JP2014501491A - 抗体組成物及び使用の方法 - Google Patents

抗体組成物及び使用の方法 Download PDF

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Abstract

発明は、抗ｇＨ抗体及び抗複合体Ｉ抗体を含んでなる組成物、並びにその使用方法を提供する。

Description

(関連出願)
この出願は、共に２０１０年９月２９日に出願された米国仮出願第６１／３８７，７３５号及び同第６１／３８７，７２５号、及び２０１１年７月１日に出願された米国仮出願第６１／５０４，０５６号の優先権を主張するものであり、その全てを出典明記によりその全体をここに援用する。
ＥＦＳ-ＷＥＢよりテキストファイルとして提出する配列表の参照
配列表を、ＥＦＳ-ＷｅｂよりＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして明細書と共に提出する(ファイル名「P4680R1US.txt」、作成日２０１１年９月１５日、サイズ２００，２７７バイト)。ＥＦＳ-Ｗｅｂより提出する配列表は明細書の一部であり、出典明記によりその全体をここに援用する。
(発明の分野)
本発明は、抗複合体Ｉ及び抗ｇＨ抗体及びその使用の方法に関する。
ヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)はβ-ヘルペスウイルスであり、ヒトヘルペスウイルス-５(ＨＨＶ-５)としても知られる。更なる哺乳類に感染する他の種のサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)が存在し、例えばマウスＣＭＶ(ＭＣＭＶ)、モルモットＣＭＶ(ＧＰＣＭＶ)、サルＣＭＶ(ＳＣＣＭＶ)、アカゲザルＣＭＶ(ｒｈＣＭＶ)及びチンパンジーＣＭＶ(ＣＣＭＶ)である。ＨＣＭＶは、米国の人口のおよそ５０％に感染する一般的なヘルペスウイルスである。ヒト感染個体の大多数では、ＨＣＭＶ感染は無症候性である。しかしながら、病気の状態、及び免疫抑制(例えば、ＨＩＶ感染、移植患者における薬物誘発性免疫抑制)において、ＨＣＭＶ再活性化又は一次感染は、様々な臨床症状、例えば単核球症、肝炎、網膜炎、肺炎、失明及び臓器不全を引き起こす。加えて、妊娠中の場合、一次ＣＭＶ感染の獲得は母親への影響はほとんどないが、発育中の胎児において重篤な臨床結果を有しうる。
先天性ＨＣＭＶ感染は、妊娠期間中に感染した母親から生まれる多くの子供が子宮内で感染し、深刻な臨床疾患を患うことから特に重要である。米国及び欧州では、１２６，０００の女性が妊娠期間中に一次ＨＣＭＶ感染にかかり、これらの母親から生まれるおよそ４０，０００の乳児が先天性感染にかかる。米国では、７５０に１人の子供がＨＣＭＶ感染により障害を持って生まれるか又は障害を形成し、精神遅滞、難聴、視力喪失、臓器異常、及び発育異常を含む。先天性ＨＣＭＶ感染は、胎児異常の最も一般的な感染源である。妊婦の一次感染が生じた後、胎児感染の防止又は治療のための承認された治療は現在ない。従って、当分野において、先天性ＨＣＭＶ感染を防止するための組成物及び方法を見出すことへの強いニーズがある。
２００５年にＮｉｇｒｏ及び同僚が研究を発表し、そこでは、ヒトＣＭＶ高力価免疫グロブリン(ＨＩＧ)が、一次ＨＣＭＶ感染を有する妊婦に投与された(Nigro et al. (2005) New Engl. J. Med. 353:1350-1362)。研究の一アームでは、ＨＣＭＶに感染した母親から生まれた３１の乳児の内１人のみが疾患を伴って生まれ、未治療の女性から生まれた子供の７／１４(５０％)がＨＣＭＶ疾患を伴って生まれた。Ｉｄ．
妊娠期間中、ＨＣＭＶは、感染した母親から胎児に胎盤を通して広がる。胎盤は胎児を子宮に固定し、特殊化した上皮細胞、間質線維芽細胞、内皮細胞、及び特殊化したマクロファージを有する。ＨＣＭＶウイルス表面は、胎盤に見られる特定の細胞タイプの感染に必要であると示されている様々なウイルス性糖タンパク質複合体を有する。ｇＨ／ｇＬ及びＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１を有するＣＭＶ糖タンパク質の複合体(以下、「複合体Ｉ」と呼ぶ)は、内皮細胞、上皮細胞及びマクロファージの感染に特に必要である。ｇＨ／ｇＬ及びｇＯを有するＣＭＶ糖タンパク質の複合体(以下、「複合体ＩＩ」と呼ぶ)は、線維芽細胞の感染に特に必要である。ＨＩＧは、ＨＣＭＶ感染に感受性である全４つの胎盤細胞へのウイルス侵入を阻止することが示されている。
調製の難しさ及び広く分布するＨＩＧ及びヒト血液製剤を使用することへの医師及び医学界の抵抗により、特に妊娠中の女性において、先天性ＨＣＭＶ感染から胎児を保護できるモノクローナル抗体(一又は複数)を含んでなる組成物を作ることが最も有益であろう。これまで、ＣＭＶの母体-胎児感染の防止のためのモノクローナル抗体組成物は開発されていない。Lanzavecchia及びMacagnoは、ＣＭＶ感染を中和するＵＬ１３０及びＵＬ１３１の組合せ又はＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１の組合せから生じるコンホメーションエピトープに結合する感染患者の固定化Ｂ細胞から単離された天然に生じる抗体を開示している（米国特許公開第２００８／０２１３２６５号及び同第２００９／００８１２３０号）。Shenk及びWangは、複合体Ｉのタンパク質に結合する抗体を開示している(米国特許第７，７０４，５１０号）。Funaro et al.も米国特許公開第２０１０-００４０６０２号においてＣＭＶに対する中和抗体を開示する。更に、抗ｇＨモノクローナル抗体、ＭＳＬ-１０９が、ヒトにおいて、２つの患者集団、同種骨髄移植レシピエント及びＡＩＤＳ及びＣＭＶ網膜炎を有する患者において試験されたが(Drobyski et al., Transplantation 51:1190-1196 (1991); Boeckh et al., Biol.Blood Marrow Transplant.7:343-351 (2001);及び Borucki et al., Antiviral Res.64:103-111 (2004)、失敗に終わった。
当分野において、先天性ＨＣＭＶ感染を含むＨＣＭＶ感染を防止するためのモノクローナル抗体を開発することのニーズが残っている。
発明は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに特異的に結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様では、発明の抗複合体Ｉ抗体は６つのＨＶＲを含む：(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：１０−１９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３。抗体は、配列番号：４３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１及び配列番号：４４のアミノ酸配列を含んでなるＦＲ２を更に含みうる。
更なる実施態様では、発明の抗複合体Ｉ抗体は、３つの重鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３)及び３つの軽鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３)を含み：(ａ)ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：６のアミノ酸配列を含み；(ｂ)ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：７のアミノ酸配列を含み；(ｃ)ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：８のアミノ酸配列を含み；(ｄ)ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：９のアミノ酸配列を含み；(ｆ)ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：２０のアミノ酸配列を含み；そして(ｅ)ＨＶＲ-Ｌ２及び軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３の第一アミノ酸は配列番号：２１のアミノ酸配列を含む。
特定の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は、(ａ)配列番号：４５、又は配列番号：４６、又は配列番号：４７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ；及び(ｂ)配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。このような抗体は、配列番号：４１のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３及び配列番号：４２のアミノ酸配列を含んでなるＦＲ４を更に含みうる。
幾つかの実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は、配列番号：４５、又は配列番号：４６、又は配列番号：４７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する配列ＶＬを含む。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号：４５、又は配列番号：４６、又は配列番号：４７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。幾つかの実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は、配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含んでなるをＶＬ含む。幾つかの実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は配列番号：４５又は配列番号：４６のＶＨ配列及び配列番号：４９のＶＬ配列を含む。
発明はまた、ＨＣＭＶｇＨに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
幾つかの実施態様では、発明の抗ｇＨ抗体は、３つの重鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３)及び３つの軽鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３)を含み：
(ａ)ＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号：７１のアミノ酸配列を含み；
(ｂ)ＨＶＲ-Ｈ２は、配列番号：７２、配列番号：７３配列番号：７４及び配列番号：９３から選択されるアミノ酸配列を含み；
(ｃ)ＨＶＲ-Ｈ３は、配列番号：７５のアミノ酸配列を含み；
(ｄ)ＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号：７６のアミノ酸配列を含み；
(ｅ)ＨＶＲ-Ｌ２は、配列番号：７７のアミノ酸配列を含み；そして
(ｆ)ＨＶＲ-Ｌ３は、配列番号：７８のアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗ｇＨ抗体は配列番号：９３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含み、配列番号：９３の位置６のアミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕから成る群から選択され、配列番号：９３の位置８のアミノ酸はＴｈｒ及びＡｒｇから成る群から選択される。
ある実施態様では、抗ｇＨ抗体は、配列番号：７２、配列番号：７３又は配列番号：７４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含む。
他の実施態様では、抗ｇＨ抗体は配列番号：９４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含み、該配列は(配列番号：９４の)位置５４にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕから成る群から選択されるアミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、位置５６にＴｈｒ及びＡｒｇから成る群から選択されるアミノ酸を更に含む。
発明はまた、配列番号：９４にアミノ酸配列において少なくとも９５％同一であるＶＨ配列を有する抗体であって、該配列がアミノ酸Ａｓｎ５４、Ｓｅｒ５４、Ｔｈｒ５４、Ｇｌｎ５４、Ｐｈｅ５４、Ｍｅｔ５４、又はＬｅｕ５４及び／又はＡｒｇ５６を含む抗体を提供する。ある実施態様では、抗体は、配列番号：８７、配列番号：８８及び配列番号：８９から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。幾つかの実施態様では、ＶＨは配列番号：９４に９５％同一なアミノ酸配列を含み、該配列は位置５４にＡｓｎ５４、Ｓｅｒ５４、Ｔｈｒ５４、Ｇｌｎ５４、Ｐｈｅ５４、Ｍｅｔ５４、又はＬｅｕ５４から選択されるアミノ酸及び／又は位置５６にＡｒｇ(Ａｒｇ５６)を有し；そして(ｂ)ＶＬ配列は配列番号：９０のアミノ酸配列に少なくとも９５％配列同一性を有する。ある実施態様では、ＶＨは、配列番号：８７、配列番号：８８及び配列番号：８９から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、ＶＬは、配列番号：９０のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、抗体は、配列番号：８９のＶＨ配列及び配列番号：９０のＶＬ配列を含む。
ある実施態様では、発明の抗体は、ＨＣＭＶの表面上のＨＣＭＶ複合体Ｉに特異的に結合し、０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０でＨＣＭＶを中和する。ある実施態様では、発明の単離された抗複合体Ｉ抗体はＨＣＭＶの表面上のＨＣＭＶ複合体Ｉに特異的に結合し、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．０１３μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ、０．００９μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００７μｇ／ｍｌ、０．００６μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００４μｇ／ｍｌ、０．００３μｇ／ｍｌ、０．００２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０００９μｇ／ｍｌ、０．０００８μｇ／ｍｌ、０．０００７μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で(例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下の抗体濃度で)５０％のＨＣＭＶを中和する。
ある実施態様では、発明の単離された抗ｇＨ抗体は、ＨＣＭＶｇＨに特異的に結合する。抗体は、ＨＣＭＶの表面上のｇＨに結合し、１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０でＨＣＭＶを中和する。発明の単離された抗ｇＨ抗体は、ＨＣＭＶの表面上のｇＨに結合し、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．０１３μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ、０．００９μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００７μｇ／ｍｌ、０．００６μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００４μｇ／ｍｌ、０．００３μｇ／ｍｌ、０．００２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で(例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下の抗体濃度で)５０％のＨＣＭＶを中和する。
発明の抗体はモノクローナル抗体であり得、例えばヒト、ヒト化又はキメラ抗体を含む。発明はまた、ＨＣＭＶｇＨ及び／又は複合体Ｉに特異的に結合する抗体断片を提供する。
特定の実施態様では、ＨＣＭＶ複合体Ｉ及び／又はｇＨに特異的に結合する抗体は完全長ＩｇＧ１抗体である。
発明はまた、ＨＣＭＶ複合体Ｉ及び／又はｇＨに特異的に結合する抗体をコードする単離された核酸を提供する。発明はまた、このような抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
発明は更に、抗体が生産されるように、複合体Ｉ及び／又はｇＨに特異的に結合する抗体をコードする核酸を有する宿主細胞を培養することを含んでなる抗体を生産する方法を提供する。方法は、宿主細胞から抗体を回収することを更に含みうる。
発明はまた、抗複合体Ｉ抗体、又は抗ｇＨ抗体、又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体の組合せ及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的製剤を提供する。各抗体の薬学的製剤は別々又は組合せでありうる。薬学的製剤は、追加の治療剤(例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビル)を更に含みうる。
発明はまた、抗複合体Ｉ抗体、又は抗ｇＨ抗体、又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体の組合せを含んでなる組成物を提供する。各抗体を含んでなる組成物は、別々又は組合せでありうる。組成物は、追加の治療剤(例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビル)を更に含みうる。
発明はまた、ＨＣＭＶ感染の阻害、治療又は防止における使用のための、抗複合体Ｉ及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物を提供する。幾つかの実施態様では、使用は、先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された組織、臓器又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある組織又は臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を阻害、治療又は防止するためである。更なる実施態様は、移植レシピエントが過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、再活性化のリスクにある場合における使用を含む。ある実施態様では、組織又は臓器移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。ある実施態様では、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物と別々である。
発明の抗体を含んでなる組成物はまた、医薬の製造において使用されうる。医薬は、ＨＣＭＶ感染の治療、阻害又は防止、例えば先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された臓器、組織又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある臓器又は組織移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の阻害、防止又は治療などにおける使用のためでありうる。更なる実施態様では、移植レシピエントは過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、再活性化のリスクにある。ある実施態様では、医薬は、追加の治療剤(例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビル)を更に含みうる。ある実施態様では、臓器又は組織移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。ある実施態様では、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体と別の組成物中にある。
発明はまた、患者に、抗ｇＨ抗体、抗複合体Ｉ抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる、ＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法を提供する。発明はまた、妊娠中の女性に、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる、先天性ＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法を提供する。発明はまた、妊娠中の女性に、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる、ＨＣＭＶ感染胎児を治療する方法を提供する。発明はまた、ＨＣＭＶ感染乳児、又は妊娠期間中にＨＣＭＶに曝された乳児を治療する方法であって、乳児に、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
発明はまた、ＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある臓器ドナー又は組織ドナーから得られた臓器又は組織から生じるＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止するための、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を移植臓器又は組織レシピエントに投与することを含んでなる、臓器又は組織移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法を提供する。更なる実施態様は、移植レシピエントが過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、再活性化のリスクにある場合における方法を含む。治療の方法は、患者に追加の治療剤を投与することを更に含みうる(例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビル)。
ある実施態様では、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物と別の組成物中にある。他の実施態様では、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物と同時に、より前に又は後に投与される。
発明はまた、ＨＣＭＶ感染の阻害、治療又は防止における使用のための、抗複合体Ｉ及び／又は抗ｇＨ抗体を提供する。幾つかの実施態様では、使用は、先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された組織、臓器又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある組織又は臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を阻害、治療又は防止するためである。更なる実施態様は、移植レシピエントが過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、再活性化のリスクにある場合における使用を含む。ある実施態様では、組織又は臓器移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。
発明の抗体は、医薬の製造において使用されうる。医薬は、ＨＣＭＶ感染の治療、阻害又は防止、例えば先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された臓器、組織又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある臓器又は組織移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の阻害、防止又は治療などにおける使用のためでありうる。更なる実施態様では、移植レシピエントは過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、再活性化のリスクにある。ある実施態様では、医薬は、追加の治療剤(例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビル)を更に含みうる。ある実施態様では、臓器又は組織移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。
発明はまた、患者に有効量の抗ｇＨ、抗複合体Ｉ抗体又はその組合せを投与することを含んでなる、ＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法を提供する。発明はまた、妊娠中の女性に有効量の発明の抗体又はその組合せを投与することを含んでなる、先天性ＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法を提供する。発明はまた、妊娠中の女性に有効量の発明の抗体又はその組合せを投与することを含んでなる、ＨＣＭＶ感染胎児を治療する方法を提供する。
発明はまた、ＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある臓器ドナー又は組織ドナーから得られた臓器又は組織から生じるＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止するための、有効量の発明の抗体又はその組合せを移植臓器又は組織レシピエントに投与することを含んでなる、臓器又は組織移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法を提供する。更なる実施態様は、移植レシピエントが過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、再活性化のリスクにある場合における方法を含む。治療の方法は、患者に追加の治療剤を投与することを更に含みうる(例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビル)。
ある実施態様では、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体と別に投与される。他の実施態様では、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体は、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体と同時に、より前に又は後に投与される。
ある実施態様では、臓器移植は、心臓、腎臓、肺、膵臓、腸、又は胸腺である。他の実施態様では、組織移植は手、角膜、皮膚、顔、ランゲルハンス島、骨髄、幹細胞、全血、血小板、血清、血液細胞、血管、心臓弁、骨、骨前駆細胞、軟骨、靱帯、腱、筋肉内壁である。
発明はまた、発明の抗ｇＨ及び／又は抗複合体Ｉ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。更なる実施態様は、配列番号：１の位置１６８のトリプトファン；配列番号：１の位置４４６のアスパラギン酸；配列番号：１の位置１７１のプロリン；及びその組合せから成る群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸を含んでなるＨＣＭＶｇＨのエピトープに結合する抗体を含む。更なる実施態様は、配列番号：２０３の位置４７のグルタミン；(ｉｉ)配列番号：２０３の位置５１のリシン；(ｉｉｉ)配列番号：２０３の位置４６のアスパラギン酸；及び(ｉｖ)その組合せから成る群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸を含んでなるＨＣＭＶ複合体Ｉのエピトープに結合する抗体を含む。更なる実施態様は、ＨＣＭＶ複合体Ｉのポリペプチドに結合する抗体であって、ポリペプチドがアミノ酸配列ＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫＹＶＥＱＬＶＤＬＴ ＬＮＹＨＹＤＡＳ(配列番号：１９４)を含む抗体を含む。
図1は、選択したヒト重鎖可変領域:VH1 FW(配列番号:52)、ヒトVH3 FW(配列番号:53)、及びヒトVH7 FW(配列番号:54)との、マウスmAb 8G8 (配列番号:50)の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。円はVL-VH相互作用を示す(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169);二重アスタリスク(一つの上に他)はVernier Positions(Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487)及びFW-CDR相互作用(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169)を示す。位置47、64、66、68の単一アスタリスクはVernier Positionsを示す(Foote and Winter (1992) J. Mol.Biol.224:487);位置58の単一アスタリスクはFW-CDR相互作用を示す(Padlan (1994) Mol.Immunol.31:169)。 図2は、ヒト軽鎖可変領域:λ3 FW領域(配列番号:69)及びヒトλ4 FW領域(配列番号:55)との、マウスmAb 8G8(配列番号:51)の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。円はVL-VH相互作用を示す(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169);二重アスタリスク(一つの上に他)はVernier Positions(Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487)及びFW-CDR相互作用(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169)を示す。位置47、64、66、68の単一アスタリスクはVernier Positionsを示す(Foote and Winter (1992) J. Mol.Biol.224:487);位置58の単一アスタリスクはFW-CDR相互作用を示す(Padlan (1994) Mol.Immunol.31:169)。 図3は、8G8λ3変異体と8G8λ4変異体を比較する中和アッセイの結果を示す。パネルA:ヒトVH1、VH3又はVH7を有するヒト化8G8λ3抗体を、マウス/ヒトキメラ8G8抗体(QE7/C2)に加えて、中和アッセイにおいて使用した。パネルB:ヒトVH1、VH3又はVH7を有するヒト化8G8λ4抗体を、マウス/ヒトキメラ8G8抗体(QE7/C2)に加えて、中和アッセイにおいて使用した。実験のEC50値はそれぞれの実験の下に示す。 図4は、8G8 HVR-L2におけるミュータント配列を示す。示すのはHVR-L2のアミノ酸配列及びFR3の第一アミノ酸である(WT、配列番号:57;A1、配列番号:58;E1、配列番号:59;T1、配列番号:60;A2、配列番号:61;E2、配列番号:62;T2、配列番号:63;SG、配列番号:64;SGSG、配列番号:65;TGDA、配列番号:66)。図中の番号はKabat番号付けに基づく。 図5は、単一アミノ酸置換を有する図4に示す変異HVR-L2領域を伴う様々なヒト化8G8抗体を使用した中和アッセイの結果を示す。パネルA:中和アッセイ。HVR-L2ミュータント抗体は全てヒト8G8 VH1鎖を有した。パネルB:実験のEC50値。 図6は、２つのアミノ酸置換を有する図4に示す変異HVR-L2領域を伴う様々なヒト化8G8抗体を使用した中和アッセイの結果を示す。パネルA:中和アッセイ。HVR-L2ミュータント抗体は全てヒト8G8 VH1鎖を有した。パネルB:実験のEC50値。 図7は、ヒト軽鎖可変領域λ4 FW(配列番号:55)及びλ4 FWにおける8G8のヒト化軽鎖可変領域(hu8G8.λ4 FW)(配列番号:48)との、マウスmAb 8G8の軽鎖可変領域(配列番号:51)のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。円はVL-VH相互作用を示す(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169);二重アスタリスク(一つの上に他)はVernier Positions(Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487)及びFW-CDR相互作用(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169)を示す。位置47、64、66、68の単一アスタリスクはVernier Positionsを示す(Foote and Winter (1992) J. Mol.Biol.224:487);位置58の単一アスタリスクはFW-CDR相互作用を示す(Padlan (1994) Mol.Immunol.31:169)。 図8は、ヒト重鎖可変領域VH1フレームワーク(VH1 FW)(配列番号:52)及びVH1 FWにおける8G8のヒト化重鎖可変領域(hu8G8.VH1)(配列番号:45)とのマウスmAb 8G8の重鎖可変領域(配列番号:50)のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。円はVL-VH相互作用を示す(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169);二重アスタリスク(一つの上に他)はVernier Positions(Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487)及びFW-CDR相互作用(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169)を示す。