinado Ejemplo 8: Caracterización del Epítopo de los anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano (hCMV) 8.1 Ensayo de competición de enlace al epítopo mediante Biacore de anticuerpos novedosos anti-hC V Para el análisis de competición de enlace al epítopo, se acoplaron los anticuerpos Ab-02 (18'900 RU), Ab-04 (16'800 RU), y Ab-28 (18'300 RU) a las células de flujo de un chip censor CM5 por medio de acoplamiento estándar de amina. Se preparó una célula de control de conformidad con lo anterior, utilizando un anticuerpo irrelevante IgG 1 humano (12'500 RU). Antes de los experimentos de enlace, se lavaron minuciosamente las células de flujo con regulador corriente. Se capturó la proteína gB de hCMV sobre los anticuerpos anti-gB inmovilizados durante 180 segundos a una velocidad de flujo de 5 microlitros/minuto a partir del sobrenadante de una línea celular 6-H5 de CHO produciendo gB (lote 080527 KS), la cual contenía aproximadamente 13 microgramos/mililitro de gB. Se aplicaron los anticuerpos secundarios de referencia ITC48 (AD-1 epítopo gB de reconocimiento), ITC52 (AD-1 epítopo gB de reconocimiento), y ITC88 (AD-2 epítopo gB de reconocimiento) en una concentración de 1000nM. Se analizó el enlace en suero regulado con fosfato con albúmina de suero bovino al 0.02 por ciento y Tween 20 al 0.05 por ciento a una velocidad de flujo de 30 microlitros/minuto. Se regeneró la superficie con 10 mM de glicina a un pH de 1.8. Se evaluaron las curvas de enlace utilizando el Software de evaluación Biacore® T100 versión 2.0.1. Los resultados se resumen en la Tabla 18 más adelante en donde ' + ' indica que el anticuerpo de enlace secundario podría enlazar una proteína gB al mismo que el anticuerpo de captura inmovilizado.
Todos los anticuerpos probados (anticuerpo de captura inmovilizado Ab-02, Ab-04 y Ab-28) parece que se enlazan a los epítopos gB que están fuera de los AD-1 y AD-2 epítopo gB reconocido por los anticuerpos de referencia ITC48, ITC52, ITC88, ya que los anticuerpos de referencia fueron capaces de enlazar eficientemente a la proteína gB al mismo tiempo que los anticuerpos probados.
Tabla 18: resumen del mapeo del anticuerpo epítopo mediante Biacore® 8.2 Análisis del epítopo novedoso reconocido por los anticuerpos anti-hCMV Para investigar adicionalmente si los anticuerpos de la presente invención reconocen o no los dominios antigénicos conocidos en gB, dominio antigénico-1 (AD-1), y dominio antigénico-2 (AD-2), se realizó un ELISA. Con este fin, AD-1 (una proteína de fusión expresada procarióticamente), y AD-2 (un péptido sintético, pep90, secuencia de aminoácidos: NETIYNTTLKYGDVVGV (SEQ ID No: 197), Meyer y colaboradores, 1992) ambos se recubrieron a 1 microgramo/mililitro en placas de ELISA. Se incubaron 50 microlitros de sobrenadante no diluido por pozo durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó el ELISA como se describe en el Ejemplo 1 anteriormente. El análisis ELISA reveló que los anticuerpos de la presente invención son específicos para AD-1- ni para AD-2, mediante lo cual se confirma el ensayo de competición de Biacore del Ejemplo 8.1.
Con el objeto de identificar positivamente los epítopos reconocidos por los anticuerpos de la presente invención, se construyó un vector de expresión de mamífero que codifica los aminoácidos 100-447 de gB. Esta región comprende todos los aminoácidos entre los epítopos gB AD-1 y AD-2. Se llevó a cabo la transfeccion transitoria de las células Cos-7 con esta construcción de expresión con Lipofectamina R 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección, las células se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, se fijaron y se permeabilizaron con metanol frío. Después de lavar con suero regulado con fosfato, las células se incubaron con anticuerpo primario (anticuerpos probados o anticuerpos de control) durante 45 minutos a 37°C en una atmósfera húmeda. Después de otro paso de lavado, se incubaron los porta objetos con IgG anti-humana conjugada con o IgG anti-ratón conjugada con FITC (Jackson ImmunoResearch, EUA) durante 45 minutos a 37°C en una atmósfera húmeda. Después de lavar los porta objetos con suero regulado con fosfato, se aplicaron cubiertas de porta objetos utilizando el DAPI que contiene medio de montaje VECTASHIELD® (LINARIS GmbH, Wertheim-Bettingen, Alemania).
Se documentó el enlace de anticuerpo mediante microscopía de fluorescencia (Axioplan 2, Cari Zeiss Microlmaging GmbH, Jena). Se mostró que los anticuerpos monoclonales Ab-02, Ab-04, Ab-28 recombinantes, neutralizantes específicamente reaccionan con la proteína gB truncada que cubre los aminoácidos 100-447 (AD169; SEQ ID NO: 239). Por consiguiente, el dominio de enlace de anticuerpos monoclonales neutralizantes, recombinantes Ab-02, Ab-04, Ab-28 se ha identificado positivamente que se localiza dentro de una región codificada por los aminoácidos 100-447 de gB (numerados de la cepa AD169 de gB; SEQ ID NO: 239). Esto demuestra inequívocamente que los anticuerpos monoclonales Ab-01 a Ab-46 de la presente invención reaccionan con un epítopo antigénico novedoso de la proteína gB y no con epítopos conocidos AD-1 y AD-2 de la proteína gB que son reconocidos por los anticuerpos monoclonales humanos identificados anteriormente en la técnica anterior. 8.3: La competición ELISA con anticuerpos anti-hCMV Con el fin de determinar la competición potencial entre un número de anticuerpos anti-hCMV versus el anticuerpo Ab-50 anti-hCMV para enlazarse a la proteína gB, se realizó un ELISA utilizando un método similar al descrito en el Ejemplo 1. En breve, una dilución en secuencia de los anticuerpos Ab-47, Ab-48, Ab-49, C23 (control), ITC52 (específico para AD-1), ITC88 (específico para AD-2), 89-104 (específico para gH) o 89-109 (específico para gH) se incubó previamente en suero regulado con fosfato/2 por ciento FCS, con una concentración constante de Ab-50 (0.5ng por pozo; denominado 'Mezcla de Anticuerpos') en una placa de 96-pozos para prevenir el enlace prematuro de gB por cualquiera de anticuerpos investigados. En adición, se prepararon cinco pozos de Ab-50 solo en una concentración de 5ng por pozo para determinar el OD450 de Ab-50 sin un anticuerpo de competición potencial. Placas ELISA de 96-pozos (Nunc) se recubrieron con 25ng por pozo de proteína gB en regulador de carbonato, pH de 9.6 durante 16 horas a 4°C. Las placas cubiertas de gB se lavaron tres veces con suero regulado con fosfato complementado con 0.1 por ciento Tween (regulador de lavado de ELISA), y se bloquearon durante 2 horas con suero regulado con fosfato/2 por ciento FCS (regulador de ELISA regulador), y se lava nuevamente tres veces con regulador de lavado de ELISA. Las placas se incubaron luego con 50 microlitros de la mezcla de Anticuerpos diluida en suero regulado con fosfato/2 por ciento FCS durante 1 hora a 37°C. Después de otro paso de lavado, se reveló el enlace de Ab-50 utilizando anticuerpos secundarios específicos anti-? acoplados con peroxidasa (anticuerpos-online.com). Después de un periodo de incubación de 1 hora, se removió el anticuerpo secundario no enlazado mediante lavado y se determinó la actividad enzimática utilizando reactivo de tetrametil- bencidina (TMB) en una concentración de 100 microlitros por pozo (1:1 mezcla de sustrato de peroxidasa TMB y solución de peroxidasa B, (KPL, Inc. EUA). Después de la incubación durante 5min a temperatura ambiente, se detuvo la reacción con 100 µ I 1M de ácido fosfórico por pozo. Se detectó la absorción (densidad óptica (OD)) a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas Emax y el software Softmax Pro 3.0 (Molecular Devices, EUA) se utilizó para el análisis.
En donde existió competición entre los anticuerpos probados y el Ab-50, se observó una reducción de la señal de OD450 en cada Mezcla de Anticuerpos cuando se compara con el Ab-50 solo. Adicionalmente, se realizó un ELISA de gB con idénticas concentraciones de IgG con el objeto de visualizar el enlace de todos los anticuerpos probados a gB. Aquí se realizó la detección utilizando anticuerpos secundarios específicos del fragmento Fcy acoplados con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, EUA). Los resultados se muestran en la Figura 4 y demuestran que Ab-50 compite para enlazarse a la proteína gB con los anticuerpos Ab-47 y Ab-49. No se observó competición entre Ab-48 y Ab-50 (Figura 4a). En adición, no se observó competición para enlazarse a la proteína gB entre Ab-50 y los anticuerpos ITC52 (específico para AD-1), ITC88 (específico para AD-2), 89-104 (específico para gH), 89-109 (específico para gH)-(Figura 4b), indicando que Ab-50 reconoce un diferente epítopo sobre hCMV que estos anticuerpos y por consiguiente, no se enlaza a AD-1 o AD-2 en la proteína gB.
