KR20140138971A - 항-hcmv 이디오타입 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-이디오타입 HCMV 항체뿐만 아니라 이들의 이용 방법을 제공한다.

Description

항-HCMV 이디오타입 항체 및 이들의 용도{ANTI-HCMV IDIOTYPIC ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 항-HCMV 이디오타입 항체 및 이들의 이용 방법에 관한 것이다.
인간 사이토메갈로바이러스(HCMV, Human cytomegalovirus )는 β-헤르페스바이러스이며, 인간 헤르페스바이러스-5(HHV-5, human herpesvirus-5)로도 알려져 있다. 쥐과 CMV(MCMV, murine CMV), 기니아피그 CMV(GPCMV, guinea pig CMV), 조류 CMV(SCCMV, simian CMV), 붉은 털 원숭이 CMV(rhCMV, rhesus CMV) 및 침팬지 CMV(CCMV, chimpanzee CMV)와 같이 추가 포유류를 감염시키는 다른 종의 사이토메갈로바이러스(CMV, cytomegalovirus)도 존재한다. HCMV는 미국 인구의 거의 50%가 감염되는 일반적인 헤르페스바이러스이다. 대부분의 감염된 인간 개인에서 HCMV 감염은 무증상성이다. 그러나 질병 상태이고 면역 저하 시(예로, HIV 감염, 이식 환자에서의 약물-유도 면역 억제 시), HCMV 재활성화 또는 일차 감염은 단핵구증, 간염, 망막염, 폐렴, 실명 및 기관 부전과 같은 다양한 임상 증상발현을 유도한다. 또한 임신 환경에서 CMV 일차 감염의 획득은 모체에는 거의 영향이 없을지라도 발달 태아에서는 중증의 임상적 영향을 미칠 수 있다.
임신 중 감염 모체에서 태어난 여러 아이들이 자궁 내 감염되어 파괴적인 임상 질환을 겪기 때문에 선천성 HCMV 감염이 특히 중요하다. 미국과 유럽에서, 126,000명의 여성이 임신 중 일차 HCMV 감염을 겪으며, 이들 모체에서 태어난 약 40,000명의 아기들이 선천성 감염을 겪는다. 미국에서는 750명 중 1명 꼴의 아이들이 HCMV 감염으로 인해 정신 지체, 청력 상실, 시력 상실, 기관 장애 및 성장 장애를 포함하는 장애를 갖고 태어나거나 장애가 발생한다. 선천성 HCMV 감염은 태아 장애의 가장 일반적인 감염 원인이다. 현재 임신한 여성의 일차 감염 발생 후 태아 감염을 예방하거나 치료하기 위해 승인된 치료법이 없다.
2005년에 Nigro와 동료들은 인간 CMV 고면역성 글로불린(HIG, human CMV hyperimmune globulin)을 일차 HCMV 감염된 임신부에 투여한 연구를 공개하였다(Nigro 등(2005) New Engl. J. Med. 353:1350-1362). 제1 연구군에서는 HCMV 감염 모체에서 태어난 31명의 유아 중 한 명만이 질환을 갖고 태어난 반면, 미치료 여성에서 태어난 아이들의 7/14(50%)는 HCMV 질환을 가지고 태어났다. [상동].
임신 중에 HCMV는 태반을 통해 감염 모체에서 태아로 전파될 수 있다. 태아를 자궁에 고정하는 태반은 특수한 상피 세포, 기질 섬유아세포, 내피 세포 및 특수한 대식구를 포함한다. HCMV 바이러스 표면은 태반에서 발견된 특수한 세포 유형의 감염에 필요한 것으로 나타난 다양한 바이러스 당단백질 복합체를 포함한다. gH/gL 및 UL128, UL130과 UL131을 포함하는 CMV 당단백질 복합체(본원에서 "복합체 I"로 불림)는 특히 내피 세포, 상피 세포 및 대식구의 감염을 위해 필요하다. gH/gL 및 gO를 포함하는 CMV 당단백질 복합체(본원에서 "복합체 II"로 불림)는 특히 섬유아세포의 감염을 위해 필요하다. HIG는 HCMV 감염에 취약한 전체 4가지 태반 세포 유형으로의 바이러스 진입을 차단하는 것으로 나타났다.
HIG의 제조 및 광범위한 배급의 어려움과 인간 혈액 산물을 특히 임신 여성에서 사용하는데 대한 의사 및 의료계의 주저로 인해, 선천성 HCMV 감염으로부터 태아를 보호할 수 있는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체들을 포함하는 조성물을 생성하는 것이 가장 유익할 것이다. CMV의 모체-태아 전파를 예방하기 위한 모노클로날 항체 조성물은 아직까지 개발되지 않았다. Lanzavecchia와 Macagno는 CMV 전파를 중화시키는 UL130 및 UL131의 조합 또는 UL128, UL130 및 UL131의 조합으로 생성되는 입체구조 에피토프에 결합하는 감염 환자의 불멸화 B 세포에서 단리된 천연 생성 항체들을 개시하였다(미국 특허 공개 번호 2008/0213265 및 2009/0081230). Shenk와 Wang은 복합체 I의 단백질에 결합하는 항체들을 개시하였다(미국 특허 번호 7,704,510). Funaro 등도 미국 특허 공개 번호 2010-0040602에 CMV에 대한 중화 항체들을 개시한다. 또한 항-gH 모노클로날 항체 MSL-109가 동종이형 골수 이식 수신자 그리고 AIDS 및 CMV 망막염 환자의 두 인간 환자군에서 평가되었으나 성공하지 못했다(Drobyski 등, Transplantation 51:1190-1196 (1991); Boeckh 등, Biol. Blood Marrow Transplant. 7:343-351 (2001); 및 Borucki 등, Antiviral Res. 64:103-111 (2004)).
본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입되는 미국 출원 일련 번호 13/248,998은 인간화 항-HCMV 모노클로날 항체를 개시한다. 미국 출원 번호 13/248,998에 개시된 항체는 섬유아세포, 상피 세포, 내피 세포 및 대식구에 대한 감염을 저해하기 위한 HCVM(HIG, human immunoglobulin) 감염 환자로부터의 인간 면역글로불린에 필적하는 중화 역가를 갖는 것으로 나타났다. 이들 항체는, 예를 들어 HCMV 감염, 선천성 HCMV 감염 및 HCMV-감염된 이식 조직을 통한 환자 감염의 예방, 저해 및/또는 치료에 유용하다.
또한 당분야에서는 HCMV에 대한 것이거나 이에 대한 것이 아닌 다른 항체(예로, 내인성 면역글로불린)를 검출하지 않고 생물학적 샘플 및/또는 임상 샘플에서 HCMV에 대한 치료적 인간화 모노클로날 항체를 검출하는 것이 필요하다. 본 발명은 특정한 항-HCMV 항체를 특이적으로 검출하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. 이들 항체는, 예를 들어 약동학(PK, pharmacokinetic) 및 약력학 연구, 그리고 환자들에서 치료적 항-HCMV 항체의 정량 및 모니터링에 유용하다.
본 발명은 항-HCMV 모노클로날 항체에 특이적으로 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체 또는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체를 제공한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체로부터의 모든 6개 HVR을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체로부터의 모든 6개 HVR을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 번호 11의 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 HVR-H2(서열 번호 36)에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 28에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 25 또는 서열 번호 26에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체들 중 임의 하나는 검출 가능한 표지에 콘쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체들 중 임의 하나는 바이오틴에 콘쥬게이션된다.
본 발명은 본 발명의 항-이디오타입 항체를 이용한 검출 방법을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 관심 항체를 특이적으로 검출하기 위한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 방법에 있어서, 상기 방법이, (a) 샘플에 존재하는 임의 관심 항체에 결합하도록 생물학적 샘플과 포착 시약을 접촉시키고 인큐베이션하며, 여기서 포착 시약은 청구항 1의 항-이디오타입 항체이고, (b) 포착 시약, 및 이에 따라 임의의 결합된 관심 항체를 관심 항체에 결합하는 검출 가능한 항체와 접촉시키고, 검출 가능한 항체의 검출 수단을 이용해서 항-이디오타입 항체에 결합된 관심 항체의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 관심 항체는 (a) 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합으로부터 선택되는 분석 방법을 제공한다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 포착 시약은 고형 지지체에 고정화되며, 상기 방법은 존재하는 임의의 관심 항체에 결합된 고정화된 포착 시약으로부터 생물학적 샘플을 분리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 고정화된 포착 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된다. 일부 구현예에서, 상기 고정화된 포착 시약은 바이오틴에 콘쥬게이션되며, 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 검출 가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비인간 종의 항체이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 마우스 항-huIgG Fcγ 항체이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 검출 가능한 항체는 직접 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 홀스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxidase)에 콘쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 상기 검출 가능한 항체는 형광측정 또는 비색측정 시약에 의해 검출된다.
본 발명은 하기를 포함하는 생물학적 샘플에서 관심 항체를 특이적으로 검출하는 방법을 추가로 제공한다: 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플을 관심 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체와 접촉시키고 인큐베이션함; (b) 상기 샘플을 상기 항-이디오타입 항체에 결합하는 면역친화성 비드와 접촉시키고 인큐베이션함; (c) 상기 관심 항체를 용출함; (d) 상기 용출된 관심 항체를 분리 매질에 적용하여 하나 초과의 샘플 성분을 분리하고, 여기서 분리된 샘플 성분이 상기 관심 항체 또는 이들의 단편 또는 특징 펩티드를 포함함; 및 (e) 하나 이상의 분리된 샘플 성분의 질량 대 전하비를 질량 분광측정에 의해 확립하고, 여기서 관심 항체는 (a) 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합으로부터 선택됨.
일부 구현예에서, 상기 방법은 면역친화성 비드와의 인큐베이션 후에 그리고 상기 관심 항체의 용출 이전 또는 이후에 상기 생물학적 샘플을 프로테아제로 처리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제는 트립신이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 바이오틴화된다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 면역친화성 비드에 결합한다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 상기 생물학적 샘플과의 접촉 및 인큐베이션 이전에 면역친화성 비드에 결합된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 면역친화성 비드는 자성 비드이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 분리 매질은 크로마토그래피 지지체이다.
상기 개시된 임의 방법들의 다양한 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함한다.
상기 개시된 임의 방법들의 다양한 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함한다.
상기 개시된 임의 방법들의 다양한 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 번호 11의 경쇄 서열을 포함한다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 결합한다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 HVR-H2(서열 번호 36)에 특이적으로 결합한다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 25 또는 서열 번호 26에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 항-HCMV 항체 상의 에피토프에 결합한다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이며 상기 항-이디오타입 항체는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 항-HCMV 항체 상의 에피토프에 결합한다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 관심 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 3의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체 및 (b) 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체이다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 상기 관심 항체에 결합하고 샘플 중의 적어도 하나의 다른 항-HCMV 항체에는 결합하지 않는다.
상기 개시된 임의 방법들의 다양한 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 인간 대상체에서 단리된다. 일부 구현예에서, 상기 인간 대상체는 (a) 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합에서 선택되는 항-HCMV 항체로 처리된다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 방법은 공지된 수준 대비 상기 관심 항체의 수준을 측정하기 위한 표준 곡선의 이용을 추가로 포함한다.
상기 개시된 임의 방법들의 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청이다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 혈청이다.
본 발명은 키트를 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합에서 선택되는 관심 항체를 생물학적 샘플에서 특이적으로 검출하기 위한 면역분석 키트를 제공하며, 상기 키트는 (a) 포착 시약으로 상기 관심 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 함유하는 용기; (b) 상기 관심 항체에 결합하는 검출 가능한 항체를 함유하는 용기; 및 (c) 상기 관심 항체의 검출 지침을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 상기 관심 항체를 검출하기 위한 ELISA 방법에서 유용하다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 상기 포착 시약에 대한 고형 지지체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 포착 시약은 상기 고형 지지체 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 상기 포착 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된다.
다양한 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 하나 이상의 상기 개시된 임의의 상기 항-이디오타입 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 (a) 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-이디오타입 항체; (b) 서열 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 번호 11의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-이디오타입 항체; 및 (c) 이들의 조합에서 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 번호 13 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 중쇄 고가변 영역을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합한다. 하나의 다른 구현예에서, 상기 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하고, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 항-이디오타입 HCMV 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 항체를 인코딩하는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 항체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 상기 숙주 세포를 배양하여 항체가 생성되도록 하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 상기 숙주 세포로부터 상기 항체의 회수를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 쥐과 mAb 4.25B10.15의 중쇄 가변 영역(VH)(서열 번호 5)과 마우스 생식계열 중쇄 가변 도메인 영역 IGHV1-54*03(서열 번호 6)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 고가변 영역들(HVRs)은 상자를 쳐서 표시한다. 마우스 생식계열 서열과 상이한 아미노산 잔기를 강조 표시한다.
도 2는 쥐과 mAb 4.25B10.15의 경쇄 가변 영역(VL)(서열 번호 7)과 마우스 생식계열 중쇄 가변 도메인 영역 IGKV5-39*01(서열 번호 8)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 아미노산은 Kabat 번호지정에 따라 번호를 표시한다. 고가변 영역들(HVRs)은 상자를 쳐서 표시한다.
도 3은 쥐과 mAb 1.9E1.1의 중쇄 가변 영역(VH)(서열 번호 9)과 마우스 생식계열 중쇄 가변 도메인 영역 IGHV1-50*01(서열 번호 10)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 고가변 영역들(HVRs)은 상자를 쳐서 표시한다. 마우스 생식계열 서열과 상이한 아미노산 잔기를 강조 표시한다.
도 4는 쥐과 mAb 1.9E1.1의 경쇄 가변 영역(VL)(서열 번호 11)과 마우스 생식계열 중쇄 가변 도메인 영역 IGLV1*01(서열 번호 12)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 아미노산은 Kabat 번호지정에 따라 번호를 표시한다. 고가변 영역들(HVRs)은 상자를 쳐서 표시한다. 마우스 생식계열 서열과 상이한 아미노산 잔기를 강조 표시한다.
도 5는 바이오틴-콘쥬게이션된 항-HCMV 이디오타입 항체(예로 1.9E1.1)가 스트렙타비딘이 코팅된 플레이트에, 그리고 용액 중의 치료적 항-HCMV 항체에 결합하는 항-HCMV PK ELISA 포맷을 나타낸다. 이어서 복합체는 화학발광 검출을 위해 HRP에 콘쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fcγ항체에 결합된다.
도 6은 실시예 2에 기재된 항-HCMV PK ELISA를 이용하여 결정된 항-HCMV 항체들인 항-CI 및 항-gH에 대한 다양한 정제된 항-이디오타입 항체들의 결합 활성을 나타낸다.
도 7은 실시예 2에 기재된 항-HCMV PK ELISA에서 포착 항체로서 항-이디오타입 모노클로날 항체 1.9E1.1를 이용하여 항-HCMV 항체인 항-gH로 스파이크 처리한 개별 혈청 샘플들의 회수를 나타낸다.
도 8은 항-HCMV 이디오타입 항체(예로 4.25B10.15)가 치료적 항-HCMV 항체에 결합하기 위해 고형 지지체 상에 고정된 항-HCMV PK ELISA 포맷을 나타낸다. 이어서 복합체는 화학발광 검출을 위해 HRP에 콘쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fcγ항체에 결합된다.
도 9는 실시예 3에 기재된 항-HCMV PK ELISA에서 포착 항체로서 항-이디오타입 모노클로날 항체 4.25B10.15 또는 4.23F9.5를 이용하여 항-HCMV 항체인 항-CI로 스파이크 처리한 개별 혈청 샘플들의 회수를 나타낸다. 항-CI는 풀링 샘플 및 샘플 1-4에 대해서는 4 ㎍/mL(고) 또는 0.5 ㎍/mL(저)에서; 샘플 5에 대해서는 2 ㎍/mL(고) 또는 0.6 ㎍/mL(저)에서, 그리고 샘플 6 및 7에 대해서는 7.62 ㎍/mL(고) 또는 0.476 ㎍/mL(저)에서 스파이크 처리되었다.