位置47、64、66、68の単一アスタリスクはVernier Positionsを示す(Foote and Winter (1992) J. Mol.Biol.224:487);位置58の単一アスタリスクはFW-CDR相互作用を示す(Padlan (1994) Mol.Immunol.31:169)。hu8G8.VH1をコードする例示的な核酸配列も示す(配列番号:185)。 図9は、ヒト重鎖可変領域VH3 FW(配列番号:53)及びVH3 FWにおける8G8のヒト化重鎖可変領域(hu8G8.VH3)(配列番号:46)との、マウスmAb 8G8の重鎖可変領域(配列番号:50)のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。円はVL-VH相互作用を示す(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169);二重アスタリスク(一つの上に他)はVernier Positions(Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487)及びFW-CDR相互作用(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169)を示す。位置47、64、66、68の単一アスタリスクはVernier Positionsを示す(Foote and Winter (1992) J. Mol.Biol.224:487);位置58の単一アスタリスクはFW-CDR相互作用を示す(Padlan (1994) Mol.Immunol.31:169)。 図10は、λ4 FW領域(配列番号:55)の軽鎖可変領域及びKabat番号付けによるアミノ酸2及び36にアミノ酸変化が導入されたλ4 FWにおける8G8のヒト化軽鎖可変領域(λ4 8G8移植)(配列番号:49)とのマウスmAb 8G8 VLの軽鎖可変領域(配列番号:51)のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。円はVL-VH相互作用を示す(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169);二重アスタリスク(一つの上に他)はVernier Positions(Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487)及びFW-CDR相互作用(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169)を示す。位置47、64、66、68の単一アスタリスクはVernier Positionsを示す(Foote and Winter (1992) J. Mol.Biol.224:487);位置58の単一アスタリスクはFW-CDR相互作用を示す(Padlan (1994) Mol.Immunol.31:169)。λ4 8G8移植片をコードする例示的な核酸配列も示す(配列番号:186)。 図11は、mAb HB1とのヒト抗体MSL-109のアミノ酸配列アラインメントを示す。パネルA:親和性成熟HB1 VL(また配列番号:90(100%同一性))とのMSL-109 VL(配列番号:90)のアラインメント;及びパネルB:親和性成熟HB1 VH(配列番号:89)とのヒト抗体MSL-109 VH(配列番号:92)のアミノ酸配列アラインメント。アミノ酸をKabat番号付けに従って番号付けする。超可変領域(HVR)をボックスで囲む。 図12Aは、MSL-109(配列番号:91)及びIGHV3-21*01(配列番号:93)からのHVR-H2のアミノ酸配列、及びなされた様々なアミノ酸置換を示す。図12B及び図12Cは、変異HVR-H2領域を有する抗体を使用した２つの異なる中和アッセイの結果を示す。Fab(図12B)及びmAb(図12C)による中和アッセイを双方示す。IC50をnM単位において提供する。 図13は、上皮細胞及び線維芽細胞の感染を防止する能力について、λ4 8G8移植片及びhu8G8.VH1を有する抗体(以下「hu8G8」)及びHB1をHIGと比較した中和アッセイの結果を示す。 図14は、上皮細胞及び線維芽細胞において欠損高力価免疫グロブリン(HIG)を使用したウィルス中和アッセイの結果を示す。HIGは抗gB特異性抗体、抗複合体Ｉ特異性抗体、抗gH/gL抗体を欠くかコントロールとしてmock欠損である。 図15は、既知の抗gB、抗gH及び抗UL131抗体と比較したHB1及びhu8G8抗体の抗原特異性を決定するFACS分析の結果を示す。x軸におけるAPC強度は抗体結合を示す。y軸は、任意の強度での最大数の細胞のパーセンテージとして表される任意強度での細胞の割合をプロットする。 図16は、上皮細胞におけるHCMV感染を阻害するそれらの能力について、hu8G8及びHBが1:1比で混合され希釈系列において試験された中和アッセイの結果を示す。２つの抗体の組合せは相加効果を有し、Bliss independence equationに従ってふるまう(効果A及びBの２つの単一化合物の組合せ応答CはC = A + B −A * Bである)。 図17は、様々な濃度のHB1での様々な濃度のhu8G8又はhu8G8でのHB1の効力を決定する中和アッセイの結果を示す。 図18は、HB1耐性HCMVミュータントを用いた中和アッセイの結果を示す。パネルAは、HB1抗体を使用した中和アッセイの結果を示す。パネルBは、hu8G8抗体を使用した中和アッセイの結果を示す。HB1耐性HCMVミュータントは依然としてhu8G8による中和に感受性である。 図19は、hu8G8耐性HCMVミュータントを用いた中和アッセイの結果を示す。パネルAは、HB1抗体を使用した中和アッセイの結果を示す。パネルBは、hu8G8抗体を使用した中和アッセイの結果を示す。hu8G8耐性HCMVミュータントは依然としてHB1による中和に感受性である。 図20は、上皮及び線維芽細胞について様々なHB1耐性ウィルスミュータントと比較したHCMV株(WT)D1(VR1814は耐性株を生成する時並行して増殖)のウィルス侵入に関するデータを示す。 図21は、FACS分析でアッセイされた、gHに耐性付与点変異を有する細胞表面発現gH/gLに結合するHB1抗体の能力を示す。異なる抗gH抗体を細胞表面発現のポジティブコントロールとして使用した。x軸はGFP強度であり、HCMV糖タンパク質発現の指標である。y軸はAPCシグナルであり、抗体結合を示す。 図22は、FACS分析でアッセイされた、複合体Iに耐性付与点変異を有する細胞表面発現複合体Iに結合するhu8G8抗体の能力を示す。抗UL131抗体及び抗gH抗体を細胞表面発現のポジティブコントロールとして使用した。x軸はGFP強度であり、HCMV糖タンパク質発現の指標である。y軸はAPCシグナルであり、抗体結合を示す。 図23A及びBは、hu8G8及びHB1のそれらの抗原に対する結合親和性を決定するスキャッチャード分析の結果を示す。結果をMunson及びRodbardのフィッティングアルゴリズムを使用してプロットした。y軸は、全抗体に対する結合125I標識抗体の濃度の割合をプロットする。全抗体を125I標識及び非標識抗体の濃度として算出した。 図24は、UL131(SRA-Helix WT)のペプチド断片(配列番号：194のアミノ酸41(Ser)〜アミノ酸68(Ser))又はアミノ酸置換Q47Kを有する対応する断片(SRA-Helix Mut)へのhu8G8及びポジティブコントロール抗体(抗HIS)の結合を測定するELISAアッセイの結果を示す。
(発明の実施態様の詳細な説明)
Ｉ．定義
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下に定義するヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(ＶＨ)フレームワークのアミノ酸配列を含んでなる。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列変化を有してもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列において同一である。
「親和性」とは、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合相互作用の強さの合計を指す。明記なき限り、ここで使用される場合、「結合親和性」とは結合対(例えば抗体及び抗原)のメンバー間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般的に解離定数(Ｋｄ)によって表される。親和性は当分野で知られている一般的な方法によって測定可能であり、ここに記載されるものを含む。結合親和性を測定するための具体的な説明的、例示的実施態様を以下に記載する。
「親和性成熟」抗体とは、そのような変更を持たない親抗体と比較して一又は複数の超可変領域(ＨＶＲ)における一又は複数の変更を有する抗体を指し、そのような変更は抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。
「抗複合体Ｉ抗体」及び「複合体Ｉに結合する抗体」なる用語は、十分な親和性で複合体Ｉに結合可能な抗体を指し、抗体は、複合体Ｉを標的にすることにおいて診断及び／又は治療剤として有用である。一実施態様では、無関係な非複合体Ｉタンパク質への抗複合体Ｉ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)で測定される場合、複合体Ｉへの抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様では、複合体Ｉに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗複合体Ｉ抗体はヒトＣＭＶ分離株間で保存されている複合体Ｉのエピトープに結合する。ある実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は、異なる種に感染するＣＭＶ株間で保存されている複合体Ｉのエピトープに結合する。ある実施態様では、「抗複合体Ｉ抗体」は複合体Ｉのコンホメーションエピトープに結合し、ある実施態様では、抗複合体Ｉ抗体はｇＨではない(すなわち、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１)複合体Ｉの個々のタンパク質メンバー内のエピトープに結合する。
「抗ｇＨ抗体」及び「ｇＨに結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でｇＨに結合可能な抗体を指し、抗体は、ｇＨを標的にすることにおいて診断及び／又は治療剤として有用である。一実施態様では、無関係な非ｇＨタンパク質への抗ｇＨ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)で測定される場合、ｇＨへの抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様では、ｇＨに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ｇＨ抗体は、ヒトＣＭＶ分離株間で保存されているｇＨのエピトープに結合する。ある実施態様では、抗ｇＨ抗体は、異なる種に感染するＣＭＶ株間で保存されているｇＨのエピトープに結合する。
ここにおいて「抗体」なる用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の抗原結合活性を呈する限り抗体断片を含む。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、限定するものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ(ａｂ’)２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子(例えばｓｃＦｖ)；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する抗体を指し、逆に、競合アッセイにおいて参照抗体は抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する。例示的な競合アッセイがここに提供される。
「キメラ」抗体なる用語は、重及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」とは、重鎖が持つ定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に更に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「複合体Ｉ」なる用語は、ここで使用される場合、明記なき限り、霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳類に感染するＣＭＶを含む何れかのサイトメガロウイルス源からの何れかの天然複合体Ｉを指す。用語は、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１ポリペプチドの全ての組合せを包含する。用語はまた、複合体Ｉのタンパク質の天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なＨＣＭＶｇＨのアミノ酸配列を配列番号：１に示す。例示的なＨＣＭＶ ｇＬのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。例示的なＨＣＭＶ ＵＬ１２８のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。例示的なＨＣＭＶ ＵＬ１３０のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。例示的なＨＣＭＶ ＵＬ１３１のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。ＨＣＭＶｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１の更なる例示的配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＧＵ１７９２８９(Dargan et al., J. Gen.Virol.91:1535-1546 (2010))に見出され得、双方ともそれらの全体を出典明記によりここに援用し、配列番号：２０６(ｇＨ)、配列番号：２０８(ｇＬ)、配列番号：２０５(ＵＬ１２８)、配列番号：２０４(ＵＬ１３０)；及び配列番号：２０３(ＵＬ１３１)としてここに含まれる。
「複合体ＩＩ」なる用語は、ここで使用される場合、明記なき限り、霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳類に感染するＣＭＶを含む何れかのサイトメガロウイルス源からの何れかの天然複合体ＩＩを指す。用語は、ｇＨ、ｇＬ及びｇＯの全ての組合せを包含する。用語はまた、複合体ＩＩのタンパク質の天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なＨＣＭＶｇＨのアミノ酸配列を配列番号：１に示す。例示的なＨＣＭＶ ｇＬのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。例示的なＨＣＭＶ ｇＯのアミノ酸配列を配列番号：２０９に示す。ＨＣＭＶｇＨ、ｇＬ及びｇＯの更なる例示的配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＧＵ１７９２８９(Dargan et al., J. Gen.Virol.91:1535-1546 (2010))に見出され得、双方ともそれらの全体を出典明記によりここに援用し、配列番号：２０６(ｇＨ)、配列番号：２０８(ｇＬ)及び配列番号：２０７(ｇＯ)としてここに含まれる。
「ｇＨ」なる用語は、ここで使用される場合、明記しない限り、霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳類を含む何れかの脊椎動物供給源からの何れかの天然ｇＨを指す。用語は、「完全長の」非プロセスｇＨ並びに細胞におけるプロセシングから生じる何れかの形態のｇＨを包含する。用語はまた、ｇＨの天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。ｇＨのアミノ酸配列は、ＣＭＶ分離株間で約９５％同一である。例示的なＨＣＭＶｇＨのアミノ酸配列を配列番号：１に示す。ＨＣＭＶｇＨの更なる例示的配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＧＵ１７９２８９(Dargan et al., J. Gen.Virol.91:1535-1546 (2010))に見出され得、双方ともそれらの全体を出典明記によりここに援用し、配列番号：２０６(ｇＨ)としてここに含まれる。
「細胞傷害剤」なる用語は、ここで使用される場合、細胞機能を阻害又は防止する及び／又は細胞死又は破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤は、限定するものではないが放射性同位体(例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体)；化学療法物質又は薬物(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤)；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素(その断片及び／又は変異体を含む)；及び下に開示される様々な抗腫瘍又は抗癌剤を含む。
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプによって異なる抗体のＦｃ領域に起因しうるそれらの生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体(例えばＢ細胞受容体)の下方制御；及びＢ細胞活性化を含む。
「有効な量」の物質、例えば薬学的製剤とは、所望の治療又は予防結果を得るための必要な容量及び期間での有効な量を指す。
ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、定常領域の少なくとも一部を有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び可変Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に延在する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン(Ｌｙｓ４４７)は存在する場合とそうでない場合がありうる。明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵｉｎｄｅｘとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従い、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されている。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般的に４つのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から成る。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般的にＶＨ(又はＶＬ)において次の配列において出現する：ＦＲ１-Ｈ１(Ｌ１)-ＦＲ２-Ｈ２(Ｌ２)-ＦＲ３-Ｈ３(Ｌ３)-ＦＲ４。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を持ち、ここで定義されるＦｃ領域を有する重鎖を持つ抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」なる用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、一次形質転換細胞、及び継代の数に関わらずそれらに由来する子孫を含む。子孫は親細胞に対して核酸内容物において完全に同一でない場合があり、変異を含みうる。元の形質転換細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫はここに含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって生産されるか、又はヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用した非ヒト供給源から得られる抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を特異的に除く。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一実施態様では、ＶＬでは、サブグループはKabat et al., supraのサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨでは、サブグループはKabat et al., supraのサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含んでなるキメラ抗体を指す。ある実施態様では、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全て又は実質的に全てのＨＶＲ(例えばＣＤＲ)は非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は場合によっては、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、ここで使用される場合、配列において超可変である及び／又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、天然の４鎖抗体は６つのＨＶＲ；ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)に３つ、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)に３つを含む。ＨＶＲは一般的に超可変ループから及び／又は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)からアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性であるか及び／又は抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)、９１−９６(Ｌ３)、２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)、及び９６−１０１(Ｈ３)で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))。例示的なＣＤＲ(ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３)は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨにおけるＣＤＲを除き、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定領域」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、abbreviated-ＣＤＲ、又はａ-ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの残基内に含まれる。例示的なａ-ＣＤＲ(ａ-ＣＤＲ-Ｌ１、ａ-ＣＤＲ-Ｌ２、ａ-ＣＤＲ-Ｌ３、ａ-ＣＤＲ-Ｈ１、ａ-ＣＤＲ-Ｈ２、及びａ-ＣＤＲ-Ｈ３)は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Almagro and Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633 (2008)を参照)。明記しない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基及び他の残基(例えばＦＲ残基)は、ここではKabat et al., supraに従って番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」は、限定するものではないが細胞傷害剤を含む一又は複数の異種性分子にコンジュゲートされた抗体である。
「個体」又は「被験体」とは、哺乳類である。哺乳類は、限定するものではないが家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及び齧歯類(例えばマウス及びラット)を含む。ある実施態様では、個体又は被験体はヒトである。
「乳児」とは、ここで使用される場合、誕生から約一年以下の年齢の範囲の個体又は被験体を指し、０〜約１２ヶ月の乳児を含む。
「単離された」抗体は、それの天然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は９５％又は９９％超の純度に精製され、例えば電気泳動(例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ、等電点電気泳動(ＩＥＦ)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ)で決定される。抗体純度の評価の方法の総説として、例えばFlatman et al., J. Chromatogr.B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された」核酸は、それの天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を元々有した細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外に、又はそれの天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗複合体Ｉ抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重及び軽鎖(又はその断片)をコードする一又は複数の核酸分子を指し、単一ベクター又は異なるベクターにおけるこのような核酸分子を含み、このような核酸分子は宿主細胞における一又は複数の位置に存在する。
「抗ｇＨ抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重及び軽鎖(又はその断片)をコードする一又は複数の核酸分子を指し、単一ベクター又は異なるベクターにおけるこのような核酸分子を含み、このような核酸分子は宿主細胞における一又は複数の位置に存在する。
「モノクローナル抗体」なる用語は、ここで使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、ありうる可変抗体を除き同一であるか及び／又は同じエピトープに結合し、例えば自然に生じる変異又はモノクローナル抗体調製物の生産中に生じるものを含み、このような変異体は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比較して、モノクローナル抗体の各モノクローナル抗体調製物は抗原における単一決定基に向けられる。従って、「モノクローナル」なる修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を意味し、何れかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術によって作られ得、限定するのもではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン座の全部又は一部を有するトランスジェニック動物を利用する方法を含み、モノクローナル抗体を作成するためのこのような方法及び他の例示的な方法がここに記載されている。
「ネイキッド抗体」は、異種性部分(例えば細胞傷害部分)又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在しうる。
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合された２つの同一な軽鎖及び２つの同一な重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ-からＣ-末端へ、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＨ)、その後に３つの定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３)を有する。同様に、Ｎ-からＣ-末端へ、各軽鎖は可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＬ)、その後に定常軽(ＣＬ)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つのタイプの内一つに割り当てられうる。
「パッケージ挿入物」なる用語は、治療用製品の商用パッケージに習慣的に含まれている説明書を指すために使用され、適応症、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含む。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
「薬学的製剤」なる用語は、そのような形態においてそこに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にし、製剤が投与されるであろう被験体に容認し難いほど毒性である更なる成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な担体」とは、被験体に非毒性である活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないがバッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
ここで使用される場合、「治療（treatment）」（及び「治療（treat）」又は「治療（treating）」などのその文法的変異）とは、治療されている個体の自然の経過を変更する目的での臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理学の経過中に実施されうる。治療の所望される効果は、限定するものではないが、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の何れかの直接的又は間接的病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行の割合の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解予後改善を含む。幾つかの実施態様では、発明の組成物は、疾患の展開を遅延するため、又は疾患の進行を遅くするため、又は疾患の発生又は疾患症状の重症度を低下するために使用される。
「可変領域」又は「可変ドメイン」なる用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般的に類似した構造を有し、各ドメインは４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含んでなる。(例えばKindt et al.Kuby Immunology, 6th ed., W.H.Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一ＶＨ又はＶＬドメインが抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ相補ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体からＶＬ又はＶＨドメインを使用して単離されうる。例えばPortolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。
「ベクター」なる用語は、ここで使用される場合、それが連結される別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造のベクター並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。あるベクターは、作動的に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、ここでは「発現ベクター」と呼ばれる。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、発明は、一つには、ＨＣＭＶ感染の感染を中和するモノクローナル抗体の発見に基づく。ある実施態様では、複合体Ｉに結合する抗体が提供される。他の実施態様では、ｇＨに結合する抗体が提供される。発明の抗体は、例えば、ＨＣＭＶ感染、先天性ＨＣＭＶ感染、及びＨＣＭＶ感染移植組織を通した患者の感染の防止、阻害及び／又は治療に有用である。抗体はまた、ＨＣＭＶ感染の診断に使用されうる。
一態様では、発明はまた、一つには、胎盤の全細胞タイプ：内皮細胞、上皮細胞、単球／マクロファージ及び線維芽細胞へのＨＣＭＶウィルス侵入を阻害し、ＨＣＭＶ耐性株の形成を低減及び／又は抑制するモノクローナル抗体の組合せを含んでなる組成物の発見に基づく。ある実施態様では、これらの組成物の使用方法が提供される。発明の組成物は、例えば、ＨＣＭＶ感染、先天性ＨＣＭＶ感染、及び過去又は現在ＨＣＭＶに感染している患者から収集されたＨＣＭＶ感染移植臓器又は組織を通した患者の感染の防止、阻害及び／又は治療に有用である。組成物はまた、ＨＣＭＶ感染の診断に使用されうる。
Ａ．例示的な抗複合体Ｉ抗体
