CN104334583A - 抗-hcmv特应抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗-特应HCMV抗体以及使用该抗体的方法。

Description

抗-HCMV特应抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗-HCMV特应抗体及使用抗-HCMV特应抗体的方法。
背景技术
人巨细胞病毒(HCMV)是β-疱疹病毒，也称为人疱疹病毒-5(HHV-5)。存在感染其他哺乳动物的其他物种的巨细胞病毒(CMV)，如鼠CMV(MCMV)、豚鼠CMV(GPCMV)、猿猴CMV(SCCMV)、猕猴CMV(rhCMV)和黑猩猩CMV(CCMV)。HCMV是感染近50％美国人群的常见疱疹病毒。对于绝大多数人感染个体，HCMV感染无症状。但是，在疾病和免疫抑制(例如，HIV感染、移植患者中药物诱发的免疫抑制)的条件下，HCMV再活化或原发性感染引起多种临床表现，如单核细胞增多症、肝炎、视网膜炎、肺炎、失明和器官衰竭。此外，在怀孕的背景下，原发性CMV感染的获得虽然对母亲没有多少后果，但在正在发育的胎儿中可以具有严重的临床后果。
先天性HCMV感染尤其重要，因为怀孕期间感染的母亲产下的许多孩子在子宫内感染，并患有破坏性临床疾病。在美国和欧洲，126,000名妇女在怀孕期间患有原发性HCMV感染，这些母亲产下的婴儿中约有40,000名患有先天性感染。在美国，750个孩子中有1个出生就患有或发展HCMV感染引起的残疾，包括智力低下、听力丧失、视力丧失、器官缺陷和生长缺陷。先天性HCMV感染是胎儿畸形最常见的感染性原因。在已发生孕妇原发性感染后，目前没有批准用于预防或治疗胎儿感染的疗法。
2005年，Nigro及其同事公开了一项研究，其中对患有原发性HCMV感染的孕妇施用人CMV超免疫球蛋白(HIG)(Nigro等(2005)New Engl.J.Med.353:1350-1362)。在该研究的一个臂中，HCMV感染的母亲产下的31名婴儿中只有一名出生就患有疾病，而未治疗的妇女产下的孩子中7/14(50％)出生就患有HCMV疾病。同上。
怀孕期间，HCMV可以经胎盘从感染的母亲传播至胎儿。将胎儿固着至子宫的胎盘包含特化上皮细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞和特化巨噬细胞。HCMV病毒表面包含多种病毒糖蛋白复合物，已显示这些病毒糖蛋白复合物为见于胎盘中的具体细胞类型的感染所需。包含gH/gL和UL128、UL130和UL131的CMV糖蛋白复合物(本文中称为“复合物I”)尤其为内皮细胞、上皮细胞和巨噬细胞的感染所需。包含gH/gL和gO的CMV糖蛋白复合物(本文中称为“复合物II”)尤其为成纤维细胞的感染所需。已显示HIG阻断病毒进入易受HCMV感染的全部四种胎盘细胞类型。
由于制备和广泛分布HIG的困难及医生和医学界不愿意使用人血液制品(尤其是在孕妇中)，产生包含可以保护胎儿免受先天性HCMV感染的一种或多种单克隆抗体的组合物将是最有益的。迄今尚未发展出用于预防CMV的母婴传播的单克隆抗体组合物。Lanzavecchia和Macagno公开了从感染患者的永生化B细胞分离的天然存在的抗体，该抗体结合产生自UL130和UL131的组合或UL128、UL130和UL131的组合的构象表位，中和CMV传播(美国专利公开号2008/0213265和2009/0081230)。Shenk和Wang公开了结合复合物I的蛋白质的抗体(美国专利号7,704,510)。Funaro等也在美国专利公开号2010-0040602中公开了抗CMV的中和抗体。此外，在两个患者群体(异源骨髓移植受体及患有AIDS和CMV视网膜炎的患者)中在人类中测试了抗-gH单克隆抗体MSL-109(Drobyski等,Transplantation 51:1190-1196(1991)；Boeckh等,Biol.Blood MarrowTransplant.7:343-351(2001)；和Borucki等,Antiviral Res.64:103-111(2004)而没有成功。
美国申请系列号13/248,998(在此以其整体引入作为参考)公开了人源化抗-HCMV单克隆抗体。对于抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞上的感染，已显示美国申请号13/248,998中公开的抗体具有与来自HCVM感染患者的人免疫球蛋白(HIG)相当的中和潜能。这些抗体用于例如预防、抑制和/或治疗HCMV感染、先天性HCMV感染及通过HCMV感染的移植组织发生的患者感染。
本领域存在检测生物样品和/或临床样品中的治疗性抗HCMV人源化单克隆抗体而不同时检测其他抗HCMV或不抗HCMV的抗体(例如内源免疫球蛋白)的需要。本发明提供特异性检测某些抗-HCMV抗体的抗-特应抗体。这些抗体用于例如药代动力学(PK)和药效学研究，以及用于定量和监测患者中的治疗性抗-HCMV抗体。
发明概述
本发明提供分离的抗-特应抗体，其特异性结合抗-HCMV单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明提供分离的抗-特应抗体，其特异性结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，或包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含来自含有SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体的全部六个HVR。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQID NO:13的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含来自含有SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的全部六个HVR。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQID NO:19的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR。在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR。在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的HVR-H2(SEQ ID NO:36)。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体结合包含在选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的氨基酸序列内的表位。在一些实施方案中，该抗-特应抗体结合包含在选自SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列内的表位。在一些实施方案中，该抗-特应抗体结合包含在选自SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列内的表位。
在一些实施方案中，将以上抗-特应抗体中的任一种与可检测标记缀合。在一些实施方案中，将以上抗-特应抗体中的任一种与生物素缀合。
本发明还提供使用本发明的抗-特应抗体的检测方法。在一个实施方案中，本发明提供用于特异性检测生物样品中的目的抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，其包括：(a)使该生物样品与捕获试剂接触并孵育，其中该捕获试剂是第1项的抗-特应抗体，以便结合存在于样品中的任意目的抗体；和(b)使该捕获试剂与结合该目的抗体的可检测抗体接触，并从而使任意结合的目的抗体与结合该目的抗体的可检测抗体接触，且用该可检测抗体的检测手段测量结合于该抗-特应抗体的目的抗体的水平，其中该目的抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合。
在该方法的一些实施方案中，将该捕获试剂固定至固体支持物，且该方法进一步包括将该生物样品从结合于存在的任意目的抗体的固定的捕获试剂分开的步骤。在一些实施方案中，该固定的捕获试剂包被在微量滴定板上。在一些实施方案中，该固定的捕获试剂与生物素缀合并结合至链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板上。
在该方法的一些实施方案中，该可检测抗体是结合人抗体的来自非人物种的抗体。在一些实施方案中，该可检测抗体是小鼠抗-人IgG Fcγ抗体。
在该方法的一些实施方案中，该可检测抗体可直接检测。在一些实施方案中，该可检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。在一些实施方案中，通过荧光测定试剂或量热测定试剂来检测该可检测标记。
本发明还提供用于特异性检测生物样品中的目的抗体的方法，其包括：(a)使该生物样品与特异性结合该目的抗体的抗-特应抗体接触并孵育；(b)使该样品与结合该抗-特应抗体的免疫亲和珠接触并孵育；(c)洗脱该目的抗体；(d)将该洗脱的目的抗体加至分离介质以实现一种以上样品组分的分开，其中分开的样品组分包含目的抗体或其片段或特征肽；和(e)通过质谱法测定一种或多种分开的样品组分的质量电荷比，其中该目的抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在与该免疫亲和珠孵育之后和洗脱该目的抗体之前或之后用蛋白酶处理该生物样品，在一些实施方案中，该蛋白酶是胰蛋白酶。
在该方法的一些实施方案中，该抗-特应抗体是生物素化的。在一些实施方案中，该抗-特应抗体结合链霉抗生物素蛋白包被的顺磁免疫亲和珠。
在该方法的一些实施方案中，该抗-特应抗体在与该生物样品接触和孵育之前结合于该免疫亲和珠。
在该方法的一些实施方案中，该免疫亲和珠是磁珠。
在该方法的一些实施方案中，该分离介质是层析支持物。
在上文公开的方法中任意种的多种实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
在上文公开的方法中任意种的多种实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
在上文公开的方法中任意种的多种实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR。在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的HVR-H2(SEQ ID NO:36)。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体结合该抗-HCMV抗体上包含在选自SEQ ID NO:25或SEQID NO:26的氨基酸序列中的表位。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体，该抗-特应抗体结合该抗-HCMV抗体上包含在选自SEQ ID NO:27或SEQID NO:28的氨基酸序列中的表位。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:3的轻链序列的第一抗-HCMV抗体及(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该抗-特应抗体结合该目的抗体而不结合样品中的至少一种其他抗-HCMV抗体。
在上文公开的方法中任意种的多种实施方案中，该生物样品分离自人对象。在一些实施方案中，该人对象已用抗-HCMV抗体治疗，该抗-HCMV抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该方法进一步包括用标准曲线来确定该目的抗体与已知水平相比的水平。
在上文公开的方法中任一种的一些实施方案中，该生物样品是血液、血浆或血清。在一些实施方案中，该样品是血清。
本发明还提供试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供用于特异性检测生物样品中的目的抗体的免疫测定试剂盒，该目的抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合；该试剂盒包含：(a)含有特异性结合该目的抗体的抗-特应抗体作为捕获试剂的容器；(b)含有结合该目的抗体的可检测抗体的容器；和(c)检测该目的抗体的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒在用于检测该目的抗体的ELISA法中使用。
在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含捕获试剂的固体支持物。在一些实施方案中，该捕获试剂固定在该固体支持物上。在一些实施方案中，该捕获试剂包被在微量滴定板上。
在多种实施方案中，该抗-特应抗体是上文公开的任意抗-特应抗体中的一种或多种。在一些实施方案中，该抗-特应抗体选自：(a)包含SEQ IDNO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列的第一抗-特应抗体；(b)包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列的第二抗-特应抗体；和(c)其组合。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体特异性结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含至少一个选自NO:13–24的重链高变区。在另一实施方案中，该抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在另一实施方案中，该抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
本发明还提供分离的编码本发明的抗-特应HCMV抗体的核酸。本发明还提供包含编码这类抗体的核酸的宿主细胞。本发明还提供产生抗体的方法，其包括培养包含编码该抗体的核酸的宿主细胞，使得产生抗体。该方法可以进一步包括从该宿主细胞回收该抗体。
附图简述