I. 정의
"친화도"는 분자(예로, 항체)의 단일 결합 부위 및 그 결합 파트너(예로, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 이용되는 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예로, 항체 및 항원) 간 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여 당분야에 공지된 일반적 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 실례적이고 예시적 구현예가 하기에 기재된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의의 개념으로 이용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예로 2특이적 항체), 및 항체 단편을 비제한적으로 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예로, scFv); 및 항체 단편에서 형성되는 다특이적 항체가 비제한적으로 포함된다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 나타낸다. 5개의 주요 항체 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 일부는 서브클래스(이소형), 예로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 구분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 클래스에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "검출하는"은 표적 분자의 정성적 및 정량적 측정 모두를 포괄하는 가장 광의의 개념으로 이용된다. 하나의 측면에서, 본원에 기재되는 검출 방법은 생물학적 샘플에서 관심 항체의 단순한 존재를 확인하는데 이용된다. 또 다른 측면에서, 방법은 샘플 중 관심 항체가 검출 가능한 수준으로 존재하는지를 평가하는데 이용된다. 또 다른 측면에서, 방법은 샘플 중 관심 항체의 양을 정량하고, 또한 상이한 샘플의 항체 수준을 비교하기 위해 이용될 수 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 관심 항체를 함유할 수 있는 임의의 생물학적 물질을 나타낸다. 샘플은 생물학적 유체, 예컨대 전혈 또는 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장을 포함하는 전혈 성분, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 난포액, 정액, 양수, 모유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 및 관심 항체를 함유할 수 있는 다른 신체 성분일 수 있다. 다양한 구현예에서, 샘플은 임의 동물의 신체 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 포유류에서 유래한다. 일부 구현예에서, 샘플은 인간 대상체에서 유래한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 치료적 항-HCMV 항체 또는 항체들로 치료받은 환자 또는 임상 환자에서 유래한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다.
용어 "포착 시약" 또는 "코팅 항체"는 관심 항체의 이디오타입에 결합하고 적합한 조건 하에서 생물학적 샘플 중 관심 항체에 결합하고 이를 포착할 수 있는 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체들의 혼합물을 나타내며 포착 시약 및 관심 항체의 복합체는 나머지 샘플에서 분리될 수 있다.
본원에서 이용되는 "항-이디오타입 항체"는 인지체 항체, 이 경우에는 관심 항체의 VH 및/또는 VL 도메인에 결합하는 항체이다. 전형적으로, 상기 항-이디오타입 항체는 마우스와 같은 포유류를 관심 항체로 면역화하고 하이브리도마를 제조하고 하이브리도마에서 유도되는 항체 패널에서 포착 시약에 대한 것이건 검출 가능한 항체에 대한 것이건 무관하게 분석에서 가장 깨끗한 신호를 생성하는 항체를 선택하여 제조된다. 전형적으로 포착 시약은 고정되거나 고정화 가능하다. 이러한 항-이디오타입 항체는 모노클로날 항체이며, 예를 들어 설치류 항체, 예컨대 쥐과 또는 래트 항체일 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "항-복합체 I 항체", "항-CI 항체" 또는 "항-CI "는 서열 번호 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 2의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-HCMV 항체 또는 아래에 나타낸 바와 같은 적어도 하나의 HVR 영역을 포함하는 항체를 나타낸다:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGLEWI
G WINTYTGEPTYADDFKG RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYC
AR SWYYVSNYWYFDV WGQGTLVTVSS (서열 번호 1)
진한 밑줄 친 서열은 서열 번호 1의 HVR-H1(서열 번호 29), HVR-H2(서열 번호 30) 및 HVR-H3(서열 번호 31)에 해당한다.
SVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSQHSTYTIE WYQQQPGKGPRYLMK
LKKDGSHSTGD GIPDRFSGSSSGADRYLTISNLQSEDEADYYC GVGDT
IKEQFVYV FGGGTKLTVLG (서열 번호 2)
진한 밑줄 친 서열은 서열 번호 2의 HVR-L1(서열 번호 32), HVR-L2(서열 번호 33) 및 HVR-L3(서열 번호 34)에 해당한다.
본원에서 이용되는 용어 "항-gH 항체" 또는 "항-gH"는 서열 번호 3의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 4의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-HCMV 항체 또는 아래에 나타낸 바와 같은 적어도 하나의 HVR 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
EEQVLESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSPYSVF WVRQAPGKGLEWV
SSINSNSRYKYYADSVKG RFTISRDNAENSIFLQMNSLRAEDTAVYYC
ARDRSYYAFSSGSLSDYYYGLDV WGQGTLVTVSS (서열 번호 3)
진한 밑줄 친 서열은 서열 번호 3의 HVR-H1(서열 번호 35), HVR-H2(서열 번호 36) 및 HVR-H3(서열 번호 37)에 해당한다.
DIVMTQSPLSLSVTPGEPASISC RSSQSLLHTNGYNYLD WYVQKPGQS
PQLLIY LASNRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC MQA
LQIPRT FGQGTKVEIK (서열 번호 4)
진한 밑줄 친 서열은 서열 번호 4의 HVR-L1(서열 번호 38), HVR-L2(서열 번호 39) 및 HVR-L3(서열 번호 40)에 해당한다
본원에서 이용되는 "항-CI 이디오타입 항체"는 항-CI의 검출에 유용한 충분한 특이성과 친화도로 서열 번호 1의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항-CI 모노클로날 항체 또는 서열 번호 1의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항-CI 모노클로날 항체의 전체 6개 고가변 영역(예로, 서열 번호 29-34)을 포함하는 항-CI 항체에 특이적으로 결합하는 것이다.
본원에서 이용되는 "항-gH 이디오타입 항체"는 항-gH의 검출에 유용한 충분한 특이성과 친화도로 서열 번호 3의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항-gH 모노클로날 항체 또는 서열 번호 3의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 항-gH 모노클로날 항체의 전체 6개 고가변 영역(예로, 서열 번호 35-40)을 포함하는 항-gH 항체에 특이적으로 결합하는 것이다.
용어 "검출 가능한 항체"는 관심 항체에 결합하고, 검출 수단에 의해 증폭되는 표지를 통해 직접 또는 예로 표지되는 또 다른 항체를 통해 간접 검출될 수 있는 항체를 나타낸다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비인간 종의 항체이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 관심 항체의 이디오타입에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이러한 항체들의 혼합물이다. 직접 표지를 위해, 항체는 전형적으로 일부 수단에 의해 검출 가능한 부분에 콘쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 홀스래디쉬 페록시다아제에 콘쥬게이션된다.
용어 "검출 수단"은 본원의 분석에서 측정되는 보고 신호를 통해 검출 가능한 항체의 존재를 검출하는데 이용되는 부분 또는 기법을 나타낸다. 마이크로타이터 플레이트 상에 포착된 표지와 같은 고정화된 표지를 증폭하는 시약이 포함된다.
*본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 이용된다. 상기 용어에는 천연 서열의 Fc 영역 및 변이형 Fc 영역이 포함된다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226에서, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나 Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호지정은 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호지정 시스템에 따른다.
"틀" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 구성된다. 따라서 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환적으로 이용되어 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양"은 상호 교환적으로 이용되며 외인성 핵산이 도입된 세포와 이들 세포의 자손을 포함하여 나타낸다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되며, 여기에는 일차 형질전환된 세포와 계대의 수에 무관하게 이들로부터 유도된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 내용물이 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 인코딩 서열을 이용하는 비인간 원천에서 유도되는 항체에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 상기 정의에는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체가 제외된다.
"인간 공통 틀"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 틀 서열의 선택에서 가장 일반적으로 나타나는 아미노산 잔기를 나타내는 틀이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 서브그룹에서 선택된다. 일반적으로 서열의 서브그룹은 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 서브그룹이다. 하나의 구현예에서, VL에 대한 서브그룹은 [Kabat 등, supra]에서의 서브그룹 카파 I이다. 하나의 구현예에서, VH에 대한 서브그룹은 [Kabat 등, supra]에서의 서브그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 인간 FR로부터의 아미노산 잔기 및 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 적어도 하나 그리고 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 여기서 전부 또는 실질적으로 전부의 HVR(예로 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하며, 전부 또는 실질적으로 전부의 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체에서 유래되는 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예로 비인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 거친 항체를 나타낸다.
본원에서 이용되는 용어 "고가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에 고가변성이 있고/있거나 구조적으로 정의되는 루프("고가변 루프"를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 나타낸다. 일반적으로, 천연 4개 사슬의 항체는 6개의 HVR을 포함한다; 3개는 VH에 있고(H1, H2, H3), 3개는 VL에 있다(L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 고가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 가장 높은 서열 변이를 갖고/갖거나 항원 인식에 관여한다. 예시적인 고가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 생긴다. (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 생긴다. (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 고가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약자화된 CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR 영역 내에 포함된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 생긴다. (Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참고). 달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예로 FR 잔기)는 본원에서 [Kabat 등, supra]에 따라 번호지정된다.
"개인" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류에는 가축 동물(예로, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예로 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예로 마우스 및 래트)가 비제한적으로 포함된다. 특정 구현예에서, 개인 또는 대상체는 인간이다.
본원에서 이용되는 "유야"는 출생 연령이 약 1년 이하인 개인 또는 대상체를 나타내며, 0 내지 약 12개월령의 유아가 포함된다.
"단리된" 항체는 그 천연 환경 성분에서 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어 전기영동(예로 SDS-PAGE, 등전 초점조절(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예로, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정되는 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 리뷰는, 예로 [Flatman 등, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참고한다.
"단리된" 핵산은 그 천연 환경의 성분에서 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산에는 보통 핵산 분자를 함유하는 세포에 포함된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 그 천연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 또는 염색체 외부에 존재한다.
"항-이디오타입 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별개의 벡터들에서의 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자(들)를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 나타낸다.
본원에서 이용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종성인 항체 모집단에서 수득되는 항체, 즉 모집단을 형성하는 개별 항체가, 예로 천연 생성 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 조제물의 생성 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고 동일하고/동일하거나 동일한 에피토프에 결합하는 것을 나타내며, 상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 생성된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과는 대조적으로, 모노클로날 항체 조제물의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 생성된다. 따라서 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종성 항체 모집단에서 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 이용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 및 인간 면역글로불린 유전자위의 전체 또는 일부를 함유하는 유전자도입 동물을 이용하는 방법을 비제한적으로 포함하는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체의 제조를 위한 이러한 방법 및 다른 예시적 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종성 부분(예로 세포독성 부분) 또는 방사성 표지에 콘쥬게이션되지 않은 항체를 나타낸다. 네이키드 항체는 약학 제형물 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 생성 면역글로불린 분자를 나타낸다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디설피드-결합으로 연결된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이다. N- 에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게 N- 에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄에는 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나가 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 해당 치료 제품의 이용에 관한 적응증, 용도, 투여량, 투여, 병용 치료, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 시판 패키지에 일반적으로 포함하는 지침을 나타내는데 이용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열 동일성의 일부로 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 서열 동일성 백분율을 얻기 위해 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율의 결정 목적을 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 당분야의 기술 수준 내에서 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당분야 숙련자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬을 위해 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나 본원에서의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 %값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.이 저자로서 그 소스 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록된 미국 저작권 사무소, Washington D.C., 20559에 사용자 문서와 함께 출원되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California에서 공개적으로 이용 가능하며, 혹은 소스 코드에서 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 체계에서 사용하도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2가 채용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 와의, 또는 대비한 아미노산 서열 동일성%(대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 와, 또는 대비해 특정한 아미노산 서열 동일성%를 갖는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로도 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
*100 곱하기 X/Y
식 중, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 스코어링되는 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성%와 같지 않은 것으로 이해될 것이다. 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 아미노산 서열 동일성%값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.
항-HCMV 항체의 "특징 펩티드"는 하나의 항체 이소형에 배타적으로 존재하는 단백분해 펩티드(예로 트립신 분해 펩티드)를 나타낸다. 예를 들어, 항-CI 특징 펩티드는 서열 번호 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 2의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-HCMV 항체에 배타적으로 존재하는 트립신 분해 펩티드일 수 있다. 추가 예에서, 항-gH 특징 펩티드는 서열 번호 3의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 4의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-HCMV 항체에 배타적으로 존재하는 트립신 분해 펩티드일 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원으로의 결합에 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 틀 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다. (예로, Kindt 등, Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman 및 Co., page 91 (2007) 참고.) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예로, [Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991)]을 참고한다.
본원에서 이용되는 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 용어에는 자가 복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입되는 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 나타낸다.
II. 조성물 및 방법
하나의 측면에서, 본 발명은 인간화된 항-HCMV 모노클로날 항체인 항-CI 및 항-gH에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항-CI에 결합하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 항-gH에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 생물학적 샘플, 예를 들어 임상 샘플에서 예로 항-CI 및 항-gH의 검출 및/또는 정량을 위해 유용하다.
A. 예시적인 항-이디오타입 항체
하나의 측면에서, 본 발명은 항-CI 및 항-gH의 검출에 유용하기 충분한 특이성 및 친화도를 갖는 항-HCMV 항체 항-CI 또는 항-gH에 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 모든 6개 HVR을 포함하는 항-HCMV 항체에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 모든 6개 HVR을 포함하는 항-HCMV 항체에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
(a) HVR-H1은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HVR-H2는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하며;
(c) HVR-H3은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HVR-L1은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하며;
(e) HVR-L2는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
(f) HVR-L3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
(a) HVR-H1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HVR-H2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며;
(c) HVR-H3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HVR-L1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하며;
(e) HVR-L2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고;
(f) HVR-L3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 번호 11의 경쇄 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-CI 이디오타입 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환(예로, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만 해당 서열을 포함하는 항-CI 이디오타입 항체는 항-CI에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 번호 5에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖 영역에서(즉 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-CI 이디오타입 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 5에서의 VH 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH는 하기로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 서열 번호 7의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-CI 이디오타입 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환(예로, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항-CI 이디오타입 항체는 항-CI에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 번호 7에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖 영역에서(즉 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-CI 이디오타입 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 7에서의 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VL은 하기로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의 구현예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의 구현예에서와 같은 VL을 포함하는 항-CI 이디오타입 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 해당 서열들의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 5 및 서열 번호 7에서의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-gH 이디오타입 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환(예로, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 해당 서열을 포함하는 항-gH 이디오타입 항체는 항-gH에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 번호 9에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖 영역에서(즉 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-gH 이디오타입 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 9에서의 VH 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH는 하기로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-gH 이디오타입 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환(예로, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 해당 서열을 포함하는 항-gH 이디오타입 항체는 항-gH에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 번호 11에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖 영역에서(즉 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-gH 이디오타입 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 11에서의 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VL은 하기로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의 구현예들에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의 구현예들에서와 같은 VL을 포함하는 항-gH 이디오타입 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 해당 서열들의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 9 및 서열 번호 11에서의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-HCMV 이디오타입 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 서열 번호 5의 VH 서열 및 서열 번호 7의 VL 서열을 포함하는 항-CI 이디오타입 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 서열 번호 9의 VH 서열 및 서열 번호 11의 VL 서열을 포함하는 항-gH 이디오타입 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 서열 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 서열 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 HVR-H2(서열 번호 36)에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 28에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 25 또는 서열 번호 26에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28에서 선택되는 아미노산 서열 내에 포함되는 에피토프에 결합한다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 구현예들에 따른 항-HCMV 이디오타입 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서, 항-HCMV 이디오타입 항체는 항체 단편, 예로 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 전장 항체, 예로 온전한 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.
A. 항체 제조
본 발명에 따라 이용되는 항-이디오타입 항체의 제조를 위한 예시적 기법에 대한 설명은 다음과 같다.
1. 폴리클로날 항체
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당분야 숙련자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는, 예를 들어 면역화 제제 및 필요하다면 보강제의 1회 이상의 주입에 의해 포유류에서 생성될 수 있다. 전형적으로 면역화 제제 및/또는 보강제는 다회의 피하 또는 복강내 주입에 의해 포유류에 주입될 것이다. 면역화 제제에는 항-CI, 항-gH, 이들의 항원 결합 단편, 또는 이들의 융합 단백질이 포함될 수 있다. 면역화되는 포유류에서 면역원성으로 알려져 있는 단백질에 면역화 제제를 콘쥬게이션하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예에는 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제가 비제한적으로 포함된다. 채용될 수 있는 보강제의 예에는 프로인트 완전 보강제 및 MPL-TDM 보강제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로오스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 프로토콜은 당분야 숙련자가 과도한 실험 없이 선택할 수 있다. 이어서 포유류에서 채혈하고, 혈청을 항-이디오타입 항체 역가에 대해 분석할 수 있다. 필요하다면 항체 역가가 증가하거나 안정화될 때까지 포유류에 추가 접종할 수 있다.