一態様では、発明は、複合体Ｉに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は、ｇＨ／ｇＬとのＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１の会合から生じるコンホメーションエピトープに、又は複合体Ｉの個々のメンバー内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は、０．７μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０でＨＣＭＶを中和する。他の態様では、抗複合体Ｉ抗体はＨＣＶＭの表面上の複合体Ｉに特異的に結合し、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．０１３μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ、０．００９μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００７μｇ／ｍｌ、０．００６μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００４μｇ／ｍｌ、０．００３μｇ／ｍｌ、０．００２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０００９μｇ／ｍｌ、０．０００８μｇ／ｍｌ、０．０００７μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で(例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下の抗体濃度で)５０％のＨＣＭＶを中和する。
一態様では、発明は、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：１０−１９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含んでなる抗複合体Ｉ抗体を提供する。
一態様では、発明は、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。
他の態様では、発明は、(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１０−１９から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。
一実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
他の実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、全ての、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される３つのＶＨＨＶＲ配列、及び(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：２１のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域フレームワークＦＲ３の第一アミノ酸及びＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される３つのＶＬＨＶＲ配列を含む。ある実施態様では、上に提供される抗複合体Ｉ抗体の何れか一又は複数のアミノ酸は、次のＨＶＲ位置で置換される：ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：１０)において：位置４、５、１１、及び１２。ある実施態様では、置換はここに提供されるように保存的置換である。ある実施態様では、何れか一又は複数の次の置換が、任意の組合せにおいてなされうる：ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：５７)において：Ｄ４Ｅ、Ｄ４Ｔ、Ｄ４Ｓ、Ｇ５Ａ、Ｄ１１Ｅ、Ｄ１１Ｔ、Ｄ１１Ｓ、及びＧ１２Ａ。上記置換の全ての可能な組合せが、配列番号：２１のコンセンサス配列に包含される。
任意の上記実施態様において、抗複合体Ｉ抗体はヒト化である。一実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：２２のＦＲ１配列、配列番号：２３のＦＲ２配列、配列番号：２４のＦＲ３配列、及び配列番号：２５のＦＲ４配列を含んでなるＶＨを含む。他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：２２のＦＲ１配列、配列番号：２７のＦＲ２配列、配列番号：２８のＦＲ３配列、及び配列番号：２９のＦＲ４配列を含んでなるＶＨを含む。他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：３０のＦＲ１配列、配列番号：３１のＦＲ２配列、配列番号：３２のＦＲ３配列、及び配列番号：２５のＦＲ４配列を含んでなるＶＨを含む。他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：３３のＦＲ１配列、配列番号：２３のＦＲ２配列、配列番号：３４のＦＲ３配列、及び配列番号：２５のＦＲ４配列を含んでなるＶＨを含む。
他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：３５のＦＲ１配列、配列番号：３６のＦＲ２配列、配列番号：３７のＦＲ３配列、及び配列番号：３８のＦＲ４配列を含んでなるＶＬを含む。他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：３９のＦＲ１配列、配列番号：４０のＦＲ２配列、配列番号：４１のＦＲ３配列、及び配列番号：４２のＦＲ４配列を含んでなるＶＬを含む。他の実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：４３のＦＲ１配列、配列番号：４４のＦＲ２配列、配列番号：４１のＦＲ３配列、及び配列番号：４２のＦＲ４配列を含んでなるＶＬを含む。
任意の上記抗体において、ＶＬＦＲ３配列は、配列番号：６７又は配列番号：６８から選択される一つと置換されうる。
他の態様では、抗複合体Ｉ抗体は、配列番号：４６又は配列番号：４７のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗複合体Ｉ抗体は複合体Ｉに結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：４５、又は配列番号：４６、又は配列番号：４７において、合計で１〜１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外の領域において生じる(例えばＦＲにおいて)。特定の実施態様では、ＶＨは、(ａ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１、(ｂ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
他の態様では、抗体が配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む、抗複合体Ｉ抗体が提供される。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗複合体Ｉ抗体は複合体Ｉに結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：４８又は配列番号：４９において、合計で１〜１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外の領域において生じる(例えばＦＲにおいて)。特定の実施態様では、ＶＬは、(ａ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１０−１９から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
他の態様では、抗体が、上記の何れかの実施態様にあるようなＶＨ、及び上記の何れかの実施態様にあるようなをＶＬ含む、抗複合体Ｉ抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：４５及び配列番号：４９においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号：４６及び配列番号：４９においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。他の実施態様では、抗体は、配列番号：４７及び配列番号：４９においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。他の実施態様では、抗体は、配列番号：４５及び配列番号：４８においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。他の実施態様では、抗体は、配列番号：４６及び配列番号：４８においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。他の実施態様では、抗体は、配列番号：４７及び配列番号：４８においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
更なる態様では、発明は、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体と競合する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様では、配列番号：４５−４７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ及び配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含んでなる抗複合体Ｉ抗体と競合する及び／又は同じエピトープに結合する抗体が提供される。
更なる態様では、発明は、配列番号：２０３のアミノ酸位置４７のグルタミン、配列番号：２０３のアミノ酸位置５１のリシン；配列番号：２０３のアミノ酸位置４６のアスパラギン酸及びその組合せから選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸を含んでなる抗複合体Ｉ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。エピトープを含む対応するアミノ酸は、ＵＬ１３１アミノ酸配列におけるおよそ同じ位置でありうるが、様々なＨＣＭＶ株間のＵＬ１３１におけるアミノ酸配列の差異により異なりうる。
更なる態様では、発明は、ＨＣＭＶ複合体Ｉのポリペプチドに結合する抗体であって、該ポリペプチドがアミノ酸配列ＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫ ＹＶＥＱＬＶＤＬＴＬＮＹＨＹＤＡＳ(配列番号：１９４)を含む抗体を提供する。
更なる態様では、発明は、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。更なる態様では、発明は、０．７μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０でここに提供される抗複合体Ｉ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。他の態様では、発明は、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体と同じエピトープに結合し、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．０１３μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ、０．００９μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００７μｇ／ｍｌ、０．００６μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００４μｇ／ｍｌ、０．００３μｇ／ｍｌ、０．００２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０００９μｇ／ｍｌ、０．０００８μｇ／ｍｌ、０．０００７μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度(例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下の抗体濃度)で５０％のＨＣＭＶを中和する抗体を提供する。
発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗複合体Ｉ抗体はモノクローナル抗体であり、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む。一実施態様では、抗複合体Ｉ抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ(ａｂ’)２断片である。他の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここで定義される他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗複合体Ｉ抗体は、下記のセクション１−７に記載するように何れかの特性を単独で又は組合せにおいて組み入れうる。
Ｂ．例示的な抗ｇＨ抗体
一態様では、発明は、ｇＨに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様では、抗ｇＨ抗体はｇＨのエピトープに特異的に結合し、０．８μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０１５、０．０１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０のＥＣ９０でＨＣＭＶを中和する。幾つかの実施態様では、抗ｇＨ抗体は、０．０１〜０．１７ｎＭの範囲におけるＩＣ５０でバキュロウイルスにおいて生産されるｇＨ／ｇＬ二量体のエピトープに特異的に結合する。様々な実施態様では、ＩＣ５０は０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．１ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１６ｎＭ、又は０．１７ｎＭでありうる。
他の実施態様では、抗体はＨＣＭＶの表面上のｇＨに結合し、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．０１３μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ、０．００９μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００７μｇ／ｍｌ、０．００６μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００４μｇ／ｍｌ、０．００３μｇ／ｍｌ、０．００２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で(例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下の抗体濃度で)５０％のＨＣＭＶを中和する。
一態様では、発明は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７２、７３又は７４から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：７８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含んでなる抗ｇＨ抗体を提供する。
一実施態様では、発明は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨ ＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。他の実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨ ＨＶＲ配列を含む。他の実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨ ＨＶＲ配列を含む。
他の態様では、発明は、(ａ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：７８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬ ＨＶＲ配列、及び配列番号：７２、配列番号：７３、又は配列番号：７４から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる抗体を提供する。
他の態様では、発明は、(ａ)(ｉ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１、(ｉｉ)配列番号：７２、配列番号：７３、又は配列番号：７４から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２、及び(ｉｉｉ)配列番号：７５から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨ ＨＶＲ配列を含んでなるＶＨドメイン；及び(ｂ)(ｉ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１、(ｉｉ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：７８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬ ＨＶＲ配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる抗体を提供する。
他の態様では、発明は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：７８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる抗体を提供する。
他の態様では、発明は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：７８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる抗体を提供する。
他の態様では、発明は、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：７８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる抗体を提供する。
ある実施態様では、上に提供される抗ｇＨ抗体の何れか一又は複数のアミノ酸は、次のＨＶＲ位置で置換される：ＨＶＲ-Ｈ２(配列番号：９１)において：位置６及び８。ある実施態様では、置換はここに提供されるように保存的置換である。ある実施態様では、何れか一又は複数の次の置換が、任意の組合せにおいてなされうる：ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：９１)において：Ｄ６Ｓ、Ｄ６Ｔ、Ｄ６Ｎ、Ｄ６Ｑ、Ｄ６Ｆ、Ｄ６Ｍ、Ｄ６Ｌ、及びＴ８Ｒ。上記置換の全ての可能な組合せが、配列番号：９３のコンセンサス配列に包含される。
任意の上記実施態様において、抗ｇＨ抗体はヒト化である。一実施態様では、抗ｇＨ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。他の実施態様では、抗ｇＨ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：７９のＦＲ１配列、配列番号：８０のＦＲ２配列、配列番号：８１のＦＲ３配列、及び配列番号：８２のＦＲ４配列を含んでなるＶＨを含む。他の実施態様では、抗ｇＨ抗体は上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に配列番号：８３のＦＲ１配列、配列番号：８４のＦＲ２配列、配列番号：８５のＦＲ３配列、及び配列番号：８６のＦＲ４配列を含んでなるＶＬを含む。
他の態様では、発明の抗ｇＨ抗体は、配列番号：９２のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含むが、位置５４のアミノ酸はＡｓｎ(Ｎ)及び／又は位置５６のアミノ酸はＡｓｎ(Ｒ)である。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ｇＨ抗体はｇＨに結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：９２において合計で１〜１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されているが、位置５４のアミノ酸はＡｓｎ(Ｎ)及び／又は位置５６のアミノ酸はＡｓｎ(Ｒ)である。ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外の領域において生じる(例えばＦＲにおいて)。場合によっては、抗ｇＨ抗体は、配列番号：８７、配列番号：８８又は配列番号：８９においてＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１、(ｂ)配列番号：７２、配列番号：７３及び配列番号：７４から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
他の態様では、発明の抗ｇＨ抗体は、配列番号：９０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ｇＨ抗体はｇＨに結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：９０において、合計で１〜１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲの外の領域において生じる(例えばＦＲにおいて)。場合によっては、抗ｇＨ抗体は配列番号：９０においてＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、(ａ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：７８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
他の態様では、発明の抗ｇＨ抗体は、上記の何れかの実施態様にあるようなＶＨ、及び上記の何れかの実施態様にあるようなをＶＬ含む。一実施態様では、抗体は、配列番号：８７及び配列番号：９０においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
他の実施態様では、抗体は、配列番号：８８及び配列番号：９０においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
他の実施態様では、抗体は、配列番号：８９及び配列番号：９０においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
更なる態様では、発明は、ここに提供される抗ｇＨ抗体と競合する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様では、配列番号：８７、８８又は８９のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ及び配列番号：９０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含んでなる抗ｇＨ抗体と競合する及び／又は同じエピトープに結合する抗体が提供される。
更なる態様では、発明は、配列番号：１のアミノ酸位置１６８のトリプトファン、配列番号：１のアミノ酸位置４４６のアスパラギン酸；配列番号：１のアミノ酸位置１７１のプロリン及びその組合せから選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸を含んでなる抗ｇＨ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。エピトープを含む対応するアミノ酸は、ｇＨアミノ酸配列におけるおよそ同じ位置でありうるが、様々なＨＣＭＶ株間のｇＨにおけるアミノ酸配列の差異により異なりうる。
更なる態様では、発明は、０．０１〜０．１７ｎＭの範囲のＩＣ５０でここに提供される抗ｇＨ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。様々な実施態様では、ＩＣ５０は、０．１７ｎＭ以下(例えば、０．１６ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．１０ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ以下でありうる。例えば、ある実施態様では、ＨＢ１(配列番号：８９のＶＨ配列及び配列番号：９０のＶＬ配列を含んでなる抗ｇＨ抗体)と同じエピトープに結合し、０．１７ｎＭ以下(例えば０．１６ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．１０ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ以下)のＩＣ５０を有するか、又は０．８μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０１５、０．０１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０でＨＣＭＶ相互作用を中和する抗体が提供される。
他の態様では、発明は、ここに提供される抗ｇＨ抗体と同じエピトープに結合し、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．０１３μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、０．０１１μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌ、０．００９μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００７μｇ／ｍｌ、０．００６μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００４μｇ／ｍｌ、０．００３μｇ／ｍｌ、０．００２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で(例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下の抗体濃度で)５０％のＨＣＭＶを中和する抗体が提供される。
発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗ｇＨ抗体はモノクローナル抗体であり、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む。一実施態様では、抗ｇＨ抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ(ａｂ’)２断片である。他の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここで定義される他の抗体クラス又はアイソタイプである。
更なる態様では、上記実施態様による抗ｇＨ抗体は、下記のセクション１−７に記載するように何れかの特性を単独で又は組合せにおいて組み入れうる。
１．抗体親和性
ある実施態様では、発明の抗体は、ここで提供する場合、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。
一実施態様では、Ｋｄは、次のアッセイによって記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)標識抗原でＦａｂを均衡にし、ついで抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで結合抗原を捕獲することによって測定する(例えばChen等, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイ条件を確率するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)中の捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)で一晩被覆し、その後ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミンで室温(およそ２３℃)で２から５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した対象のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, Cancer Res. 57: 4593-4599(1997)における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでより長い時間(例えば約６５時間)継続する場合がある。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。ついで、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０(登録商標))で８回洗浄した。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγカウンター(Packard)で１０分間計数する。最大結合の２０％か又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択して競合結合測定に用いる。
他の実施態様によれば、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップで２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈した後、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定では、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０ＴＭ)界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen等, J. Mol Biol 293:865-881(1999)を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイにより結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、ストップフロー具備分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、バンドパス＝１６ｎｍ)の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
２．抗体断片
ある実施態様では、ここに提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載の他の断片を含む。所定の抗体断片の概説については、Hudson等 Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えばPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号を参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含みインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまたHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。
抗体断片は、限定しないが、ここに記載されるようにインタクトな抗体のタンパク質消化並びに組換え宿主細胞(例えば大腸菌又はファージ)による生産を含む様々な技術によって作製されうる。
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はキメラ抗体である。あるキメラ抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, PNAS USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサル由来の可変領域)とヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体はクラス又はサブクラスが親抗体のものとは変化せられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体はその抗原結合断片を含む。
ある種の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ(又はその一部)が非ヒト抗体由来であり、ＦＲ(又はその一部)がヒト抗体配列由来である一又は複数の可変ドメインを含む。場合によっては、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、非ヒト抗体(例えば、ＨＶＲ残基が誘導される抗体)からの対応する残基で置換され、例えば抗体特異性又は親和性が回復又は改善される。
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えばAlmagro 及び Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に概説されており、更に例えば、Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等, PNAS USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同７５２７７９１号、同６９８２３２１号、及び同７０８７４０９号；Kashmiri等, Methods 36:25-34 (2005)(ＳＤＲ(ａ-ＣＤＲ)グラフトを記載)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(「リサーフェシング(resurfacing)」を記載)；Dall'Acqua等, Methods 36:43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記載)；及びOsbourn等, Methods 36:61-68 (2005) 及び Klimka等, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(ＦＲシャッフリングに対する「案内選別(guided selection)」アプローチ法を記載)に記載されている。
ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域には、限定されるものではないが、「ベストフィット法」を使用して選択されるフレームワーク領域(例えば、Sims等 J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照)；軽鎖又は重鎖可変ドメインの特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域(例えば、Carter等 PNAS USA, 89:4285 (1992)；及び Presta等 J. Immunol., 151:2623 (1993))；ヒト成熟(体細胞的に変異された)フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照)；及びＦＲライブラリーのスクリーニング由来のフレームワーク領域(例えば、Baca等, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 及び Rosok等, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)が含まれる。
４．ヒト抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して産生せしめることができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に反応してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫源を投与することによって調製することができる。このような動物は、ヒト免疫グロブリン座位の全て又は一部を典型的には含み、内在性免疫グロブリン座位を置き換えるか、又は染色体外、又は動物の染色体内にランダムに組み込まれて存在する。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン座位は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説は、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照のこと。また、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ(登録商標)技術を記載した米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許第７０４１８７０号；ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号を参照。このような動物により産生されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組合せることにより、更に修飾することができる。
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner等, J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体は、Li等, PNAS. USA, 103:3557-3562 (2006)にまた記載されている。付加的な方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載)、及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載)に記載されている。また、ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers 及びBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及び Vollmers及びBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより産生せしめることもできる。ついで、このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組合せられうる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
５．ライブラリー由来抗体
本発明の組成物中における抗体は、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体について、そのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。このような方法は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)において概説され、更に例えばMcCafferty等, Nature 348:552-554；Clackson等, Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及びBradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えられ、これがついで、Winter等, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、抗原-結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片又はＦａｂ断片として、抗体断片をディスプレイする。免疫化されたソースからのライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性の抗体が提供される。あるいは、天然レパートリーを、Griffiths等, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されているように、免疫化をすることなく、広範囲の非自己、更には自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供するために(例えばヒトから)クローニングすることができる。最後に、ナイーブライブラリーは、幹細胞から再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することで合成的に作製することができ、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されているような、再配置をインビトロで達成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許文献には、例えば米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願第２００５／００７９５７４号、同２００５／０１１９４５５号、同２００５／０２６６０００号、同２００７／０１１７１２６号、同２００７／０１６０５９８号、同２００７／０２３７７６４号、同２００７／０２９２９３６号、及び同２００９／０００２３６０号が含まれる。
ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体又は抗体断片は、ここでのヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
６．多重特異性抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、結合特異性の一つは複合体Ｉ又はｇＨに対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。ある実施態様では、結合特異性の一つは複合体Ｉに対してであり、他方はｇＨに対してである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、複合体Ｉ又はｇＨの二つの異なるエピトープに結合しうる。また二重特異性抗体は細胞表面上に複合体Ｉ又はｇＨを有する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されるものではないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現(Milstein及びCuello, Nature 305: 537 (1983)を参照)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J. 10: 3655 (1991))、及び「ノブ-イン-ホール」技術(例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照)が含まれる。また、多重特異性抗体は、抗体ヘテロ二量体分子を作製するための静電気操縦効果の設計(国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号)；２又はそれ以上の抗体又は断片の架橋(例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan等, Science, 229: 81 (1985)を参照)；二重特性抗体の産生のためのロイシンジッパーの使用(例えば、Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用(例えば、Hollinger等, PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；及び単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用(例えば、Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)；及びTutt等 J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているような三重特異性抗体の調製により、作製することができる。
「オクトパス抗体」を含む３又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もここに含まれる(例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照)。
また、ここでの抗体又は断片は、複合体Ｉ又はｇＨ並びに他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む(例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照)。
７．抗体変異体
ある実施態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合性を有している限り、欠失、挿入、及び置換をどのように組合せて、最終コンストラクトに到達してもよい。
ａ)置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のために関心ある部位はＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「保存的置換」と題して表１に示す。より実質的な変化は「例示的置換」との項目で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを基準にして以下に更に記載される。アミノ酸置換は関心ある抗体に導入され得、生成物が所望の活性、例えば保持された／改善された抗原結合性、低減した免疫原性、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣについて、スクリーニングされる。
Figure 2014501491
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(２)中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
(６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。
一タイプの置換変異体は、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般的に、更なる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体に対して所定の生物学的性質(例えば親和性の増加、免疫原性の減少)に修飾(例えば改善)を有するか、及び／又は親抗体の実質的に保持された所定の生物学的性質を有しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えばここに記載されたもののようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便に産生せしめることができる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージにディスプレイさせ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
改変(例えば置換)は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされうる。このような改変はＨＶＲ「ホットスポット」、つまり体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び／又はＳＤＲｓ(ａ−ＣＤＲｓ)においてなされる場合があり、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそれから再選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、様々な方法(例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発)の何れかによって成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。ついで、二次抗体が作製される。ついで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異体が同定される。多様性を導入する他の方法は、幾つかのＨＶＲ残基(例えば一度に４−６残基)が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基が、例えばアラニンスキャン突然変異誘発又はモデリングを使用して、特に同定されうる。特にＣＤＲ-Ｈ３及びＣＤＲ-Ｌ３がしばしば標的とされる。
ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的改変(例えばここで提供される保存的置換)をＨＶＲにおいてなすことができる。そのような改変はＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側でありうる。上に提供された変異ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様では、何れかの各ＨＶＲが改変されず、又は一、二又は三のアミノ酸置換を含む。
突然変異誘発の標的とされうる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science 244:1081-1085 (1989)によって記載されている「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」と呼ばれる。この方法において、残基又は標的残基の群(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基)が同定され、中性の又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、抗体の抗原との相互作用に影響があるかどうかが決定される。最初の置換に対して機能的感受性を示しているアミノ酸位置に更なる置換を導入することができる。あるいは、又は付加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造が抗体と抗原間の接触点を同定する。そのような接触残基及び近傍の残基は置換のための候補として標的にされるか又は削除されうる。変異体は、それらが所望の性質を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端の融合を含む。
ｂ)グリコシル化変異体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、一又は複数のグリコシル化部位が作られ又は除去されるように改変させることによって、簡便に達成されうる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合される炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対してＮ結合により一般的に結合する分枝状で二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、ガラクトース、及びシアル酸を含み得、並びにフコースが二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合される。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、なされうる。
一実施態様では、Ｆｃ領域に(直接又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％でありうる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法によって測定して、Ａｓｎ２９７(例えば複合のハイブリッド及び高マンノース構造)に結合した全ての糖構造の合計に対してＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７はＦｃ領域内の約２９７位(Ｆｃ領域のＥｕ番号付け)に位置したアスパラギン残基を意味する；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中のマイナーな配列変異のために、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、つまり２９４位と３００位の間に位置している場合がありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。「脱フコシル化された」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産可能な細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠けているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞(Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号, Adams等，特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)が含まれる。
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化が低減され、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている場合がある。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairet等)；米国特許第６６０２６８４号(Umana等)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana等)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号(Patel等)；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
ｃ)Ｆｃ領域変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体を産生せしめてもよい。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含んでなるヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域)を含みうる。
ある実施態様では、本発明は、幾つかであるが全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異体を考察し、これは、抗体を、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、あるエフェクター機能(例えば、補体及びＡＤＣＣ)は不要か又は有害である用途のために望ましい候補とする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイが実施されうる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く(よってＡＤＣＣ活性を欠くと思われる)が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確かめるために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するための非限定的なインビトロアッセイが米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及びHellstrom, I等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；５８２１３３７(Bruggemann, M.等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。別法では、非放射性アッセイ法が用いられ得る(例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されているような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。Ｃｌｑ結合アッセイが、抗体がＣｌｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにまた実施されうる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期定量も当該技術分野で知られている方法を使用して実施することがまたできる(例えば、Petkova, S.B.等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
減少したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものを含む(米国特許第６７３７０５６号)。このようなＦｃ変異体は、二又はそれ以上のアミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７に置換を有するＦｃ変異体を含み、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む(米国特許第７３３２５８１号)。
ＦｃＲへの改良又は減少された結合を有するある種の抗体変異体が記載されている(例えば米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。
ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換(残基のＥＵ番号付け)を有するＦｃ領域を含む。
幾つかの実施態様では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているように、改変された(つまり、改善され又は減少した)Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を生じる改変がＦｃ領域に改変がなされる。
増加した半減期及び胎児への母性ＩｇＧｓの移動に関与する新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合性を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１(Hinton等)に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換をそこに有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数での置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む(米国特許第７３７１８２６号)。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様では、システイン操作抗体、例えば抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換される「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作ることが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置させられ、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー薬剤部分に結合させ、ここで更に記載されるように免疫コンジュゲートを作るために使用されうる。ある実施態様では、以下の残基の任意の一又は複数がシステインと置換されうる：軽鎖のＶ２０５(カバット番号付け)；重鎖のＡ１１８(ＥＵ番号付け)；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００(ＥＵ番号付け)。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるようにして、産生されうる。
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、当該技術分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか等を含む、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。
Ｃ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え法及び構成物を使用して製造することができる。一実施態様では、ここに記載の抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体をコードする単離核酸が提供される。このような核酸は、ＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列(例えば、抗体の軽及び／重鎖)をコードしてもよい。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(１)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクター、又は(２)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第一ベクター、及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第２ベクターを含む(例えば、これらによって形質転換される)。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はリンパ球系細胞(例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。一実施態様では、抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体の作製方法が提供され、該方法は、上に提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で、培養し、場合によっては宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体の組換え生産では、例えば上述のような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、直ちに単離され、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定されうる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のために適した宿主細胞は、ここに記載される原核細胞又は真核細胞である。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で生産されうる。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号、及び米国特許第５８４０５２３号を参照のこと。(また大腸菌中での抗体断片の発現を記述しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製されうる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」された菌及び酵母株を含み、部分的に又は完全にヒト化したグリコシル化パターンを持つ抗体の生産を生じる。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004),及びLi等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からもまた誘導される。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫の細胞を含む。特にヨウトガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用されうる多くのバキュロウィルス株が同定されている。
植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号(遺伝子導入植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記述)を参照。
脊椎動物細胞をまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態で増殖するよう適合化された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物細胞株の他の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７)によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株(Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞)；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ)；マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞)；サル腎細胞(ＣＶ１)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８)；ヒト肝細胞(ＨｅｐＧ２)；マウス乳腺腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２)；Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等のミエローマ細胞株である。抗体生産のために適した哺乳類動物宿主細胞株の概説として、例えばYazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp255-268 (2003)を参照のこと。
Ｄ．アッセイ
ここに提供される抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体は、当分野で知られている様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、発明の抗体は、知られている方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等によってその抗原結合活性について試験される。
他の態様では、複合体Ｉの結合についてここに記載の抗複合体Ｉ抗体と競合する抗体を同定するために競合アッセイが使用されうる。
他の態様では、ｇＨの結合についてここに記載の抗ｇＨ抗体と競合する抗体を同定するために競合アッセイが使用されうる。
ある実施態様では、このような競合抗体は、ｇＨ又は複合体Ｉの同じエピトープに結合する(例えば、直線状又はコンホメーションエピトープ)。
抗体が結合するエピトープをマッピングする詳細な例示的方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
例示的な競合アッセイでは、固定された複合体Ｉ又はｇＨが、それぞれ複合体Ｉ又はｇＨに結合する第一標識抗体、及び複合体Ｉ又はｇＨへの結合について第一抗体と競合するその能力について試験されている第二非標識抗体を含んでなる溶液中においてインキュベートされる。第二抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定された複合体Ｉ又はｇＨが、第一標識抗体を含むが第二非標識抗体を含まない溶液中においてインキュベートされる。複合体Ｉ又はｇＨへの第一抗体の結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が除去され、固定された複合体Ｉ又はｇＨに付随するラベルの量が測定される。固定された複合体Ｉ又はｇＨに付随するラベルの量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプルにおいて有意に低減された場合、これは、複合体Ｉ又はｇＨへの結合について第二抗体が第一抗体と競合していることを意味する。Harlow and Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
競合アッセイはまた、ｇＨ及び／又は複合体Ｉ又は複合体ＩＩの他のメンバーでトランスフェクトされ細胞表面上に発現された細胞を使用してＦＡＣＳにより上記の方法において実施されてもよい。加えて、ｇＨ及び／又は再構成複合体Ｉ又は複合体ＩＩを用いたＥＬＩＳＡも、競合アッセイにおいて使用できる。抗ｇＨ及び抗複合体Ｉ抗体を測定するためのＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡの使用は、実施例に更に記載される。