图1显示鼠mAb 4.25B10.15的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:5)与小鼠种系重链可变结构域区IGHV1-54*03(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列比对。框中是高变区(HVR)。突出显示不同于小鼠种系序列的氨基酸残基。
图2显示鼠mAb 4.25B10.15的轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:7)与小鼠种系重链可变结构域区IGKV5-39*01(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列比对。按照Kabat编号来编号氨基酸。框中是高变区(HVR)。
图3显示鼠mAb 1.9E1.1的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:9)与小鼠种系重链可变结构域区IGHV1-50*01(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列比对。框中是高变区(HVR)。突出显示不同于小鼠种系序列的氨基酸残基。
图4显示鼠mAb 1.9E1.1的轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:11)与小鼠种系重链可变结构域区IGLV1*01(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列比对。按照Kabat编号来编号氨基酸。框中是高变区(HVR)。突出显示不同于小鼠种系序列的氨基酸残基。
图5显示生物素缀合的抗-HCMV特应抗体(例如1.9E1.1)结合链霉抗生物素蛋白包被的平板及溶液中的治疗性抗-HCMV抗体的抗-HCMV PKELISA形式。然后通过与HRP缀合的小鼠抗-人IgG Fcγ抗体结合该复合物来进行化学发光检测。
图6显示用实施例2中所述的抗-HCMV PK ELISA测定的多种纯化的抗-特应抗体对抗-HCMV抗体抗-CI和抗-gH的结合活性。
图7显示用抗-特应单克隆抗体1.9E1.1作为实施例2中所述的抗-HCMV PK ELISA测定中的捕获抗体得到的掺入(spiked)抗-HCMV抗体抗-gH的各血清样品的回收。
图8显示抗-HCMV特应抗体(例如4.25B10.15)固定在固体支持物上来结合治疗性抗-HCMV抗体的抗-HCMV PK ELISA形式。然后通过与HRP缀合的小鼠抗-人IgG Fcγ抗体结合该复合物来进行化学发光检测。
图9显示用抗-特应单克隆抗体4.25B10.15或4.23F9.5作为实施例3中所述的抗-HCMV PK ELISA中的捕获抗体得到的掺入抗-HCMV抗体抗-CI的各血清样品的回收。对于混合样品及样品1-4，按4μg/mL(高)或0.5μg/mL(低)掺入抗-CI；对于样品5，按2μg/mL(高)或0.6μg/mL(低)掺入，对于样品6和7，按7.62μg/mL(高)或0.476μg/mL(低)掺入。
发明详述
I.定义
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量，包括本文中描述的那些。用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案在下文中描述。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体以外的包含完整抗体的部分的分子，其结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要种类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“检测”以最广泛的含义使用，包括靶分子的定性和定量测量二者。在一方面，用本文所述的检测方法来鉴定目的抗体在生物样品中的存在。在另一方面，用该方法来测试样品中的目的抗体是否以可检测的水平存在。还在另一方面，可以用该方法来定量该目的抗体在样品中的量，并进一步比较来自不同样品的抗体水平。
术语“生物样品”指可以包含目的抗体的任意生物物质。样品可以是生物液体，如全血或全血成分(包括红细胞、白细胞、血小板、血清和血浆)、腹水、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊膜液、乳汁、唾液、痰、泪液、汗液、黏液、脑脊液和身体的其他可以包含目的抗体的组分。在多种实施方案中，该样品是来自任意动物的身体样品。在一些实施方案中，该样品来自哺乳动物。在一些实施方案中，该样品来自人对象。在一些实施方案中，该生物样品来自临床患者或用一种或多种治疗性抗-HCMV抗体治疗的患者。在某些实施方案中，该生物样品是血清或血浆。在某些实施方案中，该生物样品是来自临床患者的血清。
术语“捕获试剂”或“包被抗体”指抗-特应抗体或这类抗体的混合物，其结合目的抗体的独特型，且能够结合和捕获生物样品中的目的抗体，使得可以在适宜的条件下将捕获试剂和目的抗体的混合物从样品的其余部分分开。
本文所用的“抗-特应抗体”是结合关联抗体(在此例中是目的抗体)的VH和/或VL结构域的抗体。通常，通过以下来制备这类抗-特应抗体：用目的抗体免疫诸如小鼠的哺乳动物，产生杂交瘤，从一系列源自杂交瘤的抗体选择在测定中产生最干净的信号的那些抗体，用于捕获试剂或可检测抗体。通常，捕获试剂是固定的或可固定的。这类抗-特应抗体是单克隆抗体，且可以是例如啮齿动物抗体，如鼠或大鼠抗体。
本文所用的术语“抗-复合物I抗体”、“抗-CI抗体”或“抗-CI”指包含SEQ ID NO：1的重链可变结构域和SEQ ID NO：2的轻链可变结构域的抗-HCMV抗体或包含至少一个HVR区的抗体，如下文所示：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWIGWINTYTGEPTYADDFKGRVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARSWYYVSNYWYFDVWGQGTLVTVSS    (SEQ ID NO： 1)
黑体下划线序列对应于SEQ ID NO：1的HVR-H1(SEQ ID NO：29)、HVR-H2(SEQ ID NO：30)和HVR-H3(SEQ ID NO：31)。
SVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIEWYQQQPGKGPRYLMKLKKDGSHSTGDGIPDRFSGSSSGADRYLTISNLQSEDEADYYCGVGDT IKEQFVYVFGGGTKLTVLG    (SEQ ID NO： 2)
黑体下划线序列对应于SEQ ID NO：2的HVR-L1(SEQ ID NO：32)、HVR-L2(SEQ ID NO：33)和HVR-L3(SEQ ID NO：34)。
本文所用的术语“抗-gH抗体”或“抗-gH”指包含SEQ ID NO：3的重链可变结构域和SEQ ID NO：4的轻链可变结构域的抗-HCMV抗体或包含至少一个HVR区的抗体，如下文所示：
EEQVLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSPYSVFWVRQAPGKGLEWVSSINSNSRYKYYADSVKGRFTISRDNAENSIFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSYYAFSSGSLSDYYYGLDVWGQGTLVTVSS  (SEQ ID NO： 3)
黑体下划线序列对应于SEQ ID NO：3的HVR-H1(SEQ ID NO：35)、HVR-H2(SEQ ID NO：36)和HVR-H3(SEQ ID NO：37)。
DIVMTQSPLSLSVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNYLDWYVQKPGQSPQLLIYLASNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYCMQA LQIPRTFGQGTKVEIK    (SEQ ID NO：4)
黑体下划线序列对应于SEQ ID NO:4的HVR-L1(SEQ ID NO:38)、HVR-L2(SEQ ID NO:39)和HVR-L3(SEQ ID NO:40)。
本文所用的“抗-CI特应抗体”是这样的抗体，该抗体特异性结合具有SEQ ID NO:1的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的抗-CI单克隆抗体，或结合包含具有SEQ ID NO:1的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的抗-CI单克隆抗体的全部六个高变区(例如SEQ ID NO:29-34)的抗-CI抗体，该抗体具有足够的特异性和亲和力用于检测抗-CI。
本文所用的“抗-gH特应抗体”是这样的抗体，该抗体特异性结合具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域序列的抗-gH单克隆抗体，或结合包含具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域序列的抗-gH单克隆抗体的全部六个高变区(例如SEQ ID NO:35-40)的抗-gH抗体，该抗体具有足够的特异性和亲和力用于检测抗-gH。
术语“可检测抗体”指这样的抗体，该抗体结合目的抗体，且能够通过由检测手段扩增的标记直接检测，或通过例如另一标记的抗体间接检测。在一些实施方案中，该可检测抗体是结合人抗体的来自非人物种的抗体。在一些实施方案中，该可检测抗体是结合目的抗体的特应型的抗-特应抗体或这类抗体的混合物。对于直接标记，该抗体通常与可通过某些手段检测的部分缀合。在一些实施方案中，该可检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。
术语“检测手段”指用于通过随后在本文的测定中读出的信号报告来检测该可检测抗体的存在的部分或技术。它包括扩大固定的标记(如捕获在微量滴定板上的标记)的试剂。
本文的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kaba等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号系统，也称为EU指数。
“构架”或“FR”指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，该人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择来自可变结构域序列亚组。通常，该序列亚组是Kabat等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是Kabat等,上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是Kabat等,上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，而全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基95-102(Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在CDR的称为缩短的CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有说明，本文按照Kabat等,上文编号可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)。
“个体(individual)”或“对象(subject)”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，该个体或对象是人。
本文所用的“婴儿”指年龄在从出生至不超过约一岁的范围内的个体或对象，且包括从0至约12个月的婴儿。
“分离的”抗体是已从其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的纯度大于95％或99％。评估抗体纯度的方法的综述见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
“分离的编码抗-特应抗体的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括单个载体或分开的载体中的这种(类)核酸分子，及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这种(类)核酸分子。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体的方法来产生抗体。例如，将要按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指天然存在的具有不同结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由形成二硫键的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配至两个类型之一，称为κ和λ。
术语“包装说明书”用来指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或有关这类治疗性产品的用途的警告的信息。
就参考多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口来达到最大百分比序列同一性，而不将任意保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术之内的多种方式来达到以测定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对，例如，使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内达到最大比对所需的任意算法。但是，为了本文的目的，用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，源代码已随用户文件提交美国版权办公室,Washington D.C.,20559，它在美国版权办公室注册在美国版权注册号TXU510087之下。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California公开可得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用在UNIX操作系统上，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变动。