2. 모노클로날 항체
본 발명의 항체는 대안적으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 [Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)]에서 최초 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예로, 미국 특허 번호 4,816,567 참고)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화를 위해 이용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 생성하기 위해 상술된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구가 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구가 단리된 후 적합한 융합 제제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포주에 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 미융합 부모 골수종 세포(융합 파트너로도 불림)의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종되고 성장된다. 예를 들어, 부모 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마에 대해 선택적인 배양 배지는 전형적으로 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다(HAT 배지).
융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 제조 세포에 의해 안정적인 고수준의 항체 제조를 뒷받침하며, 미융합 부모 세포에 대해 선택하는 선택 배지에 민감함 것들이다. 골수종 세포주는 쥐과 골수종 세포주, 예컨대 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA에서 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 유래의 것들, 및 SP-2와 유도체, 예로 American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA에서 입수 가능한 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해 기재되었다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 생성된 모노클로날 항체의 제조에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 제조되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관 내 결합 분석, 예컨대 방사선면역분석(RIA) 또는 효소 연관 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 [Munson 등, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 제조하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 상기 목적을 위해 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는, 예로 마우스 내로 세포의 i.p. 주입에 의해 동물에서 종양의 복수로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적 항체 정제 절차, 예를 들어 친화도 크로마토그래피(예로, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로오스를 이용) 또는 이온 교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적 절차를 이용하여(예로, 쥐과 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여) 쉽게 단리되고 서열 분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 원천으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내에 배치될 수 있고, 이는 처리 없이는 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 E. coli 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득할 수 있다. 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 문헌에는 [Skerra 등, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]이 포함된다.
추가 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 [McCafferty 등, Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기법을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리에서 단리될 수 있다. [Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 이용한 쥐과 및 인간 항체 각각의 단리를 기재한다. 이후 문헌들은 매우 큰 파지 라이브러리의 구축을 위한 전략으로서 사슬 셔플링(Marks 등, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라 조합 감염 및 생체 내 재조합에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 제조를 기재한다(Waterhouse 등, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). 따라서 이들 기법은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기법에 대한 활용 가능한 대안들이다.
원칙적으로 합성 항체 클론은 파지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리의 스크리닝에 의해 선택된다. 이러한 파지 라이브러리가 원하는 항원에 대해 스크리닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고 이에 따라 라이브러리에서 비결합 클론으로부터 분리된다. 이어서 결합 클론이 항원에서 용출되고 추가적인 사이클의 항원 흡착/용출에 의해 추가 농축될 수 있다.
가변 도메인은 VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서, 또는 각각 불변 도메인에 융합되고 비공유 상호작용하는 Fab 단편으로서 파지 상에서 기능적으로 디스플레이될 수 있다[Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원 결합 클론에 대해 검색될 수 있다.
VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위 재조합될 수 있고, 이어서 [Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원 결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 원천으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대해 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로 미감작 레퍼토리가 클로닝되어 [Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 인간 항체의 단일 원천을 제공할 수 있다. 마지막으로 미감작 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터의 미배열 V 유전자 절편을 클로닝하고 고가변 CDR3 영역을 인코딩하는 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 이용하여 [Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 재배열을 수행하여 합성적으로 제조될 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당분야에 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항-CI 또는 항-gH가 흡착 플레이트의 웰을 코팅하거나 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현되거나 세포 정렬에 이용되거나, 또는 스트렙타비딘이 코팅된 비드를 이용한 포착을 위해 바이오틴에 콘쥬게이션되거나, 또는 패닝 디스플레이 라이브러리를 위한 임의의 다른 방법에서 이용될 수 있다.
느린 해리 역학(및 우수한 결합 친화도)을 갖는 항체의 선택은 [Bass 등, Proteins, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690]에 기재된 바와 같이 긴 세척 및 1가 파지 디스플레이의 이용 및 [Marks 등, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 저밀도 항원 코팅에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명의 임의의 항-이디오타입 항체는 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 관심 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차의 설계에 이어 적합한 불변 영역(Fc) 서열 및 관심 파지 클론의 Fv 서열을 이용한 전장 항-이디오타입 항체 클론의 구축에 의해 수득될 수 있다.
3. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 개질을 도입하여 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질에는, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 구축물이 원하는 특징, 예로 항원 결합을 보유하는 한, 임의 조합의 결실, 삽입, 및 치환이 최종 구축물에 생성되도록 수행될 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이화를 위한 관심 부위에는 HVR 및 FR이 포함된다. 보존적 치환을 "보존적 치환"이라는 제목 하에 표 1에 나타낸다. 보다 실질적인 변화를 "예시적 치환"이라는 제목 하에 표 1에, 아미노산 측쇄 클래스를 나타내어 아래에 더 상세히 기재하여 제공한다. 아미노산 치환이 관심 항체 내로 도입될 수 있고, 산물이 원하는 활성, 예로 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
원래
잔기 		예시적
치환 		바람직한
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 필요로 할 것이다.
치환 변이체의 한 유형에는 부모 항체(예로, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기의 치환이 관여된다. 일반적으로 추가 연구를 위해 선택된 생성 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정한 생물학적 특성의 개질(예로 개선)(예로 증가된 친화도, 감소된 면역원성)을 가질 것이고/것이거나 부모 항체의 특정한 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체로, 이는 예로 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기법을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지에 디스플레이되고 특정한 생물학적 활성(예로 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변형(예로, 치환)은, 예로 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에 수행될 수 있다. 이러한 변형은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기(예로, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) 참고), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 수행될 수 있으며, 생성 변이체 VH 또는 VL이 결합 친화도에 대해 평가된다. 이차 라이브러리의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예로 [Hoogenboom 등. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O?rien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되었다. 친화도 성숙의 일부 구현예에서, 임의의 다양한 방법(예로, 오류율이 높은 PCR, 사슬 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이화)에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자 내로 다양성이 도입된다. 이어서 이차 라이브러리가 생성된다. 라이브러리는 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법에는 HVR-지정 접근이 관여되며, 여기에는 몇몇 HVR 잔기(예로, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여되는 HVR 잔기는, 예로 알라닌 스캐닝 돌연변이화 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 자주 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변형(예로, 본원에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 수행될 수 있다. 이러한 변형은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 밖에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR은 변형되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
[Cunningham 및 Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 돌연변이화를 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역 확인을 위해 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이화"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기 그룹(예로, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기)이 확인되고 항체와 항원의 상호작용이 영향받는지를 결정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예로 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 추가 치환이 처음 치환에 대해 기능적 민감도를 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 간 접촉 포인트를 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 주변 잔기는 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 포함하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입에는 1개 잔기에서 백 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는 항체의 N- 또는 C-말단의 효소(예로 ADEPT에 대한 것) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드로의 융합이 포함된다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예로 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-이디오타입 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예로, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예로, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다(예로, 하기로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물이다, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프종세포(예로, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 구현예에서, 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체의 제조 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공되는 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 선택적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)에서 회수하는 것을 포함한다.
항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체의 재조합 제조를 위해, 예로 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적 절차를 이용하여(예로 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체를 인코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 본원에 기재된 원핵생물 또는 진핵생물 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 제조될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예로 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참고한다. (또한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254를 참고한다(E. coli에서 항체 단편의 발현을 기재함)). 발현 후, 항체가 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트에서 단리될 수 있고 추가 정제될 수 있다.
원핵생물에 부가하여, 진핵생물 미생물, 예컨대 필라멘트성 진균 또는 효모는 그 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체 제조를 일으키는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 항체 인코딩 벡터를 위해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 등, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참고한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 개체(무척추동물 및 척추동물)에서 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(podoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 이용될 수 있는 여러 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양도 숙주로 이용될 수 있다. 예로, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429를 참고한다(형질감염 식물에서의 항체 제조를 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재함).
척추동물 세포도 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 성장에 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예로, Graham 등, J. Gen Virol. 36:59 (1977)에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 버팀 세포(예로, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이신장 세포(VERO-76); 인간 경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예로, Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 DHFR- CHO 세포(Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 제조에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해서는, 예로 [Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참고한다.
C. 분석
본원에 제공된 항-HCMV 이디오타입 항체는 당분야에 공지된 다양한 분석에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나 스크리닝되거나 또는 분석될 수 있다.
1. 결합 분석 및 다른 분석
하나의 측면에서, 본 발명의 항체는, 예로 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 그 항원 결합 활성에 대해 평가된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-HCMV 이디오타입 항체와 항-HCMV 항체의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 경쟁 분석이 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 이러한 경쟁 항체는 항-CI의 동일한 에피토프(예로 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 특정 구현예에서, 이러한 경쟁 항체는 항-gH의 동일한 에피토프(예로 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다.
항체가 결합하는 에피토프의 맵핑을 위한 상세한 예시적 방법은 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology 중 vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적 경쟁 분석에서, 고정화된 항-HCMV 항체는 항-HCMV 항체에 결합하는 제1 표지 항체 및 항-HCMV 항체에 대한 결합에 있어서 제1 항체와 경쟁하는 그 능력을 평가받는 제2 미표지 항체 각각을 포함하는 용액 중에 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로 고정화된 항-HCMV 항체는 제1 표지 항체를 포함하지만 제2 미표지 항체는 포함하지 않는 용액 중에 인큐베이션된다. 항-HCMV 항체에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서의 인큐베이션 후, 과량의 미결합 항체가 제거되고, 고정화된 항-HCMV 항체와 연합된 표지의 양이 측정된다. 고정화된 항-HCMV 항체와 연합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 평가 샘플에서 실질적으로 감소된 경우, 제2 항체가 항-HCMV 항체에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 시사한다. [Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]를 참고한다.
경쟁 분석은 또한 항-HCMV 항체로 형질감염되고 세포 표면에 발현되는 세포를 이용한 FACS로 상술된 바와 같은 방식으로 수행될 수 있다. 추가적으로 항-HCMV 항체를 이용한 ELISA는 경쟁 분석에서 또한 이용될 수 있다.
D. 검출 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-이디오타입 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 생물학적 샘플 중 항-HCMV 항체인 항-CI 또는 항-gH의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 본원에서 이용되는 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예컨대 전혈, 또는 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장을 포함하는 전혈 성분, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 난포액, 정액, 양수, 모유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 및 관심 항체를 함유할 수 있는 다른 신체 성분이다. 다양한 구현예에서, 샘플은 임의 동물의 신체 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 포유류에서 유래한다. 일부 구현예에서, 샘플은, 예를 들어 임상 샘플에서의 인간화된 항체와 같이, 항체 측정 시 인간 대상체에서 유래한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 치료용 항-HCMV 항체(예로, 항-CI 및/또는 항-gH)로 치료받은 환자 또는 임상 환자에서 유래한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다.
특정 구현예에서, 표지된 항-HCMV 이디오타입 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 표지에는 직접 검출되는 표지 또는 부분(예컨대 형광, 발색, 전자 밀집, 화학발광 및 방사활성 표지)뿐만 아니라, 예로 효소 반응 또는 분자적 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 부분이 비제한적으로 포함된다. 예시적 표지에는 방사선 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레신 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라아제, 예로 초파리 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제(미국 특허 번호. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP), 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예로 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제(HRP와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 채용하는 효소와 커플링됨), 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 바이오틴/애비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등이 비제한적으로 포함된다.
1. ELISA
일부 구현예에서, 항-HCMV 이디오타입 항체는 ELISA 분석에서 이용된다. 본원에 기재된 분석은 관심 항체에 대한 포착 시약으로 항-HCMV 이디오타입 항체를 이용하는 ELISA이다. 분석의 첫 번째 단계에서, 관심 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플은 포착(또는 코팅) 항체와 접촉되고 인큐베이션되어 포착 항체가 관심 항체를 포착하거나 결합하여 검출 단계에서 검출될 수 있도록 한다. 검출 단계에는 검출 가능한 항체의 이용이 관여되며, 이는 임의의 결합된 관심 항체와 접촉되는 경우 존재한다면 관심 항체에 결합한다. 검출 수단을 이용해서 항체 상 표지를, 그리고 이에 따라 존재하는 관심 항체의 존재 또는 양을 검출한다.
특정 구현예에서, 분석은 다음 단계를 이용한다.
첫 번째 단계
본원에서 분석의 첫 번째 단계에는 본원에 정의된 관심 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플이 관심 항체에 대해 생성된 항-이디오타입 항체인 고정화된 포착(또는 코팅) 시약과 접촉되고 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 이들 항체는 모노클로날 항체이며, 임의 종에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 설치류 항체이며, 추가 구현예에서는 쥐과 또는 래트 항체, 그리고 추가구현예에서는 쥐과 항체이다.
다양한 구현예에서, 항-이디오타입은 본원에 개시된 임의의 항-이디오타입 항체이다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하는 항체이며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 서열 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 번호 11의 경쇄 서열을 포함한다.
고정화는 통상적으로 분석 절차 전에 포착 시약을 수불용성 매트릭스 또는 표면으로의 흡착에 의해(미국 특허 번호 3,720,760) 또는 비공유 또는 공유 커플링에 의해(예를 들어 미국 특허 번호 3,645,852 또는 Rotmans 등; J. Immunol. Methods, 57:87-98 (1983)에 기재된 바와 같은 환원제 및 질산으로 지지체의 사전 활성화를 이용해서 또는 이용하지 않고 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 가교를 이용해서) 또는 이후에, 예로 면역침전에 의해 불용화함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 포착 항체는 바이오틴에 콘쥬게이션되고 스트렙타비딘이 코팅된 표면에 결합된다. 다른 구현예에서, 포착 항체는 단백질 태그, 예컨대 His 태그 또는 GST에 콘쥬게이션되고, 적합한 표면, 예로 니켈 또는 구리 코팅 표면이나 글루타치온 코팅 표면에 결합된다.
고정화에 이용되는 고상은, 예로 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태의 지지체를 포함하여 본질적으로 수불용성이고 면역측정 분석에 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 담체일 수 있다. 일반적으로 이용되는 지지체의 예에는 작은 시트, SEPHADEX®겔, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드 및 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로 제조되는 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 포함하는 분석 플레이트 또는 시험관뿐만 아니라 입상 재료, 예컨대 여과지, 아가로오스, 가교 덱스트란 및 다른 다당류가 포함된다. 대안적으로 미국 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에 기재된 반응성 수불용성 매트릭스, 예컨대 시아노겐-브로마이드 활성화 탄수화물 및 반응성 기재가 포착 시약 고정화에 적합하게 채용된다. 일부 구현예에서, 고정화된 포착 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된다. 일부 구현예에서, 이용되는 고상은 한 번에 여러 샘플을 분석하는데 이용될 수 있는 멀티웰 마이크로타이터 플레이트, 예를 들어 MICROTEST™ 또는 MAXISORP™ 96-웰 ELISA 플레이트, 예컨대 NUNC MAXISORB™ 또는 IMMULON™으로 판매되는 것이다.
고상은 상기 정의된 바와 같이 포착 시약으로 코팅되며, 이는 원하는 대로 비공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 연결에 의해 연결될 수 있다. 부착을 위한 기법에는 미국 특허 번호 4,376,110 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재된 것들이 포함된다. 공유인 경우, 플레이트 또는 다른 고상은 당분야에 널리 공지된 조건 하에, 예컨대 실온에서 1시간 동안 포착제와 함께 가교제와 인큐베이션된다.
고상 기재에 포착 시약을 부착하기 위해 일반적으로 이용되는 가교제에는, 예로 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 호모이관능성 이미도에스테르, 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르, 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드가 포함된다. 유도체화 제제, 예컨대 메틸-3-((p-아지도페닐)디티오)프로피온이미데이트는 광의 존재 하에 가교를 형성할 수 있는 광활성화 가능한 중간체를 생성한다.