Ejemplo 9: Modelo estructural del citomegalovirus humano (hCMV) gB Ya que actualmente no hay información estructural disponible para la proteína gB del hCMV, se generó un modelo tridimensional de la conformación trimérica del ectodominio del citomegalovirus humano (hCMV) la cepa AD169 de gB (SEQ ID NO: 239) basado en la estructura de cristal del HSV-1 gB, el cual más probablemente representa la conformación de post-fusión (Heldwein y colaboradores, 2006). Este modelo de la estructura de post-fusión del gB de hCMV fue generado mediante procedimientos de modelación de homología estándares utilizando el programa MODELLER (Eswar y colaboradores, 2006), basándose en una alineación de secuencias con la estructura de plantilla del HSV-1 gB (Heldwein y colaboradores, ibid).
La glicoproteína B (gB) es la más conservada de todas las glicoproteínas de la envoltura del virus de herpes, y las secuencias de proteínas de HSV-1 y gB de hCMV comparten el 28 por ciento de identidad y 40 por ciento de similitud. El monómero gB de hCMV consiste en 906 aminoácidos (gB cepa AD169; SEQ ID NO: 239), de los cuales casi el ectodominio entero (residuos Tyr89 a Val700) se incluye en el modelo (Figura 3). Los dominios individuales I a V, los cuales se definieron anteriormente basándose en la estructura de HSV-1 gB, se pueden identificar claramente a partir del modelo de homología del citomegalovirus humano (hCMV) gB. El Dominio I (Dom I) ( I le -? 33 a Thr343) constituye parte de la interfase del trímero y se localiza proximal a la membrana. El Dom II discontinuo está compuesto de los residuos Leui2i a Asn132 y Cys344 a Ser 38 (Figura 3). Los bucles flexibles los cuales comprenden residuos Val30e a Glu 3i7 y Leu43g a His468 no se incluyen en el modelo, ya que no son resueltos en la estructura de la plantilla del HSV-1 gB. El Dom III comprende tres segmentos discontinuos, Ser95 a Cysm, Asn477 a Ser5 9> y Leu638 a Ser646 (Figura 3). Así como en HSV-1 gB, sus larga hélice a forma, junto con los segmentos respectivos a partir de los otros monómeros, la Forma la interfase del trímero. Dom IV (Tyr8g a Cys9 y Cys550 a Asp637) se localiza en la parte superior de la molécula y contiene el epítopo AD-1, mientras que el Dom V (Met647 a Asp69e) representa el elemento de puente entre la parte extracelular y la hélice de la transmembrana. La estructura global del monómero del gB de hCMV y también el arreglo de las subunidades en el trímero so por consiguiente, sugeridas para que sean muy similares a las de HSV-1 gB, como se esperaría a partir del grado de similitud de secuencias.
La estructura de cristal del HSV-1 gB se eligió como plantilla para los estudios de modelación, como dos estructuras de cristal de las proteínas gB del HSV-1 (Heldwein y colaboradores, ibid), y EBV (Backovic y colaboradores, 2009) ya existen. Estas proteínas exhiben una identidad de secuencia del 30 por ciento y muestran una estructura terciaria muy similar. La identidad de secuencia de la gB del citomegalovirus humano (hCMV) a estas dos proteínas de estructura conocida es del 28 al 33 por ciento, sugiriendo fuertemente que la gB de hCMV también comparte el mismo pliegue tridimensional. Se eligió HSV-1 gB como plantilla de modelación porque la resolución de la estructura del cristal es mucho mejor que la de EBV gB. El modelo resultante de gB del citomegalovirus humano (hCMV) se encontró que exhibe una buena geometría local y no se detectaron choques estéricos. En adición, pares de cisteínas se localizan en distancia de enlace disulfuro, indicando que no solamente las características globales, sino también los detalles estructurales locales fueron reflejados correctamente por el modelo. Este modelo también proporcionó la base para el diseño de una construcción que permitió la expresión de Dom II como una cadena de péptidos continua simple. Para este dominio, el cual es discontinuo en la secuencia de aminoácidos primaria, se designó un enlazador de cinco residuos para conectar las dos partes del dominio como se describe en el Ejemplo 10 más adelante.
Ejemplo 10: Reconocimiento de la proteína gB de hCMV mediante suero humano Para investigar el Dom I y Dom II para enlazar el anticuerpo, se construyeron los plásmidos de expresión que permitieron la síntesis de cualquiera de los dos dominios en células eucarióticas. En ambos casos la estrategia de clonación involucró la unión de una etiqueta de epítopo HA en la terminal amino del péptido respectivo con el fin de facilitar la detección.
Ejemplo 10.1: Expresión de la proteína qB de hCMV Dom II y reconocimiento mediante suero humano Basándose en el modelo estructural del citomegalovirus humano (hCMV) gB, se analizó, si el gB Dom II expresado recombinantemente sería inmunogénico durante una infección natural. Para este fin se construyó un vector de expresión eucariótico que permitió la expresión de Dom II células de mamífero. Dom II es un epítopo discontinuo que es generado por los aminoácidos 121-132 y los aminoácidos 344-438 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID NO: 239). Para expresar Dom II, las secuencias de nucleótidos que codifican para los residuos 121-132 y 344-438 específicos para gB se juntaron mediante un tramo de nucleótidos que codifica un enlazador flexible de cinco aminoácidos (lle-Ala-Gly-Ser-Gly; SEQ ID NO: 319). Esta secuencia de nucleótidos se insertó hacia dentro del vector de expresión pcUL132sigHA, un vector basado en pcDNA3.1 que contiene la secuencia de señales auténtica de la glicoproteína de envoltura gpUL132 del citomegalovirus humano (hCMV) (aminoácidos 1-27; SEQ ID No. 320; Spaderna y colaboradores, 2005), seguida por una etiqueta de epítopo (HA) de hemaglutinina de influenza (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 321). El Dom II que codifica la secuencia de nucleótidos se insertó corriente abajo de la secuencia de la etiqueta HA utilizando los sitios de restricción EcoRI y Xbal. La expresión de proteína correcta a partir del plásmido da lugar a una proteína de fusión de Dom II etiquetada HA, la cual es transportada a través del retículo endoplásmico y la red trans-golgi, y, por consiguiente, apropiadamente modificada por la glicosilación. La región de codificación para el Dom II discontinuo acoplado con enlazador fue sintetizado químicamente (GeneArt, Regensburg, Alemania).
Para analizar el péptido Dom II para el reconocimiento del anticuerpo, Dom II se expresó transitoriamente en las células Cos7 células y fue analizado para determinar su reactividad en inmunofluorescencia indirecta utilizando 13 sueros a partir de donantes seropositivos al hCMV seleccionados al azar. Las células Cos7 cultivadas sobre cubiertas de porta objetos de vidrio en placas de 24 pozos fueron transfectadas con 0.8 9 del ADN del plásmido de expresión que codifica al Dom II utilizando Lipofectamina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). 48 horas después de transfección las células se fijaron y permeabilizaron con metanol enfriado con hielo. Los sueros de los pacientes se agregaron entonces as el anticuerpo primario. Los anticuerpos del suero no enlazados se removieron mediante tres pasos de lavado pasos utilizando PBS. El enlace del anticuerpo primario a partir de sueros humanos se detectó con el anticuerpo secundario conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) (Dako, Hamburgo, Alemania). Se hizo contra teñido de núcleos celulares con DAPI (4',6-diamidino-2-fenil-indol). Se reunieron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2 adaptado con una cámara de dispositivo acoplado a la carga Visitron Systems (Puchheim, Alemania). Se procesaron las imágenes utilizando MetaView software y Adobe Photoshop.
Anticuerpos: Controles: monoclonal anticuerpo C23 humano específico para gB (TI-23; Meyer y colaboradores, 1990), monoclonal anticuerpo 14-16A murino específico para gN (Mach y colaboradores, 2000), y monoclonal anticuerpo SA4 murino específico para gH (Urban y colaboradores, 1992), murino anti-HA (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania), y murino anti-GST (BIOZOL, Eching, Alemania). Un plásmido con expresión total de gB (aminoácidos 1-906) sirvió como control adicional. Aunque todos los sueros mostraron una reacción positiva con el gB entero, solamente cuatro de 13 sueros tiñeron positivo para Dom II. Esto demuestra que Dom II es responsable de inducir anticuerpos durante la infección natura por el citomegalovirus humano (hCMV).
Para probar la frecuencia de que el suero del paciente que contiene anticuerpos dirigidos contra Dom II de gB sobre un panel más grande de sueros humanos y compararlo con la frecuencia de sueros que contienen anticuerpos contra los dominios antigénicos conocidos de gB, AD-1 y AD-2, la secuencia de codificación de Dom II fue expresada bacterianamente como una proteína de fusión GST, se purificó y se usa en ELISA. Los plásmidos para la expresión de las proteínas de fusión de Dom ll-GST (Glutationa-S-transferasa) en E. coli se generaron utilizando el vector de expresión pGEX-6P-1 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). El DNA del plásmido se utilizó para transformar DH10B de E. coli para la expresión de las proteínas de fusión GST. Las respectivas proteínas de fusión fueron inducidas y la forma soluble de la proteína se purificó a partir de Usados de E. coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para preparar una matriz de afinidad, 2.6mg de proteína de fusión purificada Dom ll-GST fue dializada contra un regulador de acoplamiento y conjugada a la Resina de Acoplamiento AminoLink Plus (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EUA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 4 mililitros de una preparación de globulina hiperinmune de hCMV, se diluye 1:3 (volumen/volumen) con suero regulado con fosfato, se pasó sobre 2 mililitros de cuentas acopladas al antígeno, seguida por el lavado extensivo con suero regulado con fosfato. Se eluyó IgG enlazada con 0.2M Glicina-HCI, pH de 3.0, en fracciones de 1 mililitro y las fracciones fueron dializadas contra PBS. Se determinó la concentración total de IgG mediante un ELISA. En breve, placas de poliestireno de 96-pozos se recubrieron con 100 nanogramos de IgG anti-humano de cabra anti-humano AffiniPure, específico para FCY (Jackson Immuno Research, West Grove, EUA) en 0.5M de regulador de carbonato, pH 9.6, durante la noche a 4°C. Diluciones en serie log2 de las fracciones eluidas en un volumen de 50 microlitros se le agregaron y se detectó la IgG enlazada utilizando una IgG anti-humana fragmento monoclonal F (ab)2 de cabra conjugada con peroxidasa policlonal, específica para Fcy. (Jackson Immuno Research, West Grove, EUA). Una preparación de IgG humana (Jackson Immuno Research, West Grove, EUA) con concentración conocida se utilizó como norma.