在利用ALIGN-2来进行氨基酸序列比较的情况下，按以下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地叙述为，具有或包含与给定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：
100乘以分数X/Y
其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非明确地另有说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2计算机程序按前一段落中所述获得。
抗-HCMV抗体的“特征肽”指仅存在于一种抗体同种型中的蛋白酶解肽(例如胰蛋白酶消化肽段)。例如，抗-CI特征肽可以是仅存在于包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域的抗-HCMV抗体中的胰蛋白酶消化肽段。在另一实例中，抗-gH特征肽可以是仅存在于包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的抗-HCMV抗体中的胰蛋白酶消化肽段。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991))。
本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
在一方面，本发明提供特异性结合人源化抗-HCMV单克隆抗体抗-CI和抗-gH的抗-特应抗体。在某些实施方案中，提供结合抗-CI的抗-特应抗体。在某些实施方案中，提供结合抗-gH的抗体。本发明的抗体用于例如检测和/或定量生物样品中(例如临床样品中)的抗-CI和抗-gH。
A.示例性抗-特应抗体
在一方面，本发明提供分离的抗-特应抗体，其以足以用于检测抗-CI和抗-gH的特异性和亲和力结合抗-HCMV抗体抗-CI或抗-gH。
在某些实施方案中，抗-特应抗体结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列。在某些实施方案中，抗-特应抗体结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含来自含有SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体的全部六个HVR。在某些实施方案中，抗-特应抗体结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ IDNO:4的轻链序列。在某些实施方案中，抗-特应抗体结合抗-HCMV抗体，该抗-HCMV抗体包含来自含有SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的全部六个HVR。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
在另一方面，抗-CI特应抗体包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗-CI特应抗体保留结合抗-CI的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:5中取代、插入和/或缺失了总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失存在于HVR之外的区域中(即在FR中)。可选地，该抗-CI特应抗体包含SEQ ID NO:5中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，该VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，提供抗-CI特应抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VH)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗-CI特应抗体保留结合抗-CI的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7中取代、插入和/或缺失了总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失存在于HVR之外的区域中(即在FR中)。可选地，该抗-CI特应抗体包含SEQ ID NO:7中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，该VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，提供抗-CI特应抗体，其中该抗体包含上文提供的实施方案中任一个的VH及上文提供的实施方案中任一个的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，抗-gH特应抗体包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗-gH特应抗体保留结合抗-gH的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:9中取代、插入和/或缺失了总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失存在于HVR之外的区域中(即在FR中)。可选地，该抗-gH特应抗体包含SEQ ID NO:9中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，该VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，提供抗-gH特应抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VH)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗-gH特应抗体保留结合抗-gH的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:11中取代、插入和/或缺失了总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失存在于HVR之外的区域中(即在FR中)。可选地，该抗-gH特应抗体包含SEQ ID NO:11中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，该VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，提供抗-gH特应抗体，其中该抗体包含上文提供的实施方案中任一个的VH及上文提供的实施方案中任一个的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，本发明提供与本文提供的抗-HCMV特应抗体结合相同的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:5的VH序列和SEQ ID NO:7的VL序列的抗-CI特应抗体结合相同的表位的抗体，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ IDNO:11的VL序列的抗-gH特应抗体结合相同的表位的抗体。在某些实施方案中，提供特异性结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR的抗体。在某些实施方案中，提供特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR的抗体。在某些实施方案中，提供特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的HVR-H2(SEQ ID NO:36)的抗体。在某些实施方案中，提供结合包含在选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的氨基酸序列内的表位的抗体。在一些实施方案中，该抗-特应抗体结合包含在选自SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列内的表位。在一些实施方案中，该抗-特应抗体结合包含在选自SEQID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列内的表位。
在本发明的另一方面，以上实施方案中任一个的抗-HCMV特应抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗-HCMV特应抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，该抗体是全长抗体，例如完整的IgG1抗体或本文定义的其他抗体种类或同种型。
A.抗体产生
以下是有关用于产生用于本发明的抗-特应抗体的示例性技术的描述。
1.多克隆抗体
本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法为技术人员已知。可以例如通过一次或多次免疫剂和(如果希望)佐剂的注射来在哺乳动物中制备多克隆抗体。通常，将通过多次皮下或腹膜内注射来在哺乳动物中注射免疫剂和/或佐剂。免疫剂可以包括抗-CI、抗-gH、其抗原结合片段或其融合蛋白质。将免疫剂与已知在所免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质缀合可以是有用的。这类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以利用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成trehalose dicorynomycolate)。免疫流程可以由本领域技术人员选择而无需过多实验。然后可以对哺乳动物进行采血，并测定血清的抗-特应抗体效价。根据需要，可以加强免疫哺乳动物，直至抗体效价提高或稳定。
2.单克隆抗体
备选地，本发明的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法(见例如美国专利号4,816,567)制备。
在杂交瘤法中，按上文所述免疫小鼠或其他适当的宿主动物(如仓鼠)来引出产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(AcademicPress,1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺乏的细胞的生长。
融合配偶体骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选择的产抗体细胞稳定高水平产生抗体且对选择未融合的亲本细胞的选择培养基敏感的那些。骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可获自Salk Institute Cell DistributionCenter,San Diego,California USA的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及可获自American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA的SP-2及衍生细胞系(例如X63-Ag8-653细胞)。还已针对人单克隆抗体的产生描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63页(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。
针对抗该抗原的单克隆抗体的产生测定在其中培养杂交瘤细胞的培养基。可以通过免疫沉淀法或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。可以例如通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)中所述的Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。
一旦鉴定出产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可以通过有限稀释法亚克隆该克隆，并通过标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(AcademicPress,1986))培养。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以例如通过将细胞腹膜内注入小鼠，在动物中作为腹水肿瘤体内培养杂交瘤细胞。
通过常规抗体纯化方法(例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等)来从培养基、腹水或血清适宜地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
用常规方法(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞可作为这种DNA的来源。一旦分离，即可将该DNA放入表达载体，然后将该表达载体转染入否则将不产生抗体蛋白质的宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，可以从用描述于McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中的技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可行选择。