96-웰 플레이트가 이용되는 경우, 이들은 전형적으로 완충액, 예컨대 0.05M 나트륨 카르보네이트 중에 희석된 포착 시약의 혼합물을 적어도 약 10시간 동안 인큐베이션하여 코팅될 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 적어도 하룻밤 동안, 약 4-20 ℃, 또는 약 4-8 ℃의 온도, 및 약 8-12, 약 9-10, 또는 약 9.6의 pH에서 수행된다. 더 짧은 코팅 시간(1-2시간)이 바람직한 경우, 니트로셀룰로오스 필터 저부를 갖는 96-웰 플레이트(Millipore MULTISCREEN™를 이용하거나 37 ℃에서 코팅할 수 있다. 플레이트가 적층되고 자체 분석보다 오래 전에 코팅될 수 있고, 이어서 분석이 수동, 반자동 또는 자동 방식으로, 예컨대 로보틱스의 이용에 의해, 여러 샘플에서 동시에 수행될 수 있다.
이어서 코팅된 플레이트는 전형적으로 플레이트 웰 상 과량 부위에 대한 자유 리간드의 원치 않는 결합을 방지하기 위해 결합 부위에 비특이적으로 결합하고 이를 포화하는 차단제로 처리된다. 상기 목적을 위한 적절한 차단제의 예에는, 예로 젤라틴, 소 혈청 알부민, 달걀 알부민, 카제인 및 무지방 우유가 포함된다. 차단 처리는 전형적으로 약 1-4시간 또는 약 1.5 내지 3시간 동안 상온 조건 하에 일어난다.
코팅 또는 차단 후, 적절히 희석된 분석될 표준물질(정제된 관심 항체) 또는 생물학적 샘플이 고정화된 상에 첨가된다. 특정 구현예에서, 희석 비율은 약 5-15부피%, 또는 약 10 부피%이다. 상기 목적을 위해 희석에 이용될 수 있는 완충액에는 (a) 0.5% BSA, 0.05% TWEEN 20™세제(P20), 0.05% PROCLIN™300 항생제, 5mM EDTA, 0.25% 3-((3-콜아미도프로필)디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트(CHAPS) 계면활성제, 0.2% 베타-감마 글로불린, 및 0.35M NaCl을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS); (b) 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.05% P20, 및 0.05% PROCLIN™300, pH 7을 함유하는 PBS; (c) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN.TM.300, 5mM EDTA, 및 0.35M NaCl, pH 6.35을 함유하는 PBS; (d) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™300, 5mM EDTA, 0.2% 베타-감마 글로불린 및 0.35M NaCl을 함유하는 PBS; 및 (e) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™300, 5mM EDTA, 0.25% CHAPS, 및 0.35M NaCl을 함유하는 PBS가 포함된다. PROCLIN™300은 보존제로 작용하며, TWEEN 20™은 비특이적 결합을 배제하기 위한 세제로 작용한다.
채택되는 포착 시약의 양은 표준물질에 비해 우수한 신호를 제공하기 위해 충분히 크지만, 샘플 중 관심 항체의 최대 예측 수준에 비해 몰 과량은 아니다. 특정 구현예에서, 첨가되는 생물학적 샘플의 양은 고정화된 포착 시약이 샘플의 적절한 희석 후 생물학적 샘플에서 예상되는 자유 관심 항체의 최대 몰 농도의 몰 과량이 되는 정도이다. 이러한 예상 수준은 주로 환자의 임상 조건에서 분석되는 특정한 생물학적 샘플 중 자유 관심 항체의 농도 수준 간 임의의 공지된 상관관계에 의존한다. 따라서, 예를 들어 성인 환자는 상당히 높은 혈청 중 자유 관심 항체의 최대 예상 농도를 가질 수 있는 반면, 어린이는 주어진 용량에 근거하여 혈청 중 더 낮은 수준의 자유 관심 항체를 가질 것으로 예상될 것이다.
포착 시약의 농도는 생물학적 샘플의 임의의 필요한 희석을 고려하여, 관심 항체의 관심 농도 범위에 의해 결정될 수 있다. 포착 시약의 최종 농도는 또한 관심 범위에 걸쳐 분석의 민감도를 최대화하도록 실험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로 몰 과량은 적합하게는 샘플의 임의의 적절한 희석 후 생물학적 샘플 중 관심 항체의 최대 예상 몰 농도의 약 10배 미만이다.
샘플 및 고정화된 포착 시약의 인큐베이션 조건은 분석 민감도를 최대화하고 해리를 최소화하며 샘플에 존재하는 임의 관심 항체가 고정화된 포착 시약에 결합하도록 선택된다. 인큐베이션은 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위, 예를 들어 실온이나 그 주위의 상당히 일정한 온도에서 수행된다. 인큐베이션 시간은 일반적으로 약 10시간 이하이다. 다양한 구현예에서, 인큐베이션 시간은 실온에서 또는 그 주위에서 포착 시약에 대한 관심 항체의 결합을 최대화하기 위해 약 0.5 내지 3시간 또는 약 1.5-3시간이다. 생물학적 유체 중 프로테아제가 관심 항체를 분해하는 것을 방지하기 위해 프로테아제 저해제가 첨가되는 경우, 인큐베이션 기간이 더 길어질 수 있다.
상기 단계에서 인큐베이션 혼합물의 pH는 보통 약 4-9.5 범위 또는 약 6-9 범위 또는 약 7 내지 8일 것이다. 인큐베이션 완충액의 pH는 포착되는 관심 항체에 대한 포착 시약의 유의미한 수준의 특이적 결합을 유지하도록 선택된다. 보레이트, 포스페이트, 카르보네이트, TRIS-HCl 또는 TRIS-포스페이트, 아세테이트, 바르비탈 등을 포함하는 다양한 완충액이 상기 단계 동안 원하는 pH를 달성하고 유지하기 위해 채택될 수 있다. 채택되는 특정 완충액이 본 발명에 중요한 것은 아니지만, 개별 분석에서 하나의 완충액이 다른 것에 비해 바람직할 수 있다.
선택적인 두 번째 단계
분석 방법의 선택적인 두 번째 단계에서, 생물학적 샘플은 고정화된 포착 시약으로부터 분리되어(예를 들어 세척에 의해) 포착되지 않은 관심 항체가 제거된다. 세척에 이용되는 용액은 일반적으로 약 6-9의 pH 범위에서 인큐베이션 단계에 대해 상술된 고려사항 및 완충액을 이용하여 결정되는 pH를 갖는 완충액("세척 완충액")이다. 세척은 3회 이상 수행될 수 있다. 세척 온도는 일반적으로 냉장실 내지 온화한 온도이며, 분석 기간 동안 전형적으로 약 0-40 ℃, 또는 약 4-30℃의 일정한 온도가 유지된다. 예를 들어, 세척 완충액은 세척 전 저장소에서 4℃에서 얼음에 배치될 수 있고, 상기 단계를 위해 플레이트 세척기가 이용될 수 있다. 포착된 관심 항체가 후속 단계에서 어느 정도 해리될 수 있다는 임의의 우려가 있는 경우 가교제 또는 다른 적합한 제제가 상기 단계에서 첨가되어 현재 결합된 관심 항체가 포착 시약에 공유 부착되도록 할 수 있다.
세 번째 단계
다음 단계에서, 존재하는 임의의 결합된 관심 항체와 함께 고정화된 포착 시약은 약 20-40℃, 또는 약 36-38℃의 온도에서 검출 가능한 항체와 접촉되며, 둘 간의 접촉을 위한 정확한 온도 및 시간은 채용되는 검출 수준에 주로 의존한다. 예를 들어 4-메틸움벨리페릴-β-갈락토시드(MUG), 스트렙타비딘-HRP, 또는 스트렙타비딘-β-갈락토시다아제가 검출 수단으로 이용되는 경우, 접촉은 신호를 최대로 증폭하기 위해 하룻밤 동안(예로 약 15-17시간 이상) 수행될 수 있다. 검출 가능한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있지만, 배경 노이즈를 감소시키기 위해 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서, 분석에서 코팅 및 검출을 위해 동일한 항-이디오타입 항체가 이용된다. 다른 구현예에서, 코팅 및 검출을 위해 배경 노이즈가 최소화되도록 선택되는 상이한 항-이디오타입 항체가 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비인간종 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 항-huIgG Fc 항체이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 마우스 항-huIgG Fcγ 항체이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 항체는 직접 검출 가능하다. 특정 구현예에서, 검출 가능한 항체는 바이오틴화된다. 이러한 경우, 바이오틴화 표지에 대한 검출 수단은 애비딘 또는 스트렙타비딘-HRP일 수 있고, 검출 수단의 측정은 형광측정 또는 비색측정일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 HRP에 콘쥬게이션되고 검출 수단은 비색측정이다.
세척 후 예상되는 자유 관심 항체의 최대 농도(상술된 바와 같음)에 대한 몰 과량의 검출 가능한 항체가 플레이트에 첨가된다. 임의 항체가 채택될 수 있지만 상기 항체(직접 또는 간접 검출 가능함)는 모노클로날 항체이다. 검출 가능한 항체의 친화도는 소량의 자유 관심 항체가 검출될 수 있도록 충분히 높지만 관심 항체가 포착 시약에서 떨어지도록 유도할 만큼 높지는 않아야 한다.
네 번째 단계
*분석 방법의 마지막 단계에서, 이제 포착 시약에 결합된 샘플에서의 임의의 자유 관심 항체의 수준이 검출 가능한 항체에 대한 검출 수단을 이용하여 측정된다. 생물학적 샘플이 임상 환자에서 유래하는 경우, 측정 단계는 상기 세 단계의 결과로 일어나는 반응을 표준 곡선과 비교하여 공지된 양에 비해 관심 항체의 수준을 측정하는 것을 포함한다.
고정화된 포착 시약에 첨가되는 항체는 직접 표지되거나, 또는 과량의 제1 항체의 세척 후 제1 항체의 동물종의 IgG에 대해 생성된 몰 과량의 제2 표지 항체의 첨가에 의해 간접 검출될 것이다. 후자의 간접적 분석에서, 제1 항체에 대한 표지된 항혈청은 원 위치에서 표지된 항체를 생성하도록 샘플에 첨가된다.
제1 또는 제2 항체에 대해 이용되는 표지는 항-이디오타입 항체에 대한 자유 관심 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출 가능한 관능부이다. 적합한 표지의 예는 직접 검출될 수 있는 부분, 예컨대 형광단, 화학발광 및 방사활성 표지뿐만 아니라 검출되기 위해 반응하거나 유도체화되어야 하는 효소와 같은 부분을 포함하여, 면역분석에서의 이용을 위해 공지된 여러 표지이다. 이러한 표지의 예에는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레신 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라아제, 예로 초파리 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제(미국 특허 번호. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, HRP, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예로 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제(HRP와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 채용하는 효소와 커플링됨), 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 바이오틴(예로, 애비딘, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘-HRP, 및 스트렙타비딘-β-갈락토시다아제와 MUG로 검출 가능), 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등이 포함된다.
이들 표지를 단백질 또는 폴리펩티드에 공유 결합시키는 통상적 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 커플링제, 예컨대 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등을 이용하여 항체에 상술된 형광, 화학발광 및 효소 표지를 태그화할 수 있다. 예를 들어, [미국 특허 번호 3,940,475(형광측정) 및 미국 특허 번호 3,645,090(효소); Hunter 등, Nature, 144:945 (1962); David 등, Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain 등, J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. 및 Cytochem., 30:407-412 (1982)]을 참고한다.
효소를 포함하는 이러한 표지의 항체에 대한 콘쥬게이션은 면역분석 기법에서 당업자를 위한 표준 조작 절차이다. 예를 들어, [O'Sullivan 등, "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzymology 중, ed. J. J. Langone 및 H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166]을 참고한다. 적합한 시판 표지 항체도 이용될 수 있다.
최종 표지된 항체의 첨가 후, 결합된 항체의 양은 세척을 통해 과량의 미결합 표지 항체를 제거한 후 표지에 적절한 검출 방법을 이용하여 부착된 표지의 양을 측정하고, 측정된 양을 생물학적 샘플 중 관심 항체의 양과 연관시켜 결정된다. 예를 들어 효소의 경우, 발색되고 측정되는 색상의 양은 존재하는 관심 항체의 양의 직접적 척도가 될 것이다. 구체적으로 HRP가 표지인 경우, 색상은 기질 TMD를 이용하여, 측정 파장 450nm 및 참조 파장 620 또는 630nm를 이용하여 검출될 수 있다.
하나의 예에서, 제1 미표지 항체에 대해 생성된 효소 표지된 제2 항체가 고정상에서 세척된 후, 색상 또는 화학발광이 발색되고 고정화된 포착 시약을 효소의 기질과 인큐베이션하여 측정된다. 이어서 병렬 수행한 표준 관심 항체에 의해 생성되는 색상 또는 화학 발광과의 비교에 의해 관심 항체의 농도가 계산된다.
2. 질량 분광측정
일부 구현예에서, 항-HCMV 이디오타입 항체는 항-HCMV 항체인 항-CI 및/또는 항-gH를 위한 질량 분광측정 분석에서 이용된다. 본원에 기재된 분석은 생물학적 샘플에서 항-HCMV 항체의 면역친화성 포착을 위해 항-HCMV 이디오타입 항체를 이용한다. 샘플은 질량 분광측정에 의한 항-HCMV 항체의 정량 이전에 분리 기법, 예컨대 크로마토그래피를 이용하여 추가 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 특징 펩티드 단편이 단백분해에 의해 생성되며, 선택된 특징 펩티드는 항-HCMV 항체에 대한 대리 분석물질로서 측정된다. 특정 구현예에서, 대리 펩티드는 HPLC를 이용하여 직렬식 질량 분광측정(MS/MS)에 의한 검출로 정량된다.
생물학적 샘플의 처리
항-CI, 항-gH에서 선택된 항-HCMV 항체 또는 이들의 조합은 포유류, 예컨대 인간에게 투여되거나 조직, 세포 배양, 혈장 또는 혈청에서 선택되는 생물학적 원천과 접촉된다. 혈청 및 혈장 샘플의 분석은 이들의 높은 프로테옴 배경, 즉 여러 단백질 및 다른 분석물질로 인해 문제가 되는 것으로 알려져 있다. 투여 후 수 분, 수 시간, 수 일 범위의 특정 시기 이후, 항-HCMV 항체, 또는 이들의 단편을 포함하는 생물학적 샘플이 수집된다. 생물학적 샘플은 주사기 또는 캐뉼라에 의해 유체를 인출하는 것을 포함하는 임의 수단에 의해 수집될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈액 산물, 예컨대 혈청, 혈장 등이나 관심 상체를 함유하는 다른 체액일 수 있다.
생물학적 샘플은 제형화, 고정화, 원심분리, 단리, 소화, 혈액 세포의 응고 유도 또는 방지, 가수분해 또는 정제를 포함하는 통상적 절차에 의해 분석 샘플을 형성하도록 처리된다.
생물학적 샘플의 처리는 불순물을 제거하고 샘플 성분의 분리를 방해하거나 데이터 수집 또는 분석을 어렵게 만들 수 있는 샘플 이종성을 감소시키는 작용을 한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 처리는 샘플 취급을 단순화하고, 분해로부터 보존하거나 샘플 부피를 최소화하거나 질량 분광측정 분석에서 관심 샘플 성분(분석물질)을 선택한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 처리는 생물학적 샘플을 약물 대사 또는 약동학 효과 결정에 관여하는 대사물질, 단편 또는 유도체로 전환한다.
처리된 분석 샘플의 포착
항체는 면역친화성 비드 상에 포착되며, 여기서 비드는 투여된 항-HCMV 항체에 특이적인 고정화된 항-이디오타입 항체를 갖는다. 다양한 구현예에서, 항-이디오타입은 본원에 개시된 임의의 항-이디오타입 항체이다. 투여된 항-HCMV 항체에 특이적인 항-이디오타입 항체는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 면역친화성 비드에 콘쥬게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 항-HCMV 항체에 특이적인 항-이디오타입은 바이오틴화되고 강력한 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용(KD=10-15M)을 통해 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드에 결합된다. 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드를 이용하는 논리에는 하기가 포함된다: (i) 강력한 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용(KD=10-15M), (ii) 고정화된 스트렙타비딘/바이오틴화 분석물질은 입증된 방법임, (iii) 높은 결합 능력(온전한 단백질에 대해 충분한 재료), (iv) 낮은 비특이적 결합, (v) 질량 분광측정 상용성 용매를 이용한 샘플 용출, (vi) 비드로부터의 우수한 샘플 회수, 및 (vii) 이용 용이성 및 자동화 적합성.