La pureza de la proteína de fusión Dom ll-GST fue >90 por ciento estimada a partir del teñido Coomassie de la proteína después del PAGE. Un total de 80 sueros aleatoriamente seleccionados a partir de individuos seropositivos al hCMV, como se determina mediante una prueba disponible comercialmente, fueron analizados. Diez sueros a partir de donantes negativos a hCMV sirvieron como controles negativos. Dentro del panel de sueros a partir de individuos seropositivos para hCMV la reactividad para gB fue del 100 por ciento, resaltando la alta inmunogenicidad de esta proteína (Figura 5). De acuerdo con nuestras observaciones previas, la reacción positiva con AD-1 de gB también fue del 100 por ciento. 57 por ciento de los sueros contenían anticuerpos contra AD-2 (Schoppel y colaboradores, 1996). La proteína de fusión Dom II fue reconocida por 94 por ciento de los sueros. Por consiguiente, Dom II representa otro dominio muy inmunogénico de gB. Ya que podría usarse como antígeno una proteína de fusión expresada procarióticamente, esto sugeriría que la glicosilacion de la proteína no es esencial para el enlace del anticuerpo. Las diferencias en la frecuencia de reconocimiento entre el análisis de inmunofluorescencia es que inicialmente se usaron para el análisis de los anticuerpos que enlazan a Dom II y el ELISA puede deberse a las diferentes sensibilidades de los ensayos.
En aras de la consistencia en nomenclatura de los dominios antigénicos gB, Dom II se designó AD-4.
Ejemplo 10.2: Expresión de la proteína gB de hCMV Dom I con una etiqueta HA y reconocimiento por sueros humanos Para expresar Dom I, la secuencia de nucleótidos que codifica para los aminoácidos 132-343 de la cepa AD169 de gB (SEQ ID NO: 239) se insertó en el vector de expresión pcUL132sigHA (descrito anteriormente) para generar el vector pcAD-5. Para analizar el péptido Dom I para el reconocimiento de anticuerpo, Dom I se expresó transitoriamente en células Cos7 y se analizó para determinar su reactividad mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando el mismo método que el descrito en el Ejemplo 10.1 anterior.
Los anticuerpos específicos de Dom I en sueros humanos se midieron en un ELISA de captura. Para la producción de anticuerpos recombinantes, células 293T en matraces de 75cm2 se transfectaron con 20 microgramos de ADN de plásmido pcAD-5 mediante precipitación de fosfato de calcio. Los matraces se incubaron durante 6 días y entonces las células y sus sobrenadantes se cosecharon. Para el ELISA de captura, se recubrieron placas de ELISA con 125ng/pozo de anticuerpo monoclonal anti-HA de ratón (Sigma), se lava, bloquea y se lava nuevamente, como se describe en el Ejemplo 8.3 anterior, y entonces se incuba con sobrenadante de células transfectadas 293T (que contienen HA-etiquetado Dom I) durante 2 horas a 37°C. Luego se enjuagan las placas y se incuban con suero humano en una dilución 1:50 durante 2 horas a 37°C. El anticuerpo no ligado se removió mediante lavado e IgG anti-humana o anti-ratón peroxidasa-conjugada (Dako, Hamburgo, Alemania), se le agregó a una dilución apropiada durante 1 hora. La placa se lavó entonces y 100µ? de sustrato de peroxidasa de TMB diluido 1:1 en una solución de sustrato de peroxidasa B (KPL, Inc. EUA), se le agregó durante 5min. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 microlitros 1M H3PO4 y se determinó la OD450 utilizando un lector de microplacas Emax (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemania). Las placas se lavaron y revelaron como se describe en el Ejemplo 10.1 anterior. Todos los anticuerpos se diluyeron en suero regulado con fosfato con 2 por ciento FCS. El enlace de anticuerpos analizado mediante inmunofluorescencia indirecta confirmó que los cuatro anticuerpos probados (Ab-47. Ab-48, Ab-49 y Ab-50) fueron reactivos con el péptido específico para Dom I- (los resultados no se muestran).
Habiendo identificado a Dom I como un nuevo objetivo para los anticuerpos neutralizantes, se volvieron a probar los sobrenadantes del anticuerpo clonal a partir de cuatro individuos para obtener información aproximadamente la frecuencia global de los anticuerpos específicos para Dom I en individuos infectados con hCMV. La frecuencia de memoria específica de Dom I en células-B fue variable entre diferentes donantes; sin embargo el 100 por ciento de los anticuerpos de Dom I (6/6) que fueron probados, mostraron actividad neutralizante (los resultados no se muestran).
Para obtener información sobre la frecuencia de reconocimiento de los anticuerpos Dom I, se determinó la reactividad de los anticuerpos contra Dom I en un panel de sueros más grande de individuos infectados (hCMV) citomegalovirus humano y comparándose con dominios antigénicos conocidos. Como se describe en el Ejemplo 10.1 anterior, un total de 80 sueros seleccionados al azar a partir de individuos hCMV seropositivos fueron analizados (Figura 5). Dom I fue reconocido por 57 por ciento de los sueros por consiguiente, indicando que este dominio representa un dominio antigénico sobre la proteina gB donde induce anticuerpos con alta frecuencia durante la infección.
En aras de consistencia en nomenclatura de los dominios antigénicos de gB, Dom I fue designado AD-5.
Ejemplo 11: Correlación entre la titulación del anticuerpo AD-4 (Dom II) y la capacidad de neutralización en sueros humanos Datos en la literatura apoyan la hipótesis de que gB es uno de los antígenos dominantes con respecto a la inducción de los anticuerpos neutralizantes durante la infección natural y se ha reportado una correlación entre la titulación de anti-gB y la capacidad de neutralización (Marshall y colaboradores, 1992). No está claro si esta correlación reside en una variedad de diferentes especificidades de anticuerpos dirigidas contra un número de diferentes epítopos o si un número limitado de dominios es responsable. Para investigar si los anticuerpos específicos Ad-4 (Dom II) contribuyen significativamente a la capacidad de neutralización global de un suero dado, determinamos la titulación de la neutralización en el panel de sueros y la correlacionamos con la titulación ELISA contra gB, AD-1, AD-2 y AD-4 recombinantes, respectivamente. Las proteínas se diluyeron entre 25ng y 200ng (dependiendo del antígeno) en 0.5M regulador de carbonato de sodio, pH 9.6, o en 6M urea (AD-1), y 50µ? se utilizaron para recubrir placas de microtitulación durante la noche a 4°C. Todos los siguientes pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Los pozos de reacción fueron enjuagados con suero regulado con fosfato complementado con 0.1 por ciento Tween 20 y bloqueados durante 2 horas con suero regulado con fosfato que contiene 2 por ciento de FCS. Se enjuagaron nuevamente las placas con suero regulado con fosfato complementado con 0.1 por ciento Tween 20 y se incubaron con anticuerpos monoclonales, suero humano, reacciones de anticuerpo policlonal eluído o suero de ratón (50µ?/????) durante 2 horas. El anticuerpo no enlazado se removió mediante lavado e IgG anti-humana o anti-ratón conjugada con peroxidasa (Dako, Hamburgo, Alemania) se le agregó a una dilución apropiada durante 1 hora. La placa se lavó y 100µ? de sustrato de peroxidasa tetrametil-bencidina (TMB) diluida 1:1 en solución de sustrato de peroxidasa B (KPL, Inc. EUA), se le agregó durante 5min. La reacción fue detenida mediante la adición de 100 µ I 1 M H3P04 y se determinó OD450 utilizando Lector de microplacas Emax (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemania). La dilución de todos los anticuerpos se hizo en suero regulado con fosfato con 2 por ciento de FCS. En todos los ensayos que incluyeron las proteínas de fusión gB, se examinó el respectivo compañero de fusión procariótico en paralelo y la densidad óptica sustraída de los valores obtenidos con la proteína de fusión con el gB.
Como se reporta anteriormente, hubo una correlación entre el reconocimiento de gB en ELISA y la capacidad de neutralización (Marshall y colaboradores, ibíd.). El análisis también mostró una correlación estadísticamente significativa entre la capacidad de neutralización y la titulación de enlace de anticuerpos contra AD-1 y AD-4 (Dom II) pero no AD-2 (Figura 6).
Ejemplo 12: AD-4 (Dom II) induce los anticuerpos neutralizantes de virus durante la infección natural Para investigar con mayor detalle la cuestión de si AD-4 induce los anticuerpos neutralizantes de virus durante la infección natural usamos dos enfoques: Primero, aislamos anticuerpos policlonal anti-AD-4 a partir de una preparación de IgG humana combinada utilizando la proteína de fusión AD-4-GST (Dom ll-GST) purificada como matriz de afinidad. Como se esperaba, la preparación de IgG humana contenía anticuerpos reactivos con un número de diferentes glicoproteínas de envoltura específicas para hCMV e un análisis de inmunofluorescencia indirecta después de la expresión transitoria de los respectivos complejos de glicoproteínas en las células Cos-7.