基本上，通过筛选噬菌体文库来选择合成的抗体克隆，该噬菌体文库包含展示与噬菌体外壳蛋白融合的多种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。针对希望的抗原筛选这类噬菌体文库。表达能够结合希望的抗原的Fv片段的克隆吸附至抗原，从而从文库中的非结合克隆分开。然后从抗原洗脱结合克隆，并可以通过附加的抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。
可以按Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述，将可变结构域作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接)或作为Fab片段(其中它们各与恒定结构域融合且非共价相互作用)功能性展示在噬菌体上。
可以通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的库，并在噬菌体文库中随机组合，然后可以按Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述针对抗原结合克隆筛选该文库。来自免疫的来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述克隆首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的人抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，通过从干细胞克隆未重排V基因区段、用包含随机序列的PCR引物来编码高变的CDR3区并实现体外重排来合成制备首次用于实验的文库。
文库的筛选可以通过本领域已知的多种技术来实现。例如，抗-CI或抗-gH可以用来包被吸附平板的孔、表达在固定至吸附平板的宿主细胞上或用于细胞分选、或与生物素缀合来用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠捕获、或用于任意其他用于淘选展示文库的方法。
可以通过使用Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690中所述的更长的洗涤和单价噬菌体展示及Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述的低抗原包被密度来促进具有缓慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗体的选择。
本发明的任意抗-特应抗体可以通过以下获得：设计适宜的抗原筛选方法来选择目的噬菌体克隆，然后用来自该目的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷中所述的适宜的恒定区(Fc)序列构建全长抗-特应抗体克隆。
3.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或在抗体的氨基酸序列内插入残基和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。进行取代诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“保守取代”的表头下显示保守取代。表1中在“示例性取代”的表头下显示更实质性的改变，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表1
原残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以按照共同的侧链性质分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基)和/或SDR(a-CDR)中进行这类改变，针对结合亲和力测试所得到的变体VH或VL。通过构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)中的任一种来在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选该文库来鉴定具有希望的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定点途径，其中随机化几个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可以例如用丙氨酸扫描诱变或模拟来明确地鉴定出涉及抗原结合的HVR残基。尤其是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在证明对最初的取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选残基靶向或消除。可以筛选变体来确定它们是否包含希望的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
B.重组方法和组合物
抗体可以用例如美国专利号4,816,567中所述的方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述的抗-特应抗体的核酸。这种核酸可以编码含有抗体的VL的氨基酸序列和/或含有抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗-复合物I抗体或抗-gH抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗-复合物I抗体或抗-gH抗体的重组产生，分离例如上文所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还见Charlton,Methods in MolecularBiology,248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ),255-268页(2003)。
C.测定
可以通过本领域已知的多种测定针对其物理/化学性质和/或生物学活性鉴定、筛选或表征本文提供的抗-HCMV特应抗体。
1.结合测定和其他测定
在一方面，例如通过已知的方法(如ELISA、Western印迹等)针对其抗原结合活性测试本发明的抗体。
在另一方面，可以用竞争测定来鉴定与本文所述的抗-HCMV特应抗体竞争结合抗-hCMV抗体的抗体。
在某些实施方案中，这种竞争抗体结合抗-CI的相同表位(例如线性表位或构象表位)。在某些实施方案中，这种竞争抗体结合抗-gH的相同表位(例如线性表位或构象表位)。
Methods in Molecular Biology 66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中的Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”中提供了用于定位抗体结合的表位的详细的示例性方法。
在示例性竞争测定中，在溶液中孵育固定的抗-HCMV抗体，该溶液包含结合该抗-HCMV抗体的第一标记抗体和针对其与该第一抗体竞争结合抗-HCMV抗体的能力进行测试的第二未标记抗体。该第二未标记抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照，在溶液中孵育固定的抗-HCMV抗体，该溶液包含该第一标记抗体但不包含该第二未标记抗体。在允许该第一抗体与该抗-HCMV抗体结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的抗-HCMV抗体结合的标记的量。如果测试样品中与固定的抗-HCMV抗体结合的标记的量相对于对照样品实质性减少，则表明该第二抗体与该第一抗体竞争结合抗-HCMV抗体。见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
竞争测定也可以用FACS以上述方式进行，该FACS使用用抗-HCMV抗体转染并表达在细胞表面的细胞。此外，使用抗-HCMV抗体的ELISA也可以用于竞争测定。
D.用于检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任意抗-特应抗体或包含这类抗体的组合物用于检测抗-HCMV抗体抗-CI或抗-gH在生物样品中的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是生物液体，如全血或全血成分(包括红细胞、白细胞、血小板、血清和血浆)、腹水、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊膜液、乳汁、唾液、痰、泪液、汗液、黏液、脑脊液和身体的其他可以包含目的抗体的组分。在多种实施方案中，该样品是来自任意动物的身体样品。在一些实施方案中，该样品来自哺乳动物。在一些实施方案中，该样品来自人对象，例如，在测量临床样品中的抗体(如人源化抗体)时。在一些实施方案中，该生物样品来自临床患者或用治疗性抗-HCMV抗体(例如抗-CI和/或抗-gH)治疗的患者。在某些实施方案中，该生物样品是血清或血浆。在某些实施方案中，该生物样品是来自临床患者的血清。
在某些实施方案中，提供包含标记的抗-HCMV特应抗体的组合物。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光标记、生色标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分(如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
1.ELISA
在一些实施方案中，该抗-HCMV特应抗体用于ELISA测定。本文所述的测定是利用抗-HCMV特应抗体作为目的抗体的捕获试剂的ELISA。在该测定的第一步中，使疑似含有或含有目的抗体的生物样品与捕获(或包被)抗体接触并孵育，使得捕获抗体捕获或结合目的抗体，使得可以在检测步骤中检测目的抗体。检测步骤涉及使用可检测抗体，在与任意结合的目的抗体接触时，该可检测抗体结合目的抗体(如果存在)。用检测手段来检测抗体上的标记，从而检测存在的目的抗体的存在或量。
在某些实施方案中，该测定利用以下步骤。
第一步
在本文的测定的第一步中，使疑似含有或含有本文定义的目的抗体的生物样品与固定的捕获(或包被)试剂接触并孵育，该捕获试剂是抗该目的抗体的抗-特应抗体。在一些实施方案中，这些抗体是单克隆抗体，且可以来自任意物种。在一些实施方案中，该抗体是啮齿动物抗体，在其他实施方案中，是鼠或大鼠抗体，在其他实施方案中，是鼠抗体。
在多种实施方案中，该抗-特应抗体是本文公开的任意抗-特应抗体。在某些实施方案中，该抗-特应抗体是包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)的抗体，其中：(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。在某些实施方案中，该抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
通常通过在测定方法之前(如通过吸附至非水溶性基质或表面(美国专利号3,720,760)或非共价或共价偶联(例如，使用戊二醛或碳二亚胺交联，之前用例如硝酸和美国专利号3,645,852中或Rotmans等；J.Immunol.Methods,57:87-98(1983)中所述的还原剂活化或不活化支持物))或之后(例如通过免疫沉淀)使捕获试剂不溶解来达到固定。在一些实施方案中，该捕获抗体与生物素缀合，并结合于链霉抗生物素蛋白包被的表面。在其他实施方案中，该捕获抗体与诸如His标记或GST的蛋白质标记缀合，并结合于适宜的表面，例如镍或铜包被的表面，或谷胱甘肽包被的表面。
用于固定的固相可以是基本上不溶于水且用于免疫测定的任意惰性支持物或载体，包括例如表面、颗粒、多孔基质等形式的支持物。常用的支持物的实例包括小片、凝胶、聚氯乙烯、塑料球珠及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的测定板或试管，包括96孔微量滴定板，以及颗粒材料，如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其他多糖。备选地，适宜地利用美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反应性非水溶性基质(溴化氰活化的糖类)和反应性基底进行捕获试剂的固定。在一些实施方案中，该固定的捕获试剂包被在微量滴定板上。在一些实施方案中，所使用的固相是可以用来同时分析几个样品的多孔微量滴定板，例如MICROTESTTM或MAXISORPTM96孔ELISA平板，如作为NUNC MAXISORBTM或IMMULONTM销售的平板。
用上文定义的捕获试剂包被固相，该捕获试剂可以根据需要通过非共价或共价相互作用或物理连接连接。用于附着的技术包括美国专利号4,376,110及其中引用的参考文献中所述的那些。如果共价连接，则用交联剂与捕获试剂一起在本领域公知的条件(如室温1小时)下孵育平板或其他固相。
用于将捕获试剂附着至固相基底的常用交联剂包括例如1,1-二(重氮乙酰)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮水杨酸的酯)、同双功能亚胺酯(包括二琥珀酰亚胺酯，如3,3'-二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯))和双功能马来酰亚胺(如二-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷)。诸如甲基-3-((对-叠氮苯基)-二硫代)丙酰亚胺酯的衍生剂产生能够在光的存在下形成交联的可光活化中间体。
如果利用96孔板，则可以用通常稀释在缓冲液(如0.05M碳酸钠)中的捕获试剂的混合物通过孵育至少约10小时来包被它们。在一些实施方案中，孵育是在约4-20℃或约4-8℃的温度和约8-12、约9-10或约9.6的pH下过夜。如果希望更短的包被时间(1-2小时)，则可以使用具有硝酸纤维素滤膜底(Millipore MULTISCREENTM)的96孔板或在37℃包被。可以在测定本身之前很长时间堆叠和包被平板，然后可以以手动、半自动或自动方式(例如通过使用机器人)同时对几个样品进行测定。
然后通常用非特异性结合并饱和结合部位的封闭剂处理包被的平板，以防止游离配体与平板孔上过量的部位的不想要的结合。适合用于此目的的封闭剂的实例包括例如明胶、牛血清白蛋白、卵白蛋白、酪蛋白和脱脂乳。封闭处理通常在环境温度条件下进行约1-4小时、或约1.5至3小时。