면역친화성 비드는 다공성 중합체 모놀리스를 포함할 수 있고, 수집 저장소와 유체 소통하는 플로우-스루 채널에 구성될 수 있다. 비드는 플로우-스루 용기, 예컨대 컬럼 또는 깔때기에 포함될 수 있고, 여기서 생물학적 원천으로부터의 샘플이 한 쪽 말단 또는 개구에서 도입되고 샘플이 또 다른 말단 또는 개구에서 용출된다. 면역친화성 비드는 복수의 플로우-스루 용기에 분배될 수 있고, 각각 별도의 수집 저장소와 소통한다. 용기 및 저장소는 자동화 및 결과의 재현성의 목적을 위해 12x8 횡렬의 96 마이크로타이터 웰 포맷으로 또는 24x16 횡렬의 384 마이크로타이터 웰 포맷으로 구성될 수 있다.
항-HCMV 항체를 수신하는 포유류(생물학적 원천)로부터의 혈장 또는 혈청 샘플은 수동 피펫팅 또는 자동화 로보틱 분배에 의해 비드에 적용된다. 비드는 웰 또는 다른 용기에 구성되거나, 또는 샘플이 한 쪽 말단 또는 개구에서 도입되고 세척 유출액 또는 용출 샘플이 또 다른 말단 또는 개구에서 용출되는 컬럼 또는 다른 플로우-스루 장치에 구성될 수 있다. 비드에 결합된 항-이디오타입 항체에 특이적인 샘플 성분이 결합할 수 있게 된다. 비드는 비특이적 단백질 및 다른 비특이적 샘플 성분을 헹궈내기 위해 세척된다. 결합된 항체는 비드 상에서, 예로 PNGaseF로 탈글리코실화될 수 있다. 결합된 샘플 성분은 샘플 플레이트 내에서 분리된 수신 용기 또는 웰로 용출될 수 있다. 이어서 용출된 샘플은 수동 피펫팅 또는 로보틱 전달에 의해 이동되고 역상 크로마토그래피에 의해 분리되며 분리된 샘플 성분은 질량 분광측정에 의해 분석된다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 프로테아제로 소화될 수 있다. 특징 펩티드 단편이 단백분해에 의해 생성되고, 선택된 특징 펩티드가 항-HCMV 항체에 대한 대리 분석물질로서 측정된다. 예시적 구현예에서, 생물학적 샘플은 트립신 소화로 소화될 수 있다. 트립신 소화에 있어서, 샘플은 DTT로 환원되고, 나트륨 요오도아세테이트로 S-카르복시메틸화된 후 트립신으로 소화될 수 있다. 소화된 샘플은 분리 방법, 예를 들어 역상 HPLC, 예로 Nucleosil C18 컬럼; 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 예로 TSK 3000SWxL 컬럼; 또는 TSK 보로네이트 컬럼을 이용한 보로네이트 친화도 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다.
샘플 성분의 분리
분석 샘플을 형성하기 위해, 생물학적 샘플은 둘 이상의 샘플 성분의 분리를 시행하기 위해 분리 매질에 적용될 수 있다. 분리 방법에는 친화도, 크로마토그래피 및 전기영동 방법이 포함된다. 친화도 방법에는 친화도 크로마토그래피, 흡착 및 고정화된 친화도 매트릭스가 포함된다. 크로마토그래피 방법에는 HPLC, 소수성 상호작용(HIC), 음이온 교환, 양이온 교환, 역상, 일반상, 이온쌍 역상, 박층, 모세관 플로우, 및 크기 배제가 포함된다. 전기영동 방법에는 1차원, 슬랩 겔, 모세관, 폴리아크릴아미드, 변성, 비변성, 자유 용액, 종이, 2-차원, 등전 초점조절, 및 구배 전압이 포함된다. 다른 분리 방법에는 투석, 원심분리, 침강, 유동, 침전, 면역침전 및 겔 여과가 포함된다.
분리 방법은 용출 시간, 소수성, 친수성, 이동 시간, 비율, 속도, 크로마토그래피 체류 시간, 용해도, 분자 부피 또는 크기, 전체 전하, 하전 상태, 이온 전하, 등전위점, 해리 상수(pKa), 항체 친화도, 전기영동 이동성, 이온화 전위, 쌍극 모멘텀, 수소 결합능, 및 기체상에서의 이온 이동성을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 물리 화학적 특성에 의해 생물학적 샘플의 성분 분리를 시행할 수 있다.
질량 분광측정 입구 장치 내로의 모세관 흐름 주입에 의한 저속 플로우는 질량 측정의 민감도를 촉진하여 더 낮은 농도의 분석물질 및 더 높은 분자량 종, 예컨대 온전한 단백질 및 항체가 검출되고 분석될 수 있게 한다.
분리된 샘플 성분의 질량 분광측정
질량 분광측정 분석을 위한 샘플 제조는 일반적으로 공지된 기법에 따라 수행될 수 있다. ["Modern Protein Chemistry: Practical Aspects", Howard, G. C. 및 Brown, W. E., Eds. (2002) CRC Press, Boca Raton, Florida]를 참고한다.
성분이 순차적으로 또는 회분식 방식으로 용출되거나 질량 분광측정에서 직접 검출되도록 하는 친화도 또는 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 절차에 의해 혼합물의 상이한 화학 성분이 먼저 단리되거나 분리되거나 부분적으로 분리되는 본 발명의 방법은 생물학적 샘플에서 유래되는 항체 혼합물의 분석에 적절하다. 항체의 다양한 구조적 특징 및 특성이 분절화, 탈아미드화, 당화, 산화, 부분적 서열 정보, 예로 N-말단 및 C-말단, 이량체 및 응집 상태를 포함하는 질량 분광측정 분석에서 규명될 수 있다. 생물학적 샘플 중 하나 이상의 화학적 성분은 투여된 항-HCMV 항체의 서열, 구조 및 분자량이 알려져 있으므로, 그 정확한 질량 측정에 의해 고도로 특이적인 방식으로 분석될 수 있다.
높은 질량 정확성, 높은 민감도 및 높은 해상도가 가능한 다양한 질량 분광측정 시스템이 당분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 채용될 수 있다. 이러한 질량 분광측정기의 질량 분석기에는 4중극(Q), 비행 시간(TOF), 이온 포획, 자기 섹터 또는 FT-ICR 또는 이들의 조합이 비제한적으로 포함된다. 질량 분광측정기의 이온원은 주로 샘플 분자 이온 또는 위-분자 이온 및 특정한 분석 가능한 단편 이온을 생성해야 한다. 이러한 이온원의 예에는 대기압 이온화원, 예로 전기분무 이온화(ESI) 및 대기압 화학 이온화(APCI) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)가 포함된다. ESI 및 MALDI는 질량 분광측정 분석을 위해 단백질을 이온화하는데 가장 일반적으로 채용되는 두 방법이다. ESI 및 APCI는 LC/MS에 의해 소분자를 분석하기 위해 가장 일반적으로 이용되는 이온원 기법이다(Lee, M. "LC/MS Applications in Drug Development"(2002) J. Wiley & Sons, New York).
표면 강화 레이저 탈착 이온화(SELDI)는 고처리량 질량 분광측정을 허용하는 샘플 기반 이온화 기법의 한 예이다(미국 특허 번호 6,020,208). 전형적으로 SELDI는 단백질 및 다른 생체분자의 복잡한 혼합물을 분석하는데 이용된다. SELDI는 분석물질, 예컨대 단백질과 용액 중에 상호작용하는 "단백질 칩"과 같은 화학 반응성 표면을 채용한다. 이러한 표면은 분석물질과 선택적으로 상호작용하고 이들을 그 위에 고정한다. 따라서 본 발명의 분석물질은 칩 상에서 부분 정제된 후 질량 분광측정기에서 신속히 분석될 수 있다. 기재 표면의 상이한 부분에 여러 반응성 부분을 제공함으로써, 처리량이 증가될 수 있다.
기능적 시스템에서, 질량 분광측정기는 관심 화학종의 질량을 그 정확한 또는 계산되는 질량의 20ppm 내에서, 전형적으로는 그 정확한 또는 계산되는 질량의 5ppm 내에서 정확히 측정할 것이다. 시판되는 질량 분석기는 전체 질량 스펙트럼을 동시에 그리고 혼합물 중 복수의 분석물질에 대해 충분한 스펙트럼이 확보될 수 있도록 하는 빈도로 샘플링하고 기록하여 질량 분광측정 신호 강도 또는 피크 면적이 정량적 대표값이 되도록 할 수 있다. 이는 또한 모든 질량에 대해 관찰되는 용출 시간이 질량 분석기에 의해 개질되거나 왜곡되지 않도록 하고 정량적 측정이 일시적 신호의 풍부함을 측정하기 위한 필요에 의해 손상되지 않도록 도울 것이다.
분석 가변성은 표적 분석물질과 유사한 물리화학적 특성을 갖는 내부 표준물질(IS)의 이용에 의해 교정될 수 있다. (Mesmin 등(2011) Bioanalysis 3: 477-480). 특징 펩티드가 항-HCMV 항체에 대한 대리 분석물질로 측정되는 일부 구현예에서, 특징 펩티드에 대응하는 안정한 동위원소 표지(SIL) 펩티드가 내부 표준물질로 이용될 수 있다. (Hagman 등(2008) Anal. Chem. 80: 1290-1296; Mesmin 등(2010) Rapid Commun. Mass Spectrom. 24: 2875-2884).
전기분무 이온화 질량 분광측정(ESI)
증가된 분석물질 이온화 효율로 인해 더 낮은 유속에서 더 높은 민감도가 달성된다(Gale 등(1993) Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:1017). 따라서 분 당 나노리터 범위의 유속에서 샘플 함유 유체의 전기분무 주입을 수행함으로써 적절한 교정 후 정확한 정량을, 그리고 질량 분광측정과 조합되는 경우 유체 내에 함유된 분석물질에 대해 높은 민감도를 제공한다. 소형화 및 통합화된 마이크로컬럼 및 높은 선택성 및 민감도, 그리고 MS의 전방 말단으로서 정확한 정량 분석을 제공하는 친화도 크로마토그래피 흡착제를 갖는 마이크로컬럼을 포함하는 시스템 및 장치가 보고되었다(미국 특허 번호 6,811,689; 미국 특허 번호 6,020,208; 미국 특허 번호 6,579,719).
항체와 같이 상대적으로 고분자량인 화합물의 질량은 대부분의 질량 분광측정기에 의해 쉽게 결정되는 질량 대 전하비(m/z)에서 검출될 수 있다(전형적인 m/z 범위 2000 내지 3000). 특히 전기분무 이온화 질량 분광측정 ESI-MS는 뛰어난 검출 한계로 하전된 극성 또는 염기성 화합물에 대해 그리고 다중 하전된 화합물의 분석에 대해 적합하다. 따라서 ESI는 분자량(MW) 150,000 이상의 항체 및 항체-약물 콘쥬게이트와 같은 거대 생체분자의 검출 및 분석을 허용한다. 높은 질량의 이온에서는 전형적으로 일련의 다중 하전된 분자 이온이 관찰된다. 양이온에 대한 분자량은 측정된 m/z비에 전하의 수(n)를 곱하고 양이온의 질량(C+)에 그 이온 상의 전하의 수(n)를 곱한 값을 빼서 결정된다.
ESI 방법은 인터페이스 렌즈 전위를 조절함으로써 분절화의 존재 또는 부재가 조절될 수 있도록 한다. 전기분무 이온화(ESI)는 액체 분리 방법(전방 말단)뿐만 아니라 질량 분광측정 검출 방법(후방 말단)과도 상용성이다("Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications", Cole, R. B., Ed. (1997) Wiley, New York).
ESI-MS 데이터는 여러 스캔을 함께 평균낸 후 데이터를 조면화하여 확보됨으로써 우수한 피크 강도 및 형태를 제공할 수 있다. 저질량 화합물에 대해 종종 관찰되는 가장 풍부한 피크는 양이온 모드에서의 [M+H]+ 이온 및 음이온 모드에서의 [M-H]- 이다. 이중 및 삼중 하전 이온뿐만 아니라 이량체도 관찰될 수 있다. 이중 하전된 양이온은 질량 (MW+2C+)/2에서 관찰될 것이며, 여기서 MW는 분자량이고 C+는 이온화 양이온, 예컨대 H+, Na+, 또는 NH4+이다. 매우 저질량의 화합물을 제외하고, 검출되는 이온은 다중 하전될 것이다. ESI의 유연한(저이온화 전위) 조건으로 인해, 전형적으로 분자 이온만이 관찰된다. ESI 스펙트럼은 이온이 보유하는 다양한 수의 전하로 인해 질량 대 전하비가 상이한 몇몇 분자 이온 피크를 가질 수 있다.
샘플, 예로 ADC 또는 다른 생체분자의 희석 용액이 ESI-MS 분석을 위한 피하 바늘을 통해 느리게 펌핑될 수 있다. 샘플은 플로우 주입 또는 LC/MS를 통해 도입될 수 있다. 전형적인 유속은 분 당 1 마이크로리터(㎕) 미만부터 분당 약 1 밀리리터(ml)까지의 범위이다. ESI는 다른 경우 증기화하거나 이온화하기 어려운 큰 생물학적 분자에 특히 적합하다. 바늘은 고전압에서 유지되며, 바늘 말단의 강한 전기장이 분무화된 용액을 하전시키고 하전된 액적을 생성한다. 하전된 액적은 물을 증발시켜 궁극적으로 작은 개구를 통해 진공 챔버 내로 이동하는 분자 이온을 생성한다. 용매 증발 과정 동안, 비공유 결합된 복합체가 용액에서 기상으로 이동한다. (Hu 등(1994)). 일반적으로 온전한 기상 복합체를 유지하기 위해 온화한 탈용매화 조건이 필요하다. 개구는 이온이 완전히 탈용매화되도록 가열될 수 있다. 일부 MS 시스템은 역류 가열 기체를 채용할 수 있다. 하전된 액적은 피하 바늘에서 방출되며, 진공 챔버로 들어가기 전에 용매를 증발시킴에 따라 수축한다. 탈용매를 보조하기 위해 열 및 기류가 이용될 수 있다. 작은 모세관 전기분무 방출기, 팁, 나노전기분무로 알려진 절차의 이용에 의해 유체 흐름을 감소시켜 ESI 측정에 필요한 샘플의 양이 감소될 수 있다. 나노전기분무 방법은 1 ㎕ 샘플에 있어서 약 10-30분 동안 일정한 신호를 생성할 수 있다. 낮은 흐름은 이온 효율을 증가시키고 이온 억제를 감소시키는 것으로 나타났다. 나노전기분무 방법은 MS/MS 단백질 연구를 위해 빈번하게 이용된다(Korner 등(1996) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 7:150-156; Mann, M. and Wilm, M. (1996) Anal. Chem. 68:1-8).
단백질의 ESI는 분자량이 증가함에 따라 전하의 수가 증가하는 경향을 갖는 다중 하전된 이온을 생성한다. 주어진 이온종에 대한 전하의 수는 다음과 같은 방법으로 결정될 수 있다: (i) 1개의 전하가 상이한 2 전하 상태를 비교하고 동시 공식을 풀고; (ii) 동일한 전하를 그러나 상이한 부가물 질량을 갖는 종을 찾고; (iii) 분리된 동위원소 클러스터에 대한 질량 대 전하비를 조사함. ESI 및 ESI-MS 방법 및 이들 방법을 수행하기 위한 파라미터는 당분야에 널리 공지되어 있다. 전기분무 이온화 공정의 온화함은 온전한 항체 콘쥬게이트가 질량 분광측정에 의해 직접 검출될 수 있게 한다.