Segundo, probamos los anticuerpos monoclonales humanos específicos para gB que se dan a conocer en esta invención para enlazarse a AD-4. Se encontró que todos los anticuerpos recombinantes se enlazaron a AD-4 en inmunofluorescencia indirecta utilizando la proteína AD-4 transitoriamente expresada en células Cos7. Por consiguiente, AD-4 representa un epítopo conformacional que es reconocido por los anticuerpos monoclonales humanos que se dan a conocer en esta invención.
Para preparar una matriz para el aislamiento de los anticuerpos específicos para AD-4, 2.6mg de la proteína de fusión AD-4-GST purificada se acopla covalentemente con Sepharose y se utiliza para purificar por IgG específica para AD-4 a partir de 4 mililitros de la preparación de IgG humana. Se obtuvo un total de 127 g IgG. Las pruebas ELISA verificaron que la fracción (E3) de IgG purificada por afinidad (E3) mostró enlace específico con AD-4 y gB pero no con AD-1 y AD-2 (Figura 7a). Para excluir además la contaminación con la aminación de los anticuerpos AD-4 purificados por afinidad con anticuerpos dirigidos contra antígenos adicionales relevantes para la neutralización sobre hCMV realizamos análisis de inmunofluorescencia indirecta con células Cos7 que expresan transitoriamente gH o el complejo gM/gN; proteínas de envoltura viral que se sabe que inducen anticuerpos neutralizantes durante la infección natural (Shimamura y colaboradores, 2006; Urban y colaboradores, 1996). La fracción de IgG anti-AD-4 policlonal purificada no contiene anticuerpos detectables específicos contra complejos de envoltura no-gB. Más aún, la fracción de IgG estaba libre de IgM (no mostrado). La preparación de IgG purificada por afinidad (E3) se probó entonces en ensayos de neutralización. Se logró el 50 por ciento neutralización de la inefectividad del virus en concentraciones de IgG de aproximadamente 0.2 microgramos/mililitro, lo cual está dentro del intervalo de los anticuerpos monoclonales humanos específicos para gB más potentes que se dan a conocer en esta invención (Figura 7b). En cambio, la combinación de sueros originales a partir de la cual se derivó la fracción IgG purificada por afinidad mostró el 50 por ciento de neutralización del virus de entrada a aproximadamente 200 microgramos/mililitro IgG (Figura 7b). En resumen, estos datos proporcionan más evidencia de que AD-4 no solamente representa a un dominio inmunogénico de gB, sino que también es el objetivo de los anticuerpos neutralizantes del virus.
Ejemplo 13: Especificidad de enlace de anticuerpos recom binantes humanos 13.1: Fina especificidad de enlace de anticuerpos recombinantes humanos con AD-4 El tamaño de AD-4 (>100 aminoácidos) es suficientemente grande para albergar varios epítopos que enlazan anticuerpos. Se ha encontrado cercana proximidad de epítopos que se pueden unir mediante anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes para AD-1 y AD-2 de gB y se han implicado como un mecanismo para evadir neutralización efectiva del virus. Por consiguiente, era de interés obtener más información sobre los epítopos potenciales dentro de AD-4. Intentos iniciales para recortar AD-4 mediante la omisión de los aminoácidos 121-132 en el extremo terminal amino o los últimos cinco aminoácidos en el extremo terminal carboxilo dio como resultado la pérdida completa del enlace del anticuerpo, lo que indica que solamente el dominio completo es capaz de formar la estructura de enlace de anticuerpo. Para identificar los residuos de contacto del anticuerpo potencialmente críticos dentro de AD-4, se construyó un número (n = 17) de plásmidos de expresión eucariótica que expresó péptidos mutantes AD-4, en cada uno de los cuales dos residuos expuestos a la superficie adyacentes fueron cambiados a alanina (Figura 8). La superficie de exposición de los residuos fue identificada del modelo de gB de hCMV como se describe en el Ejemplo 9.
Cuando los anticuerpos monoclonales humanos Ab-11, Ab-14, y Ab-28 se examinaron en inmunofluorescencia indirecta, después de la expresión transitoria de las proteínas AD-4 respectivas, se encontraron dos patrones de reconocimiento. El anticuerpo Ab-28 se enlazó a todas las proteínas mutantes de AD-4, mientras que los anticuerpos restantes no reconocieron a los mutantes en donde los residuos de Usina 378 y 379 fueron intercambiados por alanina. Esto demuestra que AD-4 es reconocido por los anticuerpos recombinantes monoclonales humanos que se dan a conocer en esta memoria descriptiva.
En adición, estos datos indican que la secuencia de di-lisina (K378K379) dentro de AD-4 representa un sitio crítico de enlace de anticuerpo. Sin embargo, es difícil cuantificar las señales obtenidas en inmunofluorescencia indirecta y hubo una posibilidad de que la falta de reacción con el péptido mutante AD-4G sólo estaba reflejando enlace reducido de los anticuerpos por debajo del límite de detección del ensayo. Por consiguiente, para obtener más datos cuantitativos y confirmar los resultados obtenidos por inmunofluorescencia indirecta, cinco de las proteínas mutantes AD-4 se expresaron como proteínas de fusión GST, purificadas y se utilizaron en un ELISA. La pureza de las proteínas de fusión GST fue comparable para todos los péptidos de AD-4 de tipo natural mostrados anteriormente en la Figura 5. Además del mutante AD-4G (K378K379), las proteínas de fusión incluyeron AD-4H (Q380E381), AD-4E (E359D362), y AD-4I (N383S385), los cuales afectan estéricamente los residuos adyacentes, así como el mutante más distantemente localizado AD-4L (N405T406). Los resultados obtenidos por el ELISA estuvieron de acuerdo con los datos de inmunofluorescencia. Con la excepción de AD-4G, las proteínas mutantes fueron reconocidas por los anticuerpos monoclonales con comparable eficiencia. AD-4G sin embargo, solamente fue reconocida por el anticuerpo Ab-28 (Figura 9a). De manera interesante, la fracción IgG purificada por afinidad mostró reactividad similar con todas las proteínas de fusión AD-4 indicando que la mayoría de los anticuerpos enlazan independientemente de la mutación AD-4G (Figura 9b). La preparación de IgG purificada por afinidad se derivó de una combinación de un número desconocido de donantes y, por consiguiente, se esperaría que se promediaran las diferencias individuales en el reconocimiento de los epítopos AD-4.
Para obtener más información de la especificidad potencial del epítopo AD-4, examinamos si dos Usinas en las posiciones 378 y 379 son también residuos importantes para la reactividad con los anticuerpos presentes en sueros humanos individuales. Para este fin, se examinaron los cinco péptidos mutantes AD-4 con el mismo panel de sueros que lo anterior y se calculó un cociente entre el valor más alto y más bajo de absorbencia para cada suero. Como se puede ver en la Figura 10, la mayoría de los sueros reconocieron a los cinco péptidos AD-4 con similar eficiencia dando como resultado una diferencia máxima baja de 1 a 5 veces. Sin embargo, cinco sueros mostraron diferencias máximas en el intervalo de 10 a 100 veces. De manera interesante, la diferencia se debió a un reconocimiento reducido de la proteína mutante AD-4G con una excepción. El suero con la diferencia máxima más alta mostró enlace reducido con la proteína mutante AD-4H (Q380E381), el cual en el modelo 3D de AD-4 se sitúa en cercana proximidad con el motivo di-lisina en AD-4G (K378K379). Por consiguiente, aunque el enlace de unos pocos sueros mostró una dependencia casi completa en la secuencia del péptido gB original entre 378 y 381, el reconocimiento de AD-4 por sueros humanos individuales fue en gran medida independiente de esta secuencia. En línea con este resultado fue el hallazgo de las fracciones IgG purificadas por afinidad utilizando la proteína mutante AD-4G como antígeno tuvieron un patrón de reconocimiento similar en ELISA de las proteínas mutantes AD-4 y titulación de la neutralización comparable con IgG purificada sobre AD-4 del tipo natural. 13.2: Fina especificidad de enlace de anticuerpos recombinantes humanos con AD-5 (Dom I) Experimentos similares a los descritos en el Ejemplo 13.1 anterior no pudieron ser realizados con AD-5 (Dom I) porque, en contraste con AD-4, AD-5 no se pliega correctamente después de la expresión procariótica y por consiguiente, no se puede generar antígeno por purificación por afinidad purificación. Sin embargo, fue posible subdividir AD-5 en dos dominios, los cuales fueron probados para determinar el reconocimiento de anticuerpos. Basándose en información estructural, AD-5 fue dividido en Subdominio 1 (AD-5-S1), el cual comprende los aminoácidos 133-144 y 251-343 de la proteína gB AD169 (SEQ ID No: 239), y Subdominio 2 (AD-5-S2), el cual comprende los aminoácidos 140-255 de la proteína gB AD169 (SEQ ID No: 239).