包被和封闭后，向固定相加入适当稀释的标准品(纯化的目的抗体)或待分析生物样品。在某些实施方案中，稀释比例按体积计约为5-10％、或约10％。可以用来为此目的进行稀释的缓冲液包括：(a)含有0.5％BSA、0.05％TWEEN 20TM去垢剂(P20)、0.05％PROCLINTM300抗生素、5mMEDTA、0.25％3-((3-胆酰胺丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸(CHAPS)表面活性剂、0.2％β-γ球蛋白和0.35M NaCl的磷酸缓冲盐溶液(PBS)；(b)含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％P20和0.05％PROCLINTM300的pH 7的PBS；(c)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％PROCLINTM300、5mM EDTA和0.35M NaCl的pH 6.35的PBS；(d)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％PROCLINTM300、5mM EDTA、0.2％β-γ球蛋白和0.35M NaCl的PBS；及(e)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％PROCLINTM300、5mM EDTA、0.25％CHAPS和0.35M NaCl的PBS。PROCLINTM300作为防腐剂，TWEEN 20TM作为去垢剂来消除非特异性结合。
所利用的捕获试剂的量足够大，以产生与标准品相比良好的信号，但与样品中目的抗体的最大预期水平相比未摩尔过量。在某些实施方案中，所加入的生物样品的量是这样，使得固定的捕获试剂与适当的样品稀释后生物样品中预期的游离目的抗体的最大摩尔浓度相比处于摩尔过量。此预期水平主要取决于所分析的具体生物样品中游离目的抗体的浓度水平与患者的临床病症之间任意已知的相关。因此，例如，成年患者可以在他/她的血清中具有非常高的最大预期游离目的抗体浓度，而根据所提供的剂量预期儿童将在他/她的血清中具有较低的游离目的抗体浓度。
捕获试剂的浓度可以通过目的抗体的浓度范围确定，考虑生物样品的任意必要的稀释。捕获试剂的终浓度也可以根据经验确定，以最大化该测定在目的范围内的灵敏度。通常，摩尔过量适宜地低于任意适当的样品稀释后生物样品中最大预期目的抗体摩尔浓度的约10倍。
选择用于孵育样品和固定的捕获试剂的条件，以最大化测定的灵敏度，最小化解离，并确保存在于样品中的任意目的抗体结合固定的捕获试剂。在从约0℃至约40℃范围内的比较恒定的温度下，例如在室温或约室温下进行孵育。孵育时间通常不超过约10小时。在多种实施方案中，孵育时间在室温或约室温下为约0.5至3小时或约1.5-3小时，以最大化目的抗体与捕获试剂的结合。如果加入蛋白酶抑制剂来防止生物液体中的蛋白酶降解目的抗体，则孵育持续时间可以更长。
在此阶段，孵育混合物的pH通常将在约4-9.5的范围内，或在约6-9或约7-8的范围内。选择孵育缓冲液的pH，以维持捕获试剂与所捕获的目的抗体的显著水平的特异性结合。可以在此步骤中利用多种缓冲液来达到和维持希望的pH，包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、TRIS-HCl或TRIS-磷酸盐、乙酸盐、巴比妥盐等。所利用的具体缓冲液对本发明并不重要，但在单个测定中，一种缓冲液可以比另一种更优选。
可选的第二步
在该测定方法的可选的第二步中，将生物样品从固定的捕获试剂分开(例如通过洗涤)，以去除未捕获的目的抗体。用来进行洗涤的溶液通常是具有用上文针对孵育步骤描述的考虑和缓冲液确定的pH的缓冲液(“洗涤缓冲液”)，具有约6-9的pH范围。洗涤可以进行三次或更多次。洗涤的温度通常是从冰箱温度至中等温度，在测定期间维持恒定温度，通常为约0-40℃，或约4-30℃。例如，洗涤前可以将洗涤缓冲液于储存器中4℃放置在冰浴中，且可以利用洗板机来进行此步骤。如果有捕获的目的抗体可以在后续步骤中以某种程度解离的顾虑，则还可以在此阶段加入交联剂或其他适宜的试剂，以允许现已结合的目的抗体共价附着至捕获试剂。
第三步
在下一个步骤中，使存在任意结合的目的抗体的固定的捕获试剂在约20-40℃或约36-38℃的温度下与可检测抗体接触，使二者接触的精确温度和时间主要取决于所利用的检测手段。例如，在用4-甲基伞形酮酰-β-半乳糖苷(MUG)、链霉抗生物素蛋白-HRP或链霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶作为检测手段时，接触可以过夜(例如约15-17小时或更长)进行，以将信号放大至最大。虽然可检测抗体可以是多克隆或单克隆抗体，但它优选是单克隆抗体，以降低背景噪音。在一些实施方案中，可以在测定中用相同的抗-特应抗体进行包被和检测。在其他实施方案中，可以用不同的抗-特应抗体进行包被和检测，这样选择该抗-特应抗体，使得背景噪音最小化。
在一些实施方案中，该可检测抗体是结合人抗体的来自非人物种的抗体。在一些实施方案中，该可检测抗体是抗-人IgG Fc抗体。在一些实施方案中，该可检测抗体是小鼠抗-人IgG Fcγ抗体。在一些实施方案中，该可检测抗体可直接检测。在某些实施方案中，该可检测抗体是生物素化的。在这类情况下，用于生物素化标记的检测手段可以是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白-HRP，且该检测手段的读出可以是荧光测定或比色测定。在一些实施方案中，该抗体与HRP缀合，且该检测手段是比色测定。
洗涤平板后，向平板加入就预期的最大游离目的抗体浓度(如上文所述)而言摩尔过量的可检测抗体。此抗体(可直接或间接检测)是单克隆抗体，但可以利用任意抗体。可检测抗体的亲和力必须足够高，使得可以检测到小量的游离目的抗体，但不能太高，以致它导致从捕获试剂拉下目的抗体。
第四步
在该测定方法的最后一步中，用可检测抗体的检测手段测量现结合于捕获试剂的来自样品的任意目的抗体的水平。如果生物样品来自临床患者，则该测量步骤包括将由于以上三个步骤而发生的反应与标准曲线相比较，以确定目的抗体与已知量相比的水平。
加至固定的捕获试剂的抗体将直接标记，或通过在洗去过量的第一抗体后加入摩尔过量的抗该第一抗体的动物物种的IgG的第二标记抗体来间接检测。在后者(间接测定)中，向样品中加入抗该第一抗体的标记抗血清，以原位产生标记抗体。
用于第一或第二抗体的标记可以是不干扰游离目的抗体与抗-特应抗体的结合的任意可检测官能团。适宜的标记的实例是已知用于免疫测定的许多标记，包括可以直接检测的部分(如荧光染料标记、化学发光标记和放射性标记)，以及必须反应或衍生来检测的部分(如酶)。这类标记的实例包括放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮，HRP，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联，生物素(可通过例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白-HRP和具有MUG的链霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶来检测)，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
可用常规方法来将这些标记结合至蛋白质或多肽。例如，诸如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双-亚胺、双-重氮化联苯胺等的偶联剂可以用于用上述荧光标记、化学发光标记和酶标记标记抗体。见例如美国专利号3,940,475(荧光测定)和美国专利号3,645,090(酶)；Hunter等,Nature,144:945(1962)；David等,Biochemistry,13:1014-1021(1974)；Pain等,J.Immunol.Methods,40:219-230(1981)；及Nygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407-412(1982)。
对免疫测定技术领域的普通技术人员而言，这种标记(包括酶)与抗体的缀合是标准操作方法。见例如Methods in Enzymology,J.J.Langone和H.Van Vunakis编辑,73卷(Academic Press,New York,New York,1981),147-166页中的O'Sullivan等“Methods for the Preparation ofEnzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay”。也可以使用适宜的市售标记抗体。
加入最后的标记抗体后，通过以下确定结合抗体的量：通过洗涤去除过量的未结合标记抗体，然后用适于该标记的检测方法测量所附着的标记的量，并使测量的量与生物样品中目的抗体的量相关。例如，在酶的情况下，显示和测量的颜色量将是存在的目的抗体量的直接测量。具体而言，如果标记是HRP，则可以用底物TMD检测颜色，使用450nm读取波长和620或630nm参考波长。
在一个实例中，在从固定相洗去抗第一未标记抗体的酶标记的第二抗体后，通过用酶的底物孵育固定的捕获试剂来显示和测量颜色或化学发光。然后通过与平行进行的标准目的抗体产生的颜色或化学发光比较来计算目的抗体的浓度。
2.质谱法
在一些实施方案中，抗-HCMV特应抗体用于抗-HCMV抗体抗-CI和/或抗-gH的质谱法测定。本文所述的测定利用抗-HCMV特应抗体来从生物样品免疫亲和捕获抗-HCMV抗体。在通过质谱法定量抗-HCMV抗体之前，可以用诸如层析的分开技术进一步处理样品。在一些实施方案中，通过蛋白酶解产生特征肽片段，并将所选择的特征肽作为抗-HCMV抗体的替代分析物测量。在某些实施方案中，用具有串联质谱分析(MS/MS)的HPLC定量替代肽。
处理生物样品
对哺乳动物(如人)施用选自抗-CI、抗-gH或其组合的抗-HCMV抗体，或使选自抗-CI、抗-gH或其组合的抗-HCMV抗体与选自组织、细胞培养物、血浆或血清的生物来源接触。已知来自血清和血浆的分析由于其高蛋白质背景(即许多蛋白质和其他分析物)而存在问题。在从施用后几分钟、几小时至几天的某个时期后，收集包含抗-HCMV抗体或其片段的生物样品。生物样品可以通过任意手段收集，包括通过注射器或插管抽取液体。生物样品可以是血液或血液产物，如血清、血浆等，或其他包含目的抗体的体液。
通过包括以下的常规方法处理生物样品以形成分析样品：配制、固定、离心、分离、消化、诱导或阻止血细胞凝固、水解或纯化。
处理生物样品有助于去除杂质和降低可以妨碍样品组分的分开或使数据收集或分析难理解的样品异质性。备选地，或此外，处理简化了样品处理、防止降解、最小化样品体积或选择质谱分析中的目的样品组分(分析物)。备选地，或此外，处理将生物样品转化为测定药物代谢或药物代谢动力学作用中的目的代谢物、片段或衍生物。
捕获经处理的分析样品
抗体捕获在免疫亲和珠上，其中该免疫亲和珠具有固定的对所施用的抗-HCMV抗体特异的抗-特应抗体。在多种实施方案中，该抗-特应抗体是本文公开的任意抗-特应抗体。对所施用的抗-HCMV抗体特异的抗-特应抗体可以用本领域已知的任意适宜的方法缀合至免疫亲和珠。在一些实施方案中，对所施用的抗-HCMV抗体特异的抗-特应抗体是生物素化的，并通过强生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用(KD＝10-15M)结合于链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠。使用链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠的理论包括：(i)强链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用(KD＝10-15M)；(ii)固定的链霉抗生物素蛋白/生物素化的分析物是经证明的方法；(iii)高结合量(足够的物质用于完整蛋白质)；(iv)低非特异性结合；(v)用质谱法相容的溶剂洗脱样品；(vi)良好地从磁珠回收样品；和(vii)方便使用且易于自动化。
免疫亲和珠可以包含多孔聚合物整体，且可以配置在与收集储器流体连通的流穿通道中。磁珠可以包含在流穿容器(如柱或漏斗)中，其中在一端或一个孔口引入来自生物来源的样品，并从另一端或另一个孔口洗脱样品。免疫亲和珠可以分布在多个流穿容器中，每个流穿容器与分开的收集储器连通。为了自动化和结果的可重复性的目的，可以将容器和储器配置在12列x8行的96微量滴定孔形式或24列x16行的384微量滴定孔形式中。
通过手工移液或自动化机器人分配将来自接受抗-HCMV抗体的哺乳动物(生物来源)的血浆或血清加至磁珠。磁珠可以配置在孔或其他容器中，或配置在柱或其他流穿装置中，其中在一端或一个孔口引入样品，并从另一端或另一个孔口洗脱洗涤流出物或洗脱的样品。允许对磁珠结合的抗-特应抗体特异的样品组分结合。洗涤磁珠来漂洗去非特异性蛋白质和其他非特异性样品组分。可以例如用PNGaseF在磁珠上去糖基化结合的抗体。结合的样品组分可以洗脱入具有分开的接收容器或孔的样品板。然后可以通过手工移液或通过机器人转移处理所洗脱的样品，通过反相层析分开，并通过质谱法分析分开的样品组分。
在一些实施方案中，可以用蛋白酶消化生物样品。通过蛋白酶解产生特征肽片段，并将所选择的特征肽作为抗-HCMV抗体的替代分析物测量。在示例性实施方案中，可以用胰蛋白酶消化生物样品。对于胰蛋白酶消化，样品可以用DTT还原，用碘乙酸钠S-羧甲基化，然后用胰蛋白酶消化。可以通过分开方法分析消化的样品，例如，反相HPLC，例如Nucleosil C18柱；大小排阻层析(SEC)，例如TSK 3000SWxL柱；或使用TSK硼酸盐柱的硼酸盐亲和层析。
样品组分的分开
为了形成分析样品，可以将生物样品加至分离介质来实现一种以上样品组分的分开。分开方法包括亲和、层析和电泳法。亲和法包括亲和层析、吸附和固定的亲和基质。层析法包括HPLC、疏水相互作用(HIC)、阴离子交换、阳离子交换、反相、正相、离子对反相、薄层、毛细管流和大小排阻。电泳法包括单向、平板凝胶、毛细管、聚丙烯酰胺、变性、天然、自由溶液、纸、双向、等电聚焦和梯度电压。其他分开方法包括：透析、离心、沉降、漂浮、沉淀、免疫沉淀和凝胶过滤。