하나의 구현예에서, 단백질, 항체, 항체 단편 또는 항체-콘쥬게이트(거대 분자)의 Q1 질량 스펙트럼은 방법의 일부로서 수행된다. 거대 분자의 적합한 품질의 Q1 질량 스펙트럼이 수득될 수 있다. 단백질 엔벨로프가 이동할 가능성이 있으므로, 크로마토그래피를 위해 이용되는 모든 용매가 새로 제조되고 관찰된 범위에 스펙트럼 엔벨로프를 배치하기 위해 용출 용매에 산이 첨가된다. 100,000 질량 단위를 초과하는 단백질에 있어서, 포름산과 같은 산이 용출 용매에서, 예를 들어 용매 A(물) 및 B(아세토니트릴) 모두에서 약 0.1%(부피)로 이용될 수 있다. 100,000 질량 단위 미만의 단백질에 있어서 A 및 B 용매 모두에 대해 0.05%(부피) TFA의 트리플로오로아세트산(TFA)과 같은 더 강산이 이용될 수 있다. 포름산의 양이 감소됨에 따라, 온전한 글리코실화 항체 트라스투주맵은 더 많은 전하를 얻어 엔벨로프가 왼쪽으로 더, 그리고 관찰된 범위의 m/z(1800-3000m/z) 내로 이동한다. 탈클러스터링 전위(DP) 전압이 약 30-120V에서 약 70-190V로 증가됨에 따라, 항체 상의 전하는 더 증가한다. 따라서 적용되는 전압, 용매 조성 및 이온 페어링 제제가 고려하고 조정할 인자들이다. 탈클러스터링 전위(DP)가 증가되어(램프화되어) 최적 전하 이온 범위를 선택하기 충분한 해상도를 확보할 수 있다. 선형도는 광범위한 m/z에 걸쳐 수득될 수 있다. 항체의 탈글리코실화는 온전한 항체 또는 중쇄, 단편 또는 ADC의 정량을 돕는다. 글리코실화는 더 낮은 이온화 효율 및 이에 따라 감소된 민감도에 기여한다. 항체 또는 항체 단편 콘쥬게이트의 정량 시, 항체의 탈글리코실화는 질량 스펙트럼의 이종성을 감소시키고, 민감도를 증가시켜서 분석을 단순화할 수 있다.
디콘볼루션(Deconvolution) 표를 이용하여 정량될 각각의 종에 대해 정확한 질량 대 전하비(m/z)를 결정한다. 디콘볼루션 소프트웨어 애플리케이션, 예컨대 Analyst.TM. QS(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)가 시판되고/되거나 질량 분광측정기에 제공된다. 디콘볼루션 소프트웨어는 일반적으로 사용자에게 디콘볼루션된 질량표뿐만 아니라 이들 질량을 계산하는데 이용되는 m/z 이온의 하위 표를 제공한다.
E. 키트
*편의상, 본 발명의 분석 방법은 키트 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 하기의 기본 성분을 포함하는 패키지화된 조합이다:
(a) 관심 항체에 대한 항-이디오타입 항체로 이루어진 포착 시약;
(b) 관심 항체에 결합하는 검출 가능한(표지된 또는 표지되지 않은) 항체; 및
(c) 이들 시약을 이용하여 분석 방법을 어떻게 수행하는지에 대한 지침.
이들 기본 성분은 상기에서 정의된다.
키트는 포착 시약에 대한 고형 지지체를 추가로 포함할 수 있고, 이는 별도 성분으로 또는 포착시약이 이미 고정화된 상태로 제공될 수 있다. 따라서 키트에서의 포착 항체는 고형 지지체 상에 고정화될 수도 있고, 또는 키트에 포함되거나 키트에서 별도로 제공되는 지지체 상에 고정화될 수도 있다. 일부 구현예에서, 포착 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된다. 검출 가능한 항체는 상이한 종에서 생성된 미표지 항체에 대해 생성된 표지된 항체에 의해 검출되는 미표지 항체 또는 직접 검출되는 표지된 항체일 수 있다. 표지가 효소인 경우, 키트에는 보통 효소에 필요한 기질 및 보조 인자가 포함될 것이다; 여기서 표지가 형광단인 경우에는 검출 가능한 발색단을 제공하는 염료 전구체이고; 표지가 바이오틴인 경우, 애비딘, 스트렙타비딘, 또는 MUG와 0-갈락토시다아제 또는 HRP에 콘쥬게이션된 스트렙타비딘과 같은 애비딘이다.
다양한 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 본원에 개시된 하나 이상의 임의의 항-이디오타입 항체이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 하기에서 선택된다: (a) 서열 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 번호 7의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-이디오타입 항체; (b) 서열 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 번호 11의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-이디오타입 항체; 및 (c) 이들의 조합.
키트는 또한 전형적으로 표준물질로서 관심 항체(예로, 정제된 항-CI 및/또는 항-gH)뿐만 아니라 다른 첨가제, 예컨대 안정화제, 세척 및 인큐베이션 완충액 등을 포함한다.
키트 성분은 분석의 민감도를 실질적으로 최대화하는 시약의 용액 중 농도를 제공하기 위해 적합하게 변하는 상대량의 다양한 시약과 함께 소정비로 제공될 것이다. 특히 부형제를 포함하는 시약은 건조 분말로, 보통 동결건조되어 제공될 수 있으며, 이는 해리 시 평가될 샘플과 조합하기 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다.
II. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 기술에 근거하여 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 항 항-CI 및 항-gH 하이브리도마의 생성
5마리 Balb/c 마우스(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA, USA)를 각각의 뒷다리 발바닥 및 복강 내로 3-4일 간격으로 대사 가능한 스쿠알렌, Tween 80, 트레할로오스 6,6-디미콜레이트 및 모노포스포릴 지질 A(모든 성분은 Sigma Aldrich, USA에서 입수)를 포함하는 보강제 중 항-CI 또는 항-gH로 고면역화하였다. 4 내지 6회 추가접종 후, 표준 효소 연관 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 혈청 역가를 평가하여 항-CI 또는 항-gH에 대해 양성 혈청 역가를 갖는 마우스를 확인하였다. 비장 및 슬와 림프절의 B 세포를 마우스 골수종 세포(X63.Ag8.653 또는 P3X63Ag.U1; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)와 전기융합(Hybrimune-Hybridoma Production System; Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA, USA)에 의해 융합시켰다. 10-14일 후, 하이브리도마 상청액을 수확하고 ELISA에 의해 CDR 특이적 항체 제조에 대해 스크리닝하였다. 이어서 모든 특이적 클론을 예비 HCMV PK ELISA에서 재스크리닝하고, 여기서 후보 항-ID 재료를ELISA 플레이트를 코팅하고 항-CI 및 항-gH를 포착하기 위한 시약으로 이용하고, 폴리클로날 항-인간 항체를 검출 시약으로 이용하였다. 하이브리도마 클론 1.9E1.1, 4.25B10.15 및 2.41A2.4는 웰 당 단일 세포의 최초 라운드 서브클로닝 후 예비 HCMV PK ELISA에서 높은 특이적 결합을 나타내었고(FACSAria 세포 정렬기; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), 따라서 항체 제조를 위해 스케일을 상향 조정하였다(Innova 2000 Shake Flask Format; New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA). PK 분석에서 클론 2.41A2.4의 결합 패턴은 상기 클론이 람다 경쇄 틀을 포함하는 에피토프에 결합함을 제시하였다. 상청액을 친화도 크로마토그래피(MabSelect SuRe; GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, USA)로 정제하고, 멸균 여과하고, PBS 중에서 4℃에 보관하였다. 모노클로날 항체의 이소형을 Isostrip 마우스 mAb 이소형 분석 키트(Roche Applied Biosciences, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 결정하였다. 이소형은 IgG1, 람다(1.9E1.1), IgG1, 카파(4.25B10.15) 및 IgG2a, 카파(2.41A2.4)로 결정되었다.
모노클로날 항체의 결합 친화도를 표 2에 나타낸 바와 같이 Biacore 분석으로 결정하였다.
모노클로날 항체 결합 항체 결합 친화도
4.25B10.15 항-CI 4.7nM
2.41A2.4 항-CI 17nM
1.9E1.1 항-gH 0.1nM
모노클로날 항체 4.25B10.15 및 1.9E1.1에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 4.25B10.15에 대해 도 1 및 2에 그리고 1.9E1.1에 대해 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이 결정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같은 모노클로날 항체 4.25B10.15의 중쇄의 고가변 영역은 다음과 같다:
HVR-H1 NYLIE 서열 번호 13
HVR-H2 VINPGSGGTNYNEKFEA 서열 번호 14
HVR-H3 HGSSYWYFDV 서열 번호 15
도 2에 나타낸 바와 같은 모노클로날 항체 4.25B10.15의 경쇄의 고가변 영역은 다음과 같다:
HVR-L1 RASQSISDYLH 서열 번호 16
HVR-L2 YASQSIS 서열 번호 17
HVR-L3 QNGHSFPYT 서열 번호 18
도 3에 나타낸 바와 같은 모노클로날 항체 1.9E1.1의 중쇄의 고가변 영역은 다음과 같다:
HVR-H1 DYWMY 서열 번호 19
HVR-H2 AIDTSDSYTTYNQNFKG 서열 번호 20
HVR-H3 SGFPLFYYPMDY 서열 번호 21
도 4에 나타낸 바와 같은 모노클로날 항체 1.9E1.1의 경쇄의 고가변 영역은 다음과 같다:
HVR-L1 RSSTGAVTTSNYAN 서열 번호 22
HVR-L2 GTVNRAP 서열 번호 23
HVR-L3 ALWYSNHLV 서열 번호 24
실시예 2: 항-gH의 검출을 위한 ELISA 분석
도 5는 항-gH의 검출에 이용되는 ELISA 분석("항-gH 임상 PK ELISA"로 불림)의 모식도를 나타낸다. 항-gH에 대해 바이오틴-콘쥬게이션된 항-이디오타입 항체는 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로플레이트에 결합되고 샘플 중 항-gH를 검출하는데 이용된다. 결합된 항-gH는 HRP-콘쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fcg 항체를 이용하여 검출된다.
바이오틴-콘쥬게이션된 항-이디오타입 항체는 분석 희석제(PBS/0.5% BSA/0.05% 폴리소르베이트 20/0.35M NaCl/0.25% CHAPS/5mM EDTA/0.05% ProClin 300, pH 7.4±0.1) 중에 500ng/mL로 희석된다. 사용 전에 세척 완충액(PBS/0.05% 폴리소르베이트 20, pH7.46)으로 이용하기 전에 Roche SA 플레이트를 3회 세척한다. 50 ㎕/웰의 바이오틴-콘쥬게이션된 항-이디오타입 항체(1.9E1.1)를 스트렙타비딘이 코팅된 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 실온에서 25-35분 동안 인큐베이션한다. 곡선 표준물질, 분석 대조군 또는 샘플을 분석 희석제(상술된 바와 같음) 중에 1:50 희석한다. 희석된 샘플, 곡선 표준물질 및 분석 대조물질을 플레이트에 첨가하고, 진탕하면서 실온에서 100-130분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 4회 세척한다. 100㎕/웰의 HRP-콘쥬게이션된 마우스 항-huIgG Fcγ (8 ng/ml)를 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 실온에서 1 시간±5분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 4회 세척하고 100㎕/웰의 TMB를 첨가한다. 플레이트를 진탕하면서 실온에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 각 웰에 100㎕의 1M 인산을 첨가한다. 450nm의 측정 파장 및 620 또는 630nm의 참조 파장을 이용하여 플레이트를 측정한다.
도 6은 예비 항-HCMV 인간 PK ELISA에서 평가된 바와 같이 항-CI 및 항-gH에 대한 다양한 항-이디오타입 항체의 결합 활성을 나타낸다. 분석은 다음과 같이 수행하였다: 마이크로타이터 ELISA 플레이트를 하룻밤 동안 PBS 중에 1㎍/mL의 항-이디오타입 모노클로날 항체로 코팅하였다. 항-CI 및 항-gH를 1% NHS 중에 희석하고 웰에 첨가한 뒤 50ng/mL(웰 내 농도)의 HRP-양성 항-huIgG로 검출하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 하나의 항-이디오타입 항체, 1.9E1.1만이 항-gH의 부재 시 OD의 2배를 초과하는 광학 밀도(OD)를 항-gH의 존재 하에 제공하였다. 다른 항-이디오타입 항체는 높은 배경 OD를 제공하여, 이들 항-이디오타입 항체와 인간 혈청(NHS) 중 내인성 IgG의 교차 반응을 제시하였다.
항-gH 임상 PK ELISA를 이용하여 개별 공여자의 혈청 내로 스파이크 처리된 항-gH의 양을 정량하였다. 항-gH는 미처리 혈청 중 고(2㎍/mL) 또는 저(0.3㎍/mL) 농도로 스파이크처리하였다. 도 7은 포착 항체로 1.9E1.1을 이용하여 항-gH로 스파이크 처리된 개별 혈청의 회수 백분율을 나타낸다. 상기 분석은 항-이디오타입 항체 1.9E1.1이 저 및 고 항-gH 농도 모두에서 스파이크 처리된 모든 개별 혈청에서 우수한 정확도를 제공하였음을 나타내었다.
실시예 3: 항-CI의 검출을 위한 ELISA 분석
도 8은 항-CI의 검출에 이용되는 ELISA 분석("항-CI 임상 PK ELISA"로 불림)의 모식도를 나타낸다. 항-CI에 대해 항-이디오타입 항체는 마이크로플레이트에 결합되고 샘플 중 항-CI를 검출하는데 이용된다. 결합된 항-CI는 HRP-콘쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fcg 항체를 이용하여 검출된다.
마이크로타이터 플레이트를 하룻밤 동안 2-8 ℃에서 웰 당 100 ㎕의 0.75㎍/ml 항-CI 이디오타입 항체(0.05M 나트륨 카르보네이트 완충액, pH 9.6±0.1 중)로 코팅한다. 플레이트를 세척 완충액 사이클마다 웰 당 400㎕로 3회 세척한다. 웰 당 200㎕의 차단 완충액(PBS/0.5% BSA/0.05% 폴리소르베이트 20/0.05% ProClin 300, pH 7.4±0.1)을 첨가하고, 플레이트를 1-3시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한다. 표준물질/샘플 희석제(0.5% 정상 풀링 인간 혈청을 포함하는 분석 희석제; 분석 희석제는PBS/0.5% BSA/0.05% 폴리소르베이트-20/0.35M NaCl/0.25% CHAPS/5mM EDTA/0.05% ProClin 300, pH 7.4±0.1로 이루어짐)로 표준 곡선을 제조한다. 플레이트를 세척 완충액 사이클마다 웰 당 400㎕로 3회 세척한다. 희석된 표준물질, 대조물질 및 샘플을 2개씩 플레이트에 웰 당 100㎕로 첨가한다. 플레이트를 2시간±10분 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한다. 플레이트를 세척 완충액의 사이클마다 웰 당 400㎕로 4회 세척한다. 콘쥬게이트 완충액(PBS/0.5% BSA/0.05% 폴리소르베이트 20/0.05% ProClin 300, pH 7.4±0.1) 중에 희석된 HRP 콘쥬게이트를 웰 당 100㎕ 첨가한다. 플레이트를 1시간±5분 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액의 사이클마다 웰 당 400㎕로 4회 세척한다. 웰 당 100㎕의 TMB 기질을 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 실온에서 약 15분 동안 인큐베이션한다. 각 웰에 100㎕의 1M 인산을 첨가한다. 450nm의 측정 파장 및 620 또는 630nm의 참조 파장을 이용하여 플레이트를 측정한다.
코팅 농도를 최적화하기 위해 다양한 농도의 포착 항체 4.25B10.15로 코팅된 플레이트를 이용하여 항-CI 임상 PK ELISA 분석을 수행하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 0.75mg/ml의 항체 4.25B10.15로 코팅된 플레이트가 최적의 신호 대 배경비를 제공하였다. 배경(bkgd)은 스파이크 처리하지 않은 인간 혈청으로 수득된 분석 신호와 같다.