２．活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物学的活性を有するその抗複合体Ｉ抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、０．７μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０でＨＣＭＶを中和するＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１及びｇＨ／ｇＬの会合から生じるコンホメーションエピトープへの特異的結合、又は複合体Ｉの単一タンパク質内のエピトープへの特異的結合を含みうる。幾つかの実施態様では、ＥＣ９０は０．５μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．３μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．１μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０８μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０６μｇ／ｍｌ以下である。さらに他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０４μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０２μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０１５μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０１２μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０１１μｇ／ｍｌ以下である。他の実施態様では、ＥＣ９０は０．０１０μｇ／ｍｌ以下である。このような生物学的活性を有する抗体を含んでなる組成物も提供される。
一態様では、アッセイは、生物学的活性を有するその抗ｇＨ抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、１μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ以下のＥＣ９０のＥＣ９０でのＨＣＭＶの中和を含みうる。
発明の組成物における抗ｇＨ抗体は、０．１７ｎＭ以下(例えば、０．１６ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．１０ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ以下のＩＣ５０でバキュロウイルスにおいて発現されるｇＨ／ｇＬ二量体に結合する。インビボ及び／又はインビトロにおいてこのような生物学的活性を有する抗体を含んでなる組成物も提供される。
ある実施態様では、発明の抗体はこのような生物学的活性について試験される。このようなアッセイの例示的な説明について実施例３を参照のこと。
Ｅ．イムノコンジュゲート
発明はまた、一又は複数の細胞傷害性物質、例えば化学療法物質又は薬物、増殖阻害物質、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的活性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体にコンジュゲートされたここの抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体を含んでなるイムノコンジュゲートを含んでなる組成物を提供する。
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定しないが、メイタンシノイド(米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照)；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ(ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ)(米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号及び同第７４９８２９８号を参照)；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体(米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号、及び同第５８７７２９６号；Hinman等, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode等, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照)；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン(Kratz等, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照)；メトトレキセート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテシン及びＣＣ１０６５を含む一又は複数の薬物に抗体がコンジュゲートされる抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)である。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定しないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされたここに記載された抗体を含む。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされるここに記載の抗体を含む。様々な放射性同位元素が放射性コンジュゲートの生産のために利用可能である。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)イメージング(磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばまたヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
ここでのイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定するものではないが、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)安息香酸塩)を含む架橋剤を用いて調製されるコンジュゲートが明示的に考えられる。
Ｆ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様では、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体、又はかかる抗体を含んでなる組成物の何れかは、生物学的サンプルにおける複合体Ｉ及び／又はｇＨの存在を検出するために有用である。「検出」なる用語は、ここで使用される場合、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様では、生物学的サンプルは、細胞又は組織、例えば胎盤、腎臓、心臓、肺、肝臓、膵臓、腸、胸腺、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、及び静脈を含む。更に、抗体を含んでなる組成物は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞及びマクロファージにおけるＨＣＭＶを検出するために使用されうる。
一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体が提供される。更なる態様では、生物学的サンプルにおける複合体Ｉ及び／又はｇＨの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様では、方法は、ここに記載のように生物学的サンプルを抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体と、複合体Ｉへの抗複合体Ｉ抗体の結合及び／又はｇＨへの抗ｇＨ抗体の結合を可能にする条件下で接触させること、及び複合体が抗複合体Ｉ抗体及び複合体Ｉ及び／又は抗ｇＨ抗体及びｇＨ間で形成されるか検出することを含む。このような方法は、インビトロ又はインビボ方法でありうる。一実施態様では、抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体の組合せは、例えば複合体Ｉ及びｇＨが患者の選択のためのバイオマーカーである場合など、抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体の組合せを用いた治療に適格である被験体を選択するために使用される。
発明の組成物を使用して診断されうる例示的な障害は、ＨＣＭＶ感染、例えば移植臓器又は組織からのＨＣＭＶ感染、先天性ＨＣＭＶ感染、妊娠中のＨＣＭＶ感染、及び小児、乳児及び成人におけるＨＣＭＶ感染を含む。
ある実施態様では、標識抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物が提供される。標識には、限定するものではないが、直接検出される標識又は分子(例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される酵素ないしはリガンドなどの分子が含まれる。例示的な標識には、限定するものではないが、放射性同位体である３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希有土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環のオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために水素ペルオキシダーゼを用いる酵素とカップリングさせたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離基などが含まれる。
Ｇ．薬学的製剤
ここに記載された抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体の組合せの薬学的製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、一又は複数の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol,A.編(1980))と所望の度合いの純度を有する抗体を混合することにより調製される。ここに記載されるように、抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体は、単一の組合せられた薬学的製剤に、又は別々の薬学的製剤に製剤化されうる。薬学的に許容される担体は用いられる用量及び濃度でレシピエントに一般に非毒性であり、限定しないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体(例えばＺｎ-タンパク質錯体)；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ここでの例示的な薬学的に許容可能な担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(ｓＨＡＳＥＧＰ)、例えばヒト可溶性ＰＨ-２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)のような間質薬剤分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むある種の例示的ｓＨＡＳＥＧＰｓ及び使用方法は米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは一又は複数のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は米国特許第６２６７９５８号に記載される。水性抗体製剤は米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されたものを含み、後者の製剤はヒスチジン-アセテートバッファーを含む。
また、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体に加えて、ここでの製剤は治療される特定の適応症に必要な活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含みうる。例えば、ガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビルを更に提供することが所望されうる。このような活性成分は意図される目的のために有効である量で組合わせて適切に存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過により、直ぐに達成されうる。
Ｈ．治療方法及び組成物
ここに提供される抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる何れかの組成物は、治療方法において使用されうる。
一態様では、医薬としての使用のための抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物が提供される。更なる態様では、ＨＣＶＭ感染の治療における使用のための抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物が提供される。ある実施態様では、治療の方法における使用のための抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物が提供される。ある実施態様では、発明は、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる有効量の組成物を個体に投与することを含んでなる、ＨＣＭＶ感染を有する個体を治療する方法における使用のための抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物を提供する。他の実施態様では、発明は、先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された組織、臓器又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある組織又は臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を防止、阻害又は治療する方法における使用のための組成物を提供する。一つのこのような実施態様では、組織又は臓器移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。更なる実施態様では、移植レシピエント又は個体は過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、ＨＣＭＶの再活性化及び感染のリスクにある。ある実施態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを個体又は移植レシピエントに投与することを更に含む。他の実施態様では、発明はまた、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を乳児に投与することを含んでなる、ＨＣＭＶ感染乳児、又は妊娠期間中にＨＣＭＶに曝された乳児の方法又は治療における使用のための、抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物を提供する。更なる実施態様では、発明は、感染のリスクがある個体におけるＨＣＭＶ感染の治療、阻害又は防止における使用のための、抗複合体Ｉ抗体又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様では、発明は、医薬の製造又は調製における抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体又は抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる組成物の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、ＨＣＭＶ感染の治療、防止又は阻害のためである。更なる実施態様では、医薬は、有効量の医薬をＨＣＭＶ感染を有する個体に投与することを含んでなるＨＣＭＶ感染の治療、防止又は阻害における使用のためである。他の実施態様では、医薬は、先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された組織、臓器又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある組織又は臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の防止、阻害又は治療の方法における使用のためである。一つのこのような実施態様では、組織又は臓器移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。更なる実施態様では、移植レシピエント又は個体は過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、ＨＣＭＶの再活性化及び感染のリスクにある。ある実施態様では、医薬は、有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを更に含む。更なる実施態様では、医薬は、ＨＣＭＶ感染を阻害又は防止するために有効量の医薬を個体に投与することを含んでなる、感染のリスクがある個体におけるＨＣＭＶ感染の治療、阻害又は防止における使用のためである。他の実施態様では、医薬は、ＨＣＭＶ感染乳児、又は妊娠期間中にＨＣＭＶに曝された乳児の治療における使用であって、乳児に、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる使用のためである。上記実施態様の何れかによる「個体」は、ヒトでありうる。ある実施態様では、医薬は、個体におけるＨＣＭＶウィルス力価の低減又はＨＣＭＶウィルス力価の増加の防止のためである。一実施態様では、方法は、ＨＣＭＶウィルス力価を低減又はＨＣＭＶウィルス力価の増加を防止するめに、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる有効量の組成物を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」は、ＨＣＭＶ感染のリスクがあるヒト、及び／又は妊婦及び／又は臓器移植レシピエントである。
更なる態様では、発明は、ＨＣＭＶ感染を治療、防止又は阻害するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる有効量の組成物を個体に投与することを含む。他の実施態様では、発明は、先天性のＨＣＭＶ感染、又は移植された組織、臓器又はドナーがＨＣＭＶに感染しているか又は感染したことがある組織又は臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を防止、阻害又は治療する方法であって、抗複合体Ｉ抗体及び抗ｇＨ抗体を含んでなる有効量の組成物を個体又は移植レシピエントに投与することを含んでなる方法を提供する。一つのこのような実施態様では、組織又は臓器移植レシピエントは、ＨＣＭＶ感染に血清反応陰性である。更なる実施態様では、移植レシピエント又は個体は過去にＨＣＭＶに感染したことがあり、ＨＣＭＶの再活性化及び感染のリスクにある。一つのこのような実施態様では、方法は、下記のように、有効量の少なくとも一つの更なる治療剤を個体に投与することを更に含む。他の実施態様では、発明は、ＨＣＭＶ感染乳児、又は妊娠期間中にＨＣＭＶに曝された乳児を治療、阻害又は防止する方法であって、乳児に、発明の抗体又はその組合せを含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、ヒトでありうる。
更なる態様では、発明は、感染のリスクがある個体におけるＨＣＭＶ感染を阻害又は防止する方法を提供する。一実施態様では、方法は、ＨＣＭＶ感染を阻害又は防止するために、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる有効量の組成物を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
ある実施態様では、発明は、個体におけるＨＣＭＶウィルス力価を低減する又はＨＣＭＶウィルス力価の増加を防止する方法を提供する。一実施態様では、方法は、ＨＣＭＶウィルス力価を低減又はＨＣＭＶウィルス力価の増加を防止するめに、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体を含んでなる有効量の組成物を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」は、ＨＣＭＶ感染のリスクがあるヒト、及び／又は妊婦及び／又は臓器移植レシピエントである。
ＨＣＭＶウィルス力価は、例えばウイルス抗体を測定するＥＬＩＳＡ、ウィルスＤＮＡ（ウイルス量を決定するために特定のウィルス遺伝子及び／又はウィルスゲノム）の量を定量化及び／又はサンプルからのウィルスを培養することによってＨＣＭＶの存在を測定する血清又は組織ベースアッセイなど、当分野で知られている任意の手段で測定できる。このような診断検査は市販されており、例えばＣＯＢＡＳ(登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ(登録商標)ＴａｑＭａｎ(登録商標)ＣＭＶ Ｔｅｓｔ及びＣＯＢＡＳ(登録商標）ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＣＭＶ ＭＯＮＩＴＯＲ Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ）があり、ＨＣＭＶ ＤＮＡの定量化によってＨＣＭＶ感染を診断するため及び抗ウイルス治療をモニタするために使用できる。ある実施態様では、個体におけるＨＣＭＶウィルス力価は、未治療の個体と比較して、又は治療前の同じ個体のウィルス力価と比較して約１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％以下の何れか低減する。
更なる実施態様では、移植される臓器又は組織は、一個体から第二の個体に移植可能な任意の臓器又は組織でありうる。例えば、移植される臓器は、限定するものではないが心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、又は胸腺でありうる。加えて、例えば、移植される臓器は、限定するものではないが、手、角膜、皮膚、顔、ランゲルハンス島、骨髄、幹細胞、全血、血小板、血清、血液細胞、血管、心臓弁、骨、骨前駆細胞、軟骨、靱帯、腱、筋肉内壁でありうる。
更なる態様では、発明は、例えば上記治療方法の何れかにおける使用のための、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体及び／又はｇＨ抗体の何れかを含んでなる組成物及び薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体の何れか、及び薬学的に許容可能な担体を含む。他の実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体の何れか、及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。
発明の組成物中における抗体は、治療において単独で、又は他の薬剤との組合せにおいて使用してもよい。例えば、発明の抗体は、少なくとも一つの更なる治療剤と共に投与されうる。ある実施態様では、更なる治療剤は、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット及び／又はシドホビルである。他の実施態様では、更なる治療剤は、更なる治療用単離抗体である。
上記のこのような併用療法は、組合せ投与（２以上の治療在が同じ又は別の製剤中に含まれる）、及び別々の投与（この場合、発明の抗体組成物の投与は更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与より前に、同時に、及び／又は後に行われる）を含包含する。
本発明の組成物(及び任意の更なる治療剤)は、非経口、腹腔内、及び鼻腔内、及び局所治療が望まれるならば、病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与されうる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、任意の適切な経路、例えば投与が短期か慢性であるかどうかに部分的に依存して、静脈内又は皮下注射のような注射によるものとできる。限定しないが、単一又は様々な時点にわたる複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールがここで考えられる。
本発明の組成物は、良好な医療実務に合致した形で製剤化され、用量決定され、投与される。この点で考慮される要因には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務家に既知の他の要因が含まれる。組成物は、必要ではないが、場合によっては、問題の疾患を予防又は治療するために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の要因に依存する。これらは一般にここに記載のものと同じ用量及び投与経路で、あるいはここに記載の用量のおよそ１から９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると判定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
疾患の防止又は治療について、発明の組成物中に含まれる抗体の適切な投与量は（単独又は一又は複数の他の更なる治療剤との組合せにおいて使用される場合）、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的のために投与されるか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、及び主治医の判断に依存するだろう。ここに記載の組成物中に含まれる各抗体は、一度に又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存し、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の各抗体が、例えば一又は複数の別々の投与又は連続的な注入によって、患者に投与される初回の候補投与量でありうる。一つの典型的な投与量は約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得、上記の要因に依存する。数日又はそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存し、治療は一般的に疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されうる。各抗体の一つの例示的投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の投与が患者に投与されうる。このような投与は、間欠的に、例えば毎週又は毎三週に投与されうる（例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６投与の抗体をうける）。最初の高負荷投与量、次いで一又は複数の低投与量が投与されうる。この治療の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニタされる。
任意の上記製剤又は治療方法は、抗複合体Ｉ抗体及び／又は抗ｇＨ抗体の代わりに又は加えて、ここに記載の抗体のイムノコンジュゲートを使用して実施されうることが理解される。
製品
当該発明のもう１つの局面において、前記した障害の治療、予防および／または診断で有用な材料を含有する製品が提供される。該製品は、容器および該容器上の、または該容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。該容器はガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。該容器は、単独の、または該疾患を治療し、予防し、および／または診断するのに有効なもう１つの組成物と組み合わされた組成物を保有し、および滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、該容器は皮下注射針を刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい)。該組成物中の少なくとも１つの活性な剤は当該発明の抗体である。該ラベルまたは添付文書は、該組成物が選択された疾患を治療するのに用いられることを示す。さらに、該製品は、(ａ)組成物がその中に含有された第一の容器、ここに、該組成物は当該発明の抗体を含み；および(ｂ)組成物がその中に含有された第二の容器、ここに、該組成物はさらなる細胞傷害性またはそうでなければ治療剤を含む、を含むことができる。当該発明のこの実施態様における製品は、さらに、該組成物を用いて、特定の疾患を治療することができることを示す添付文書を含んでもよい。別法として、または加えて、該製品は、さらに、注射用の静菌性水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液のような医薬上許容される緩衝液を含む第二の(または第三の)容器を含んでもよい。それは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含めた、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
前記した製品のいずれも、抗−複合体Ｉ抗体および／または抗−ｇＨ抗体の代わりに、またはそれらに加えて、本明細書中で記載された抗体のイミュノコンジュゲートを含んでもよいと理解される。
以下に示すのは当該発明の方法および組成物の例である。種々の他の実施態様は、先に提供した一般的な記載を仮定すれば実施することができると理解される。
材料および方法
ウイルスの成長。ＶＲ１８１４(Ｒａｖｅｌｌｏ Ｌａｂ，Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ ＩＲＣＣＳ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓａｎ Ｍａｔｔｅｏ，Ｐａｖｉａ Ｉｔａｌｙ)を、ＤＭＥＭ中である以外は指示されたように７ないし１４継代培養したヒト胎児肺繊維芽細胞(ＭＲＣ５)(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ)中で、または指示されたように４ないし６継代のＰ０ヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)(Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中で拡大培養し、および上清を濃縮し、完全培地に再度懸濁させ、および凍結させた。完全培地は、１０％胎児子ウシ血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌグルタミン(全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡからのものである)および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Ｃｅｌｌｇｒｏ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ)を補足したＤＭＥＭから構成されるものであった。胎盤上皮細胞である、ＭＲＣ５およびＨＵＶＥＣ細胞中で、また、ヒト網膜色素上皮細胞(ＡＲＰＥ−１９)(ＡＴＣＣ−指示されたように培養)、単球由来マクロファージ(ＭＤＭ)、および細胞栄養芽層中にて、アッセイを９６ウェルプレート中で行った。指示されたように、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒト単球豊富化カクテル(Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ)を用い、ＭＤＭを全血から単離した。次いで、単球を０．１μｇ／ｍｌリポ多糖(ＬＰＳ)(Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ)で刺激し、およびＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。血小板および未結合細胞を感染に先立ってＰＢＳで洗浄して除去した。細胞栄養芽層を１９週胎盤(Ｌｉｂｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＪＣＶ １１３：４３７−４４９からのプロトコルを用いるＰｅｒｅｉｒａ Ｌａｂ，ＵＣＳＦ)から単離し、および９６−ウェル組織培養プレート中に播いた。細胞栄養芽層調製物を細胞栄養芽層マーカーサイトケラチン７(ＣＫ７)(Ｄａｋｏ)についてアッセイし、および感染の開始時には９０％を超えて陽性であることが判明した。