分开方法可以通过一种或多种物理化学特性来实现生物样品组分的分开，其包括但不限于洗脱时间、疏水性、亲水性、迁移时间、迁移率、迁移速度、层析保留时间、溶解度、分子体积或大小、净电荷、电荷状态、离子电荷、等电点、解离常数(pKa)、抗体亲和力、电泳迁移率、电离电势、偶极矩、形成氢键的能力和在气相中的离子迁移率。
通过毛细管流注入质谱分析入口装置的低流速有助于质量检测的灵敏度，允许检测和表征低浓度分析物和高分子量种类(如完整蛋白质和抗体)。
分开的样品组分的质谱分析
用于质谱分析的样品的制备通常可以按照已知的技术进行。见“Modern Protein Chemistry:Practical Aspects”,Howard,G.C.和Brown,W.E.编辑(2002)CRC Press,Boca Raton,Florida。
本发明的方法适合用于分析源自生物样品的抗体混合物，其中首先通过包括亲和或层析的一种或多种方法分离、分开或部分分开混合物的不同化学组分，该方法导致组分顺次或以分批方式洗脱或通过质谱法直接检测。可以从质谱分析阐明抗体的多种结构特征和性质，包括：片段化、脱酰胺作用、糖化、氧化、部分序列信息(例如N端和C端)、二聚体和聚集状态。由于所施用的抗-HCMV抗体具有已知的序列、结构和分子量，可以通过测量其准确质量来以高度特异的方式表征生物样品中的一种或多种化学组分。
多种高质量准确度、高灵敏度和高分辨率的质谱系统为本领域已知，且可以用于本发明的方法。这类质谱仪的质量分析器包括但不限于四级杆(Q)、飞行时间(TOF)、离子阱、扇形磁场或FT-ICR或其组合。质谱仪的离子源应主要产生样品分子离子或伪分子离子和某些可表征的片段离子。这类离子源的实例包括大气压电离源，例如电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离源(APCI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。ESI和MALDI是两种最常用来电离蛋白质进行质谱分析的方法。ESI和APCI是最常用于通过LC/MS分析小分子的离子源技术(Lee,M.“LC/MS Applications in DrugDevelopment”(2002)J.Wiley&Sons,New York)。
表面增强激光解吸电离(SELDI)是允许进行高通量质谱分析的基于表面的电离技术的实例(美国专利号6,020,208)。通常，用SELDI来分析蛋白质和其他生物分子的复杂混合物。SELDI利用化学反应性表面(如“蛋白质芯片”)来与溶液中的分析物(例如蛋白质)相互作用。这类表面选择性地与分析物相互作用，并将它们固定在其上。因此，本发明的分析物可以在芯片上得到部分纯化，然后在质谱仪中快速分析。通过在基底表面上的不同部位提供多个反应性部分，可以提高通量。
在功能系统中，质谱仪将准确测量目的化学种类的质量至其精确质量或计算质量的20ppm之内，且通常至其精确质量或计算质量的5ppm或更小之内。市售质量分析器可以以这样的频率同时采样和记录整个质谱，该频率允许获取混合物中的多个组分的足够谱，以确保质谱分析信号强度或峰面积在数量上具有代表性。这还将确保质量分析器不改变或扭曲针对质量观察到的洗脱时间，它将帮助确保测量瞬时信号丰度的需要不危害定量测量。
可以通过使用具有与靶分析物的理化性质相似的理化性质的内标准品(IS)来校正分析变异性。(Mesmin等(2011)Bioanalysis 3:477-480)。在将特征肽作为抗-HCMV抗体的替代分析物测量的一些实施方案中，可以用对应于特征肽的稳定同位素标记(SIL)肽作为内标准品。(Hagman等(2008)Anal.Chem.80:1290-1296；Mesmin等(2010)Rapid Commun.MassSpectrom.24:2875-2884)。
电喷雾电离质谱法(ESI)
由于提高的分析物电离效率而在较低流速下达到了较高灵敏度(Gale等(1993)Rapid Commun.Mass Spectrom.7:1017)。因此，在与质谱法组合时，通过以纳升/分钟范围内的流速进行含有样品的液体的电喷雾注射提供了适当校正后的准确定量，及对包含在该液体内的分析物的高灵敏度。已作为MS的前沿报道了包括小型化并加固的具有亲和层析吸附剂的微柱和微柱阵列的系统和装置，其提供高选择性和灵敏度及准确的定性分析(美国专利号6,811,689；美国专利号6,020,208；美国专利号6,579,719)。
相对高分子量化合物(如抗体)的质量可以在通过大多数质谱仪容易地测定的质量-电荷比(m/z)上检测(典型的m/z范围为至多2000至3000)。电喷雾电离质谱法ESI-MS尤其适合用于带电荷、极性或碱性的化合物，及用于以良好的检测极限分析带多个电荷的化合物。因此，ESI允许检测和表征具有150,000或更高分子量(MW)的大的生物分子，如抗体和抗体-药物缀合物。对于高质量离子，通常观察到一系列带多个电荷的分子离子。阳离子的分子量通过测量的m/z比x电荷数(n)-阳离子(C+)的质量x该离子上的电荷数(n)来确定。
ESI法允许存在或缺乏待通过控制界面镜片电势来控制的片段化。电喷雾电离(ESI)与液体分离法(前端)以及质谱检测法(后端)相容("Electrospray Ionization Mass Spectrometry:Fundamentals,Instrumentation,and Applications",Cole,R.B.编辑(1997)Wiley,NewYork)。
ESI-MS数据可以通过将许多次扫描一起平均并修匀数据来提供良好的峰强度和形状而获得。对于低质量化合物，观察到的最丰富的峰通常是阳离子模式中的[M+H]+离子和阴离子模式中的[M-H]-离子。还可以观察到带两个和三个电荷的离子。带两个电荷的阳离子将以质量(MW+2C+)/2观察到，其中MW是分子量，C+是电离阳离子，如H+、Na+或NH4+。除质量非常低的化合物外，所检测到的离子将带多个电荷。由于ESI的软(低电离电势)条件，通常仅观察到分子离子。ESI谱可以具有几个分子离子峰，该分子离子峰由于离子所具有的多种电荷数而在质量-电荷比上不同。
可以将样品(例如ADC或其他生物分子)的稀释溶液缓慢泵过皮下注射针头进行ESI-MS分析。样品可以经流动注入或LC/MS引入。典型的流速在不到1μl/分钟至约1ml/分钟的范围内。ESI尤其适合用于否则将难以蒸发或电离的大的生物分子。针头保持高电压，针头末端的强电场使雾化溶液带电，产生带电液滴。带电液滴蒸发水分，最终产生通过小孔运行进入真空室的分子离子。在溶剂蒸发过程中，非共价结合的复合物从溶液转移至气相(Hu等(1994))。通常需要温和的去溶剂化条件来保持完整的气相复合物。可以加热孔口，以确保离子完全去溶剂化。一些MS系统可以利用逆流加热气体。带电荷液滴从皮下注射针头发射，并随着它们蒸发溶剂而缩小，然后进入真空室。可以用热和气流来辅助去溶剂化。通过用小的毛细管电喷雾发射器、尖端(称为纳升电喷雾的方法)来减小流量，可以减少ESI测量所需的样品量。对于1μl样品，纳升电喷雾法可以产生恒定信号约10-30分钟。已显示低流量提高离子效率并降低离子抑制。纳升电喷雾法常用于MS/MS蛋白质研究(Korner等(1996)J.Am.Soc.MassSpectrom.7:150-156；Mann,M.和Wilm,M.(1996)Anal.Chem.68:1-8)。
蛋白质的ESI产生带多个电荷的离子，电荷数趋向于随分子量的增加而增加。给定离子种类上的电荷数可以通过诸如以下的方法测定：(i)比较因一个电荷而不同的两个电荷状态并解联立方程；(ii)寻找具有相同的电荷但不同的加合物质量的种类；(iii)检查解析的同位素簇的质量-电荷比。ESI和ESI-MS的方法及进行这些方法所需的参数为本领域公知。电喷雾电离法的温和性允许通过质谱法直接检测完整的抗体缀合物。
在一个实施方案中，作为方法的一部分运行蛋白质、抗体、抗体片段或抗体缀合物(大分子)的Q1质谱。可以获得大分子的适宜质量的Q1质谱。由于存在蛋白质包络位移的可能，用于层析的所有溶剂都现配，并向洗脱溶剂中加入酸来将谱包络置于观察范围内。对于大于100,000质量单位的蛋白质，可以按约0.1％(体积)在洗脱溶剂(例如，溶剂A(水)和B(乙腈)二者)中加入诸如甲酸的酸。对于小于100,000质量单位的蛋白质，A和B溶剂二者可以按0.05％(体积)使用更强的酸，如三氟乙酸(TFA)。随着甲酸的量减少，完整的糖基化抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)接载更多的电荷，使包络进一步向左位移，进入m/z的观察范围(1800-3000m/z)。随着去簇电势(DP)电压从约30-120V提高至约70-190V，抗体上的电荷进一步增加。因此，所施加的电压、溶剂组成和离子配对剂是要考虑和调节的因素。可以提高(斜坡)去簇电势(DP)来获得足以选择最佳电荷离子范围的分辨率。可以在宽范围的m/z内获得线性。抗体的去糖基化帮助定量完整抗体或重链、片段或ADC。糖基化促成较低的电离效率，从而降低灵敏度。在定量抗体或抗体片段缀合物时，抗体的去糖基化可以降低质谱的异质性，提高灵敏度，从而简化分析。
用去褶合表来确定待定量的每个种类的精确质量电荷比(m/z)。诸如AnalystTM QS(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)的去褶合软件应用是市售的和/或随质谱仪提供。去褶合软件通常为用户提供去褶合质量表以及用来计算这些质量的m/z离子的子表。
E.试剂盒
为方便起见，本发明的测定方法可以以试剂盒的形式提供。这种试剂盒是包括以下基本要素的包装组合：
(a)由抗目的抗体的抗-特应抗体组成的捕获试剂；
(b)结合目的抗体的可检测(标记或未标记)抗体；和
(c)关于如何用这些试剂进行该测定方法的说明。
这些基本要素在上文中定义。
试剂盒可以进一步包含捕获试剂的固体支持物，其可以作为分开的要素提供或已将捕获试剂固定在其上。因此，试剂盒中的捕获抗体可以固定在固体支持物上，或者它们可以固定在试剂盒所包含或与试剂盒分开提供的固体支持物。在一些实施方案中，捕获试剂包被在微量滴定板上。可检测抗体可以是直接检测的标记抗体，或通过在不同物种中制备的抗未标记抗体的标记抗体检测的未标记抗体。在标记是酶时，试剂盒通常将包括该酶所需的底物和辅因子；在标记是荧光团时，试剂盒通常将包括提供可检测生色团的染料前体；在标记是生物素时，试剂盒通常将包括抗生物素蛋白，如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、或与HRP缀合的链霉抗生物素蛋白或具有MUG的0-半乳糖苷酶。
在多种实施方案中，该抗-特应抗体是本文公开的任意抗-特应抗体中的一种或多种。在一些实施方案中，该抗-特应抗体选自：(a)包含SEQ IDNO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列的第一抗-特应抗体；(b)包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列的第二抗-特应抗体；和(c)其组合。
试剂盒通常还包含作为标准品的目的抗体(例如纯化的抗-CI和/或抗-gH)，以及其他添加剂，如稳定剂、洗涤和孵育缓冲液等。
试剂盒的成分将以预先确定的比例提供，适宜地变动多种试剂的相对量，以在溶液中提供基本上最大化测定灵敏度的试剂浓度。尤其是，试剂可以作为包含赋形剂的干粉(通常为冻干)提供，其在溶解时将提供具有适合用于与待测样品组合的浓度的试剂溶液。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解，由于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1：抗抗-CI和抗-gH杂交瘤的产生
用含有可代谢鲨烯、Tween 80、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose6,6-dimycolate)和单磷酰脂质A(所有成分均获自Sigma Aldrich,USA)的佐剂中的抗-CI或抗-gH按3-4天的间隔在每个后爪垫中及腹膜内超免疫五只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories International,Inc.,Wilmington,MA,USA)。加强4至6次后，通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)评价血清效价来鉴定具有抗抗-CI或抗-gH阳性血清效价的小鼠。通过电融合(Hybrimune-Hybridoma Production System；Harvard Apparatus,Inc.,Holliston,MA,USA)来使来自脾和腘淋巴结的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653或P3X63Ag.U1；American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)融合。10-14天后，收集杂交瘤上清，并通过ELISA筛选CDR特异性抗体产生。然后在初步HCMV PK ELISA中再次筛选所有特异性克隆，其中用候选抗-ID物质作为包被ELISA平板和捕获抗-CI和抗-gH的试剂，用多克隆抗-人抗体作为检测试剂。在第一轮每个孔单个细胞的亚克隆(FACSAria cell sorter；BD Biosciences,San Jose,CA,USA)后，杂交瘤克隆1.9E1.1、4.25B10.15和2.41A2.4在初步HCMV PK ELISA中显示高特异性结合，因此将它们扩增(Innova 2000Shake Flask Format；New Brunswick Scientific,Enfield,CT,USA)用于抗体产生。克隆2.41A2.4在PK测定中的结合模式表明，此克隆结合包含λ轻链构架的表位。通过亲和层析(MabSelect SuRe；GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ,USA)纯化上清，无菌过滤，并于4℃保存在PBS中。用Isostrip Mouse mAbIsotyping试剂盒(Roche Applied Biosciences,Indianapolis,IN,USA)测定单克隆抗体的同种型。测定同种型为IgG1、λ(1.9E1.1)，IgG1、κ(4.25B10.15)，及IgG2a、κ(2.41A2.4)。
通过Biacore分析测定单克隆抗体的结合亲和力，如表2中所示。
表2
单克隆抗体 结合的抗体 结合亲和力
4.25B10.15 抗-CI 4.7nM