4.25B10.15로 코팅된 플레이트 (73427-34)
8G8 (㎍/mL) 코팅 1㎍/mL 신호 대 배경(Signal/bkgd) 비 코팅 0.75㎍/mL 신호 대 배경비 코팅 0.5㎍/mL 신호 대 배경비
16 1.876 13.8 1.593 19.1 1.281 14.7
8 1.771 13.0 1.378 16.5 1.075 12.3
4 1.371 10.0 1.107 13.3 0.901 10.4
1 0.599 4.4 0.439 5.3 0.379 4.3
0.5 0.372 2.7 0.271 3.2 0.231 2.7
0.25 0.254 1.9 0.174 2.1 0.161 1.8
0.125 0.194 1.4 0.128 1.5 0.120 1.4
bkgd 0.136 0.084 0.087
항-CI 임상 PK ELISA를 0.5% 인간 혈청 풀 내로 스파이크 처리된 다양한 농도의 항-CI를 이용하여 표준 곡선과 함께 수행하였다. 결과를 표 4에 요약한다. 분석은 일관된 용량 반응, 그리고 항-CI의 농도 증가와 함께 증가하는 더 높은 신호 대 배경(S/B)비를 나타내었다.
항-CI ug/mL OD 신호 대 배경(S/B)비
20 1.970 22.3
10 1.725 19.6
5 1.203 13.6
2.5 0.743 8.4
1.25 0.431 4.9
0.625 0.261 3.0
0.313 0.174 2.0
0.156 0.134 1.5
bkgd 0.088
항-이디오타입 항체 4.25B10.15 또는 4.23F9.5를 포착 항체로 이용하여 항-CI 임상 PK ELISA를 이용해서 개별 공여자로부터 혈청 내로 스파이크 처리된 항-CI의 양을 정량하였다. 풀링 샘플 및 샘플 1-4에 대해 4 ㎍/mL(고) 또는 0.5㎍/mL(저)에서; 샘플 5에 대해 12㎍/mL(고) 또는 0.6㎍/mL(저)에서 그리고 샘플 6과 7에 대해 7.62㎍/mL(고) 또는 0.476㎍/mL(저)에서 항-CI를 스파이크 처리하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 항-이디오타입 항체 4.25B10.15가 4.23F9.5보다 더 우수하게 나타나, 고 및 저 항-CI 농도 모두에서 모든 샘플에 대해 정확한 스파이크 회수를 제공하였다.
실시예 4: 인간 혈청 중 항-CI 및 항-gH의 정량을 위한 LC-MS/MS 분석
인간 혈청 중 항-CI 및 항-gH의 정량을 위해 LC-MS/MS 분석을 개발하였다. 분석에서는 면역친화성 포착을 이용하여 인간 혈청으로부터 2개의 모노클로날 항체 항-CI 및 항-gH를 단리하였다. 이어서 결합 항체의 단백분해에 의해 특징 펩티드 단편을 트립신으로 생성하고, 선택된 특징 펩티드를 이들의 안정한 동위원소 표지된 내부 표준물질(SIL ISs)과 함께 항-CI 및 항-gH에 대한 대리 분석물질로서 MS/MS 검출과 HPLC를 이용하여 측정하였다. 항-CI 및 항-gH에 대한 특징 트립신 분해 펩티드는 다음과 같았다:
항-CI(P2) EQFVYVFGGGTK (서열 번호 25)
항-CI(P4) DTSTSTAYLELSSLR (서열 번호 26)
항-gH(P2) GLEWVSSINSNSR (서열 번호 27)
항-gH(P5) LSC*AASGFTFSPYSVFWVR (서열 번호 28)
* 알킬화된 시스테인 잔기
SIL IS는 진하게 나타낸 아미노산 위치에서 안정한 동위원소 표지된 아미노산을 포함하였다:
항-CI(P2) EQFVYVFGGGTK (서열 번호 25)
항-CI(P4) DTSTSTAYLELSSLR (서열 번호 26)
항-gH(P2) GLEWVSSINSNSR (서열 번호 27)
항-gH(P5) LSC*AASGFTFSPYSVFWVR (서열 번호 28)
* 알킬화된 시스테인 잔기
특징 펩티드 항-CI(P2) 및 항-gH(P2)는 각각 항-CI 및 항-gH의 정량을 위해 이용되는 일차적인 대리 펩티드인 반면 항-CI(P4) 및 항-gH(P5)는 품질 제어 목적을 위해 이용되는 이차적인 대리 펩티드였다. 방법은 명목 범위 0.100 내지 20.0㎕/mL 내에서 항-CI 및 항-gH의 정량에 적용 가능하다. 분석을 위해 25-㎕ 인간 혈청 분취물이면 충분하다. 샘플을 폴리프로필렌 튜브에 보관하고 분석 전에 약 -70 ℃에서 냉동 유지하였다.
하기 샘플 유형을 평가 목적을 위해 추출하였다. 표시된 것을 제외하고, 샘플 별로 항-이디오타입 모노클로날 항체(항-ID mAb) 부하는 각각 3.0 ㎍이었다:
풀링 블랭크(MB) 인간 혈청.
각각의 항체에 대해 하기 농도에서 항-CI 및 항-gH(조합됨)로 강화된 교정 표준물질(CAL): 0.100, 0.200, 0.400, 1.00, 4.00, 8.00, 10.0 및 20.0 ㎍/mL(각 수준에서 n=2).
각각의 항체에 대해 하기 농도에서 항-CI 및 항-gH(조합됨)로 강화된 품질 제어물질(QC): 0.250, 2.00, 7.50㎍/mL(각 수준에서 n=4).
고 교정기 이후의 오염 블랭크(CB).
곡선 희석 위 QC(DIL QC)는 40㎍/mL의 항-CI 및 항-gH 농도에서 제조하였고 분취 전에 10배 희석하였다.
6명의 개별 인간 공여자로부터의 특이성 샘플(SP) (각각 n=1).
0.200 ㎍/mL 농도의 항-CI 및 항-gH로 강화된 6명의 개인 인간 공여자로부터의 강화 특이성 샘플(SPF).
하기 농도 0.100, 0.200, 0.400, 1.00, 4.00, 8.00, 10.0 및 20.0 ㎍/mL(각 수준에서 n=2)에서 항-CI 및 항-gH(조합됨)로 강화되고 샘플 별로 각각 1.50 ㎍의 항-CI 항-ID mAb 및 항-gH 항-ID mAb 부하를 함유하는 추가 교정 표준물질(CAL).
분석용 샘플은 다음 단계에 의해 처리하였다:
1. 275㎕의 플레이트 컨디셔닝 완충액(0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1 Tween 20 / Trizma HCl(1M) / NaCl(5M) / EDTA(0.5M) / 물 / 소 혈청 알부민, v/v/v/v/w)을 첨가하여 Immulon 1B 96-웰 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트(Thermo, 제품 번호 3355)를 사전 컨디셔닝한다. 플레이트를 약 1분 동안 부드럽게 볼텍싱한다. 플레이트를 뒤집어서 컨디셔닝 완충액을 버리고 플레이트를 흡착 패드 상에 두드리며 건조시킨다.
2. 25㎕ 분취량의 혈청 샘플을 3.0 ㎍ 또는 1.5 ㎍ 항-CI 항-ID mAb, 3.0㎍ 또는 1.5㎍ 항-gH 항-ID mAb 및 10mM HBS-EP 완충액(GE Healthcare, 제품 번호 94318)의 혼합물에 첨가하여 사전 컨디셔닝된 96웰 마이크로웰 플레이트를 총 부피 150㎕로 만들었다.
3. 플레이트를 접착 필름으로 덮고, 타이터 플레이트 진탕기 상에서 일정하고 부드럽게 진탕하며 2시간 동안 실온(RT)에서 인큐베이션한다.
4. RT에서 1-2분 동안 혼합하여 필요한 부피의 스트렙타비딘 Dynabeads M-280(Life Technologies, 제품 번호 602-10) (웰 당 100㎕ 기준)을 동일한 부피의 10mM HBS-EP로 완충액을 교환한다. 상기 절차를 2회 반복한다. 상청액을 버린 후, 10mM HBS-EP로 50㎕ 부피로 만들어서 비드를 초기 시작 부피에 비해 2배 농축한다.
5. 이어서 50㎕의 농축 비드를 단계 3의 각 웰에 첨가하고 일정하고 부드러운 진탕 하에 2시간 동안 RT에서 결합하도록 놔둔다.
6. 외부 자석(Biotek 96-웰 Flat Magnet) 및 Biotek 플레이트 세척기를 이용해서 자성 비드를 분리하고 상청액 중 미결합 단백질을 버린다. 플레이트 세척기를 이용해서 비드를 75㎕의 비드 세척 완충액(5.0:3.0:0.2:91.8 Trizman HCl(1M) / NaCl(5M) / EDTA(0.5M) / 물, v/v/v/v)으로 3회 세척한다. 외부 자석을 이용해서 비드가 분리된 후 상청액을 버린다. 타이터 플레이트 진탕기를 이용해서 각각의 3회 세척 사이에 타이터 플레이트를 진탕하여 비드를재현탁한다.
7. 비드를 네 번째로 200㎕의 비드 세척 완충액으로 세척하고, 외부 자석을 이용해서 비드가 분리된 후 상청액을 버리고, 타이터 플레이트 진탕기를 이용해서 짧게 진탕하여 재현탁한다.
8. 자성 비드를 분리하고 상청액을 버린다. 비드를 75㎕ 비드 세척 용액(수중 20% 아세토니트릴)으로 1회 세척하고, 타이터 플레이트 진탕기를 이용해서 짧게 진탕하여 재현탁한다. 자성 비드를 분리하고 상청액을 버린다. 비드를 비드 세척 용액으로 마지막으로 세척하고, 타이터 플레이트 진탕기를 이용해서 짧게 진탕하여 재현탁한다.
9. 세척물을 버린 후, 75㎕의 Rapigest 계면활성제 용액(0.05:40:10 Rapigest(Rapigest SF 계면활성제, 물(Waters), 제품 번호 186002122) /암모늄 비카르보네이트, 50mM / ACN, w/v/v), 25㎕의 내부 표준물질(또는 내부 표준물질 희석제, 즉 수중 20% 아세토니트릴), 및 10㎕의 DTT(0.1M)를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 ~1시간 동안 사전 가열된 오븐에서 60 ℃에서 인큐베이션한다.
10. 25㎕의 요오도아세트미드(0.1M)를 각 웰에 첨가한다. 잘 섞는다. ~0.5시간 동안 RT에서 인큐베이션한다(광으로부터 보호한다).
11. 2.5㎍의 트립신을 각 웰에 첨가한다. 잘 섞는다. 하룻밤 동안(16-20hrs) 37℃에서 인큐베이션한다.
12. 15㎕의 2M HCl을 각 웰에 첨가한다. 잘 섞는다. ~0.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다.
13. 플레이트를 자석 위에 놓고 전체 용액을 96웰 에펜도르프(Eppendorf) 저결합 수집 플레이트 상부에 놓인 Multicreen HTS 필터 플레이트(Millipore, Part# MSHVN4550)로 옮긴다.
14. 3000rpm에서 5분 동안 필터 플레이트/수집 플레이트 조합을 원심분리하여 여액을 수집한다.
15. 플레이트를 주입 매트로 밀봉하고, LC/MS/MS 시스템 상에 15㎕을 직접 주입한다(10㎕ 주입 루프 상에).
데이터 감소
데이터 시스템은 MCMV3068A, MCMV5322A, 및 내부 표준물질 피크의 면적을 자동으로 계산하고 주석하도록 구성되었다. 이차 방정식의 1/농도 제곱 가중치의 최소 제곱 회귀 알고리즘을 적용하여 교정 표준물질의 피크 면적비(PARs)를 이용하여 교정 곡선을 구축하였다. 이어서 모든 농도를 교정선에 대한 이들의 PAR로부터 계산하였다.
초기 실험은 이것이 모든 특징 펩티드에 대해 두 분석물질 항-CI 및 항-gH 둘 다의 교정 범위를 0.100에서 20.0㎍/mL로 확장하는 것이 타당하였음을 나타내었다. 이차 방정식 회귀(1/x2 가중)를 항-CI 및 항-gH에 대해 적용하였다(1.5㎍의 각각의 항-ID mAb 부하로).
또한 분석 특이성을 여러 개별 혈청 로트에서 평가하고, 품질 제어(QC) 샘플을 교정 표준물질에 대해 제조하고 정량하였다. 우수한 정확도 및 정밀도 데이터를 모든 4개의 특징 펩티드에 대해 QC를 위해 수득하였다. 곡선 희석 위 QC 샘플을 곡선 범위에서 성공적으로 희석하였다. 일차 및 이차 펩티드의 일관된 면적비를 두 분석물질에 대해 모두 관찰하였다. 특이성 샘플은 분석물질 체류 시간에 어떠한 간섭의 존재도 나타내지 않았다. 강화된 특이성 샘플은 로트별 매트릭스 효과의 유의미한 증거를 나타내지 않았다.
각각의 항-이디오타입 항체에 대해 1.5㎍의 항-이디오타입 항체 부하를 이용하여 분석을 다음과 같이 추가 평가하였다. 항-이디오타입 항체 2.41A2.4를 항-CI의 검출을 위해 이용하였고, 항-이디오타입 항체 1.9E1.1을 항-gH의 검출을 위해 이용하였다. 각각 항-CI 및 항-gH 0.100 내지 20.0㎍/mL 범위의 적어도 8개 교정 포인트를 갖는 2개 세트의 표준 곡선을 수행하였다; 하나의 곡선은 샘플 배치 시작 시, 다른 하나는 종료 시이다. 교정 표준물질의 후교정값은 명목 농도의 ±20% 이내여야 했다. 표준물질의 후교정 농도가 허용 범위 밖에 속하면, 해당 표준물질을 배제하고 모든 남은 값들이 허용 범위 내에 있을 때까지 교정 데이터의 회귀 분석을 반복하였다. 허용 가능한 교정 곡선에 있어서 배제 후 잔여 수행에서 적어도 6개 교정 수준이 나타나고 최소 75%의 전체 교정 표준물질이 존재하였다. 각각의 하기 유형의 적어도 1개 블랭크 샘플을 분석하였다: (a) 내부 표준물질 없는 시약 블랭크; (b) 내부 표준물질 없는 매트릭스 블랭크; 및 (c) 내부 표준물질이 있는 매트릭스 블랭크.
정량 하한(LLOQ), 저, 중 및 고-수준 QC 샘플(n=6)으로 수행하여 분석내 정밀도 및 정확도를 평가하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 항-CI 및 항-gH의 LLOQ 농도에 대해 분석 내 변동 계수는 복제 분석내 결정에 있어서 25.0% 미만(허용 기준)이었고, 평균 정확도는 이론치 분석물질 농도의 ±25.0% 이내(허용 기준)였다. 항-CI 및 항-gH의 모든 다른 농도에 있어서, 분석 내 변동 계수는 복제 분석내 결정에 있어서 20.0% 미만이었고, 평균 정확도는 이론치 분석물질 농도의 ±20.0% 이내였다. 따라서 분석은 광범위한 약물 농도에 걸쳐 허용 가능한 정밀도 및 정확도를 나타낸다.
원래 표준 곡선의 상한을 넘어 샘플을 희석하는 능력을 평가하기 위해 추가적인 "곡선 위" 매트릭스 품질 제어 풀을 약 600㎍/mL의 항-CI 및 항-gH 농도로 제조하였다. 상기 QC 풀의 6개 복제물을 두 일련의 10배 희석을 이용하여 개별적으로 100배 희석하고 분석하였다. 희석물질은 두 일련의 10배 희석을 이용하여 제조하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 분석 내 변동 계수는 복제 분석내 결정에 있어서 20.0% 미만이었고, 평균 정확도는 이론치 분석물질 농도의 ±20.0% 이내였다.