Con el objeto de determinar si los anticuerpos AD-5 descritos en la presente invención reconocieron estos subdominios, se realizó un ELISA de captura como se describe en el Ejemplo 10.2 en donde células 293T fueron transfectadas con subdominios AD-5-S1 y AD-5-S2, así como AD-4 + AD-5. Los anticuerpos Ab-47 a Ab-50 recombinantes de AD-5 se utilizaron para la detección en vez de sueros de pacientes. Los resultados de la inmunofluorescencia indirecta realizada mostró que los anticuerpos Ab-47 y Ab-50 reconocieron a AD-5-S1 (los resultados no se muestran). Los resultados a partir del ELISA de captura se muestran en la Figura 11, y éstos muestran que todos de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50 reconocieron gB AD-4 + AD-5 y que los anticuerpos Ab-47, Ab-49 y Ab-50 reconocieron gB AD-5 y en particular AD-5-S1. Ninguno de los anticuerpos Ab-47 a Ab-50 reconocieron gB AD-5 -S2. A partir de estos resultados se puede deducir por consiguiente, que los anticuerpos Ab-47, Ab-49 y Ab-50 reconocen un epítopo en la proteína gB que se localiza en AD-5-S1, es decir, dentro de los aminoácidos 133-144 y 251-343 de la proteína gB (cepa AD169; SEQ ID No: 239).
Ejemplo 14: Modelo de conformación por fusión previa de gB de hCMV Dentro de la estructura gB del citomegalovirus humano (hCMV) que fue modelado de acuerdo con HSV-1 gB, se sitúa AD-4 en un montecito en medio de la molécula. El motivo di-lisina es fácilmente accesible en la superficie. En ausencia de datos sobre la orientación de los anticuerpos de enlace AD-4 en el espacio tridimensional se puede predecir que el enlace de anticuerpo en esta conformación de proteína puede influenciar la interacción de gB con proteínas vecinas. Para varios virus de herpes, incluyendo hCMV, se sabe que gB necesita interactuar con glicoproteínas de envoltura adicionales con el objeto de funcionar adecuadamente durante el proceso de fusión (Avitabile y colaboradores, 2009; Patrone y colaboradores, 2007). Más probablemente, sin embargo, la HSV-1 gB representa la conformación de post-fusión. Este supuesto se basa en la homología estructural de la HSV-1 gB al VSV-G para lo que las estructuras tanto pre- como post-fusión previa están disponibles (Roche y colaboradores, 2006 y 2007). Se piensa que la forma de fusión previa es prevaleciente sobre el virión, mientras que la fusión posterior reside principalmente en algún, todavía indefinido, compartimiento celular. Los anticuerpos específicos para AD-4 aparentemente pueden reconocer ambas conformaciones de gB ya que se enlazan a formas celulares así como virales de gB. Ya que para VSV-G las formas de pre- y post-fusión muestran reconfiguraciones estructurales extensas de dominios de proteína individuales, modelamos la forma de fusión previa de gB del citomegalovirus humano (hCMV) con el objeto de obtener mayor percepción de la localización potencial de AD-4 dentro del trímero de la fusión previa y la posición de los residuos que son importantes para el enlace de anticuerpos.
Se tomaron dominios gB de hCMV simples I, II, III y IV a partir del modelo de la fusión posterior, y se sobrepusieron sobre la estructura de la fusión previa de VSV-G (Roche y colaboradores, 2007) utilizando el algoritmo MultiProt (Shatsky y colaboradores, 2004). El gB de hCMV dominio V y los residuos Leu469 a Arg496 del dominio III fueron excluidos, ya que ellos no son globulares y no hay estructuras equivalentes presentes en la plantilla de VSV-G. Los bucles de conexión entre los dominios ajustados individualmente fueron modelados con ModLoop (Fiser y colaboradores, 2003). El modelo de fusión previa trimérica se obtuvo mediante la aplicación de la geometría de fusión previa de VSV-G.
Aunque la conformación de la fusión posterior de gB de hCMV se puede modelar fácilmente basándose en la estructura de cristales homologa de HSV-gB, no hay información estructural experimental todavía disponible para la conformación de perfusión de esta familia de moléculas. A partir de los dos conformaciones de VSV-G, se sabe que los dominios de proteína individuales mantienen sus pliegues pero el arreglo relativo de los dominios cambia drásticamente después de la transición entre el estado de pre-fusión y post-fusión. Con el objeto de obtener más percepciones dentro de la localización potencial de AD-4 dentro del trímero de la fusión previa y de la posición de los residuos, lo cual es importante para el enlace de los anticuerpos, se creó un modelo hipotético de la conformación de la fusión previa de gB de hCMV. Para este fin, se obtuvieron los pliegues de dominio individuales a partir del modelo de fusión posterior y la información empleada sobre el arreglo del dominio a partir de la estructura de fusión previa de la glicoproteína G a partir de VSV-G (Roche y colaboradores, ibíd.). El modelo resultante no exhibe choques estéricos y las secuencias de unión son suficientemente largas para conectar los dominios en esta geometría alternativa sugiriendo que este arreglo de dominio es estructuralmente factible en gB de hCMV. El arreglo de dominio de la estructura de fusión previa de gB de hCMV es muy parecida a la del modelo previo de la conformación de perfusión de EBV gB que se generó basándose en la estructura de cristal post-fusión respectiva (Backovic y colaboradores, 2009).
Una diferencia clave entre la conformación de pre-fusión y post-fusión de gB de hCMV se encuentra en la composición de la parte apical de la proteína. En la conformación post-fusión esta región se forma mediante el dominio IV, en donde se localiza AD-1. En contraste, en modelo de pre-fusión Dom ll/AD-4 se sitúa en la parte superior de la molécula, con el motivo di-lisina (Lys378, Lys379) localizado en una posición central sobre la superficie apical de Dom ll/AD-4. Por consiguiente, la organización espacial de las moléculas de IgG enlazadas a la forma de pre-fusión de gB probablemente será diferente a la forma de post-fusión y podrá interferir con el enlace de gB a los componentes de la célula objetivo. Aparte de bloquear las interacciones con las moléculas no-gB, las moléculas de IgG enlazadas a Dom ll/AD-4 también podrían ser caces de restringir los cambios de conformación dentro de la proteína que podrían ser necesarias para la función adecuada.
Ejemplo 15: Ensayos de neutralización en la presencia de sueros humanos En un escenario clínico, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar de una manera profiláctica o terapéutica por medio de infusión intravenosa. Por consiguiente, es necesario excluir la posibilidad de que la función del anticuerpo se deteriore por la presencia de anticuerpos en el suero humano. Tres tipos diferentes de sueros se examinaron: suero negativo para los anticuerpos específicos para el citomegalovirus humano (hCMV), suero positivo los anticuerpos específicos para el citomegalovirus humano (hCMV) e Intratect® (Biotest AG), una preparación de suero hCMV enriquecida con anticuerpos específicos para CMV. Primero se determinó por titulación la concentración de IgG y la actividad neutralizante del 50 por ciento de cada suero analizado. Dicho de una manera breve, placas de ELISA se recubrieron con anticuerpo atrapador específico del fragmento FCY de IgG anti-humano, (Jackson ImmunoResearch, EUA). Diluciones en serie de dos-veces de sueros en regulador de ELISA se compararon con un estándar de IgG de concentración conocida (Jackson ImmunoResearch, EUA). La concentración de IgG se calculó usando el software de ELISA Softmax Pro 3.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Se determinó el 50 por ciento de actividades de neutralización de los sueros realizando un ensayo de neutralización basado en luciferasa como se describe anteriormente en el Ejemplo 2.
En seguida, en un ensayo de neutralización competitiva como se describió anteriormente en el Ejemplo 2, se tituló el anticuerpo Ab-28 de tal manera que cruzaría la marca del 50 por ciento de neutralización, antes de la adición de suero a una concentración constante. Se añadieron sueros que fueran cualquiera de negativos o positivos para los anticuerpos específicos para el citomegalovirus humano (hCMV e Intratect® al anticuerpo Ab-28 titulado a una concentración constante alrededor de su respectivo 50 por ciento-de actividad neutralizante. Como se muestra en la Figura 12, pareció no haber inhibición de la potencia neutralizante de Ab-28 por los anticuerpos de los sueros. Después de agregar suero negativo para hCMV al anticuerpo Ab-28 titulado, la curva se veía idéntica a la curva de Ab-28 solo. Este resultado indica que no hay un reactivo inespecífico en el suero humano que pudiera dañar la capacidad neutralizante de Ab-28. Al añadir suero positivo para hCMV o Intratect® al Ab-28, se observó un realce en la actividad neutralizante de Ab-28 y del suero. La actividad neutralizante del suero se incrementó en aproximadamente 20-40 por ciento en la presencia de Ab-28 y la capacidad neutralizante de Ab-28 se incrementó aproximadamente 15 por ciento después de la adición de suero positivo para hCMV o Intratect®.