以下のＨＣＭＶ株はＪａｙ Ｎｅｌｓｏｎ博士(Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＯＨＳＵ)；Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ)から得た： Ａｄｉｎｉｓ、Ｂｒｏｗｎ、Ｃａｎｏ、Ｄａｖｉｓ、Ｄｅｍｅｎｔ、Ｇｒｕｎｄｅｎ、Ｈａｒｒｉｓ、Ｋｅｏｎｅ、Ｌｙｓｉｓｔｒａｔａ、ＮｅｗＲｏｃｋ、Ｐｈｏｅｂｅ、Ｐｏｗｅｒｓ、Ｓａｌｖｏ、Ｓｃｈｍｏｅ、Ｓｉｍｐｓｏｎ、およびＷａｔｋｉｎｓ。以下のＨＣＭＶ株はＳｕｎｗｅｎ Ｃｈｏｕ博士(ＯＨＳＵ)から得た：Ｃ０７９、Ｃ３２３、Ｃ３２７、Ｃ３３６、Ｃ３５２、Ｃ３５３、およびＣ３５９。解凍したウイルスをＭＲＣ５繊維芽細胞に加え、および１００％ＣＰＥが目に見えるまで成長させた(感染後ほぼ１０ないし１２日)。３日後、細胞を掻き取り、および上清を収穫し、および超遠心を用いて濃縮した。各株の希釈物を用いて、９６−ウェルプレート中の新鮮な繊維芽細胞を感染させた。ウイルスを１８時間感染させ、その後、細胞を１００％エタノールで固定した。Ｍａｂ８１０、抗−ＩＥ抗体(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ)での染色および免疫蛍光分析を行った。力価を計算し、およびこれを用いて、中和アッセイのための、１の感染多重度(ＭＯＩ)に必要なウイルスの量を決定した。
中和アッセイ。中和アッセイは、当該アッセイをＤＭＥＭ(Ｇｉｂｃｏ)中で行い、前記したように免疫蛍光によって検出した以外は、実質的にＡｂａｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２２：８２−９３におけるように行った。簡単に述べれば、抗体を系列希釈し、培地と、または非−阻害性抗体と混合した場合に、最終のビリオン濃度の結果、細胞当たりほぼ１の感染性ウイルス(ＭＯＩ＝１)がもたらされるように、完全培地中で希釈されたウイルスと混合した。抗体およびウイルスを混合し、およびＭＲＣ５、ＡＲＰＥ−１９、ＨＵＶＥＣまたは単球−由来マクロファージ(ＭＤＭ)の密集単層への添加に先立って３７度で１時間インキュベートした。ウイルスを１８時間感染させ、その時点の後、細胞を１００％エタノールで固定した。細胞をＰＢＳ、２％ＢＳＡ中でブロックし、次いで、抗−ＨＣＭＶ ＩＥ抗体、Ｍａｂ８１０(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)またはウサギ抗ＨＣＭＶ ＩＥ(Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｌａｂ，Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ)で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、および適当なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８およびＨｏｅｃｈｓｔ株(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)と共にインキュベートした。所与の抗体濃度を含有する二連ウェルからのデータを平均し、１００％に設定された、抗体の不存在下における感染と比較した。細胞をイメージングし、およびＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ(登録商標)ＭｉｃｒｏＴＭおよびＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ(登録商標)(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ)を用いてカウントした。データをｌｏｇ変換し、正規化し、グラフ化し、およびＰｒｉｓｍ(ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ)を用いてＥＣ５０およびＥＣ９０を計算した。ＥＣ９０値は、ＥＣ５０−曲線フィッティングアルゴリズムを用いて最良適合曲線から計算した。検出のアッセイ範囲は、ウェル当たり１００ないし６．５×１０５感染性ウイルス粒子である。アッセイの検証は、特に、異なるウイルスの感染の多重度にて実験間で確かめた。
臨床株の増幅およびクラスター分析。(Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの)ＨＣＭＶの臨床株を繊維芽細胞上で成長させ、上清を収穫し、および超遠心を用いて濃縮した。ＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット(Ｑｉａｇｅｎ)を用いて感染した細胞から単離した。ＨＣＭＶ遺伝子プライマーは、公共のドメインにあるＨＣＭＶ株の整列を用いて設計した。５００塩基未満だけ離れた保存された領域を選択した。臨床株からの配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ(登録商標)を用いて調べ、およびＭａｃＶｅｃｔｏｒを用いて翻訳した。整列はＣｌｕｓｔａｌＷによって、およびＪａｌｖｉｅｗ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒにおいて行い、最近接％同一性を用いて系図を構築した。
バキュロウイルスによる蛋白質の発現。発現された蛋白質を検出するために、標準的な手法によってウサギポリクローナル抗体を生産した。各ウサギを、ＨＣＭＶ蛋白質に対応するペプチドで免疫化した。ペプチドは以下の通りであった：
ｇＨ＿８７１ ＨＰＨＨＥＹＬＳＤＬＹＴＰＣＳＳＳＧＲＲＤＨＳＬＥＲＬＴＲ(配列番号：１９５)、
ｇＨ＿９７７ ＣＰＨＶＷＭＰＰＱＴＴＰＨＤＷＫＧＳＨＴＴＳＧＬＨＲＰＨ(配列番号：１９６)、
ｇＬ＿８７３ ＣＧＬＰＰＥＬＫＱＴＲＶＮＬＰＡＨＳＲＹＧＰＱＡＶＤＡＲ(配列番号：１９７)、
ＵＬ１２８＿９８８ ＶＧＬＤＱＹＬＥＳＶＫＫＨＫＲＬＤＶＣＲＡＫＭＧＹＭＬＱ(配列番号：１９８)、
ＵＬ１２８＿９８９ ＲＱＶＶＨＮＫＬＴＳＣＮＹＮＰＬＹＬＥＡＤＧＲＩＲ(配列番号：１９９)、
ＵＬ１３０＿８９２ ＲＤＹＳＶＳＲＱＶＲＬＴＦＴＥＡＮＮＱＴＹＴＦＣＴＨＰＮ(配列番号：２００)、
ＵＬ１３０＿８９２ ＳＰＷＦＴＬＴＡＮＱＮＰＳＰＰＷＳＫＬＴＹＰＫＰＨＤＣ(配列番号：２０１)、およびＵＬ１３１＿９９３ ＴＡＥＫＮＤＹＹＲＶＰＨＹＷＤＡＣＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫ(配列番号：２０２)。
血清は、ペプチド−結合カラム上への捕獲および引き続いての溶出によって精製した。分泌された蛋白質について、バキュロウイルス構築体を、各個々のＨＣＭＶ蛋白質の細胞外ドメインについて作成した。ＨＣＶＭ細胞外ドメインの各々を、バキュロウイルスシグナル配列およびＣ−末端の６×−Ｈｉｓタグに融合した。バキュロウイルス発現ベクターを用いて、ＳＦ９またはＴｉｎｉ昆虫細胞を感染させた。蛋白質を収穫し、およびゲル濾過し、およびアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシー染色によって調べた。全ての５つの蛋白質(ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１)を含有する画分をプールした。ｇＢトリマー構築体は、ｇＢ Ｓ６４−Ｋ１１５をＱ４９９−Ｅ６５５に融合することによって作り出した。昆虫細胞の感染によって発現させると、この構築体は、膜に係留されていないｇＢ蛋白質、予測された形成されたトリマー、結合された中和および非−中和ｇＢ抗体をもたらし、およびそのプレ−融合形態であるように見えた。ｇＨおよびｇＬを共発現させると、得られたｇＨ／ｇＬ蛋白質はＨＢ１および(Ｄａｖｉｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＯＨＳＵ，Ｒｙｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．８２：６０−７０(２００８)からの)非−立体配座および立体配座ｇＨエピトープの双方を認識する以下の抗体：ＭＳＬ−１０９、ウサギ抗−ｇＨ、ウサギ抗−ｇＬ、ウサギ抗−ｇＨ＿９７７およびウサギ抗−ｇＬ＿８７３に結合した。ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１による昆虫細胞の共感染の結果、ウサギ抗−ｇＨ、抗−ｇＬ、抗−ＵＬ１２８、抗−１３０、抗−１３１および前記したウサギポリクローナル抗体を含めた、ｈｕ８Ｇ８および非−立体配座および立体配座抗体に結合した少量の異種蛋白質がもたらされた。
ｐＲＫ−ＣＭＶベクターの構築。全長ウイルス糖蛋白質の表面発現のために、３つの別々のヒト発現プラスミドを構築した。個々のＨＣＭＶ遺伝子は開始から停止まで増幅した。ｇＨ、ｇＬ、ｇＢはゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡからのＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１から増幅させ、まず、ＰＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いてクローン化した。その後、遺伝子を、各ＨＣＭＶ遺伝子および最後の３’遺伝子を、ｅＧＦＰをコードする遺伝子から分離する「自己−開裂２Ａペプチド」配列を持つＧｅｎｅｎｔｅｃｈ哺乳動物発現ベクター(ｐＲＫ−ｔｋ−Ｎｅｏ)(Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−９４(２００４))にクローン化した。３つのプラスミドを構築し、１つはｇＢおよびｅＧＦＰを持つものであり、１つはｇＨ、ｇＬ、およびｅＧＦＰを持つものであり、および１つはＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、およびｅＧＦＰを持つものである。プラスミドを、リポフェクタミン２０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ)を用いてヒト胚腎臓(ＨＥＫ)−２９３Ｔ細胞(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ)にトランスフェクトした。
Ｃｙｔｏｇａｍ(登録商標)(ＨＩＧ)枯渇。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、上皮細胞へのウイルス侵入を中和するＨＩＧの成分のアッセイのために、リポフェクタミン２０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いてｇＢ／ｅＧＦＰまたはｇＨ／ｇＬ／ｅＧＦＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１／ｅＧＦＰまたはモックプラスミドいずれかでトランスフェクトし、および４８時間インキュベートした。Ａｃｃｕｔａｓｅ(Ｓｉｇｍａ)を用いて細胞を解離し、ペレット化し、および１２のアリコットに分けた。Ｃｙｔｏｇａｍ(登録商標)をＰＢＳおよび０．５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)中で２０μｇ／ｍｌまで希釈し、および３×１０７のトランスフェクトされた細胞を含む懸濁液中で１時間インキュベートした。次いで、Ｃｙｔｏｇａｍ(登録商標)を３×１０７のトランスフェクトされた細胞の新鮮なアリコットに系列的に移動させた。新しい細胞への継代は、抗体の最大特異的欠失が見られるまで(６継代)行った。ＥＬＩＳＡアッセイを行って、ある種のＨＣＭＶ特異的抗体の枯渇を検出した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ(ＮＵＮＣ)プレートを、ＰＢＳおよび／またはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物中で、精製されたバキュロウイルス生産ｇＢ、ｇＨ／ｇＬ、またはｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１で被覆した。検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ)にコンジュゲートしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃγで決定した。検出の下限は０．０８μｇ／ｍｌである。次いで、得られたＨＩＧを、前記した中和アッセイで用いるために、１００ｋＤ分子量カットオフコンセントレーター(Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ)を用いて濃縮した。
アフィニティー枯渇カラムを以下のように生じさせた。蛋白質(１ないし２ｍｇの可溶性ｇＢまたはｇＨ／ｇＬ)をＰＢＳに対して徹底的に透析し、ＰＢＳ中で平衡化したほぼ１ｍｌのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ ＡＬＤ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂に加えた。シアノホウ水素化ナトリウム(０．２ｍｌの１Ｍ溶液)を加えて、蛋白質を、アルデヒド含有樹脂に化学的にカップリングさせ、および反応を４℃で一晩進行させた。個々の樹脂を小さなカラムに負荷し、およびＰＢＳで徹底的に洗浄して、いずれの未結合蛋白質も除去した。８００μｌの容量中の２ミリグラムのＣｙｔｏｇａｍ(登録商標)をカラムに負荷し、および０．４ｍＬ／分の流速にてＰＢＳで洗浄した。非−結合蛋白質を数個の０．５ｍｌのアリコットに収集し、これを、５０００ダルトンの分子量カットオフを持つ回転コンセントレーター中でほぼ１００μｌまで別々に濃縮した。試料を滅菌濾過し、およびアッセイまで４℃で貯蔵した。
ＦＡＣＳ。既に記載したｐＲＫ−ＣＭＶベクターを、単独で、またはリポフェクタミン２０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて、一緒にしたｇＨ／ｇＬおよびＵＬ１２８−１３１につき５０：５０の比率にてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間後に、Ａｃｃｕｔａｓｅ(Ｓｉｇｍａ)を用いて細胞を解離させた。一次または二次抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ)の全てのインキュベーション、および洗浄は、ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、０．２％アジ化ナトリウム(ＦＡＣＳ緩衝液)中で行った。染色の後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の２％パラホルムアルデヒド中で固定した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ４(Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)を用いて蛍光分析を行い、およびＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ(Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．)を用いてデータを処理した。
耐性ウイルス突然変異体の生成。本明細書中に記載された抗体に対して耐性であるウイルス突然変異体を生じさせるために、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈで合成された抗体ＭＳＬ−１０９(Ａｕｌｉｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３：１３４４−４７(１９９１))、ＨＢ１、ｈｕ８Ｇ８、またはＡＲＰＥ１９細胞(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ)中のＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８の組合せのいずれかの最適下濃度の存在下で、ＨＣＭＶ株ＶＲ１８１４を上皮細胞上で成長させた。実験は、ＥＣ５０、２× ＥＣ５０、またはＥＣ９０、および０．５の感染多重度(ＭＯＩ)にて３ウェルの各抗体を含む２４ウェルプレート中で開始させた。各週において、各々のウェル容量の半分を新しい細胞に継代し、および抗体の濃度を１．５倍増加させるか、または一定に保った。典型的には、突然変異体はほぼ継代９までには単一のウイルスプラークとして出現した。これらのウイルスは増大させる濃度の抗体中で１０× ＥＣ９０の最終濃度まで成長させた。引き続いて、突然変異体をストックし、および前記した中和アッセイによって、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８に対する耐性について分析した。全プロセスをＡＲＰＥ−１９細胞上で４つの別々の時点に(抗体濃度当たり３つのウェル)、およびＨＢ１およびＭＳＬ１０９のみを含むＭＲＣ５細胞上で２つの別々の時点に開始した(ｈｕ８Ｇ８はＭＲＣ５細胞上のウイルスを中和しない)。
さらなる耐性突然変異を生じさせるために、細胞外ウイルスをＮ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素(ＥＮＵ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ)または紫外光(２５４λ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ)で処理し、２４−ウェルフォーマット(処理当たり２４ウェル)または９６−ウェルフォーマット(処理当たり７２ウェル)いずれかでＡＲＰＥ−１９またはＭＲＣ５細胞を感染させた。(１または２のＭＯＩでの)感染後に、培地を、ＥＣ１００のＨＢ１またはＥＣ１００のｈｕ８Ｇ８、または各々ＥＣ５０の２つの抗体の組合せ、またはガンシクロビール(ＧＣＶ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ)を含む完全培地で培地を置き換えた。各週に、上清を、増大させる濃度の抗体またはＧＣＶを含む新鮮な細胞に継代した。成長するウイルスをより大きなウェルに移し、および２ないし３か月後にストックした。全プロセスは２つの別々の時点に開始した。
糖蛋白質の配列決定。ＤＮＡを対照または突然変異体ウイルス感染細胞または上清(ＤＮＡ 血液／組織抽出キット(Ｂｌｏｏｄ／Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ)，Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ)から単離した。プライマーは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ(ＮＣＢＩ)のデータベースで入手可能なＨＣＭＶ株ＡＤ１６９、ＦＩＸ、ＴＢ４０Ｅ、Ｔｏｌｅｄｏ、およびＴｏｗｎｅ配列の整列に従って、各遺伝子わたって保存された配列に対して設計した。糖蛋白質Ｈは、丁度停止コドンが欠如した、開始コドンないし塩基２１９６からの各臨床株から増幅させた。糖蛋白質Ｂは、丁度停止コドンが欠如した、開始ないし塩基２６８６から増幅させた。ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１は、各々、Ａｋｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１１１７−２２(２００３)から得られたｃＤＮＡ配列に従って開始ないし停止から増幅させた。ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)産物を、ダイターミネーター反応および整列させかつトリミングした配列を用いて配列決定した(Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ)。
突然変異の反復発生。前記したｇＨ／ｇＬ遺伝子またはＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１遺伝子を含有したｐＲＫ−ＣＭＶ発現プラスミドを修飾して、各耐性突然変異体において見出される単一の突然変異を置き換えた。各ｇＨ／ｇＬプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞(ＡＴＣＣ)にトランスフェクトし(リポフェクタミン２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ)、２日間発現させ、次いで、対照抗−ｇＨ抗体１０Ｆ８またはＨＢ１に結合する表面発現ＨＣＭＶ蛋白質の能力について、前記したように、蛍光活性化細胞ソーティング(ＦＡＣＳ)分析によって評価した。各ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１プラスミドをｇＨ／ｇＬプラスミドでトランスフェクトし、２日間発現させ、次いで、ＨＢ１、ｈｕ８Ｇ８、および対照ウサギ抗−ＵＬ１３１＿９９３抗体に結合する表面発現蛋白質の能力について評価した。分析およびイメージは、ＦｌｏｗＪｏ(Ｔｒｅｅｓｔａｒ；Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ)を用いて生じさせた。
ウイルス侵入の分析。(抗体の不存在下にてＡＲＰＥ−１９細胞上で平行して継代した)耐性および対照株のストックを成長させ、および上清を収穫した(純物)。定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を、ｐｐ６５ ＤＮＡ(ｐｐ６５Ｆ ＴＣＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧ(配列番号：１８９)、ｐｐ６５Ｒ ＣＧＧＣＣＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＴＴ(配列番号：１９０)、ＴａｑｍａｎプローブＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＡＡＣＧ(配列番号：１９１)について行った。コピー数を確認するために、標準曲線を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)にクローン化されたｐｐ６５で得た。コピー数に基づくウイルスの希釈物を、固定および可視化に先立ってＡＲＰＥ−１９およびＭＲＣ５細胞に１８時間感染させた。ＤＮＡコピー当たりの感染性粒子を計算し、抗体無くして継代した株に対して正規化し、およびＥｘｃｅｌバージョン１４．１．２(Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ；Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ)を用いてグラフ化した。
実施例１−抗−複合体Ｉおよび抗−ｇＨ抗体の生産
抗−複合体ＩネズミｍＡｂ ８Ｇ８の生産。Ｂａｌｂ／ｃマウスの２群(各群において１０匹)を、マウス当たり１×１０６ｐｆｕの濃度にて、全ＵＶ不活化(３０００ｍＪ)ＨＣＭＶ(株ＶＲ１８１４)で、１週間につき２回、合計７回の注射ＳＣ／ＩＰにて免疫化した。動物の最初の群において、各マウスをＲＩＢＩアジュバントで初回免疫し、引き続いて、ＰＢＳ中のＨＣＭＶを注射した。マウスの第二の群において、動物を初回免疫せず、次いで、ＲＩＢＩアジュバント中のＨＣＭＶを注射した。免疫化マウスのテスト出血を、前記したように、ＥＬＩＳＡによる血清試料滴定およびウイルス中和アッセイに付した。トップの５匹の応答するマウスをハイブリドーマの生産のために選択した。膝窩および鼠径の節およびマウス骨髄腫系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３からのリンパ球を用い、融合の２つの別々の組を行った。融合された細胞を９６−ウェル組織培養プレート(５８プレート)中で平板培養し、およびＨＡＴ培地補足物(Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．)を用いるハイブリドーマ選択は融合から１日後に開始した。前記した上皮細胞についてのウイルス中和アッセイを用い、合計７３８のＩｇＧ＋ハイブリドーマをスクリーニングした。得られた抗体に対するＨＣＭＶ株ＶＲ１８１４についてのＥＣ５０(μｇ／ｍｌ)を種々の細胞型についてテストし、およびＭＳＬ−１０９(抗−ｇＨ抗体)と比較し、表２に示す。モノクローナル抗体８Ｇ８はスクリーニングにおいて同定された最も効力がある中和抗体であって、ヒト化およびさらなる特徴付けのために選択した。
Figure 2014501491
ネズミ８Ｇ８ ｍＡｂのヒト化および分析。ネズミハイブリドーマ８Ｇ８は、ラムダ３または４軽鎖(図２)およびＶＨ１、ＶＨ３またはＶＨ７重鎖フレームワーク(図１)いずれかを用い、標準ＣＤＲグラフトによってヒト化した。比較のために、λ３およびλ４についてのコンセンサスヒトλ生殖細胞系配列の整列を図２に示す。中和アッセイを行い、８Ｇ８ヒト／ネズミキメラ抗体(ＱＥ７／Ｃ２)を、８Ｇ８λ３またはλ４軽鎖いずれかと組み合わせた８Ｇ８ ＶＨ１、ＶＨ３またはＶＨ７ヒト化重鎖と比較した。λ４変種はＨＣＭＶを中和したが、λ３変種は中和しなかったことが判明した(図３)。
λ４のＨＶＲ−Ｌ２を図４に示したように突然変異させて、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、アミノ酸５０Ｃ、５０Ｄ、５６における置換、ならびにアミノ酸５７(ＦＲ３の最初のアミノ酸)におけるアミノ酸置換を導入して、抗体に対する安定性を供した。次いで、種々の突然変異させた軽鎖を８Ｇ８ヒトＶＨ１鎖と組み合わせ、および得られた抗体を前記したような中和アッセイにおいてテストした。単一のアミノ酸置換を持つ抗体は、全て、良好な中和活性を示した(すなわち、Ａ１、Ｅ１、Ｔ１、Ａ２、Ｅ２、およびＴ２)(図５)。同様に、２つのアミノ酸置換を含有する全ての抗体は良好な中和活性を示した(すなわち、ＳＧＳＧおよびＴＧＤＡ)。単一の突然変異体ＳＧを比較対照として含ませ、それもまた良好な中和活性を示した。(図６)。
ヒト化８Ｇ８λ４抗体の配列を図７に示す(ｈｕ８Ｇ８．λ４ ＦＷ)。図８はヒト化８Ｇ８ ＶＨ１配列の配列(ｈｕ８Ｇ８．ＶＨ１)を示し、他方、図９はヒト化８Ｇ８ ＶＨ３配列の配列(ｈｕ８Ｇ８．ＶＨ３)を示す。図１０はヒト化８Ｇ８λ４抗体の配列を示し、そこでは、ポリペプチドがセリンで開始し(Ｑは欠失されており、およびＬはＳに突然変異されている)、およびアミノ酸３６がネズミアミノ酸(Ｙ)を保有するように、最初の２つのアミノ酸(ＱＰ)が修飾されている。この抗体のポリペプチド配列はλ４ ８Ｇ８グラフトとして示される。該ポリペプチドをコードする代表的な核酸配列をポリペプチド配列の下方に示す。
抗−ｇＨ抗体のアフィニティー成熟。モノクローナル抗体ＭＳＬ−１０９は、１９９４年８月４日に公開され、かつその全体をここに引用して援用する、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９４／１６７３０において公開されたＭＳＬ−１０９の可変重鎖および可変軽鎖の配列についての抗体配列を用いて合成した。ＭＳＬ−１０９ ＶＨおよびＶＬ鎖のアミノ酸配列を図１１に示す(ＶＬ、配列番号：９０；ＶＨ、配列番号：９２)。ＭＳＬ−１０９抗体は、重鎖ＶＨ３および軽鎖Ｖκ２を含有するＩｇＧ１フレームワークに基づくものであった。この抗体をコードする組換えＤＮＡをＣＨＯ細胞にクローン化した。
抗体ＭＳＬ−１０９は、相補的決定領域(ＣＤＲ)のランダム化、続いての、徐々に限定する濃度のビオチニル化ｇＨ／ｇＬを持つファージディスプレイによるバインダーの選択によってアフィニティー成熟させた。ＣＤＲの各位置は、「ＮＮＫ」コドンでのオリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発によってランダム化し、ここに、Ｎは４つの天然ヌクレオチドのいずれかであって、Ｋは５０％チミジンおよび５０％グアニンである。ＮＮＫコドンは２０の天然アミノ酸のいずれかをコードすることができる。軽鎖および重鎖についてのライブラリーを別々に作成し、および各鎖の３つのＣＤＲの各々を同時にランダム化した。この結果、各ＣＤＲに１までの突然変異を含む、各鎖に０ないし３のランダムアミノ酸変化を有するクローンがもたらされる。ライブラリーは、ファージＦａｂ断片ディスプレイベクターにおいて、かつ標準的な方法によって作成された。結合クローンは、連続数ラウンドの選択において、ファージディスプレイライブラリーを１および０．１ｎＭビオチニル化ｇＨ／ｇＬと共にインキュベートすることによって選択し、次いで、１００ｎＭ ｇＨ／ｇＬまたはＭＳＬ−１０９ ＩｇＧいずれかと競合させて、より低い親和性のクローンのｇＨ／ｇＬへの結合を低下させた。結合したクローンをニュートラアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したＥＬＩＳＡプレート上に捕獲し、洗浄し、および１０ｍＭ ＨＣｌ中に室温にて１０分間溶出させた。溶出したファージを１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で中和し、およびこれを用いて、次の選択のラウンド用の増幅のためにＥ．ｃｏｌｉを感染させた。第二ラウンドの選択からのクローンを配列決定して、選択されたファージにおいて頻繁な突然変異を決定した。好都合な突然変異を持つクローンを、競合ファージＥＬＩＳＡによってテストした。
重鎖のＫａｂａｔ位置５３および５５において個々のまたは組み合わされた突然変異を持つ突然変異体ＭＳＬ−１０９のＩｇＧおよびＦａｂ断片を発現させ、およびＣＭＶのイン・ビトロ中和についてテストした。(Ｄ５３を、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｗ、Ｙ、ＶまたはＡで置き換える)アミノ酸５３単独における、または(Ｔ５５をＲまたはＫいずれかで置き換える)アミノ酸５５におけるアミノ酸置換と組み合わせたアミノ酸置換は、改良された中和能力を持つ抗体を供した(図１２Ｂおよび１２Ｃ)。これらの変化のいくつかの模式図を図１２Ａに示す。加えて、ＭＳＬ−１０９におけるアミノ酸Ｎ５２をＳで置き換えることができる。この置換は能力に影響しないが、位置５２のグリコシル化無くしての位置５３におけるＳを可能とする。アミノ酸５３および／またはアミノ酸位置５５における種々のアミノ酸置換を用いる重鎖可変配列についての８９の可能な組合せがある(配列番号：８７、８８、８９、および９６−１８２)。コンセンサス配列は配列番号：９４として供される。これらの抗−ｇＨ抗体のＦａｂ断片を、バキュロウイルスで生産されたｇＨ／ｇＬダイマーに対する親和性についてのファージディスプレイＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。具体的には、ＭＳＬ−１０９変種Ｆａｂ断片を提示するファージクローンを系列希釈されたｇＨ／ｇＬと共にインキュベートし、および室温で１時間インキュベートした。未結合ファージを、ｇＨ／ｇＬで被覆されたＥＬＩＳＡプレートウェルに対する混合物を室温で１０分間インキュベートすることによって検出した。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、および固定化されたｇＨ／ｇＬに結合したファージを抗−Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲートとの３０分間のインキュベーション、続いての、洗浄、およびＴＭＢ基質での発生によって検出した。ファージ−ｇＨ／ｇＬ混合物におけるファージの５０％が遊離している点であるＩＣ５０は、非−線形回帰によって計算した。ＩＣ５０は０．０１ないし０．１ｎＭの範囲にあった。選択された変種に対する個々の親和性を表３に示す。
Figure 2014501491
驚くべきことに、ＶＨ２ ＨＶＲにおけるアミノ酸の変化は、劇的により高い結合および中和能力を持つ抗体を生じた。例えば、ＨＢ１(Ｄ５３Ｎ／Ｔ５５Ｒ)は、ファージＥＬＩＳＡによって示されるようにＭＳＬ−１０９よりもｇＨ／ｇＬに対して１０倍増大した親和性を有した(表３)。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＦａｂ断片として発現させた場合、ＨＢ１(Ｄ５３Ｎ／Ｔ５５Ｒ)は、中和アッセイによって示されるように、非経口ＭＳＬ−１０９抗体よりもＡＲＰＥ−１９細胞へのＨＣＭＶ侵入の阻害についてほぼ４０倍より大きい効力がある(すなわち、ＥＣ５０＝０．１５ｎＭ−対−６．２ｎＭ)(図１２Ｂ)。さらに、ＨＢ１(Ｄ５３Ｎ／Ｔ５５Ｒ)は、ＣＨＯ細胞において全長ＩｇＧとして発現させた場合、中和アッセイによって示されるように、ＡＲＰＥ−１９細胞へのＨＣＭＶ浸入の阻害についてほぼ６倍より効力がある(表４、図１２Ｃ)。種々の細胞型についての、中和アッセイ(１つの代表的な実験)においてＭＳＬ−１０９抗体と比較したＨＢ１抗体についてのＥＣ５０およびＥＣ９０(μｇ／ｍｌ)を以下の表４に示す。
Figure 2014501491
実施例２−抗体の機能的研究
ＨＢ１(Ｄ５３Ｎ／Ｔ５５Ｒ)およびｈｕ８Ｇ８を、上皮細胞、内皮細胞、マクロファージおよび繊維芽細胞へのＨＣＭＶウイルス侵入をブロックする能力について中和アッセイでＨＩＧと比較した。ｈｕ８Ｇ８は上皮細胞について０．００３μｇ／ｍｌ(０．０２ｎＭ)、内皮細胞について０．００４μｇ／ｍｌ(０．０３ｎＭ)、および単球について０．００１μｇ／ｍｌ(０．００６ｎＭ)のＥＣ５０を有する。ｈｕ８Ｇ８は、これらの細胞型の各々について中和ＨＣＭＶにおいてＨＢ１よりも少なくとも８倍より効力がある。しかしながら、予測されたように、ｈｕ８Ｇ８は繊維芽細胞へのウイルスの侵入をブロックせず、他方、ＨＢ１は０．１１μｇ／ｍｌのＥＣ５０(０．７ｎｍ)にてブロックする(図１３参照)。
ＨＩＧは、一次ＨＣＭＶ感染を持つ妊娠した婦人に与えられた場合、ＨＣＭＶ胎児感染および／または病気を予防することが報告されており(Ｎｉｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００５)、これは、発生する胎児に対する保護を付与するＣＭＶ−特異的抗体の能力を示唆する。中和アッセイによって評価した場合、ＨＩＧは、全てのテストされた細胞型へのウイルス侵入を中和することが判明したが、モノクローナル抗体のいずれよりもかなり低い効力であった(図１３参照)。この比較的低い効力は、抗−ＣＭＶ中和活性を持つ小さな割合の蛋白質を有するに過ぎないＨＩＧのポリクローナル性質によるものである。
実施例３−ＨＩＧ枯渇研究
高力価免疫グロブリンにおける中和抗体成分を同定するために、６つの系列的インキュベーションによってｇＢまたは複合体ＩでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用い、抗−ｇＢ抗体または抗−複合体Ｉ(ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１)抗体を枯渇させた。Ｃｙｔｏｇａｍ(登録商標)(ＨＩＧ)枯渇は、前記した方法に従って行った。吸収された血清の分析は、精製されたｇＢ ＥＬＩＳＡによってアッセイして、対照細胞についての０％と比較して、ｇＢでトランスフェクトされた細胞と反応性である抗体の＞９５％が、この手法によって吸収されたことを示した。しかしながら、前記したように、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの溶解物でのＥＬＩＳＡによってアッセイして、対照細胞についての０％と比較して、複合体Ｉでトランスフェクトされた細胞と反応性である抗体の約４５％のみが吸収されていた。