항체 항-CI 항-gH
수행 ID
IA-0 IA-1 IA-2 IA-3 IA-0 IA-1 IA-2 IA-3
(㎍/mL) (㎍/mL)
0.108 0.238 1.60 16.8 0.0989 0.232 1.64 15.8
0.124 0.227 1.65 17.3 0.109 0.229 1.44 13.3
0.105 0.221 1.70 15.7 0.120 0.210 1.70 14.9
0.109 0.222 1.66 16.4 0.108 0.225 1.75 13.3
0.103 0.192 1.62 14.6 0.111 0.225 1.26 13.4
0.105 0.211 1.72 16.1 0.116 0.217 1.50 15.5
N 6 6 6 6 6 6 6 6
이론치 농도 0.100 0.200 1.50 15.0 0.100 0.200 1.50 15.0
평균 0.109 0.219 1.66 16.1 0.111 0.223 1.55 14.4
S.D. 0.0078 0.0157 0.047 0.930 0.0073 0.0082 0.185 1.17
C.V.% 7.18 7.17 2.85 5.76 6.55 3.67 11.9 8.16
이론치로부터의 차이% 9.02 9.30 10.5 7.66 10.7 11.5 3.20 -4.18
하한 0.0750 0.160 1.20 12.0 0.0750 0.160 1.20 12.0
상한 0.125 0.240 1.80 18.0 0.125 0.240 1.80 18.0
항체 항-CI 항-gH
수행 ID QC 4(㎍/mL) QC 4(㎍/mL)
676 559
682 635
595 748
598 720
649 671
637 650
N 6 6
이론치 농도 600 600
평균 639 664
S.D. 37.4 66.7
C.V.% 5.85 10.1
이론치로부터의 차이% 6.56 10.6
하한 480 480
상한 720 720
적어도 10개의 상이한 개별 로트/공여자(강화되지 않은 것(SP) 및 내부 표준물질로만 강화된 것(SP/IP) 둘 다)로부터의 매트릭스 샘플을 분석하여 분석 특이성을 평가하였다. 강화되지 않은 특이도 샘플에 있어서, 내부 표준물질의 예상 체류 시간에 존재하는 임의의 간섭 크로마토그래피 배경 피크 반응은 내부 표준물질로 강화된 특이성 샘플에서 내부 표준물질에 대해 결정되는 평균 크로마토그래피 반응의 5% 미만이었다. 내부 표준물질(들)로만 강화된 특이성 샘플에 있어서, 이들 샘플에서 측정된 반응비(간섭 배경 피크 반응/내부 표준물질 피크 반응)는 수행 동안 분석된 허용 가능한 정량 하한(LLOQ) CAL 및 QC에서 대응하는 분석물질에 대해 결정된 평균 반응비의 20% 미만이어서 항-CI 및 항-gH 모두에 대해 허용 가능한 분석 특이성을 나타내었다.
분석 선택성을 이용 수준의 내부 표준물질(들) 및 낮은 QC 수준의 표적 분석물질(들)로 강화된 10개의 상이한 개별 로트의 분석으로 평가하였다. 이들 평가 샘플을 SPF로 확인한다. 분석 내 변동 계수는 복제 결정에 있어서 20.0% 미만이었고, 평균 정확도는 항-CI의 모든 평가 샘플에 대해(표 7) 그리고 항-gH의 10개 중 9개 평가 샘플에 대해(표 8) 이론치 분석물질 농도의 ±20.0% 이내여서 두 항체 모두에 대해 허용 가능한 분석 선택성이 확인되었다.
샘플 ID SPF 1
SPF 2
SPF 3
SPF 4
SPF 5
SPF 6 SPF 7 SPF 8 SPF 9 SPF 10
0.189 0.157 0.215 0.182 0.184 0.182 0.167 0.178 0.218 0.186
0.171 0.193 0.204 0.183 0.224 0.182 0.178 0.166 0.185 0.194
0.211 0.217 0.228 0.192 0.150 0.204 0.220 0.186 0.190 0.202
N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
이론치 농도 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200
평균 0.190 0.189 0.216 0.186 0.186 0.189 0.188 0.177 0.198 0.194
S.D. 0.0199 0.0305 0.0121 0.0052 0.0370 0.0126 0.0278 0.0099 0.0175 0.0079
C.V.% 10.5 16.1 5.59 2.82 19.9 6.65 14.8 6.62 8.87 4.09
이론치로부터의 차이% -4.91 -5.52 7.76 -7.17 -7.02 -5.38 -5.92 -11.7 -1.23 -2.83
하한 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160
상한 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240
샘플 ID SPF 1
SPF 2
SPF 3
SPF 4
SPF 5
SPF 6 SPF 7 SPF 8 SPF 9 SPF 10
0.201 0.152 0.221 0.161 0.213 0.191 0.191 0.157 0.179 0.201
0.189 0.265 0.217 0.230 0.202 0.199 0.185 0.172 0.187 0.238
0.156 0.193 0.175 0.219 0.175 0.225 0.193 0.249 0.204 0.204
N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
이론치 농도 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200 0.200
평균 0.182 0.204 0.205 0.204 0.196 0.205 0.190 0.193 0.190 0.214
S.D. 0.0231 0.0572 0.0255 0.0369 0.0194 0.0176 0.0045 0.0495 0.0127 0.0207
C.V.% 12.7 28.1 12.5 18.1 9.89 8.58 2.38 25.7 6.68 9.69
이론치로부터의 차이% -9.03 1.78 2.34 1.78 -1.75 2.47 -5.17 -3.74 -5.05 7.00
하한 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160 0.160
상한 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240 0.240
특징 펩티드의 SIL IS로 강화된 샘플에 대해 교차 분석물질 간섭 확인을 평가하였다. 상기 분석에서 측정된 개별 분석물질에 대응하는 대리 특징 펩티드는 분석 절차를 이용해서 독립적으로 생성될 수 없으므로, 항-CI 또는 항-gH로 강화된 샘플에 대해 동일한 개별 분석물질 특징 펩티드 간 교차 분석물질 간섭은 평가하지 않았다. 그보다는 항-CI에 대응하는 특징 펩티드 및 항-gH에 대응하는 특징 펩티드 간 교차 분석물질 간섭을 평가하였다. 다른 분석물질 및 내부 표준물질에 대한 신호의 가능한 기여에 대해 개별적으로 각각의 내부 표준물질을 확인하였다. 예상되는 이용 수준에서 하나의 내부 표준물질로만 대조군 매트릭스 샘플("AI")을 강화하고 3개씩 분석하였다. 그 예상 체류 시간에 존재하는 크로마토그래피 피크에서 분석물질의 반응에 대한 기여는 수행 동안 분석된 허용 가능한 LLOQ CAL 및/또는 LLOQ QC에서 그 분석물질에 대해 결정된 평균 크로마토그래피 반응의 20% 미만이어야 했다. 내부 표준물질의 예상 체류 시간에 존재하는 간섭 크로마토그래피 배경 피크 반응은 내부 표준물질로 강화되고 수행 동안 분석된 허용 가능한 정량 상한(ULOQ) CAL 및 고수준 QC에서 내부 표준물질에 대해 결정된 평균 크로마토그래피 반응의 5% 미만이어야 했다. 전체적으로 항-CI 및 항-gH의 특징 펩티드의 SIL IS로 강화된 샘플에 대해 유의미한 교차 분석물질 간섭은 관찰되지 않았다.
QC를 적어도 3회의 냉동/해동 사이클을 거쳐 고 및 저 QC 농도에서 급속냉동기 냉동/해동 안정성을 평가하였다. 수준별로 적어도 6개 복제물을 분석하였다. 냉동/해동 샘플의 변동 계수는 복제물 결정에 대해 20% 이하였고, 평균 정확도는 이론치 농도의 ± 20% 이내로, 항-CI 및 항-gH 모두에 대해 허용 가능한 냉동/해동 안정성을 나타내었다.
상기 발명을 이해의 명확성 목적으로 예시 및 실시예로써 일부 상세히 기재하였으나, 기재 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본원에 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시는 그 전문이 참고문헌으로 명시적으로 도입된다.
<110> GENENTECH <120> ANTI-HCMV IDIOTYPIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> GNE-0399 PCT <150> 61/616,914 <151> 2012-03-28 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Tyr Tyr Val Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Thr 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Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Glu Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Pro Leu Phe Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Val Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Glu 1 5 10 15 Ala <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 His Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 18 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 Asp Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 21 Ser Gly Phe Pro Leu Phe Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 22 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Gly Thr Val Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val 1 5 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg 1 5 10 15 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ser Asn Ser Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Alkylated Cys <400> 28 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr Ser Val Phe 1 5 10 15 Trp Val Arg <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 10 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Ser Trp Tyr Tyr Val Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr Ser Val Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Ser Ser Ile Asn Ser Asn Ser Arg Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val 20 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Met Gln Ala Leu Gln Ile Pro Arg Thr 1 5

Claims (52)

  1. 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체 또는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서,(a) HVR-H1은 서열 목록 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 목록 번호 14의 아미노산 서열을 포함하며;
    (c) HVR-H3은 서열 목록 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 목록 번호 16의 아미노산 서열을 포함하며;
    (e) HVR-L2는 서열 목록 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 목록 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 항-이디오타입 항체.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 7의 경쇄 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
    (a) HVR-H1은 서열 목록 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 목록 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며;
    (c) HVR-H3은 서열 목록 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 목록 번호 22의 아미노산 서열을 포함하며;
    (e) HVR-L2는 서열 목록 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 목록 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 항-이디오타입 항체.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 11의 경쇄 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체.
  9. 청구항 3에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 적어도 하나의 HVR에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체.
  10. 청구항 3에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체의 HVR-H2(서열 목록 번호 36)에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체.
  11. 청구항 1에 있어서, 검출 가능한 표지에 콘쥬게이션된 항-이디오타입 항체.
  12. 청구항 1에 있어서, 바이오틴에 콘쥬게이션된 항-이디오타입 항체.
  13. 생물학적 샘플에서 관심 항체를 특이적으로 검출하기 위한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 방법에 있어서, 상기 방법이, (a) 상기 샘플에 존재하는 임의 관심 항체에 결합하도록 상기 생물학적 샘플과 포착 시약을 접촉시키고 인큐베이션하며, 여기서 상기 포착 시약은 청구항 1의 항-이디오타입 항체이고, (b) 상기 포착 시약, 및 이에 따라 임의의 결합된 관심 항체를 상기 관심 항체와 결합하는 검출 가능한 항체와 접촉시키고, 상기 검출 가능한 항체에 대한 검출 수단을 이용해서 상기 항-이디오타입 항체에 결합된 상기 관심 항체의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 관심 항체는 (a) 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합으로부터 선택된, 분석 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 포착 시약은 고형 지지체에 고정화되며, 상기 방법은 존재하는 임의의 상기 관심 항체에 결합된 상기 고정화된 포착 시약으로부터 상기 생물학적 샘플을 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 고정화된 포착 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된, 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 고정화된 포착 시약은 바이오틴에 콘쥬게이션되며, 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합된, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비인간 종 유래 항체인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 마우스 항-huIgG Fcγ 항체인 방법.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 직접 검출 가능한 방법.
  20. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 홀스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxidase)에 콘쥬게이션된, 방법.
  21. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 검출 가능한 항체는 형광측정 또는 비색측정 시약에 의해 검출된, 방법.
  22. 생물학적 샘플에서 관심 항체를 특이적으로 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은, (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 관심 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체와 접촉시키고 인큐베이션하고; (b) 상기 샘플을 상기 항-이디오타입 항체에 결합하는 면역친화성 비드와 접촉시키고 인큐베이션하고; (c) 상기 관심 항체를 용출하고; (d) 상기 용출된 관심 항체를 분리 매질(media)에 적용하여 하나 초과의 샘플 성분을 분리하고, 여기서 분리된 샘플 성분은 관심 항체 또는 이들의 단편 또는 특징 펩티드를 포함하며; (e) 하나 이상의 분리된 샘플 성분의 질량 대 전하비를 질량 분광측정에 의해 확립하는 것을 포함하고, 여기서 상기 관심 항체는 (a) 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합으로부터 선택된, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 면역친화성 비드와의 인큐베이션 후에 그리고 상기 관심 항체의 용출 이전 또는 이후에 상기 생물학적 샘플을 프로테아제로 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 프로테아제는 트립신인 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 바이오틴화된, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 면역친화성 비드에 결합하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 상기 생물학적 샘플과의 접촉 및 인큐베이션 이전에 상기 면역친화성 비드에 결합된, 방법.
  28. 청구항 22에 있어서, 상기 면역친화성 비드는 자성 비드인 방법.
  29. 청구항 22에 있어서, 상기 분리 매질는 크로마토그래피 지지체인 방법.
  30. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 관심 항체는 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 7의 경쇄 서열을 포함하는 방법.
  31. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 관심 항체는 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고, 상기 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서,
    (a) HVR-H1은 서열 목록 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 목록 번호 14의 아미노산 서열을 포함하며;
    (c) HVR-H3은 서열 목록 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 목록 번호 16의 아미노산 서열을 포함하며;
    (e) HVR-L2는 서열 목록 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 목록 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  32. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 7의 경쇄 서열을 포함하는 방법.
  33. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 관심 항체는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이며 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 11의 경쇄 서열을 포함하는 방법.
  34. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 관심 항체는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서,
    (a) HVR-H1은 서열 목록 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 목록 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며;
    (c) HVR-H3은 서열 목록 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 목록 번호 22의 아미노산 서열을 포함하며;
    (e) HVR-L2는 서열 목록 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 목록 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  35. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 서열 목록 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 11의 경쇄 서열을 포함하는 방법.
  36. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 관심 항체는 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 항-HCMV 항체이고 상기 항-이디오타입 항체는 상기 항-HCMV 항체의 HVR-H2(서열 목록 번호 36)에 특이적으로 결합하는 방법.
  37. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 관심 항체는 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체 및 (b) 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체인 방법.
  38. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 상기 관심 항체에 결합하고 상기 샘플 중 적어도 하나의 다른 항-HCMV 항체에는 결합하지 않는 방법.
  39. 청구항 13 내지 18 및 22 내지 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 인간 대상체에서 단리된, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 인간 대상체는 (a) 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합에서 선택되는 항-HCMV 항체로 처리된, 방법.
  41. 청구항 13 내지 18, 22 내지 29 및 40 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 공지된 수준 대비 상기 관심 항체의 수준을 측정하기 위한 표준 곡선의 이용을 추가로 포함하는 방법.
  42. 청구항 13 내지 18, 22 내지 29 및 40 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청인 방법.
  43. 청구항 41에 있어서, 상기 샘플은 혈청인 방법.
  44. (a) 서열 목록 번호 1의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 2의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-HCMV 항체; (b) 서열 목록 번호 3의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 4의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-HCMV 항체; 및 (c) 이들의 조합에서 선택되는 관심 항체를 생물학적 샘플에서 특이적으로 검출하기 위한 면역분석 키트에 있어서, 상기 키트가, (a) 포착 시약으로 상기 관심 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 함유하는 용기; (b) 상기 관심 항체에 결합하는 검출 가능한 항체를 함유하는 용기; 및 (c) 상기 관심 항체의 검출 지침을 포함하는 키트.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 관심 항체를 검출하기 위한 ELISA 방법에서 유용한 키트.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 포착 시약에 대한 고형 지지체를 추가로 포함하는 키트.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 포착 시약은 상기 고형 지지체 상에 고정화된, 키트.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 포착 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된, 키트.
  49. 청구항 44에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체는 (a) 서열 목록 번호 5의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 7의 경쇄 서열을 포함하는 제1 항-이디오타입 항체; (b) 서열 목록 번호 9의 중쇄 서열 및 서열 목록 번호 11의 경쇄 서열을 포함하는 제2 항-이디오타입 항체; 및 (c) 이들의 조합에서 선택된, 키트.
  50. 번호 13 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 중쇄 고가변 영역을 포함하는 항-HCMV 항체에 특이적으로 결합하는 단리된 항-이디오타입 항체.
  51. 청구항 50에 있어서, 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서,
    (a) HVR-H1은 서열 목록 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 목록 번호 14의 아미노산 서열을 포함하며;
    (c) HVR-H3은 서열 목록 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 목록 번호 16의 아미노산 서열을 포함하며;
    (e) HVR-L2는 서열 목록 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 목록 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  52. 청구항 50에 있어서, 3개의 중쇄 고가변 영역(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 고가변 영역(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서,
    (a) HVR-H1은 서열 목록 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 목록 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며
    (c) HVR-H3은 서열 목록 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 목록 번호 22의 아미노산 서열을 포함하며;
    (e) HVR-L2는 서열 목록 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 목록 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
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