Ejemplo 16: Ensayo de neutralización post-adsorción Con el fin de determinar si los anticuerpos de la presente invención podrían bloquear una etapa temprana de penetración del virus en las células, realizamos un ensayo de neutralización post-adsorción. El método del ensayo de neutralización fue similar al descrito en el Ejemplo 2; sin embargo inicialmente HFFs y hCMV que expresa luciferasa se incubaron durante 1 hora a 4°C para permitir sólo la adsorción del virus pero no la fusión del virus- y la membrana celular. Después de este periodo de adsorción, el virus no adsorbido se desechó lavándolo con 1xPBS. Los anticuerpos se titularon a partir de concentraciones muy altas de IgG de 150 microgramos/mililitro a 5 microgramos/mililitro en una placa separada y entonces se agrega a las mezclas de virus-células pre-adsorbidas. Los anticuerpos Ab-02, Ab-28, Ab-04 y un anticuerpo de control C23 (T123; una generosa donación de Teijin Pharma Limited, Japón) se utilizaron para este experimento y cada anticuerpo se incubó durante 30, 80 ó 120min a 4°C con las mezclas de virus-células pre-adsorbidas. Se ha demostrado que el anticuerpo C23 específico para AD-2 inhibe la penetración del virus en las células (Ohizumi y colaboradores, 1992). Después de los periodos de incubación de 30, 80 ó 120 minutos, se lavaron las placas una vez más y entonces se incubaron durante 48 horas a 37°C. A partir de este punto en adelante, el ensayo se continuó como el del Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Figura 13 y se resumen como sigue. Después de un periodo de incubación de 30 minutos, cuando menos 100 microgramos/mililitro de cada anticuerpo se requirió que lograra el 50 por ciento de reducción de infectividad del virus. C23, por otra parte, pareció inhibir la penetración del virus incluso en concentraciones muy bajas de 5 microgramos/mililitro después de una incubación de 30 minutos. Después de 80 minutos solamente 20 microgramos/mililitro de Ab-02 y Ab-28 se necesitaron para el 50 por ciento de neutralización. Para Ab-04 sin embargo, se requirieron 55 microgramos/mililitro para neutralizar la infectividad del virus en 50 por ciento. La curva de 80 minutos del anticuerpo de control C23 no mostró el resultado esperado. Se esperaría que este anticuerpo fuera cuando menos tan bueno, si no es que mejor, después de un tiempo de incubación más largo. También, los errores estándar de la media fueron muy dispersos para C23 en el periodo de incubación 80 minutos y por consiguiente, este punto de tiempo fue excluido de los resultados. Cuando se incubó el virus pre adsorbido con los anticuerpos durante 120 minutos solamente alrededor de 5-15 microgramos/mililitro de cada anticuerpo o C23 se requiere para una reducción del 50 por ciento de la infectividad viral. En conclusión, los anticuerpos Ab-02, Ab-28 y Ab-04 son capaces de prevenir la penetración de los virus ya adsorbidos en las células.
Ejemplo 17: Ensayos de neutralización competitiva con otros anticuerpos específicos para gB Se ha reportado la competición por el enlace del epítopo gB entre anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes para los anticuerpos específicos para AD-1 (Ohlin y colaboradores, 1993). Para investigar los posibles efectos competitivos o hasta sinérgicos entre los anticuerpos de la presente invención y otros anticuerpos específicos para gB, se llevaron a cabo ensayos de neutralización competitiva para determinar el efecto de los anticuerpos específicos para AD-1 (ITC52), y AD-2 (ITC88) anticuerpos sobre la actividad neutralizante de los anticuerpos de la presente invención. Para hacer esto, se tituló un anticuerpo y se añadió el otro anticuerpo a una concentración constante aproximada al 50 por ciento de su actividad neutralizante. Estos ensayos de neutralización competitiva se llevaron a cabo con cada uno de los anticuerpos: Ab-11 , Ab-14, Ab-19, Ab-28, Ab-04, Ab-42. Se compararon dos enfoques diferentes en donde se tituló el anticuerpo de prueba y se agregaron ITC52 ó ITC88 a una concentración constante o los anticuerpos ITC se titularon y el anticuerpo de prueba anticuerpo se agregó a una concentración constante. Ya que ITC52 es un anticuerpo no neutralizante, se agregó en una concentración de 3 microgramos/ mililitro, la misma concentración a la cual se le agregó el anticuerpo neutralizante ITC88. Solamente se muestran los datos para Ab-28, ya que los demás anticuerpos probados se comportaron de una manera similar. También, se muestra solamente un enfoque, es decir, dejando Ab-28 a una concentración constante y titulando el anticuerpo ITC, porque el enfoque alternativo mostró resultados comparables (Figura 14).
Los resultados indican que parece haber una leve dificultad de actividad neutralizante de Ab-28 en la presencia de una concentración alta del anticuerpo ITC52 específico para AD1. Se observó este efecto para cada anticuerpo probado y se ha reproducido en otro experimento independiente (los datos no se muestran). Sin embargo, una concentración alta de ITC52 parece no disminuir la actividad de neutralización de ITC88. Ab-28 e ITC88 juntos dieron como resultado una actividad de neutralización mejorada. Esto es visible en particular en el segundo punto de datos de ITC88 solo al contrario de cuando se mezcla. Se observa en este punto un aumento del 40 por ciento de la actividad neutralizante de ITC88 ante la presencia de Ab-28 mostrando el Ab-28 un aumento en la neutralización de aproximadamente el 15 por ciento con ITC88 que solo.
En adición al experimento anterior que analiza los efectos inhibidores, aditivos o sinérgicos potenciales entre diferentes anticuerpos específicos para AD-4 y específicos para AD-1 o AD-2, también investigamos si se podrían observar efectos similares entre los anticuerpos específicos para AD-4 (Dom II), y AD-5 (Dom I). Ab-28 (específico para AD-4) se mezcló con cualquiera de Ab-50 ó Ab-49 (específico para AD-5) en una proporción de 50:50 en primer pozo y continuó con 1:2 diluciones en serie antes de agregar hCMV con expresión de luciferasa. Las actividades neutralizantes de estas mezclas de anticuerpos se compararon con las titulaciones simples de los anticuerpos respectivos (Figura 15). Solamente se observó un ligero efecto entre los anticuerpos específicos para AD-4 y AD-5 sin efectos inhibidores o sinérgicos. Se repitió este experimento en otras dos ocasiones con resultados comparables (los datos no se muestran).
Tabla 19: Compendio de los números de las SEQ ID en el Listado de Secuencias acompañante, para CDRs de cadena pesada y ligera de los anticuerpos neutralizantes mostrados en las Tablas 7 y 13 anteriores.