次いで、枯渇したＨＩＧを中和アッセイで用いて、上皮細胞へのウイルス侵入の予防に対する枯渇の影響を決定した。モック−吸収ＨＩＧと比較した吸収されたＨＩＧ調製物の系列的希釈を、前記した中和アッセイで用いた。これらの実験の結果を図１４に示す。ｇＢに対する抗体は、上皮細胞に対するＨＩＧの中和能力に有意に寄与するように見えず、他方、複合体Ｉに対する抗体はＨＩＧの中和活性に有意に寄与するように見える。複合体Ｉ特異的抗体の除去は、上皮細胞についてテストした場合、約８５％だけＨＩＧの中和能力(ＥＣ５０)を減少させた。
繊維芽細胞に対する枯渇したＨＩＧのアッセイは、中和を検出するのに必要な非常に高い濃度のため可能でなかった。ＨＩＧのＥＣ５０はこの細胞型に対してほぼ５００μｇ／ｍｌである。ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１蛋白質は繊維芽細胞への侵入に必要でないので、前記したようなカラムに結合したバキュロウイルス発現ｇＢまたはｇＨ／ｇＬを用いて、これらの蛋白質／複合体について特異的なＨＩＧからの抗体を特異的に枯渇させた。抗ｇＢ抗体のほとんど完全な枯渇では(ｇＢカラム上でのｇＢ抗体の９５％枯渇−対−ｇＨ／ｇＬカラム上でのｇＢ抗体の０％枯渇)、中和シフトは観察されなかった。しかしながら、枯渇した抗ｇＨ／ｇＬ抗体の大部分では(ｇＨ／ｇＬカラム上でのｇＨ／ｇＬ抗体の８４％枯渇−対−ｇＢカラム上でのｇＨ／ｇＬ抗体の０％枯渇)、ＥＣ５０の６５％低下が観察された(図１４参照)。
これらのデータから、ＨＩＧにおける主要な中和抗体がｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体に向けられると結論された。具体的には、複合体Ｉ中和抗体はＨＩＧにおける上皮細胞侵入のための主要な中和抗体である。加えて、ＨＩＧにおけるｇＨ／ｇＬ抗体は、繊維芽細胞へのウイルス侵入の阻害において支配的な役割を有する。これらの実験は、ＨＩＧ中和において抗−ｇＢ抗体に対してほとんど役割を示さない。
バキュロウイルス発現ｇＢ，ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を用いてＨＩＧを吸収することによって、ＥＬＩＳＡにより、ＨＩＧのほぼ１％はｇＢ反応性であり、他方、ほぼ０．１ないし０．２％は複合体ＩまたはｇＨ／ｇＬいずれかに反応性であると判断された。ＨＩＧにおける複合体−特異的抗体の濃度を知ることによって、それらの複合体−特異的抗体の中和能力は、以下の表５に示されるように、現実に関連複合体に向けられ、中和に導く(例えば、繊維芽細胞に対して８１０μｇ／ｍｌ×０．１−０．２＝０．８−１．６)ＩｇＧのパーセンテージについて無傷のＨＩＧの中和能力を修正することによって計算することができた。
Figure 2014501491
表５において先に示されたように、ＨＢ１およびヒト化８Ｇ８(ＶＨ１またはＶＨ３いずれか)の組合せは、中和アッセイでテストした全ての細胞型に対するＨＩＧの中和能力を近似することができる。細胞をＨＣＭＶの以下の感染の多重度(ＭＯＩ)において感染させた：上皮細胞ＭＯＩ＝１、内皮細胞ＭＯＩ＝１、マクロファージＭＯＩ＝０．５および繊維芽細胞ＭＯＩ＝１。ＨＢ１は繊維芽細胞に対する感染の阻害について(複合体Ｉ−特異的であるＨＩＧの量について修正して)ＨＩＧに対する匹敵する中和能力を有するが、上皮細胞、内皮細胞、またはマクロファージに対して適切な能力を供しない。ヒト化８Ｇ８(ＶＨ１)および(ＶＨ３)は、上皮細胞、内皮細胞およびマクロファージに対して(複合体Ｉ−特異的であるＨＩＧの量について修正して)ＨＩＧに対する匹敵する中和能力を有する。しかしながら、それは繊維芽細胞の感染を中和しない。かくして、抗体の組合せは、テストされた全ての細胞型について、複合体Ｉ−特異的抗体について調整された、ＨＩＧのそれと匹敵するＨＣＭＶの中和を供する。
ＨＣＭＶの全ての種々の細胞型を中和するＶＨ１を持つＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８の能力を、再度、中和アッセイにおいてテストし、およびＨＩＧの計算されたおよび現実の中和能力と比較した。細胞を以下のＨＣＭＶのＭＯＩで感染させた：上皮細胞ＭＯＩ＝１、内皮細胞ＭＯＩ＝０．２５、マクロファージＭＯＩ＝０．２５および繊維芽細胞ＭＯＩ＝０．８。この実験の結果は表６において以下に示す。表５に示されるこの実験からの平均ＥＣ９０および結果は、表６において陰影をつけたボックス中で以下に示す。
Figure 2014501491
実施例４−ＨＣＭＶ臨床単離体の中和
ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１遺伝子は、Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅｌａｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおける２つの研究所から入手した２０を超える臨床単離体から配列決定し、およびさらなる公に入手可能な配列と共に編集した。公に入手可能な配列を米国、欧州、および日本に由来する株から生じさせた。
各株によって感染された細胞を溶解させ、およびＤＮＡ血液／組織抽出キット(Ｑｉａｇｅｎ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ)を用いて抽出した。プライマーを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ(ＮＣＢＩ)データベースで入手可能なＡＤ１６９、ＦＩＸ、ＴＢ４０Ｅ、Ｔｏｌｅｄｏ、およびＴｏｗｎｅ配列の整列に従って保存された配列に対して設計した。糖蛋白質ｇＨは、丁度停止コドンが欠如した、開始コドンないし塩基２１９６の各臨床株から増幅した。ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)産物を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにおけるダイターミネーター反応を用いて配列決定した。配列を整列させ、およびトリミングした(シーケンサー)。さらなるｇＨ配列は、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６：６０４−７(１９９２)からの受入番号を用い、次いで、「関連配列」を得ることによって、ＮＣＢＩデータベースから入手した。全体で、シグナルペプチドを除去した後に、５７株からの糖蛋白質配列をクラスター化し(ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ(ＥＢＩ)；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ)、パーセンテージ同一性による平均距離を用いて系図に整列させた(ＪａｌＶｉｅｗ；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ ２００９)。
配列決定の結果は、(シグナルペプチドを除去した後の)臨床単離体にわたりＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１における配列の１％変動を示した。この知見は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１が一次ＨＣＭＶ感染を持つ妊娠した婦人の間で高度に保存されていたことを示す欧州における研究と合致した(Ｂａｌｄａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５１：１２２５−３３(２００６))。
ｇＨは(シグナルペプチドを除去した後の)蛋白質レベルにおいて全ての株の間で少なくとも９５％同一である。２つの区別される枝を持つ系統樹が構築された(データは示さず)。該系統樹は、ｇＨ蛋白質配列が２つの系統グループに分離されるという従前の報告と合致する(Ｃｈｏｕ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６：６０４−７(１９９２))。また、文献に従うと、双方の枝におけるＨＣＭＶ単離体は地理的に区別できなかった(すなわち、日本において単離された株は双方の枝において見出すことができた)(Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４：６４７−６５５(２００３))。
繊維芽細胞に対するＨＣＭＶの臨床単離体の多様なパネルの感染性を中和するＨＢ１(Ｄ５３Ｎ／Ｔ５５Ｒ)の能力をテストした。表７はＨＩＧと比較したＨＢ１の有効性を示す。ＨＢ１は、(ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１−特異的であるＨＩＧの量について修正した場合)最大のｇＨ配列多様性を表すか、またはＨＩＧよりも良好なＨＣＭＶの株の各々を中和することが判明した。多数の実験において、種々のＭＯＩにおけるＨＣＭＶ株Ｄｅｍｅｎｔ、ＡｄｉｎｉｓおよびＶＲ１８１４を用いる中和アッセイの結果もまた以下の表７に示す。
Figure 2014501491
実施例５−抗体の特異性
ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８の抗原特異性を評価した。ウイルス糖蛋白質を含有するプラスミドは、各蛋白質が「自己開裂２Ａペプチド」を持つ各遺伝子を分離することによって等しい化学量論的量で発現されるように構築した(Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−９４(２００４))。プラスミドは(ｃＤＮＡからクローン化された)ｇＢ／ｅＧＦＰ、ｇＨ／ｇＬ／ｅＧＦＰ、またはＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１／ｅＧＦＰいずれかの全長遺伝子を含有した。リポフェクタミン２０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ)を用い、プラスミドをヒト胚腎臓(ＨＥＫ)２９３Ｔ細胞(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ)にトランスフェクトして、それらの表面でＣＭＶ糖蛋白質を発現させた。２日後に、分解を解離し、および飽和する一次抗体ＨＢ１、ｈｕ８Ｇ８、抗ｇＢ、アフィニティー―精製ウサギ抗ＵＬ１３１＿９３３またはアフィニティー−精製ウサギ抗−ｇＨ＿９７７で染色した。細胞を、アロフィコシアニンにコンジュゲートした適当な二次抗体(ＡＰＣ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ)で染色した。個々の細胞の蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ)を用いて測定し、およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ；Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ)を用いて分析した。ＧＦＰ陽性細胞(ＣＭＶ導入遺伝子を発現するもの)を選択的にグラフ化して、抗体の結合を示した。
図１５に示されるように、ＨＢ１は、ｇＨ／ｇＬを、単独で、またはＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１と複合させて発現する細胞に対して反応した。ｈｕ８Ｇ８は、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を発現する細胞のみに反応し(図１５)、およびｇＨ／ｇＬ単独またはｇＨ／ｇＬ／ｇＯを発現する細胞には反応しなかった(データは示さず)。いずれの抗体もｇＢを発現する細胞には反応しなかった。かくして、ＨＢ１は、ｇＨ／ｇＬ複合体に、および複合体Ｉに存在するｇＨ上のエピトープを認識する。ｈｕ８Ｇ８抗体は、複合体１を形成する５つのエンベロープ蛋白質内のエピトープに結合するが、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯまたはｇＨ／ｇＬ単独には結合しない。
実施例６−相乗作用および拮抗作用の評価
ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８を、ウイルス中和アッセイにおいて組み合わせてテストして、２つの抗体を合わせた場合に能力に差が存在したかを決定した。該抗体は異なる標的を有し、恐らくは、独立して、ウイルス侵入をブロックするにおいて作用するので、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８の効果は相加的であると推定された。かくして、Ｂｌｉｓｓ独立方程式を適用した(効果ＡおよびＢを持つ２つの単一の化合物についての合わせた応答ＣはＣ＝Ａ＋Ｂ−Ａ＊Ｂである)。この目的で、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８を１：１の比率で混合し、および上皮細胞に対するウイルス中和アッセイで系列希釈においてテストし、ＥＣ５０を前記したように計算した。ＨＢ１は上皮細胞に対するｈｕ８Ｇ８の能力を増強させず、または減少させず、１：１曲線は、正確に、シミュレートされたＢｌｉｓｓ独立曲線と重複し、相乗作用よりはむしろ相加性を示唆する(図１６および表８参照)。同様に、ｈｕ８Ｇ８は予測されたように繊維芽細胞に対するＨＢ１の能力を改変しなかった。というのは、ｈｕ８Ｇ８は繊維芽細胞へのＨＣＭＶ侵入をブロックしないからである(データは示さず)。かくして、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８は１：１の比率でいずれの拮抗作用または相乗作用も示さない。
Figure 2014501491
ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８が広い範囲の比率で相乗作用または拮抗作用を示したかを評価するために、ＥＣ５０値にわたる対の「チェッカーボード」希釈系列を用いて、中和アッセイを行った。各抗体を以下の表９に示したように希釈し、他方、ウイルス濃度は一定であった。抗体濃度の種々の組合せでの、上皮細胞についての、(無抗体対照に対して正規化された)感染した細胞のパーセントを以下の表９に示す：
Figure 2014501491
中和アッセイを用い、前記したように、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８についてのＥＣ５０を、０．８、０．０１６、０．００３２μｇ／ｍｌの他の抗体の存在下で決定した。これらの実験の結果を以下の表１０および１１に、および図１７に示す。
Figure 2014501491
Figure 2014501491
各抗体単独の能力を種々の比率の組合せと比較すると、相乗作用または拮抗作用の証拠は無かった。例えば、ｈｕ８Ｇ８の能力の曲線をｈｕ８Ｇ８のそれおよびＨＢ１の０．０８μｇ／ｍｌと比較すると(滴定された抗体の不存在下における感染は１００％に対して正規化される)、我々は、曲線が重複していることを見出した(図１７参照)。今度は、ＨＢ１能力曲線の各々は(１００％感染に対して正規化された)種々の濃度のｈｕ８Ｇ８の存在下で重複した(図１７参照)。かくして、比率の広い範囲では、抗体の間に相乗作用または拮抗作用の証拠は無い。
実施例７−開発されたウイルス耐性の評価
ヒトＣＭＶは(Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)またはヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)と比較して)比較的低い突然変異率を有するが、耐性突然変異の発生を介する、ＨＢ１またはｈｕ８Ｇ８または双方に対する中和を回避するウイルスの能力を評価した。ウイルスを、最適下濃度のＨＢ１(またはＭＳＬ−１０９)、またはｈｕ８Ｇ８または一緒にしたＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８抗体の双方のいずれかの存在下で成長させた。各抗体の濃度は、ウイルスを各週に新しい細胞に継代するにつれて徐々に増大した(容量のほぼ５０％を各ラウンドで新しい細胞に継代した)。各個々の抗体に対して耐性である突然変異体ウイルスが観察されたが、突然変異体は該組合せに対する耐性を付与しなかった。全ての耐性ウイルス突然変異体は単一のプラークから出現した。
ＨＢ１による中和に対する耐性を付与する突然変異体が出現した(図１８参照)。しかしながら、これらの突然変異体は、中和アッセイによって示されるように、同様のＥＣ５０を持つｈｕ８Ｇ８に対して依然として感受性であった(図１８および表１２および１３参照)。
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加えて、ｈｕ８Ｇ８によって中和に対する耐性を付与する突然変異体が出現し、およびこれらの突然変異体は、依然として、同様なＥＣ５０を持つＨＢ１に対して感受性であった(図１９および表１４および１５参照)。
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ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８抗体に対する耐性の分子性質を理解するために、各耐性株からのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１を配列決定した。ＨＢ１に対して耐性である全ての株はｇＨにおいて単一の非−保存的アミノ酸突然変異を保有し、およびＶＲ１８１４およびＤ１株(抗体圧力無くして平行して上皮細胞で継代したＶＲ１８１４)と比較して、他の突然変異は他の糖蛋白質で見出されなかった(表１６)。ＨＢ１に対して耐性である１１の個々の株が生じ、３つのアミノ酸のみにおいて５つの区別されるヌクレオチド突然変異を含む。これらのアミノ酸のいずれも、配列決定されているか、または公表された配列を有する臨床株において突然変異したことが見出されなかった。
ｈｕ８Ｇ８に応答しての突然変異は、あまり頻繁には生起せず、３つの株のみが耐性であることが判明した。ｈｕ８Ｇ８に対して耐性である全ての３つの株はＵＬ１３１において単一の非−保存的アミノ酸突然変異を保有し、ＶＲ１８１４およびＤ１株と比較して、他の突然変異は他の糖蛋白質において見出されなかった(表１６参照)。突然変異したｇＨおよびＵＬ１３１配列を６０の入手可能な臨床株配列と比較すると、該株のいずれもこれらの突然変異を運ばなかった。
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細胞に感染するＨＢ１−耐性株の能力をＤ１株に対して比較すると、これらの耐性株はかなりの侵入欠陥を有し(２０倍までより低い有効性)、これらの株はイン・ビボでの成長に対して減衰するであろうことを示唆する(図２０参照)。細胞に感染するｈｕ８Ｇ８−耐性株の能力をＤ１株と比較すると、耐性株は等しい効力にて細胞に感染できることが見出された；しかしながら、これらの株は非常に遅く成長し、生産における欠陥を示唆する(データは示さず)。さらなる分析が、この減衰についてのメカニズムを理解するのに必要とされる。
これらの突然変異が、各々、ｇＨおよびＵＬ１３１に結合するＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８の能力に影響したかを決定するために、部位−特異的突然変異誘発を用いて、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の表面に耐性突然変異を持つ複合体Ｉ(ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１)を一過的に発現させ、および抗体結合のＦＡＣＳ分析を行った。Ｐ１７１に対する突然変異(突然変異体１および３：ＨまたはＳに対するＰ１７１)は、ＨＢ１に対して２ないし５倍より耐性であったに過ぎず、およびｇＨ／ｇＬに対するこの抗体の結合は認識可能に変化しなかった。しかしながら、ＨＢ１−突然変異体２、５および６で見出された突然変異(ＣまたはＲに対するＷ１６８)は、結合するＨＢ１の能力を完全に排除した(図２１参照)。さらに、これらのウイルス突然変異体はＨＢ１によって中和されなかった(図１８参照)。突然変異体４(Ｄ４４６Ｎ)は中間的表現型を提示し；それはＨＢ１による中和に対して５００倍より耐性であった(図１８参照)が、ＨＢ１への結合は依然として検出できた(図２１参照)。
ＵＬ１３１における突然変異がどのようにしてｈｕ８Ｇ８結合に影響したかを決定するために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１の野生型または突然変異体複合体でのトランスフェクションを行い、および抗−ｇＨ(ＨＢ１およびＭＳＬ−１０９)、抗−ＵＬ１３１＿９９３およびｈｕ８Ｇ８への結合をＦＡＣＳ分析によって測定した(図２２参照)。全ての３つのＵＬ１３１突然変異は、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体についてのｈｕ８Ｇ８の結合を排除した。
ＨＢ１−耐性突然変異体を、(ＨＳＶ−２ ｇＨおよびＥＢＶ ｇＨについての最近の解決された構造に基づいて)ＨＣＭＶ糖蛋白質Ｈの構造のモデルにマッピングした(Ｂａｃｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９７：２２６３５−２２６４０(２０１０))。突然変異した残基の全てをｇＨの同一面にマッピングした(データは示さず)。ＨＢ１ ＦａｂをｇＨの構造にモデル化した。ＨＢ１ Ｆａｂのフットプリントは全ての突然変異を含み、ＨＢ１がこれらの突然変異によって規定されるエピトープに結合することを示唆する。同様に、ｈｕ８Ｇ８−耐性突然変異体は相互に対して近接している(４残基離れる)が、ＵＬ１３１についての構造は知られておらず、双方は推定アルファ−ラセンドメインにマッピングされ、およびラセンの同一面に存在すると予測される。かくして、結合分析と一緒にして、耐性突然変異は、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体に対するＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８双方についてのエピトープを解明する。
実施例８−親和性分析
ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８双方の親和性は、各々、以下に記載するように、バイアコア(ｂｉａｃｏｒｅ)およびスキャッチャード分析によって決定した。
可溶性バキュロウイルス−発現ｇＨ／ｇＬに対するＨＢ１の親和性は、バイアコア分析によって決定し、および１ｎＭであると判明した。具体的には、バキュロウイルスが発現した分泌ｇＨ／ｇＬに結合するＨＢ１の能力は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ)を用いる表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)測定(Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９１)によって評価した。ＳＰＲベースのバイオセンサーは、表面近くの屈折率の変化を報告する。蛋白質標的(「リガンド」)がセンサーチップ表面に共有結合により固定化されると、ＳＰＲを用いて、表面に注入された結合パートナー(「分析物」)の非共有結合相互作用をモニターすることができ；分析物結合のリアルタイム測定を用いて、相互作用の反応速度論および親和性の双方を決定することができる。
分析物Ｂが固定化されたリガンドＡに結合する１：１相互作用の場合において、平衡は数式１：
Figure 2014501491
を用いて記載される。
式１において、ｋｏｎは会合速度定数であり、ｋｏｆｆは解離速度定数であって、平衡解離定数ＫＤはＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから決定される。１：１結合についての複合体形成の速度は数式２：
Figure 2014501491
を用いて決定される。
ＳＰＲシグナル(Ｒ)の項で表現すると、数式２は数式３：
Figure 2014501491
として書くことができる。
数式３においては、Ｃは遊離分析物の濃度であって、Ｒｍａｘは表面の最大分析物結合能力である。同様に、溶液中で二量体化して、２つの結合部位を形成することができる分析物Ｂについては、平衡は数式４によって記載することができる。
Figure 2014501491
結合の速度の濃度依存性、および遊離分析物の不存在下における解離の速度を測定することによって、反応速度定数を決定し、およびそれを用いてＫＤを計算することができる。
ＳＰＲ測定は、ＨＢ１を非共有結合により固定化するための抗−Ｆｃ捕獲方法を用いて行うことができ、続いて、結合の反応速度論の決定のために変化させた濃度のｇＨ／ｇＬを注入した。ＣＭ５バイオセンサーチップ(ＢＲ １０００ １４、ＣＭ５研究グレード；ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．)をドッキングさせ、電気泳動用緩衝液(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ ７．４)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０１％ポリソルベート２０)で初回刺激し、および製造業者によって提供された指示に従って７０％グリセロールで正規化した。以下に簡単に概説するように、マウスモノクローナル抗−ヒトＦｃ抗体(Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ，ＢＲ−１００８−３９，ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．)をＣＭ５チップの全ての４つのフローセルに固定化した。製造業者によって記載されたプロトコルに従い、かつ７分の活性化時間を用い、Ｎ−エチルＮ’(３ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)(アミンカップリングキット、ＢＲ−１０００−５０；ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．)を用いてフローセルを活性化した。次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中に希釈された６０μＬの２５μｇ／ｍＬ抗体を１０μＬ／分の流速で注入することによって、アミンカップリングを通じて、活性化されたマトリックスを捕獲抗体と反応させた。カップリング注入の最後において、５μＬ／分の流速での３５μＬの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌの注入によって、いずれの残存する未反応のＮＨＳ基も不活化した。このようにして共有結合によって固定化された捕獲抗体の量は、カップリング手法の前および後におけるＳＰＲシグナルから見積もり、それが４つのフローセルにわたって８０００ないし９５００ＲＵの範囲を与えた。
約１００(任意のＳＰＲまたは共鳴単位(ＲＵ))未満のＲｍａｘ値は、決定することができる速度定数の範囲を制限することなく良好なノイズに対するシグナルの比率を供するものとして共通して認められている。予備的な実験は、３０μＬ／分の流速における０．１３μｇ／ｍＬ ＨＢ１の６０μＬの注入の結果、約５０ＲＵのシグナルがｇＨ／ｇＬでの飽和に際して観察されるような十分なＨＢ１の捕獲がもたらされたことを示した。かくして、ＨＢ１のこの濃度および注入プロトコルを速度定数の決定で用いた。
結合測定は、参照として用いたフローセル１にて、前記したようにＨＢ１をフローセル２に捕獲することによって行った。２倍増分にて０．３９ｎＭないし１００ｎＭの濃度で変化させたｇＨ／ｇＬの溶液を電気泳動用緩衝液中で調製した。３０μＬ／分の流速におけるセンサーチップ表面への６０μＬのこれらの溶液の注入のために、センサーグラムを収集した。センサーチップを２５℃で維持し、および注入の最後に続いて１０分間、解離をモニターした。センサーチップ表面が、３０μＬの３Ｍ ＭｇＣｌ２の注入を介して結合サイクルの間に再生された。この注入は、捕獲抗体からのいずれの残存するＨＢ１：ｇＨ／ｇＬ複合体の解離も引き起こした。次いで、次の結合サイクルのために、ＨＢ１を前記したフローセル２上に捕獲した。「ブランク」センサーグラムを、センサーチップ上への電気泳動用緩衝液の注入のために同様に収集した。
まず、参照セルで測定されたシグナルを差し引くことによって、動的分析のために、観察されたセンサーグラムを調製した。曲線の再生部分から得られたシグナルを除去した。次いで、プレ−分析物注入ベースラインの平均ＲＵ値を差し引くことによって、センサーグラムをゼロとした。最後に、電気泳動用緩衝液のみの注入のために測定されたセンサーグラムをｇＨ／ｇＬを含有する溶液の注入のために得られた曲線から差し引いた。データは、製造業者によって供給されたソフトウェアを用い、１：１のラングミュアー結合モデルまたは二価分析物モデルに従って分析した。
合計ＳＰＲシグナルはｇＨ／ｇＬ濃度と共に増加し、これは、Ｆｃ−捕獲ＨＢ１が抗原結合に対して能力があったことを示す。１：１ラングミュアー結合モデルに従ったデータの分析は、表１７に示された速度定数にて０．１５ｎＭの見掛けの平衡解離定数(ＫＤ)を示した；しかしながら、計算された曲線は、２．１の比較的大きなχ２の値を伴う観察されたセンサーグラムによく合致しなかった。観察されたセンサーグラムは二価分析物ＫＤモデルによって良好に記載され(χ２＝０．４)、１．０ｎＭの見掛けのＫＤおよび表１８に示された速度定数を生じた。
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バイアコアを用いてｈｕ８Ｇ８の親和性を決定できなかったので、スキャッチャード分析を代替モデルとして使用した。この方法においては、ヨウ素化抗体を未標識抗体の希釈シリーズと混合し、および競合についてアッセイした。ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄのフィッティングアルゴリズムを用いて結果をプロットして、抗体の親和性を決定した(図２３)。平均ＫｄはＨＢ１について１．２７ｎＭであって、ｈｕ８Ｇ８について２．０３ｎＭである(表１７)。また、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８双方についてのアデノウイルス細胞−表面−発現ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体についてのスキャッチャード分析によって親和性測定を決定し、各々、１．２７ｎＭおよび２．０３ｎＭであることが判明した。
具体的には、Ｉｏｄｏｇｅｎ方法(Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ)を用い、ＨＢ１およびｈｕ８Ｇ８をヨウ素化した。放射性標識抗体を、ＮＡＰ−５カラムを用いるゲル濾過によって遊離１２５Ｉ−Ｎａから精製した。精製されたｈｕ８Ｇ８抗体は１２．３０μＣｉ／μｇの特異的活性を有し、および精製されたＨＢ１抗体は１４．６６μＣｉ／μｇの特異的活性を有した。固定された濃度のヨウ素化抗体を含有し、かつ未標識抗体の濃度を減少させる５０μｌの競合反応混合物を９６ウェルプレートに入れた。蛋白質複合体ｇＨ／ｇＬ／１２８／１３０／１３１を発現する、アデノウイルスにより一過的にトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９細胞を、Ｓｉｇｍａ Ａｃｃｕｔａｓｅ(登録商標)Ｓｏｌｕｔｉｏｎ(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ)を用いてフラスコから脱着させ、パラホルムアルデヒドで固定し、および結合緩衝液(２％ＦＢＳ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ)で洗浄した。洗浄した細胞を、０．２ｍＬの結合緩衝液中の２５，０００細胞の密度で、５０μＬの競合反応混合物の三連を含有する９６ウェルプレートに加えた。細胞との各競合反応におけるヨウ素化抗体の最終濃度は１００ｐＭであり、および細胞との競合反応における未標識抗体の最終濃度は変化させ、５００ｎＭで出発し、次いで、１０の濃度について１：２倍希釈によって減少させ、ゼロ添加緩衝液のみの試料を含んだ。細胞との競合反応物を室温にて２時間インキュベートし、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移し、結合緩衝液で４回洗浄して、無結合ヨウ素化抗体を分離した。フィルターをＷａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４７０ガンマカウンター(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ)でカウントした。ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄ(Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７：２２−３９(１９８０))のフィッティングアルゴリズムを用いて、抗体の結合親和性を決定する、Ｎｅｗ Ｌｉｇａｎｄソフトウェア(Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ)を用いて結合データを計算した。
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実施例９−複合体Ｉへのｈｕ８Ｇ８結合の分析