2.41A2.4 抗-CI 17nM
1.9E1.1 抗-gH 0.1nM
测定了单克隆抗体4.25B10.15和1.9E1.1的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列，4.25B10.15如图1和2中所示，1.9E1.1如图3和4中所示。
图1中所示的单克隆抗体4.25B10.15的重链高变区是：
HVR-H1  NYLIE                  SEQ ID NO:13
HVR-H2  VINPGSGGTNYNEKFEA      SEQ ID NO:14
HVR-H3  HGSSYWYFDV             SEQ ID NO:15
图2中所示的单克隆抗体4.25B10.15的轻链高变区是：
HVR-L1  RASQSISDYLH          SEQ ID NO:16
HVR-L2  YASQSIS              SEQ ID NO:17
HVR-L3  QNGHSFPYT            SEQ ID NO:18
图3中所示的单克隆抗体1.9E1.1的重链高变区是：
HVR-H1  DYWMY               SEQ ID NO:19
HVR-H2  AIDTSDSYTTYNQNFKG   SEQ ID NO:20
HVR-H3  SGFPLFYYPMDY        SEQ ID NO:21
图4中所示的单克隆抗体1.9E1.1的轻链高变区是：
HVR-L1  RSSTGAVTTSNYAN       SEQ ID NO:22
HVR-L2  GTVNRAP              SEQ ID NO:23
HVR-L3  ALWYSNHLV            SEQ ID NO:24
实施例2：用于检测抗-gH的ELISA测定
图5显示用于检测抗-gH的ELISA测定(称为“抗-gH临床PK ELISA”)的示意图。使抗抗-gH的生物素缀合抗-特应抗体结合于链霉抗生物素蛋白包被的微孔板，并用来检测样品中的抗-gH。用HRP缀合的小鼠抗-人IgGFcg抗体检测结合的抗-gH。
将生物素缀合的抗-特应抗体按500ng/mL稀释在测定稀释液(PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨酯20/0.35M NaCl/0.25％CHAPS/5mMEDTA/0.05％ProClin 300，pH 7.4±0.1)中。Roche SA平板使用前用洗涤缓冲液(PBS/0.05％聚山梨酯20，pH7.46)洗涤三次。向链霉抗生物素蛋白包被的平板中加入50μl/孔生物素缀合的抗-特应抗体(1.9E1.1)，室温下搅拌孵育平板25-35分钟。将曲线标准品、测定对照或样品1:50稀释在测定稀释液(上文所述)中。将稀释的样品、曲线标准品和测定对照加至平板，并在室温下搅拌孵育100-130分钟。洗涤平板4次。加入100μl/孔HRP缀合的小鼠抗-人IgG Fcγ(8ng/ml)，室温下震荡孵育平板1小时±5分钟。洗涤平板4次，加入100μl/孔TMB。室温下搅拌孵育平板10-15分钟。向每个孔中加入100μl 1M磷酸。用450nm读取波长，和620或630nm参考波长读取平板。
图6显示在初步抗-HCMV人PK ELISA中测试的抗抗-CI和抗-gH的多种抗-特应抗体的结合活性。该测定按以下进行：用含1μg/mL抗-特应单克隆抗体的PBS过夜包被微量滴定ELISA平板。将抗-CI和抗-gH稀释在1％NHS中，并加至孔中，然后用50ng/mL(孔内浓度)的HRP-绵羊抗-人IgG检测。
如图6中所示，只有一种抗-特应抗体(1.9E1.1)在抗-gH的存在下产生比缺乏抗-gH的情况下的OD高两倍的光密度(OD)。其他抗-特应抗体产生高背景OD，表明那些抗-特应抗体与人血清(NHS)中的内源IgG的交叉反应。
用抗-gH临床PK ELISA来定量掺入来自个体供体的血清中的抗-gH的量。按高浓度(2μg/mL)或低浓度(0.3μg/mL)在干净血清中掺入抗-gH。图7显示用1.9E1.1作为捕获抗体测定的掺入抗-gH的个体血清的百分比回收。测定显示，对于按低和高抗-gH浓度掺入的所有个体血清，抗-特应抗体1.9E1.1提供良好的准确度。
实施例3：用于检测抗-CI的ELISA测定
图8是用于检测抗-CI的ELISA测定(称为“抗-CI临床PK ELISA”)的示意图。使抗抗-CI的抗-特应抗体结合于微孔板，并用来检测样品中的抗-CI。用HRP缀合的小鼠抗-人IgG Fcg抗体检测结合的抗-CI。
用100μl/孔0.75μg/ml抗-CI特应抗体(在0.05M碳酸钠缓冲液pH9.6±0.1中)在2-8℃过夜包被微量滴定板。用400μl/孔/循环洗涤缓冲液洗涤平板3次。加入200μl/孔封闭缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨酯20/0.05％ProClin 300，pH 7.4±0.1)，室温下震荡孵育平板1-3小时。用标准品/样品稀释液(含0.5％正常混合人血清的测定稀释液；测定稀释液由PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨酯-20/0.35M NaCl/0.25％CHAPS/5mMEDTA/0.05％ProClin 300组成，pH 7.4±0.1)制备标准曲线。用400μl/孔/循环洗涤缓冲液洗涤平板3次。将稀释的标准品、对照和样品按100μl/孔一式两份加至平板。室温下震荡孵育平板2小时±10分钟。用400μl/孔/循环洗涤缓冲液洗涤平板4次。按100μl/孔加入稀释在缀合物缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨酯20/0.05％ProClin 300，pH 7.4±0.1)中的HRP缀合物。室温下震荡孵育平板1小时±5分钟，然后用400μl/孔/循环洗涤缓冲液洗涤平板4次。加入100μl/孔TMB底物，室温下震荡孵育平板约15分钟。向每个孔中加入100μl1M磷酸。用450nm读取波长，和620或630nm参考波长读取平板。
用不同浓度的捕获抗体4.25B10.15包被的平板进行抗-CI临床PKELISA测定来优化包被浓度。如表3中所示，0.75mg/ml抗体4.25B10.15包被的平板产生最佳的信号背景比。背景(bkgd)等于用未掺入的人血清获得的测定信号。
表3
用按不同浓度掺入0.5％人血清混合物中的抗-CI的标准曲线进行抗-CI临床PK ELISA。结果总结在表4中。测定显示一致的剂量反应，信号背景(S/B)比随抗-CI浓度的逐渐提高而逐渐提高。
表4
抗-CI ug/mL OD S/B比
20 1.970 22.3
10 1.725 19.6
5 1.203 13.6
2.5 0.743 8.4
1.25 0.431 4.9
0.625 0.261 3.0
0.313 0.174 2.0
0.156 0.134 1.5
bkgd 0.088
用抗-特应抗体4.25B10.15或4.23F9.5作为捕获抗体，用抗-CI临床PK ELISA来定量掺入来自个体供体的血清中的抗-CI的量。抗-CI按4μg/mL(高)或0.5μg/mL(低)掺入混合样品和样品1-4，按12μg/mL(高)或0.6μg/mL(低)掺入样品5，按7.62μg/mL(高)或0.476μg/mL(低)掺入样品6和7。如图9中所示，抗-特应抗体4.25B10.15表现得比4.23F9.5好，对于高和低抗-CI浓度的所有个体血清，提供准确的掺入回收。
实施例4：用于定量人血清中的抗-CI和抗-gH的LC-MS/MS测定
发展了LC-MS/MS测定来定量人血清中的抗-CI和抗-gH。该测定用免疫亲和捕获来从人血清分离两种单克隆抗体抗-CI和抗-gH。然后通过用胰蛋白酶蛋白酶解结合的抗体来产生特征肽片段，用具有MS/MS检测的HPLC作为抗-CI和抗-gH的替代分析物测量所选择的特征肽连同它们的稳定同位素标记的内标准品(SIL IS)。抗-CI和抗-gH的特征胰蛋白酶肽如下所示：
*烷基化的半胱氨酸残基
SIL IS在以黑体显示的氨基酸位置处包含稳定同位素标记的氨基酸：
*烷基化的半胱氨酸残基
特征肽抗-CI(P2)和抗-gH(P2)分别是用于定量抗-CI和抗-gH的主要替代肽，而抗-CI(P4)和抗-gH(P5)是用于质量控制目的的次要替代肽。该方法适用于定量0.100至20.0μg/mL的标称范围内的抗-CI和抗-gH。25μl人血清整分试样足够进行分析。样品在分析前保存在聚丙烯管中，并在约-70℃保持冷冻。
提取以下样品类型用于评价目的。除非指出，抗-特应单克隆抗体(抗-ID mAb)负荷为每个样品3.0μg：
混合空白(MB)人血清。
每种抗体的按以下浓度用抗-CI和抗-gH(组合)强化的校准标准品(CAL)：0.100、0.200、0.400、1.00、4.00、8.00、10.0和20.0μg/mL(每个水平n＝2)。
每种抗体的按以下浓度用抗-CI和抗-gH(组合)强化的质量控制(QC)：0.250、2.00、7.50μg/mL(每个水平n＝4)。
高校准物之后的遗留空白(CB)。
按40μg/mL的抗-CI和抗-gH浓度制备并在分装前10倍稀释的超出曲线稀释QC(DIL QC)。
来自6名个体人供体的特异性样品(SP)(各n＝1)。
按0.200μg/mL的浓度用抗-CI和抗-gH强化的来自6名个体人供体的强化特异性样品(SPF)。
按以下浓度用抗-CI和抗-gH(组合)强化：0.100、0.200、0.400、1.00、4.00、8.00、10.0和20.0μg/mL(每个水平n＝2)，且每个样品包含各1.50μg负荷的抗-CI抗-ID mAb和抗-gH抗-ID mAb的其他校准标准品(CAL)。
通过以下步骤处理用于分析的样品：
1.通过加入275μL平板调节缓冲液(0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1Tween 20/Trizma HCl(1M)/NaCl(5M)/EDTA(0.5M)/水/牛血清白蛋白，v/v/v/v/w)来预调节Immulon 1B 96孔平底微量滴定板(Thermo,产品号3355)。温和地涡旋平板约1分钟。通过颠倒平板来弃除调节缓冲液，并在吸附垫上轻拍平板吸干。
2.将血清样品的25μL整分试样加至3.0μg或1.5μg抗-CI抗-IDmAb、3.0μg或1.5μg抗-gH抗-ID mAb和10mM HBS-EP缓冲液(GEHealthcare,产品号94318)的混合物，在预调节的96孔微孔板中产生150μL的总体积。
3.用粘合膜盖上平板，并在滴定板震荡器上恒定的温和震荡下室温(RT)孵育2小时。
4.通过在RT下混合1-2分钟来用等体积的10mM HBS-EP对所需体积的链霉抗生物素蛋白Dynabeads M-280(Life Technologies,产品号602-10)(基于100μL/孔)进行缓冲液更换。此方法重复三次。弃上清后，用10mM HBS-EP将体积补足至50μL，使得磁珠与最初的起始体积相比浓缩了2倍。
5.然后将50μL浓缩磁珠加至来自步骤3的每个孔，并使其在恒定的温和震荡下室温结合2小时。
6.使用外磁铁(Biotek 96-well Flat Magnet)和Biotek洗板机，分开磁珠并弃除上清中未结合的蛋白质。用洗板机用75μL磁珠洗涤缓冲液(5.0:3.0:0.2:91.8Trizman HCl(1M)/NaCl(5M)/EDTA(0.5M)/水，v/v/v/v)洗涤磁珠三次。用外磁铁分开磁珠后弃上清。使用滴定板震荡器，在三次洗涤的每一次之间震荡滴定板来重悬磁珠。
7.用200μL磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠第四次，用外磁铁分开磁珠后弃上清，用滴定板震荡器短暂震荡来重悬。
8.分开磁珠并弃上清。用75μL磁珠洗涤溶液(含20％乙腈的水)洗涤磁珠一次，用滴定板震荡器短暂震荡来重悬。分开磁珠并弃上清。用磁珠洗涤溶液洗涤磁珠最后一次，用滴定板震荡器短暂震荡来重悬。
9.弃除洗液后，向每个孔中加入75μL Rapigest表面活性剂溶液(0.05:40:10Rapigest(Rapigest SF表面活性剂,Waters,产品号186002122)/碳酸氢铵,50mM/ACN,w/v/v)、25μL内标准品(或内标准品稀释液，即含20％乙腈的水)和10μL DTT(0.1M)。在预热的烘箱中60℃孵育平板～1小时。
10.向每个孔中加入25μL iodoacetmide(0.1M)。混合孔。在RT孵育～0.5小时(避光)。
11.向每个孔中加入2.5μg胰蛋白酶。混合孔。37摄氏度过夜(16-20小时)孵育。
12.向每个孔中加入15μL 2M HCl。混合孔。37℃孵育～0.5小时。
13.将平板放置在磁铁上，并将全部溶液转移至置于96孔EppendorfLo-bind收集板顶部的Multicreen HTS Filter Plate(Millipore,Part#MSHVN4550)。
14.3000转/分钟离心滤板/收集板组合5分钟来收集滤液。
15.用注射垫密封平板，并直接注射15μL(在10μL注射环上)至LC/MS/MS系统上。
数据整理
配置数据系统来自动计算和注释MCMV3068A、MCMV5322A和内标准品峰的面积。通过应用二次、1/浓度平方加权、最小二乘回归算法来用校准标准品的峰面积比(PAR)构建校准曲线。然后针对校准曲线从它们的PAR计算所有浓度。
最初的实验证明，对于所有特征肽，将分析物抗-CI和抗-gH二者的校准范围从0.100μg/mL延伸至20.0μg/mL是可行的。将二次回归(1/x2权重)应用于抗-CI和抗-gH(各具有1.5μg抗-ID mAb负荷)。
此外，在多个个体血清批次中测试了测定特异性，制备质量控制(QC)样品，并针对校准标准品定量。对于全部四个特征肽的QC，获得了良好的准确度和精确度。成功地将超曲线稀释QC样品稀释在曲线范围内。针对两种分析物观察到了主要和次要肽的一致的面积比。特异性样品在分析物保留时间下未显示任何干扰的存在。强化的特异性样品未显示任何批次对批次基质效应的显著证据。
使用各抗-特应抗体的1.5μg的抗-特应抗体负荷，按以下进一步评价该测定。抗-特应抗体2.41A2.4用于检测抗-CI，抗-特应抗体1.9E1.1用于检测抗-gH。分别运行了具有从0.100至20.0μg/mL抗-CI和抗-gH范围内的至少八个校准点的两组标准曲线；一条曲线在样品批次开始时，一条在结束时。要求校准标准品的反算值在标称浓度的±20％之内。如果标准品的反算浓度落在允许范围之外，则排除该标准品，重复校准数据的回归分析，直至所有其余的值处于允许范围之内。对于可接受的校准曲线，至少代表六个校准水平，且在排除后保留运行中的总校准标准品的最少75％。分析了以下类型中每一种的至少一个空白样品：(a)不含内标准品的试剂空白；(b)不含内标准品的基质空白；和(c)含内标准品的基质空白。