Tabla 20a Tabla 20b LCDRl LCDR2 LCDR3 Secuencias Se muestran el dominio VH, el dominio VL y las secuencias de CDR de los miembros enlazadores en el listado de secuencias adjunto, en donde las SEQ ID NOS corresponden como sigue: 1 SM5-1 VH nucleótidos 2 SM5-1 VH aminoácidos 3 SM5-1 VH CDR 1 aminoácidos 4 SM5-1 VH CDR 2 aminoácidos 5 SM5-1 VH CDR 3 aminoácidos 6 SM4-10 VH nucleótidos 7 SM4-10 VH aminoácidos 8 SM4-10 VH CDR 1 aminoácidos 9 SM4-10 VH CDR 2 aminoácidos 10 SM4-10 VH CDR 3 aminoácidos 11 SM6-5 VH nucleótidos 12 SM6-5 VH aminoácidos 13 SM6-5 VH CDR 1 aminoácidos 14 SM6-5 VH CDR 2 aminoácidos 15 SM6-5 VH CDR 3 aminoácidos 16 SM1-6 VH nucleótidos 17 SM1-6 VH aminoácidos 18 SM1-6 VH CDR 1 aminoácidos 19 SM1-6 VH CDR 2 aminoácidos 20 SM1-6 VH CDR 3 aminoácidos 21 SM3-1 VH nucleótidos 22 SM3-1 VH aminoácidos 23 SM3-1 VH CDR 1 aminoácidos 24 SM3-1 VH CDR 2 aminoácidos 25 SM3-1 VH CDR 3 aminoácidos 26 SM11-17 VH nucleótidos 27 SM11-17 VH aminoácidos 28 SM11-17 VH CDR 1 aminoácidos 29 SM11-17 VH CDR 2 aminoácidos 30 SM11-17 VH CDR 3 aminoácidos 31 SM11-21 VH nucleótidos 32 SM11-21 VH aminoácidos 33 SM11-21 VH CDR 1 aminoácidos 34 SM11-21 VH CDR 2 aminoácidos 35 SM11-21 VH CDR 3 aminoácidos 36 SM6-11 VH nucleótidos 37 SM6-11 VH aminoácidos 38 SM6-11 VH CDR 1 aminoácidos 39 SM6-11 VH CDR 2 aminoácidos 40 SM6-11 VH CDR 3 aminoácidos 41 SM4-3 VH nucleótidos 42 SM4-3 VH aminoácidos 43 SM4-3 VH CDR 1 aminoácidos 44 SM4-3 VH CDR 2 aminoácidos 45 SM4-3 VH CDR 3 aminoácidos 46 SM5-3 VH nucleótidos 47 SM5-3 VH aminoácidos 48 SM5-3 VH CDR 1 aminoácidos 49 SM5-3 VH CDR 2 aminoácidos 50 SM5-3 VH CDR 3 aminoácidos 51 SM5-9 VH nucleótidos 52 SM5-9 VH aminoácidos 53 SM5-9 VH CDR 1 aminoácidos 54 SM5-9 VH CDR 2 aminoácidos 55 SM5-9 VH CDR 3 aminoácidos 56 SM1-7 VH nucleótidos 57 SM1-7 VH aminoácidos 58 SM1-7 VH CDR 1 aminoácidos 59 SM1-7 VH CDR 2 aminoácidos 60 SM1-7 VH CDR 3 aminoácidos 61 SM1-8 VH nucleótidos 62 SM1-8 VH aminoácidos 63 SM1-8 VH CDR 1 aminoácidos 64 S 1-8 VH CDR 2 aminoácidos 65 SM1-8 VH CDR 3 aminoácidos 66 SM3-4 VH nucleótidos 67 SM3-4 VH aminoácidos 68 SM3-4 VH CDR 1 aminoácidos 69 SM3-4 VH CDR 2 aminoácidos 70 SM3-4 VH CDR 3 aminoácidos 71 SM6-23 VH nucleótidos 72 SM6-23 VH aminoácidos 73 SM6-23 VH CDR 1 aminoácidos 74 SM6-23 VH CDR 2 aminoácidos 75 SM6-23 VH CDR 3 aminoácidos 76 SM11-18 VH nucleótidos 77 S 11-18 VH aminoácidos 78 SM11-18 VH CDR 1 aminoácidos 79 SM11-18 VH CDR 2 aminoácidos 80 SM11-18 VH CDR 3 aminoácidos 81 SM11-19 VH nucleótidos 82 SM11-19 VH aminoácidos 83 SM11-19 VH CDR 1 aminoácidos 84 SM11-19 VH CDR 2 aminoácidos 85 SM11-19 VH CDR 3 aminoácidos 86 SM11-20 VH nucleótidos 87 SM11-20 VH aminoácidos 88 SM11-20 VH CDR 1 aminoácidos 89 SM11-20 VH CDR 2 aminoácidos 90 SM11-20 VH CDR 3 aminoácidos 91 SM5-1 VL nucleótidos 92 SM5-1 VL aminoácidos 93 SM5-1 VL CDR 1 aminoácidos 94 SM5-1 VL CDR 2 aminoácidos 95 SM5-1 VL CDR 3 aminoácidos 96 SM4-10 VL nucleótidos 7 SM4-10 VL aminoácidos 8 SM4-10 VL CDR 1 aminoácidos 9 SM4-10 VL CDR 2 aminoácidos 100 SM4-10 VL CDR 3 aminoácidos 101 SM6-5 VL nucleótidos 102 SM6-5 VL aminoácidos 103 SM6-5 VL CDR 1 aminoácidos 104 SM6-5 VL CDR 2 aminoácidos 105 SM6-5 VL CDR 3 aminoácidos 106 SM1-6 VL nucleótidos 107 SM 1 -6 VL aminoácidos 108 SM1-6 VL CDR 1 aminoácidos 109 SM1-6 VL CDR 2 aminoácidos 110 SM1-6 VL CDR 3 aminoácidos 111 SM3-1 VL nucleótidos 112 SM3-1 VL aminoácidos 113 SM3-1 VL CDR 1 aminoácidos 114 SM3-1 VL CDR 2 aminoácidos 115 S 3-1 VL CDR 3 aminoácidos 116 SM5-6 VL nucleótidos 117 SM5-6 VL aminoácidos 118 SM5-6 VL CDR 1 aminoácidos 119 SM5-6 VL CDR 2 aminoácidos 120 SM5-6 VL CDR 3 aminoácidos 121 SM6-48 VH nucleótidos 122 SM6-48 VH aminoácidos 123 SM6-48 VH CDR 1 aminoácidos 124 SM6-48 VH CDR 2 aminoácidos 125 SM6-48 VH CDR 3 aminoácidos 126 SM4-3 VL nucleótidos 127 SM4-3 VL aminoácidos 128 SM4-3 VL CDR 1 aminoácidos 129 SM4-3 VL CDR 2 aminoácidos 130 SM4-3 VL CDR 3 aminoácidos 131 SM5-9 VL nucleótidos 132 SM5-9 VL aminoácidos 133 SM5-9 VL CDR 1 aminoácidos 134 SM5-9 VL CDR 2 aminoácidos 135 SM5-9 VL CDR 3 aminoácidos 136 SM4-12 VL nucleótidos 137 SM4-12 VL aminoácidos 138 SM4-12 VL CDR 1 aminoácidos 139 SM4-12 VL CDR 2 aminoácidos 140 SM4-12 VL CDR 3 aminoácidos 141 SM5-5 VL nucleótidos 142 SM5-5 VL aminoácidos 143 SM5-5 VL CDR 1 aminoácidos 144 SM5-5 VL CDR 2 aminoácidos 145 SM5-5 VL CDR 3 aminoácidos 146 SM3-2 VL nucleótidos 147 SM3-2 VL aminoácidos 148 SM3-2 VL CDR 1 aminoácidos 149 SM3-2 VL CDR 2 aminoácidos 150 SM3-2 VL CDR 3 aminoácidos 151 SM3-4 VL nucleótidos 152 SM3-4 VL aminoácidos 153 SM3-4 VL CDR 1 aminoácidos 154 SM3-4 VL CDR 2 aminoácidos 155 SM3-4 VL CDR 3 aminoácidos 156 SM4-1 VL nucleótidos 157 SM4-1 VL aminoácidos 158 SM4-1 VL CDR 1 aminoácidos 159 SM4-1 VL CDR 2 aminoácidos 160 SM4-1 VL CDR 3 aminoácidos 161 SM4-5 VL nucleótidos 162 SM4-5 VL aminoácidos 163 SM4-5 VL CDR 1 aminoácidos 164 SM4-5 VL CDR 2 aminoácidos 165 SM4-5 VL CDR 3 aminoácidos 166 SM4-7 VL nucleótidos 167 SM4-7 VL aminoácidos 168 SM4-7 VL CDR 1 aminoácidos 169 SM4-7 VL CDR 2 aminoácidos 170 SM4-7 VL CDR 3 aminoácidos 171 SM6-6 VL nucleótidos 172 SM6-6 VL aminoácidos 173 SM6-6 VL CDR 1 aminoácidos 174 SM6-6 VL CDR 2 aminoácidos 175 SM6-6 VL CDR 3 aminoácidos 176 SM6-51 VL nucleótidos 177 SM6-51 VL aminoácidos 178 SM6-51 VL CDR 1 aminoácidos 179 SM6-51 VL CDR 2 aminoácidos 180 SM6-51 VL CDR 3 aminoácidos 181 VH FWR1 82 VH FWR3 183 VH FWR3 (*02,*03,*04) 184 VH FWR4 (*01) 185 VL FWR1 186 VL FWR2 187 VL FWR3 188 IGHJ6*02 aminoácidos 189 IGHJ3*02 aminoácidos 190 IGHJ5*01 aminoácidos 191 IGHJ5*02 aminoácidos 192 IGLJ1*01 aminoácidos 193 IGLJ2*01 aminoácidos 194 IGLJ3*01 aminoácidos 195 IGLG3*02 aminoácidos 196 Cebador 179-Je 197 Péptido sintético 198 Cebador 0.74-¦Je 199 Cebador 075-Je 200 Cebador 076-¦Je 201 Cebador 150-¦Je 202 Cebador 151-¦Je 203 Cebador 077-¦Je 204 Cebador 078-¦Je 205 Cebador 007-¦Je 206 Cebador 152- -Je 207 Cebador 153· ¦Je 208 Cebador 066- -Je 209 Cebador 067- -Je 210 Cebador 068 -Je 211 Cebador 069 -Je 212 Cebador 070 -Je 213 Cebador 258 -Je 214 Cebador 259 -Je 215 Cebador 260 -Je 216 Cebador 261 -Je 217 Cebador 262 -Je 218 Cebador 263 -Je 219 Cebador 264 -Je 220 Cebador 265 -Je 221 Cebador 266 -Je 222 Cebador 267-Je 223 Cebador 84-B 224 Cebador 155-Je 225 Cebador 85-B 226 Cebador 161 -Je 227 Cebador 162-Je 228 Cebador 154-Je 229 Cebador 001-Je 230 Cebador 158-Je 231 Cebador 003-Je 232 Cebador 159-Je 233 Cebador 156-Je 234 Cebador 157-Je 235 Cebador 062-Je 236 Cebador 063-Je 237 Cebador 065-Je 238 Cebador 064-Je 239 gB Cepa AD169 240 gB cepa Towne 241 SM10 VH nucleótidos 242 SM10 VH aminoácidos 243 SM10 VH CDR 1 aminoácidos 244 SM10 VH CDR 2 aminoácidos 245 SM10 VH CDR 3 aminoácidos 246 SM12 VH nucleótidos 247 SM12 VH aminoácidos 248 SM12 VH CDR 1 aminoácidos 249 SM12 VH CDR 2 aminoácidos 250 SM12 VH CDR 3 aminoácidos 251 2C2 VH nucleótidos 252 2C2 VH aminoácidos 253 2C2 VH CDR 1 aminoácidos 254 2C2 VH CDR 2 aminoácidos 255 2C2 VH CDR 3 aminoácidos 256 1 G2 VH nucleótidos 257 1 G2 VH aminoácidos 258 1G2 VH CDR 1 aminoácidos 259 1G2 VH CDR 2 aminoácidos 260 1G2 VH CDR 3 aminoácidos 261 SM10 VL nucleótidos 262 SM10 VL aminoácidos 263 SM10 VL CDR 1 aminoácidos 264 SM10 VL CDR 2 aminoácidos 265 SM10 VL CDR 3 aminoácidos 266 SM12 VL nucleótidos 267 SM12 VL aminoácidos 268 S 12 VL CDR 1 aminoácidos 269 SM12 VL CDR 2 aminoácidos 270 SM12 VU CDR 3 aminoácidos 271 2C2 VL nucleótidos 272 2C2 VL aminoácidos 273 2C2 VL CDR 1 aminoácidos 274 2C2 VL CDR 2 aminoácidos 275 2C2 VL CDR 3 aminoácidos 276 1 G2 VL nucleótidos 277 1G2 VL aminoácidos 278 1G2 VL CDR 1 aminoácidos 279 1G2 VL CDR 2 aminoácidos 280 1G2 VL CDR 3 aminoácidos 281 IGHV4-39 FWR1 282 IGHV4-39 FWR2 283 IGHV4-39 FWR3 284 IGHV4-59 FWR1 285 IGHV4-59 FWR2 286 IGHV4-59 FWR3 287 IGKV2D-28 FWR1 288 IGKV2D-28 FWR2 289 IGKV2D-28 FWR3 290 IGKV1D-33 FWR1 291 IGKV1D-33 FWR2 292 IGKV1D-33 FWR3 293 IGLV1-47 FW1 294 IGLV1-47 FW2 295 IGLV1-47 FW3 296 Cebador 5'lg L VH 4/6 297 Cebador 5'lg L VK 1/2 298 Cebador 5'lg L VA 3 299 Cebador 5'lg L VA 1 300 Cebador 3'lg CY CH 1 301 Cebador 3'lg CK 543 302 Cebador 3'lg CA cadena 303 Cebador 5'lg Agel VH4 304 Cebador 5'lg Agel VK 2-24 305 Cebador 5'lg Agel VK 2-28 306 Cebador 5'lg Agel VA 3 307 Cebador 5'lg Agel VK 1-5 308 Cebador 5'lg Agel VH 4-39 309 Cebador 5'lg Agel VA 1 310 Cebador 3'lg Salí JH 311 Cebador 3'lg BsiWI JK 2 312 Cebador 3'lg Salí JH 6 313 Cebador 3'lg Bsi WIJK 1/4 314 Cebador 3'lg Xhol CA 315 Cebador 5' Ausente 316 Cebador 3'lgG Interno 317 Cebador 3'CK494 318 Cebador 3'CA 319 Enlazador sintético 320 gpUL132 Secuencia de seña 321 HA marca de epítopo Referencias Todas las referencias citadas en donde sea en esta memoria descriptiva, incluyendo aquéllas citadas en cualquier parte anteriormente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y para todos los propósitos.