ｈｕ８Ｇ８の複合体Ｉへの結合をさらに特徴付けるために、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、ｈｕ８Ｇ８が、実施例７において同定された耐性突然変異を含有するＵＬ１３１の一部に結合できたかをテストした。具体的には、ＵＬ１３１をコードするＤＮＡを、位置４１におけるセリンについてのコドンから位置６８におけるセリンについてのコドン(ＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹ ＫＹＶＥＱＬＶＤＬＴ ＬＮＹＨＹＤＡＳ(配列番号：１９４))から増幅させ、Ｎ末端Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、およびＴＥＶ開裂部位(ＤＮＡ６５４５７０)を持つ制限−独立クローニング(Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ)(ＲＩＣ)ベクターにクローン化した。ＵＬ１３１のこの部分は該蛋白質の二次構造において推定アルファ−ラセンを形成する。また、ＵＬ１３１を、複合体Ｉ(ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１)との関係でＵＬ１３１へのｈｕ８Ｇ８結合を排除する突然変異Ｑ４７Ｋでクローン化した。配列実証構築体をＥ．ｃｏｌｉ株Ｒｏｓｅｔｔａ２(ＤＥ３)中で成長させた。スターター培養を、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ培地中で３０℃にて一晩成長させた。１Ｌの培養における蛋白質発現は、０．３ｍＭ ＩＰＴＧにてＯＤ６００ ０．７において１６℃で一晩誘導した。細胞を収穫し、音波処理、およびＥＤＴＡ−フリーのプロテアーゼ阻害剤錠剤(Ｒｏｃｈｅ)を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール(緩衝液Ａ)中の細胞破壊器によって直ちに溶解させた。溶解させた細胞を１００００ｒｐｍで４０分間沈降させ、および清澄化された溶解物を重力流Ｎｉ−キレート化アフィニティーカラム(Ｑｉａｇｅｎ)に負荷した。カラムを、５０ｍＭイミダゾールを含む、１０カラム容量の緩衝液Ａおよび１０カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。蛋白質を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、５００ｍＭイミダゾールで溶出させ、直ちに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および５％グリセロールに透析した。蛋白質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および５％グリセロール中でのサイズ排除クロマトグラフィーカラム(Ｓ２００ １０／３０、ＧＥ)でさらに精製した。
ＵＬ１３１蛋白質断片へのｈｕ８Ｇ８結合を決定するために、Ｍａｘｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩コーティング緩衝液中のウェル当たり１μｇ、２００ｎｇ、または４０ｎｇ蛋白質で４℃にて一晩コーティングした。洗浄緩衝液(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ［Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ］)での３回の洗浄の後、ウェルをアッセイ希釈剤(０．５％ＢＳＡを含む洗浄緩衝液［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］)で１時間ブロックした。ｈｕ８Ｇ８をアッセイ緩衝液中で１０μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌにおいて１時間インキュベートした。３回の洗浄の後、ウェルを、１：５０００のペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド抗−ヒト抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ)と共にインキュベートし、または１：５００または１：５０００のホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド抗−ペンタ−ＨＩＳ(Ｑｉａｇｅｎ)と共に１時間インキュベートした。実験の結果を図２４に示し、これは、２００ｎｇ蛋白質でコーティングし、かつ１０μｇ／ｍｌ ｈｕ８Ｇ８と共にインキュベートしたＥＬＩＳＡプレートからのデータを含む。
これまでの発明を理解の明瞭性の目的で説明および実施例によって幾分詳細に記載してきたが、該記載および実施例は当該発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書中で引用された全ての特許および科学文献の開示は、ここに引用して、その全体が明示的に援用される。

Claims (102)

  1. ３つの重鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３)及び３つの軽鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３)を含んでなる、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する単離された抗体であって：
    (ａ)ＨＶＲ-Ｈ１が、配列番号：６のアミノ酸配列を含み；
    (ｂ)ＨＶＲ-Ｈ２が、配列番号：７のアミノ酸配列を含み；
    (ｃ)ＨＶＲ-Ｈ３が、配列番号：８のアミノ酸配列を含み；
    (ｄ)ＨＶＲ-Ｌ１が、配列番号：９のアミノ酸配列を含み；
    (ｅ)ＨＶＲ-Ｌ２が、配列番号：１０−１９から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
    (ｆ)ＨＶＲ-Ｌ３が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む抗体。
  2. ３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３）及び３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３）を含んでなる、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する単離された抗体であって：
    （ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号：６のアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号：７のアミノ酸配列を含み；
    （ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号：８のアミノ酸配列を含み；
    （ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号：９のアミノ酸配列を含み；
    （ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含み；そして
    （ｅ）軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３の第一アミノ酸及びＨＶＲ-Ｌ２が配列番号：２１のアミノ酸配列を含む抗体。
  3. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：３５、配列番号：３９、及び配列番号：４３から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１、及び配列番号：３６、配列番号：４０；及び配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２を含む請求項１に記載の抗体。
  4. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：３７及び配列番号：４１から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３；及び配列番号：３８及び配列番号：４２から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４を含む請求項１に記載の抗体。
  5. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：４５、配列番号：４６及び配列番号：４７から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む請求項１に記載の抗体。
  6. 前記ＶＨ配列が、配列番号：４５、配列番号：４６及び配列番号：４７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載の抗体。
  7. 前記ＶＬ配列が、配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含む請求項５に記載の抗体。
  8. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：４５、配列番号：４６又は配列番号：４７から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨ；及び配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む請求項５に記載の抗体。
  9. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：４５又は配列番号：４６のＶＨ配列及び配列番号：４９のＶＬ配列を含む請求項８に記載の抗体。
  10. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体が、０．０５μｇ／ｍｌ〜０．０００７μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で５０％のＨＣＭＶを中和する請求項１−９の何れか一項に記載の抗体。
  11. ３つの重鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３)及び３つの軽鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３)を含んでなる、ＨＣＭＶｇＨに結合する単離された抗体であって：
    (ａ)ＨＶＲ-Ｈ１が、配列番号：７１のアミノ酸配列を含み；
    (ｂ)ＨＶＲ-Ｈ２が、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、及び配列番号：９３から選択されるアミノ酸配列を含み；
    (ｃ)ＨＶＲ-Ｈ３が、配列番号：７５のアミノ酸配列を含み；
    (ｄ)ＨＶＲ-Ｌ１が、配列番号：７６のアミノ酸配列を含み；
    (ｅ)ＨＶＲ-Ｌ２が、配列番号：７７のアミノ酸配列を含み；そして
    (ｆ)ＨＶＲ-Ｌ３が、配列番号：７８のアミノ酸配列を含む抗体。
  12. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が配列番号：９３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含み、配列番号：９３の位置６のアミノ酸がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕから成る群から選択され、配列番号：９３の位置８のアミノ酸がＴｈｒ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項１１に記載の抗体。
  13. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：７２、配列番号：７３及び配列番号：７４から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含む請求項１２に記載の抗体。
  14. ＨＶＲ-Ｈ２が、配列番号：７４のアミノ酸配列を含む請求項１３に記載の抗体。
  15. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が配列番号：９４のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、配列番号：９４の位置５４のアミノ酸がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕから成る群から選択され、配列番号：９４の位置５６のアミノ酸がＴｈｒ又はＡｒｇから選択される請求項１２に記載の抗体。
  16. ＶＨが、配列番号：８７、配列番号：８８及び配列番号：８９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の抗体。
  17. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：９０のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む請求項１５に記載の抗体。
  18. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：９０のＶＬ配列を含む請求項１７に記載の抗体。
  19. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：８９のＶＨ配列を含む請求項１８に記載の抗体。
  20. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、０．００１〜０．０１μｇ／ｍｌのＥＣ９０でＨＣＭＶを中和する請求項１１−１９の何れか一項に記載の抗体。
  21. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１−２０の何れか一項に記載の抗体。
  22. ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である請求項１−２１の何れか一項に記載の抗体。
  23. 前記抗体が抗体断片である請求項１−２２の何れか一項に記載の抗体。
  24. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体が完全長ＩｇＧ１抗体である請求項１−１０及び２１−２２の何れか一項に記載の抗体。
  25. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が完全長ＩｇＧ１抗体である請求項１１−２２の何れか一項に記載の抗体。
  26. 請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体を含んでなる組成物。
  27. 追加の治療剤を更に含んでなる請求項２６に記載の組成物。
  28. 薬学的に許容可能な担体を更に含んでなる請求項２６又は２７に記載の組成物。
  29. 請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  30. 請求項２９の核酸を含んでなる宿主細胞。
  31. 抗体が生産されるように請求項３０の宿主細胞を培養することを含んでなる抗体を生産する方法。
  32. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する単離された抗体及びＨＣＭＶｇＨに結合する単離された抗体を含んでなる組成物。
  33. 組成物がＨＣＭＶ感染を中和する請求項３２に記載の組成物。
  34. 組成物が少なくとも５０％のＨＣＭＶを中和する請求項３３に記載の組成物。
  35. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体及びＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、１：１の比において組成物中に存在する請求項３２−３４の何れか一項に記載の組成物。
  36. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体の濃度が少なくとも０．０００７μｇ／ｍｌ〜０．０５μｇ／ｍｌであり、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体の濃度が少なくとも０．００１〜０．０１μｇ／ｍｌである請求項３２−３５の何れか一項に記載の組成物。
  37. 請求項３２−３６の何れか一項に記載の組成物であって、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体が、３つの重鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３)及び３つの軽鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３)を含み：
    (ａ)ＨＶＲ-Ｈ１が、配列番号：６のアミノ酸配列を含み；
    (ｂ)ＨＶＲ-Ｈ２が、配列番号：７のアミノ酸配列を含み；
    (ｃ)ＨＶＲ-Ｈ３が、配列番号：８のアミノ酸配列を含み；
    (ｄ)ＨＶＲ-Ｌ１が、配列番号：９のアミノ酸配列を含み；
    (ｅ)ＨＶＲ-Ｌ２が、配列番号：１０−１９から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
    (ｆ)ＨＶＲ-Ｌ３が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む組成物。
  38. 請求項３２−３６の何れか一項に記載の組成物であって、ＨＣＭＶｇＨに結合する前記抗体が、３つの重鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３)及び３つの軽鎖超可変領域(ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３)を含み：
    (ａ)ＨＶＲ-Ｈ１が、配列番号：７１のアミノ酸配列を含み；
    (ｂ)ＨＶＲ-Ｈ２が、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、及び配列番号：９３から選択されるアミノ酸配列を含み；
    (ｃ)ＨＶＲ-Ｈ３が、配列番号：７５のアミノ酸配列を含み；
    (ｄ)ＨＶＲ-Ｌ１が、配列番号：７６のアミノ酸配列を含み；
    (ｅ)ＨＶＲ-Ｌ２が、配列番号：７７のアミノ酸配列を含み；そして
    (ｆ)ＨＶＲ-Ｌ３が、配列番号：７８のアミノ酸配列を含む組成物。
  39. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：３５、配列番号：３９、及び配列番号：４３から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ１、及び配列番号：３６、配列番号：４０；及び配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ２を含む請求項３２−３８の何れか一項に記載の組成物。
  40. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：３７及び配列番号：４１から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ３；及び配列番号：３８及び配列番号：４２から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインフレームワークＦＲ４を含む請求項３２−３９の何れか一項に記載の組成物。
  41. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：４５、配列番号：４６及び配列番号：４７から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む請求項３２−４０の何れか一項に記載の組成物。
  42. 前記ＶＨ配列が、配列番号：４５、配列番号：４６及び配列番号：４７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記ＶＬ配列が、配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含む請求項４１に記載の組成物。
  44. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、(ａ)配列番号：４５、配列番号：４６又は配列番号：４７から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨ；及び(ｂ)配列番号：４８又は配列番号：４９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む請求項４１に記載の組成物。
  45. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が、配列番号：４５又は配列番号：４６のＶＨ配列及び配列番号：４９のＶＬ配列を含む請求項４４に記載の組成物。
  46. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が配列番号：９３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含み、配列番号：９３の位置６のアミノ酸がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕから成る群から選択され、配列番号：９３の位置８のアミノ酸がＴｈｒ及びＡｒｇから成る群から選択される請求項３２−４５の何れか一項に記載の組成物。
  47. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：７２、配列番号：７３及び配列番号：７４から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含む請求項３２−４６の何れか一項に記載の組成物。
  48. ＨＶＲ-Ｈ２が、配列番号：７４のアミノ酸配列を含む請求項４７に記載の組成物。
  49. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が配列番号：９４のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、配列番号：９４の位置５４のアミノ酸がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕから成る群から選択され、配列番号：９４の位置５６のアミノ酸がＴｈｒ又はＡｒｇから選択される請求項３２−４６の何れか一項に記載の組成物。
  50. ＶＨが、配列番号：８７、配列番号：８８及び配列番号：８９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項４９に記載の組成物。
  51. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：９０のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む請求項５０に記載の組成物。
  52. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：９０のＶＬ配列を含む請求項５１に記載の組成物。
  53. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、配列番号：８９のＶＨ配列を含む請求項５２に記載の組成物。
  54. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体及びＨＣＭＶｇＨに結合する前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３２−５３の何れか一項に記載の組成物。
  55. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体及びＨＣＭＶｇＨに結合する前記抗体が、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である請求項３２−５４の何れか一項に記載の組成物。
  56. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する前記抗体が抗体断片である請求項３２−５５の何れか一項に記載の組成物。
  57. ＨＣＭＶｇＨに結合する前記抗体が抗体断片である請求項３２−５５の何れか一項に記載の組成物。
  58. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体が完全長ＩｇＧ１抗体である請求項３２−５５及び５７の何れか一項に記載の組成物。
  59. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が完全長ＩｇＧ１抗体である請求項３２−５５及び５６の何れか一項に記載の組成物。
  60. 薬学的に許容可能な担体を更に含んでなる請求項３２−５９の何れか一項に記載の組成物。
  61. 追加の治療剤を更に含んでなる請求項６０に記載の組成物。
  62. 追加の治療剤がガンシクロビル、ホスカルネット、バルガンシクロビル及びシドホビルから選択される請求項６１に記載の組成物。
  63. 医薬としての使用のための請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物。
  64. ＨＣＭＶ感染の阻害、治療又は防止における使用のための請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物。
  65. 先天性のＨＣＭＶ感染又は移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の阻害、治療又は防止における使用のための請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物。
  66. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体と別の組成物中にある請求項６３−６５の何れか一項に記載の組成物。
  67. 医薬の製造における請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物の使用。
  68. 医薬が、ＨＣＭＶ感染の治療、阻害又は防止のためである請求項６７に記載の使用。
  69. 医薬が、先天性のＨＣＭＶ感染又は移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の阻害、防止又は治療のためである請求項６８に記載の使用。
  70. 医薬が、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体とは別の組成物中におけるＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含む請求項６７−６９の何れか一項に記載の使用。
  71. 有効量の請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物を患者に投与することを含んでなるＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法。
  72. 有効量の請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物を妊娠中の患者に投与することを含んでなる先天性のＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法。
  73. ＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止するために有効量の請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物を移植レシピエントに投与することを含んでなる、移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を治療、阻害又は防止する方法。
  74. 移植レシピエントがＨＣＭＶ血清反応陰性である請求項７３に記載の方法。
  75. 移植レシピエントが、ＨＣＭＶ血清反応陽性ドナーから臓器又は組織を受けている又は受けたことがある請求項７４に記載の方法。
  76. 患者に追加の治療剤を投与することを更に含んでなる請求項７１−７５の何れか一項に記載の方法。
  77. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物が、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物と別に投与される請求項７１−７６の何れか一項に記載の方法。
  78. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物が、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物と別の組成物である請求項７１−７７の何れか一項に記載の方法。
  79. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物が、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物と同時に投与される請求項７７又は７８に記載の方法。
  80. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体を含んでなる組成物が、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体を含んでなる組成物より前又は後に投与される請求項７７又は７８に記載の方法。
  81. 医薬の製造における請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体又は抗体の組合せの使用。
  82. 医薬が、ＨＣＭＶ感染の阻害、防止又は治療のためである請求項８１に記載の使用。
  83. 医薬が、先天性のＨＣＭＶ感染又は移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の阻害、防止又は治療のためである請求項８２に記載の使用。
  84. ＨＣＭＶ感染の治療、防止又は阻害における使用のための請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体又は抗体の組合せの使用。
  85. 治療が、先天性のＨＣＭＶ感染又は移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の防止又は阻害のためである請求項８４に記載の使用。
  86. 有効量の請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体又は抗体の組合せを患者に投与することを含んでなるＨＣＭＶ感染を治療、防止又は阻害する方法。
  87. 有効量の請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体又は抗体の組合せを妊娠中の患者に投与することを含んでなる先天性のＨＣＭＶ感染を治療、防止又は阻害する方法。
  88. 移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染を治療、防止又は阻害する方法であって、有効量の請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体又は抗体の組合せを移植レシピエントに投与することを含んでなる方法。
  89. 移植レシピエントがＨＣＭＶ血清反応陰性である請求項８８に記載の方法。
  90. 移植レシピエントが、ＨＣＭＶ血清反応陽性ドナーから臓器又は組織を受けている又は受けたことがある請求項８９に記載の方法。
  91. 患者に追加の治療剤を投与することを更に含んでなる請求項９０に記載の方法。
  92. ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体が、ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体と別に投与される請求項８６−９１の何れか一項に記載の方法。
  93. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体と同時に投与される請求項９２に記載の方法。
  94. ＨＣＭＶｇＨに結合する抗体が、ＨＣＭＶ複合体Ｉに結合する抗体より前又は後に投与される請求項９２に記載の方法。
  95. 請求項１−２５に記載の抗体の何れか一つと同じエピトープに結合する単離された抗体。
  96. ＨＣＭＶｇＨのエピトープに結合する単離された抗体であって：
    (ｉ)配列番号：１の位置１６８のトリプトファン；
    (ｉｉ)配列番号：１の位置４４６のアスパラギン酸；
    (ｉｉｉ)配列番号：１の位置１７１のプロリン；及び
    (ｉｖ)その組合せ
    から成る群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸を含んでなる抗体。
  97. ＨＣＭＶｇＨのエピトープに結合する請求項９６に記載の抗体であって：
    (ｉ)配列番号：１の位置１６８のトリプトファン；
    (ｉｉ)配列番号：１の位置４４６のアスパラギン酸；
    (ｉｉｉ)配列番号：１の位置１７１のプロリン；及び
    (ｉｖ)その組合せ
    から成る群から選択されるアミノ酸を含んでなる抗体。
  98. ＨＣＭＶ複合体Ｉのエピトープに結合する単離された抗体であって：
    (ｉ)配列番号：２０３の位置４７のグルタミン；
    (ｉｉ)配列番号：２０３の位置５１のリシン；
    (ｉｉｉ)配列番号：２０３の位置４６のアスパラギン酸；及び
    (ｉｖ)その組合せ
    から成る群から選択されるアミノ酸に対応するアミノ酸を含んでなる抗体。
  99. 請求項９８に記載の抗体であって：
    (ｉ)配列番号：２０３の位置４７のグルタミン；
    (ｉｉ)配列番号：２０３の位置５１のリシン；
    (ｉｉｉ)配列番号：２０３の位置４６のアスパラギン酸；及び
    (ｉｖ)その組合せ
    から成る群から選択されるアミノ酸を含んでなる抗体。
  100. ＨＣＭＶ複合体Ｉのポリペプチドに結合する単離された抗体であって、アミノ酸配列ＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫＹＶＥＱＬＶＤＬＴ ＬＮＹＨＹＤＡＳ(配列番号：１９４)を含んでなる抗体。
  101. 患者におけるＨＣＭＶウイルス力価の増加を低減又は防止する方法であって、患者に有効量の請求項１−２５の何れか一項に記載の抗体又は抗体の組合せを投与することを含んでなる方法。
  102. 患者におけるＨＣＭＶウイルス力価の増加を低減又は防止する方法であって、有効量の請求項２６−２８及び３２−６２の何れか一項に記載の組成物を患者に投与することを含んでなる方法。
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