运行了定量下限(LLOQ)、低、中和高水平QC样品(n＝6)来评价测定内精确度和准确度。如表5中所示，对于抗-CI和抗-gH的LLQQ浓度，重复测定内测定的测定内变异系数小于25.0％(接受标准)，平均准确度在理论分析物浓度的±25.0％之内(接受标准)。对于所有其他浓度的抗-CI和抗-gH，重复测定内测定的测定内变异系数小于20％，平均准确度在理论分析物浓度的±20％之内。因此，该测定证明在广范围的药物浓度内可接受的精确度和准确度。
用约600μg/mL的抗-CI和抗-gH浓度制备附加的“超曲线”基质质量控制混合物，以评估稀释最初高于标准曲线上限的样品的能力。用两个系列10倍稀释分别将此QC混合物的六个重复稀释100倍，并分析。用两个系列10倍稀释制备稀释液。如表6中所示，重复测定内测定的测定内变异系数小于20％，平均准确度在理论分析物浓度的±20％之内。
表5
表6
抗体 抗-CI 抗-gH
运行ID QC 4(μg/mL) QC 4(μg/mL)
676 559
682 635
595 748
598 720
649 671
637 650
N 6 6
理论浓度 600 600
平均值 639 664
S.D. 37.4 66.7
％C.V. 5.85 10.1
与理论值的％差异 6.56 10.6
下限 480 480
上限 720 720
分析了来自至少10个不同个体批次/供体的基质样品(未强化(SP)和仅用内标准品强化(SP/IS)二者)来评价测定特异性。对于未强化的特异性样品，在内标准品的预期保留时间出现的任何干扰层析背景峰的响应都小于在用该内标准品强化的特异性样品中针对该内标准品测定的平均层析响应的5％。对于仅用一种或多种内标准品强化的特异性样品，在这些样品中测量的响应比(干扰背景峰响应/内标准品峰响应)小于在运行期间分析的可接受的定量下限(LLOQ)CAL和QC中针对相应的分析物测定的平均响应比的20％，证明对抗-CI和抗-gH二者的可接受的测定特异性。
通过分析用低QC水平的一种或多种分析物和使用水平的一种或多种内标准品强化的10个不同个体批次来评价测定选择性。这些测试样品标识为SPF。对于所有抗-CI测试样品(表7)和9/10抗-gH测试样品(表8)，重复测定的测定内变异系数小于20％，平均准确度在理论分析物浓度的±20％之内，确认了对两种抗体的可接受的测定选择性。
表7
表8
针对用特征肽的SIL IS强化的样品评价了交叉分析物干扰检验。未针对用抗-CI或抗-gH强化的样品评价相同的单个分析物特征肽之间的交叉分析物干扰评价，因为不能用该测定方法独立产生对应于在此测定中测量的单个分析物的替代特征肽。相反，在对应于抗-CI的特征肽和对应于抗-gH的特征肽之间评价了交叉分析物干扰。针对对其他分析物和内标准品的可能的信号贡献单独检验了每个内标准品。按预期使用水平仅用一种内标准品强化对照基质样品(“AI”)，并一式三份地分析。要求对来自在其预期保留时间出现的层析峰的分析物的响应的贡献小于在运行期间分析的可接受的LLOQ CAL和/或LLOQ QC中针对该分析物测定的平均层析响应的20％。要求在内标准品的预期保留时间出现的干扰层析背景峰的响应小于在用该内标准品强化并在运行期间分析的可接受的定量上限(ULOQ)CAL和高水平QC中针对该内标准品测定的平均层析响应的5％。总体上，未针对用抗-CI和抗-gH的特征肽的SIL IS强化的样品观察到显著的交叉分析物干扰。
通过使QC经受至少三个冻/融循环来在低和高QC浓度下评价了低温冰箱冻/融稳定性。每个水平分析了至少六个重复。对于重复测定，冻/融样品的变异系数小于或等于20％，平均准确度在理论浓度的±20％之内，证明抗-CI和抗-gH二者的可接受的冻/融稳定性。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但该描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容以其整体明确引入作为参考。

Claims (52)

1.分离的抗-特应抗体，其特异性结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，或特异性结合包含SEQID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体。
2.权利要求1的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体。
3.权利要求1的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体。
4.权利要求2的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
5.权利要求4的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
6.权利要求3的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
7.权利要求6的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
8.权利要求2的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR。
9.权利要求3的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的至少一个HVR。
10.权利要求3的抗-特应抗体，其中所述抗-特应抗体特异性结合包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体的HVR-H2(SEQ ID NO:36)。
11.权利要求1的抗-特应抗体，其与可检测标记缀合。
12.权利要求1的抗体，其与生物素缀合。
13.用于特异性检测生物样品中的目的抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，其包括：(a)使所述生物样品与捕获试剂接触并孵育，其中所述捕获试剂是权利要求1的抗-特应抗体，以便结合存在于所述样品中的任意目的抗体；和(b)使所述捕获试剂与结合所述目的抗体的可检测抗体接触，并且从而使任意结合的目的抗体与结合所述目的抗体的可检测抗体接触，且用所述可检测抗体的检测手段测量结合于所述抗-特应抗体的目的抗体的水平，其中所述目的抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合。
14.权利要求13的方法，其中将所述捕获试剂固定至固体支持物，且所述方法进一步包括将所述生物样品从下述固定的捕获试剂分开的步骤，所述固定的捕获试剂结合于存在的任意目的抗体。
15.权利要求14的方法，其中将所述固定的捕获试剂包被在微量滴定板上。
16.权利要求14的方法，其中将所述固定的捕获试剂与生物素缀合，并结合至链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板。
17.权利要求16的方法，其中所述可检测抗体是结合人抗体的来自非人物种的抗体。
18.权利要求17的方法，其中所述可检测抗体是小鼠抗-人IgG Fcγ抗体。
19.权利要求17或18的方法，其中所述可检测抗体可直接检测。
20.权利要求17或18的方法，其中将所述可检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。
21.权利要求17或18的方法，其中通过荧光测定试剂或量热测定试剂来检测所述可检测抗体。
22.用于特异性检测生物样品中的目的抗体的方法，其包括：(a)使所述生物样品与特异性结合所述目的抗体的抗-特应抗体接触并孵育；(b)使所述样品与结合所述抗-特应抗体的免疫亲和珠接触并孵育；(c)洗脱所述目的抗体；(d)将所述洗脱的目的抗体加至分离介质以实现一种以上样品组分的分开，其中分开的样品组分包含目的抗体或其片段或特征肽；和(e)通过质谱法测定一种或多种分开的样品组分的质量电荷比，其中所述目的抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合。
23.权利要求22的方法，其进一步包括在与所述免疫亲和珠孵育之后用蛋白酶处理所述生物样品，和洗脱所述目的抗体之前或之后，用蛋白酶处理所述生物样品。
24.权利要求23的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
25.权利要求22的方法，其中所述抗-特应抗体是生物素化的。
26.权利要求25的方法，其中所述抗-特应抗体结合链霉抗生物素蛋白包被的顺磁免疫亲和珠。
27.权利要求26的方法，其中所述抗-特应抗体在与所述生物样品接触和孵育之前，结合于所述免疫亲和珠。
28.权利要求22的方法，其中所述免疫亲和珠是磁珠。
29.权利要求22的方法，其中所述分离介质是层析支持物。
30.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，且所述抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
31.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的抗-HCMV抗体，且所述抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
32.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述抗-特应抗体包含SEQ ID NO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列。
33.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述目的抗体是包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体，且所述抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
34.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述目的抗体是包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体，且所述抗-特应抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
35.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述抗-特应抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列。
36.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述目的抗体是包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗-HCMV抗体，且所述抗-特应抗体特异性结合所述抗-HCMV抗体的HVR-H2(SEQID NO:36)。
37.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述目的抗体是包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体及(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体。
38.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述抗-特应抗体结合所述目的抗体，而不结合所述样品中的至少一种其他抗-HCMV抗体。
39.权利要求13-18和22-29中任一项的方法，其中所述生物样品分离自人对象。
40.权利要求39的方法，其中所述人对象已用选自以下的抗-HCMV抗体处理：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合。
41.权利要求13-18、22-29和40中任一项的方法，其中所述方法进一步包括用标准曲线来确定所述目的抗体与已知水平相比的水平。
42.权利要求13-18、22-29和40中任一项的方法，其中所述生物样品是血液、血浆或血清。
43.权利要求41的方法，其中所述样品是血清。
44.用于特异性检测生物样品中的目的抗体的免疫测定试剂盒，所述目的抗体选自：(a)包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的第一抗-HCMV抗体；(b)包含SEQ ID NO:3的重链序列和SEQID NO:4的轻链序列的第二抗-HCMV抗体；和(c)其组合；所述试剂盒包含：(a)含有特异性结合所述目的抗体的抗-特应抗体作为捕获试剂的容器；(b)含有结合所述目的抗体的可检测抗体的容器；和(c)检测所述目的抗体的说明书。
45.权利要求44的试剂盒，其在用于检测所述目的抗体的ELISA法中使用。
46.权利要求45的试剂盒，其进一步包含用于所述捕获试剂的固体支持物。
47.权利要求46的试剂盒，其中所述捕获试剂固定在所述固体支持物上。
48.权利要求47的试剂盒，其中所述捕获试剂包被在微量滴定板上。
49.权利要求44的试剂盒，其中所述抗-特应抗体选自：(a)包含SEQ IDNO:5的重链序列和SEQ ID NO:7的轻链序列的第一抗-特应抗体；(b)包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:11的轻链序列的第二抗-特应抗体；和(c)其组合。
50.分离的特异性结合抗-HCMV抗体的抗-特应抗体，其包含至少一个选自NO:13–24的重链高变区。
51.权利要求50的抗体，其包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
52.权利要求50的抗体，其包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
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