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Claims (41)

REIVINDICACIONES
1. Un miembro enlazador aislado para la protelna gB del citomegalovirus humano (hCMV), el cual se enlaza a la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV) en una región dentro de los residuos 121 a 132 y 344 a 438, siendo definida la numeración de residuos de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de gB de la cepa AD169 de longitud completa SEQ ID No: 239, comprendiendo este miembro enlazador aislado un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde el conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) tiene 22 o menos alteraciones de aminoácidos a partir de un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en donde: HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 3; HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 4; HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 5; LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 93; LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 94; y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 95, y en donde el miembro enlazador tiene una KD de no más de 50 nM, como se define mediante resonancia de plasmón superficial.
2. El miembro enlazador aislado para la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV) de la reivindicación 1, el cual se enlaza a la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV) con una KD de no más de 1 nM, como se define mediante resonancia de plasmón superficial.
3. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la KD no es mayor de 0.5 nM.
4. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 2 o con la reivindicación 3, en donde la KD no es mayor de 0.1 nM.
5. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el miembro enlazador no se enlaza a un dominio antigénico 1 (AD-1) o a un dominio antigénico 2 (AD-2) de la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV).
6. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración del miembro enlazador requerida para una neutralización del 50 por ciento de un aislado clínico del citomegalovirus humano (hCMV) es de 10 microgramos/mililitro o menos en un ensayo de neutralización para la neutralización de la infección por el citomegalovirus humano (hCMV) de los fibroblastos de prepucio humano.
7. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 6, el cual comprende una HCDR1 en donde: el residuo de Kabat 31 es Asp o Gly; el residuo de Kabat 32 es His, Phe o Tyr; el residuo de Kabat 33 es Tyr; el residuo de Kabat 34 es Met, Me o Leu; y el residuo de Kabat 35 es Val o Asn.
8. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la HCDR1 es la SEQ ID No: 3.
9. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, el cual comprende una HCDR2 en donde: el residuo de Kabat 50 es Trp, Ser o Cys; el residuo de Kabat 53 es Gln, Asn o His; el residuo de Kabat 54 es Ser o Thr; el residuo de Kabat 58 es Gly, Lys, Asn o His; el residuo de Kabat 60 es Gly o Ala; y el residuo de Kabat 64 es Gln o Arg.
10. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 4.
11. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende una HCDR3 en donde: el residuo de Kabat 99 es Thr o Ala; el residuo de Kabat 100 es Val o Met; el residuo de Kabat 100A es Ser o Thr el residuo de Kabat 100B es Asn o Thr; el residuo de Kabat 100C es Ser o Phe; el residuo de Kabat 100E es Leu, Met o Ala; el residuo de Kabat 100F es Ser o Gly; el residuo de Kabat 100K es His o Tyr; el residuo de Kabat 100L es Asn, Ser o Asp; el residuo de Kabat 100M es Arg, Val o Me; el residuo de Kabat 100N es Leu o Met; el residuo de Kabat 101 es Asp o Gly; y el residuo de Kabat 102 es Ala, Val o lie.
12. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 5.
13. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde el residuo de Kabat 26 en la LCDR1 es Ser o Asn, o en donde el residuo de Kabat 27 en la LCDR1 es Ser o Arg.
14. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la LCDR1 es la SEQ ID No: 93.
15. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, en donde el residuo de Kabat 56 en la LCDR2 es Ser o Pro.
16. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la LCDR2 es la SEQ ID No: 94.
17. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende una LCDR3 en donde: el residuo de Kabat 89 es Gly o Ala; el residuo de Kabat 91 es Pro o Trp; el residuo de Kabat 93 es Arg o Ser; el residuo de Kabat 94 es Ser o Asp; el residuo de Kabat 95a es Ser, Gly o Ala; el residuo de Kabat 96 es Val o Tyr; y el residuo de Kabat 97 es Me o Val.
18. El miembro enlazador aislado de acuerdo con la reivindicación 17, el cual comprende una LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 95.
19. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde: HCDR1 es la SEQ ID No: 3; HCDR2 es la SEQ ID No: 4; HCDR3 es la SEQ ID No: 5; LCDR1 es la SEQ ID No: 93; LCDR2 es la SEQ ID No: 94; y LCDR3 es la SEQ ID No: 95.
20. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el miembro enlazador comprende una molécula de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, que comprende un dominio de anticuerpo VH, y en donde el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos del dominio VH mostrada en la SEQ ID No: 2.
21. El miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el miembro enlazador comprende una molécula de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, que comprende un dominio de anticuerpo VL en donde el dominio VL tiene la secuencia de aminoácidos del dominio VL mostrada en la SEQ ID No: 92.
22. Una molécula de anticuerpo aislada, la cual comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 92.
23. Una molécula de anticuerpo aislada, que se enlaza a la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV), en donde la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio VH cuando menos el 90 por ciento idéntica a la SEQ ID No: 2, y una secuencia de aminoácidos del dominio VL cuando menos el 90 por ciento idéntica a la SEQ ID No: 92.
24. Un miembro enlazador o una molécula de anticuerpo que compite para enlazarse a la proteína gB del citomegalovirus humano (hCMV) con un miembro enlazador o con una molécula de anticuerpo aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
25. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, en donde la molécula de anticuerpo es una IgG.
26. U n dom i n io VH aislado de una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 22 a 25.
27. Un dominio VL aislado de una molécu la de anticuerpo de acuerdo con cualqu iera de las reivindicaciones 21 a 25.
28. Una composición que comprende un miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivind icaciones 1 a 21 , o una molécu la de anticuerpo de acuerdo con cualq u iera de las reivind icaciones 22 a 25, y u n excipiente farmacéuticamente aceptable.
29. Una composición q ue comprende un miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , o una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, para utilizarse en un método para el tratamiento del cuerpo hu mano o animal mediante terapia.
30. La composición de acuerdo con la reivindicación 29, para utilizarse en el tratamiento de un trastorno asociado con el citomegalovi rus humano (hCMV) .
31 . Una composición que comprende un miembro enlazador aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , o una molécu la de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivind icaciones 22 a 25, para utilizarse en el tratamiento de u n trastorno asociado con el citomegalovirus humano (hCMV) .
32. La composición de acuerdo con la reivindicación 30 , o la composición para usarse de acuerdo con la reivindicación 31 , en donde el trastorno es u na infección por el citomegalovirus h u mano (hCMV).
33. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, la cual comprende además un miembro enlazador aislado o una molécula de anticuerpo que se enlaza a la proteína gB, gH, gl_, UL128, UL130 y/o UL131A del citomegalovirus humano (hCMV).
34. Un método para el tratamiento de un trastorno asociado con el citomegalovirus humano (hCMV) en un individuo, el cual comprende administrar un miembro enlazador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, o una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, al individuo, y de preferencia en donde el individuo tiene un sistema inmunológico comprometido.
35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el individuo es una mujer embarazada, un recién nacido, un receptor de trasplante, o un individuo infectado con VIH.
36. Una molécula de ácido nucleico aislada, la cual comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un miembro enlazador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, un dominio VH de acuerdo con la reivindicación 26, un dominio VL de acuerdo con la reivindicación 27, o una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25.
37. Una célula huésped transfectada in vitro o transducida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 36.
38. Un método para la producción de un miembro enlazador, una molécula de anticuerpo, o un dominio de anticuerpo VH o VL, el cual comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 37, bajo condiciones para la producción del miembro enlazador, la molécula de anticuerpo, o el dominio de anticuerpo VH o VL.
39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, el cual comprende además aislar y/o purificar el miembro enlazador, la molécula de anticuerpo, el dominio VH, o el dominio Vi_.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 38 o con la reivindicación 39, el cual comprende además formular el miembro enlazador, la molécula de anticuerpo, el dominio VH, o el dominio VL, en una composición que comprende cuando menos un componente adicional.
41. Un método para la neutralización del citomegalovirus humano (hCMV) en un sujeto o en una muestra, el cual comprende administrar a este sujeto o a esta muestra, un miembro enlazador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, o una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en una cantidad suficiente para reducir la infectividad del citomegalovirus humano (hCMV) por cuando menos el 50 por ciento, en una concentración de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5.0 microgramos/mililitro.
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